DE3509210C2

DE3509210C2 -

Info

Publication number: DE3509210C2
Application number: DE3509210A
Authority: DE
Inventors: Allan P. Newburyport Mass. Us Jarvis; George A. Medfield Mass. Us Koch; Paul G. Washington D.C. Us Abrams
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-05-24
Filing date: 1985-03-14
Publication date: 1988-03-31
Also published as: DK57885D0; SE8405105L; JPS60250256A; GB8428320D0; GB2159171A; DE3509210A1; IT8468287A0; AU3450684A; IT1179899B; DK57885A; NL8500451A; BE902457A; SE8405105D0; FR2564858A1; IL73344A0

Description

Die Erfindung betrifft die Selektion von Zellen, die eine bestimmte, angestrebte Substanz sezernieren, aus einer heterogenen Zellpopulation und insbesondere ein einfacheres Screeningverfahren für solche Zellkulturen einschließlich Rekombinant-DNA- und Hybridomverschmelzungsprodukten zur Selektion lebensfähiger Zellen, die die betreffende spezielle Substanz ausscheiden.The invention relates to the selection of cells that secrete a certain targeted substance from a heterogeneous cell population and in particular a simpler screening process for such cell cultures including recombinant DNA and hybridoma fusion products more viable for selection Cells that secrete the specific substance in question.

Die jüngsten Fortschritte bei der Herstellung und Modifizierung von biologischem Material, beispielsweise beim sog. Genetic Engineering sowie der Erzeugung monoklonaler Antikörper nach dem Hybridomverfahren, führten zu der Notwendigkeit, individuelle Zellen, die bestimmte Substanzen produzieren, identifizieren zu können.The latest advances in manufacturing and modification of biological material, for example in so-called genetic engineering and the production of monoclonal antibodies after Hybridoma procedures, led to the need individual cells that contain certain substances produce, identify.

Bei der Herstellung monoklonaler Antikörper wird beispielsweise eine heterogene Zellkultur, in der auch mindestens eine Zelle vorliegt, welche den betreffenden speziellen Antikörper erzeugt, mit einer immortalen Zellinie, beispielsweise Myelomzellen, verschmolzen. Auch unter den günstigsten Bedingungen ist dieses Verschmelzungsverfahren nur teilweise erfolgreich, da einige Zellen nicht verschmelzen, andere Zellen der Kultur statt mit den Myelomzellen miteinander verschmelzen und auch Verschmelzungen von Myelomzellen untereinander vorkommen. Selbst wenn angenommen wird, daß sämtliche Zellen der Zellkultur mit Myelomzellen verschmelzen, produzieren doch nur wenige Verschmelzungsprodukte die betreffende angestrebte Substanz. Demzufolge besteht Bedarf an einem Screening-Verfahren zur sicheren Selektion bestimmter spezieller Verschmelzungsprodukte. Eines der üblicherweise hierzu verwendeten Screening-Verfahren besteht in der Kultivierung der Zellen aus dem Verschmelzungsgemisch in Mikrotitrierschalen, dem Test der Flüssigkeit jedes Compartments der Mikrotitrierschalen auf die betreffende angestrebte Substanz und der Weiterkultivierung der Zellen jedes Compartments, die ein positives Testergebnis liefern. Bei dieser Verfahrensweise treten allerdings unter anderen folgende Probleme auf: Nach der Abtrennung der Zellen zur Weiterkultivierung besteht das Risiko einer physikalischen Beschädigung der Zellen; die Abtrennung der Zellen ist ferner schwierig durchzuführen. Hinzu kommt das Risiko einer Kontamination der Kulturen sowie einer Einwirkung von Fremdstoffen, beispielsweise von Zellfragmenten und höhermolekularen Verunreinigungen, auf die Spezifität des Tests auf die betreffende angestrebte Substanz. Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, daß bestimmte Zellarten in Mikrotitrierschalen nicht gut kultivierbar sind.In the production of monoclonal antibodies becomes a heterogeneous cell culture, in which there is also at least one cell, which generates the specific antibody in question, with an immortal cell line, for example Myeloma cells, fused. Even among the cheapest This is a merger only partially successful because some cells fail merge, other cells of the culture instead of with the myeloma cells merge and also fusion of myeloma cells with each other occurrence. Even if it is assumed that all Cells of the cell culture fuse with myeloma cells, produce only a few fusion products the targeted substance in question. As a result there is a need for a screening process for safe selection of certain special fusion products. One of the commonly used for this Screening method is cultivation of the cells from the fusion mixture in microtitration dishes, the test of the liquid each compartment of the microtitration dishes the substance in question and the further cultivation of the cells of each compartment, the one deliver positive test result. With this procedure However, the following occur among others Problems on: After separating the cells there is a risk of further cultivation physical damage to the cells; the separation the cells are also difficult to perform. There is also the risk of contamination of the cultures and exposure to foreign substances, for example of cell fragments and higher molecular impurities, on the specificity of the test on the particular targeted substance. Another difficulty consists of certain types of cells in microtitration dishes are not easy to cultivate.

Auch das Rekombinant-DNA-Verfahren erfordert einen Screening-Schritt zur Selektierung lebensfähiger Rekombinanten. Beim üblichen Standardverfahren zur Rekombinantenerzeugung wird ein Plasmid oder ein anderer Vektor in eine Zelle, normalerweise einen prokaryotischen Organismus, eingeführt. Das Plasmid bzw. der Vektor enthält ein Gen, das in die Zelle transscribiert werden kann, die dann die interessierende Substanz erzeugt. Bei der Hybridomtechnik bildet ein erheblicher Prozentsatz der Verschmelzungsprodukte der Plasmide bzw. Vektoren mit Zellen keine lebensfähigen Kulturen, aus denen die interessierende Substanz gewonnen werden kann, so daß auch hier ein Screening-Schritt erforderlich ist. Ähnliche Verfahren wie zur Identifizierung von Hybridomzellen sind bei der Rekombinanttechnik üblich, wobei auch ähnliche Probleme und Schwierigkeiten vorliegen.The recombinant DNA method also requires one Screening step to select viable recombinants. With the usual standard procedure for Recombinant generation is a plasmid or a different vector into a cell, usually one prokaryotic organism. The plasmid or the vector contains a gene that enters the cell can be transcribed, then the one of interest Substance created. In hybridoma technology forms a significant percentage of the merger products the plasmids or vectors with cells are not viable Cultures that make up the interested Substance can be obtained, so that here too Screening step is required. Similar procedures how to identify hybridoma cells common in recombinant technology, although similar Problems and difficulties exist.

In der US-PS 43 52 883 ist ein Verfahren zur Einkapselung lebensfähiger Zellen einschließlich Hybridomzellen und genetisch modifizierter Zellen in semipermeablen Membranen angegeben. Nach der Einkapselung sind die Zellen in gesundem, lebensfähigem Zustand und zur Aufrechterhaltung eines normalen Stoffwechsels befähigt, wobei sie die normalerweise sezernierten Substanzen ebenfalls ausscheiden und auch innerhalb der Kapseln Zellteilung eintreten kann. Jüngste Ergebnisse zeigten, daß die Abmessungen der Poren der Kapselmembranen so kontrolliert bzw. eingestellt werden können, daß ein Durchtritt von Zellen und hochmolekularen Verunreinigungen ausgeschlossen ist. Auf diese Weise ist es möglich, die Kapselmembranen als Filtermittel zu verwenden, wodurch die Prüfung auf die angestrebte Substanz erleichtert wird. Das Einkapselungsverfahren der US-PS 43 52 883 trägt ferner dazu bei, eine mechanische Beschädigung der Zellen zu vermeiden, und vereinfacht die Zellhandhabung.In US-PS 43 52 883 is a method for encapsulation viable cells including hybridoma cells and genetically modified cells in semipermeable Membranes specified. After encapsulation the cells are in a healthy, viable state and to maintain normal metabolism empowered, usually secreting Also excrete substances and also within the capsules can cause cell division. Recent results showed that the dimensions of the pores of the Capsule membranes controlled or adjusted in this way can be that a passage of cells and high molecular impurities excluded is. In this way it is possible for the capsule membranes to use as a filter medium, whereby the test for the desired substance is facilitated becomes. The encapsulation process of U.S. Patent 4,352,883 also helps prevent mechanical damage of the cells and simplifies cell handling.

In der älteren DE-OS 35 04 724 ist ein Verfahren zur Einkapselung von Materialien gemäß der US-PS 43 52 883 beschrieben, das dadurch eine feinere Einstellung der Membranporosität erlaubt und zu Mikrokapseln mit defektfreieren Membranen führt, daß die zunächst erhaltenen Gelpartikel auf der Basis eines Salzes eines polyanionischen Polymers mit mehrwertigen Kationen vor der Ausbildung der endgültigen Membranen und abschließende Umsetzung mit einem polykationischen Polymer durch teilweise Abtrennung der mehrwertigen Kationen expandiert und weiter hydratisiert werden. Auf S. 7, 2. Abs. dieser Druckschrift ist kurz erwähnt, daß derart eingekapselte Zellkulturen durch Prüfung des extrakapsulären Mediums auf eine sezernierte Substanz zum Zellscreening herangezogen werden können, ohne daß hierzu allerdings nähere Einzelheiten angegeben sind.In the older DE-OS 35 04 724 a method for Encapsulation of materials according to US Pat. No. 4,352,883 described, which thereby a finer adjustment of the Permitted membrane porosity and using microcapsules defect-free membranes leads to the initially obtained Gel particles based on a salt of a polyanionic Polymers with multivalent cations before the formation of the final membranes and final implementation with a polycationic polymer by partial separation of the polyvalent cations expanded and further hydrated will. On page 7, 2nd paragraph of this document is short mentions that such encapsulated cell cultures by testing of the extracapsular medium to a secreted substance can be used for cell screening without however, further details are given.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Screening-Verfahren zur Identifizierung von Zellen in einer gemischten Zellkultur anzugeben, die eine bestimmte interessierende Substanz ausscheiden. Das Verfahren soll dabei auch zur Selektion von Hybridomzellen geeignet sein, die einen bestimmten angestrebten monoklonalen Antikörper produzieren. Ferner soll auch die Identifizierung genetisch modifizierter Zellen möglich sein, die eine angestrebte Substanz ausscheiden. Das Verfahren soll die Identifizierung bzw. Selektion von eine bestimmte interessierende Substanz produzierenden Hybridomzellen aus einer Zellkultur erlauben, die mindestens eine diese Substanz produzierende Zelle enthält.The invention is based on the object novel screening process for identification to indicate cells in a mixed cell culture, that excrete a certain substance of interest. The procedure is also intended for selection of hybridoma cells that have a particular ability to produce the desired monoclonal antibody. Furthermore, the identification of genetically modified is said to be Cells that can be targeted Excrete substance. The procedure is said to Identification or selection of a specific one hybridoma cells of interest allow from a cell culture that at least contains a cell producing this substance.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Anspruch 2 betrifft eine vorteilhafte Weiterbildung. The task is solved according to the requirements. Claim 2 relates to an advantageous further training.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screening einer Zellkultur zur Selektion von Zellen, die eine angestrebte Substanz sezernieren, ist durch folgende wesentliche Schritte gekennzeichnet:The inventive method for screening a Cell culture for selection of cells that are targeted Secreting substance is by the following marked essential steps:

(A) Encapsulate the cells of the cell culture in one Variety of capsules, each one intracapsular Have volume that of a Membrane is given which is aimed for Permeable substance, however for the cells are impermeable;
(B) inserting the encapsulated cells into a Establishment with a large number of compartments, each an extracapsular Contain medium and on which the encapsulated Cells are distributed;
(C) running the synthesis of the subject Substance through the selected cell (s) and their secretion into the intracapsular Volume;
(D) Allowing the secreted substance to pass through through the membrane;
(E) Examine the extracapsular medium of each Compartments on the secreted substance and
(F) Repeat steps (B) to (E) with the capsules from a compartment, which in Step (E) gave a positive test result, until the cell to be selected containing capsule is identified.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf heterogene Zellpopulationen, die durch Verschmelzen einer Vielzahl von Zellen, unter denen sich mindestens eine Zelle befindet, welche die angestrebte Substanz produziert, mit einer immortalen Zellinie erhalten wurden, beispielsweise auf Hybridomzellen, die durch Verschmelzung eines Lymphocyten mit einer immortalen Zellinie, wie etwa Myelomzellen, erzeugt wurden, oder auf genetisch modifizierte Zellen, wie etwa Verschmelzungsprodukte einer prokaryotischen Zelle mit einem Vektor, der ein Gen enthält, das die Produktion der speziellen Substanz durch intrazelluläre Transskription codiert, angewandt werden.The method according to the invention can also affect heterogeneous cell populations, by merging a variety of cells, among which there is at least one cell that Desired substance produced with an immortal Cell line were obtained for example on hybridoma cells, which by fusing a lymphocyte with an immortal cell line, such as myeloma cells, generated, or on genetically modified cells, such as products of fusion of a prokaryotic Cell with a vector that contains a gene that through the production of the special substance encoded intracellular transcription.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screening bzw. zur Identifizierung einer ausgewählten Zelle, die eine interessierende Substanz sezerniert, beruht auf der Einkapselung einer heterogenen Zellkultur, die eine Vielzahl von Zellen enthält, in einer Vielzahl von Kapseln, wobei die Zellkultur eine beliebige Kultur darstellen kann und mindestens eine Zelle enthält, welche die interessierende Substanz sezerniert. Die Kapseln besitzen ein von einer Membran vorgegebenes intrakapsuläres Volumen, die für die Substanz durchlässig ist, nicht jedoch für die Zellen. Die Membran kann ferner auch so ausgelegt sein, daß sie den Durchtritt von Molekülen mit einer Molekülmasse oberhalb eines bestimmten Werts verhindert. Besonders im Fall von Hybridomzellen werden die Zellen günstigerweise in einer Dichte eingekapselt, daß nicht mehr als eine Zelle pro Kapsel vorliegt; in diesem Fall kann dann ein einziger Klon erhalten werden. The screening method according to the invention or to identify a selected cell, which secretes a substance of interest is based on the encapsulation of a heterogeneous cell culture, which contains a multitude of cells, in a variety of capsules, the cell culture can represent any culture and at least a cell that contains the cell of interest Substance secreted. The capsules have an intracapsular membrane Volume that is permeable to the substance is, but not for the cells. The membrane can also be designed so that it Passage of molecules with a molecular mass above of a certain value is prevented. Especially in the case of hybridoma cells, the cells are favorably in one density encapsulated that no more than one cell per capsule; in this case a only clone can be obtained.

Die eingekapselten Zellen werden in einer Vorrichtung mit einer Vielzahl von Compartments kultiviert, wobei jedes Compartment ein extrakapsuläres Medium, vorzugsweise ein differentielles Kulturmedium, enthält. Die auszuwählende Zelle synthetisiert und sezerniert die betreffende Substanz in das intrakapsuläre Volumen, die wiederum durch die Membran hindurch in das extrakapsuläre Medium hinein austritt. Das extrakapsuläre Medium jedes Compartments wird auf die betreffende Substanz hin geprüft, wobei das Verfahren mit den Kapseln derjenigen Compartments wiederholt wird, die bei der Prüfung auf die betreffende Substanz ein positives Testergebnis liefern, bis die zu selektierende Zelle identifiziert ist. Die Compartments sind vorzugsweise Vertiefungen, beispielsweise von Mikrotitrierplatten oder -schalen, die das extrakapsuläre Medium und die Kapseln aufnehmen können. Im Fall von Hybridomzellen erleichtert die Möglichkeit, aus dem erhaltenen Verschmelzungsprodukt einen Klon erzeugen zu können, den Screening-Schritt, wenn keine Kapsel mehr als eine einzige Hybridomzelle enthält, wobei zugleich die Isolierung stabiler, Antikörper ausscheidender Hybridomzellen erheblich beschleunigt wird.The encapsulated cells are in a device cultivated with a variety of compartments, each compartment being an extracapsular medium, preferably a differential culture medium. The cell to be selected is synthesized and secretes the substance in question into the intracapsular Volume, in turn, through the membrane emerges into the extracapsular medium. The extracapsular medium of each compartment is checked for the substance in question, whereby the procedure with the capsules of those compartments is repeated when examining the substance in question a positive test result deliver until the cell to be selected is identified is. The compartments are preferably wells, for example microtitration plates or shells containing the extracapsular medium and can take the capsules. In the case of hybridoma cells facilitates the opportunity to get out of the Fusion product to create a clone can, the screening step when no more capsule contains as a single hybridoma cell, at the same time isolation of stable, antibody-excreting Hybridoma cells is accelerated significantly.

Die nach dieser Verfahrensweise identifizierten Kapseln können ihrerseits als Immunisierungsmittel verwendet werden, wobei die Kapseln in ein Versuchstier injiziert werden können, das dann Antikörper gegen die ausgeschiedene Substanz erzeugt.The identified by this procedure Capsules in turn can act as immunizers used, the capsules in a laboratory animal can be injected, which is then antibody against the excreted substance.

Die identifizierten Kapseln können ferner auch in ein Wirtstier implantiert werden, beispielsweise in den Peritonealraum von Mäusen. Die sezernierte Substanz kann dann von der Implantationsstelle, vorzugsweise aus der vom Wirtstier aufgrund seiner Immunantwort auf die Implantation erzeugten Flüssigkeit, gewonnen werden.The identified capsules can also can also be implanted in a host animal, for example in the peritoneal space of mice. The secreted Substance can then be taken from the implantation site, preferably from that of the host animal due to its immune response fluid generated on the implantation will.

Das sehr breit anwendbare Erfindungskonzept eignet sich besonders für die Hybridomtechnik, da z. B. die Verschmelzungsprodukte von Lymphocyten mit einer immortalen Zellinie, beispielsweise Myelomzellen, einem Screening-Schritt unterworfen werden müssen, um festzustellen, welche der Zellen den betreffenden interessierenden monoklonalen Antikörper produziert. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise eignet sich ebenso auch günstig für das Rekombinant-DNA-Verfahren. Aufgrund der Erfindungskonzeption kann das Screening in einer einfacheren, weniger schädlichen Weise als bei herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist ferner besonders günstig zur Identifizierung von eine bestimmte Substanz erzeugenden Zellen anwendbar, die von einer örtlichen bzw. räumlichen Festlegung abhängig sind.The very broadly applicable concept of invention is particularly suitable for the hybridoma technology, since z. B. the merger products of lymphocytes with an immortal cell line, for example Myeloma cells, a screening step must be subjected to determine which of the cells the relevant monoclonal of interest Produces antibodies. The procedure according to the invention is also convenient for that Recombinant DNA method. Because of the concept of the invention can the screening in a simpler, less harmful than conventional methods be performed. The method according to the invention is also particularly favorable for identification from cells producing a certain substance applicable by a local or spatial Determination are dependent.

Bei derartigen Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zuerst eine heterogene Zellkultur hergestellt, welche die zu selektierende(n) Zelle(n) enthält. Eine zuvor hergestellte Zellkultur, beispielsweise eine Kultur von Hybridomzellen oder einer genetisch modifizierten Zellinie, kann verwendet werden; alternativ kann auch eine jeweils speziell für das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Kultur eingesetzt werden. Ein übliches Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellen (vgl. G. Kohler und C. Milstein, Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predetermined Specificity, Nature 256 (1975) 495) geht beispielsweise von einer Kultur, z. B. von Lymphocyten aus Milz, aus, bei der zumindest einige Zellen die interessierende Substanz produzieren. Die Kultur wird nach herkömmlichen Verfahren in Einzelzellen aufgeteilt, beispielsweise durch Durchpassieren der Milz durch ein Drahtnetz. Die Zellen werden dann mit Zellen einer immortalen Zellinie zusammengemischt, beispielsweise Myelomzellen, worauf etwa durch Verschmelzung unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) Hybridomzellen erzeugt werden. Im einzelnen werden die Lymphocyten und Myelomzellen in einem Verschmelzungsmedium inkubiert, beispielsweise modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) nach Dulbecco, dem etwa 40% PEG zugesetzt werden. Die Zellen werden dann aus der PEG-Lösung entnommen und vor dem Screening-Schritt zu einer Kultur wachsen gelassen. Die Myelomzellen sind hierbei vorzugsweise antibiotikumsempfindlich bzw. erfordern Zusätze zum Medium, so daß ein differentielles Wachstumsmedium, beispielsweise ein Medium, das Wirkstoffe enthält, die nicht verschmolzene Zellen abtöten, als Trenneinrichtung herangezogen werden kann. Nach der Identifizierung lebensfähiger Hybridomzellen kann ein weiterer Screening-Schritt erforderlich sein, um festzustellen, ob diese Zellen die interessierende Substanz produzieren.In such applications of the invention A heterogeneous cell culture is first prepared, which contains the cell (s) to be selected. A cell culture previously prepared, for example a culture of hybridoma cells or one genetically modified cell line, can be used will; alternatively, one can be specific produced for the inventive method Culture. A common procedure for the generation of hybridoma cells (cf. G. Kohler and C. Milstein, Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predetermined Specificity, For example, Nature 256 (1975) 495) a culture, e.g. B. from lymphocytes from spleen, where at least some cells are of interest Produce substance. The culture is after conventional processes divided into single cells, for example by passing through the spleen a wire mesh. The cells then become cells an immortal cell line mixed together, for example Myeloma cells, whereupon through fusion using polyethylene glycol (PEG) hybridoma cells are generated. In detail the lymphocytes and myeloma cells become one Fusion medium incubated, for example modified Eagle medium (DMEM) according to Dulbecco, to which about 40% PEG are added. The cells will then removed from the PEG solution and before the Screening step grown to a culture. The myeloma cells are preferably sensitive to antibiotics or require additions to Medium so that a differential growth medium for example a medium that contains active ingredients, that kill non-fused cells as a separator can be used. After Can identify viable hybridoma cells another screening step may be required to determine if these cells are of interest Produce substance.

Wenn genetisch modifizierte Zellen selektiert werden sollen, kann zu ihrer Herstellung nach dem Verfahren von F. Bolivar et al., Construction and Characterization of New Cloning Vehicles, II, a multipurpose cloning system, Gene 2 (1977) 95-113, verfahren werden. Hierbei wird ein Plasmid oder ein Vektor unter Verwendung von Restriktionsenzymen in eine Zelle eingeführt, die dann nach üblichen Verfahren kultiviert wird. Das Plasmid bzw. der Vektor enthalten ein Gen, das durch die Zelle transscribiert werden kann, die dann die interessierende Substanz produziert. Wie im Fall von Hybridomzellen ist auch hier die Verwendung eines differentiellen Wachstumsmediums für die Zellselektion günstig. Das Plasmid mit dem Gen, das die interessierende Substanz codiert, kann beispielsweise ferner ein Gen enthalten, das eine Differenzierung des Verschmelzungsprodukts von nicht verschmolzenen Produkten erlaubt; so kann das Plasmid beispielsweise bei gegen Rifamycin empfindlichen Zellen Rifamycinresistenz hervorrufen, wodurch die Verwendung eines Rifamycin enthaltenden differentiellen Wachstumsmediums beim Screening- Schritt ermöglicht wird.When genetically modified cells are selected can be used to manufacture them according to F. Bolivar et al., Construction and Characterization of New Cloning Vehicles, II, a multipurpose cloning system, Gene 2 (1977) 95-113. Here is a Plasmid or a vector using Restriction enzymes introduced into a cell that then cultivated according to usual methods. The plasmid or the vector contain a gene that can be transcribed through the cell that then the substance of interest is produced. As in the case of hybridoma cells, this is also the case here Using a differential growth medium favorable for cell selection. The plasmid with the gene encoding the substance of interest, may also contain, for example, a gene that a differentiation of the product of the merger allowed of non-fused products; so the plasmid can be used, for example, against rifamycin cause sensitive cells to become resistant to rifamycin, whereby the use of a rifamycin-containing differential growth medium in screening Step is enabled.

Nach der Erzeugung der Zellkolonie werden die Zellen eingekapselt. Hierzu wird das oben angegebene allgemeine Verfahren der US-PS 43 52 883 bevorzugt. Die Abmessungen der Poren der Mikrokapseln können bei dieser Verfahrensweise kontrolliert und eingestellt werden. Es ist dementsprechend möglich, Zellen einzukapseln, die sowohl IgG (Molekülmasse etwa 160 000) als auch IgM (Molekülmasse etwa 900 000) in die Kapseln hinein sezernieren, wobei das IgG frei durch die Membranporen hindurchtreten kann, während der Durchtritt von IgM im wesentlichen verhindert wird. Die Kapselmembran wirkt dabei als Filter und verhindert den Durchtritt von Zellen bzw. von hochmolekularen Verunreinigungen und Zellen.After the cell colony is created encapsulated the cells. For this, the above is given general method of US-PS 43 52 883 preferred. The dimensions of the pores of the microcapsules can checked and set in this procedure will. Accordingly, it is possible Encapsulate cells that contain both IgG (molecular mass about 160,000) and IgM (molecular weight about 900 000) into the capsules, whereby the IgG freely pass through the membrane pores can, while the passage of IgM essentially is prevented. The capsule membrane acts as Filter and prevents the passage of cells or of high molecular weight contaminants and cells.

Wie oben angegeben, wird die Einkapselung vorzugsweise nach dem Verfahren der US-PS 43 52 883 durchgeführt. Hierbei wird die Zellkultur zunächst in bekannter Weise in eine fein verteilte Form gebracht und in einem wäßrigen Medium suspendiert, das sich zur Unterhaltung und Aufrechterhaltung der Stoffwechselprozesse eignet. Geeignete derartige Medien sind beispielsweise PBS (Ca/Mg-frei) nach Dulbecco, wie dem Fachmann geläufig ist. Eine wasserlösliche Substanz, die mit den Zellen physiologisch verträglich ist und die unter Ausbildung einer formbeständigen, zusammenhängenden temporären Kapsel oder gelierten Masse wasserunlöslich gemacht werden kann, wird dann dem Medium zugesetzt. Die resultierende Lösung wird anschließend in Tröpfchen übergeführt, welche die Zellen zusammen mit ihrem Wachstumsmedium enthalten; diese Tröpfchen werden unmittelbar darauf unter Ausbildung der temporären Kapseln wasserunlöslich gemacht. Das gelierbare Material kann ein nichttoxisches, wasserlösliches Material sein, das durch Temperaturänderung, pH- Änderung oder Änderung der Ionenumgebung, wasserunlöslich gemacht werden kann, ohne daß hierdurch die Stoffwechselprozesse der Zellen nachteilig beeinflußt werden. Das gelierbare Material enthält vorzugsweise eine Vielzahl leicht ionisierbarer Gruppen, beispielsweise Carboxyl- oder Aminogruppen, die mit Polymeren, welche eine Vielzahl von Gruppen entgegengesetzter Ladung enthalten, unter Ausbildung von Salzbindungen reagieren können. As stated above, the encapsulation preferably according to the method of US-PS 43 52 883 performed. This is the cell culture first in a known manner in a finely divided Shaped and suspended in an aqueous medium, which is for entertainment and maintenance the metabolic processes are suitable. Suitable such Media are, for example, PBS (Ca / Mg-free) according to Dulbecco, as is known to the expert. A water-soluble substance that is physiological with the cells is tolerated and under training a stable, coherent temporary Capsule or gelled mass made water insoluble can then be added to the medium. The resulting solution is then in droplets transferred which the cells along with their Contain growth medium; these droplets will immediately afterwards with the formation of the temporary Capsules made insoluble in water. The gelatable Material can be a non-toxic, water-soluble Material that is affected by temperature change, pH Change or change in the ionic environment, insoluble in water can be made without the Metabolic processes of the cells adversely affected will. Contains the gellable material preferably a variety of easily ionizable Groups, for example carboxyl or amino groups, those with polymers that have a variety of groups opposite charge included, under training of salt bonds can react.

Gegenwärtig bevorzugte gelierbare Materialien sind natürliche oder synthetische Polysaccharide und vorzugsweise Natriumalginat. Andere erfindungsgemäß günstig verwendbare Polysaccharide sind saure Fraktionen von Guargummi, Gummi arabicum, Carrageenan, Pectin, Traganthgummi und Xanthangummi. Diese Materialien können durch Umsetzung mit Kationen unter Ausbildung formbeständiger Massen "vernetzt" und durch Abtrennung der vernetzenden Ionen durch Ionenaustausch oder Komplexbildung wieder in Lösung gebracht werden.Currently preferred gellable materials are natural or synthetic polysaccharides and preferably sodium alginate. Others according to the invention Polysaccharides which can be used advantageously are acidic Fractions of guar gum, gum arabic, carrageenan, Pectin, gum tragacanth and xanthan gum. These materials can by reacting with cations "networked" with the formation of dimensionally stable masses and by separating the crosslinking ions Ion exchange or complex formation back in solution to be brought.

Eine günstig verwendbare gelierbare Lösung enthält etwa 10⁶ Zellen/ml in einer 1,0- bis 1,5%igen (M/V) Natriumalginatlösung. Die Lösung wird anschließend in Tröpfchenform übergeführt, beispielsweise durch Hindurchdrücken der Lösung durch eine Vorrichtung mit einem Düsenkopf. Diese Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse mit einer oberen Lufteinlaßdüse und einem länglichen Hohlkörper, der mit gleitender Reibung in einem Stopfen eingepaßt ist. Eine Injektionsspritze, beispielsweise eine 10-ml-Spritze, die mit einer Schrittpumpe verbunden ist, ist oberhalb des Gehäuses vorgesehen, deren Nadel, beispielsweise eine mit Polytetrafluorethylen beschichtete Nadel von 0,25 mm Innendurchmesser, durch die gesamte Länge des Gehäuses hindurchgeht. Das Innere des Gehäuses ist so ausgebildet, daß die Spitze der Nadel einer konstanten laminaren Luftströmung ausgesetzt ist, die als Zerstäuber wirkt. Bei der Anwendung wird die Schrittpumpe betätigt, die inkrementweise aus der oberhalb des Gehäuses angeordneten Spritze, die mit der das einzukapselnde Material enthaltenden Lösung gefüllt ist, Lösungströpfchen herausdrückt, die an der Nadelspitze erscheinen. Die Tröpchen werden jeweils vom Luftstrom "abgeschnitten" und fallen etwa 2,5 bis 3,5 cm tief in eine Gelierungslösung, in der sie durch Absorption vernetzender Ionen unmittelbar in den Gelzustand übergehen. Vorzugsweise wird als Gelierungslösung eine Calciumionen enthaltende Lösung eingesetzt, beispielsweise eine Kochsalzlösung mit 1,2% (M/V) Calciumchlorid. Der Abstand zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche der CaCl₂-Lösung ist groß genug, daß die Natriumalginat-Zellsuspension die physikalisch günstigste Form anzunehmen vermag, nämlich die Form einer Kugel, d. h. maximales Volumen bei minimaler Oberfläche. Die Luft im Rohr entweicht durch eine Öffnung im Stopfen. Die gelierten, formbeständigen, aus kugelförmigen Teilchen bestehenden Massen bzw. temporären Kapseln, die vorzugsweise einen Durchmesser von 50 µm bis zu einigen mm aufweisen, sammeln sich in der Lösung als separate Phase an und können, beispielsweise durch Absaugen, abgetrennt werden.An inexpensive gelable solution contains about 10⁶ cells / ml in a 1.0 to 1.5% (M / V) sodium alginate solution. The solution is then transferred in droplet form, for example by pushing the solution through a device with a nozzle head. This device exists from a housing with an upper air inlet nozzle and an elongated hollow body with sliding Friction is fitted in a stopper. An injection syringe, for example a 10 ml syringe, the connected to a step pump is above provided the housing, the needle, for example one coated with polytetrafluoroethylene Needle of 0.25 mm inside diameter, through the whole Length of the housing goes through. The inner the housing is designed so that the tip of the Needle exposed to constant laminar air flow is that acts as an atomizer. When using the step pump is actuated, incrementally from the arranged above the housing Syringe containing the material to be encapsulated containing solution is filled, solution droplets that appears at the tip of the needle. The Droplets are "cut off" from the air flow and fall about 2.5 to 3.5 cm deep into one Gelling solution in which it is crosslinking by absorption Ions immediately change to the gel state. A gelling solution is preferably used Solution containing calcium ions used, for example a saline solution with 1.2% (M / V) Calcium chloride. The distance between the needle tip and the surface of the CaCl₂ solution is large enough that the sodium alginate cell suspension physically Can take the cheapest form, namely the form a ball, d. H. maximum volume with minimal surface. The air in the pipe escapes through an opening in the stopper. The gelled, dimensionally stable, from spherical particles existing masses or temporary capsules, preferably a diameter from 50 µm to a few mm, collect in the solution as a separate phase and can for example, by suction.

Im nächsten Schritt wird um jede temporäre Kapsel herum durch Vernetzung von Oberflächenschichten eine permanente Membran ausgebildet. Zur Vernetzung der gelierten Massen wird hierbei vorzugsweise eine wäßrige Lösung eines Polymers mit einer Vielzahl von Gruppen entgegengesetzter Ladung verwendet. Wenn carboxylgruppenhaltige oder andere saure Polysaccharide zur Erzeugung der temporären Kapseln verwendet werden, eignen sich polykationische Materialien, die mit sauren Gruppen reaktive Gruppen enthalten, beispielsweise Amine, Imine oder Amide, günstig als Vernetzungsmittel. Derzeit bevorzugte polykationische Materialien sind beispielsweise Polylysin, Polyethylenimin und Polyvinylamin. Die polykationischen Materialien reagieren mit den Säuregruppen am polyanionischen Material der gelierten Masse unter Ausbildung von Vernetzungen über Salzbindungen. Je nach dem verwendeten System kann es bevorzugt sein, die durch diese Reaktion gebildeten permanenten Kapseln mit einer Lösung einer Substanz umzusetzen, mit der freie kationische Gruppen besetzt werden können, beispielsweise durch Umsetzung der Kapseln mit einer Natriumalginatlösung niederer Konzentration.The next step is around each temporary capsule around by networking surface layers a permanent membrane is formed. This is used to network the gelled masses preferably an aqueous solution of a polymer with a variety of groups of opposite charge used. If carboxyl-containing or others acidic polysaccharides to create the temporary Capsules are used are polycationic Materials that are reactive with acidic groups contain, for example amines, imines or amides, favorable as a crosslinking agent. Currently preferred polycationic Materials include polylysine, Polyethyleneimine and polyvinylamine. The polycationic Materials react with the acid groups on the polyanionic Gelled mass material under training of cross-links via salt bonds. Depending on the system used, it may be preferred that permanent capsules formed by this reaction with a solution of a substance with which free cationic groups can be occupied, for example by implementing the capsules with a Low concentration sodium alginate solution.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Kapseln besitzen Membranen, deren Permeabilität so eingestellt ist, daß die erforderliche Filterfunktion bezüglich der Molekülmasse vorliegt, damit die interessierende Substanz die Membran passieren kann, während Verunreinigungen mit höherer Molekülmasse sowie Zellen innerhalb der Membran zurückgehalten werden. Wie oben erwähnt, können die Kapseln so ausgebildet werden, daß sie den freien Durchtritt von IgG erlauben, IgM jedoch im wesentlichen zurückhalten. Zur Unterstützung der Kontrolle und Einstellung der Porenabmessungen gibt es zwei Verfahren, von denen das eine auf dem Aufbau mehrerer Schichten und das andere auf einem Hydratationseffekt beruhen. Beim ersten Verfahren werden die gelierten Kügelchen in polykationische Lösungen unterschiedlicher Ionenstärke oder unterschiedlicher Konzentration eingebracht. Die um die gelierten Kügelchen herum abgeschiedenen Materialschichten bilden dann eine Vielfachschichtstruktur. So können die temporären Kapseln beispielsweise in eine Lösung von hochmolekularem Polylysin und anschließend in eine Lösung von niedermolekularem Polylysin oder Polyvinylamin eingebracht werden. Der Kontakt mit der zweiten Lösung dient zur Ausbildung einer zweiten Membran, wodurch die Porengröße verringert wird.The capsules used according to the invention have Membranes whose permeability is set in this way is that the required filter function regarding the molecular mass is present, so that the one of interest Substance can pass through the membrane while contaminating with higher molecular mass as well as cells be retained within the membrane. As above mentioned, the capsules can be designed that they allow free passage of IgG, IgM however, restrain essentially. For support the control and adjustment of the pore dimensions there are two procedures, one of which is one on building multiple layers and the other be based on a hydration effect. The first procedure are the gelled beads in polycationic Solutions of different ionic strength or different Concentration introduced. Those around the gelled Balls of deposited material layers around then form a multilayer structure. So can the temporary capsules, for example, in a Solution of high molecular weight polylysine and then in a solution of low molecular weight polylysine or polyvinylamine be introduced. The contact with the second solution is used to form a second Membrane, which reduces the pore size.

Beim zweiten Verfahren zur Kontrolle der Porenabmessungen wird von der Feststellung Gebrauch gemacht, daß Alginatgele je nach ihrem Hydratationsgrad unterschiedliches Volumen aufweisen, wobei der Hydratationsgrad wiederum von der Ionenstärke der Metallionenlösung abhängt, in der diese Verbindungen in ein Hydratationsgleichgewicht gebracht werden. Um eine expandierte Alginatgelmasse herum gebildete Membranen sind gleichmäßiger als Membranen, die um nicht expandierte Gelmassen herum erzeugt wurden. Dieses Phänomen führte zusammen mit der Feststellung, daß um dichte Gele herum gebildete Membranen in der Regel intakt bleiben, wenn das Gel expandiert wird, zu einem Verfahren zur Vergrößerung der Porenabmessungen und zur Erzeugung verbesserter Membranen (vgl. die DE-OS 35 04 724). So kann beispielsweise eine Membran mit einer Porengröße, die einer Molekülmasse von etwa 200 000 entspricht (d. h. ausreichend zur Freisetzung von IgG unter Zurückhaltung von IgM) unter Verwendung eines polykationischen Vernetzungsmittels mittlerer Molekülmasse um ein Zellen enthaltendes Gel hoher Dichte nach Gleichgewichtseinstellung und Expandieren der gelierten Massen mit einem einwertigen Kation bei niederer Ionenstärke hergestellt werden. Die Lösung der einwertigen Kationen führt zur Entfernung der Calciumionen und erhöht den Hydratationsgrad des Gels, was wiederum zur Vergrößerung der Poren führt. In the second method for checking the pore dimensions use is made of the determination that alginate gels differ depending on their degree of hydration Have volume, the degree of hydration again from the ionic strength of the metal ion solution depends on in which these connections in one Hydration balance. To one expanded alginate gel mass formed around membranes are more uniform than membranes that are not around expanded gel masses were generated around. This Phenomenon led to the finding that membranes usually formed around dense gels stay intact when the gel expands into one Process for enlarging the pore dimensions and to produce improved membranes (see. DE-OS 35 04 724). For example a membrane with a pore size that one Corresponds to a molecular mass of approximately 200,000 (i.e. sufficient releasing IgG with restraint of IgM) using a polycationic Crosslinking agent of average molecular weight around one cell containing high density gel after equilibrium and expanding the gelled masses with a monovalent cation with low ionic strength getting produced. The solution of the monovalent Cations lead to the removal of calcium ions and increases the degree of hydration of the gel, which in turn leads to enlargement of the pores.

Obgleich die oben genannten Verfahren zu einer Verbesserung der Permeabilitätskontrolle von Membranen führen, besitzen nach diesen Verfahren hergestellte Membranen keine scharfe Ausschlußgrenze für bestimmte Molekülmassen. Die Poren jeder einzelnen Membran besitzen wechselnde Größe und führen daher nicht zum absoluten Ausschluß des Durchtritts von Molekülen mit hoher Molekülmasse. Der Durchtritt dieser Moleküle durch solche Membranen ist allerdings so langsam, daß er durch die Membranen praktisch ausgeschlossen ist. Dabei wird angenommen, daß die Poren durch die Zwischenräume zwischen den vernetzten Materialien, aus denen die Membranen aufgebaut sind, vorgegebene gekrümmte Gänge darstellen. Moleküle mit hoher Molekülmasse und daher einem höheren effektiven Volumen unterliegen einer größeren Zahl von Zusammenstößen mit der Membranstruktur, was ihren Durchtritt durch die Membran behindert. Sämtliche hier angegebenen quantitativen Permeabilitätsdaten beruhen auf empirischer Beobachtung der Diffusion von Molekülen bekannter Molekülmasse durch die Membran hindurch.Although the above procedures do improve control the permeability of membranes, have membranes produced by these processes no sharp exclusion limit for certain molecular masses. Have the pores of every single membrane changing size and therefore do not lead to the absolute Exclusion of the passage of molecules with high Molecular mass. The passage of these molecules through such membranes is so slow, however, that it is practically excluded by the membranes. It is assumed that the pores pass through the gaps between the cross-linked materials to which the membranes are built, predetermined curved ones Represent gears. High molecular weight molecules and therefore subject to a higher effective volume a larger number of clashes with the membrane structure, what their passage through the Diaphragm obstructed. All quantitative data given here Permeability data are based on empirical Observation of the diffusion of molecules of known molecular mass through the membrane.

Die eingekapselten Zellen werden dann einige Tage in einem Wachstumsmedium kultiviert und danach in eine Screening-Einrichtung gebracht, die eine Vielzahl von Compartments aufweist, beispielsweise auf eine Mikrotitrierplatte mit 96 Vertiefungen oder etwa auf Weichagar. Vorzugsweise werden etwa 10 bis 100 Kapseln in jedes Compartment eingebracht. Die die betreffende angestrebte Substanz erzeugenden Zellen synthetisieren und sezernieren diese Substanz, die durch die Kapselmembran hindurch in das extrakapsuläre Medium hinein austritt. Das extrakapsuläre Medium jedes Compartments wird dann nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch RIA oder Enzymassay, auf die betreffende Substanz geprüft. Das Verfahren kann mit Kapseln von jedem Compartment wiederholt werden, bei dem sich ein positives Testergebnis ergab, bis die selektierte Zelle identifiziert ist. Wenn möglich sollte der Wiederholungsschritt bei einer Kapseldichte von einer Kapsel pro Vertiefung erfolgen. Bei dieser Kapseldichte folgt aus einem positiven Testergebnis, daß die betreffende eingekapselte Zelle, welche die interessierende Substanz sezerniert, sich in der Mikrokapsel befindet.The encapsulated cells then become a few Cultivated for days in a growth medium and afterwards brought to a screening facility, the one Has a large number of compartments, for example on a microtitration plate with 96 wells or on soft agar. Preferably about 10 to 100 capsules placed in each compartment. The targeted substance in question synthesize and secrete the producing cells this substance that goes through the capsule membrane emerges into the extracapsular medium. The extracapsular medium of each compartment is then by conventional methods, for example by RIA or enzyme assay for the substance in question checked. The procedure can be done with capsules from anyone Compartment to be repeated, with one positive test result resulted until the selected Cell is identified. If possible, the Repeat step with a capsule density of one capsule per well. At this Capsule density follows from a positive test result, that the encapsulated cell in question, which the substance of interest secretes itself in the microcapsule is located.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.The invention is described below using an exemplary embodiment explained in more detail.

example

Durch Verschmelzung von Milzzellen von mit Azotobacter-Nitrogenase immunisierten Mäusen (BALB/c- Mäusen) nach dem Polyethylenglycolverfahren mit einer Myelomzellinie von BALB/c-Mäusen (GM 3570) wurde eine Zellinie erzeugt, die IgG-Antikörper gegen Azotobacter-Nitrogenase produzierte. Die Myelomzellinie, die kein IgG produziert, stammte vom Human Genetic Mutant Cell Repository.By fusing spleen cells with Azotobacter nitrogenase immunized mice (BALB / c- Mice) using the polyethylene glycol process a myeloma cell line from BALB / c mice (GM 3570) a cell line was generated, the IgG antibody against Azotobacter nitrogenase. The Myeloma cell line that did not produce IgG from the Human Genetic Mutant Cell Repository.

Die BALB/c-Hybridomzellen (Bezeichnung C25) wurden in einer 150 mM Natriumchloridlösung mit 1,34% (M/V) Natriumalginat (NaG-Kelco) suspendiert. Die viskose Suspension wurde in eine 10-ml-Spritze aufgezogen und dann auf den Düsenkopf der oben beschriebenen Tropfenerzeugungsvorrichtung aufgesetzt. Die Tröpfchen wurden durch Inkontaktbringen mit einer 150 mM Natriumchloridlösung mit 1,2% (M/V) Calciumchlorid in Gelform übergeführt. Die gelierten Kügelchen bildeten eine separate Phase und wurden durch Absaugen gewonnen. Die gelierten Kügelchen wurden dann dreimal mit 150 mM Natriumchloridlösung gewaschen und danach 6 min bei Raumtemperatur in einer Lösung von Poly-L-lysin (Sigma, Molekülmasse 65 000) einer Konzentration von 1,875 mg/ml inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kapseln mit 25 ml 5 mM CHES- Puffer (2-N-Cyclohexylaminoethansulfonsäure, Sigma) in 150 mM Natriumchloridlösung mit 0,2% (M/V) Calciumchlorid, pH 7,5, dann einmal in 150 mM Natriumchloridlösung mit 0,2% (M/V) Calciumchlorid und schließlich einmal mit 150 mM Natriumchloridlösung gewaschen. Die Kapseln wurden dann weitere 4 min bei Raumtemperatur in 150 mM Natriumchloridlösung mit 0,06% (M/V) NaG inkubiert, einmal in 150 mM Natriumchloridlösung gewaschen und weitere 15 min bei Raumtemperatur in 150 mM Natriumchloridlösung mit 55 mM Natriumcitrat inkubiert. Die Lösung wurde dann dekantiert und durch frische 55 mM Natriumcitrat-/Natriumchloridlösung ersetzt. Die Kapseln wurden anschließend weitere 6 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach zweimal mit 150 mM Natriumchloridlösung, einmal mit modifiziertem Eagle-Medium nach Dulbecco (hoher Glucosegehalt) und einmal mit modifiziertem Eagle-Medium (hoher Glucosegehalt) nach Dulbecco mit einem Gehalt von 20% Kälberfetalserum (FCS-Flow Laboratories) und Penicillin, Streptomycin, 1 mM Glutamin und 5 · 10^-5 M Mercaptoethanol gewaschen. Die nach diesem Verfahren erhaltenen Kapseln waren für IgG durchlässig, jedoch gegenüber IgM im wesentlichen undurchlässig.The BALB / c hybridoma cells (designation C25) were suspended in a 150 mM sodium chloride solution with 1.34% (M / V) sodium alginate (NaG-Kelco). The viscous suspension was drawn into a 10 ml syringe and then placed on the nozzle head of the drop generator described above. The droplets were gelatinized by contacting them with a 150 mM sodium chloride solution containing 1.2% (w / v) calcium chloride. The gelled beads formed a separate phase and were collected by suction. The gelled beads were then washed three times with 150 mM sodium chloride solution and then incubated for 6 minutes at room temperature in a solution of poly-L-lysine (Sigma, molecular weight 65,000) at a concentration of 1.875 mg / ml. After the incubation, the capsules were filled with 25 ml of 5 mM CHES buffer (2-N-cyclohexylaminoethanesulfonic acid, Sigma) in 150 mM sodium chloride solution with 0.2% (w / v) calcium chloride, pH 7.5, then once in 150 mM sodium chloride solution washed with 0.2% (M / V) calcium chloride and finally once with 150 mM sodium chloride solution. The capsules were then incubated for a further 4 min at room temperature in 150 mM sodium chloride solution with 0.06% (M / V) NaG, washed once in 150 mM sodium chloride solution and incubated for a further 15 min at room temperature in 150 mM sodium chloride solution with 55 mM sodium citrate. The solution was then decanted and replaced with fresh 55 mM sodium citrate / sodium chloride solution. The capsules were then incubated for a further 6 min at room temperature and then twice with 150 mM sodium chloride solution, once with modified Eagle medium according to Dulbecco (high glucose content) and once with modified Eagle medium (high glucose content) according to Dulbecco with a content of 20% calf fetal serum (FCS-Flow Laboratories) and penicillin, streptomycin, 1 mM glutamine and 5 x 10 ^-5 M mercaptoethanol. The capsules obtained by this method were permeable to IgG, but essentially impermeable to IgM.

Die Zellen innerhalb der Kapseln wurden einige Tage in einem Kulturgefäß kultiviert und dann auf eine Mikrotitrierplatte mit 24 Vertiefungen zusammen mit Kulturmedium bei einer Konzentration von etwa 20 Volumen-% Kapseln und 80 Volumen-% Kulturmedium aufgeteilt. Nach etwa 3 Tagen Inkubation wurden Proben aus jeder Vertiefung nach dem unten angegebenen Verfahren auf Gehalt an Anti-Azotobacter-Nitrogenase getestet. Der Inhalt der Vertiefungen, bei denen ein positives Testergebnis erhalten wurde, wurde in neuen Mikrotitrierplatten mit 24 Vertiefungen unter Verwendung des Kulturmediums weiter kultiviert, bis lebensfähige Hybridomzellen identifiziert wurden, die Anti-Azotobacter-Nitrogenase produzierten.The cells inside the capsules were few Days cultivated in a culture vessel and then on a microtitration plate with 24 wells with culture medium at a concentration of about 20 volume% capsules and 80 volume% culture medium divided. After about 3 days of incubation, samples were taken from each well using the procedure below for anti-Azotobacter nitrogenase content tested. The content of the wells where one positive test result was obtained in new microtitration plates with 24 wells below Cultivated using the culture medium until viable hybridoma cells have been identified which produced anti-Azotobacter nitrogenase.

Zur Ermittlung der Produktion von Anti-Azotobacter- Nitrogenase wurde folgendes Testverfahren herangezogen:
Die Vertiefungen einer EIA-Mikrotitrierplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit 100 µl einer Lösung von Azotobacter-Nitrogenase einer Konzentration von 10 µg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 4° C wurde überschüssige PBS-Lösung abgegossen, worauf die Vertiefungen mit einer 1%igen Lösung von BSA in PBS nachbeschichtet wurden. Nach 1 h wurde die BSA-PBS-Lösung abgegossen. Die Proben wurden mit BSA-PBS-Lösung verdünnt; Standardlösungen wurden durch Verdünnen einer Lösung von gereinigter Anti-Azotobacter-Nitrogenase einer Konzentration von 1 µg/ml in BSA-PBS hergestellt. Die Proben wurden dann 1 h bei 37° C inkubiert, worauf die Vertiefungen dreimal mit PBS-Lösung gewaschen wurden. Anschließend wurde in jede Vertiefung 1 : 1000 verdünntes, mit Peroxidase konjugiertes Ziegen-Anti- Maus-IgG in BSA-PBS zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde jede Vertiefung fünfmal mit PBS-Lösung gewaschen und danach mit 100 µl einer 55 mM Natriumcitratlösung mit 4 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,02 Volum-% Wasserstoffperoxid, pH 4,5, versetzt. Nach 15 min wurde die Reaktion durch Zusatz von 100 µl 4 N HCl gestoppt. Die Platten wurden schließlich mit einem Plattenauswertegerät anhand einer Farbreaktion bezüglich der Aktivität an Anti-Azotobacter-Nitrogenase ausgewertet.The following test procedure was used to determine the production of anti-Azotobacter nitrogenase:
The wells of a 96-well EIA microtitration plate were coated with 100 μl of a solution of Azotobacter nitrogenase at a concentration of 10 μg / ml in phosphate-buffered saline (PBS). After overnight incubation at 4 ° C., excess PBS solution was poured off, and the wells were then coated with a 1% solution of BSA in PBS. After 1 h the BSA-PBS solution was poured off. The samples were diluted with BSA-PBS solution; Standard solutions were prepared by diluting a solution of purified anti-Azotobacter nitrogenase at a concentration of 1 µg / ml in BSA-PBS. The samples were then incubated at 37 ° C for 1 h, after which the wells were washed three times with PBS solution. Subsequently, 1: 1000 diluted goat anti-mouse IgG in BSA-PBS, which was conjugated with peroxidase, was added to each well. After 2 h of incubation at room temperature, each well was washed five times with PBS solution and then 100 μl of a 55 mM sodium citrate solution with 4 mg / ml of o-phenylenediamine and 0.02% by volume of hydrogen peroxide, pH 4.5, were added. After 15 min, the reaction was stopped by adding 100 μl of 4 N HCl. The plates were finally evaluated with a plate evaluation device based on a color reaction with regard to the activity on anti-Azotobacter nitrogenase.

Aus dem obigen Beispiel ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine gegenüber herkömmlichen Verfahrensweisen wesentlich einfachere Selektion von Zellen ermöglicht, die eine bestimmte, angestrebte Substanz produzieren. Die Erfindungskonzeption ist zugleich in sehr breitem Rahmen praktisch anwendbar.From the example above it can be seen that the inventive method a conventional Procedures much simpler Allows selection of cells that have a specific, produce the desired substance. The concept of the invention is also very broad practically applicable.

Claims

1. Method for screening a cell culture for the selection of cells which secrete a desired substance,
marked by
following steps:

(A) encapsulating the cells of the cell culture in a multiplicity of capsules, each having an intracapsular volume which is predetermined by a membrane which is permeable to the desired substance but is impermeable to the cells;
(B) placing the encapsulated cells in a device having a plurality of compartments, each containing an extracapsular medium;
(C) allowing the synthesis of the substance in question by the selected cell (s) and their secretion into the intracapsular volume;
(D) passing the secreted substance through the membrane;
(E) Examine the extracapsular medium of each compartment for the secreted substance
and
(F) repetition of steps (B) to (E) with the capsules from a compartment, which gave a positive test result in step (E) until a capsule containing the cell to be selected is identified.

2. The method according to claim 1, characterized in that Capsules are used in which the density of the viable cells within the intracapsular volume in the statistical mean is not larger than a cell / capsule.