NO850534L - Fremgangsmaate for dyrking av celler - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en metode for dyrking av skjøre celler som er i stand til å formere seg og mer spesielt en metode for å optimalisere gassutveksling i kulturer av slike celler. Celler som drar fordel av metoden ved den foreliggende oppfinnelse, inkluderer dyrecellelinjer, slik som forskjellige myelomceller, cellelinjer som er naturlig eller kunstig trans-formert fra primærkulturer, sammensmeltede celler slik som hybridomer, maligne transformanter, og andre celler som ikke har cellevegger, f.eks. sfæroblaster.

Det er vel kjent at oksygen er nødvendig i dyrking av dyreceller, og at den tilgjengelige mengde oksygen for diffu-sjon inn i en celle er viktig for cellens levedyktighet og vekst. Generelt kan for lite oksygen drepe en celle eller i beste fall begrense dens vekst. Som et eksempel trenger voksne hybridomkulturer minst omtrent 0,12 millimol oksygen/liter/time/10 9 celler. Hvis mindre oksygen er tilgjengelig,

blir mitose- og proteinproduksjonen begrenset. Også kan for mye^ oksygen føre til oksygentoksisitet som kan drepe en celle ved å oksydere essensielle proteiner. En cellkulturs hastighet for oksygenopptak øker med vekten av cellekulturen, og idet tettheten av cellekulturen øker, blir det mer vanskelig å overføre tilstrekkelige mengder oksygen fra overflaten av kulturen til det indre volum av kulturen.

Karbondioksyd, som influerer pH og bikarbonatkonsentrasjo-nen, trenges også for å opprettholde vekt av dyreceller; det er nødvendig å kontrolelre den hvis man søker å dyrke store mengder av celler.

Konvensjonelle teknikker for dyrking av pattedyrceller

i laboratoriemålestokk involverer suspendering av cellene i et medium i petriskål. Oksygen og karbondioksyd diffunderer gjennom overflaten av mediet og inn i cellene. Dybden av kul-turmediet påvirker hastigheten av oksygen og karbondioksyddif-fus jon til celler. Idet dybden av mediet øker, minker forhol-det mellom gjenomsnitts overflateareal og volumet av mediet.

På samme tid er konsentrasjonen av oksygen og karbondioksyd

i luften over skålen og/eller oppløsningshastigheten i mediet utilstrekkelig til å gi tilstrekkelig gasskonsentrasjon gjennom volumet av mediet for å tilfredsstille kravene til de voksne celler. Ved det punktet blir oksygentilgangen en vektbegren-

sende faktor. Følgelig lærer de tidligere metoder at man bør holde dybden av mediet for slike statiske kulturer innen milli-meterområdet. Generelt er den øvre grense for celletetthet for slike kulturer, idet man bruker luft i overvolumet som oksygentilførsel, omtrent 10^ celler pr. milliliter kultur.

Når celledyrkingsteknikker blir opptrappet til dyrking

av pattedyrceller i industrielle mengder, møtes vanskeligheter med å opprettholde tilgangen av tilstrekkelige mengder oksygen til å tilfredsstille cellenes krav. Se Glacken et al., Mamma-lian Cell Culture: Engineering Principles and Scale-up Trends in Biotechnology, Elsevier Science Publications, 0166 - 9430/83, side 102 (1983). En løsning på dette problem innebærer å sørge for økte konsentrasjoner av oksygen og karbondioksyd i rommet over mediumoverflaten mens celletettheten øker. Imidlertid, med denne tilnærming, kan for mye oksygen være tilstede nær overflaten av mediet, hvilket forårsaker oksygentoksisitet,

og dyre måleinnretninger og oksygensensorer må kontinuerlig teste og tilpasse oksygenkonsentrasjonen i mediet for å opprettholde optimale proporsjoner av gassene gjennom mediet.

I voksende celler som har cellevegger, f.eks. prokaryo-tiske celler, blir gasser ofte sprøytet direkte gjennom mediet for å tilføre cellene nødvendige gasskonsentrasjoner. Imidlertid er direkte gjennomsprøyting uegnet i dyrking av celler som ikke har cellevegg, er nokså skjøre, og blir fysisk skadet når gassen blir sprøytet ved store nok hastigheter til å gi tilstrekkelige gasskonsentrasjoner i mediet. Det er også slik at proteinkomponenter i mediet, som vanligvis trengs i alle dyrecellekulturer, produserer et skum på overflaten av mediet, som kan fange cellene. Celler som er fanget i skummet, dør raskt. Antiskummende stoffer som tilsettes mediet for å hindre skumdannelse, er potensielt toksiske overfor cellene i kulturen.

Som beskrevet i Glacken-artikkelen, har nyere utviklinger på celledyrkingsområdet inkludert innelukking av celler i kapsler som består av kalsiumalginat for å produsere høye celletettheter. US-patent nr. 4 352 883 kalt "Encapsulation of Biolo-gical Material" beskriver innkapsling av celler for å beskytte dem fra skadelige faktorer slik som bakterier. US 4 409 331 beskriver en metode for å produsere produkter av dyre- og andre celler ved å høste slike produkter fra innkapslede cellekultu- rer hvor cellene er plassert i semipermeable kapselmembraner.

Som det viser seg fra det ovenfor beskrevne, ville det være ønskelig å gi forbedret gassutveksling i dyrking av pattedyrceller og andre skjøre celler. Følgelig er det et mål for oppfinnelsen å optimalisere gasskonsentrasjonen i et medium uten å skade cellene eller å gripe til dyre kontrollteknikker. Et annet mål er å gi en fremgangsmåte for å dyrke store celle-kulturer, f.eks. 20 - 30 liters kulturer, til store celletettheter, f.eks. 1x10 Q celler/ml. Et annet mål er å dyrke celler som ikke har cellevegger, slik som dyreceller eller sfæroblaster ved å bruke gassgjennomsprøyting for å tilfredsstille cellenes gasskrav uten å ødelegge cellene. Et annet mål er å dyrke dyreceller i kultur til tettheter sammenlignbare med celletettheter i mange normale vev.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en metode for effektiv dyrking av skjøre celler, dvs. celler som ikke har noen cellevegg, til høy tetthet. Metoden innbefatter trinn som består i å suspendere sfæroidale kapsler i et medium som inneholder en utsædskultur av cellene som skal dyrkes. Kapslene innbefatter semipermeable membraner tilstrekkelige til å beskytte cellene fra fysisk skade og tilstrekkelig permeable til å tillate gjennomgang av nødvendige næringsstoffer, vita-miner, ioner, gasser, osv., som trenges for å understøtte vekten av cellene. En gass som inneholder komponenter som trenges av cellene, blir sprøytet direkte gjennom mediet blant de suspenderte kapslene, enten kontinuerlig eller intermitte-rende, under celleveksten. Sammensetningen av den gjennom-sprøytede gassen er tilstrekkelig til å opprettholde en konstant oksygen- og/eller karbondioksydkonsentrasjon i mediet, en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å forsyne cellene med oksygen og/eller karbondioksyd i mengder som er vel tilpasset til å understøtte cellemitose og metabolisme. Idet man bruker konvensjonelle medier og denne gassgjennomsprøytingsteknikken, er det mulig å dyrke celler inne i kapslene ved tettheter i størrelsesorden på 5 x 10 g celler/ml av bunnfelte kapsler.

Hvis ønsket, kan stoffer som blir produsert av cellene, høstes enten fra innsiden av kapslene eller fra mediet.

I foretrukne utførelser, når man dyrker dyrecellene, høstes gjennomsprøytede gassen karbondioksyd og oksygen i balanserte mengder som er tilstrekkelige til å produsere et ønsket C^/CC^-innhold i mediet. Fortrinnsvis er C^/CG^-innholdet i mediet tilstrekkelig til å maksimere celletettheten inne i kapslene ved å fremme optimal cellevekst. Dette betyr at oksygenet er tilstede i den gjennomsprøytede gassen ved nivåer mellom omtrent 0,15 mm Hg, og omtrent 450 mm Hg, fortrinnsvis minst mellom 0,15 og 200 mm Hg, og optimalt for pattedyrceller, 150 - 17 0 mm Hg.

Med fordel kan pattedyrceller som kan dyrkes i henhold

til fremgangsmåten, inkludere genetisk konstruerte celler, myelomceller, og hybridomer og andre sammensmeltede celler.

En prinsippiell fordel ved den foreliggende teknikk for dyrking av pattedyrceller som bruker gjennomsprøyting for gassutveksling, er at cellene blir forsynt med en rikelig gasstil-førsel. Således kan selv tette og voluminøse kulturer bli forsynt med oksygen og/eller karbondioksyd ved nivåer hvor gassutveksling ikke blir en vektbegrensende faktor. Dette er mulig fordi cellene er innkapslet i membraner og således er beskyttet fra den fysiske skade som normalt forårsakes av gjennomstrømningen. Gjennomstrømningen er en effektiv metode for å forsyne mediet med optimale konsentrasjoner av oksygen og karbondioksyd fordi en likevekt kan opprettes ved en terskel-hastighet for gjennomsprøyting mellom konsentrasjonen av gassene i den gjennomsprøytede gassen og konsentrasjonen av gassene i mediet. Oksygen og karbondioksydkonsentrasjoner i mediet kan således settes ved optimale nivåer ved å kontrollere deres konsentrasjoner i gassen som blir gjennomsprøytet. Behovet for dyrt kontroll- og gassmålingsutstyr blir derfor fjernet. Andre momenter, mål og fordeler ved oppfinnelsen vil vise seg for dem som er dyktige på området ved å lese de følgende krav og detaljerte spesifikasjoner sammen med tegningen.

FIG. 1 illustrerer skjematisk pattedyrceller innkapslet

i en mikrokapsel egnet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse;

FIG. 2 illustrerer skjematisk et cellekulturapparat egnet

for anvendelse i praktiseringen av oppfinnelsen;

FIG. 3 er en grafisk fremstilling av totalantall celler

pr. milliliter medium i forhold til tiden av forskjel-

lige porsjonstilførte kulturer med og uten gassgjen-nomsprøyting; FIG. 4 er en grafisk fremstilling av celler pr. milliliter av bunnfelte kapsler i forhold til tiden for en kontinuerlig tilført, gassgjennomsprøytet innkapslet kultur som illustrerer celletetthetene som er oppnå-elige /ved å bruke fremgangsmåten av oppfinnelsen; og FIG. 5 er en grafisk fremstilling lik fig. 4 som viser veksten av en porsjonstilført kultur.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på observasjonen

at celler uten cellevegger, f.eks. pattedyrceller, innkapslet i semipermeable membraner, er immune overfor, fysisk skade og oksygentoksisitetsproblemer forårsaket av gjennomsprøyting,

og at gassgjennomsprøyting kan anvendes effektivt til å tilføre oksygen og/eller karbondioksyd til slike celler. Når man bruker metoden fra denne oppfinnelse, kan konsentrasjonen av oksygen og karbondioksyd balanseres til å gi optimale nivåer i et medium, og økte celleutbytter kan oppnås i store celledyrkingskar. Fordi G^- og CG^-konsentrasjonene i mediet vil være proporsjonale med deres konsentrasjon i den gjennornstrommete gassen, blir konsentrasjonskosntroll og dens medfølgende omkostning elimi-nert .

Idet vi vender oss til fig. 1, kan pattedyrceller 11 bli innkapslet i sfæroidale, typiske sfæriske kapsler 13 ved hjelp av fremgangsmåten fremsatt i US-patent nr. 4 352 883, hvis innhold det her henvises til. De vanlig foretrukne innkapslings-teknikkene blir forklart i den samtidig inngitte ansøkning nr. 85.0535. For innholdet refererer vi til denne ansøkning.

En typisk innkapslingsfremgangsmåte involverer dannelse av

en suspensjon som inneholder omtrent 10 celler/ml i 1% (volum/ vekt) natriumalginat (NaG-Kelco LV). Tettheten av cellene i suspensjonen vil bestemme antall celler pr. kapsel i den endelig produserte utsædskultur. Suspensjonen blir overført til et jethodeapparat som består av en beholder som har en øvre luftinntaksdyse og en f orlenget hul del som er friksjons-tilpasset inn i en stopper. En sprøyte, f .eks. en 10 cc sprøyte, utstyrt med en trinnvis pumpe, er montert på toppen av beholderen med en nål, f.eks. en 0,01 inch I.D. Teflondek-

det nål, som passerer gjennom lengden av beholderen. Det indre av beholderen er utformet slik at toppen av nålen blir utsatt for en konstant laminær luftstrøm som virker som en luftkniv.

I anvendelse blir sprøyten som er full av løsningen som inneholder materialet som skal innkapsles, montert på toppen av beholderen, og den trinnvise pumpen blir aktivert til trinnvis å tvinge dråper av løsningen til toppen av nålen. Luftstrømmen "kutter av" hver dråpe, som så faller omtrent 2,5 - 3,5 cm ned i en 1,2% (vekt/volum) kalsiumkloridløsning, som danner gelmasser som blir oppsamlet ved aspirering. Gelmassene blir inkubert i tre kompletterte volumer av isotont saltvann for gelekspansjon i tilsammen omtrent 11 minutter. Deretter blir det dannet en membran rundt gelmassene vedkontakt med et 750 mg/liter poly-L-lysin (Sigma Chemical Company, 65 000 dalton molekylvekt) i isoton saltvannsløsning. Etter 12 minutters reaksjon, blir de resulterende kapsler vasket i 10 minutter med 1,4 g/l løsning av CHES (2-cykloheksylaminoetansulfansyre) buffer (Sigma) som inneholder 0,2% (vekt/volum) kalsiumklorid i saltvann. Kapslene blir vasket i ca. 8 minutter med 0,3%

(vekt/volum) kalsiumklorid i saltvann og en membran nr. 2 blir dannet rundt kapslene ved en 10 minutters reaksjon med 105

mg/l polyvinylamin (Polyscience, 50 000 - 150 000 dalton molekylvekt) i saltvann. Kapslene blir vasket igjen med to volumer isotont saltvann i 7 minutter og etterdekkes med en 7 minutters

_2

nedsenkning i 5 x 10 % (vekt/volum) NaG i saltløsning. Kapslene blir vasket i enda 4 minutter i saltvann, så blir de in-trakapsulære volumer gjendannet til væske ved 2 neddykkinger i 55 millimolar natriumcitrat i saltløsning, den første i 20 minutter og den andre i 6 minutter. Kapslene blir vasket 2 ganger i saltvann og vasket 1 gang i 4 minutter i medium. Kapslene 13 er så ferdige til inkubering i et vekstmedium 16.

Kapslene slik som illustrert i fig. 1, fremstilt i henhold til denne innkapslingsmetode har membraner som er impermeable for høymolekylvektproteiner, bakterier og cellene som skal dyrkes.

Fig. 2 illustrerer skjematisk et apparat for celledyrking

i henhold til oppfinnelsen. Det består av et 316L rustfritt stål elektropolert, 50 liters kar 10 tilpasset med et lokk

12. En motor 14 driver omdreiningsakselen 16 til å rotere propellene 18 og 20 som er plassert i kultur 22. Kultur 22 innbefatter et konvensjonelt medium slik som Eagle's modifiserte medium med tilsatt serum. Alternativt kan det bestå

av et hypertont medium som har en osmolaritet på omtrent 360 milliosmol av typen beskrevet herefter og beskrevet i større detalj i den sammenhørende søknad nr. 85.0533,

inngitt på samme dato som denne, hvis innhold det

er referert til her. En mengde kapsler slik som kapselen av-bildet i fig. 1 er suspendert i mediet. Typisk er kapslene sfæriske eller sfæroidale og har en diameter i størrelsesorden på mindre enn omtrent 2 mm. Kapslene som har en gjennomsnitts diameter i størrelsesorden på 0,8 mm virker godt.

Gasskravene til cellene blir møtt ved å la en oksygen-

og karbondioksydinneholdende gas passere gjennom sterilt filter 24, luftrør 26, og gjennomsprøytingshode 28. Gjennomsprøy-tingshodet 28 kan inneholde et 2,5 um mikroporøst porselensfil-ter . Til dyrking av dyreceller kan gassen bestå av 95% luft,

5% CO ? (i volum). Gassbobler passerer fra gjennomsprøytingsho-det opp gjennom mediet blant kapslene. Gjennomsprøytingshastig-heten bør være tilstrekkelig til å opprettholde partialtrykket av oksygen i mediet likt med partialtrykket av oksygen i gassen. Trykket av oksygen i mediet kan derved settes til et nivå ved eller såvidt over det som cellene trenger for optimal vekst.

På grunn av serumkomponenten i mediet, forårsaker gjennomsprøy-ting at skum samler seg i overvolumet 30 i kar 10. Imidlertid beskytter kapslene cellene fra dehydrering om de midlertidig skulle bli ført inn i skummet, og beskytter også cellene fra mekanisk skade. Således kan gassprøyting gjennom en innkapslet kultur tilfredsstille den økende cellepopulasjons behov for oksygen, og derved gjøre det mulig å oppnå ekstremt høye celletettheter. Gassen som går ut av kulturen, passerer gjennom utgangsåpning 32 og filter 34. En typisk gasstrømshastig-het for en 30 liters kultur er 0,2 standard kubikkfot pr. time.

Når man praktiserer oppfinnelsen på porsjonstilførselsmå-ten, blir mediet ganske enkelt utmålt ned i kar 10 sammen med mikrokapsler som inneholder utsædskulturen, og kulturen blir dyrket til maksimum tetthet ved gassgjennomsprøyting. Imidlertid er kanskje den beste måten å praktisere oppfinnelsen på å la medium passere gjennom kulturen ved å innføre en kontinuerlig eller periodevis strøm av medium inn i inngangsåpnin-gen 38, og tømme av medium gjennom filterelement 40. Filterelement 40 kan inneholde et rustfritt, mikroporøst nett som har porer mindre enn diameteren av kapslene, f.eks. 50 - 100um. Medium kan bli dratt med gjennom ventil 42. Nivået av medium

i kulturen kan observeres i det gjennomsiktige rør 44. En typisk hastighet av mediumstrøm i inngangsåpning 38 og ut gjennom filter 40 er 4 ml til 12 ml pr. minutt.

Hvis man søker å høste inn proteiner eller andre stoffer produsert av cellene, vil metoden som anvendes avhenge av for-holdet mellom de effektive molekylstørrelser av stoffet av interesse og permeabiliteten av kapselmembranene. Som beskrevet i de ovenfor refererte patenter, kan permeabiliteten av kapselmembranene kontrolleres innen grenser. Hvis proteinet av interesse er for stort til å gå gjennom membranen, samler proteinene seg inne i mikrokapslene; hvis det er lite nok til å gå gjennom membranene, vil de samle seg i det ekstrakapsulære medium.

I anvendelse bestemmer en systembruker en ønsket mengde oksygen og/eller karbondioksyd til å bli oppløst i medium 22.

De valgte gasskonsentrasjoner og proporsjoner avhenger av typen celler som dyrkes, men er uavhengig av strømning eller planlagt celletetthet. For de fleste dyreceller vil den ønskede konsentrasjon (partielt trykk) av oksygen være mellom omtrent 15

og 200 mm Hg. For eksempel vil det valgte oksygenkonsentrasjons-nivå for en cellekultur være større enn det som er tilstrekkelig for å forsyne cellene med 0,12 mM/l/time/10 9 celler, det tidligere fastsatte omtrentlige minimumsbehov for kraftig cellevekst.

Konsentrasjonen av gasser i mediet er proporsjonal med konsentrasjonen av gassene i den gjennomsprøytede gassen forut-satt at gjennomsprøytingshastigheten er tilstrekkelig høy til å dekke over variasjoner i G^/CC^-konsentrasjon forårsaket av cellerespirasjonsaktivitet. Ved et terskelnivå er gjennom-sprøytingshastigheten tilstrekkelig til å opprettholde en likevekt mellom gass og væskefåsene i kar 10. Systembrukeren kan følgelig sette gjennomsprøytingshastigheten til å tilføre den ønskede blanding av gasser til gjennomsprøytingshodet 28. Gjennomsprøytingshodet 28 tilfører så gassen til kultur 22 i en hastighet som opprettholder en konstant konsentrasjon oksygen i mediet. En slik gjennomsprøytingshastighet er 0,2 standard kubikkfot/time i et 30 liters dyrkingskar. Kapslene 13 beskytter cellene 11 i mediet mot mekanisk skade. Kapslene beskytter også cellene som kan bli transportert inn i skummet i overvolumet i karet, fra oksygenskade eller dehydratisering.

Således trenger oksygenkonsentrasjonen i mediet ikke å kontrolleres, fordi det etableres en likevekt mellom konsentrasjonen av gassene oppløst i medium 22 og de forutvalgte konsentrasjoner av gassene som sprøytes igjennom.

Gjennomsprøytingen fortsetter og cellene 11 i kapslene

13 tillates å gjennomgå mitose. Til slutt, når cellekulturen har nådd den ønskede celletetthet, kan stoffene produsert av cellene, slik som antistoffer, bli høstet enten fra innsiden av kapslene eller fra det ekstrakapsulære medium.

Gjennomsprøyting i et mikroinnkapslet cellekultursystem slik som beskrevet ovenfor, er blitt observert å understøtte en celletetthet på omtrent 5x10 gceller pr. ml av bunnfelte kapsler, eller omtrent 1x10 g celler pr. ml medium. Dette er en forbedring på omtrent 2 størrelsesordener i forhold til konvensjonelle dyrkingsteknikker. Bortsett fra å forbedre celleproduktutbyttet ved å øke celletettheten tillater gassgjen-nomsprøyting i henhold til oppfinnelsen dyrkingsteknikkene å bli opptrappet til kommersielle produksjonsnivåer.

Således kan det ses at gjennomsprøyting gir forbedrede, effektive gassutvekslinger til mikroinnkapslede pattedyrceller.

Oppfinnelsen vil bli videre forstått fra de følgende, ubegrensende eksempler.

EKSEMPEL 1

Omtrent 800 ml bunnfelte kapsler som inneholder ca. 10<5>mus-mus hybridomceller pr. milliliter ble likt fordelt i tilstrekkelig medium til å utgjøre 2,3 liter volumer av innkapslede utsædskulturer. Samtidig ble 2,3 liter volumer av medium som inneholdt sammenlignbare antall av de samme celler pr. volumenhet av medium fremstilt. Mediet var standard Eagle's medium tilsatt 5% fetal bovinserum. De fire utsædskulturene ble dyrket med svak røring og uten tilsetninger til mediet i 10 dager. En innkapslet kultur og én uinnkapslet kultur ble gjennomsprøytet ved en hastighet på 0,3 standard kubikkfot pr. time i 4 dager, og 1,0 standard kubikkfot pr. time deretter. De to gjenværende utsædskulturene ble ikke gjennomsprøytet.

Den gjennomsprøytede gassen besto av 5% CG^og 95% luft (i volum). Celletettheten i de henholdsvise kulturer ble kontrollert, og data ble plottet. Resultatene er vist i fig. 3.

Som det går frem av data, hadde den ugjennomsprøytede uinnkapslede kulturen etter 6 dager vokset til en celletetthet pa omtrent 8x10 5 celler/ml kultur, og den ugjennomsprøytede konvensjonelle cellekultur hadde vokst til en tetthet på omtrent 3x10 celler/ml. De gjennomsprøytede uinnkapslede og innkapslede kulturer hadde vokst til en tetthet på omtrent

6 6

1,5 x 10 celler/ml og 1,3 x 10 celler/ml, henholdsvis. Deretter falt celletettheten av både de ugjennomsprøytede og gjennom-sprøytede suspensjonskulturer hurtig, inntil på dag 10, tettheten av begge kulturer var mindre enn 2x10 5 celler pr. milliliter. Dette viser at gjennomsprøyting av uinnkapslede kulturer ikke har noen signifikant nytteeffekt sammenlignet med den samme kultur som anvender oksygen oppløst i mediet fra overvolumet. Den ugjennomsprøytede innkapslede kultur var bare mode-rat mer vellykket. Dens celletetthet var på omtrent 7 x 10~* celler/ml og gikk ned på dag 9. Den innkapslede, gjennomstrøm-mede kultur, i motsetning, viste en jevn økning i celletetthet fra dag 2 til dag 9, og celletettheten ble deretter opprettholdt på omtrent 3x10 celler/ml. Dette eksempel viser at levedyk-tigheten av celler og cellevekst blir fremmet i følsomme dyreceller hvis de blir dyrket i en gassgjennomsprøytet, innkapslet kultur, og at trinnene både for innkapsling og gjennomstrømning er nødvendige for å oppnå dette resultat.

EKSEMPEL 2

To innkapslede hybridomcellekulturer ble fremstilt og suspendert i Eagle<1>s medium tilsatt 5% fetal bovinserum,- 100 ganger det normale jernionekonsentrasjon og 2 ganger den normale aminosyrekonsentrasjon. Mediet hadde et osmotisk trykk på omtrent 360 milliosmol. Kultur nr. 1 hadde en utgangscelletett-het på 5 x 10^ celler/ml kultur, ble tilført næring i 13 dager ved hjelp av sirkulering av.friskt medium på 6 ml/minutt, og deretter i 5 dager på 11 ml/minutt. Kultur nr. 2 (med en ut- gangscelletetthet på 1 x 10 celler/ml) fikk kontinuerlig næ-ringstilførsel på 4 ml/minutt i 9 dager, og ble porsjonstilført ved å utskifte 10 liter medium pr. dag på hver av dag 9 til 20. Begge kulturer ble gjennomsprøytet med luft i løpet av sin vekstcyklus med 0,2 standard kubikkfot pr. time. Celletettheten av hver kultur ble kontrollert. Resultatene er fremstilt i fig. 4 og 5. Som illustrert oppnådde den kontinuerlig til-førte kultur (fig. 4) ved og etter dag 17, en celletetthet på mellom 1x10 8 celler/ml av bunnfelte kapsler og 5 x 10<8>celler/ml av bunnfelte kapsler. Siden volumet av mediet var omtrent 5 ganger volumet av kapslene, betyr dette at celletettheten pr. milliliter kultur var mellom omtrent 5x10 7 og 1 x 10 celler/ml.

Som vist i fig. 5 oppnådde den porsjonstilførte kultur også en tetthet større enn 1x10 celler/ml av bunnfelte kapsler .

Fagmannen på området kan bestemme andre modifikasjoner eller variasjoner av fremgangsmåtene og produktene beskrevet her. Slike andre modifikasjoner og variasjoner er inkludert i de følgende krav.

Claims (11)

1. En metode for dyrking av celler som ikke har cellevegg, til høy tetthet, karakterisert ved følgende trinn: A. direkte gjennomsprøyting av en gass gjennom et vekstmedium, for å forsyne nevnte medium med en konstant gasskonsentrasjon tilstrekkelig til å opprettholde levedyktighet og understøtte mitose av nevnte celler, idet nevnte celler er plassert i sfæroidale kapsler suspendert i nevnte medium, idet nevnte kapsler har semipermeable membraner tilstrekkelig til å beskytte nevnte celler fra fysisk skade og tilstrekkelig permeable til å tillate gjennomgang av komponenter som trenges til å opprettholde levedyktighet og understøtte mitose av nevnte celler; og B. å tillate nevnte celler å vokse.

2. Metode i henhold til krav 1, karakterisert ved et tilleggstrinn som består i å høste stoffer som blir produsert av nevnte celler enten fra innsiden av kapslene eller fra nevnte medium.

3. Metode i henhold til krav 1, karakterisert ved at nevnte celler er dyreceller og nevnte gass er en oksygeninneholdende gass.

4. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at nevnte gass videre inneholder karbondioksyd.

5. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at nevnte celler innbefatter pattedyrceller.

6. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at nevnte oksygeninneholdende gass inneholder balanserte mengder av oksygen og karbondioksyd tilstrekkelig til å produsere en optimal, konstant oksygen- og karbondioksydkonsentrasjon i nevnte medium til å understøtte metabolisme og fremme mitose i nevnte celler.

7. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at partialtrykket av oksygen i nevnte medium er innen området 15-200 mm Hg.

8. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at nevnte dyreceller innbefatter sammensmeltede celler.

9. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at nevnte dyreceller innbefatter genetisk konstruerte celler.

10. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at nevnte dyreceller innbefatter myelomceller.

11. Metode i henhold til krav 3, karakterisert ved at nevnte dyreceller tillates å vokse til en tetthet på minst omtrent 5 x 10 celler/ml kultur.