NO850534L

NO850534L - PROCEDURE FOR CULTING CELLS

Info

Publication number: NO850534L
Application number: NO850534A
Authority: NO
Inventors: Randall G Rupp
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1984-02-13
Filing date: 1985-02-12
Publication date: 1985-08-14
Also published as: GB2154246B; AU572608B2; DE3504748A1; IT8567141A0; DE3504748C2; BE901702A; DK65085D0; IT1184884B; GB2154246A; NL8500351A; SE8500622L; FR2559500A1; SE8500622D0; AU3857185A; DK65085A; JPS6110115B2; JPS60199380A; IT8567141A1; GB8503248D0

Description

Denne oppfinnelse vedrører en metode for dyrking av skjøre celler som er i stand til å formere seg og mer spesielt en metode for å optimalisere gassutveksling i kulturer av slike celler. Celler som drar fordel av metoden ved den foreliggende oppfinnelse, inkluderer dyrecellelinjer, slik som forskjellige myelomceller, cellelinjer som er naturlig eller kunstig trans-formert fra primærkulturer, sammensmeltede celler slik som hybridomer, maligne transformanter, og andre celler som ikke har cellevegger, f.eks. sfæroblaster. This invention relates to a method for cultivating fragile cells that are capable of reproduction and more particularly to a method for optimizing gas exchange in cultures of such cells. Cells that benefit from the method of the present invention include animal cell lines, such as various myeloma cells, cell lines naturally or artificially transformed from primary cultures, fused cells such as hybridomas, malignant transformants, and other cells that do not have cell walls, e.g. e.g. spheroblasts.

Det er vel kjent at oksygen er nødvendig i dyrking av dyreceller, og at den tilgjengelige mengde oksygen for diffu-sjon inn i en celle er viktig for cellens levedyktighet og vekst. Generelt kan for lite oksygen drepe en celle eller i beste fall begrense dens vekst. Som et eksempel trenger voksne hybridomkulturer minst omtrent 0,12 millimol oksygen/liter/time/10 9 celler. Hvis mindre oksygen er tilgjengelig, It is well known that oxygen is necessary in the cultivation of animal cells, and that the amount of oxygen available for diffusion into a cell is important for the cell's viability and growth. In general, too little oxygen can kill a cell or at best limit its growth. As an example, adult hybridoma cultures require at least about 0.12 millimoles of oxygen/liter/hour/10 9 cells. If less oxygen is available,

blir mitose- og proteinproduksjonen begrenset. Også kan for mye^ oksygen føre til oksygentoksisitet som kan drepe en celle ved å oksydere essensielle proteiner. En cellkulturs hastighet for oksygenopptak øker med vekten av cellekulturen, og idet tettheten av cellekulturen øker, blir det mer vanskelig å overføre tilstrekkelige mengder oksygen fra overflaten av kulturen til det indre volum av kulturen. mitosis and protein production are limited. Also, too much^ oxygen can lead to oxygen toxicity which can kill a cell by oxidizing essential proteins. A cell culture's rate of oxygen uptake increases with the weight of the cell culture, and as the density of the cell culture increases, it becomes more difficult to transfer sufficient amounts of oxygen from the surface of the culture to the inner volume of the culture.

Karbondioksyd, som influerer pH og bikarbonatkonsentrasjo-nen, trenges også for å opprettholde vekt av dyreceller; det er nødvendig å kontrolelre den hvis man søker å dyrke store mengder av celler. Carbon dioxide, which influences the pH and the bicarbonate concentration, is also needed to maintain the weight of animal cells; it is necessary to control it if one seeks to grow large quantities of cells.

Konvensjonelle teknikker for dyrking av pattedyrcellerConventional techniques for culturing mammalian cells

i laboratoriemålestokk involverer suspendering av cellene i et medium i petriskål. Oksygen og karbondioksyd diffunderer gjennom overflaten av mediet og inn i cellene. Dybden av kul-turmediet påvirker hastigheten av oksygen og karbondioksyddif-fus jon til celler. Idet dybden av mediet øker, minker forhol-det mellom gjenomsnitts overflateareal og volumet av mediet. on a laboratory scale involves suspending the cells in a medium in a petri dish. Oxygen and carbon dioxide diffuse through the surface of the medium and into the cells. The depth of the culture medium affects the rate of oxygen and carbon dioxide diffusion into cells. As the depth of the medium increases, the ratio between the average surface area and the volume of the medium decreases.

På samme tid er konsentrasjonen av oksygen og karbondioksydAt the same time, the concentration of oxygen and carbon dioxide

i luften over skålen og/eller oppløsningshastigheten i mediet utilstrekkelig til å gi tilstrekkelig gasskonsentrasjon gjennom volumet av mediet for å tilfredsstille kravene til de voksne celler. Ved det punktet blir oksygentilgangen en vektbegren- in the air above the dish and/or the dissolution rate in the medium insufficient to provide sufficient gas concentration throughout the volume of the medium to satisfy the requirements of the adult cells. At that point, the oxygen supply becomes a weight limit-

sende faktor. Følgelig lærer de tidligere metoder at man bør holde dybden av mediet for slike statiske kulturer innen milli-meterområdet. Generelt er den øvre grense for celletetthet for slike kulturer, idet man bruker luft i overvolumet som oksygentilførsel, omtrent 10^ celler pr. milliliter kultur. send factor. Consequently, the previous methods teach that one should keep the depth of the medium for such static cultures within the millimeter range. In general, the upper limit of cell density for such cultures, using air in the supervolume as oxygen supply, is approximately 10^ cells per milliliters of culture.

Når celledyrkingsteknikker blir opptrappet til dyrkingWhen cell culture techniques are scaled up to cultivation

av pattedyrceller i industrielle mengder, møtes vanskeligheter med å opprettholde tilgangen av tilstrekkelige mengder oksygen til å tilfredsstille cellenes krav. Se Glacken et al., Mamma-lian Cell Culture: Engineering Principles and Scale-up Trends in Biotechnology, Elsevier Science Publications, 0166 - 9430/83, side 102 (1983). En løsning på dette problem innebærer å sørge for økte konsentrasjoner av oksygen og karbondioksyd i rommet over mediumoverflaten mens celletettheten øker. Imidlertid, med denne tilnærming, kan for mye oksygen være tilstede nær overflaten av mediet, hvilket forårsaker oksygentoksisitet, of mammalian cells in industrial quantities, difficulties are encountered in maintaining the supply of sufficient amounts of oxygen to satisfy the cells' demands. See Glacken et al., Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scale-up Trends in Biotechnology, Elsevier Science Publications, 0166-9430/83, page 102 (1983). A solution to this problem involves ensuring increased concentrations of oxygen and carbon dioxide in the space above the medium surface while the cell density increases. However, with this approach, too much oxygen may be present near the surface of the medium, causing oxygen toxicity,

og dyre måleinnretninger og oksygensensorer må kontinuerlig teste og tilpasse oksygenkonsentrasjonen i mediet for å opprettholde optimale proporsjoner av gassene gjennom mediet. and expensive measuring devices and oxygen sensors must continuously test and adjust the oxygen concentration in the medium to maintain optimal proportions of the gases through the medium.

I voksende celler som har cellevegger, f.eks. prokaryo-tiske celler, blir gasser ofte sprøytet direkte gjennom mediet for å tilføre cellene nødvendige gasskonsentrasjoner. Imidlertid er direkte gjennomsprøyting uegnet i dyrking av celler som ikke har cellevegg, er nokså skjøre, og blir fysisk skadet når gassen blir sprøytet ved store nok hastigheter til å gi tilstrekkelige gasskonsentrasjoner i mediet. Det er også slik at proteinkomponenter i mediet, som vanligvis trengs i alle dyrecellekulturer, produserer et skum på overflaten av mediet, som kan fange cellene. Celler som er fanget i skummet, dør raskt. Antiskummende stoffer som tilsettes mediet for å hindre skumdannelse, er potensielt toksiske overfor cellene i kulturen. In growing cells that have cell walls, e.g. prokaryotic cells, gases are often injected directly through the medium to supply the cells with the necessary gas concentrations. However, direct spraying is unsuitable in growing cells that do not have a cell wall, are rather fragile, and are physically damaged when the gas is sprayed at high enough velocities to provide sufficient gas concentrations in the medium. It is also the case that protein components in the medium, which are usually needed in all animal cell cultures, produce a foam on the surface of the medium, which can trap the cells. Cells trapped in the foam die quickly. Antifoaming substances that are added to the medium to prevent foaming are potentially toxic to the cells in the culture.

Som beskrevet i Glacken-artikkelen, har nyere utviklinger på celledyrkingsområdet inkludert innelukking av celler i kapsler som består av kalsiumalginat for å produsere høye celletettheter. US-patent nr. 4 352 883 kalt "Encapsulation of Biolo-gical Material" beskriver innkapsling av celler for å beskytte dem fra skadelige faktorer slik som bakterier. US 4 409 331 beskriver en metode for å produsere produkter av dyre- og andre celler ved å høste slike produkter fra innkapslede cellekultu- rer hvor cellene er plassert i semipermeable kapselmembraner. As described in the Glacken article, recent developments in the field of cell culture have included encapsulating cells in capsules consisting of calcium alginate to produce high cell densities. US Patent No. 4,352,883 entitled "Encapsulation of Biological Material" describes the encapsulation of cells to protect them from harmful factors such as bacteria. US 4,409,331 describes a method for producing products from animal and other cells by harvesting such products from encapsulated cell cultures where the cells are placed in semipermeable capsule membranes.

Som det viser seg fra det ovenfor beskrevne, ville det være ønskelig å gi forbedret gassutveksling i dyrking av pattedyrceller og andre skjøre celler. Følgelig er det et mål for oppfinnelsen å optimalisere gasskonsentrasjonen i et medium uten å skade cellene eller å gripe til dyre kontrollteknikker. Et annet mål er å gi en fremgangsmåte for å dyrke store celle-kulturer, f.eks. 20 - 30 liters kulturer, til store celletettheter, f.eks. 1x10 Q celler/ml. Et annet mål er å dyrke celler som ikke har cellevegger, slik som dyreceller eller sfæroblaster ved å bruke gassgjennomsprøyting for å tilfredsstille cellenes gasskrav uten å ødelegge cellene. Et annet mål er å dyrke dyreceller i kultur til tettheter sammenlignbare med celletettheter i mange normale vev. As can be seen from the above, it would be desirable to provide improved gas exchange in the culture of mammalian cells and other fragile cells. Accordingly, it is an object of the invention to optimize the gas concentration in a medium without damaging the cells or resorting to expensive control techniques. Another aim is to provide a method for growing large cell cultures, e.g. 20 - 30 liter cultures, for high cell densities, e.g. 1x10 Q cells/ml. Another goal is to grow cells that do not have cell walls, such as animal cells or spheroblasts, using gas permeation to satisfy the cells' gas requirements without destroying the cells. Another goal is to grow animal cells in culture to densities comparable to cell densities in many normal tissues.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en metode for effektiv dyrking av skjøre celler, dvs. celler som ikke har noen cellevegg, til høy tetthet. Metoden innbefatter trinn som består i å suspendere sfæroidale kapsler i et medium som inneholder en utsædskultur av cellene som skal dyrkes. Kapslene innbefatter semipermeable membraner tilstrekkelige til å beskytte cellene fra fysisk skade og tilstrekkelig permeable til å tillate gjennomgang av nødvendige næringsstoffer, vita-miner, ioner, gasser, osv., som trenges for å understøtte vekten av cellene. En gass som inneholder komponenter som trenges av cellene, blir sprøytet direkte gjennom mediet blant de suspenderte kapslene, enten kontinuerlig eller intermitte-rende, under celleveksten. Sammensetningen av den gjennom-sprøytede gassen er tilstrekkelig til å opprettholde en konstant oksygen- og/eller karbondioksydkonsentrasjon i mediet, en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å forsyne cellene med oksygen og/eller karbondioksyd i mengder som er vel tilpasset til å understøtte cellemitose og metabolisme. Idet man bruker konvensjonelle medier og denne gassgjennomsprøytingsteknikken, er det mulig å dyrke celler inne i kapslene ved tettheter i størrelsesorden på 5 x 10 g celler/ml av bunnfelte kapsler. The present invention relates to a method for the efficient cultivation of fragile cells, i.e. cells which have no cell wall, to a high density. The method includes the step of suspending spheroidal capsules in a medium containing a seed culture of the cells to be cultured. The capsules include semipermeable membranes sufficient to protect the cells from physical damage and sufficiently permeable to allow the passage of necessary nutrients, vitamins, ions, gases, etc., needed to support the weight of the cells. A gas containing components needed by the cells is injected directly through the medium among the suspended capsules, either continuously or intermittently, during cell growth. The composition of the injected gas is sufficient to maintain a constant oxygen and/or carbon dioxide concentration in the medium, a concentration which is sufficient to supply the cells with oxygen and/or carbon dioxide in amounts well adapted to support cell mitosis and metabolism . Using conventional media and this gas permeation technique, it is possible to grow cells inside the capsules at densities on the order of 5 x 10 g cells/ml of bottomed capsules.

Hvis ønsket, kan stoffer som blir produsert av cellene, høstes enten fra innsiden av kapslene eller fra mediet. If desired, substances produced by the cells can be harvested either from the inside of the capsules or from the medium.

I foretrukne utførelser, når man dyrker dyrecellene, høstes gjennomsprøytede gassen karbondioksyd og oksygen i balanserte mengder som er tilstrekkelige til å produsere et ønsket C^/CC^-innhold i mediet. Fortrinnsvis er C^/CG^-innholdet i mediet tilstrekkelig til å maksimere celletettheten inne i kapslene ved å fremme optimal cellevekst. Dette betyr at oksygenet er tilstede i den gjennomsprøytede gassen ved nivåer mellom omtrent 0,15 mm Hg, og omtrent 450 mm Hg, fortrinnsvis minst mellom 0,15 og 200 mm Hg, og optimalt for pattedyrceller, 150 - 17 0 mm Hg. In preferred embodiments, when culturing the animal cells, the permeated gas carbon dioxide and oxygen are harvested in balanced amounts sufficient to produce a desired C₂/CC₂ content in the medium. Preferably, the C^/CG^ content in the medium is sufficient to maximize the cell density inside the capsules by promoting optimal cell growth. This means that the oxygen is present in the permeated gas at levels between about 0.15 mm Hg, and about 450 mm Hg, preferably at least between 0.15 and 200 mm Hg, and optimally for mammalian cells, 150 - 170 mm Hg.

Med fordel kan pattedyrceller som kan dyrkes i henholdAdvantageously, mammalian cells that can be cultured according to

til fremgangsmåten, inkludere genetisk konstruerte celler, myelomceller, og hybridomer og andre sammensmeltede celler. to the method, include genetically engineered cells, myeloma cells, and hybridomas and other fused cells.

En prinsippiell fordel ved den foreliggende teknikk for dyrking av pattedyrceller som bruker gjennomsprøyting for gassutveksling, er at cellene blir forsynt med en rikelig gasstil-førsel. Således kan selv tette og voluminøse kulturer bli forsynt med oksygen og/eller karbondioksyd ved nivåer hvor gassutveksling ikke blir en vektbegrensende faktor. Dette er mulig fordi cellene er innkapslet i membraner og således er beskyttet fra den fysiske skade som normalt forårsakes av gjennomstrømningen. Gjennomstrømningen er en effektiv metode for å forsyne mediet med optimale konsentrasjoner av oksygen og karbondioksyd fordi en likevekt kan opprettes ved en terskel-hastighet for gjennomsprøyting mellom konsentrasjonen av gassene i den gjennomsprøytede gassen og konsentrasjonen av gassene i mediet. Oksygen og karbondioksydkonsentrasjoner i mediet kan således settes ved optimale nivåer ved å kontrollere deres konsentrasjoner i gassen som blir gjennomsprøytet. Behovet for dyrt kontroll- og gassmålingsutstyr blir derfor fjernet. Andre momenter, mål og fordeler ved oppfinnelsen vil vise seg for dem som er dyktige på området ved å lese de følgende krav og detaljerte spesifikasjoner sammen med tegningen. A principle advantage of the present technique for growing mammalian cells that uses perfusion for gas exchange is that the cells are supplied with an abundant supply of gas. Thus, even dense and voluminous cultures can be supplied with oxygen and/or carbon dioxide at levels where gas exchange does not become a weight-limiting factor. This is possible because the cells are enclosed in membranes and are thus protected from the physical damage normally caused by the flow. The flow-through is an efficient method of supplying the medium with optimal concentrations of oxygen and carbon dioxide because an equilibrium can be established at a threshold velocity for permeation between the concentration of the gases in the permeating gas and the concentration of the gases in the medium. Oxygen and carbon dioxide concentrations in the medium can thus be set at optimum levels by controlling their concentrations in the gas being injected. The need for expensive control and gas measurement equipment is therefore removed. Other points, objects and advantages of the invention will become apparent to those skilled in the art by reading the following claims and detailed specifications together with the drawings.

FIG. 1 illustrerer skjematisk pattedyrceller innkapsletFIG. 1 schematically illustrates mammalian cells encapsulated

i en mikrokapsel egnet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse; in a microcapsule suitable for use in the present invention;

FIG. 2 illustrerer skjematisk et cellekulturapparat egnet FIG. 2 schematically illustrates a suitable cell culture apparatus

for anvendelse i praktiseringen av oppfinnelsen; for use in the practice of the invention;

FIG. 3 er en grafisk fremstilling av totalantall cellerFIG. 3 is a graphical representation of the total number of cells

pr. milliliter medium i forhold til tiden av forskjel- per milliliters of medium in relation to the time of difference

lige porsjonstilførte kulturer med og uten gassgjen-nomsprøyting; FIG. 4 er en grafisk fremstilling av celler pr. milliliter av bunnfelte kapsler i forhold til tiden for en kontinuerlig tilført, gassgjennomsprøytet innkapslet kultur som illustrerer celletetthetene som er oppnå-elige /ved å bruke fremgangsmåten av oppfinnelsen; og FIG. 5 er en grafisk fremstilling lik fig. 4 som viser veksten av en porsjonstilført kultur. cultures added in equal portions with and without gas permeation; FIG. 4 is a graphic representation of cells per milliliters of bottomed capsules versus time for a continuously fed gas-permeated encapsulated culture illustrating the cell densities achievable using the method of the invention; and FIG. 5 is a graphical representation similar to fig. 4 showing the growth of an aliquoted culture.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på observasjonenThe present invention is based on the observation

at celler uten cellevegger, f.eks. pattedyrceller, innkapslet i semipermeable membraner, er immune overfor, fysisk skade og oksygentoksisitetsproblemer forårsaket av gjennomsprøyting, that cells without cell walls, e.g. mammalian cells, enclosed in semipermeable membranes, are immune to physical damage and oxygen toxicity problems caused by permeation,

og at gassgjennomsprøyting kan anvendes effektivt til å tilføre oksygen og/eller karbondioksyd til slike celler. Når man bruker metoden fra denne oppfinnelse, kan konsentrasjonen av oksygen og karbondioksyd balanseres til å gi optimale nivåer i et medium, og økte celleutbytter kan oppnås i store celledyrkingskar. Fordi G^- og CG^-konsentrasjonene i mediet vil være proporsjonale med deres konsentrasjon i den gjennornstrommete gassen, blir konsentrasjonskosntroll og dens medfølgende omkostning elimi-nert . and that gas injection can be used effectively to supply oxygen and/or carbon dioxide to such cells. When using the method of this invention, the concentration of oxygen and carbon dioxide can be balanced to provide optimal levels in a medium, and increased cell yields can be achieved in large cell culture vessels. Because the G^ and CG^ concentrations in the medium will be proportional to their concentration in the recirculated gas, concentration cost control and its associated costs are eliminated.

Idet vi vender oss til fig. 1, kan pattedyrceller 11 bli innkapslet i sfæroidale, typiske sfæriske kapsler 13 ved hjelp av fremgangsmåten fremsatt i US-patent nr. 4 352 883, hvis innhold det her henvises til. De vanlig foretrukne innkapslings-teknikkene blir forklart i den samtidig inngitte ansøkning nr. 85.0535. For innholdet refererer vi til denne ansøkning. Turning to fig. 1, mammalian cells 11 can be encapsulated in spheroidal, typical spherical capsules 13 by means of the method set forth in US Patent No. 4,352,883, the content of which is referred to here. The commonly preferred encapsulation techniques are explained in co-filed application No. 85,0535. For the content, we refer to this application.

En typisk innkapslingsfremgangsmåte involverer dannelse avA typical encapsulation method involves the formation of

en suspensjon som inneholder omtrent 10 celler/ml i 1% (volum/ vekt) natriumalginat (NaG-Kelco LV). Tettheten av cellene i suspensjonen vil bestemme antall celler pr. kapsel i den endelig produserte utsædskultur. Suspensjonen blir overført til et jethodeapparat som består av en beholder som har en øvre luftinntaksdyse og en f orlenget hul del som er friksjons-tilpasset inn i en stopper. En sprøyte, f .eks. en 10 cc sprøyte, utstyrt med en trinnvis pumpe, er montert på toppen av beholderen med en nål, f.eks. en 0,01 inch I.D. Teflondek- a suspension containing approximately 10 cells/ml in 1% (vol/wt) sodium alginate (NaG-Kelco LV). The density of the cells in the suspension will determine the number of cells per capsule in the final produced seed culture. The suspension is transferred to a jet head apparatus which consists of a container having an upper air intake nozzle and an elongated hollow part which is friction-fitted into a stopper. A syringe, e.g. a 10 cc syringe, fitted with a step-up pump, is fitted to the top of the container with a needle, e.g. a 0.01 inch I.D. Teflon cover

det nål, som passerer gjennom lengden av beholderen. Det indre av beholderen er utformet slik at toppen av nålen blir utsatt for en konstant laminær luftstrøm som virker som en luftkniv. the needle, which passes through the length of the container. The interior of the container is designed so that the top of the needle is exposed to a constant laminar air flow that acts like an air knife.

I anvendelse blir sprøyten som er full av løsningen som inneholder materialet som skal innkapsles, montert på toppen av beholderen, og den trinnvise pumpen blir aktivert til trinnvis å tvinge dråper av løsningen til toppen av nålen. Luftstrømmen "kutter av" hver dråpe, som så faller omtrent 2,5 - 3,5 cm ned i en 1,2% (vekt/volum) kalsiumkloridløsning, som danner gelmasser som blir oppsamlet ved aspirering. Gelmassene blir inkubert i tre kompletterte volumer av isotont saltvann for gelekspansjon i tilsammen omtrent 11 minutter. Deretter blir det dannet en membran rundt gelmassene vedkontakt med et 750 mg/liter poly-L-lysin (Sigma Chemical Company, 65 000 dalton molekylvekt) i isoton saltvannsløsning. Etter 12 minutters reaksjon, blir de resulterende kapsler vasket i 10 minutter med 1,4 g/l løsning av CHES (2-cykloheksylaminoetansulfansyre) buffer (Sigma) som inneholder 0,2% (vekt/volum) kalsiumklorid i saltvann. Kapslene blir vasket i ca. 8 minutter med 0,3% In use, the syringe full of the solution containing the material to be encapsulated is mounted on the top of the container, and the stage pump is actuated to incrementally force droplets of the solution to the top of the needle. The air stream "cuts off" each drop, which then falls approximately 2.5 - 3.5 cm into a 1.2% (w/v) calcium chloride solution, forming gel masses that are collected by aspiration. The gel masses are incubated in three completed volumes of isotonic saline for gel expansion for a total of approximately 11 minutes. A membrane is then formed around the gel masses by contact with a 750 mg/litre poly-L-lysine (Sigma Chemical Company, 65,000 dalton molecular weight) in isotonic saline solution. After 12 minutes of reaction, the resulting capsules are washed for 10 minutes with a 1.4 g/l solution of CHES (2-cyclohexylaminoethanesulfonic acid) buffer (Sigma) containing 0.2% (w/v) calcium chloride in saline. The capsules are washed for approx. 8 minutes with 0.3%

(vekt/volum) kalsiumklorid i saltvann og en membran nr. 2 blir dannet rundt kapslene ved en 10 minutters reaksjon med 105 (w/v) calcium chloride in salt water and a No. 2 membrane is formed around the capsules by a 10 minute reaction with 105

mg/l polyvinylamin (Polyscience, 50 000 - 150 000 dalton molekylvekt) i saltvann. Kapslene blir vasket igjen med to volumer isotont saltvann i 7 minutter og etterdekkes med en 7 minutters mg/l polyvinylamine (Polyscience, 50,000 - 150,000 dalton molecular weight) in salt water. The capsules are washed again with two volumes of isotonic saline for 7 minutes and covered with a 7-minute

_2 _2

nedsenkning i 5 x 10 % (vekt/volum) NaG i saltløsning. Kapslene blir vasket i enda 4 minutter i saltvann, så blir de in-trakapsulære volumer gjendannet til væske ved 2 neddykkinger i 55 millimolar natriumcitrat i saltløsning, den første i 20 minutter og den andre i 6 minutter. Kapslene blir vasket 2 ganger i saltvann og vasket 1 gang i 4 minutter i medium. Kapslene 13 er så ferdige til inkubering i et vekstmedium 16. immersion in 5 x 10% (w/v) NaG in saline. The capsules are washed for another 4 minutes in saline, then the intracapsular volumes are rehydrated by 2 immersions in 55 millimolar sodium citrate in saline, the first for 20 minutes and the second for 6 minutes. The capsules are washed twice in saline and washed once for 4 minutes in medium. The capsules 13 are then ready for incubation in a growth medium 16.

Kapslene slik som illustrert i fig. 1, fremstilt i henhold til denne innkapslingsmetode har membraner som er impermeable for høymolekylvektproteiner, bakterier og cellene som skal dyrkes. The capsules as illustrated in fig. 1, prepared according to this encapsulation method have membranes impermeable to high molecular weight proteins, bacteria and the cells to be cultured.

Fig. 2 illustrerer skjematisk et apparat for celledyrkingFig. 2 schematically illustrates an apparatus for cell cultivation

i henhold til oppfinnelsen. Det består av et 316L rustfritt stål elektropolert, 50 liters kar 10 tilpasset med et lokk according to the invention. It consists of a 316L stainless steel electropolished, 50 liter vessel 10 fitted with a lid

12. En motor 14 driver omdreiningsakselen 16 til å rotere propellene 18 og 20 som er plassert i kultur 22. Kultur 22 innbefatter et konvensjonelt medium slik som Eagle's modifiserte medium med tilsatt serum. Alternativt kan det bestå 12. A motor 14 drives the rotary shaft 16 to rotate the propellers 18 and 20 which are located in the culture 22. The culture 22 includes a conventional medium such as Eagle's modified medium with added serum. Alternatively, it can pass

av et hypertont medium som har en osmolaritet på omtrent 360 milliosmol av typen beskrevet herefter og beskrevet i større detalj i den sammenhørende søknad nr. 85.0533, of a hypertonic medium having an osmolarity of approximately 360 milliosmoles of the type described below and described in greater detail in the related application No. 85.0533,

inngitt på samme dato som denne, hvis innhold detentered on the same date as this, the contents of which there

er referert til her. En mengde kapsler slik som kapselen av-bildet i fig. 1 er suspendert i mediet. Typisk er kapslene sfæriske eller sfæroidale og har en diameter i størrelsesorden på mindre enn omtrent 2 mm. Kapslene som har en gjennomsnitts diameter i størrelsesorden på 0,8 mm virker godt. is referred to here. A quantity of capsules such as the capsule pictured in fig. 1 is suspended in the medium. Typically, the capsules are spherical or spheroidal and have a diameter on the order of less than about 2 mm. The capsules, which have an average diameter of around 0.8 mm, work well.

Gasskravene til cellene blir møtt ved å la en oksygen-The gas requirements of the cells are met by allowing an oxygen

og karbondioksydinneholdende gas passere gjennom sterilt filter 24, luftrør 26, og gjennomsprøytingshode 28. Gjennomsprøy-tingshodet 28 kan inneholde et 2,5 um mikroporøst porselensfil-ter . Til dyrking av dyreceller kan gassen bestå av 95% luft, and carbon dioxide-containing gas pass through sterile filter 24, air tube 26, and spray-through head 28. The spray-through head 28 may contain a 2.5 µm microporous porcelain filter. For growing animal cells, the gas can consist of 95% air,

5% CO ? (i volum). Gassbobler passerer fra gjennomsprøytingsho-det opp gjennom mediet blant kapslene. Gjennomsprøytingshastig-heten bør være tilstrekkelig til å opprettholde partialtrykket av oksygen i mediet likt med partialtrykket av oksygen i gassen. Trykket av oksygen i mediet kan derved settes til et nivå ved eller såvidt over det som cellene trenger for optimal vekst. 5% CO? (in volume). Gas bubbles pass from the spray head up through the medium between the capsules. The spray-through rate should be sufficient to maintain the partial pressure of oxygen in the medium equal to the partial pressure of oxygen in the gas. The pressure of oxygen in the medium can thereby be set to a level at or just above what the cells need for optimal growth.

På grunn av serumkomponenten i mediet, forårsaker gjennomsprøy-ting at skum samler seg i overvolumet 30 i kar 10. Imidlertid beskytter kapslene cellene fra dehydrering om de midlertidig skulle bli ført inn i skummet, og beskytter også cellene fra mekanisk skade. Således kan gassprøyting gjennom en innkapslet kultur tilfredsstille den økende cellepopulasjons behov for oksygen, og derved gjøre det mulig å oppnå ekstremt høye celletettheter. Gassen som går ut av kulturen, passerer gjennom utgangsåpning 32 og filter 34. En typisk gasstrømshastig-het for en 30 liters kultur er 0,2 standard kubikkfot pr. time. Due to the serum component of the medium, permeation causes foam to accumulate in the supervolume 30 of vessel 10. However, the capsules protect the cells from dehydration should they be temporarily introduced into the foam, and also protect the cells from mechanical damage. Thus, gas spraying through an encapsulated culture can satisfy the growing cell population's need for oxygen, thereby making it possible to achieve extremely high cell densities. The gas exiting the culture passes through outlet opening 32 and filter 34. A typical gas flow rate for a 30 liter culture is 0.2 standard cubic feet per hour.

Når man praktiserer oppfinnelsen på porsjonstilførselsmå-ten, blir mediet ganske enkelt utmålt ned i kar 10 sammen med mikrokapsler som inneholder utsædskulturen, og kulturen blir dyrket til maksimum tetthet ved gassgjennomsprøyting. Imidlertid er kanskje den beste måten å praktisere oppfinnelsen på å la medium passere gjennom kulturen ved å innføre en kontinuerlig eller periodevis strøm av medium inn i inngangsåpnin-gen 38, og tømme av medium gjennom filterelement 40. Filterelement 40 kan inneholde et rustfritt, mikroporøst nett som har porer mindre enn diameteren av kapslene, f.eks. 50 - 100um. Medium kan bli dratt med gjennom ventil 42. Nivået av medium When the invention is practiced in the portion feeding manner, the medium is simply metered into vessel 10 together with microcapsules containing the seed culture, and the culture is grown to maximum density by gas sparging. However, perhaps the best way to practice the invention is to allow medium to pass through the culture by introducing a continuous or periodic flow of medium into the inlet opening 38, and draining the medium through filter element 40. Filter element 40 may contain a stainless, microporous mesh. which have pores smaller than the diameter of the capsules, e.g. 50 - 100 µm. Medium can be entrained through valve 42. The level of medium

i kulturen kan observeres i det gjennomsiktige rør 44. En typisk hastighet av mediumstrøm i inngangsåpning 38 og ut gjennom filter 40 er 4 ml til 12 ml pr. minutt. in the culture can be observed in the transparent tube 44. A typical rate of medium flow in inlet opening 38 and out through filter 40 is 4 ml to 12 ml per minute.

Hvis man søker å høste inn proteiner eller andre stoffer produsert av cellene, vil metoden som anvendes avhenge av for-holdet mellom de effektive molekylstørrelser av stoffet av interesse og permeabiliteten av kapselmembranene. Som beskrevet i de ovenfor refererte patenter, kan permeabiliteten av kapselmembranene kontrolleres innen grenser. Hvis proteinet av interesse er for stort til å gå gjennom membranen, samler proteinene seg inne i mikrokapslene; hvis det er lite nok til å gå gjennom membranene, vil de samle seg i det ekstrakapsulære medium. If one seeks to harvest proteins or other substances produced by the cells, the method used will depend on the ratio between the effective molecular sizes of the substance of interest and the permeability of the capsule membranes. As described in the above-referenced patents, the permeability of the capsule membranes can be controlled within limits. If the protein of interest is too large to pass through the membrane, the proteins accumulate inside the microcapsules; if there is little enough to pass through the membranes, they will accumulate in the extracapsular medium.

I anvendelse bestemmer en systembruker en ønsket mengde oksygen og/eller karbondioksyd til å bli oppløst i medium 22. In application, a system user determines a desired amount of oxygen and/or carbon dioxide to be dissolved in medium 22.

De valgte gasskonsentrasjoner og proporsjoner avhenger av typen celler som dyrkes, men er uavhengig av strømning eller planlagt celletetthet. For de fleste dyreceller vil den ønskede konsentrasjon (partielt trykk) av oksygen være mellom omtrent 15 The chosen gas concentrations and proportions depend on the type of cells being cultured, but are independent of flow or planned cell density. For most animal cells, the desired concentration (partial pressure) of oxygen will be between approximately 15

og 200 mm Hg. For eksempel vil det valgte oksygenkonsentrasjons-nivå for en cellekultur være større enn det som er tilstrekkelig for å forsyne cellene med 0,12 mM/l/time/10 9 celler, det tidligere fastsatte omtrentlige minimumsbehov for kraftig cellevekst. and 200 mm Hg. For example, the selected oxygen concentration level for a cell culture will be greater than that which is sufficient to supply the cells with 0.12 mM/l/hour/10 9 cells, the previously determined approximate minimum requirement for vigorous cell growth.

Konsentrasjonen av gasser i mediet er proporsjonal med konsentrasjonen av gassene i den gjennomsprøytede gassen forut-satt at gjennomsprøytingshastigheten er tilstrekkelig høy til å dekke over variasjoner i G^/CC^-konsentrasjon forårsaket av cellerespirasjonsaktivitet. Ved et terskelnivå er gjennom-sprøytingshastigheten tilstrekkelig til å opprettholde en likevekt mellom gass og væskefåsene i kar 10. Systembrukeren kan følgelig sette gjennomsprøytingshastigheten til å tilføre den ønskede blanding av gasser til gjennomsprøytingshodet 28. Gjennomsprøytingshodet 28 tilfører så gassen til kultur 22 i en hastighet som opprettholder en konstant konsentrasjon oksygen i mediet. En slik gjennomsprøytingshastighet er 0,2 standard kubikkfot/time i et 30 liters dyrkingskar. Kapslene 13 beskytter cellene 11 i mediet mot mekanisk skade. Kapslene beskytter også cellene som kan bli transportert inn i skummet i overvolumet i karet, fra oksygenskade eller dehydratisering. The concentration of gases in the medium is proportional to the concentration of the gases in the permeated gas, provided that the permeation rate is sufficiently high to cover variations in G^/CC^ concentration caused by cell respiration activity. At a threshold level, the permeation rate is sufficient to maintain an equilibrium between gas and liquid pockets in vessel 10. Accordingly, the system user can set the permeation rate to supply the desired mixture of gases to the permeation head 28. The permeation head 28 then supplies the gas to culture 22 at a rate that maintains a constant concentration of oxygen in the medium. Such a spray-through rate is 0.2 standard cubic feet/hour in a 30 liter grow tank. The capsules 13 protect the cells 11 in the medium against mechanical damage. The capsules also protect the cells that can be transported into the foam in the excess volume in the tub, from oxygen damage or dehydration.

Således trenger oksygenkonsentrasjonen i mediet ikke å kontrolleres, fordi det etableres en likevekt mellom konsentrasjonen av gassene oppløst i medium 22 og de forutvalgte konsentrasjoner av gassene som sprøytes igjennom. Thus, the oxygen concentration in the medium does not need to be controlled, because an equilibrium is established between the concentration of the gases dissolved in medium 22 and the preselected concentrations of the gases that are sprayed through.

Gjennomsprøytingen fortsetter og cellene 11 i kapsleneThe perfusion continues and the cells 11 in the capsules

13 tillates å gjennomgå mitose. Til slutt, når cellekulturen har nådd den ønskede celletetthet, kan stoffene produsert av cellene, slik som antistoffer, bli høstet enten fra innsiden av kapslene eller fra det ekstrakapsulære medium. 13 is allowed to undergo mitosis. Finally, when the cell culture has reached the desired cell density, the substances produced by the cells, such as antibodies, can be harvested either from inside the capsules or from the extracapsular medium.

Gjennomsprøyting i et mikroinnkapslet cellekultursystem slik som beskrevet ovenfor, er blitt observert å understøtte en celletetthet på omtrent 5x10 gceller pr. ml av bunnfelte kapsler, eller omtrent 1x10 g celler pr. ml medium. Dette er en forbedring på omtrent 2 størrelsesordener i forhold til konvensjonelle dyrkingsteknikker. Bortsett fra å forbedre celleproduktutbyttet ved å øke celletettheten tillater gassgjen-nomsprøyting i henhold til oppfinnelsen dyrkingsteknikkene å bli opptrappet til kommersielle produksjonsnivåer. Inoculation in a microencapsulated cell culture system as described above has been observed to support a cell density of approximately 5x10 g cells per ml of bottomed capsules, or approximately 1x10 g of cells per ml medium. This is an improvement of approximately 2 orders of magnitude over conventional cultivation techniques. Apart from improving the cell product yield by increasing the cell density, gas permeation according to the invention allows the cultivation techniques to be scaled up to commercial production levels.

Således kan det ses at gjennomsprøyting gir forbedrede, effektive gassutvekslinger til mikroinnkapslede pattedyrceller. Thus, it can be seen that permeation provides improved, efficient gas exchanges to microencapsulated mammalian cells.

Oppfinnelsen vil bli videre forstått fra de følgende, ubegrensende eksempler. The invention will be further understood from the following, non-limiting examples.

EKSEMPEL 1EXAMPLE 1

Omtrent 800 ml bunnfelte kapsler som inneholder ca. 10<5>mus-mus hybridomceller pr. milliliter ble likt fordelt i tilstrekkelig medium til å utgjøre 2,3 liter volumer av innkapslede utsædskulturer. Samtidig ble 2,3 liter volumer av medium som inneholdt sammenlignbare antall av de samme celler pr. volumenhet av medium fremstilt. Mediet var standard Eagle's medium tilsatt 5% fetal bovinserum. De fire utsædskulturene ble dyrket med svak røring og uten tilsetninger til mediet i 10 dager. En innkapslet kultur og én uinnkapslet kultur ble gjennomsprøytet ved en hastighet på 0,3 standard kubikkfot pr. time i 4 dager, og 1,0 standard kubikkfot pr. time deretter. De to gjenværende utsædskulturene ble ikke gjennomsprøytet. Approximately 800 ml bottomed capsules containing approx. 10<5>mouse-mouse hybridoma cells per milliliters were equally distributed in sufficient medium to make up 2.3 liter volumes of encapsulated seed cultures. At the same time, 2.3 liter volumes of medium containing comparable numbers of the same cells per volume unit of medium produced. The medium was standard Eagle's medium supplemented with 5% fetal bovine serum. The four seed cultures were grown with gentle stirring and without additions to the medium for 10 days. One encapsulated culture and one unencapsulated culture were sprayed at a rate of 0.3 standard cubic feet per second. hour for 4 days, and 1.0 standard cubic feet per hour thereafter. The two remaining seed cultures were not inoculated.

Den gjennomsprøytede gassen besto av 5% CG^og 95% luft (i volum). Celletettheten i de henholdsvise kulturer ble kontrollert, og data ble plottet. Resultatene er vist i fig. 3. The injected gas consisted of 5% CG^ and 95% air (by volume). The cell density in the respective cultures was checked, and data was plotted. The results are shown in fig. 3.

Som det går frem av data, hadde den ugjennomsprøytede uinnkapslede kulturen etter 6 dager vokset til en celletetthet pa omtrent 8x10 5 celler/ml kultur, og den ugjennomsprøytede konvensjonelle cellekultur hadde vokst til en tetthet på omtrent 3x10 celler/ml. De gjennomsprøytede uinnkapslede og innkapslede kulturer hadde vokst til en tetthet på omtrent As shown by the data, after 6 days the uninoculated unencapsulated culture had grown to a cell density of approximately 8x10 5 cells/ml culture, and the uninoculated conventional cell culture had grown to a density of approximately 3x10 5 cells/ml. The inoculated unencapsulated and encapsulated cultures had grown to a density of approximately

6 6 6 6

1,5 x 10 celler/ml og 1,3 x 10 celler/ml, henholdsvis. Deretter falt celletettheten av både de ugjennomsprøytede og gjennom-sprøytede suspensjonskulturer hurtig, inntil på dag 10, tettheten av begge kulturer var mindre enn 2x10 5 celler pr. milliliter. Dette viser at gjennomsprøyting av uinnkapslede kulturer ikke har noen signifikant nytteeffekt sammenlignet med den samme kultur som anvender oksygen oppløst i mediet fra overvolumet. Den ugjennomsprøytede innkapslede kultur var bare mode-rat mer vellykket. Dens celletetthet var på omtrent 7 x 10~* celler/ml og gikk ned på dag 9. Den innkapslede, gjennomstrøm-mede kultur, i motsetning, viste en jevn økning i celletetthet fra dag 2 til dag 9, og celletettheten ble deretter opprettholdt på omtrent 3x10 celler/ml. Dette eksempel viser at levedyk-tigheten av celler og cellevekst blir fremmet i følsomme dyreceller hvis de blir dyrket i en gassgjennomsprøytet, innkapslet kultur, og at trinnene både for innkapsling og gjennomstrømning er nødvendige for å oppnå dette resultat. 1.5 x 10 cells/ml and 1.3 x 10 cells/ml, respectively. Thereafter, the cell density of both the uninoculated and inoculated suspension cultures fell rapidly, until on day 10, the density of both cultures was less than 2x10 5 cells per cell. milliliters. This shows that permeation of unencapsulated cultures has no significant beneficial effect compared to the same culture that uses oxygen dissolved in the medium from the excess volume. The uninoculated encapsulated culture was only moderately more successful. Its cell density was approximately 7 x 10~* cells/ml and decreased on day 9. The encapsulated, flow-through culture, in contrast, showed a steady increase in cell density from day 2 to day 9, and the cell density was then maintained at approximately 3x10 cells/ml. This example shows that cell viability and cell growth are promoted in susceptible animal cells if grown in a gas-permeated, encapsulated culture, and that both the encapsulation and flow-through steps are necessary to achieve this result.

EKSEMPEL 2EXAMPLE 2

To innkapslede hybridomcellekulturer ble fremstilt og suspendert i Eagle<1>s medium tilsatt 5% fetal bovinserum,- 100 ganger det normale jernionekonsentrasjon og 2 ganger den normale aminosyrekonsentrasjon. Mediet hadde et osmotisk trykk på omtrent 360 milliosmol. Kultur nr. 1 hadde en utgangscelletett-het på 5 x 10^ celler/ml kultur, ble tilført næring i 13 dager ved hjelp av sirkulering av.friskt medium på 6 ml/minutt, og deretter i 5 dager på 11 ml/minutt. Kultur nr. 2 (med en ut- gangscelletetthet på 1 x 10 celler/ml) fikk kontinuerlig næ-ringstilførsel på 4 ml/minutt i 9 dager, og ble porsjonstilført ved å utskifte 10 liter medium pr. dag på hver av dag 9 til 20. Begge kulturer ble gjennomsprøytet med luft i løpet av sin vekstcyklus med 0,2 standard kubikkfot pr. time. Celletettheten av hver kultur ble kontrollert. Resultatene er fremstilt i fig. 4 og 5. Som illustrert oppnådde den kontinuerlig til-førte kultur (fig. 4) ved og etter dag 17, en celletetthet på mellom 1x10 8 celler/ml av bunnfelte kapsler og 5 x 10<8>celler/ml av bunnfelte kapsler. Siden volumet av mediet var omtrent 5 ganger volumet av kapslene, betyr dette at celletettheten pr. milliliter kultur var mellom omtrent 5x10 7 og 1 x 10 celler/ml. Two encapsulated hybridoma cell cultures were prepared and suspended in Eagle<1>'s medium supplemented with 5% fetal bovine serum, 100 times the normal iron ion concentration and 2 times the normal amino acid concentration. The medium had an osmotic pressure of approximately 360 milliosmoles. Culture No. 1 had an initial cell density of 5 x 10 3 cells/ml culture, was fed for 13 days by circulating fresh medium at 6 ml/minute, and then for 5 days at 11 ml/minute. Culture no. 2 (with an initial cell density of 1 x 10 cells/ml) received a continuous nutrient supply of 4 ml/minute for 9 days, and was supplied in portions by replacing 10 liters of medium per day on each of days 9 through 20. Both cultures were aerated during their growth cycle at 0.2 standard cubic feet per hour. The cell density of each culture was checked. The results are presented in fig. 4 and 5. As illustrated, the continuously fed culture (Fig. 4) at and after day 17 achieved a cell density of between 1x10 8 cells/ml of bottomed capsules and 5 x 10<8> cells/ml of bottomed capsules. Since the volume of the medium was approximately 5 times the volume of the capsules, this means that the cell density per milliliters of culture was between approximately 5x10 7 and 1 x 10 cells/ml.

Som vist i fig. 5 oppnådde den porsjonstilførte kultur også en tetthet større enn 1x10 celler/ml av bunnfelte kapsler . As shown in fig. 5, the aliquoted culture also achieved a density greater than 1x10 cells/ml of bottomed capsules.

Fagmannen på området kan bestemme andre modifikasjoner eller variasjoner av fremgangsmåtene og produktene beskrevet her. Slike andre modifikasjoner og variasjoner er inkludert i de følgende krav. The person skilled in the art can determine other modifications or variations of the methods and products described herein. Such other modifications and variations are included in the following claims.

Claims

1. A method for growing cells that do not have a cell wall to high density, characterized by the following steps: A. direct injection of a gas through a growth medium, to supply said medium with a constant gas concentration sufficient to maintain viability and support mitosis of said cells, said cells being placed in spheroidal capsules suspended in said medium, said capsules having semipermeable membranes sufficient to protect said cells from physical damage and sufficiently permeable to allow passage of components needed to maintain viability and support mitosis of said cells; and B. to allow said cells to grow.

2. Method according to claim 1, characterized by an additional step which consists in harvesting substances that are produced by said cells either from the inside of the capsules or from said medium.

3. Method according to claim 1, characterized in that said cells are animal cells and said gas is an oxygen-containing gas.

4. Method according to claim 3, characterized in that said gas further contains carbon dioxide.

5. Method according to claim 3, characterized in that said cells include mammalian cells.

6. Method according to claim 3, characterized in that said oxygen-containing gas contains balanced amounts of oxygen and carbon dioxide sufficient to produce an optimal, constant oxygen and carbon dioxide concentration in said medium to support metabolism and promote mitosis in said cells.

7. Method according to claim 3, characterized in that the partial pressure of oxygen in said medium is within the range 15-200 mm Hg.

8. Method according to claim 3, characterized in that said animal cells include fused cells.

9. Method according to claim 3, characterized in that said animal cells include genetically engineered cells.

10. Method according to claim 3, characterized in that said animal cells include myeloma cells.

11. Method according to claim 3, characterized in that said animal cells are allowed to grow to a density of at least approximately 5 x 10 cells/ml culture.