CH615947A5

CH615947A5 - Process for the cultivation of anchorage-dependent cells in a microcarrier culture, microcarriers for carrying it out and use of the process.

Info

Publication number: CH615947A5
Application number: CH1382677A
Authority: CH
Inventors: David W Levine; William G Thilly; Daniel I C Wang; Jason S Wong
Original assignee: Massachusetts Inst Technology
Priority date: 1976-11-11
Filing date: 1977-11-11
Publication date: 1980-02-29
Also published as: FR2370792A1; SE417108B; SE7712700L; DE2759579C2; JPS5614270B2; JPS5362889A; BR7707551A; ZA776251B; NL7712202A; IN147612B; JPS5699790A; CA1063050A; DE2749989A1; FI60407C; JPS575514B2; JPS5735953B2; GB1535150A; SE460906B; DE2749989C3; SE8006993L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur. Die beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Miktroträger besitzen eine in der Folge noch näher definierte Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen, und dadurch wird auf diesen Mikroträgern ein gutes Wachstum der verankerungsabhängigen Zellen erzielt. The present invention relates to a method for growing anchorage-dependent cells in a microcarrier culture. The microcarriers used in the method according to the invention have a subsequently defined amount of positively charged chemical groups, and as a result good growth of the anchoring-dependent cells is achieved on these microcarriers.

Es ist wichtig, dass man in der Lage ist, Zellen von Säugetieren sowohl im Laboratoriums-Masstab als auch im industriellen Masstab zu züchten. Im Laboratoriums-Masstab ist der einschränkende Faktor bei Forschungsarbeiten auf dem Zellgebiet oder Virusgebiet bei sub-zellularem Niveau oft die Menge an Rohmaterial, die für die Untersuchungen zur Verfügung steht. Bei Arbeiten im industriellen Masstab wurden sehr viele Anstrengungen bezüglich der Entwicklung von pharmazeutischen Produkten unternommen, die auf Produkten der Säugetierzellen basieren. Zu derartigen Produkten gehören in erster Linie Impfstoffe, also Vaccinen, gegen Viruserkrankungen des Menschen oder der Tiere, jedoch auch ferner menschliche Wachstumshormone und andere Körperhormone, sowie biochemische Stoffe, die zur medizinischen Anwendung geeignet sind. It is important to be able to grow mammalian cells on both laboratory and industrial scales. On the laboratory scale, the limiting factor in research on the cell area or virus area at the sub-cellular level is often the amount of raw material available for the studies. While working on an industrial scale, a great deal of effort has been devoted to the development of pharmaceutical products based on products from mammalian cells. Such products primarily include vaccines, that is, vaccines, against viral diseases of humans or animals, but also furthermore human growth hormones and other body hormones, as well as biochemical substances which are suitable for medical use.

Einige Arten der Säugetierzellen wurden für ein Wachstum in Suspensionskulturen adaptiert. Beispiele für derartige, in Suspensionen züchtbare Säugetierzellen sind HeLa (des Menschen), BHK (Nierenzellen des Hamsterbabys) und L-Zellen (der Maus). Derartige Zellen haben im allgemeinen keine normale genetische Ausstattung, d. h. zu viele oder zu wenige Chromosomen oder abnormale Chromosomensätze. Oft erzeugen diese Zellen einen Tumor, wenn sie einem Tier der geeigneten Art injiziert werden. Some types of mammalian cells have been adapted for growth in suspension cultures. Examples of such mammalian cells that can be grown in suspensions are HeLa (human), BHK (kidney cells of the hamster baby) and L cells (the mouse). Such cells generally have no normal genetic makeup, i.e. H. too many or too few chromosomes or abnormal sets of chromosomes. These cells often produce a tumor when injected into an animal of the appropriate type.

Andere Arten an Säugetierzellen konnten bis jetzt nicht so adaptiert werden, dass sie in einer Suspensionskultur gezüchtet werden können, und diese Arten an Säugetierzellen wachsen nur dann, wenn sie an einer geeigneten Oberfläche gebunden sind. Derartige Zelltypen werden im allgemeinen als «verankerungsabhängig» («anchorage-dependent») bezeichnet, und zu derartigen Zellen gehören 3T3-Mausfibroblastzellen, Maus-Knochenmark-Epithel-Zellen; Murin-Leukämie-Virus bildende Stämme der Maus-Fibroblasten, primäre und sekundäre Küken-Fibroblasten, WI-38-Menschen-Fibroblast-Zellen und normale Menschenembrio-Lungenfibroblast-Zellen (HEL299) mit der Hinterlegungsnummer ATCC CCL137. Es wurden einige verankerungsabhängige Zellen gezüchtet, die Tumore hervorrufen, aber es wurden auch andere Arten gezüchtet, und es stellte sich heraus, dass diese keine Tumore erzeugten. Es können auch einige verankerungsabhängige Zellen gezüchtet werden, wie die oben genannten Zellen mit der Bezeichnung WI-38 und HEL299, welche in genetischer Hinsicht normal sind. Other species of mammalian cells have not yet been adapted to be grown in a suspension culture, and these species of mammalian cells only grow when bound to a suitable surface. Such cell types are generally referred to as "anchorage-dependent", and such cells include 3T3 mouse fibroblast cells, mouse bone marrow epithelial cells; Murine leukemia virus-forming strains of mouse fibroblasts, primary and secondary chick fibroblasts, WI-38 human fibroblast cells and normal human embryonic lung fibroblast cells (HEL299) with accession number ATCC CCL137. Some anchorage-dependent cells were raised that produce tumors, but other species were also grown and were found not to produce tumors. Some anchorage dependent cells can also be grown, such as the above named cells WI-38 and HEL299, which are genetically normal.

Es wurden bisher wesentliche Fortschritte bei der Zellzüchtung im grossen Masstab von Säugetierzellen erzielt, wenn man diese Zellzüchtung unter Verwendung von Zellstämmen durchführte, die in Suspensionskulturen gezüchtet werden konnten. Im Gegensatz dazu waren die Fortschritte bezüglich einer Zellzüchtung im grossen Ausmass äusserst begrenzt, Significant advances have been made in large-scale mammalian cell growth when this cell culture was performed using cell strains that could be grown in suspension cultures. In contrast, advances in cell growth have been extremely limited,

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wenn verankerungsabhängige Säugetierzellen gezüchtet werden sollten. Bisher angewandte Arbeitstechniken, die zur Bildung von grossen Mengen an verankerungsabhängigen Zellen angewandt wurden, bestanden darin, dass man Verfahren, die im kleinen Ausmass durchgeführt wurden, in linearer Weise ausdehnte. Anlagen zur Zellzüchtung verwendeten eine grosse Anzahl von Reaktionsgefässen für kleine Ansätze, beispielsweise in Form von Schalen, Arzneifläschchen, zylindrischen Rohren und zylindrischen Flaschen. Jedes dieser Reaktionsgefässe stellte eine getrennte Einheit dar oder ein isoliertes Reaktionsgefäss für ein ansatzweises Arbeiten, und deshalb war für jedes dieser Reaktionsgefässe eine individuelle Einstellung der Umgebung nötig. Diese Kontrolleinstellungen bezüglich der Umgebung waren jedoch aufgrund ökonomischer Betrachtungen äusserst primitiv gehalten. Änderungen bezüglich der Nährmittel wurden durch Wechsel des Mediums korrigiert, und dies ist ein Arbeitsvorgang, der zwei Arbeitsschritte umfasst, nämlich die Entfernung des alten Mediums und die Zugabe des neuen Mediums. Da es für eine Anlage mittlerer Grösse nicht unüblich war, Hunderte von derartigen, für einzelne Ansätze bestimmten Reaktionsgefässen zur gleichen Zeit zu bearbeiten, machte selbst ein einziger Wechsel des Mediums die Bearbeitung von Hunderten von Reaktionsgefässen nötig, wobei alle Arbeitsschritte genau durchgeführt und unter absolut sterilen Bedingungen ausgeführt werden muss-ten. Irgendwelche Arbeitsvorgänge, die mehrere Arbeitsschritte umfassten, wie zum Beispiel eine Übertragung der Zellen oder die Ernte der gewonnenen Zellen, führten dementsprechend zu noch viel drastischeren Problemen. Deshalb waren die Kosten für die Ausrüstung und die Vorrichtungen, die Raumkosten und die Kosten für die eingesetzten Arbeitskräfte für derartige Zuchtanlagen sehr hoch. when anchorage-dependent mammalian cells should be grown. Previously used working techniques that were used to form large amounts of anchorage-dependent cells consisted of expanding processes that were carried out on a small scale in a linear manner. Cell cultivation plants used a large number of reaction vessels for small batches, for example in the form of dishes, medicinal bottles, cylindrical tubes and cylindrical bottles. Each of these reaction vessels was a separate unit or an isolated reaction vessel for a batch process, and therefore an individual setting of the environment was necessary for each of these reaction vessels. However, these control settings regarding the environment were kept extremely primitive due to economic considerations. Changes in nutrients have been corrected by changing the medium, and this is a two-step process, namely removing the old medium and adding the new medium. Since it was not uncommon for a medium-sized plant to process hundreds of such reaction vessels intended for individual batches at the same time, even a single change of medium made it necessary to process hundreds of reaction vessels, with all work steps being carried out precisely and under absolutely sterile conditions Conditions had to be carried out. Accordingly, any work involving several steps, such as transferring the cells or harvesting the cells obtained, led to even more drastic problems. Therefore, the cost of the equipment and devices, the space cost and the cost of labor for such breeding facilities were very high.

Es wurden auch andere Arbeitsmethoden vorgeschlagen, die Alternativen zu der oben beschriebenen linearen Vergrösse-rung von kleinen Ansätzen von Kulturen darstellen. Zu derartigen alternativen Methoden, die in der Literatur beschrieben wurden, gehören Plastiksäckchen, aufgestapelte Platten, Spiralfolien oder spiralförmige Filme, Vorrichtungen zur Ausbreitung von Glasperlen, künstliche Kapillare und Mikroträger. Von diesen Systemen besitzen solche auf der Basis von Mikro-trägern spezielle und einzigartige Vorteile. Beispielsweise wird dadurch ein sehr starker Anstieg bezüglich des erreichbaren Verhältnisses von der Oberfläche, an welcher ein Wachstum auftreten kann, also der sogenannten Wachstumsoberfläche, zu dem Volumen des Gefässes erreicht werden, indem man Mikroträger anwendet, und zwar sowohl bezüglich den bisher traditionell angewandten als auch bezüglich den oben genannten, jetzt neu entwickelten alternativen Arbeitsverfahren. Das Verhältnis von Wachstumsoberfläche zu Gefässvolumen wird in der Folge als S/V-Verhältnis abgekürzt. Durch die Erhöhung des S/V-Verhältnisses, die mit Hilfe der Mikroträger erreichbar ist, wird es möglich, aus einer einzigen Einheit aufgebaute Vorrichtungen für eine ansatzweise homogene Züchtung oder ansatzweise quasi-homogene Züchtung oder halb-ansatzweise Züchtung zu entwickeln, wobei diese Züchtungsvorrichtungen eine hohe Produktivität, bezogen auf das Volumen, besitzen. Dementsprechend kann ein einziges aus einem gerührten Tank bestehendes Reaktionsgefäss verwendet werden, bei dem einfache Kontrollvorrichtungen zur Einstellung des pH-Wertes und/oder der Sauerstoffzufuhr angewandt werden, wobei gegebenenfalls diese Einstellungen automatisch gemacht werden, und derartige Tanks stellen eine homogene Umgebung für eine grosse Anzahl an Zellen dar, wodurch es nicht mehr nötig ist, teure und raumverschwendende speziell eingestellte Brutkästen zur Erzeugung der gewünschten Umgebung zu verwenden. Ferner ist auch die Gesamtzahl an Arbeitsschritten, die benötigt wird, um eine bestimmte Anzahl an Zellen zu züchten, durch ein derartiges Arbeitsverfahren wesentlich vermindert. Zusammenfassend sei darauf hingewiesen, dass die Mikroträgermaterialien bezüglich der Wirtschaftlichkeit, des nötigen Startkapitals, des erforderlichen Raumes und der Erfordernisse an Arbeitskraft bei der Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen zu ganz wesentlichen Vorteilen im Vergleich zu bisher bekannten Züchtungsmethoden führen. Other working methods have also been proposed which are alternatives to the linear enlargement of small batches of cultures described above. Such alternative methods that have been described in the literature include plastic bags, stacked plates, spiral foils or spiral films, devices for spreading glass beads, artificial capillaries and microcarriers. Of these systems, those based on microcarriers have special and unique advantages. For example, a very sharp increase in the achievable ratio of the surface on which growth can occur, i.e. the so-called growth surface, to the volume of the vessel will be achieved by using microcarriers, both in terms of the traditionally used and regarding the above-mentioned, newly developed alternative working methods. The ratio of growth surface to vessel volume is subsequently abbreviated as the S / V ratio. By increasing the S / V ratio, which can be achieved with the aid of the microcarriers, it becomes possible to develop devices built from a single unit for a partially homogeneous cultivation or partially quasi-homogeneous cultivation or semi-batch cultivation, these breeding devices have a high productivity in terms of volume. Accordingly, a single reaction vessel consisting of a stirred tank can be used, in which simple control devices are used to adjust the pH and / or the oxygen supply, these settings being made automatically, if necessary, and such tanks provide a homogeneous environment for a large number on cells, which means that it is no longer necessary to use expensive and space-wasting specially designed incubators to create the desired environment. Furthermore, the total number of work steps required to grow a certain number of cells is significantly reduced by such a working method. In summary, it should be pointed out that the microcarrier materials lead to very significant advantages compared to previously known cultivation methods in terms of economy, the necessary start-up capital, the required space and the labor requirements in the cultivation of anchorage-dependent cells.

Die Mikroträger führen auch zu ganz wesentlichen Vorteilen bezüglich einer Kontinuität der Umgebung der Zellen, The microcarriers also lead to very important advantages in terms of continuity in the environment of the cells,

denn die Zellen können so in einer einzigen, gut eingestellten Umgebung gezüchtet werden. Dementsprechend machen es Mikroträger möglich, verankerungsabhängige Säugetierzellen unter bestimmten festgesetzten Umgebungsbedingungen zu züchten, wobei diese Bedingungen immer wieder reguliert werden können, um ein konstantes optimales Zellenwachstum hervorzurufen. because the cells can be grown in a single, well-set environment. Accordingly, microcarriers make it possible to grow anchorage-dependent mammalian cells under certain specified environmental conditions, which conditions can be regulated again and again to produce constant optimal cell growth.

Eines der ziemlich vielversprechenden Mikroträgersysteme, die bisher bekannt wurden, wurde von van Wezel beschrieben, und bei diesem System verwendete man mit Diäthylami-noäthyl substituierte Dextran-Perlen in einem gerührten Tank. Diese Methode wurde in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: A. L. van Wezel, «Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture», Nature 216:64 (1967); D. van Hemert, D.G. Kilburn und A.L. van Wezel, «Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products», Biotechnol. Bioeng. 11:875 (1969), sowie den Aufsatz von A.L. van Wezel, «Microcarrier Cultures of Animal Cells», in dem Buch Tissue Culture, Methods and Applications, P.F. Kruse und M.K. Patterson, eds., Academic Press, New York, Seite 372 (1973). One of the rather promising microcarrier systems known to date has been described by van Wezel, and this system uses dextran beads substituted with diethylaminoethyl in a stirred tank. This method has been described in the following publications: A.L. van Wezel, "Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture", Nature 216: 64 (1967); D. van Hemert, D.G. Kilburn and A.L. van Wezel, "Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products", Biotechnol. Bioeng. 11: 875 (1969), and the essay by A.L. van Wezel, "Microcarrier Cultures of Animal Cells", in the book Tissue Culture, Methods and Applications, P.F. Kruse and M.K. Patterson, eds., Academic Press, New York, page 372 (1973).

Diese Perlen werden von der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc., Piscataway, New Jersey, hergestellt, und es handelt sich dabei um ein Ionenaustauscher-System, das unter dem Markennamen DEAE-Sephadex A50 vertrieben wird. Chemisch gesehen, werden diese Perlen aus einem vernetzten Dextran-Grundgerüst hergestellt, bei dem Diäthylaminoäthyl-gruppen kovalent an die Dextrankette gebunden sind. Man nimmt an, dass die käuflich erhältlichen DEAE-Sephadex A50-Perlen eine Teilchengrösse von 40-120 [im besitzen und ferner eine positive Ladungskapazität von etwa 5,4 Milliäquivalenten pro Gramm an trockenem, vernetztem Dextran, These beads are manufactured by Pharmacia Fine Chemicals Inc., Piscataway, New Jersey, and are ion exchange systems sold under the brand name DEAE-Sephadex A50. From a chemical point of view, these beads are made from a cross-linked dextran backbone in which diethylaminoethyl groups are covalently bound to the dextran chain. It is believed that the commercially available DEAE-Sephadex A50 beads have a particle size of 40-120 µm and also a positive charge capacity of about 5.4 milliequivalents per gram of dry, cross-linked dextran,

wobei in diesem Fall das Gewicht an gebundenen Diäthylami-noäthylgruppen nicht berücksichtigt wird. Die im Markennamen dieser Perlen aufscheinende Bezeichnung «DEAE» stellt eine Abkürzung für Diäthylaminoäthyl dar. Von van Wezel wurde ebenfalls angeführt, dass andere Anionenaustauscherharze, wie zum Beispiel DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 und QAE-Sephadex A25 das Zellenwachstum unterstützen. in this case the weight of bound diethylaminoethyl groups is not taken into account. The name “DEAE” that appears in the brand name of these pearls is an abbreviation for diethylaminoethyl. Van Wezel also mentioned that other anion exchange resins, such as DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 and QAE-Sephadex A25, support cell growth.

Das System, das von van Wezel vorgeschlagen wurde, kombiniert mehrfache Oberflächen mit bewegbaren Oberflächen, und es bietet die Möglichkeit, erneuernde Zellmanipulationen durchzuführen und stellt auch Vorteile bezüglich einer Ver-grösserung des Produktionsmasstabes und der Einstellung und Kontrolle der Zellumgebung dar. Trotz dieser Möglichkeiten wurden die vorgeschlagenen Arbeitsverfahren nicht in wesentlichem Ausmass ausgenützt, weil bei auf diesem Gebiet durchgeführten Forschungsarbeiten Schwierigkeiten bei der Zellzüchtung aufgrund von bestimmten schädlichen Einflüssen angetroffen wurden, die von den Perlen verursacht wurden. Zu diesen schädlichen Einflüssen der Perlen gehören das anfängliche Absterben eines grossen Prozentsatzes der Zellen des Impfstoffes und ungeeignetes Wachstum der Zellen selbst bei denjenigen Zellen, die an die Oberfläche gebunden sind. Man verstand den Grund für diese schädlichen Einflüsse nicht vollständig, es wurde jedoch angenommen, dass diese Nachteile auf eine Toxizität der Perlen oder auf eine Nährstoffadsorption der Perlen zurückzuführen sein können. Es sei in diesem Zusammenhang auf die folgenden Literaturstellen The system proposed by van Wezel combines multiple surfaces with movable surfaces, it offers the possibility to carry out renewed cell manipulations and also offers advantages in terms of increasing the production scale and adjusting and controlling the cell environment. Despite these possibilities, the proposed working methods have not been exploited to any significant extent because research in the field has encountered difficulties in cell growth due to certain deleterious influences caused by the pearls. These deleterious effects of the pearls include the initial death of a large percentage of the cells of the vaccine and inappropriate growth of the cells even in those cells that are attached to the surface. The reason for these deleterious effects was not fully understood, but it was believed that these disadvantages could be due to pearl toxicity or pearl nutrient adsorption. It is in this connection to the following references

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verwiesen: van Wezel. A.L. (1967), Nature 216:64-65; der Aufsatz von van Wezel, A.L. (1973), in dem Buch Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse P.R. und Patterson, M.R. (eds.), Seiten 372-377, Academic Press, New York; van Hemert, P., Kilburn, D.G. und van Wezel, A.L. (1969), Bio-technol. Bioeng. 11:875-885; Horng, C. und McLimans, W. (1975), Biotechnol. Bioeng. 17:713-732. referenced: van Wezel. A.L. (1967) Nature 216: 64-65; the essay by van Wezel, A.L. (1973), in the book Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse P.R. and Patterson, M.R. (eds.), pages 372-377, Academic Press, New York; van Hemert, P., Kilburn, D.G. and van Wezel, A.L. (1969), Bio-technol. Bioeng. 11: 875-885; Horng, C. and McLimans, W. (1975), Biotechnol. Bioeng. 17: 713-732.

Es könnte möglich sein, dass die nachteiligen Einflüsse dieser käuflich erhältlichen Ionenaustauscherharze auf deren Herstellungsmethodik zurückzuführen sind. Bestimmte derartige Herstellungsverfahren für Polyhydroxymaterialien sind in der Patentliteratur beschrieben, wie zum Beispiel in den folgenden USA-Patenten: 3 277 025; 3 275 576; 3 042 667 und It could be possible that the adverse effects of these commercially available ion exchange resins are due to their manufacturing methodology. Certain such manufacturing processes for polyhydroxy materials are described in the patent literature, such as in the following United States patents: 3,277,025; 3,275,576; 3 042 667 and

3 208 994, die alle von Flodin et al. sind. Unabhängig von den Gründen sei jedoch hervorgehoben, dass die gegenwärtig käuflich erhältlichen Materialien ganz einfach nicht ausreichend sind, um ein gutes Zellenwachstum bei einer grossen Vielzahl an Zelltypen zu erreichen. 3,208,994, all of Flodin et al. are. Regardless of the reasons, it should be emphasized, however, that the materials currently available on the market are simply not sufficient to achieve good cell growth with a large number of cell types.

Ein Lösungsversuch zur Überwindung einiger derartiger schädlicher Einflüsse, die bei Versuchen zur Verwendung derartiger käuflich erhältlicher Mikroträger für das Zellenwachstum angetroffen wurden, ist in dem USA-Patent Nr. An attempt to solve some of such deleterious influences encountered in attempts to use such commercially available microcarriers for cell growth is described in U.S. Patent No.

4 036 693 von Levine et al., das am 19. Juli 1977 ausgegeben wurde, beschrieben. In dieser USA-Patentschrift wird ein Verfahren zur Behandlung der erwähnten käuflich erhältlichen Ionenaustauscherharze mit makromolekularen Polyanionen, wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, beschrieben. 4,036,693 to Levine et al., Issued July 19, 1977. This United States patent describes a method for treating the aforementioned commercially available ion exchange resins with macromolecular polyanions, such as carboxymethyl cellulose.

Obwohl sich dieses Verfahren als vorteilhaft herausgestellt hat, wäre es natürlich wesentlich günstiger, wenn die fraglichen Perlen schon von Anfang an so hergestellt werden könnten, dass sie solche Eigenschaften besitzen, die für ein sehr gutes Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen bestimmt sind. Although this method has been found to be advantageous, it would of course be much cheaper if the beads in question could be manufactured from the beginning so that they have properties which are intended for very good growth of anchorage-dependent cells.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Ladungskapazität von Mikroträgern innerhalb eines bestimmten Bereiches eingestellt und/oder abgestimmt werden muss, damit man ein Material erhält, das zu einem guten Wachstum einer grossen Anzahl von verankerungsabhängigen Zelltypen bei vernünftigen Konzentrationen des Mikroträgers führt. Basierend auf diesen Feststellungen wurden nun Mikroträger-Perlen hergestellt, die festgesetzte Ladungskapazitäten besitzen, und derartige Perlen wurden verwendet, um ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zellen zu erzielen. It has now surprisingly been found that the charge capacity of microcarriers has to be adjusted and / or adjusted within a certain range in order to obtain a material which leads to good growth of a large number of anchoring-dependent cell types at reasonable concentrations of the microcarrier. Based on these findings, microcarrier beads having fixed charge capacities have now been made and such beads have been used to achieve good growth of a variety of anchorage dependent cells.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Mikroträger verwendet, die eine Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen auf sich besitzen, wobei die Anzahl der Gruppen so ausgewählt wird, dass eine Austauschkapazität gewährleistet ist, die in einem solchen Bereich liegt, dass ein gutes Wachstum der Zellen erzielt wird, und wobei die Austauschkapazität im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt, und man die verankerungsabhängigen Zellen in einer Suspension des Mikroträgers züchtet und diese Zellkultur unter solchen Bedingungen belässt, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird. The present invention relates to a method for cultivating anchorage-dependent cells in a microcarrier culture, which is characterized in that microcarriers are used which have an amount of positively charged chemical groups on them, the number of groups being selected so that an exchange capacity which is in such a range that good cell growth is achieved and the exchange capacity is in the range of 0.1 to 4.5 milliequivalents per gram of dry, untreated microcarrier, and the anchorage-dependent cells are in one Suspension of the microcarrier is grown and this cell culture is left under such conditions that cell growth is caused.

Bevorzugte Mikroträger, die zur Durchführung des erfin-dungsgemässen Verfahrens verwendet werden, sind dabei vernetzte Dextran-Perlen, die auf ihrer Oberfläche positiv geladene chemische Gruppen aufweisen. Bevorzugte derartige positiv geladene chemische Gruppen sind tertiäre oder quaternäre Amingruppen, wobei von diesen Diäthylaminoäthylgrup-pen speziell bevorzugt sind. Preferred microcarriers which are used to carry out the method according to the invention are crosslinked dextran beads which have positively charged chemical groups on their surface. Preferred such positively charged chemical groups are tertiary or quaternary amine groups, of which diethylaminoethyl groups are particularly preferred.

Die Mikroträger, die zur Durchführung des erfindungsge-mässen Verfahrens herangezogen werden, können vorzugsweise eine Austauschkapazität besitzen, die im Bereich von 1,0 bis 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt, insbesondere pro Gramm der trok-kenen, unbehandelten vernetzten Dextran-Perlen. The microcarriers which are used to carry out the method according to the invention can preferably have an exchange capacity which is in the range from 1.0 to 2.8 milliequivalents per gram of the dry, untreated microcarrier, in particular per gram of the dry, untreated cross-linked dextran beads.

Wie bereits erwähnt wurde, werden bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens die verankerungsabhängigen Zellen in Anwesenheit des suspendierten positiv geladenen Mikroträgers gezüchtet, und man belässt die Zellkultur unter solchen Bedingungen, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens verfährt man dabei so, dass man a) die positiv geladenen Mikroträger in einem Medium zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen suspendiert, As already mentioned, when carrying out the method according to the invention, the anchoring-dependent cells are grown in the presence of the suspended positively charged microcarrier, and the cell culture is left under such conditions that cell growth is brought about. According to a preferred embodiment of the method according to the invention, the procedure is as follows: a) to suspend the positively charged microcarriers in a medium for growing anchoring-dependent cells,

b) die Zellen in die Suspension des Mikroträgers einimpft, wobei sich eine Zellkultur bildet, und c) diese Zellkultur unter solchen Bedingungen belässt, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird. b) inoculating the cells into the suspension of the microcarrier, thereby forming a cell culture, and c) leaving this cell culture under such conditions that cell growth is caused.

Es ist jedoch auch möglich, das erfindungsgemässe Verfahren so auszuführen, dass in das Medium zur. Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen zunächst die Zellen eingeimpft werden, und dann in diesem Medium anschliessend die positiv geladenen Mikroträger suspendiert werden und die Zellkultur unter solchen Bedingungen belassen wird, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird. However, it is also possible to carry out the method according to the invention in such a way that. Cultivation of anchorage-dependent cells, the cells are first inoculated, and then the positively charged microcarriers are then suspended in this medium and the cell culture is left under such conditions that cell growth is brought about.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Mikroträger zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sich auf diesen Mikroträgern eine solche Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen befindet, dass eine Austauschkapazität der Mikroträger gewährleistet ist, die in einem Bereich liegt, dass ein gutes Zellwachstum auftritt, wobei die Austauschkapazität im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt. Furthermore, the present invention relates to microcarriers for carrying out the method according to the invention for growing anchoring-dependent cells, which are characterized in that there are such an amount of positively charged chemical groups on these microcarriers that an exchange capacity of the microcarriers is ensured, which is in one area is that good cell growth occurs, with the exchange capacity in the range of 0.1 to 4.5 milliequivalents per gram of dry, untreated microcarrier.

Wenn diese Mikroträger vernetzte Dextran-Perlen sind, dann weisen sie vorzugsweise auf ihrer Oberfläche eine Austauschkapazität auf, die im Bereich von 1,0 bis 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm der trockenen, unbehandelten vernetzten Dextran-Perlen liegt. Die Grösse der Dextran-Perlen ist vorzugsweise so, dass sie im trockenen Zustand einen Durchmesser von 75 |xm aufweisen, und in hydratisiertem Zustand einen Durchmesser besitzen, der im Bereich von 120 bis 200 um liegt. If these microcarriers are cross-linked dextran beads, then they preferably have an exchange capacity on their surface which is in the range of 1.0 to 2.8 milliequivalents per gram of the dry, untreated cross-linked dextran beads. The size of the dextran beads is preferably such that they have a diameter of 75 μm in the dry state and a diameter in the range from 120 to 200 μm in the hydrated state.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens auf die Gewinnung von Nebenprodukten des Wachstums der verankerungsabhängigen Zellen. Diese Anwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Suspension der positiv geladenen Mikroträger in einem Kulturmedium zur Züchtung der verankerungsabhängigen Zellen herstellt, Another object of the present invention is the application of the method according to the invention to the production of by-products of the growth of the anchoring-dependent cells. This application is characterized in that a) a suspension of the positively charged microcarriers is produced in a culture medium for the cultivation of the anchorage-dependent cells,

b) dieses Kulturmedium mit den verankerungsabhängigen Zellen beimpft, wobei sich eine Zellkultur bildet, b) inoculating this culture medium with the anchoring-dependent cells, a cell culture being formed,

c) diese Zellkultur unter solchen Bedingungen aufrechterhält, dass die Bildung der Nebenprodukte des Zellwachstums auftritt, und d) die Nebenprodukte des Zellwachstums gewinnt. c) maintaining this cell culture under conditions such that the formation of the by-products of cell growth occurs, and d) recovering the by-products of the cell growth.

Beispiele für Nebenprodukte des Zellwachstums, die in dieser Weise gewonnen werden könnten, sind Viren, Hormone und Interferon. Ferner könnten auch Impfstoffe, also Vaccinen, auf diese Weise hergestellt werden und andere Nebenprodukte des Zellwachstums erzeugt werden. Das Verfahren ist sowohl für die Gewinnung von tierischen Viren als auch von Pflanzenviren geeignet. Examples of by-products of cell growth that could be obtained in this way are viruses, hormones and interferon. Vaccines, i.e. vaccines, could also be produced in this way and other by-products of cell growth could be generated. The method is suitable for the extraction of animal viruses as well as plant viruses.

Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial, das zur Herstellung der A preferred starting material for the production of

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beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroträger eingesetzt werden kann, sind Polymermaterialien, die gebundene Hydroxylgruppen aufweisen, wobei von diesen Materialien, wie bereits weiter oben erwähnt wurde, vernetzte Dex-tran-Perlen speziell bevorzugt sind. Wenn man an diese Perlen als positiv geladene Gruppen tertiäre oder quaternäre Amin-gruppen binden will, dann ist es vorteilhaft, die Dextran-Perlen mit einer wässrigen Lösung eines tertiären oder quater-nären Amines zu behandeln, beispielsweise mit dem Chlorid des entsprechenden Amines. Wie bereits erwähnt wurde, sind speziell bevorzugte Amingruppen die Diäthylaminoäthylgrup-pen, und um diese Gruppierungen an die Dextran-Perlen zu binden, kann man beispielsweise die Dextran-Perlen mit dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides und einem alkalischen Material, beispielsweise Natriumhydroxyd, behandeln. Microcarriers which can be used in the process according to the invention are polymer materials which have bound hydroxyl groups, of which, as already mentioned above, crosslinked dextran beads are particularly preferred. If one wants to bind tertiary or quaternary amine groups to these beads as positively charged groups, then it is advantageous to treat the dextran beads with an aqueous solution of a tertiary or quaternary amine, for example with the chloride of the corresponding amine. As already mentioned, particularly preferred amine groups are the diethylaminoethyl groups, and in order to bind these groups to the dextran beads, the dextran beads can be treated, for example, with the chloride of diethylaminoethylchloride and an alkaline material, for example sodium hydroxide.

' Die Einstellung der benötigten spezifischen Ladungskapazität der Dextran-Perlen kann durchgeführt werden, indem man die absoluten Mengen an Dextran zu dem tertiären Aminsalz und dem alkalischen Material variiert, oder indem man das Verhältnis dieser Materialien und/oder die Zeit und Temperatur der Behandlung verändert. Wesentlich ist dabei, dass man schliesslich einen Mikroträger erhält, der eine Austauschkapazität besitzt, die im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt. Adjustment of the required specific charge capacity of the dextran beads can be done by varying the absolute amounts of dextran to the tertiary amine salt and the alkaline material, or by changing the ratio of these materials and / or the time and temperature of the treatment. It is essential that finally a microcarrier is obtained which has an exchange capacity which is in the range from 0.1 to 4.5 milliequivalents per gram of the dry, untreated microcarrier.

Das erfindungsgemässe Verfahren, das unter Verwendung der Mikroträger mit genau definierter Ladungskapazität durchgeführt wird, ermöglicht die Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen, ohne dass am Anfang hohe Verluste an Zellen auftreten, die bisher bei käuflich erhältlichen Mikroträgern beobachtet wurden. Auf den beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroträgern breiten sich die am Träger haftenden Zellen aus und wachsen auf den Perlen bis zum Zusammenfliessen der Zellbezirke, wobei man dadurch extrem hohe Zellkonzentrationen in dem zur Suspension herangezogenen Medium erhält. Die Konzentration der Mikroträger in der Suspension ist nicht auf ziemlich niedrige Werte beschränkt, wie dies bei bisher beschriebenen Materialien üblich war. Es scheint, dass das Zellenwachstum nur durch solche Faktoren begrenzt ist, die offenbar nicht auf die Mikroträger zurückzuführen sind. Aus diesen Gründen können starke Erhöhungen in der Produktivität der Zellkultur pro Volumeneinheit, also in der volumetrischen Produktivität, erzielt werden. Kurz gesagt können die potentiellen Vorteile, die durch die Verwendung von Mikroträgern bei der Zellzüchtung erreichbar sind, und zwar insbesondere bei der Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen, jetzt tatsächlich ausgenützt werden. The method according to the invention, which is carried out using the microcarriers with a precisely defined charge capacity, enables the anchoring-dependent cells to be grown without initially having high cell losses which have previously been observed in commercially available microcarriers. On the microcarriers used in the method according to the invention, the cells adhering to the carrier spread and grow on the beads until the cell regions come together, whereby extremely high cell concentrations are obtained in the medium used for the suspension. The concentration of the microcarriers in the suspension is not limited to fairly low values, as was customary with the materials described so far. It appears that cell growth is limited only by factors that do not appear to be due to the microcarriers. For these reasons, sharp increases in the productivity of the cell culture per unit volume, that is, in the volumetric productivity, can be achieved. In short, the potential benefits that can be achieved through the use of microcarriers in cell growth, particularly in the growth of anchorage dependent cells, can now actually be exploited.

Die Erfindung sei nun anhand der Zeichnung näher erläutert. The invention will now be explained in more detail with reference to the drawing.

In Figur 1 ist auf der Ordinate die Zellkonzentration in 105 Zellen pro Millimeter aufgetragen. Auf der Abszisse ist die Zeit in Stunden aufgetragen. Es wurde das Wachstum von normalen diploiden Menschenembryo-Lungenfibrinoblast-Zellen (HEL299) untersucht, und es wurden bei der Züchtung Mikroträgerkonzentrationen von 2 g vernetztem trockenem Dextran-Mikroträger pro Liter angewandt, und zwar sowohl bei dem käuflich erhältlichen mit Diäthylaminoäthylgruppen substituierten Dextran-Mikroträger als auch bei dem nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Diäthylaminoäthylgruppen aufweisenden Mikroträger. In Figur 1 sind die Ergebnisse, welche mit Hilfe der bisher bekannten Miktroträ-ger erzielt wurden, die mit ausgefüllten schwarzen Punkten angegebenen Messpunkte, während die Messwerte, die mit Hilfe der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Träger erhalten wurden, durch unausgefüllte Kreise veranschaulicht sind. Aus den beiden Kurven sieht man, dass mit Hilfe der nach dem erfindungsgemässen Verfahren behandelten Trägermaterialien ein wesentlicher Anstieg der Zellkonzentration erreicht werden kann, während in diesem Fall mit Hilfe der im Handel erhältlichen Trägermaterialien sogar ein Absinken der Zellkonzentration hervorgerufen wurde. In Figure 1, the cell concentration in 105 cells per millimeter is plotted on the ordinate. Time is plotted in hours on the abscissa. The growth of normal human diploid embryo pulmonary fibrinoblast cells (HEL299) was examined and microcarrier concentrations of 2 g of crosslinked dry dextran microcarrier per liter were used in the cultivation of both the commercially available dextran microcarrier substituted with diethylaminoethyl groups and also in the case of the microcarrier having diethylaminoethyl groups and produced by the process according to the invention. In FIG. 1, the results which have been achieved with the aid of the previously known microcarriers are the measurement points indicated with filled black dots, while the measurement values obtained with the aid of the carriers produced according to the method according to the invention are illustrated by open circles. It can be seen from the two curves that a substantial increase in the cell concentration can be achieved with the aid of the carrier materials treated according to the method according to the invention, while in this case even a decrease in the cell concentration was brought about with the aid of the commercially available carrier materials.

Figur 2 ist ebenfalls ein Diagramm, wobei wieder auf der Ordinate die Zellkonzentrationen in 105 Zellen pro Milliliter angegeben sind, und auf der Abszisse auch hier die Zeit in Stunden aufgetragen ist. Der verwendete Mikroträger war in diesem Fall ein nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellter Mikroträger und dieser wurde in einer Konzentration von 5 g pro Liter angewandt, wobei der Mikroträger als trockenes vernetztes Dextran berechnet wurde. Es wurden zwei Arten an Zellen untersucht, und zwar normale diploide Lungenfibrinoblast-Zellen des menschlichen Embryo (HEL299) und sekundäre Kükenembryo-Fibrinoblasten. Die Werte für die menschlichen HEL299-Zellen sind durch Kreise veranschaulicht, während die Werte für die sekundären Kükenfibrinoblast-Zellen durch unausgefüllte Dreiecke veranschaulicht werden. FIG. 2 is also a diagram, the cell concentrations in 105 cells per milliliter again being shown on the ordinate, and the time in hours being plotted on the abscissa. The microcarrier used in this case was a microcarrier produced by the process according to the invention and this was used in a concentration of 5 g per liter, the microcarrier being calculated as dry crosslinked dextran. Two types of cells were examined, normal human embryo diploid lung fibrinoblast cells (HEL299) and secondary chick embryo fibrinoblasts. The values for the human HEL299 cells are illustrated by circles, while the values for the secondary chick fibrinoblast cells are illustrated by open triangles.

In der Folge werden nun bevorzugte Ausführungsarten der Erfindung beschrieben. Preferred embodiments of the invention will now be described below.

In der vorliegenden Beschreibung versteht man unter dem Ausdruck «Mikroträger» bzw. «Mikroträger für die Zellkultur» oder «Mikroträger für das Zellenwachstum bzw. die Zellenzüchtung» kleine getrennte Teilchen, die geeignet sind, dass Zellen daran gebunden werden und darauf wachsen. Oft, jedoch nicht immer, sind die Mikroträger poröse Perlen oder Körner, die aus dem Polymermaterial gebildet werden. Üblicherweise haften die Zellen und wachsen auch an der äusseren Oberfläche derartiger Perlen. In the present description, the expression “microcarrier” or “microcarrier for cell culture” or “microcarrier for cell growth or cell growth” is understood to mean small separate particles which are suitable for cells to be bound to and grow on them. Often, but not always, the microcarriers are porous beads or grains formed from the polymer material. Usually the cells adhere and also grow on the outer surface of such beads.

Wie weiter oben beschrieben wurde, wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Menge der Ladungskapazität auf Mikroträgern für die Zellzüchtung in einem gewissen Bereich eingestellt oder einreguliert werden muss, damit ein entsprechendes Zellwachstum bei vernünftigen Konzentrationen der Mikroträger erreicht wird. Geeignete Arbeitsbedingungen und bevorzugte Bereiche hängen von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel den speziellen Zellen, die gezüchtet werden sollen, der Art der Mikroträger, der Konzentration der Mikroträger und anderen Variablen des Züchtungsverfahrens, einschliesslich der Zusammensetzung des Züchtungsmediums. In allen Fällen jedoch hat es sich herausgestellt, dass die Menge der Ladungskapazität, die geeignet ist, wesentlich unterhalb der Ladungsmengen liegt, von denen man annahm, dass sie bisher in den käuflich erhältlichen Anionaustauscherharzen anwesend waren, die bis jetzt als Mikroträger für Zellkulturen vorgeschlagen worden waren. Beispielsweise nimmt man an, dass die DEAE-Sephadex A50-Perlen, die von van Wenzel vorgeschlagen wurden, eine Ladungskapazität von etwa 5,4 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten vernetzten Dextrans, also des Dextrans ohne Berücksichtigung seiner aufgebrachten Diäthylaminoäthylgruppen, besitzen. Im Gegensatz zu dieser relativ hohen Ladungskapazität wurden nun die erfindungsgemässen Mikroträger hergestellt, die eine Ladungskapazität von etwa 0,1 bis etwa 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm der trockenen unbehandelten Mikroträger besitzen. Diese fraglichen Mikroträger haben sich als geeignet zur Durchführung der erfindungsgemässen Zellzüchtungen herausgestellt. Wenn die Mikroträger Ladungskapazitäten aufweisen, die unterhalb von etwa 0,1 Milliäquivalenten pro Gramm liegen, dann nimmt man an, dass die Zellen Schwierigkeiten besitzen, sich an den Mikroträgern anzuheften. Wenn andererseits die Mikroträger Ladungskapazitäten besitzen, die über etwa 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm liegen, dann treten Verluste der ursprünglichen zur Beimpfung verwendeten Zellen auf, und selbst die überlebenden Zellen wachsen nicht gut, insbesondere dann, wenn relativ hohe Mikroträgerkonzentrationen angewandt werden. As has been described above, it has now surprisingly been found that the amount of charge capacity on microcarriers for cell growth has to be adjusted or regulated in a certain range in order for corresponding cell growth to be achieved at reasonable concentrations of the microcarriers. Suitable working conditions and preferred ranges depend on various factors, such as the specific cells to be grown, the type of microcarrier, the concentration of the microcarrier and other variables of the growth process, including the composition of the growth medium. In all cases, however, it has been found that the amount of charge capacity that is suitable is significantly less than the amount of charges that have been thought to be present in the commercially available anion exchange resins that have been proposed as microcarriers for cell cultures were. For example, it is believed that the DEAE-Sephadex A50 beads proposed by van Wenzel have a charge capacity of approximately 5.4 milliequivalents per gram of dry, untreated, cross-linked dextran, i.e. dextran without considering its applied diethylaminoethyl groups. In contrast to this relatively high charge capacity, the microcarriers according to the invention have now been produced, which have a charge capacity of approximately 0.1 to approximately 4.5 milliequivalents per gram of the dry untreated microcarriers. These microcarriers in question have been found to be suitable for carrying out the cell growth according to the invention. If the microcarriers have charge capacities that are below about 0.1 milliequivalents per gram, it is believed that the cells have difficulty attaching to the microcarriers. On the other hand, if the microcarriers have charge capacities in excess of about 4.5 milliequivalents per gram, losses of the original cells used for inoculation occur and even the surviving cells do not grow well, especially when relatively high microcarrier concentrations are used.

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Für das Wachstum von normalen diploiden menschlichen Fibroblasten auf vernetzten Dextran-Mikroträgern hat es sich herausgestellt, dass ein bevorzugter Bereich der Ladungskapazität, die von den Diäthylaminoäthylgruppen zur Verfügung gestellt wird, im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten vernetzten Dextrans liegt. Während der bevorzugte Bereich je nach den unterschiedlichen Zelltypen und den bei der Züchtung angewandten Bedingungen variieren kann, so kann man dennoch annehmen, dass die bevorzugten Bereiche für beliebige angewandte Bedingungen im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm liegen werden. Die bevorzugten und die optimalen Bedingungen können vom Fachmann auf diesem Gebiet für jede Art an vorgegebenen Züchtungsbedingungen durch kurze Vorversuche bestimmt werden. For the growth of normal diploid human fibroblasts on cross-linked dextran microcarriers, it has been found that a preferred range of charge capacity provided by the diethylaminoethyl groups ranges from about 1.0 to about 2.8 milliequivalents per gram of dry, untreated cross-linked Dextrans. While the preferred range may vary depending on the different cell types and the conditions used in culturing, it can still be assumed that the preferred ranges for any conditions used will be in the range of 0.1 to 4.5 milliequivalents per gram. The preferred and the optimal conditions can be determined by the person skilled in the art for each type of given breeding conditions by short preliminary tests.

Es ist klar zu sehen, dass natürlich gewisse Schwierigkeiten bestehen, wenn man versucht, die Ladungskapazität von Mikroträgern genau auf die Gewichtseinheit bezogen zu definieren. Beispielsweise werden zwei Perlen, die miteinander in jeder Weise identisch sind, mit Ausnahme dessen, dass sie aus Materialien erzeugt wurden, die unterschiedliche Dichten besitzen, und die auf der Oberfläche die gleiche Ladungsverteilung aufweisen, unterschiedliche Werte für ihre Ladungskapazität pro Gewichtseinheit liefern. In gleicher Weise können zwei Perlen, die identische Ladungskapazitäten pro Gewichtseinheit aufweisen, gegebenenfalls ziemliche unterschiedliche Ladungsverteilungen auf den Perlen aufweisen. It is clear to see that there are, of course, certain difficulties when trying to define the charge capacity of microcarriers precisely in relation to the weight unit. For example, two beads that are identical to each other in every way, except that they are made from materials that have different densities and that have the same charge distribution on the surface, will give different values for their charge capacity per unit weight. In the same way, two beads, which have identical charge capacities per unit weight, can possibly have quite different charge distributions on the beads.

Eine andere Definition kann gemacht werden, indem man den Bereich von geeigneten Ladungen in dem Mass-System der Ladungskapazizät pro Gewichtseinheit des Mikroträgers in seiner endgültigen, bei der Verwendung angewandten Form angibt. Eine derartige Angabe würde weitere Faktoren berücksichtigen, wie zum Beispiel das Gewicht der an den Mikroträger gebundenen Diäthylaminoäthylgruppen oder andere positiv geladene Gruppen und auch die Hydratation der Perlen und ähnliche weitere Faktoren. Im Gegensatz dazu basiert die zuerst genannte Definition auf dem trockenen vernetzten Dextran und trägt derartigen zuletzt genannten Faktoren in keiner Weise Rechnung. Da die Mikroträger in wässrige Zellkulturmedien eingebracht werden sollen, soll die Dichte der Mikroträger in der Nähe von 1,0 g pro cm3 liegen, und zwar deshalb, weil die Miktroträger leicht in dem Kulturmedium dispergierbar sein sollen. Unter Berücksichtung dieser Tatsache hat man sich deshalb entschieden, dass der Bereich geeigneter Ladungskapazitäten für die erfindungsgemässen Mikroträger in der beschriebenen Weise definiert im Bereich von etwa 0.012 bis etwa 0,25 Milliäquivalenten pro Gramm liegen soll. Another definition can be made by giving the range of suitable charges in the measurement system of charge capacity per unit weight of the microcarrier in its final form used in use. Such a statement would take into account other factors such as the weight of the diethylaminoethyl groups bound to the microcarrier or other positively charged groups and also the hydration of the pearls and similar other factors. In contrast, the first-mentioned definition is based on the dry cross-linked dextran and in no way takes into account such last-mentioned factors. Since the microcarriers are to be introduced into aqueous cell culture media, the density of the microcarriers should be in the vicinity of 1.0 g per cm 3, because the microcarriers should be easily dispersible in the culture medium. Taking this fact into account, it has therefore been decided that the range of suitable charge capacities for the microcarriers according to the invention in the manner described should be in the range from about 0.012 to about 0.25 milliequivalents per gram.

Die Bereiche von geeigneten Ladungskapazitäten, die weiter oben definiert wurden, bezogen auf die Gewichtsbasis, sind gültig, wenn man annimmt, dass die Mikroträger eine im wesentlichen einheitliche Ladungsverteilung über ihre Gesamtmasse aufweisen. Wenn die Ladungsverteilung ungleichmässig ist, dann könnte es möglich sein, geeignete Mikroträger zu haben, deren Ladungskapazität ausserhalb der angeführten Bereiche liegen. Das wesentliche Kriterium ist natürlich, dass die Ladungskapazität so eingestellt und/oder abgestimmt wird, dass sie einen Wert besitzt, der ausreichend ist, um ein gutes Zellenwachstum auf den Mikroträgern zu gewährleisten. The ranges of suitable charge capacities, defined above, based on weight, are valid if it is assumed that the microcarriers have a substantially uniform charge distribution over their total mass. If the charge distribution is uneven, then it may be possible to have suitable microcarriers whose charge capacity is outside the ranges mentioned. The essential criterion is, of course, that the charge capacity is adjusted and / or adjusted so that it has a value that is sufficient to ensure good cell growth on the microcarriers.

Da es möglich ist, dass das Ladungsmuster auf der äusseren Oberfläche der Mikroträger derjenige Faktor ist, der tatsächlich die ausschlaggebende Bedeutung besitzt, ist es auch wünschenswert, in der Lage zu sein, einen geeigneten Bereich der Ladungskapazität in der Masseinheit des wahrscheinlich auftretenden Oberflächenmusters zu definieren. Dies kann gemacht werden, indem man annimmt, dass der aktive Teil der Mikroträger sich ausschliesslich auf der äusseren Oberfläche der Perlen bis zu einer Tiefe von etwa 20Â (Angström) befindet. Wenn man ferner annimmt, dass die geladenen Gruppen in den weiter oben erwähnten Fällen gleichmässig über die Perlen verteilt sind, dann können die oben angegebenen Bereiche in Ladungskapazitäten in dieser äusseren Schale umgerechnet werden. Wenn nun dieses Näherungsverfahren verwendet wird, dann liegt der Bereich der Ladungskapazitäten, der sich als geeignet herausgestellt hat, in der Grössenord-nung von etwa 0,012 Milliäquivalenten pro cm3 bis etwa 0,25 Milliäquivalenten pro cm3. Dieses Näherungsverfahren berücksichtigt Änderungen des Volumens des Mikroträgers aufgrund von unterschiedlichen Ladungsdichten. Since it is possible that the charge pattern on the outer surface of the microcarrier is the factor that is actually of crucial importance, it is also desirable to be able to define an appropriate range of charge capacity in the unit of measurement of the surface pattern likely to occur . This can be done by assuming that the active part of the microcarrier is only on the outer surface of the beads to a depth of about 20Â (angstroms). If, furthermore, it is assumed that the charged groups are evenly distributed over the beads in the cases mentioned above, then the ranges given above can be converted into charge capacities in this outer shell. If this approximation method is now used, the range of charge capacities that has been found to be suitable is in the order of magnitude of approximately 0.012 milliequivalents per cm3 to approximately 0.25 milliequivalents per cm3. This approximation takes into account changes in the volume of the microcarrier due to different charge densities.

Mikroträger, welche die benötigte Ladungskapazität besitzen, können hergestellt werden, indem man Mikroträger, die aus Polymermaterialien gebildet wurden, welche gebundene Hydroxylgruppen aufweisen, mit einer wässrigen Lösung eines alkalischen Materiales und einem tertiären Amin oder quater-nären Amin behandelt. Die Perlen können am Anfang in einem wässrigen Medium gequollen sein, ohne dass andere Bestandteile anwesend sind, oder man kann die Perlen ganz einfach mit dem wässrigen Medium in Berührung bringen, das bereits die benötigte Base und das erforderliche Amin enthält. Dieses Verfahren, bei welchem alkalische Materialien eingesetzt werden, um die Bindung der positiv geladenen Amino-gruppen an das Hydroxylgruppen enthaltende Polymermaterial hervorzurufen, wird von Hartmann in der USA-Patentschrift Nr. 1 777 970 beschrieben. Microcarriers that have the required charge capacity can be made by treating microcarriers formed from polymeric materials that have bound hydroxyl groups with an aqueous solution of an alkaline material and a tertiary amine or quaternary amine. The beads may initially be swollen in an aqueous medium without other ingredients present, or the beads may simply be contacted with the aqueous medium which already contains the base and amine required. This method, in which alkaline materials are used to cause the binding of the positively charged amino groups to the hydroxyl group-containing polymer material, is described by Hartmann in US Pat. No. 1,777,970.

Beispiele für geeignete Hydroxylgruppen enthaltende Polymermaterialien, die zur Herstellung der Mikroträger verwendet werden können, sind Polysaccharide, wie zum Beispiel Dextran, Dextrin, Stärke, Cellulose, Polyglucose und substituierte Derivate dieser Polysaccharide. Bestimmte synthetische Polymermaterialien, wie zum Beispiel Polyvinylalkohol und hydroxysubstituierte Acrylate oder Methacrylate wie beispielsweise Hydroxyäthyl-methacrylat, sind ebenfalls geeignet. Dextran, und insbesondere vernetztes Dextran, in Form von kleinen Kügelchen, Körnern oder Perlen ist speziell bevorzugt, weil dieses Material käuflich erhältlich ist, relativ billig ist und zu Mikroträgern führt, welche ein hervorragend gutes Zellwachstum unterstützen. Examples of suitable hydroxyl group-containing polymer materials that can be used to prepare the microcarriers are polysaccharides, such as dextran, dextrin, starch, cellulose, polyglucose and substituted derivatives of these polysaccharides. Certain synthetic polymer materials such as polyvinyl alcohol and hydroxy substituted acrylates or methacrylates such as hydroxyethyl methacrylate are also suitable. Dextran, and in particular cross-linked dextran, in the form of small beads, grains or pearls is particularly preferred because this material is commercially available, is relatively cheap and leads to microcarriers which support excellent cell growth.

Beliebige Materialien, die alkalisch sind, können zur Durchführung der Reaktion verwendet werden. Die Alkalimetallhy-droxyde, wie zum Beispiel Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, sind jedoch die bevorzugten alkalisch reagierenden Substanzen. Any materials that are alkaline can be used to carry out the reaction. However, the alkali metal hydroxides, such as sodium hydroxide or potassium hydroxide, are the preferred alkaline substances.

Sowohl tertiäre Amine als auch quaternäre Amine sind geeignete Ausgangsmaterialien zur Herstellung positiv geladener Gruppen, die an die Hydroxylgruppen enthaltenden Polymermaterialien gebunden werden können. Speziell bevorzugte Materialien sind chlorsubstituierte oder bromsubstituierte tertiäre Amine oder Salze derselben, und als spezielle Beispiele seien genannt: Both tertiary amines and quaternary amines are suitable starting materials for the production of positively charged groups which can be bonded to the polymer materials containing hydroxyl groups. Particularly preferred materials are chlorine-substituted or bromine-substituted tertiary amines or salts thereof, and specific examples include:

Diäthylaminoäthylchlorid, Diäthylaminoäthylbromid, Dimethylaminoäthylchlorid, Dimethylaminoäthylbromid, Diäthylaminomethylchlorid, Diäthylaminomethylbromid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylchlorid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylbromid, Di-(hydroxyäthyl)-aminomethylchlorid, Di-(hydroxyäthyl)-aminomethylbromid, ß-Morpholino-äthylchlorid, ß-Morpholinoäthylbromid, ß-Morpholino-methylchlorid, ß-Morpholinomethylbromid und Salze dieser Verbindungen, wie zum Beispiel die entsprechenden Hydro-chloride. Diethylaminoethylchloride, diethylaminoethylbromide, dimethylaminoethylchloride, dimethylaminoethylbromide, diethylaminomethylchloride, diethylaminomethylbromide, di- (hydroxyethyl) -aminoethylchloride, di- (hydroxyethyl) -aminoethylbromide, di- (hydroxyethyl) -aminomethylbromide, di- (hydroxyethyl) -aminomethylbromide, di- (hydroxyethyl) -aminomethylchloride, di- (hydroxyethyl) -aminomethylchloride, di- (hydroxyethyl) -aminomethylchloride, di- (hydroxyethyl) -aminomethylchloride, di- (hydroxyethyl) -aminomethylchloride, di- (hydroxyethyl) aminomethylchloride, ß-morpholinoethyl bromide, ß-morpholino-methyl chloride, ß-morpholinomethyl bromide and salts of these compounds, such as the corresponding hydrochlorides.

Ein weiter Bereich der Reaktionstemperaturen und der Reaktionszeiten kann angewandt werden. Es ist vorzuziehen, die Umsetzungen bei Temperaturen durchzuführen, die im Bereich von etwa 18 bis 65°C liegen. Es können jedoch auch andere Temperaturen angewandt werden. Die Reaktionskine5 A wide range of reaction temperatures and times can be used. It is preferable to carry out the reactions at temperatures ranging from about 18 to 65 ° C. However, other temperatures can also be used. The reaction kin5

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tik hängt natürlich in weitem Ausmass von der Reaktionstemperatur ab und auch von der Konzentration der Reaktionspartner. Sowohl die Zeit als auch die Temperatur beeinflussen die schliesslich erreichte endgültige Austauschkapazität. Tics naturally depend to a large extent on the reaction temperature and also on the concentration of the reactants. Both the time and the temperature influence the final exchange capacity finally reached.

Bis jetzt wurden die Gründe, warum die Ladungskapazität der Mikroträger eine speziell kritische Grösse beim Zellenwachstum ist, noch nicht vollständig verstanden. Obwohl der Erfindungsgedanke durch keine Theorie irgendwie eingeengt werden soll, ist es dennoch möglich, dass die Ladungskapazität an der Oberfläche zu bestimmten lokalen Diskontinuitäten der Zusammensetzung des Mediums führt, und dass dies der bedeutendste Einfluss bezüglich der Hemmung oder Förderung des Wachstums von Zellen in Kulturen auf Mikroträgern ist. Irgendwelche anderen Möglichkeiten der Erklärung der beobachteten Effekte seien jedoch in keiner Weise irgendwie ausgeschlossen. The reasons why the charge capacity of the microcarriers is a particularly critical variable in cell growth have not yet been fully understood. Although the theory is not to be narrowed in any way by any theory, it is still possible that the surface charge capacity leads to certain local discontinuities in the composition of the medium, and this has the most significant impact on inhibiting or promoting the growth of cells in cultures Microcarriers is. However, any other way of explaining the observed effects is in no way excluded.

Es gibt natürlich bestimmte Perlen, die nicht geeignet sind, um ein gutes Zellwachstum hervorzurufen, selbst dann, wenn sie eine Ladungskapazität haben, die innerhalb der angegebenen Bereiche liegt. Dies kann auf Seitenketten an denjenigen Gruppen zurückzuführen sein, die die Ladungskapazität hervorrufen und die toxisch sind oder sonst irgendwelche nachteilige Einflüsse auf das Zellenwachstum besitzen. Weitere beeinflussende Faktoren können die Anwesenheit von absorbierten oder adsorbierten schädlichen Zusammensetzungen oder Verbindungen sein, oder Perlen können auch aufgrund ihrer Porosität oder aus anderen Gründen nicht geeignet sein. Wenn derartige Perlen zur Zellzüchtung ausser aufgrund ihrer Ladungskapazität nicht geeignet sind, dann werden diese Perlen nicht als Mikroträger für das Zellwachstum betrachtet. There are, of course, certain beads that are not suitable for producing good cell growth, even if they have a charge capacity that is within the specified ranges. This may be due to side chains on those groups that produce the charge capacity and that are toxic or have any other adverse effects on cell growth. Other influencing factors may be the presence of absorbed or adsorbed harmful compositions or compounds, or pearls may not be suitable due to their porosity or for other reasons. If such beads are not suitable for cell growth other than because of their charge capacity, then these beads are not considered to be microcarriers for cell growth.

Die Erfiindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert. The invention will now be explained in more detail by means of examples.

Beispiel l Example 1

Herstellung von verbesserten Mikroträgern Manufacture of improved microcarriers

Verbesserte Mikroträger können nach dem folgenden Arbeitsverfahren hergestellt werden: Improved microcarriers can be made using the following process:

Trockene, ungeladene vernetzte Dextran-Perlen werden gesiebt, damit man diejenigen erhält, die einen Durchmesser von etwa 75 [im besitzen. 1 g dieser Fraktion wird zu 10 ml destilliertem Wasser zugegeben, und man lässt die Perlen quellen. Ein geeignetes käuflich erhältliches Ausgangsmaterial für trockenes, vernetztes Dextran ist das Markenprodukt Sephadex G-50 der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Piscata-way, New Jersey. Dry, uncharged, crosslinked dextran beads are sieved to obtain those approximately 75 µm in diameter. 1 g of this fraction is added to 10 ml of distilled water and the beads are allowed to swell. A suitable commercially available starting material for dry, crosslinked dextran is the branded product Sephadex G-50 from Pharmacia Fine Chemicals, Piscata-way, New Jersey.

Eine wässrige Lösung, die 0,01 Mol an dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides sowie 0,015 Mol an Natriumhydroxyd enthält, wird in einer Menge von 10 ml Volumen hergestellt. Das als Ausgangsmaterial verwendete Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides wurde von der Verwendung zweimal aus Methylenchlorid umkristallisiert. Die erhaltene wässrige Lösung wird dann zu der Suspension an gequollenen Dextran-Perlen zugegeben, die dann heftig in einem Schüttelwasserbad während einer Stunde bei 60°C gerührt wird. Nach 1 Stunde werden die Perlen aus der Reaktionsmischung abgetrennt, indem man sie durch ein Whatman-Füterpapier Nr. 595 filtriert und mit 500 ml destilliertem Wasser wäscht. An aqueous solution containing 0.01 mol of the chloride of diethylaminoethyl chloride and 0.015 mol of sodium hydroxide is prepared in an amount of 10 ml volume. The chloride of diethylaminoethyl chloride used as the starting material was recrystallized twice from the use of methylene chloride. The aqueous solution obtained is then added to the suspension of swollen dextran beads, which is then stirred vigorously in a shaking water bath at 60 ° C. for one hour. After 1 hour the beads are separated from the reaction mixture by filtering through Whatman # 595 paper and washing with 500 ml of distilled water.

Perlen, die nach diesem Verfahren hergestellt wurden, enthalten etwa 2,0 Milliäquivalente Ladungskapazität pro Gramm des trockenen vernetzten unbehandelten Dextrans. Diese Ladungskapazität kann durch Bestimmung der Anion-austauschfähigkeit der Perlen nach dem folgenden Arbeitsverfahren bestimnt werden. Beads made by this process contain about 2.0 milliequivalents of charge capacity per gram of dry crosslinked untreated dextran. This charge capacity can be determined by determining the anion exchangeability of the beads using the following procedure.

Die hergestellten Perlen werden gründlich mit 0,1 normaler Salzsäure gewaschen, um alle Austauschstellen mit Chloranio-nen, also Cl-, zu sättigen. Sie werden dann mit 10"4 normaler Salzsäure gewaschen, um ungebundene Chloridionen zu entfernen. Anschliessend werden die Perlen mit einer 10-gew.- The beads produced are washed thoroughly with 0.1 normal hydrochloric acid in order to saturate all exchange sites with chloro anions, that is Cl-. They are then washed with 10 "4 normal hydrochloric acid to remove unbound chloride ions. The beads are then washed with a 10 wt.

prozentigen, bezogen auf das Gewicht, Natriumsulfatlösung gewaschen, um eine Gegensättigung der Austauscherstellen mit Sulfatanionen, also SO42-, zu erreichen. Das bei dem Waschen mit der Natriumsulfatlösung ausfliessende Material wird quantitativ aufgefangen, denn es enthält die von dem Austauscher freigesetzten Chloridionen. Diese Lösung wird dann mit 1 molarer Silbernitratlösung unter Verwendung von Kaliumchromat als Indikator titriert. percent, based on the weight, washed sodium sulfate solution in order to achieve counter-saturation of the exchanger sites with sulfate anions, that is SO42-. The material that flows out during washing with the sodium sulfate solution is collected quantitatively, because it contains the chloride ions released by the exchanger. This solution is then titrated with 1 molar silver nitrate solution using potassium chromate as an indicator.

Nach diesem Titrieren werden die Perlen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, mit einer Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (diese Lösung wird in der Folge als «PBS-Lösung abgekürzt) gespült, dann in einer PBS-Lösung suspendiert und im Autoklaven behandelt. Nach diesem Arbeitsverfahren erhält man hydratisierte Perlen, die einen Durchmesser von etwa 120 bis 200 (im besitzen, und die etwa eine Ladungskapazität von 2,0 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten vernetzten Dextrans aufweisen. After this titration, the beads are washed thoroughly with distilled water, rinsed with a phosphate-buffered saline solution (this solution is subsequently abbreviated to “PBS solution”), then suspended in a PBS solution and treated in an autoclave. This process produces hydrated pearls which are about 120 to 200 µm in diameter and which have a charge capacity of about 2.0 milliequivalents per gram of dry, untreated, cross-linked dextran.

Beispiel 2 Example 2

Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen mit erfindungsgemässen Mikroträgern, im Vergleich zu einer entsprechenden Züchtung mit käuflich erhältlichen Ionenaustauscherharten Cultivation of anchoring-dependent cells with microcarriers according to the invention, in comparison to a corresponding cultivation with commercially available ion exchangers

Alle Zellen wurden in dem von Dulbecco modifizierten Eagle-Medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) gezüchtet. Bei der Züchtung von normalen diploiden Fibroblasten wurde das Medium auf 10% unter Verwendung von Serum von Kälberföten ergänzt. Bei der Züchtung von primären und sekundären Küken-Fibroblasten wurde das Medium mit 1 % Kükenserum, 1 % Kälberserum und 2 % Tryptose-Phosphat-Brühe (ein Produkt der Difco Laboratories, Detroit, MI) ergänzt. Der Vorrat wurde auf 100 mm Kunststoffschäl-chen, erhältlich von der Falcon Plastics, Inc., Oxnard, CA, gegossen. All cells were grown in Dulbecco's Modified Eagle's Medium. In the cultivation of normal diploid fibroblasts, the medium was supplemented to 10% using serum from calf fetuses. When growing primary and secondary chick fibroblasts, the medium was supplemented with 1% chick serum, 1% calf serum and 2% tryptose phosphate broth (a product of Difco Laboratories, Detroit, MI). The stock was poured onto 100 mm plastic dishes available from Falcon Plastics, Inc., Oxnard, CA.

Die primären Kükenembryo-Fibroblasten wurden hergestellt, indem man 10 Tage alte Embryos zerkleinerte und dann einer Trypsin-Behandlung (Trypsinierung) unterwarf. Sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten wurden am ersten Tag der primären Konfluenz durch Trypsinierung hergestellt. Für die Zellen, die in den Kunststoffschälchen gezüchtet wurden, The primary chick embryo fibroblasts were prepared by crushing 10 day old embryos and then subjecting them to trypsin treatment. Secondary chick embryo fibroblasts were trypsinized on the first day of primary confluence. For the cells that were grown in the plastic dishes

betrug die Verdopplungszeit etwa 20 Stunden. the doubling time was about 20 hours.

Diploide menschliche Fibroblasten, die aus der Lunge von Embryos stammten, nämlich die Zellen HEL299 mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. CCL 137 wurden von der American Type Culture, Collection, Rockville, MD, erhalten. Diese Zellen hatten in den Kunststoffschälchen eine Verdopplungszeit von 19 Stunden. Diploid human fibroblasts derived from the lungs of embryos, namely HEL299 cells with accession number ATCC # CCL 137, were obtained from the American Type Culture, Collection, Rockville, MD. These cells had a doubling time of 19 hours in the plastic dishes.

Die Züchtung der Zellen auf dem Mikroträger wurde einfach damit begonnen, dass man die Zellen und die Träger-Perlen in einem gerührten Zuchtmedium zusammenbrachte. 100 ml des Zuchtmediums wurden in Glasflaschen (glass Spinner bottles) eines Rauminhaltes von 250 ml, die einen Durchmesser von 6,5 cm besassen, eingebracht, wobei die Glasflaschen mit einem 4,5 cm langen Magnetrührerstab, der mit Teflon beschichtet war, ausgestattet waren. Der Magnetrührer ist das Produkt der Firma Wilbur Scientific, Inc., Boston, MA. Es wurde mit einer Rührgeschwindigkeit von etwa 90 Umdrehungen pro Minute gerührt. Die Kulturen wurden direkt zu Proben verarbeitet, und diese Proben wurden mikroskopisch geprüft und photographiert. Die Zahl der Zellen wurde ermittelt, indem man die Zellkerne zählte, und zwar durch Anwendung einer Modifikation der Methodik von Sanford et al. (San-ford K.K., Earle, W.R., Evans, V.J., Waltz, H.K., und Shannon, J.E. [1951] J. Nati Cancer Inst. 11: 773). Diese Modifikation der Zählmethodik wurde von van Wezel beschrieben (s. der Aufsatz von van Wezel, A.L. (1973) in dem Buch Tissue Culture, Methods and Applications, Kruse, P.F. und Patterson, M.R. (eds.), Seiten 372-377, Academic Press, New York). The cultivation of the cells on the microcarrier was simply started by bringing the cells and the carrier beads together in a stirred growth medium. 100 ml of the growth medium were introduced into glass spinner bottles with a volume of 250 ml and a diameter of 6.5 cm, the glass bottles being equipped with a 4.5 cm long magnetic stirrer rod which was coated with Teflon . The magnetic stirrer is the product of Wilbur Scientific, Inc., Boston, MA. It was stirred at a stirring speed of about 90 revolutions per minute. The cultures were processed directly into samples and these samples were examined microscopically and photographed. The number of cells was determined by counting the cell nuclei using a modification of the methodology by Sanford et al. (San-Ford K.K., Earle, W.R., Evans, V.J., Waltz, H.K., and Shannon, J.E. [1951] J. Nati Cancer Inst. 11: 773). This modification of the counting methodology was described by van Wezel (see the article by van Wezel, AL (1973) in the book Tissue Culture, Methods and Applications, Kruse, PF and Patterson, MR (eds.), Pages 372-377, Academic Press, New York).

s s

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

«0 «0

65 65

615 947 615 947

Perlen mit daran befestigten Zellen wurden aus dem Kulturmedium abgetrennt, indem man die Perlen bei 1 g wenige Minuten lang absitzen liess und dann das darüberstehende Material absaugte. Dieses Arbeitsverfahren konnte das Ersetzen des Mediums sehr erleichtern, und es war auch die Abtrennung von Zellen von dem Mikroträger nach der Trypsinierung leicht möglich. Beads with attached cells were separated from the culture medium by letting the beads sit at 1 g for a few minutes and then aspirating the material above. This working procedure made the replacement of the medium very easy, and it was also easy to separate cells from the microcarrier after trypsinization.

Als Mikroträger wurde käuflich erhältliches DEAE Sepha-dex A-50 für die diploiden menschlichen Fibroblasten verwendet, und dieses Trägermaterial wurde mit Trägermaterial verglichen, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren synthetisiert und titriert wurde. Bei beiden Typen der Trägermaterial-Perlen war die Konzentration 2 g trockene, unbehandelte vernetzte Dextran-Perlen pro Liter Kulturmedium. Die Ladungskapazität des Trägermaterials DEAE-Sephadex A-50 betrug 5,4 Milliäquivalente pro Gramm an trockenem vernetztem Dextran, während die Ladungskapazität der gemäss Beispiel 1 synthetisierten Trägermaterialien 2,0 Milliäquivalente pro Gramm betrug. Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in dem Diagramm in Figur 1 zusammengestellt. Commercially available DEAE Sepha-dex A-50 was used as the microcarrier for the diploid human fibroblasts, and this carrier material was compared with carrier material that was synthesized and titrated according to the method described in Example 1. For both types of carrier beads, the concentration was 2 g dry, untreated cross-linked dextran beads per liter of culture medium. The charge capacity of the carrier material DEAE-Sephadex A-50 was 5.4 milliequivalents per gram of dry crosslinked dextran, while the charge capacity of the carrier materials synthesized according to Example 1 was 2.0 milliequivalents per gram. The results obtained in this experiment are shown in the diagram in FIG. 1.

Bei dieser Art von Zellen ist ein Verlust an ursprünglich eingeführtem Impfmedium bei der Verwendung des DEAE Sephadex A-50-Trägermaterials sehr bedeutend, während im Gegensatz dazu die Fibroblasten sich an den erfindungsgemässen Trägermaterialien gut verankern, rasch vermehren und ein Zusammenfliessen auf den Trägermaterialien innerhalb von 6 Tagen erreicht ist. Diese Verhaltensweise steht in guter Übereinstimmung mit dem Verhalten, das für diese Art von Zellen bei Standard-Platten oder Schalen beschrieben wird. Wie man aus Figur 1 sieht, betrug die endgültige Zelldichte, die unter Verwendung der neuen Mikroträger in einer Konzentration von 2 g an trockenem, vernetztem Dextran pro Liter erreicht wurde, 1,2 X106 Zellen pro Millimeter. With this type of cell, a loss of originally introduced inoculation medium is very significant when using the DEAE Sephadex A-50 carrier material, whereas in contrast the fibroblasts anchor themselves well on the carrier materials according to the invention, multiply rapidly and flow together on the carrier materials within 6 days is reached. This behavior is in good agreement with the behavior described for this type of cell in standard plates or dishes. As can be seen from Figure 1, the final cell density achieved using the new microcarriers in a concentration of 2 g of dry, cross-linked dextran per liter was 1.2 X106 cells per millimeter.

Zellkulturen, die unter Verwendung der neuen Mikroträger gezüchtet wurden, zeigten weder einen anfänglichen Zellenverlust noch irgendeine Hemmung beim Erreichen des Zusam-menfliessens der Zellen. Von noch grösserer Bedeutung ist es, dass die Zellkulturen üblicherweise bei höheren Konzentrationen des Mikroträgers wachsen gelassen werden konnten. Bei dem in Figur 2 veranschaulichten Diagramm sieht man beispielsweise, dass Menschen-Fibroblasten und sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten Sättigungskonzentrationen in der Nähe von 4 X10® Zellen pro Milliliter erreichen, wenn man den neuen Mikroträger, der eine Ladungskapazität von 2,0 Milliäquivalenten pro Gramm Dextran aufweist, in einer Konzentration von 5 g an trockenem, vernetztem Dextran pro Liter der Lösung verwendete. Man sieht aus den in Figur 2 schematisch dargestellten Ergebnissen, dass selbst bei dieser relativ hohen Mikroträgerkonzentration kein wesentlicher Verlust an Impfstoff eintritt. Cell cultures grown using the new microcarriers showed neither an initial loss of cells nor any inhibition when the cells converged. It is of even greater importance that the cell cultures could usually be grown at higher concentrations of the microcarrier. For example, in the diagram illustrated in Figure 2, one can see that human fibroblasts and chick secondary embryo fibroblasts reach saturation levels near 4 X10® cells per milliliter when using the new microcarrier, which has a charge capacity of 2.0 milliequivalents per gram of dextran has been used in a concentration of 5 g of dry, cross-linked dextran per liter of the solution. It can be seen from the results shown schematically in FIG. 2 that even with this relatively high microcarrier concentration there is no significant loss of vaccine.

Sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten wurden ebenfalls bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g pro Liter gezüchtet. Bei den oben beschriebenen Bedingungen wurde eine Sättigungskonzentration von 6 X106 Zellen pro Milliliter erreicht. Wenn man dem Züchtungsmedium noch weitere 1 % an dem Serum von Kälberföten zusetzte, konnte eine Sättigungskonzentration von 8 X106 Zellen pro Milliliter erreicht werden. Dabei trat kein wesentlicher Verlust an dem Impfmedium ein. Secondary chick embryo fibroblasts were also grown at a microcarrier concentration of 10 g per liter. Under the conditions described above, a saturation concentration of 6 X106 cells per milliliter was achieved. If a further 1% of the calf fetus serum was added to the growth medium, a saturation concentration of 8 X106 cells per milliliter could be achieved. There was no significant loss of the vaccine medium.

Primäre Kükenembryo-Fibroblasten wurden bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g pro Liter, bzw. 10 g pro Liter gezüchtet, und die Wachstumseigenschaften waren ähnlich denjenigen der sekundären Küken-Fibroblasten, wobei jedoch im vorliegenden Fall ein gewisser Verlust an Impfstoff festgestellt wurde, und ebenfalls eine etwas längere Verweilphase angetroffen wurde. Primary chick embryo fibroblasts were grown at a microcarrier concentration of 5 g per liter and 10 g per liter, respectively, and the growth characteristics were similar to that of the secondary chick fibroblasts, but in the present case there was some loss of vaccine and also one somewhat longer dwell was found.

Es wurden auch Versuche unternommen, sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten unter Bedingungen zu züchten, die ähnlich denjenigen sind, welche oben angewandt wurden, wobei jedoch jetzt keine erfindungsgemässen Mikroträger verwendet wurden, sondern Mikroträger aus DEAE-Sephadex A-50 in einer Konzentration von 1 g pro Liter, bzw. 5 g pro Liter, In diesem Fall konnte kein Zellwachstum festgestellt werden, und es traten wesentliche Verluste an Impfstoff auf. Attempts have also been made to grow secondary chick embryo fibroblasts under conditions similar to those used above, but now no microcarriers according to the invention have been used, but DEAE-Sephadex A-50 microcarriers at a concentration of 1 g per Liters, or 5 g per liter, in this case no cell growth was found and there were significant losses of vaccine.

Beispiel 3 Example 3

Herstellung von Mikroträgern unter Verwendung von verschiedenen Mengen an Reaktanten Es wurden verschiedene Ansätze an Miktroträgern hergestellt, indem man das Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides und Natriumhydroxid in 20 ml destilliertem Wasser löste. Die so gewonnene Lösung wurde dann über trockene Perlen aus Sephadex G-50 gegossen, worauf dann die Perlen auf eine Kolben-Schüttelmaschine, unter Verwendung eines Wasserbades, das bei 60°C eingestellt war, gegeben wurden. Eine Serie von Perlenproben wurde mit einer Lösung behandelt, die 0,01 Mol an dem Amin und 0,015 Mol an Natriumhydroxyd enthielt, während eine weitere Serie an Perlenproben mit einer Lösung behandelt wurde, die 0,03 Mol an dem Amin und 0,045 Mol an Natriumhydroxyd enthielt. Die Reaktionszeiten wurden geändert, um bei den einzelnen Ansätzen unterschiedliche Werte für die Milliäquivalente pro Gramm zu erhalten. Preparation of microcarriers using different amounts of reactants Different batches of microcarriers were made by dissolving the chloride of diethylaminoethyl chloride and sodium hydroxide in 20 ml of distilled water. The solution thus obtained was then poured over dry Sephadex G-50 beads, after which the beads were placed on a flask shaker using a water bath set at 60 ° C. One series of bead samples was treated with a solution containing 0.01 mole of the amine and 0.015 mole of sodium hydroxide, while another series of bead samples was treated with a solution containing 0.03 mole of the amine and 0.045 mole of sodium hydroxide contained. The response times were changed in order to obtain different values for the milliequivalents per gram for the individual batches.

Diploide menschliche Fibroblasten, nämlich die Zellen mit der Bezeichnung HEL299, wurden in Suspensionskulturen gezüchtet unter Verwendung von einer Mikroträgerkonzentration von 5,0 g an trockenem, unbehandeltem vernetztem Dextran pro Liter. Dabei wurden die in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsverfahren angewandt, und man verwendete für die einzelnen Versuche Mikroträger, die unterschiedliche Werte für die Ladungskapazitäten, ausgedrückt in Milliäquivalenten pro Gramm, besassen. Die Mikroträger-Perlen wurden nach dem oben beschriebenen Verfahrem hergestellt. Wenn man die Ergebnisse in ein Diagramm eintrug, dann erhielt man für beide Versuchsreihen Kurven, die eine ähnliche Form hatten, die ganz allgemein als Glockenform bezeichnet werden kann, wobei jedoch die Kurven, die bei Verwendung von Mikroträ-gerperlen erhalten wurden, welche mit den oben angegebenen höheren Konzentrationen der Reaktanten behandelt worden waren, einen etwas schärferen Anstieg und schärferen Abfall besassen. In beiden Fällen wurden Trägermaterialien erhalten, die zu einem hervorragend guten Zellenwachstum führten. Diploid human fibroblasts, namely the cells designated HEL299, were grown in suspension cultures using a microcarrier concentration of 5.0 g of dry, untreated cross-linked dextran per liter. The working procedures described in Example 2 were used and microcarriers with different values for the charge capacities, expressed in milliequivalents per gram, were used for the individual tests. The microcarrier beads were made according to the procedure described above. If the results were plotted on a graph, curves were obtained for both series of tests which had a similar shape, which can be referred to in general terms as the bell shape, but the curves obtained when using microbeads were obtained with the higher concentrations of reactants given above had a somewhat sharper increase and drop. In both cases, carrier materials were obtained which led to an excellent cell growth.

Beispiel 4 Example 4

Herstellung von Mikroträgern unter Anwendung unterschiedlicher Verhältnisse von Amin zu Alkali Anhand dieses Beispieles werden weitere Veränderungen in der Ladungskapazität der Mikroträger erläutert, die dadurch erreicht werden können, dass man das Verhältnis von dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides zu der Natronlauge, das bei der Herstellung angewandt wird, variiert. Bei diesem Beispiel wurden die in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweisen wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass ein weiter Bereich an unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumhydroxyd angewandt wurde, während im Gegensatz dazu die verwendete Konzentration des Chlorides des Diäthylaminoäthylchlorides bei 0,01 Mol pro 20 ml konstant gehalten wurde. Die Konzentrationen an Natriumhydroxyd, die angewandt wurden, betrugen 0,01 bzw. 0,011, bzw. 0,012, bzw. 0,013, bzw. 0,014 bzw. 0,015, bzw. 0,02, bzw. 0,03, bzw. 0,05, bzw. 0,75, bzw. 0,10 Mol pro 20 ml. Production of microcarriers using different ratios of amine to alkali This example is used to explain further changes in the charge capacity of the microcarriers which can be achieved by comparing the ratio of the chloride of diethylaminoethylchloride to the sodium hydroxide solution used in the preparation. varies. In this example, the procedures described in Example 3 were repeated, except that a wide range of different concentrations of sodium hydroxide were used while, in contrast, the concentration of the chloride of diethylaminoethyl chloride used was kept constant at 0.01 mol per 20 ml . The concentrations of sodium hydroxide used were 0.01, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.02, 0.03, and 0.05, respectively. or 0.75 or 0.10 mol per 20 ml.

Dabei wurde in einem Diagramm für eine Umsetzung während 1,25 Stunden bei einer Temperatur von 60°C die erhaltene Ladungskapazität in Milliäquivalenten pro Gramm gegen die angewandte Konzentration von Natriumhydroxyd aufgetragen. Aus diesem Diagramm sah man, dass bei Verwendung von Konzentrationen von Natriumhydroxyd, die unterhalb von The charge capacity obtained was plotted in milliequivalents per gram against the applied concentration of sodium hydroxide in a diagram for a reaction for 1.25 hours at a temperature of 60 ° C. From this graph it was seen that when using concentrations of sodium hydroxide below

8 8th

s s

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

9 9

615 947 615 947

0,01 Mol pro 20 ml lagen, Mikroträger erhalten wurden, die keine feststellbaren Ladungskapazitäten besassen. Die Ladungskapazität des Endproduktes stieg jedoch mit ansteigender Konzentration der Natronlauge und erreichte ein Maximum in der Grössenordnung von 2,3 Milliäquivalenten pro Gramm trockenem, vernetztem Dextran bei einer Konzentration von etwa 0,014 Mol Natriumhydroxyd pro 20 ml. Die Ladungskapazität nahm dann beinahe in linearer Weise bis zu einem Wert von etwa 1,1 Milliäquivalenten pro Gramm trok-kenem, vernetztem Dextran ab, wenn die Konzentration an Natriumhydroxyd anstieg, und zwar bis zu einem Wert von etwa 0,10 Mol. Dementsprechend tritt eine Veränderung der Reaktionskinetik auf, wenn das Verhältnis von dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorids zu dem Natriumhydroxyd variiert wird, wobei bei dieser Änderung eine konstante Konzentration an dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides und des vernetzten Dextrans aufrechterhalten wird. 0.01 mol per 20 ml were, microcarriers were obtained that had no detectable charge capacities. However, the loading capacity of the end product increased with increasing concentration of the sodium hydroxide solution and reached a maximum in the order of 2.3 milliequivalents per gram of dry, cross-linked dextran at a concentration of about 0.014 mol of sodium hydroxide per 20 ml. The loading capacity then increased almost linearly to a value of about 1.1 milliequivalents per gram of dry crosslinked dextran as the concentration of sodium hydroxide increases to a value of about 0.10 mol. Accordingly, the reaction kinetics change when the ratio is varied from the chloride of diethylaminoethyl chloride to the sodium hydroxide, with this change maintaining a constant concentration of the chloride of diethylaminoethyl chloride and the cross-linked dextran.

Beispiel 5 Example 5

Herstellung von menschlichem Interferon in Zellen, die auf den erfindungsgemässen Mikroträgern gezüchtet werden Production of human interferon in cells which are grown on the microcarriers according to the invention

Anhand dieses Beispieles wird die Fähigkeit von auf Mikroträgern gezüchteten Zellen zur Bildung von menschlichem Interferon beschrieben. Die Zellen, die zur Herstellung des menschlichen Interferon verwendet wurden, waren normale diploide menschliche Vorhaut-Fibroblasten der Bezeichnung FS-4. Diese Fibroblasten wurden auf Mikroträgerkulturen gezüchtet, indem man die in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsverfahren anwandte. Es wurden dabei Mikroträger verwendet, die in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt und titriert wurden, wobei eine Mikroträgerkonzentration von 5 g an trockenem, vernetztem Dextran pro Liter Nährmedium verwendet wurde. Das Nährmedium, das zur Durchführung der Zellzüchtung angewandt wurde, war das Medium Dulbecco Modified Eagle-Medium (abgekürzt DMEM), wobei dieses Medium unter Verwendung von 10% Kälberfötenserum ergänzt wurde. This example describes the ability of cells grown on microcarriers to form human interferon. The cells used to make human interferon were normal diploid human foreskin fibroblasts called FS-4. These fibroblasts were grown on microcarrier cultures using the procedures described in Example 2. Microcarriers were used which were produced and titrated in the manner described in Example 1, a microcarrier concentration of 5 g of dry, crosslinked dextran per liter of nutrient medium being used. The nutrient medium used to carry out cell growth was the medium Dulbecco Modified Eagle medium (abbreviated DMEM), which medium was supplemented using 10% calf fetus serum.

Nach 8 bis 10 Tagen hörten die Kulturen zu wachsen auf. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Züchtungsmedium entfernt. Die Kulturen wurden dann 1- bis 4mal mit 100 ml an serumfreiem DMEM gewaschen. Die Zellen waren dann bereit für die Interferon-Induktion. Diese wurde erreicht, indem man zu den Kulturen 50 ml an serumfreiem DMEM-Medium zugab, die 50 jig pro Milliliter an Cyclohexamid sowie unterschiedliche Mengen an Poly I Poly C-Induktor enthielten. Nach 4 Stunden setzte man den Kulturen Actinomycin D zu, bis eine Endkonzentration von 1 |xg pro Milliliter erreicht war. After 8 to 10 days, the cultures stopped growing. At this point the growth medium was removed. The cultures were then washed 1-4 times with 100 ml of serum-free DMEM. The cells were then ready for interferon induction. This was achieved by adding 50 ml of serum-free DMEM medium to the cultures, which contained 50 jig per milliliter of cyclohexamide and different amounts of poly I poly C inductor. After 4 hours, actinomycin D was added to the cultures until a final concentration of 1 | xg per milliliter was reached.

5 Stunden nach dem Beginnen der Induktion wurde das zur Induktion verwendete Medium dekantiert und die Kulturen wurden 3- bis 4mal mit je 100 ml an warmem serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Die Kulturen wurden mit 50 ml an DMEM-Medium, das 0,5% an menschlichem Plasmaprotein enthielt, wieder aufgefüllt. Dann wurden die Kulturen weitere 18 Stunden lang unter Standardbedingungen bebrütet. Zu diesem Zeitpunkt wurde das flüssige Material von den Kulturen abdekantiert, und dieses abdekantierte Medium wurde auf seine Interferon-Aktivität getestet. Die Interferon-Aktivität wurde getestet, indem man den 50%-Spiegel der Zellschützung bei den Proben und bei Standardlösungen bestimmte, wobei die Zellschützung anhand von FS-4-Fibro-blasten vorgenommen wurde, welche mit dem Virus der Bläschenentzündung der Mundschleimhaut, also dem Vesicular Stomatitis Virus, Indiana Stamm, herausgefordert worden waren. Für den Vesicular Stomatitis Virus wird in der Folge die Abkürzung VSV verwendet. Die Ergebnisse der Ansätze zur Herstellung von Interferon sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: 5 hours after the start of induction, the medium used for induction was decanted and the cultures were washed three to four times with 100 ml of warm serum-free DMEM medium. The cultures were replenished with 50 ml of DMEM medium containing 0.5% human plasma protein. The cultures were then incubated for a further 18 hours under standard conditions. At this point the liquid material was decanted from the cultures and this decanted medium was tested for its interferon activity. The interferon activity was tested by determining the 50% level of cell protection in the samples and in standard solutions, the cell protection being carried out on the basis of FS-4 fibroblasts which were associated with the bladder infection virus of the oral mucosa, i.e. the Vesicular stomatitis virus, Indiana strain, had been challenged. The abbreviation VSV is used for the Vesicular Stomatitis Virus. The results of the approaches to the production of interferon are summarized in the following table:

Tabelle table

Konzentration des Induktors in (ig/ml Concentration of the inductor in (ig / ml

Zellkonzentration während der Herstellung in Zellen/ml Cell concentration during production in cells / ml

Interferon in Einheiten pro 106 Zellen Interferon in units per 106 cells

4 4th

2,0 X106 2.0 X106

39 39

5 5

2,6X10« 2.6X10 «

378 378

25 25th

2,6 X106 2.6 X106

886 886

50 50

2,0X10® 2.0X10®

-5000 -5000

Diese Ergebnisse stammen alle von getrennten Versuchen, und sie sollen nicht irgendeinen Zusammenhang mit der Konzentration des Induktors zeigen. These results are all from separate experiments and are not intended to show any connection with the concentration of the inductor.

Beispiel 6 Example 6

Herstellung von Zellen auf den erfindungsgemässen Mikroträgern zum Zwecke der Herstellung von Viren Die Fähigkeit der auf Mikroträgern gezüchteten Zellen zur Herstellung eines Virus wird anhand des vorliegenden Beispiels erläutert. Primäre und sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten werden in Mikroträgerkulturen nach der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise gezüchtet, wobei die Mikroträgerkonzentration bei der Züchtung der primären Zellen 10 g pro Liter war und bei der Züchtung der sekundären Zellen 5 g pro Liter betrug. Um die Bildung des Virus in Gang zu bringen, wurde das Wachstumsmedium entfernt und die Kulturen wurden 2mal mit 100 ml an serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Die Infektion der Zellen mit dem Sindbis-Virus fand in 50 ml DMEM-Medium, das mit 1% Kälberserum, 2% Tryp-tose-Phosphat-Brühe und dem Sindbis-Virus ergänzt war, statt. Die in dem DMEM-Medium anwesende Menge an Sindbis-Virus war ausreichend, um eine Multiplizität der Infektion, die als MOI abgekürzt wird, von 0,05 zu entsprechen. Production of cells on the microcarriers according to the invention for the purpose of producing viruses The ability of the cells grown on microcarriers to produce a virus is explained with the aid of the present example. Primary and secondary chick embryo fibroblasts are grown in microcarrier cultures according to the procedure described in Example 2, the microcarrier concentration being 10 g per liter when the primary cells were grown and 5 g per liter when the secondary cells were being grown. In order to start the formation of the virus, the growth medium was removed and the cultures were washed twice with 100 ml of serum-free DMEM medium. The cells were infected with the Sindbis virus in 50 ml of DMEM medium supplemented with 1% calf serum, 2% trypose phosphate broth and the Sindbis virus. The amount of Sindbis virus present in the DMEM medium was sufficient to correspond to a multiplicity of infection, abbreviated as MOI, of 0.05.

Der Virus wurde 24 Stunden nach der Infektion gewonnen, bzw. geerntet, indem man die Zuchtbrühe sammelte, sie durch schwaches Zentrifugieren klärte und das darüberstehende Material einfror. Die Bildung des Virus wurde anhand der Fleckenbildung (Plaque-Bildung) in einem Feld von sekundären Küken-Fibroblasten getestet. Die Resultate bei der Infektion dieser Mikroträgerkulturen waren die folgenden: The virus was obtained or harvested 24 hours after infection by collecting the broth, clarifying it by gentle centrifugation and freezing the material above. The formation of the virus was tested on the basis of staining (plaque formation) in a field of secondary chick fibroblasts. The results when infecting these microcarrier cultures were as follows:

Tabelle table

Zellenart Cell type

Gesamtkonzentration für die Virusbildung in Zellen pro ml Total concentration for virus formation in cells per ml

(PFU/ml) (PFU / ml)

PFU/Zelle PFU / cell

Sekundäre Secondary

4,0X10« 4.0X10 «

8,4 xlO9 8.4 x 10 9

2100 2100

Primäre Primary

1,4X10« 1.4X10 «

2,3 X IO10 2.3 X IO10

16 000 16,000

Primäre Primary

6,0X10« 6.0X10 «

2,6 X1010 2.6 X1010

5 000 5,000

Die Virusbildung wurde auch für die folgenden Kombinationen von Virus und Zellen auf Mikroträger untersucht: Poliovi-rus/WI-38; Moloney MuLV/Cl-1 Maus; VSV/Kükenembryo-Fibroblasten. Virus formation was also examined for the following combinations of virus and cells on microcarriers: Poliovirus / WI-38; Moloney MuLV / Cl-1 mouse; VSV / chick embryo fibroblasts.

Beispiel 7 Example 7

In diesem Beispiel wurde zu Vergleichszwecken das Wachstum der Zellen in zylindrischen Flaschen und unter Verwendung der erfindungsgemässen Mikroträger untersucht und zwar zum Zwecke der Herstellung der proviralen DNA (Desoxyribonukleinsäure) des Murin-Leukämie-Virus. In this example, the growth of the cells in cylindrical bottles and using the microcarriers according to the invention was examined for the purpose of comparison, specifically for the purpose of producing the proviral DNA (deoxyribonucleic acid) of the murine leukemia virus.

Es wurde die revers-übertragene DNA (reverse-transcribed DNA) des Moloney-Leukämie-Virus (M-MuLV) nach einer Infektion von JLS-V9-Zellen untersucht. Bei den verwendeten JLS-V9-Zellen handelt es sich um eine Zellart, die vom Knochenmark der Maus abgeleitet wurde. Reverse-transcribed DNA of Moloney Leukemia Virus (M-MuLV) after infection of JLS-V9 cells was examined. The JLS-V9 cells used are a type of cell that was derived from the bone marrow of the mouse.

Ein Arbeitsverfahren, das angewandt wurde, bestand darin, dass man die Zellen in zylindrischen Flaschen züchtete. Es wurden dazu Zellen in zylindrischen Flaschen gezüchtet, das One working method that was used was to grow the cells in cylindrical bottles. For this purpose, cells were grown in cylindrical bottles

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

«0 «0

65 65

615 947 615 947

10 10th

Zuchtmedium wurde entfernt und es wurde der Virusimpfstoff in die Flaschen eingebracht. Bald später wurde den Kulturen frisches Medium zugesetzt und 8 bis 16 Stunden später wurde extrahiert um eine eventuelle Reinigung der vom Virus stam-nenden Desoxyribonukleinsäure (virale DNA) vorzunehmen. Die Kulturen wurden mit frischem Puffer gewaschen und die Zellen wurden mit einer Lösung zerstört, die das Waschmittel Natriumdodecylsulfat enthielt. Anschliessend wurde das Zel-■enlysat gekühlt und man gab Salz bis zur Erreichung von einer 1-molaren Lösung zu, was dazu führte, dass das Detergens gemeinsam mit der DNA, hohen Molekulargewichtes, ausfiel. Die DNA mit niedrigem Molekulargewicht blieben in dem darüberstehenden Material zurück und konnten dann vom Protein befreit werden (Deproteinisierung) und zur Durchführung weiterer Analysen konzentriert werden. Culture medium was removed and the virus vaccine was placed in the bottles. Soon afterwards, fresh media was added to the cultures and extraction was carried out 8 to 16 hours later in order to purify the deoxyribonucleic acid (viral DNA) derived from the virus. The cultures were washed with fresh buffer and the cells were destroyed with a solution containing the detergent sodium dodecyl sulfate. The cell lysate was then cooled and salt was added until a 1 molar solution was reached, which led to the detergent precipitating together with the high molecular weight DNA. The low molecular weight DNA remained in the overlying material and could then be freed from the protein (deproteinization) and concentrated for further analysis.

Die Zellkultur aus 50 zylindrischen Flaschen enthielt etwa 109 Zellen; diese Zellen wurden mit etwa 1 Liter eines Virus-Impfstoffes, der einen Titer von 3 X106 fleckenbildenden Einheiten pro ml aufwies, infiziert. Dies führte dazu, dass eine nominelle Multiplizität der Infektion von 1 bis 3 erreicht wurde, und die infizierten Zellen lieferten 5-20 Nanogramm der virusspezifischen DNA. The cell culture from 50 cylindrical bottles contained about 109 cells; these cells were infected with about 1 liter of a virus vaccine which had a titer of 3 X106 staining units per ml. This resulted in a nominal multiplicity of infection of 1 to 3, and the infected cells provided 5-20 nanograms of virus-specific DNA.

Es wurde ein einfacheres Arbeitsverfahren entwickelt, A simpler working process has been developed

indem man die erfindungsgemässen, verbesserten Mikroträger anwandte. Eine Kultur, die 10 g an entsprechenden Mikroträ-ger-Perlen in einem Liter Wachstumsmedium enthielt, wurde verwendet. Sobald das Zusammenfliessen erreicht war, wurden die 109 Zellen auf den Mikroträger-Perlen infiziert, indem man die Perlen sich absetzen liess und dann das Medium durch einen Liter Virus-Impfstoff ersetzte. Zur Extraktion wurden die Zellen auf den Perlen mit Pufferlösung gewaschen und dann in den das Natrium-Dodecylsulfat enthaltenden Puffer eingebracht. Nach der gemeinsamen Ausfällung der DNA mit hohem Molekulargewicht und des Detergens wurde der Niederschlag zusammen mit den Perlen abzentrifugiert, und die darüberstehende Lösung zur Durchführung weiterer Analysen extrahiert. Die Ausbeute an der vom Virus stammenden DNA war vergleichbar mit derjenigen, die unter Verwendung von Kulturen in zylindrischen Flaschen erzielt werden konnte. Die Arbeit, die mit dem zuletzt genannten Züchtungsverfahren verbunden war, betrug jedoch nur etwa 5 bis 10% derjenigen, die nötig war, wenn die Züchtung in den zylindrischen Flaschen durchgeführt wurde. by using the improved microcarriers according to the invention. A culture containing 10 g of corresponding microcarrier beads in one liter of growth medium was used. Once confluence was achieved, the 109 cells on the microcarrier beads were infected by allowing the beads to settle and then replacing the medium with a liter of virus vaccine. For extraction, the cells on the beads were washed with buffer solution and then introduced into the buffer containing the sodium dodecyl sulfate. After the high molecular weight DNA and the detergent were co-precipitated, the precipitate was centrifuged along with the beads, and the above solution was extracted for further analysis. The yield of the virus-derived DNA was comparable to that obtained using cultures in cylindrical bottles. However, the work associated with the latter breeding process was only about 5 to 10% of that required when growing in the cylindrical bottles.

Beispiel 8 Example 8

Herstellung verbesserter Mikroträger mit Dimethylaminoäthyl-Ladungsgruppen Es wurde ein geeigneter Mikroträger hergestellt, in dem eine andere Austauschergruppe an das Dextran-Grundgerüst gebunden wurde als diejenige, die in Beispiel 1 verwendet wurde. Die Dimethylaminoäthylgruppen mit der Abkürzung DMAE wurden an das Dextran-Grundgerüst nach dem folgenden Arbeitsverfahren gebunden: Preparation of improved microcarriers with dimethylaminoethyl charge groups A suitable microcarrier was produced in which a different exchanger group was bound to the dextran backbone than that used in Example 1. The dimethylaminoethyl groups with the abbreviation DMAE were bound to the dextran backbone using the following working procedure:

1 g an Dextran-Perlen, nämlich dem Produkt Pharmacia G-50, die einen Durchmesser von 50 bis 75 [xm besassen, wurden in trockener Form zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, und man liess die Perlen quellen. Eine wässrige Lösung, die 0,01 Mol an dem Chlorid des Dimethylaminoäthylchlorides (das Produkt stammt von der Sigma Chemical Co.) sowie 0,015 Mol an Natriumhydroxyd enthielt, wurde in einem Volumen von 10 ml hergestellt. Diese wässrige Lösung wurde zu den gequollenen Dextran-Perlen zugegeben, und diese Suspension wurde dann wieder heftig 1 Stunde lang bei 60°C gerührt. 1 g of dextran beads, namely the product Pharmacia G-50, which had a diameter of 50 to 75 μm, were added in dry form to 10 ml of distilled water and the beads were allowed to swell. An aqueous solution containing 0.01 mole of the dimethylaminoethyl chloride chloride (the product is from Sigma Chemical Co.) and 0.015 mole of sodium hydroxide was prepared in a volume of 10 ml. This aqueous solution was added to the swollen dextran beads and this suspension was then again stirred vigorously at 60 ° C for 1 hour.

Nach der Umsetzung wurde die Perlenmasse wie in Beispiel 1 titriert. Durch diese Reaktion werden 1,0 Milliäquivalente an Dimethylaminoäthylgruppen an die Dextranmasse gebunden. After the reaction, the pearl mass was titrated as in Example 1. This reaction binds 1.0 milliequivalents of dimethylaminoethyl groups to the dextran mass.

Um Mikroträger mit einem grösseren Substitutionsgrad herzustellen, wurde die oben beschriebene Reaktion ausgeführt und die Masse der Perlen wurde gründlich mit Wasser gewaschen. Dann wurde das überschüssige Wasser abfiltriert, und die Perlenmasse gewogen, um die Menge an Wasser zu bestimmen, die von der Perlenmasse zurückgehalten wird. Zu dieser Perlenmasse gab man dann eine geeignete Menge an frischen Reagenzien, d. h. dem Chlorid des Dimethylaminoäthylchlorides und Natronlauge, so dass die endgültige Konzentration an Dimethylaminoäthyl und Natronlauge in diesen nachfolgenden Reaktionsmischungen identisch mit der anfänglich eingesetzten war. In order to produce microcarriers with a greater degree of substitution, the reaction described above was carried out and the mass of the beads was washed thoroughly with water. The excess water was then filtered off and the mass of pearls weighed to determine the amount of water retained by the mass of pearls. A suitable amount of fresh reagents was then added to this mass of pearls. H. the chloride of dimethylaminoethyl chloride and sodium hydroxide solution, so that the final concentration of dimethylaminoethyl and sodium hydroxide solution in these subsequent reaction mixtures was identical to that initially used.

Auf diese Weise konnte eine Reihe von Mikroträgern hergestellt werden, wobei ihre Ladungskapazitäten 1,0 bzw. 2,0 bzw. 2,5 bzw. 3,5 Milliäquivalente an Dimethylaminoäthylgruppen pro Gramm unumgesetztem Dextran betrug. Es wurden Zellen, nämlich die Zellen HEL 299, in Mikroträger-Kulturen gezüchtet, wobei 5 g Mikroträger pro Liter angewandt wurden, und die in dem Verfahren gemäss Beispiel 2 erwähnten Züchtungsbedingungen wurden eingesetzt. Die bei diesem Versuch erzielten Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: In this way, a number of microcarriers could be produced, their charge capacities being 1.0, 2.0, 2.5 and 3.5 milliequivalents of dimethylaminoethyl groups per gram of unreacted dextran. Cells, namely the HEL 299 cells, were grown in microcarrier cultures using 5 g of microcarrier per liter, and the culture conditions mentioned in the procedure of Example 2 were used. The results obtained in this experiment are summarized in the following table:

Tabelle table

Ausmass der Substitution Extent of the substitution

Zell- Cellular

Gesamt in Milliäquivalenten pro Gramm ausbreitung wachstum Total growth in milliequivalents per gram of spread

1,0 1.0

— -

2,0 2.0

— -

2,5 2.5

+ +

3,2 3.2

+ +

— -

Wie zu erwarten war, ist das Zellwachstum von dem Ausmass der Substitution mit den ladungstragenden Gruppierungen abhängig. Wenn der Substitutionsgrad zu hoch ist, dann tritt kein Zell Wachstum auf, obwohl eine Verankerung der Zellen und eine Ausbreitung der Zellen stattfindet. Bei zu niedrigem Substitutionsgrad ist die Haftung der Zellen an der Oberfläche nicht ausreichend, um eine geeignete Ausbreitung und ein entsprechendes Wachstum zu ermöglichen. As expected, cell growth is dependent on the extent of the substitution with the charge-bearing moieties. If the degree of substitution is too high, no cell growth occurs, although the cells are anchored and the cells spread. If the degree of substitution is too low, the adhesion of the cells to the surface is not sufficient to allow suitable spreading and growth.

Beispiel 9 Verbesserte Mikroträger, die positiv geladene Phosphoniumgruppen aufweisen Es wurden in diesem Falle verbesserte Mikroträger hergestellt, die als Austauschergruppen keine Amingruppen, sondern Phosphoniumgruppen aufwiesen. Die Herstellung wurde wie folgt durchgeführt: Example 9 Improved Microcarriers Which Have Positively Charged Phosphonium Groups In this case, improved microcarriers were produced which, as exchanger groups, had phosphonium groups rather than amine groups. The production was carried out as follows:

1 g an trockenen Dextran-Perlen wurde hergestellt und mit Wasser gequollen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Zu den gequollenen Perlen gab man 5 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Triäthyl-(äthyl-bromid)-phosphonium der Formel 1 g of dry dextran beads were made and swollen with water as described in Example 1. 5 ml of a saturated aqueous solution of triethyl (ethyl bromide) phosphonium of the formula were added to the swollen beads

C2H5 C2H5 C2H5 C2H5

C2H4Br C2H5 C2H4Br C2H5

sowie 5 ml einer 3-molaren Lösung von Natriumhydroxyd zu. Das Ausgangsmaterial Triäthyl-(äthyl-bromid)-phosphonium s and 5 ml of a 3 molar solution of sodium hydroxide. The starting material triethyl (ethyl bromide) phosphonium s

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

11 11

wird in der Folge auch mit TEP abgekürzt. Dieser Brei wurde bei 65°C reagieren gelassen. is subsequently abbreviated to TEP. This slurry was allowed to react at 65 ° C.

Es wurde eine Reihe von Mikroträgern hergestellt, die Ladungskapazitäten von 1,1 bzw. 1,7 bzw. 2,9 Milliäquivalenten pro Gramm besassen. Die Mikroträger mit einer Ladungs- 5 kapazität von 1,1 Milliäquivalenten pro Gramm wurden hergestellt, indem man die oben angegebenen Bedingungen während 4 Minuten aufrechterhielt. Die Mikroträger mit einer Ladungskapazität von 1,7 Milliäquivalenten pro Gramm wurden durch Umsetzung während 1 Stunde erzeugt und die 10 Mikroträger mit einer Ladungskapazität von 2,9 Milliäquivalenten pro Gramm erhielt man, indem man 3mal hintereinander umsetzte, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. A series of microcarriers were produced which had charge capacities of 1.1, 1.7 and 2.9 milliequivalents per gram. The microcarriers with a charge capacity of 1.1 milliequivalents per gram were made by maintaining the above conditions for 4 minutes. The microcarriers with a charge capacity of 1.7 milliequivalents per gram were produced by reaction for 1 hour, and the 10 microcarriers with a charge capacity of 2.9 milliequivalents per gram were obtained by reacting 3 times in succession as described in Example 7.

Es wurde eine Zellkultur unter Verwendung der Mikroträ- is ger in einer Konzentration von 5 g pro Liter für jeden dieser Träger hergestellt, wobei zur Zellzüchtung ein kontinuierlicher Zellentyp der Bezeichnung JLS-V9 verwendet wurde, und das Wachsen dieser Zellen wurde mit der Züchtung derselben auf den verbesserten Diäthylaminoäthyl-substituierten Mikroträ- 20 gern verglichen, die nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. A cell culture was prepared using the microtubes at a concentration of 5 g per liter for each of these carriers, using a continuous cell type called JLS-V9 for cell growth, and growing these cells with growing them compared to the improved diethylaminoethyl-substituted micro carriers, which were prepared by the method described in Example 3.

Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: The results obtained are summarized in the following table:

615 947 615 947

Tabelle table

Mit Diäthylaminoäthylgruppen substituierte Mikroträger Microcarriers substituted with diethylaminoethyl groups

Milliäquivalente Milliequivalents

Zellverankerung Gesamtwachstum pro Gramm und Ausbreitung Cell anchorage Total growth per gram and spread

0,9 0.9

+ + + +

1,7 1.7

3,8 3.8

+ ~ + ~

MitTriäthyl-äthylphosphoniumgruppen With triethyl-ethylphosphonium groups

substituierter Mikroträger substituted microcarrier

Milliäquivalente Milliequivalents

1,1 1.1

+ + + +

1,7 1.7

+ + + +

2,9 2.9

+ - + -

In der vorangegangenen Beschreibung wurden bestimmte Äquivalente, spezielle Arbeitsverfahren und spezielle Materialien beschrieben. Es sei darauf hingewiesen, dass die erfindungsgemässen verbesserten Mikro träger zwar ganz besonders gut geeignet sind, um verankerungsabhängige Zellen zu züchten. Dennoch können sie natürlich auch für andere Verwendungszwecke, beispielsweise zur Züchtung anderer Zellarten, eingesetzt werden. Certain equivalents, specific working methods and special materials have been described in the preceding description. It should be pointed out that the improved microcarriers according to the invention are particularly particularly suitable for growing anchorage-dependent cells. Nevertheless, they can of course also be used for other purposes, for example for the cultivation of other cell types.

B B

1 Blatt Zeichnungen 1 sheet of drawings

Claims

615 947

2nd

PATENT CLAIMS

1. A method for culturing anchoring-dependent cells in a microcarrier culture, characterized in that microcarriers are used which have a large number of positively charged chemical groups, the number of groups being selected in such a way that an exchange capacity is ensured which is ensured in a is such a range that good cell growth is achieved, and the exchange capacity is in the range of 0.1 to 4.5 milliequivalents per gram of the dry, untreated microcarrier, and the anchorage-dependent cells are grown in a suspension of the microcarrier and leaves this cell culture under such conditions that cell growth is caused.

2. The method according to claim 1, characterized in that the microcarrier contains cross-linked dextran beads.

3. The method according to claim 2, characterized in that the positively charged chemical groups on the crosslinked dextran beads comprise tertiary or quaternary amine groups.

4. The method according to claim 2, characterized in that the positively charged chemical groups on the crosslinked dextran beads comprise diethylaminoethyl groups.

5. The method according to claim 2, characterized in that the exchange capacity is in the range of 1.0 to 2.8 milliequivalents per gram of dry, untreated dextran.

6. The method according to claim 5, characterized in that the microcarriers have a diameter of 75 microns in the dry state.

7. The method according to claim 1, characterized in that a) the positively charged microcarriers are suspended in a medium for growing anchoring-dependent cells,

b) inoculating the cells into the suspension of the microcarrier, thereby forming a cell culture, and c) leaving this cell culture under such conditions that cell growth is caused.

8. microcarrier for carrying out the method for growing anchoring-dependent cells according to claim 1, characterized in that there is such an amount of positively charged chemical groups on the microcarriers that an exchange capacity of the microcarriers is guaranteed which is in such a range that good cell growth occurs, with exchange capacity in the range of 0.1 to 4.5 milliequivalents per gram of dry, untreated microcarrier.

9. microcarrier according to claim 8, characterized in that they contain cross-linked dextran beads.

10. microcarrier according to claim 9, characterized in that they have a charge capacity which is in the range of 1.0 to 2.8 milliequivalents per gram of dry, untreated, crosslinked dextran.

11. Microcarrier according to claim 8, characterized in that they have cross-linked dextran beads and that the positively charged groups which are bound to the microcarrier are tertiary or quaternary amino groups.

12. Microcarrier according to claim 11, characterized in that the positively charged groups are diethylaminoethyl groups.

13. Microcarrier according to claim 12, characterized in that the dextran beads in the hydrated state have a diameter in the range from 120 to 200 am.

14. Application of the method according to claim 1 to the production of by-products of the growth of the anchorage-dependent cells, characterized in that a) a suspension of the positively charged microcarriers is prepared in its culture medium for culturing the anchorage-dependent cells,

b) inoculating this culture medium with the anchoring-dependent cells, a cell culture being formed,

c) maintaining this cell culture under conditions such that the formation of the by-products of cell growth occurs, and d) recovering the by-products of the cell growth.