DE3504748C2

DE3504748C2 -

Info

Publication number: DE3504748C2
Application number: DE3504748A
Authority: DE
Inventors: Randall G. Medfield Mass. Us Rupp
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-02-13
Filing date: 1985-02-12
Publication date: 1987-07-23
Also published as: FR2559500A1; DK65085D0; DK65085A; NO850534L; BE901702A; GB2154246B; IT1184884B; AU572608B2; JPS6110115B2; SE8500622D0; IT8567141A1; SE8500622L; DE3504748A1; GB2154246A; NL8500351A; AU3857185A; JPS60199380A; GB8503248D0; IT8567141A0

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von zerbrechlichen, proliferationsfähigen Zellen ohne Zellwände (vgl. den Oberbegriff des Anspruchs 1), wobei insbe sondere der Gasaustausch in Kulturen derartiger Zellen opti miert wird. Zellen, die im erfindungsgemäßen Verfahren kul tiviert werden können, sind Tierzellinien, wie verschiedene Myelomzellen, aus Primärkulturen, natürlich oder künstlich transformierte Zellinien, fusionierte Zellen, wie Hybridome oder bösartige Transformanden, und andere Zellen ohne Zell wände, wie Spheroplasten.The invention relates to a method for cultivating fragile cells capable of proliferation without cell walls (cf. the preamble of claim 1), wherein in particular especially the gas exchange in cultures of such cells opti is lubricated. Cells which cul in the method according to the invention Animal cell lines, like different ones, can be activated Myeloma cells, from primary cultures, natural or artificial transformed cell lines, fused cells such as hybridomas or malignant transformants, and other cells without cells walls, like spheroplasts.

Es ist wohl bekannt, daß Sauerstoff für die Kultivierung von Tierzellen wesentlich ist und daß die Sauerstoffmenge, die für die Diffusion in eine Zelle zur Verfügung steht, für die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen wichtig ist. It is well known that oxygen is used for cultivation of animal cells is essential and that the amount of oxygen, which is available for diffusion into a cell, is important for cell viability and growth.

Im allgemeinen kann zu wenig Sauerstoff die Zelle töten oder bestenfalls ihr Wachstum begrenzen. Beispielsweise be nötigen wachsende Hybridomkulturen mindestens etwa 0,12 mMol Sauerstoff/l/h/10⁹ Zellen. Steht weniger Sauerstoff zur Ver fügung, so sind die Mitose und die Proteinproduktion begrenzt. Zuviel Sauerstoff kann zur Vergiftung führen, wobei die Zelle durch Oxidation essentieller Proteine abstirbt. Die Geschwindig keit der Sauerstoffaufnahme einer Zellkultur erhöht sich mit dem Wachstum der Zellkultur; mit zunehmender Dichte der Zell kultur wird es immer schwieriger, dem Inneren der Kultur ent sprechende Mengen an Sauerstoff von der Kulturoberfläche zu zuführen.In general, too little oxygen can kill the cell or at best limit its growth. For example, growing hybridoma cultures require at least about 0.12 mmol oxygen / l / h / 10 ⁹ cells. If less oxygen is available, mitosis and protein production are limited. Too much oxygen can lead to poisoning, and the cell dies due to the oxidation of essential proteins. The rate of oxygen uptake of a cell culture increases with the growth of the cell culture; with increasing density of the cell culture, it becomes more and more difficult to supply the interior of the culture with appropriate amounts of oxygen from the culture surface.

Kohlendioxid, das den pH-Wert und die Dicarbonatkonzentration beeinflußt, wird ebenso für die Aufrechterhaltung des Wachs tums von Tierzellen benötigt; die Kontrolle des Kohlendioxids ist wesentlich, wenn größere Mengen an Zellen kultiviert wer den sollen.Carbon dioxide, which is the pH and the dicarbonate concentration is also influenced for the maintenance of the wax needs of animal cells; the control of carbon dioxide is essential if larger amounts of cells are cultivated that should.

In herkömmlichen Laboratoriumsverfahren zur Kultivierung von Säugerzellen werden die Zellen in einer Petrischale in einem Medium suspendiert. Sauerstoff und Kohlendioxid diffun dieren durch die Oberfläche des Mediums in die Zellen. Die Tiefe des Kulturmediums beeinflußt die Diffusionsgeschwindig keit von Sauerstoff und Kohlendioxid zu den Zellen. Mit zunehmender Mediumtiefe nimmt das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen des Mediums ab. Zu einem bestimmten Zeitpunkt sind die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration in der Luft über der Schale und/oder die Lösegeschwindigkeit in das Medium ungenügend, um das Gesamtvolumen des Mediums mit genügend Gas zu versorgen und die Erfordernisse der wachsenden Zellen zu befriedigen, d. h. der verfügbare Sauerstoff wird zum be grenzenden Wachstumsfaktor. Dementsprechend lehrt der Stand der Technik, daß die Tiefe des Mediums bei statischen Kultu ren im Bereich von mm liegen soll. Im allgemeinen beträgt die obere Grenze der Zelldichte für derartige Kulturen etwa 10⁵ Zellen/ml Kulturmedium, wenn die Luft über dem Kulturmedium als Sauerstoffversorgung verwendet wird.In conventional laboratory methods for cultivating mammalian cells, the cells are suspended in a petri dish in a medium. Oxygen and carbon dioxide diffuse through the surface of the medium into the cells. The depth of the culture medium affects the rate of diffusion of oxygen and carbon dioxide to the cells. The ratio of surface to volume of the medium decreases with increasing medium depth. At some point, the oxygen and carbon dioxide concentration in the air above the dish and / or the rate of dissolution into the medium are insufficient to supply the total volume of the medium with enough gas and to meet the needs of the growing cells, that is, the available oxygen to the limiting growth factor. Accordingly, the prior art teaches that the depth of the medium in static cultures should be in the range of mm. Generally, the upper limit of cell density for such cultures is about 10 ⁵ cells / ml culture medium when the air above the culture medium is used as an oxygen supply.

Werden Verfahren zur Kultivierung von Säugerzellen in groß technischem Maßstab durchgeführt, so ist es schwierig, aus reichende Sauerstoffmengen, die die Bedürfnisse der Zellen befriedigen, zur Verfügung zu stellen (siehe Glacken et al., "Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scale- up Trends in Biotechnology", Seite 102, Elsevier Science Publications, 0166-9430/83 (1983)). Die Lösung für dieses Problem ist die Erhöhung der Sauerstoff- und Kohlendioxid konzentrationen im Luftraum über der Mediumoberfläche bei steigender Zelldichte. Dabei kann jedoch zuviel Sauerstoff an die Mediumoberfläche gelangen und zu einer Vergiftung füh ren; außerdem muß die Sauerstoffkonzentration im Medium ständig von teuren Meßvorrichtungen und Sauerstoffsensoren überwacht und eingestellt werden, um optimale Gasmengen im Medium aufrechtzuerhalten.Processes for the cultivation of mammalian cells are large performed on a technical scale, so it is difficult to get out sufficient amounts of oxygen that meet the needs of the cells satisfy, to provide (see Glacken et al., "Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scale- up Trends in Biotechnology ", page 102, Elsevier Science Publications, 0166-9430 / 83 (1983)). The solution to this The problem is the increase in oxygen and carbon dioxide concentrations in the airspace above the medium surface increasing cell density. However, there can be too much oxygen reach the surface of the medium and lead to poisoning ren; in addition, the oxygen concentration in the medium constantly from expensive measuring devices and oxygen sensors monitored and adjusted to optimal gas levels maintain in the medium.

Bei der Kultivierung von Zellen mit Zellwänden, z. B. prokario tischen Zellen, werden Gase oft direkt durch das Medium ge perlt, um die Zellen mit den benötigten Gaskonzentrationen zu versorgen. Das direkte Durchperlen ist jedoch bei der Kultivierung von Zellen ohne Zellwand ungeeignet: Diese Zellen sind zerbrechlich und werden beim Durchperlen des Gases mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, um entsprechende Gaskonzentrationen im Medium aufrechtzuerhalten, physikalisch beschädigt. Auch bilden Proteinbestandteile des Mediums, die normalerweise in allen Tierzellkulturen notwendig sind, auf der Mediumoberfläche einen Schaum, der die Zellen ein fangen kann. Die in dem Schaum eingeschlossenen Zellen ster ben rasch ab. Schaumverhütungsmittel, die dem Medium zuge setzt werden können, sind jedoch gelegentlich für die Zellen der Kultur toxisch. When culturing cells with cell walls, e.g. B. procario table cells, gases are often ge directly through the medium pearls to the cells with the required gas concentrations to supply. The direct bubbling is with the Cultivation of cells unsuitable for cell walls: These Cells are fragile and become when the gas is bubbled through at a sufficient speed to make appropriate Maintaining gas concentrations in the medium, physically damaged. Also form protein components of the medium, that are normally necessary in all animal cell cultures, on the medium surface a foam that the cells can catch. The cells enclosed in the foam ster ben quickly. Anti-foaming agent that is added to the medium can occasionally be used for the cells culture toxic.

Neuere Entwicklungen auf dem Gebiet der Zellkultivierung beinhalten das Einschließen der Zellen in Kapseln aus Calcium alginat, um so höhere Zelldichten zu erreichen (siehe Glacken). Die US-PS 43 52 883 beschreibt die Einkapselung von Zellen, um sie vor schädlichen Stoffen, wie Bakterien, zu schützen. Die US-PS 44 09 331 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Produkten aus Tier- und anderen Zellen durch Isolieren dieser Produkte aus eingekapselten Zellkulturen, in denen die Zellen sich innerhalb semipermeabler Kapselmembranen be finden.Recent developments in the field of cell cultivation involve encapsulating the cells in calcium capsules alginate in order to achieve higher cell densities (see Glacken). The US-PS 43 52 883 describes the encapsulation of cells, to protect them from harmful substances such as bacteria. The US-PS 44 09 331 describes a method for extraction isolating products from animal and other cells of these products from encapsulated cell cultures in which the cells are located within semipermeable capsule membranes Find.

Aus dem Gesagten ist ersichtlich, daß es wünschenswert wäre, den Gasaustausch bei der Kultivierung von Säugerzellen oder anderen zerbrechlichen Zellen zu verbessern.From what has been said, it can be seen that it would be desirable the gas exchange in the cultivation of mammalian cells or to improve other fragile cells.

Aufgabe der Erfindung war es, die Gaskonzentration in einem Kulturmedium zu optimieren, ohne die Zellen zu beschädigen oder teure Überwachungsvorrichtungen notwendig zu machen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren zur großtechnischen Kultivierung von Zellen in hoher Dichte, beispielsweise 1 × 10⁸ Zellen/ml in Kulturen von 20-30 l, anzugeben, wobei bei Züchtung von Zellen ohne Zellwände, wie Tierzellen oder Spheroplasten, das für die Zellen not wendige Gas durch direktes Einleiten des Gases in das Medium ohne Beschädigung der Zellen zugeführt werden soll. Außerdem sollten Tierzellen in Dichten kultiviert werden, die mit Zelldichten von vielen Normalgrößen vergleichbar sind.The object of the invention was to optimize the gas concentration in a culture medium without damaging the cells or requiring expensive monitoring devices. A further object of the invention was to provide a method for the large-scale cultivation of cells in high density, for example 1 × 10 ⁸ cells / ml in cultures of 20-30 l, with the cultivation of cells without cell walls, such as animal cells or spheroplasts, the gas necessary for the cells is to be supplied by direct introduction of the gas into the medium without damaging the cells. In addition, animal cells should be cultivated in densities that are comparable to cell densities of many normal sizes.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß durch ein Verfahren zur Kulti vierung von in kugelförmige Kapseln mit einer semiper meablen Membran eingekapselten Zellen ohne Zellwänden in hoher Dichte gelöst, das gekennzeichnet ist durch das Durchperlen eines Gases durch das Wachstumsmedium, in dem die kugelförmigen Kapseln mit den semipermeablen Membranen suspendiert sind, mit einer solchen Geschwindigkeit, daß die Gaskonzentrationen des eingeleiteten Gases und die Gaskon zentrationen im Medium im Gleichgewicht sind und das Medium mit einer praktisch konstanten und für die Lebensfähigkeit und die Aufrechterhaltung der Mitose der Zellen ausreichen den Gaskonzentration versorgt wird. Die Ansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.According to the claim, the task is accomplished by a method of cultivation Vation of spherical capsules with a semiper encapsulated cells without cell walls dissolved in high density, that is characterized by the Bubbling a gas through the growth medium in which the spherical capsules with the semipermeable membranes are suspended at such a rate that the Gas concentrations of the introduced gas and the gas concentration concentrations in the medium are in balance and the medium with a practically constant and for viability and maintaining mitosis of the cells is sufficient the gas concentration is supplied. Claims 2 and 3 name configurations of this method.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Impfkultur der zu züchtenden Zellen in kugelförmigen Kapseln eingeschlossen, deren semipermeable Membranen die Zel len vor physikalischer Beschädigung schützen und wesentliche Nährstoffe durch lassen, wie Vitamine, Ionen oder Gase, die für das Wachstum der Zellen notwendig sind. Ein Gas, das von den Zellen be nötigte Bestandteile enthält, wird währed des Zellwachs tums direkt durch das Medium geperlt, entweder kontinuier lich oder diskontinuierlich, und zwischen den Kapseln ver teilt. Die Zusammensetzung des eingeleiteten Gases reicht aus, um eine praktisch konstante Sauerstoff- und/oder Kohlen dioxidkonzentration im Medium aufrechtzuerhalten, das heißt, eine Konzentration, die groß genug ist, um die Zellen mit Sauerstoff und/oder Kohlendioxid in Mengen, die für die Aufrechterhaltung der Zellmitose und des Zellmetabolismus gut geeignet sind, zu versorgen. Unter Anwendung herkömm licher Medien und des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, innerhalb der Kapseln Zellen mit Dichten im Bereich von 5 × 10⁸ Zellen/ml nicht suspendierter Kapseln zu züchten. Gegebenen falls können die von den Zellen produzierten Substanzen ent weder aus dem Inneren der Kapsel oder aus dem Medium gewonnen werden.In the method according to the invention, a seed culture of the cells to be grown is enclosed in spherical capsules, the semipermeable membranes of which protect the cells from physical damage and allow essential nutrients to pass through, such as vitamins, ions or gases, which are necessary for the growth of the cells. A gas containing constituents required by the cells is bubbled directly through the medium during cell growth, either continuously or discontinuously, and is distributed between the capsules. The composition of the gas introduced is sufficient to maintain a practically constant concentration of oxygen and / or carbon dioxide in the medium, that is to say a concentration which is large enough to supply the cells with oxygen and / or carbon dioxide in quantities necessary for the maintenance cell mitosis and cell metabolism are well suited to care. Using conventional media and the method according to the invention, it is possible to grow cells with densities in the range of 5 × 10 ⁸ cells / ml of non-suspended capsules within the capsules. If necessary, the substances produced by the cells can either be obtained from inside the capsule or from the medium.

In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Ver fahrens wird beim Züchten von Tierzellen ein Gas durchgeperlt, das ausgewogene und ausreichende Mengen an Sauerstoff und Kohlendioxid enthält, um im Medium einen gewünschten Sauer stoff-/Kohlendioxid-Gehalt aufrechtzuerhalten. Vorzugsweise ist der Gehalt an Sauerstoff und Kohlendioxid des Mediums so groß, daß das Zellwachstum innerhalb der Kapseln beschleu nigt wird und maximale Zelldichten erhalten werden. Das be deutet, daß der Sauerstoff in dem durchgeperlten Gas in Mengen von etwa 0,2 bis 598 mbar, vorzugsweise mindestens 20 bis 265 mbar und insbesondere für Säugerzellen 200 bis 226 mbar vor liegt.In preferred embodiments of the Ver a gas is bubbled through when breeding animal cells, the balanced and sufficient amounts of oxygen and Carbon dioxide contains a desired acid in the medium Maintain substance / carbon dioxide content. Preferably is the content of oxygen and carbon dioxide in the medium so large that the cell growth inside the capsules accelerates and maximum cell densities are obtained. That be indicates that the oxygen in the bubbled gas in quantities from about 0.2 to 598 mbar, preferably at least 20 to 265 mbar and in particular 200 to 226 mbar for mammalian cells lies.

Säugerzellen, die im erfindungsgemäßen Verfahren günstiger weise gezüchtet werden können, sind genetisch veränderte Zellen, Myelomzellen und Hybridome sowie andere fusionierte Zellen.Mammalian cells, which are cheaper in the method according to the invention can be grown wisely, are genetically modified cells, Myeloma cells and hybridomas as well as other fused cells.

Ein wesentliches Kennzeichen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kultivierung von Säugerzellen ist die Tatsache, daß die Zellen durch das Einleiten von Gas ausreichend mit Gas ver sorgt werden. Das heißt, das selbst dichte und voluminöse Kul turen mit Sauerstoff und/oder Kohlendioxid ausreichend ver sorgt werden können und der Gasaustausch nicht zum begrenzenden Wachstumsfaktor wird. Das ist durch die Einkapselung der Zellen in Membranen möglich, die sie vor der physikalischen Beschädi gung schützt, die normalerweise durch das Perlen des Gases verursacht wird. Das Durchperlen von Gas ist eine wirkungsvolle Methode, das Medium mit optimalen Konzentrationen an Sauer stoff und Kohlendioxid zu versorgen, da die Gaskonzentrationen im eingeleiteten Gas und die Gaskonzentrationen im Medium bei einem Grenzwert der Durchperlgeschwindigkeit im Gleichgewicht gehalten werden können. Die Sauerstoff- und Kohlendioxidkon zentrationen im Medium können auf diese Weise auf optimale Werte eingestellt werden, wenn man ihre Konzentrationen im eingeleiteten Gas überwacht. Teure Überwachungs- und Gasbe stimmungsvorrichtungen sind dadurch überflüssig. An essential characteristic of the method according to the invention for the cultivation of mammalian cells is the fact that the Sufficiently ver. Cells by introducing gas be worried. That is, the dense and voluminous Kul itself ture with oxygen and / or carbon dioxide can be taken care of and the gas exchange not to the limiting Growth factor. That is by encapsulating the cells possible in membranes that protect them from physical damage protection that is normally caused by the bubbling of the gas is caused. The bubbling of gas is an effective one Method, the medium with optimal concentrations of acid supply material and carbon dioxide because of the gas concentrations in the introduced gas and the gas concentrations in the medium a limit of the bubble rate in equilibrium can be held. The oxygen and carbon dioxide con In this way, concentrations in the medium can be optimized Values can be set if you look at their concentrations in the introduced gas monitored. Expensive surveillance and gas equipment This eliminates the need for mood devices.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren näher erläutert:The invention is illustrated by the following figures explains:

Fig. 1 ist die schematische Darstellung von Säugerzellen, die in einer für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Mikrokapsel eingeschlossen sind; Fig. 1 is a schematic representation of mammalian cells that are included in a form suitable for the inventive method microcapsule;

Fig. 2 ist die schematische Darstellung eines für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Apparats zur Zellkultivierung; Fig. 2 is a schematic representation of a suitable apparatus for the method for cell cultivation;

Fig. 3 stellt graphisch die Gesamtzellzahl je ml Medium gegen die Dauer verschiedener diskontinuierlicher Kulturen mit und ohne Durchperlen von Gas dar; Fig. 3 graphically represents the total number of cells per ml of medium versus the duration of various discontinuous cultures with and without gas bubbling;

Fig. 4 ist die graphische Darstellung der Zellzahl je ml nicht suspendierter Kapseln gegen die Dauer einer kontinuierlich gespeisten, eingekapselten Kultur unter Einleiten von Gas, wobei die im erfindungs gemäßen Verfahren erreichbaren Zelldichten dar gestellt sind; und Fig. 4 is a graphical representation of the cell number per ml of non-suspended capsules against the duration of a continuously fed, encapsulated culture while introducing gas, the cell densities achievable in the method according to the invention being shown; and

Fig. 5 ist eine der Fig. 4 entsprechende graphische Dar stellung des Wachstums einer diskontinuierlich gespeisten Kultur. FIG. 5 is a graphical representation of the growth of a batch fed culture corresponding to FIG. 4.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Beobachtung, daß Zellen ohne Zellwände, zum Beispiel Säugerzellen, die innerhalb semipermeablen Membranen eingekapselt sind, gegenüber beim Durchperlen von Gas verursachter physikalischer Beschädigung und Sauerstoffvergiftung praktisch immun sind. Außerdem kann das durchgeperlte Gas wirkungsvoll zur Ver sorgung der Zellen mit Sauerstoff und/oder Kohlendioxid eingesetzt werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren können die Konzentrationen an Sauerstoff und Kohlendioxid so ausge wogen werden, daß im Medium optimale Mengen vorhanden sind, wodurch erhöhte Zellausbeuten in Zellkulturgefäßen mit größe ren Abmessungen erreicht werden können. Da die Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen im Medium ihrer Konzentration im durchgeperlten Gas proportional sind, fallen die Über wachung der Gaskonzentration und die damit verbundenen Kosten weg.The method according to the invention is based on the observation that cells without cell walls, for example mammalian cells, which are encapsulated within semipermeable membranes, compared to physical caused by gas bubbling Damage and oxygen poisoning are practically immune. In addition, the bubbled gas can be used effectively for ver supply of cells with oxygen and / or carbon dioxide be used. In the method according to the invention so the concentrations of oxygen and carbon dioxide be weighed that optimal amounts are present in the medium, resulting in increased cell yields in large size cell culture vessels ren dimensions can be achieved. Since the oxygen and carbon dioxide concentrations in the medium of their concentration in the bubbled gas are proportional, the over falls monitoring of the gas concentration and the associated costs path.

Fig. 1 zeigt, daß Säugerzellen 11 in kugelförmigen und typi scherweise sphärischen Kapseln 13 gemäß dem Verfahren der US-PS 43 52 883 eingekapselt werden können. Ein bevorzugtes Verfahren zur Einkapselung von Säugerzellen ist in der DE-OS 35 04 724 (US-Anmeldung 5 79 494) beschrieben. Ein typisches Verfahren zur Einkapselung besteht in der Her stellung einer Suspension, die in 1% (1 g/100 ml Lösung) Natriumalginat (NaG-Kelco LV) etwa 10⁶ Zellen/ml enthält. Die Zelldichte dieser Suspension bestimmt schließlich die Zellzahl je Kapsel in der Impfkultur. Die Suspension wird in eine Spritzkopfvorrichtung übergeführt, die aus einem Gehäuse mit einer Lufteinlaßdüse oben und einem länglichen hohlen Reibungskörper, der in einen Stopfen eingepaßt ist, besteht. Eine Spritze und beispielsweise eine 10-ml-Spritze, die mit einer Stufenpumpe verbunden und mit einer Nadel, wie einer Teflon-beschichteten Nadel mit einem inneren Durch messer von 0,025 cm ausgerüstet ist, wird oben am Gehäuse angebracht, so daß die Nadel über die Länge des Gehäuses reicht. Das Innere des Gehäuses ist so ausgelegt, daß die Nadelspitze einem ständigen laminaren Luftstrom, der als Luftmesser wirkt, ausgesetzt ist. Bei der Verwendung wird die Spritze, die das einzuhüllende Material enthält, oben am Gehäuse angebracht; die Stufenpumpe drückt Tropfen der Lösung zur Spitze der Nadel, wo jeder Tropfen vom Luft strom abgeschnitten wird und etwa 2,5 bis 3,5 cm in eine 1,2%ige Calciumchloridlösung fällt. Es entstehen Gelklumpen, die durch Absaugen gesammelt werden. Die Gelklumpen werden zur Gelexpansion insgesamt etwa 11 min in isotone Natrium chloridlösung, die dreimal erneuert wird, eingebracht. Dann wird eine Membran um die Gelklumpen durch Inberührungbringen mit einer 750 mg/l Poly-L-lysin (mit einer Molekularmasse von 65 000 Dalton) enthaltender, isotoner Natriumchloridlösung gebildet. Nach einer Reaktionszeit von 12 min werden die entstandenen Kapseln 10 min mit einer 1,4 g/l 2-Cyclohexylaminoethan-sulfonsäure-Puffer und 0,2% Calciumchlorid enthaltenden Natriumchloridlösung gewaschen. Die Kapseln werden etwa 8 min mit einer 0,3% Calciumchlorid enthaltenden Natriumchloridlösung gewaschen; eine zweite Membran wird um die Kapseln gebildet und zwar durch 10 min langes Umsetzen mit einer 105 mg/l Polyvinylamin mit einer Molekularmasse von 50 000 bis 150 000 Dalton) enthaltenden Natriumchloridlösung. Die Kapseln werden zweimal mit isotoner Natriumchloridlösung im Verlauf von 7 min gewaschen und durch 7minütiges Eintauchen in eine 5 × 10^-2% Natriumalginat enthaltende Natriumchloridlösung nachbeschichtet. Die Kapseln werden weitere 4 min in Natrium chloridlösung gewaschen; der intrakapsuläre Raum wird durch zweimaliges Eintauchen, das erste Mal während 20 min und das zweite Mal während 6 min, in eine 55 mM (mMol/l) Natrium citrat enthaltende Natriumchloridlösung wieder verflüssigt. Die Kapseln 13 werden zweimal in Natriumchloridlösung und einmal während 4 min im Medium gewaschen; dann sind sie für die Inkubation in einem Wachstumsmedium 22 fertig. Fig. 1 shows that mammalian cells 11 can be encapsulated in spherical and typically spherical capsules 13 according to the method of US-PS 43 52 883. A preferred method for encapsulating mammalian cells is described in DE-OS 35 04 724 (US application 5 79 494). A typical method for encapsulation consists in the manufacture of a suspension which contains about 10 ⁶ cells / ml in 1% (1 g / 100 ml solution) sodium alginate (NaG-Kelco LV). The cell density of this suspension finally determines the number of cells per capsule in the inoculum. The suspension is transferred to a spray head device which consists of a housing with an air inlet nozzle at the top and an elongated hollow friction body which is fitted into a stopper. A syringe and, for example, a 10 ml syringe, which is connected to a step pump and is equipped with a needle, such as a Teflon-coated needle with an inner diameter of 0.025 cm, is attached to the top of the housing so that the needle passes over the Length of the case is sufficient. The interior of the housing is designed so that the needle tip is exposed to a constant laminar flow of air that acts as an air knife. In use, the syringe containing the material to be encased is attached to the top of the housing; the step pump pushes drops of the solution to the tip of the needle, where each drop is cut off by the air stream and falls about 2.5 to 3.5 cm into a 1.2% calcium chloride solution. Lumps of gel are formed, which are collected by suction. The gel clumps are introduced for a total of about 11 minutes in isotonic sodium chloride solution, which is renewed three times, for gel expansion. A membrane is then formed around the gel clumps by contacting it with an isotonic sodium chloride solution containing 750 mg / l poly-L-lysine (with a molecular mass of 65,000 daltons). After a reaction time of 12 minutes, the resulting capsules are washed for 10 minutes with a 1.4 g / l 2-cyclohexylaminoethane sulfonic acid buffer and sodium chloride solution containing 0.2% calcium chloride. The capsules are washed for about 8 minutes with a sodium chloride solution containing 0.3% calcium chloride; a second membrane is formed around the capsules by reacting for 10 minutes with a sodium chloride solution containing 105 mg / l polyvinylamine with a molecular mass of 50,000 to 150,000 daltons). The capsules are washed twice with isotonic sodium chloride solution over a period of 7 minutes and coated for a further 7 minutes by immersing them in a sodium chloride solution containing 5 × 10 ^-2 % sodium alginate. The capsules are washed for a further 4 minutes in sodium chloride solution; the intracapsular space is liquefied again by immersing twice, the first time for 20 min and the second time for 6 min, in a sodium chloride solution containing 55 mM (mmol / l) sodium citrate. The capsules 13 are washed twice in sodium chloride solution and once in the medium for 4 minutes; then they are ready for incubation in growth medium 22 .

Die in Fig. 1 dargestellten Kapseln, die nach diesem Verfahren hergestellt worden sind, haben Membranen, die für höher mole kulare Proteine, Bakterien und zu kultivierende Zellen prak tisch undurchlässig sind.The capsules shown in Fig. 1, which have been produced by this method, have membranes that are practically impermeable to higher molecular proteins, bacteria and cells to be cultivated.

Fig. 2 stellt schematisch eine Vorrichtung zur Zellkultivie rung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren dar. Die Vorrich tung besteht aus einem elektropolierten, 50 l fassenden Gefäß 10 aus rostfreiem Stahl, das mit einer Kopfplatte 12 verschlossen ist. Ein Motor 14 treibt den Rührerschaft 16 und die sich im Wachstumsmedium 22 befindenden Schaufeln 18 und 20 an. Das Wachstumsmedium 22 ist ein herkömmliches Medium, wie ein modifiziertes Eagle-Medium mit zugesetztem Serum. Es kann aber auch ein hypertones Medium mit einer Osmolarität von etwa 360 mOsmol sein, wie es in der DE-OS 35 04 715 (US-Anmeldung 5 79 492) beschrieben ist. Eine Vielzahl von Kapseln, wie sie in Fig. 1 dargestellt sind, werden in dem Medium suspendiert. Typischerweise sind die Kapseln sphärisch oder kugelförmig und haben einen Durchmesser unter etwa 2 mm. Kapseln mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,8 mm sind gut geeignet. Fig. 2 shows schematically a device for cell cultivation tion according to the inventive method. The Vorrich device consists of an electropolished, 50 l holding vessel 10 made of stainless steel, which is closed with a top plate 12 . A motor 14 drives the stirrer shaft 16 and the blades 18 and 20 located in the growth medium 22 . The growth medium 22 is a conventional medium, such as a modified Eagle medium with serum added. However, it can also be a hypertonic medium with an osmolarity of approximately 360 mOsmol, as described in DE-OS 35 04 715 (US application 5 79 492). A variety of capsules as shown in Fig. 1 are suspended in the medium. Typically, the capsules are spherical or spherical and are less than about 2 mm in diameter. Capsules with an average diameter of about 0.8 mm are well suited.

Das von den Zellen benötigte Gas wird durch Einleiten eines Sauerstoff- und Kohlendioxid enthaltenden Gas durch ein steriles Filter 24, ein Luftrohr 26 und eine Gasfritte 28 zugeführt. Die Gasfritte 28 kann ein Porzellanfilter mit Mikroporen von 2,5 µm sein. Für das Wachstum von Tierzellen kann das Gas 95 Vol.-% Luft und 5% Kohlendioxid enthalten. Die Gasblasen aus der Gasfritte steigen durch das Medium zwischen den Kapseln auf. Die Perlgeschwindigkeit sollte ausreichen, um einen Sauerstoffpartialdruck im Medium auf rechtzuerhalten, der praktisch mit dem Sauerstoffpartialdruck im Gas im Gleichgewicht ist. Der Sauerstoffdruck im Medium kann somit auf einen Wert eingestellt werden, der dem Wert entspricht oder etwa darüber liegt, den die Zellen für optimales Wachs tum benötigen. Da im Medium Serumbestandteile vorhanden sind, entsteht durch das Durchperlen des Gases ein Schaum, der sich im Raum 30 über dem Medium des Gefäßes 10 sammelt. Sollten die Zellen vorübergehend in den Schaum transpor tiert werden, so sind sie durch die Kapseln vor der Hydrata tion und mechanischer Beschädigung geschützt. Auf diese Weise kann das Durchperlen von Gas durch eine Kultur in Kapselform den Sauerstoffbedarf einer wachsenden Zellpopulation befriedigen, wodurch extrem hohe Zelldichten erhalten werden können. Das Gas verläßt die Kultur durch den Ausgang 32 und das Filter 34. Ein typischer Gasdurchsatz für eine 30-l-Kultur beträgt 5,6 l/h.The gas required by the cells is supplied by introducing a gas containing oxygen and carbon dioxide through a sterile filter 24 , an air tube 26 and a gas frit 28 . The gas frit 28 can be a porcelain filter with micro pores of 2.5 μm. For the growth of animal cells, the gas can contain 95% by volume of air and 5% of carbon dioxide. The gas bubbles from the gas frit rise through the medium between the capsules. The bead velocity should be sufficient to maintain an oxygen partial pressure in the medium that is practically in equilibrium with the oxygen partial pressure in the gas. The oxygen pressure in the medium can thus be set to a value that corresponds to or is about the value that the cells need for optimal growth. Since serum constituents are present in the medium, the gas is bubbled through to form a foam which collects in the space 30 above the medium of the vessel 10 . If the cells are temporarily transported into the foam, the capsules protect them from hydration and mechanical damage. In this way, the bubbling of gas through a capsule-shaped culture can satisfy the oxygen demand of a growing cell population, whereby extremely high cell densities can be obtained. The gas leaves the culture through the outlet 32 and the filter 34 . A typical gas throughput for a 30 l culture is 5.6 l / h.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren chargenweise durchgeführt, so wird das Medium einfach zusammen mit den, die Impfkultur enthaltenden Mikrokapseln in das Gefäß 10 eingebracht; die Kultur wird mit durchperlendem Gas bis zur maximalen Dichte gezüchtet. Die beste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die, Medium durch die Kultur zu leiten und zwar durch Einführen eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Mediumstroms durch den Einlaß 38 und Abziehen des Mediums durch das Filterelement 40. Das Filter element 40 kann aus einem Sieb aus rostfreiem Stahl mit Poren, die kleiner als der Durchmesser der Kapseln sind, z. B. 50-100 µm, bestehen. Das Medium kann durch das Ventil 42 abgezogen werden. Die Höhe des Mediums in der Kultur kann durch das durchsichtige Rohr 44 beobachtet werden. Ein typi scher Durchsatz für das Medium, das durch den Einlaß 38 ein und durch das Filterelement 40 austritt, beträgt 4 bis 12 ml/min.If the method according to the invention is carried out in batches, the medium is simply introduced into the vessel 10 together with the microcapsules containing the inoculum; the culture is grown to maximum density with bubbling gas. The best embodiment of the method according to the invention is to pass medium through the culture by introducing a continuous or discontinuous flow of medium through inlet 38 and withdrawing the medium through filter element 40 . The filter element 40 can be made of a stainless steel sieve with pores that are smaller than the diameter of the capsules, for. B. 50-100 microns exist. The medium can be drawn off through the valve 42 . The height of the medium in the culture can be observed through the transparent tube 44 . A typical throughput for the medium which exits through the inlet 38 and out through the filter element 40 is 4 to 12 ml / min.

Sollen von den Zellen produzierte Proteine oder andere Substanzen gewonnen werden, so hängt die Durchführung des Verfahrens vom Verhältnis der effektiven Molekülgröße der interessierenden Substanz und der Permeabilität der Kapsel membran ab. Wie in den oben angegebenen Druckschriften be schrieben wird, kann die Permeabilität der Kapselmembranen innerhalb gewisser Grenzen eingestellt werden. Ist das interes sierende Protein zu groß, um die Membran zu passieren, so reichert es sich innerhalb der Mikrokapsel an; ist es für einen Durchgang durch die Membran klein genug, so sammelt es sich im extrakapsulären Raum an. Should proteins or others produced by the cells Substances are obtained, so the implementation of the Method of the ratio of the effective molecular size the substance of interest and the permeability of the capsule membrane. As in the publications cited above is written, the permeability of the capsule membranes can be set within certain limits. Is that interesting protein too large to pass through the membrane, so it accumulates inside the microcapsule; it is for one Passage through the membrane small enough so it collects in the extracapsular space.

In der Praxis bestimmt der Fachmann die gewünschte, in dem Wachstumsmedium 22 zu lösende Menge an Sauerstoff und/oder Kohlendioxid. Die gewählten Gaskonzentrationen und -Anteile hängen von der Art der zu kultivierenden Zellen ab, sie sind jedoch unabhängig von der vorhandenen oder beabsichtigten Zelldichte. Bei den meisten Tierzellen liegt die gewünschte Sauerstoffkonzentration (Partialdruck) zwischen 20 bis 266 mbar. So ist beispielsweise die gewählte Sauerstoffkonzentration für eine Zellkultur größer als die, die früher als Mindest bedarf für ein starkes Zellwachstum angegeben wurde, nämlich 0,12 mMol Sauerstoff/l/h/10⁹ Zellen.In practice, those skilled in the art determine the desired amount of oxygen and / or carbon dioxide to be dissolved in the growth medium 22 . The selected gas concentrations and proportions depend on the type of cells to be cultivated, but they are independent of the existing or intended cell density. For most animal cells, the desired oxygen concentration (partial pressure) is between 20 to 266 mbar. For example, the selected oxygen concentration for a cell culture is greater than that which was previously specified as the minimum requirement for strong cell growth, namely 0.12 mmol oxygen / l / h / 10 ⁹ cells.

Die Konzentration der Gase im Medium hängt praktisch von der Konzentration der Gase im durchgeperlten Gas ab, vorausgesetzt, die Einleitgeschwindigkeit ist hoch genug, um Schwankungen der Sauerstoff/Kohlendioxid-Konzentration, die durch die Zell atmung verursacht werden, auszugleichen. Als Grenzwert sollte die Einleitgeschwindigkeit groß genug sein, um ein Gleichge wicht zwischen dem Gas und der flüssigen Phase im Gefäß 10 aufrechtzuerhalten. Das gewünschte Gasgemisch kann mit der gewählten Einleitgeschwindigkeit der Gasfritte 28 zugeführt werden, die das Gas im Wachstumsmedium 22 mit einer solchen Ge schwindigkeit abgibt, daß praktisch eine konstante Sauerstoff konzentration im Medium vorhanden ist. Für ein 30 l fassendes Kulturgefäß ist eine geeignete Einleitgeschwindigkeit 5,6 l/h. Die Kapseln 13 schützen die Zellen 11 im Medium vor mechanischer Beschädigung, Sauerstoff vergiftung oder Dehydratation, wenn die Zellen in den Schaum im Luftraum über dem Medium transportiert werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren muß die Sauerstoffkonzentration des Mediums nicht überwacht werden, da sich ein Gleichgewicht zwischen den Konzentrationen der im Wachstumsmedium 22 gelösten Gase und den vorgewählten Konzentrationen der durchgeperlten Gasen einstellt. The concentration of the gases in the medium practically depends on the concentration of the gases in the bubbled gas, provided that the introduction speed is high enough to compensate for fluctuations in the oxygen / carbon dioxide concentration caused by cell respiration. As a limit, the introduction rate should be high enough to maintain a balance between the gas and the liquid phase in the vessel 10 . The desired gas mixture can be supplied at the selected rate of introduction of the gas frit 28 , which releases the gas in the growth medium 22 at such a speed that practically a constant oxygen concentration is present in the medium. For a 30-liter culture vessel, a suitable discharge rate is 5.6 l / h. The capsules 13 protect the cells 11 in the medium from mechanical damage, oxygen poisoning or dehydration when the cells are transported into the foam in the air space above the medium. In the method according to the invention, the oxygen concentration of the medium does not have to be monitored, since a balance is established between the concentrations of the gases dissolved in the growth medium 22 and the preselected concentrations of the bubbled gases.

Bei fortdauerndem Durchperlen des Gases tritt bei den Zellen 11 innerhalb der Kapseln 13 Mitose auf. Hat die Zellkultur die gewünschte Zelldichte erreicht, so können die von den Zellen produzierten Substanzen, wie Antikörper, entweder aus dem Inneren der Zellen oder aus dem extrakapsulären Medium gewonnen werden.With continued bubbling of the gas, mitosis occurs in the cells 11 within the capsules 13 . When the cell culture has reached the desired cell density, the substances produced by the cells, such as antibodies, can either be obtained from inside the cells or from the extracapsular medium.

Durch das Einleiten von Gas in eine Zellkultur in Mikrokapsel form im erfindungsgemäßen Verfahren können Zelldichten von etwa 5 × 10⁸ Zellen/ml nicht suspendierter Kapseln oder etwa 1 × 10⁸ Zellen/ml Kulturmedium erreicht werden. Das bedeutet eine Verbesserung von etwa zwei Größenordnungen gegenüber herkömmlichen Kultivierungsverfahren. Neben der höheren Zell produktausbeute durch Erhöhung der Zelldichte gestattet das erfindungsgemäße Verfahren die Kultivierung von Zellen in großtechnischem Maßstab, da das erfindungsgemäße Durchperlen von Gas durch ein Kulturmedium einen wirkungsvollen Gasaus tausch für Säugerzellen in Mikrokapselform bringt.By introducing gas into a cell culture in microcapsule form in the process according to the invention, cell densities of about 5 × 10 ⁸ cells / ml of unsuspended capsules or about 1 × 10 ⁸ cells / ml of culture medium can be achieved. This means an improvement of approximately two orders of magnitude over conventional cultivation methods. In addition to the higher cell product yield by increasing the cell density, the method according to the invention permits the cultivation of cells on an industrial scale, since the bubbling of gas according to the invention through a culture medium brings about an effective gas exchange for mammalian cells in microcapsule form.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

example 1

Etwa 800 ml nicht suspendierter Kapseln, die je ml etwa 10⁵ Maus- Hybridomzellen enthalten, werden gleichmäßig in genügend Medium verteilt, um zwei Impfkulturen in Kapselform mit einem Volumen von 3 l herzustellen. Gleichzeitig werden zwei Medien mit einem Volumen von 3 l hergestellt, die eine entsprechende Anzahl der gleichen Zellen je Volumeneinheit des Mediums enthalten. Als Medium wird Standard-Eagles Medium verwendet, dem 5% embryonales Kälberserum zugegeben worden ist. Die vier Impfkulturen werden unter schwachem Rühren und ohne Zugabe von frischen Medium 10 Tage kulti viert. Durch eine eingekapselte und eine nicht eingekapselte Kultur wird während 5 Tagen Gas mit einer Geschwindigkeit von 8,5 l/h und dann von 2,8 l/h durchgeperlt. Die beiden anderen Impfkulturen werden nicht begast. Das eingeleitete Gas besteht aus 5 Vol.-% Kohlendioxid und 95 Vol.-% Luft. Die Zelldichte der Kulturen wird bestimmt, die Ergebnisse sind in Fig. 3 angegeben.About 800 ml of unsuspended capsules, which contain about 10 ⁵ mouse hybridoma cells per ml, are evenly distributed in sufficient medium to produce two capsule-shaped inoculum cultures with a volume of 3 l. At the same time, two media with a volume of 3 l are produced, which contain a corresponding number of the same cells per unit volume of the medium. Standard Eagles medium to which 5% embryonic calf serum has been added is used as the medium. The four inoculum cultures are cultured for 10 days with gentle stirring and without the addition of fresh medium. Gas is bubbled through an encapsulated and an unencapsulated culture for 5 days at a rate of 8.5 l / h and then of 2.8 l / h. The other two vaccination cultures are not fumigated. The gas introduced consists of 5 vol.% Carbon dioxide and 95 vol.% Air. The cell density of the cultures is determined, the results are shown in FIG. 3.

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß nach 6 Tagen die nicht begaste, eingekapselte Kultur auf eine Zelldichte von 8 × 10⁵ Zellen/ml Kultur und die nicht begaste, herkömmliche Zellkultur auf eine Dichte von 3 × 10⁶ Zellen/ml gewachsen war. Die begaste, nicht eingekapselte und die begaste, eingekapselte Kultur erreichten eine Dichte von 1,5 × 10⁶ bzw. 1,3 × 10⁶ Zellen/ml. Danach fiel die Zelldichte sowohl der nicht begasten als auch der begasten Suspensionskultur rasch ab, bis am 10. Tag die Dichte beider Kulturen unter 2 × 10⁵Zellen/ml lag. Das zeigt, daß das Durchperlen von Gas durch nicht eingekapselte Kulturen keine deutlich günstigere Wirkung hat, wenn man sie mit der gleichen Kultur vergleicht, die im Medium gelösten Sauerstoff aus dem Luftraum verwertet. Die nicht begaste, eingekapselte Kultur ist nur geringfügig ertragreicher, die Zelldichte beträgt etwa 7 × 10⁵ Zellen/ml und nimmt am 9. Tag ab. Im Gegensatz dazu steigt die Zelldichte der eingekapselten, begasten Kultur vom 2. Tag bis zum 9. Tag an, die Zelldichte bleibt danach auf etwa 3 × 10⁶ Zellen/ml. Dieses Beispiel zeigt, daß die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen in empfindlichen Tierzellen beschleunigt wird, wenn durch die Kultur in Kapselform Gas geperlt wird, und daß sowohl die Einkapselung als auch das Durchperlen des Gases dafür notwendig sind.From Fig. 3 it can be seen that after 6 days the non-fumigated, encapsulated culture had grown to a cell density of 8 × 10 ⁵ cells / ml culture and the non-fumigated, conventional cell culture had grown to a density of 3 × 10 ⁶ cells / ml. The fumigated, non-encapsulated and the fumigated, encapsulated culture reached a density of 1.5 × 10 ⁶ and 1.3 × 10 ⁶ cells / ml. Thereafter, the cell density of both the non-fumigated and the fumigated suspension culture dropped rapidly until the density of both cultures was below 2 × 10 ⁵ cells / ml on the 10th day. This shows that the bubbling of gas through cultures which are not encapsulated does not have a significantly more favorable effect if they are compared with the same culture which utilizes oxygen from the air space dissolved in the medium. The encapsulated culture which is not fumigated is only slightly more productive, the cell density is about 7 × 10 ⁵ cells / ml and decreases on the 9th day. In contrast, the cell density of the encapsulated, fumigated culture increases from the 2nd day to the 9th day, the cell density thereafter remains at approximately 3 × 10 ⁶ cells / ml. This example shows that the viability and growth of cells in sensitive animal cells is accelerated when gas is bubbled through the culture in capsule form and that both encapsulation and bubbling of the gas are necessary for this.

Example 2

Zwei eingekapselte Hybridomzellkulturen werden in Eagle- Medium, das mit 5% embryonalem Kälberserum, dem 100fachen der Normalkonzentration an Eisen(III)-Ionen und der doppelten Normalkonzentration an Aminosäuren versetzt worden ist, suspendiert. Das Medium hat einen osmotischen Druck von etwa 360 mOsmol. Die Kultur 1 hat eine Anfangszelldichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml Kultur. Dieser Kultur wird während 13 Tagen frisches Medium mit einem Durchsatz von 6 ml/min und dann 5 Tage lang mit einem Durchsatz von 11 ml/min zugeführt. Der Kultur 2 (mit einer Anfangszelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml) wird 9 Tage lang frisches Medium mit einem Durchsatz von 4 ml/min und dann chargenweise durch Ersatz von 10 l Medium pro Tag an jedem der Tage 9 bis 20 zugeführt. Durch beide Kulturen wird während des Wachstums zyklus Luft mit einer Geschwindigkeit von 5,6 l/h duchgeperlt. Die Zelldichte jeder Kultur wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 4 und 5 angegeben. Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß die kontinuier lich gespeiste Kultur am und nach dem 17. Tag eine Zelldichte von 1 × 10⁸ bis 5 × 10⁸ Zellen/ml nicht suspendierten Kapseln erreicht. Da das Volumen des Mediums etwa 5mal größer ist als das Volumen der Kapseln, bedeutet dies, daß die Zell dichte je ml Kultur etwa 2 × 10⁷ bis 1 × 10⁸ Zellen/ml beträgt.Two encapsulated hybridoma cell cultures are suspended in Eagle medium which has been treated with 5% embryonic calf serum, 100 times the normal concentration of iron (III) ions and twice the normal concentration of amino acids. The medium has an osmotic pressure of approximately 360 mOsmol. Culture 1 has an initial cell density of 5 × 10 ⁵ cells / ml culture. This culture is fed with fresh medium at a rate of 6 ml / min for 13 days and then at a rate of 11 ml / min for 5 days. Culture 2 (with an initial cell density of 1 × 10 ⁶ cells / ml) is supplied with fresh medium at a throughput of 4 ml / min for 9 days and then batchwise by replacing 10 l of medium per day on each of days 9 to 20. Air is bubbled through both cultures at a rate of 5.6 l / h during the growth cycle. The cell density of each culture is determined. The results are shown in Figs. 4 and 5. From Fig. 4 it can be seen that the continuously Lich fed culture reaches a cell density of 1 × 10 ⁸ to 5 × 10 ⁸ cells / ml of capsules not suspended on and after the 17th day. Since the volume of the medium is about 5 times larger than the volume of the capsules, this means that the cell density per ml of culture is about 2 × 10 ⁷ to 1 × 10 ⁸ cells / ml.

Aus Fig. 5 ist ersichtlich, daß die chargenweise gespeiste Kultur auch eine Dichte über 1 × 10⁸ Zellen/ml nicht suspen dierter Kapseln erreicht.From Fig. 5 it can be seen that the batch-fed culture also reaches a density above 1 × 10 ⁸ cells / ml of non-suspended capsules.

Claims

1. A method of culturing cells encapsulated in spherical capsules with a semipermeable membrane without cell walls in high density, characterized by bubbling a gas through the growth medium in which the spherical capsules with the semipermeable membranes are suspended at such a rate that the Gas concentrations of the introduced gas and the gas concentrations in the medium are in equilibrium and the medium is supplied with a practically constant gas concentration sufficient for the viability and maintenance of the mitosis of the cells.

2. The method according to claim 1, marked by Use of a gas with an oxygen partial pressure in the medium from 20 to 265 mbar.

3. The method according to claim 1 or 2, marked by Cultivation of fused cells, genetically modified Cells or myeloma cells.