CH615947A5 - Process for the cultivation of anchorage-dependent cells in a microcarrier culture, microcarriers for carrying it out and use of the process. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur. Die beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten Miktroträger besitzen eine in der Folge noch näher definierte Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen, und dadurch wird auf diesen Mikroträgern ein gutes Wachstum der verankerungsabhängigen Zellen erzielt.

Es ist wichtig, dass man in der Lage ist, Zellen von Säugetieren sowohl im Laboratoriums-Masstab als auch im industriellen Masstab zu züchten. Im Laboratoriums-Masstab ist der einschränkende Faktor bei Forschungsarbeiten auf dem Zellgebiet oder Virusgebiet bei sub-zellularem Niveau oft die Menge an Rohmaterial, die für die Untersuchungen zur Verfügung steht. Bei Arbeiten im industriellen Masstab wurden sehr viele Anstrengungen bezüglich der Entwicklung von pharmazeutischen Produkten unternommen, die auf Produkten der Säugetierzellen basieren. Zu derartigen Produkten gehören in erster Linie Impfstoffe, also Vaccinen, gegen Viruserkrankungen des Menschen oder der Tiere, jedoch auch ferner menschliche Wachstumshormone und andere Körperhormone, sowie biochemische Stoffe, die zur medizinischen Anwendung geeignet sind.

Einige Arten der Säugetierzellen wurden für ein Wachstum in Suspensionskulturen adaptiert. Beispiele für derartige, in Suspensionen züchtbare Säugetierzellen sind HeLa (des Menschen), BHK (Nierenzellen des Hamsterbabys) und L-Zellen (der Maus). Derartige Zellen haben im allgemeinen keine normale genetische Ausstattung, d. h. zu viele oder zu wenige Chromosomen oder abnormale Chromosomensätze. Oft erzeugen diese Zellen einen Tumor, wenn sie einem Tier der geeigneten Art injiziert werden.

Andere Arten an Säugetierzellen konnten bis jetzt nicht so adaptiert werden, dass sie in einer Suspensionskultur gezüchtet werden können, und diese Arten an Säugetierzellen wachsen nur dann, wenn sie an einer geeigneten Oberfläche gebunden sind. Derartige Zelltypen werden im allgemeinen als «verankerungsabhängig» («anchorage-dependent») bezeichnet, und zu derartigen Zellen gehören 3T3-Mausfibroblastzellen, Maus-Knochenmark-Epithel-Zellen; Murin-Leukämie-Virus bildende Stämme der Maus-Fibroblasten, primäre und sekundäre Küken-Fibroblasten, WI-38-Menschen-Fibroblast-Zellen und normale Menschenembrio-Lungenfibroblast-Zellen (HEL299) mit der Hinterlegungsnummer ATCC CCL137. Es wurden einige verankerungsabhängige Zellen gezüchtet, die Tumore hervorrufen, aber es wurden auch andere Arten gezüchtet, und es stellte sich heraus, dass diese keine Tumore erzeugten. Es können auch einige verankerungsabhängige Zellen gezüchtet werden, wie die oben genannten Zellen mit der Bezeichnung WI-38 und HEL299, welche in genetischer Hinsicht normal sind.

Es wurden bisher wesentliche Fortschritte bei der Zellzüchtung im grossen Masstab von Säugetierzellen erzielt, wenn man diese Zellzüchtung unter Verwendung von Zellstämmen durchführte, die in Suspensionskulturen gezüchtet werden konnten. Im Gegensatz dazu waren die Fortschritte bezüglich einer Zellzüchtung im grossen Ausmass äusserst begrenzt,

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wenn verankerungsabhängige Säugetierzellen gezüchtet werden sollten. Bisher angewandte Arbeitstechniken, die zur Bildung von grossen Mengen an verankerungsabhängigen Zellen angewandt wurden, bestanden darin, dass man Verfahren, die im kleinen Ausmass durchgeführt wurden, in linearer Weise ausdehnte. Anlagen zur Zellzüchtung verwendeten eine grosse Anzahl von Reaktionsgefässen für kleine Ansätze, beispielsweise in Form von Schalen, Arzneifläschchen, zylindrischen Rohren und zylindrischen Flaschen. Jedes dieser Reaktionsgefässe stellte eine getrennte Einheit dar oder ein isoliertes Reaktionsgefäss für ein ansatzweises Arbeiten, und deshalb war für jedes dieser Reaktionsgefässe eine individuelle Einstellung der Umgebung nötig. Diese Kontrolleinstellungen bezüglich der Umgebung waren jedoch aufgrund ökonomischer Betrachtungen äusserst primitiv gehalten. Änderungen bezüglich der Nährmittel wurden durch Wechsel des Mediums korrigiert, und dies ist ein Arbeitsvorgang, der zwei Arbeitsschritte umfasst, nämlich die Entfernung des alten Mediums und die Zugabe des neuen Mediums. Da es für eine Anlage mittlerer Grösse nicht unüblich war, Hunderte von derartigen, für einzelne Ansätze bestimmten Reaktionsgefässen zur gleichen Zeit zu bearbeiten, machte selbst ein einziger Wechsel des Mediums die Bearbeitung von Hunderten von Reaktionsgefässen nötig, wobei alle Arbeitsschritte genau durchgeführt und unter absolut sterilen Bedingungen ausgeführt werden muss-ten. Irgendwelche Arbeitsvorgänge, die mehrere Arbeitsschritte umfassten, wie zum Beispiel eine Übertragung der Zellen oder die Ernte der gewonnenen Zellen, führten dementsprechend zu noch viel drastischeren Problemen. Deshalb waren die Kosten für die Ausrüstung und die Vorrichtungen, die Raumkosten und die Kosten für die eingesetzten Arbeitskräfte für derartige Zuchtanlagen sehr hoch.

Es wurden auch andere Arbeitsmethoden vorgeschlagen, die Alternativen zu der oben beschriebenen linearen Vergrösse-rung von kleinen Ansätzen von Kulturen darstellen. Zu derartigen alternativen Methoden, die in der Literatur beschrieben wurden, gehören Plastiksäckchen, aufgestapelte Platten, Spiralfolien oder spiralförmige Filme, Vorrichtungen zur Ausbreitung von Glasperlen, künstliche Kapillare und Mikroträger. Von diesen Systemen besitzen solche auf der Basis von Mikro-trägern spezielle und einzigartige Vorteile. Beispielsweise wird dadurch ein sehr starker Anstieg bezüglich des erreichbaren Verhältnisses von der Oberfläche, an welcher ein Wachstum auftreten kann, also der sogenannten Wachstumsoberfläche, zu dem Volumen des Gefässes erreicht werden, indem man Mikroträger anwendet, und zwar sowohl bezüglich den bisher traditionell angewandten als auch bezüglich den oben genannten, jetzt neu entwickelten alternativen Arbeitsverfahren. Das Verhältnis von Wachstumsoberfläche zu Gefässvolumen wird in der Folge als S/V-Verhältnis abgekürzt. Durch die Erhöhung des S/V-Verhältnisses, die mit Hilfe der Mikroträger erreichbar ist, wird es möglich, aus einer einzigen Einheit aufgebaute Vorrichtungen für eine ansatzweise homogene Züchtung oder ansatzweise quasi-homogene Züchtung oder halb-ansatzweise Züchtung zu entwickeln, wobei diese Züchtungsvorrichtungen eine hohe Produktivität, bezogen auf das Volumen, besitzen. Dementsprechend kann ein einziges aus einem gerührten Tank bestehendes Reaktionsgefäss verwendet werden, bei dem einfache Kontrollvorrichtungen zur Einstellung des pH-Wertes und/oder der Sauerstoffzufuhr angewandt werden, wobei gegebenenfalls diese Einstellungen automatisch gemacht werden, und derartige Tanks stellen eine homogene Umgebung für eine grosse Anzahl an Zellen dar, wodurch es nicht mehr nötig ist, teure und raumverschwendende speziell eingestellte Brutkästen zur Erzeugung der gewünschten Umgebung zu verwenden. Ferner ist auch die Gesamtzahl an Arbeitsschritten, die benötigt wird, um eine bestimmte Anzahl an Zellen zu züchten, durch ein derartiges Arbeitsverfahren wesentlich vermindert. Zusammenfassend sei darauf hingewiesen, dass die Mikroträgermaterialien bezüglich der Wirtschaftlichkeit, des nötigen Startkapitals, des erforderlichen Raumes und der Erfordernisse an Arbeitskraft bei der Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen zu ganz wesentlichen Vorteilen im Vergleich zu bisher bekannten Züchtungsmethoden führen.

Die Mikroträger führen auch zu ganz wesentlichen Vorteilen bezüglich einer Kontinuität der Umgebung der Zellen,

denn die Zellen können so in einer einzigen, gut eingestellten Umgebung gezüchtet werden. Dementsprechend machen es Mikroträger möglich, verankerungsabhängige Säugetierzellen unter bestimmten festgesetzten Umgebungsbedingungen zu züchten, wobei diese Bedingungen immer wieder reguliert werden können, um ein konstantes optimales Zellenwachstum hervorzurufen.

Eines der ziemlich vielversprechenden Mikroträgersysteme, die bisher bekannt wurden, wurde von van Wezel beschrieben, und bei diesem System verwendete man mit Diäthylami-noäthyl substituierte Dextran-Perlen in einem gerührten Tank. Diese Methode wurde in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: A. L. van Wezel, «Growth of Cell Strains and Primary Cells on Microcarriers in Homogeneous Culture», Nature 216:64 (1967); D. van Hemert, D.G. Kilburn und A.L. van Wezel, «Homogeneous Cultivation of Animal Cells for the Production of Virus and Virus Products», Biotechnol. Bioeng. 11:875 (1969), sowie den Aufsatz von A.L. van Wezel, «Microcarrier Cultures of Animal Cells», in dem Buch Tissue Culture, Methods and Applications, P.F. Kruse und M.K. Patterson, eds., Academic Press, New York, Seite 372 (1973).

Diese Perlen werden von der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc., Piscataway, New Jersey, hergestellt, und es handelt sich dabei um ein Ionenaustauscher-System, das unter dem Markennamen DEAE-Sephadex A50 vertrieben wird. Chemisch gesehen, werden diese Perlen aus einem vernetzten Dextran-Grundgerüst hergestellt, bei dem Diäthylaminoäthyl-gruppen kovalent an die Dextrankette gebunden sind. Man nimmt an, dass die käuflich erhältlichen DEAE-Sephadex A50-Perlen eine Teilchengrösse von 40-120 [im besitzen und ferner eine positive Ladungskapazität von etwa 5,4 Milliäquivalenten pro Gramm an trockenem, vernetztem Dextran,

wobei in diesem Fall das Gewicht an gebundenen Diäthylami-noäthylgruppen nicht berücksichtigt wird. Die im Markennamen dieser Perlen aufscheinende Bezeichnung «DEAE» stellt eine Abkürzung für Diäthylaminoäthyl dar. Von van Wezel wurde ebenfalls angeführt, dass andere Anionenaustauscherharze, wie zum Beispiel DEAE-Sephadex A25, QAE-Sephadex A50 und QAE-Sephadex A25 das Zellenwachstum unterstützen.

Das System, das von van Wezel vorgeschlagen wurde, kombiniert mehrfache Oberflächen mit bewegbaren Oberflächen, und es bietet die Möglichkeit, erneuernde Zellmanipulationen durchzuführen und stellt auch Vorteile bezüglich einer Ver-grösserung des Produktionsmasstabes und der Einstellung und Kontrolle der Zellumgebung dar. Trotz dieser Möglichkeiten wurden die vorgeschlagenen Arbeitsverfahren nicht in wesentlichem Ausmass ausgenützt, weil bei auf diesem Gebiet durchgeführten Forschungsarbeiten Schwierigkeiten bei der Zellzüchtung aufgrund von bestimmten schädlichen Einflüssen angetroffen wurden, die von den Perlen verursacht wurden. Zu diesen schädlichen Einflüssen der Perlen gehören das anfängliche Absterben eines grossen Prozentsatzes der Zellen des Impfstoffes und ungeeignetes Wachstum der Zellen selbst bei denjenigen Zellen, die an die Oberfläche gebunden sind. Man verstand den Grund für diese schädlichen Einflüsse nicht vollständig, es wurde jedoch angenommen, dass diese Nachteile auf eine Toxizität der Perlen oder auf eine Nährstoffadsorption der Perlen zurückzuführen sein können. Es sei in diesem Zusammenhang auf die folgenden Literaturstellen

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verwiesen: van Wezel. A.L. (1967), Nature 216:64-65; der Aufsatz von van Wezel, A.L. (1973), in dem Buch Tissue Culture, Methods and Applications. Kruse P.R. und Patterson, M.R. (eds.), Seiten 372-377, Academic Press, New York; van Hemert, P., Kilburn, D.G. und van Wezel, A.L. (1969), Bio-technol. Bioeng. 11:875-885; Horng, C. und McLimans, W. (1975), Biotechnol. Bioeng. 17:713-732.

Es könnte möglich sein, dass die nachteiligen Einflüsse dieser käuflich erhältlichen Ionenaustauscherharze auf deren Herstellungsmethodik zurückzuführen sind. Bestimmte derartige Herstellungsverfahren für Polyhydroxymaterialien sind in der Patentliteratur beschrieben, wie zum Beispiel in den folgenden USA-Patenten: 3 277 025; 3 275 576; 3 042 667 und

3 208 994, die alle von Flodin et al. sind. Unabhängig von den Gründen sei jedoch hervorgehoben, dass die gegenwärtig käuflich erhältlichen Materialien ganz einfach nicht ausreichend sind, um ein gutes Zellenwachstum bei einer grossen Vielzahl an Zelltypen zu erreichen.

Ein Lösungsversuch zur Überwindung einiger derartiger schädlicher Einflüsse, die bei Versuchen zur Verwendung derartiger käuflich erhältlicher Mikroträger für das Zellenwachstum angetroffen wurden, ist in dem USA-Patent Nr.

4 036 693 von Levine et al., das am 19. Juli 1977 ausgegeben wurde, beschrieben. In dieser USA-Patentschrift wird ein Verfahren zur Behandlung der erwähnten käuflich erhältlichen Ionenaustauscherharze mit makromolekularen Polyanionen, wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, beschrieben.

Obwohl sich dieses Verfahren als vorteilhaft herausgestellt hat, wäre es natürlich wesentlich günstiger, wenn die fraglichen Perlen schon von Anfang an so hergestellt werden könnten, dass sie solche Eigenschaften besitzen, die für ein sehr gutes Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen bestimmt sind.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Ladungskapazität von Mikroträgern innerhalb eines bestimmten Bereiches eingestellt und/oder abgestimmt werden muss, damit man ein Material erhält, das zu einem guten Wachstum einer grossen Anzahl von verankerungsabhängigen Zelltypen bei vernünftigen Konzentrationen des Mikroträgers führt. Basierend auf diesen Feststellungen wurden nun Mikroträger-Perlen hergestellt, die festgesetzte Ladungskapazitäten besitzen, und derartige Perlen wurden verwendet, um ein gutes Wachstum einer Vielzahl von verankerungsabhängigen Zellen zu erzielen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Mikroträger verwendet, die eine Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen auf sich besitzen, wobei die Anzahl der Gruppen so ausgewählt wird, dass eine Austauschkapazität gewährleistet ist, die in einem solchen Bereich liegt, dass ein gutes Wachstum der Zellen erzielt wird, und wobei die Austauschkapazität im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt, und man die verankerungsabhängigen Zellen in einer Suspension des Mikroträgers züchtet und diese Zellkultur unter solchen Bedingungen belässt, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird.

Bevorzugte Mikroträger, die zur Durchführung des erfin-dungsgemässen Verfahrens verwendet werden, sind dabei vernetzte Dextran-Perlen, die auf ihrer Oberfläche positiv geladene chemische Gruppen aufweisen. Bevorzugte derartige positiv geladene chemische Gruppen sind tertiäre oder quaternäre Amingruppen, wobei von diesen Diäthylaminoäthylgrup-pen speziell bevorzugt sind.

Die Mikroträger, die zur Durchführung des erfindungsge-mässen Verfahrens herangezogen werden, können vorzugsweise eine Austauschkapazität besitzen, die im Bereich von 1,0 bis 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt, insbesondere pro Gramm der trok-kenen, unbehandelten vernetzten Dextran-Perlen.

Wie bereits erwähnt wurde, werden bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens die verankerungsabhängigen Zellen in Anwesenheit des suspendierten positiv geladenen Mikroträgers gezüchtet, und man belässt die Zellkultur unter solchen Bedingungen, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens verfährt man dabei so, dass man a) die positiv geladenen Mikroträger in einem Medium zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen suspendiert,

b) die Zellen in die Suspension des Mikroträgers einimpft, wobei sich eine Zellkultur bildet, und c) diese Zellkultur unter solchen Bedingungen belässt, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird.

Es ist jedoch auch möglich, das erfindungsgemässe Verfahren so auszuführen, dass in das Medium zur. Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen zunächst die Zellen eingeimpft werden, und dann in diesem Medium anschliessend die positiv geladenen Mikroträger suspendiert werden und die Zellkultur unter solchen Bedingungen belassen wird, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Mikroträger zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sich auf diesen Mikroträgern eine solche Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen befindet, dass eine Austauschkapazität der Mikroträger gewährleistet ist, die in einem Bereich liegt, dass ein gutes Zellwachstum auftritt, wobei die Austauschkapazität im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt.

Wenn diese Mikroträger vernetzte Dextran-Perlen sind, dann weisen sie vorzugsweise auf ihrer Oberfläche eine Austauschkapazität auf, die im Bereich von 1,0 bis 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm der trockenen, unbehandelten vernetzten Dextran-Perlen liegt. Die Grösse der Dextran-Perlen ist vorzugsweise so, dass sie im trockenen Zustand einen Durchmesser von 75 |xm aufweisen, und in hydratisiertem Zustand einen Durchmesser besitzen, der im Bereich von 120 bis 200 um liegt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens auf die Gewinnung von Nebenprodukten des Wachstums der verankerungsabhängigen Zellen. Diese Anwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Suspension der positiv geladenen Mikroträger in einem Kulturmedium zur Züchtung der verankerungsabhängigen Zellen herstellt,

b) dieses Kulturmedium mit den verankerungsabhängigen Zellen beimpft, wobei sich eine Zellkultur bildet,

c) diese Zellkultur unter solchen Bedingungen aufrechterhält, dass die Bildung der Nebenprodukte des Zellwachstums auftritt, und d) die Nebenprodukte des Zellwachstums gewinnt.

Beispiele für Nebenprodukte des Zellwachstums, die in dieser Weise gewonnen werden könnten, sind Viren, Hormone und Interferon. Ferner könnten auch Impfstoffe, also Vaccinen, auf diese Weise hergestellt werden und andere Nebenprodukte des Zellwachstums erzeugt werden. Das Verfahren ist sowohl für die Gewinnung von tierischen Viren als auch von Pflanzenviren geeignet.

Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial, das zur Herstellung der

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beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroträger eingesetzt werden kann, sind Polymermaterialien, die gebundene Hydroxylgruppen aufweisen, wobei von diesen Materialien, wie bereits weiter oben erwähnt wurde, vernetzte Dex-tran-Perlen speziell bevorzugt sind. Wenn man an diese Perlen als positiv geladene Gruppen tertiäre oder quaternäre Amin-gruppen binden will, dann ist es vorteilhaft, die Dextran-Perlen mit einer wässrigen Lösung eines tertiären oder quater-nären Amines zu behandeln, beispielsweise mit dem Chlorid des entsprechenden Amines. Wie bereits erwähnt wurde, sind speziell bevorzugte Amingruppen die Diäthylaminoäthylgrup-pen, und um diese Gruppierungen an die Dextran-Perlen zu binden, kann man beispielsweise die Dextran-Perlen mit dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides und einem alkalischen Material, beispielsweise Natriumhydroxyd, behandeln.

' Die Einstellung der benötigten spezifischen Ladungskapazität der Dextran-Perlen kann durchgeführt werden, indem man die absoluten Mengen an Dextran zu dem tertiären Aminsalz und dem alkalischen Material variiert, oder indem man das Verhältnis dieser Materialien und/oder die Zeit und Temperatur der Behandlung verändert. Wesentlich ist dabei, dass man schliesslich einen Mikroträger erhält, der eine Austauschkapazität besitzt, die im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt.

Das erfindungsgemässe Verfahren, das unter Verwendung der Mikroträger mit genau definierter Ladungskapazität durchgeführt wird, ermöglicht die Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen, ohne dass am Anfang hohe Verluste an Zellen auftreten, die bisher bei käuflich erhältlichen Mikroträgern beobachtet wurden. Auf den beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroträgern breiten sich die am Träger haftenden Zellen aus und wachsen auf den Perlen bis zum Zusammenfliessen der Zellbezirke, wobei man dadurch extrem hohe Zellkonzentrationen in dem zur Suspension herangezogenen Medium erhält. Die Konzentration der Mikroträger in der Suspension ist nicht auf ziemlich niedrige Werte beschränkt, wie dies bei bisher beschriebenen Materialien üblich war. Es scheint, dass das Zellenwachstum nur durch solche Faktoren begrenzt ist, die offenbar nicht auf die Mikroträger zurückzuführen sind. Aus diesen Gründen können starke Erhöhungen in der Produktivität der Zellkultur pro Volumeneinheit, also in der volumetrischen Produktivität, erzielt werden. Kurz gesagt können die potentiellen Vorteile, die durch die Verwendung von Mikroträgern bei der Zellzüchtung erreichbar sind, und zwar insbesondere bei der Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen, jetzt tatsächlich ausgenützt werden.

Die Erfindung sei nun anhand der Zeichnung näher erläutert.

In Figur 1 ist auf der Ordinate die Zellkonzentration in 105 Zellen pro Millimeter aufgetragen. Auf der Abszisse ist die Zeit in Stunden aufgetragen. Es wurde das Wachstum von normalen diploiden Menschenembryo-Lungenfibrinoblast-Zellen (HEL299) untersucht, und es wurden bei der Züchtung Mikroträgerkonzentrationen von 2 g vernetztem trockenem Dextran-Mikroträger pro Liter angewandt, und zwar sowohl bei dem käuflich erhältlichen mit Diäthylaminoäthylgruppen substituierten Dextran-Mikroträger als auch bei dem nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Diäthylaminoäthylgruppen aufweisenden Mikroträger. In Figur 1 sind die Ergebnisse, welche mit Hilfe der bisher bekannten Miktroträ-ger erzielt wurden, die mit ausgefüllten schwarzen Punkten angegebenen Messpunkte, während die Messwerte, die mit Hilfe der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Träger erhalten wurden, durch unausgefüllte Kreise veranschaulicht sind. Aus den beiden Kurven sieht man, dass mit Hilfe der nach dem erfindungsgemässen Verfahren behandelten Trägermaterialien ein wesentlicher Anstieg der Zellkonzentration erreicht werden kann, während in diesem Fall mit Hilfe der im Handel erhältlichen Trägermaterialien sogar ein Absinken der Zellkonzentration hervorgerufen wurde.

Figur 2 ist ebenfalls ein Diagramm, wobei wieder auf der Ordinate die Zellkonzentrationen in 105 Zellen pro Milliliter angegeben sind, und auf der Abszisse auch hier die Zeit in Stunden aufgetragen ist. Der verwendete Mikroträger war in diesem Fall ein nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellter Mikroträger und dieser wurde in einer Konzentration von 5 g pro Liter angewandt, wobei der Mikroträger als trockenes vernetztes Dextran berechnet wurde. Es wurden zwei Arten an Zellen untersucht, und zwar normale diploide Lungenfibrinoblast-Zellen des menschlichen Embryo (HEL299) und sekundäre Kükenembryo-Fibrinoblasten. Die Werte für die menschlichen HEL299-Zellen sind durch Kreise veranschaulicht, während die Werte für die sekundären Kükenfibrinoblast-Zellen durch unausgefüllte Dreiecke veranschaulicht werden.

In der Folge werden nun bevorzugte Ausführungsarten der Erfindung beschrieben.

In der vorliegenden Beschreibung versteht man unter dem Ausdruck «Mikroträger» bzw. «Mikroträger für die Zellkultur» oder «Mikroträger für das Zellenwachstum bzw. die Zellenzüchtung» kleine getrennte Teilchen, die geeignet sind, dass Zellen daran gebunden werden und darauf wachsen. Oft, jedoch nicht immer, sind die Mikroträger poröse Perlen oder Körner, die aus dem Polymermaterial gebildet werden. Üblicherweise haften die Zellen und wachsen auch an der äusseren Oberfläche derartiger Perlen.

Wie weiter oben beschrieben wurde, wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Menge der Ladungskapazität auf Mikroträgern für die Zellzüchtung in einem gewissen Bereich eingestellt oder einreguliert werden muss, damit ein entsprechendes Zellwachstum bei vernünftigen Konzentrationen der Mikroträger erreicht wird. Geeignete Arbeitsbedingungen und bevorzugte Bereiche hängen von verschiedenen Faktoren ab, wie zum Beispiel den speziellen Zellen, die gezüchtet werden sollen, der Art der Mikroträger, der Konzentration der Mikroträger und anderen Variablen des Züchtungsverfahrens, einschliesslich der Zusammensetzung des Züchtungsmediums. In allen Fällen jedoch hat es sich herausgestellt, dass die Menge der Ladungskapazität, die geeignet ist, wesentlich unterhalb der Ladungsmengen liegt, von denen man annahm, dass sie bisher in den käuflich erhältlichen Anionaustauscherharzen anwesend waren, die bis jetzt als Mikroträger für Zellkulturen vorgeschlagen worden waren. Beispielsweise nimmt man an, dass die DEAE-Sephadex A50-Perlen, die von van Wenzel vorgeschlagen wurden, eine Ladungskapazität von etwa 5,4 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten vernetzten Dextrans, also des Dextrans ohne Berücksichtigung seiner aufgebrachten Diäthylaminoäthylgruppen, besitzen. Im Gegensatz zu dieser relativ hohen Ladungskapazität wurden nun die erfindungsgemässen Mikroträger hergestellt, die eine Ladungskapazität von etwa 0,1 bis etwa 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm der trockenen unbehandelten Mikroträger besitzen. Diese fraglichen Mikroträger haben sich als geeignet zur Durchführung der erfindungsgemässen Zellzüchtungen herausgestellt. Wenn die Mikroträger Ladungskapazitäten aufweisen, die unterhalb von etwa 0,1 Milliäquivalenten pro Gramm liegen, dann nimmt man an, dass die Zellen Schwierigkeiten besitzen, sich an den Mikroträgern anzuheften. Wenn andererseits die Mikroträger Ladungskapazitäten besitzen, die über etwa 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm liegen, dann treten Verluste der ursprünglichen zur Beimpfung verwendeten Zellen auf, und selbst die überlebenden Zellen wachsen nicht gut, insbesondere dann, wenn relativ hohe Mikroträgerkonzentrationen angewandt werden.

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Für das Wachstum von normalen diploiden menschlichen Fibroblasten auf vernetzten Dextran-Mikroträgern hat es sich herausgestellt, dass ein bevorzugter Bereich der Ladungskapazität, die von den Diäthylaminoäthylgruppen zur Verfügung gestellt wird, im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten vernetzten Dextrans liegt. Während der bevorzugte Bereich je nach den unterschiedlichen Zelltypen und den bei der Züchtung angewandten Bedingungen variieren kann, so kann man dennoch annehmen, dass die bevorzugten Bereiche für beliebige angewandte Bedingungen im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm liegen werden. Die bevorzugten und die optimalen Bedingungen können vom Fachmann auf diesem Gebiet für jede Art an vorgegebenen Züchtungsbedingungen durch kurze Vorversuche bestimmt werden.

Es ist klar zu sehen, dass natürlich gewisse Schwierigkeiten bestehen, wenn man versucht, die Ladungskapazität von Mikroträgern genau auf die Gewichtseinheit bezogen zu definieren. Beispielsweise werden zwei Perlen, die miteinander in jeder Weise identisch sind, mit Ausnahme dessen, dass sie aus Materialien erzeugt wurden, die unterschiedliche Dichten besitzen, und die auf der Oberfläche die gleiche Ladungsverteilung aufweisen, unterschiedliche Werte für ihre Ladungskapazität pro Gewichtseinheit liefern. In gleicher Weise können zwei Perlen, die identische Ladungskapazitäten pro Gewichtseinheit aufweisen, gegebenenfalls ziemliche unterschiedliche Ladungsverteilungen auf den Perlen aufweisen.

Eine andere Definition kann gemacht werden, indem man den Bereich von geeigneten Ladungen in dem Mass-System der Ladungskapazizät pro Gewichtseinheit des Mikroträgers in seiner endgültigen, bei der Verwendung angewandten Form angibt. Eine derartige Angabe würde weitere Faktoren berücksichtigen, wie zum Beispiel das Gewicht der an den Mikroträger gebundenen Diäthylaminoäthylgruppen oder andere positiv geladene Gruppen und auch die Hydratation der Perlen und ähnliche weitere Faktoren. Im Gegensatz dazu basiert die zuerst genannte Definition auf dem trockenen vernetzten Dextran und trägt derartigen zuletzt genannten Faktoren in keiner Weise Rechnung. Da die Mikroträger in wässrige Zellkulturmedien eingebracht werden sollen, soll die Dichte der Mikroträger in der Nähe von 1,0 g pro cm3 liegen, und zwar deshalb, weil die Miktroträger leicht in dem Kulturmedium dispergierbar sein sollen. Unter Berücksichtung dieser Tatsache hat man sich deshalb entschieden, dass der Bereich geeigneter Ladungskapazitäten für die erfindungsgemässen Mikroträger in der beschriebenen Weise definiert im Bereich von etwa 0.012 bis etwa 0,25 Milliäquivalenten pro Gramm liegen soll.

Die Bereiche von geeigneten Ladungskapazitäten, die weiter oben definiert wurden, bezogen auf die Gewichtsbasis, sind gültig, wenn man annimmt, dass die Mikroträger eine im wesentlichen einheitliche Ladungsverteilung über ihre Gesamtmasse aufweisen. Wenn die Ladungsverteilung ungleichmässig ist, dann könnte es möglich sein, geeignete Mikroträger zu haben, deren Ladungskapazität ausserhalb der angeführten Bereiche liegen. Das wesentliche Kriterium ist natürlich, dass die Ladungskapazität so eingestellt und/oder abgestimmt wird, dass sie einen Wert besitzt, der ausreichend ist, um ein gutes Zellenwachstum auf den Mikroträgern zu gewährleisten.

Da es möglich ist, dass das Ladungsmuster auf der äusseren Oberfläche der Mikroträger derjenige Faktor ist, der tatsächlich die ausschlaggebende Bedeutung besitzt, ist es auch wünschenswert, in der Lage zu sein, einen geeigneten Bereich der Ladungskapazität in der Masseinheit des wahrscheinlich auftretenden Oberflächenmusters zu definieren. Dies kann gemacht werden, indem man annimmt, dass der aktive Teil der Mikroträger sich ausschliesslich auf der äusseren Oberfläche der Perlen bis zu einer Tiefe von etwa 20Â (Angström) befindet. Wenn man ferner annimmt, dass die geladenen Gruppen in den weiter oben erwähnten Fällen gleichmässig über die Perlen verteilt sind, dann können die oben angegebenen Bereiche in Ladungskapazitäten in dieser äusseren Schale umgerechnet werden. Wenn nun dieses Näherungsverfahren verwendet wird, dann liegt der Bereich der Ladungskapazitäten, der sich als geeignet herausgestellt hat, in der Grössenord-nung von etwa 0,012 Milliäquivalenten pro cm3 bis etwa 0,25 Milliäquivalenten pro cm3. Dieses Näherungsverfahren berücksichtigt Änderungen des Volumens des Mikroträgers aufgrund von unterschiedlichen Ladungsdichten.

Mikroträger, welche die benötigte Ladungskapazität besitzen, können hergestellt werden, indem man Mikroträger, die aus Polymermaterialien gebildet wurden, welche gebundene Hydroxylgruppen aufweisen, mit einer wässrigen Lösung eines alkalischen Materiales und einem tertiären Amin oder quater-nären Amin behandelt. Die Perlen können am Anfang in einem wässrigen Medium gequollen sein, ohne dass andere Bestandteile anwesend sind, oder man kann die Perlen ganz einfach mit dem wässrigen Medium in Berührung bringen, das bereits die benötigte Base und das erforderliche Amin enthält. Dieses Verfahren, bei welchem alkalische Materialien eingesetzt werden, um die Bindung der positiv geladenen Amino-gruppen an das Hydroxylgruppen enthaltende Polymermaterial hervorzurufen, wird von Hartmann in der USA-Patentschrift Nr. 1 777 970 beschrieben.

Beispiele für geeignete Hydroxylgruppen enthaltende Polymermaterialien, die zur Herstellung der Mikroträger verwendet werden können, sind Polysaccharide, wie zum Beispiel Dextran, Dextrin, Stärke, Cellulose, Polyglucose und substituierte Derivate dieser Polysaccharide. Bestimmte synthetische Polymermaterialien, wie zum Beispiel Polyvinylalkohol und hydroxysubstituierte Acrylate oder Methacrylate wie beispielsweise Hydroxyäthyl-methacrylat, sind ebenfalls geeignet. Dextran, und insbesondere vernetztes Dextran, in Form von kleinen Kügelchen, Körnern oder Perlen ist speziell bevorzugt, weil dieses Material käuflich erhältlich ist, relativ billig ist und zu Mikroträgern führt, welche ein hervorragend gutes Zellwachstum unterstützen.

Beliebige Materialien, die alkalisch sind, können zur Durchführung der Reaktion verwendet werden. Die Alkalimetallhy-droxyde, wie zum Beispiel Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, sind jedoch die bevorzugten alkalisch reagierenden Substanzen.

Sowohl tertiäre Amine als auch quaternäre Amine sind geeignete Ausgangsmaterialien zur Herstellung positiv geladener Gruppen, die an die Hydroxylgruppen enthaltenden Polymermaterialien gebunden werden können. Speziell bevorzugte Materialien sind chlorsubstituierte oder bromsubstituierte tertiäre Amine oder Salze derselben, und als spezielle Beispiele seien genannt:

Diäthylaminoäthylchlorid, Diäthylaminoäthylbromid, Dimethylaminoäthylchlorid, Dimethylaminoäthylbromid, Diäthylaminomethylchlorid, Diäthylaminomethylbromid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylchlorid, Di-(hydroxyäthyl)-aminoäthylbromid, Di-(hydroxyäthyl)-aminomethylchlorid, Di-(hydroxyäthyl)-aminomethylbromid, ß-Morpholino-äthylchlorid, ß-Morpholinoäthylbromid, ß-Morpholino-methylchlorid, ß-Morpholinomethylbromid und Salze dieser Verbindungen, wie zum Beispiel die entsprechenden Hydro-chloride.

Ein weiter Bereich der Reaktionstemperaturen und der Reaktionszeiten kann angewandt werden. Es ist vorzuziehen, die Umsetzungen bei Temperaturen durchzuführen, die im Bereich von etwa 18 bis 65°C liegen. Es können jedoch auch andere Temperaturen angewandt werden. Die Reaktionskine5

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tik hängt natürlich in weitem Ausmass von der Reaktionstemperatur ab und auch von der Konzentration der Reaktionspartner. Sowohl die Zeit als auch die Temperatur beeinflussen die schliesslich erreichte endgültige Austauschkapazität.

Bis jetzt wurden die Gründe, warum die Ladungskapazität der Mikroträger eine speziell kritische Grösse beim Zellenwachstum ist, noch nicht vollständig verstanden. Obwohl der Erfindungsgedanke durch keine Theorie irgendwie eingeengt werden soll, ist es dennoch möglich, dass die Ladungskapazität an der Oberfläche zu bestimmten lokalen Diskontinuitäten der Zusammensetzung des Mediums führt, und dass dies der bedeutendste Einfluss bezüglich der Hemmung oder Förderung des Wachstums von Zellen in Kulturen auf Mikroträgern ist. Irgendwelche anderen Möglichkeiten der Erklärung der beobachteten Effekte seien jedoch in keiner Weise irgendwie ausgeschlossen.

Es gibt natürlich bestimmte Perlen, die nicht geeignet sind, um ein gutes Zellwachstum hervorzurufen, selbst dann, wenn sie eine Ladungskapazität haben, die innerhalb der angegebenen Bereiche liegt. Dies kann auf Seitenketten an denjenigen Gruppen zurückzuführen sein, die die Ladungskapazität hervorrufen und die toxisch sind oder sonst irgendwelche nachteilige Einflüsse auf das Zellenwachstum besitzen. Weitere beeinflussende Faktoren können die Anwesenheit von absorbierten oder adsorbierten schädlichen Zusammensetzungen oder Verbindungen sein, oder Perlen können auch aufgrund ihrer Porosität oder aus anderen Gründen nicht geeignet sein. Wenn derartige Perlen zur Zellzüchtung ausser aufgrund ihrer Ladungskapazität nicht geeignet sind, dann werden diese Perlen nicht als Mikroträger für das Zellwachstum betrachtet.

Die Erfiindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel l

Herstellung von verbesserten Mikroträgern

Verbesserte Mikroträger können nach dem folgenden Arbeitsverfahren hergestellt werden:

Trockene, ungeladene vernetzte Dextran-Perlen werden gesiebt, damit man diejenigen erhält, die einen Durchmesser von etwa 75 [im besitzen. 1 g dieser Fraktion wird zu 10 ml destilliertem Wasser zugegeben, und man lässt die Perlen quellen. Ein geeignetes käuflich erhältliches Ausgangsmaterial für trockenes, vernetztes Dextran ist das Markenprodukt Sephadex G-50 der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Piscata-way, New Jersey.

Eine wässrige Lösung, die 0,01 Mol an dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides sowie 0,015 Mol an Natriumhydroxyd enthält, wird in einer Menge von 10 ml Volumen hergestellt. Das als Ausgangsmaterial verwendete Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides wurde von der Verwendung zweimal aus Methylenchlorid umkristallisiert. Die erhaltene wässrige Lösung wird dann zu der Suspension an gequollenen Dextran-Perlen zugegeben, die dann heftig in einem Schüttelwasserbad während einer Stunde bei 60°C gerührt wird. Nach 1 Stunde werden die Perlen aus der Reaktionsmischung abgetrennt, indem man sie durch ein Whatman-Füterpapier Nr. 595 filtriert und mit 500 ml destilliertem Wasser wäscht.

Perlen, die nach diesem Verfahren hergestellt wurden, enthalten etwa 2,0 Milliäquivalente Ladungskapazität pro Gramm des trockenen vernetzten unbehandelten Dextrans. Diese Ladungskapazität kann durch Bestimmung der Anion-austauschfähigkeit der Perlen nach dem folgenden Arbeitsverfahren bestimnt werden.

Die hergestellten Perlen werden gründlich mit 0,1 normaler Salzsäure gewaschen, um alle Austauschstellen mit Chloranio-nen, also Cl-, zu sättigen. Sie werden dann mit 10"4 normaler Salzsäure gewaschen, um ungebundene Chloridionen zu entfernen. Anschliessend werden die Perlen mit einer 10-gew.-

prozentigen, bezogen auf das Gewicht, Natriumsulfatlösung gewaschen, um eine Gegensättigung der Austauscherstellen mit Sulfatanionen, also SO42-, zu erreichen. Das bei dem Waschen mit der Natriumsulfatlösung ausfliessende Material wird quantitativ aufgefangen, denn es enthält die von dem Austauscher freigesetzten Chloridionen. Diese Lösung wird dann mit 1 molarer Silbernitratlösung unter Verwendung von Kaliumchromat als Indikator titriert.

Nach diesem Titrieren werden die Perlen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, mit einer Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (diese Lösung wird in der Folge als «PBS-Lösung abgekürzt) gespült, dann in einer PBS-Lösung suspendiert und im Autoklaven behandelt. Nach diesem Arbeitsverfahren erhält man hydratisierte Perlen, die einen Durchmesser von etwa 120 bis 200 (im besitzen, und die etwa eine Ladungskapazität von 2,0 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten vernetzten Dextrans aufweisen.

Beispiel 2

Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen mit erfindungsgemässen Mikroträgern, im Vergleich zu einer entsprechenden Züchtung mit käuflich erhältlichen Ionenaustauscherharten

Alle Zellen wurden in dem von Dulbecco modifizierten Eagle-Medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) gezüchtet. Bei der Züchtung von normalen diploiden Fibroblasten wurde das Medium auf 10% unter Verwendung von Serum von Kälberföten ergänzt. Bei der Züchtung von primären und sekundären Küken-Fibroblasten wurde das Medium mit 1 % Kükenserum, 1 % Kälberserum und 2 % Tryptose-Phosphat-Brühe (ein Produkt der Difco Laboratories, Detroit, MI) ergänzt. Der Vorrat wurde auf 100 mm Kunststoffschäl-chen, erhältlich von der Falcon Plastics, Inc., Oxnard, CA, gegossen.

Die primären Kükenembryo-Fibroblasten wurden hergestellt, indem man 10 Tage alte Embryos zerkleinerte und dann einer Trypsin-Behandlung (Trypsinierung) unterwarf. Sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten wurden am ersten Tag der primären Konfluenz durch Trypsinierung hergestellt. Für die Zellen, die in den Kunststoffschälchen gezüchtet wurden,

betrug die Verdopplungszeit etwa 20 Stunden.

Diploide menschliche Fibroblasten, die aus der Lunge von Embryos stammten, nämlich die Zellen HEL299 mit der Hinterlegungsnummer ATCC Nr. CCL 137 wurden von der American Type Culture, Collection, Rockville, MD, erhalten. Diese Zellen hatten in den Kunststoffschälchen eine Verdopplungszeit von 19 Stunden.

Die Züchtung der Zellen auf dem Mikroträger wurde einfach damit begonnen, dass man die Zellen und die Träger-Perlen in einem gerührten Zuchtmedium zusammenbrachte. 100 ml des Zuchtmediums wurden in Glasflaschen (glass Spinner bottles) eines Rauminhaltes von 250 ml, die einen Durchmesser von 6,5 cm besassen, eingebracht, wobei die Glasflaschen mit einem 4,5 cm langen Magnetrührerstab, der mit Teflon beschichtet war, ausgestattet waren. Der Magnetrührer ist das Produkt der Firma Wilbur Scientific, Inc., Boston, MA. Es wurde mit einer Rührgeschwindigkeit von etwa 90 Umdrehungen pro Minute gerührt. Die Kulturen wurden direkt zu Proben verarbeitet, und diese Proben wurden mikroskopisch geprüft und photographiert. Die Zahl der Zellen wurde ermittelt, indem man die Zellkerne zählte, und zwar durch Anwendung einer Modifikation der Methodik von Sanford et al. (San-ford K.K., Earle, W.R., Evans, V.J., Waltz, H.K., und Shannon, J.E. [1951] J. Nati Cancer Inst. 11: 773). Diese Modifikation der Zählmethodik wurde von van Wezel beschrieben (s. der Aufsatz von van Wezel, A.L. (1973) in dem Buch Tissue Culture, Methods and Applications, Kruse, P.F. und Patterson, M.R. (eds.), Seiten 372-377, Academic Press, New York).

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Perlen mit daran befestigten Zellen wurden aus dem Kulturmedium abgetrennt, indem man die Perlen bei 1 g wenige Minuten lang absitzen liess und dann das darüberstehende Material absaugte. Dieses Arbeitsverfahren konnte das Ersetzen des Mediums sehr erleichtern, und es war auch die Abtrennung von Zellen von dem Mikroträger nach der Trypsinierung leicht möglich.

Als Mikroträger wurde käuflich erhältliches DEAE Sepha-dex A-50 für die diploiden menschlichen Fibroblasten verwendet, und dieses Trägermaterial wurde mit Trägermaterial verglichen, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren synthetisiert und titriert wurde. Bei beiden Typen der Trägermaterial-Perlen war die Konzentration 2 g trockene, unbehandelte vernetzte Dextran-Perlen pro Liter Kulturmedium. Die Ladungskapazität des Trägermaterials DEAE-Sephadex A-50 betrug 5,4 Milliäquivalente pro Gramm an trockenem vernetztem Dextran, während die Ladungskapazität der gemäss Beispiel 1 synthetisierten Trägermaterialien 2,0 Milliäquivalente pro Gramm betrug. Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in dem Diagramm in Figur 1 zusammengestellt.

Bei dieser Art von Zellen ist ein Verlust an ursprünglich eingeführtem Impfmedium bei der Verwendung des DEAE Sephadex A-50-Trägermaterials sehr bedeutend, während im Gegensatz dazu die Fibroblasten sich an den erfindungsgemässen Trägermaterialien gut verankern, rasch vermehren und ein Zusammenfliessen auf den Trägermaterialien innerhalb von 6 Tagen erreicht ist. Diese Verhaltensweise steht in guter Übereinstimmung mit dem Verhalten, das für diese Art von Zellen bei Standard-Platten oder Schalen beschrieben wird. Wie man aus Figur 1 sieht, betrug die endgültige Zelldichte, die unter Verwendung der neuen Mikroträger in einer Konzentration von 2 g an trockenem, vernetztem Dextran pro Liter erreicht wurde, 1,2 X106 Zellen pro Millimeter.

Zellkulturen, die unter Verwendung der neuen Mikroträger gezüchtet wurden, zeigten weder einen anfänglichen Zellenverlust noch irgendeine Hemmung beim Erreichen des Zusam-menfliessens der Zellen. Von noch grösserer Bedeutung ist es, dass die Zellkulturen üblicherweise bei höheren Konzentrationen des Mikroträgers wachsen gelassen werden konnten. Bei dem in Figur 2 veranschaulichten Diagramm sieht man beispielsweise, dass Menschen-Fibroblasten und sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten Sättigungskonzentrationen in der Nähe von 4 X10® Zellen pro Milliliter erreichen, wenn man den neuen Mikroträger, der eine Ladungskapazität von 2,0 Milliäquivalenten pro Gramm Dextran aufweist, in einer Konzentration von 5 g an trockenem, vernetztem Dextran pro Liter der Lösung verwendete. Man sieht aus den in Figur 2 schematisch dargestellten Ergebnissen, dass selbst bei dieser relativ hohen Mikroträgerkonzentration kein wesentlicher Verlust an Impfstoff eintritt.

Sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten wurden ebenfalls bei einer Mikroträgerkonzentration von 10 g pro Liter gezüchtet. Bei den oben beschriebenen Bedingungen wurde eine Sättigungskonzentration von 6 X106 Zellen pro Milliliter erreicht. Wenn man dem Züchtungsmedium noch weitere 1 % an dem Serum von Kälberföten zusetzte, konnte eine Sättigungskonzentration von 8 X106 Zellen pro Milliliter erreicht werden. Dabei trat kein wesentlicher Verlust an dem Impfmedium ein.

Primäre Kükenembryo-Fibroblasten wurden bei einer Mikroträgerkonzentration von 5 g pro Liter, bzw. 10 g pro Liter gezüchtet, und die Wachstumseigenschaften waren ähnlich denjenigen der sekundären Küken-Fibroblasten, wobei jedoch im vorliegenden Fall ein gewisser Verlust an Impfstoff festgestellt wurde, und ebenfalls eine etwas längere Verweilphase angetroffen wurde.

Es wurden auch Versuche unternommen, sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten unter Bedingungen zu züchten, die ähnlich denjenigen sind, welche oben angewandt wurden, wobei jedoch jetzt keine erfindungsgemässen Mikroträger verwendet wurden, sondern Mikroträger aus DEAE-Sephadex A-50 in einer Konzentration von 1 g pro Liter, bzw. 5 g pro Liter, In diesem Fall konnte kein Zellwachstum festgestellt werden, und es traten wesentliche Verluste an Impfstoff auf.

Beispiel 3

Herstellung von Mikroträgern unter Verwendung von verschiedenen Mengen an Reaktanten Es wurden verschiedene Ansätze an Miktroträgern hergestellt, indem man das Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides und Natriumhydroxid in 20 ml destilliertem Wasser löste. Die so gewonnene Lösung wurde dann über trockene Perlen aus Sephadex G-50 gegossen, worauf dann die Perlen auf eine Kolben-Schüttelmaschine, unter Verwendung eines Wasserbades, das bei 60°C eingestellt war, gegeben wurden. Eine Serie von Perlenproben wurde mit einer Lösung behandelt, die 0,01 Mol an dem Amin und 0,015 Mol an Natriumhydroxyd enthielt, während eine weitere Serie an Perlenproben mit einer Lösung behandelt wurde, die 0,03 Mol an dem Amin und 0,045 Mol an Natriumhydroxyd enthielt. Die Reaktionszeiten wurden geändert, um bei den einzelnen Ansätzen unterschiedliche Werte für die Milliäquivalente pro Gramm zu erhalten.

Diploide menschliche Fibroblasten, nämlich die Zellen mit der Bezeichnung HEL299, wurden in Suspensionskulturen gezüchtet unter Verwendung von einer Mikroträgerkonzentration von 5,0 g an trockenem, unbehandeltem vernetztem Dextran pro Liter. Dabei wurden die in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsverfahren angewandt, und man verwendete für die einzelnen Versuche Mikroträger, die unterschiedliche Werte für die Ladungskapazitäten, ausgedrückt in Milliäquivalenten pro Gramm, besassen. Die Mikroträger-Perlen wurden nach dem oben beschriebenen Verfahrem hergestellt. Wenn man die Ergebnisse in ein Diagramm eintrug, dann erhielt man für beide Versuchsreihen Kurven, die eine ähnliche Form hatten, die ganz allgemein als Glockenform bezeichnet werden kann, wobei jedoch die Kurven, die bei Verwendung von Mikroträ-gerperlen erhalten wurden, welche mit den oben angegebenen höheren Konzentrationen der Reaktanten behandelt worden waren, einen etwas schärferen Anstieg und schärferen Abfall besassen. In beiden Fällen wurden Trägermaterialien erhalten, die zu einem hervorragend guten Zellenwachstum führten.

Beispiel 4

Herstellung von Mikroträgern unter Anwendung unterschiedlicher Verhältnisse von Amin zu Alkali Anhand dieses Beispieles werden weitere Veränderungen in der Ladungskapazität der Mikroträger erläutert, die dadurch erreicht werden können, dass man das Verhältnis von dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides zu der Natronlauge, das bei der Herstellung angewandt wird, variiert. Bei diesem Beispiel wurden die in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweisen wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass ein weiter Bereich an unterschiedlichen Konzentrationen von Natriumhydroxyd angewandt wurde, während im Gegensatz dazu die verwendete Konzentration des Chlorides des Diäthylaminoäthylchlorides bei 0,01 Mol pro 20 ml konstant gehalten wurde. Die Konzentrationen an Natriumhydroxyd, die angewandt wurden, betrugen 0,01 bzw. 0,011, bzw. 0,012, bzw. 0,013, bzw. 0,014 bzw. 0,015, bzw. 0,02, bzw. 0,03, bzw. 0,05, bzw. 0,75, bzw. 0,10 Mol pro 20 ml.

Dabei wurde in einem Diagramm für eine Umsetzung während 1,25 Stunden bei einer Temperatur von 60°C die erhaltene Ladungskapazität in Milliäquivalenten pro Gramm gegen die angewandte Konzentration von Natriumhydroxyd aufgetragen. Aus diesem Diagramm sah man, dass bei Verwendung von Konzentrationen von Natriumhydroxyd, die unterhalb von

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0,01 Mol pro 20 ml lagen, Mikroträger erhalten wurden, die keine feststellbaren Ladungskapazitäten besassen. Die Ladungskapazität des Endproduktes stieg jedoch mit ansteigender Konzentration der Natronlauge und erreichte ein Maximum in der Grössenordnung von 2,3 Milliäquivalenten pro Gramm trockenem, vernetztem Dextran bei einer Konzentration von etwa 0,014 Mol Natriumhydroxyd pro 20 ml. Die Ladungskapazität nahm dann beinahe in linearer Weise bis zu einem Wert von etwa 1,1 Milliäquivalenten pro Gramm trok-kenem, vernetztem Dextran ab, wenn die Konzentration an Natriumhydroxyd anstieg, und zwar bis zu einem Wert von etwa 0,10 Mol. Dementsprechend tritt eine Veränderung der Reaktionskinetik auf, wenn das Verhältnis von dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorids zu dem Natriumhydroxyd variiert wird, wobei bei dieser Änderung eine konstante Konzentration an dem Chlorid des Diäthylaminoäthylchlorides und des vernetzten Dextrans aufrechterhalten wird.

Beispiel 5

Herstellung von menschlichem Interferon in Zellen, die auf den erfindungsgemässen Mikroträgern gezüchtet werden

Anhand dieses Beispieles wird die Fähigkeit von auf Mikroträgern gezüchteten Zellen zur Bildung von menschlichem Interferon beschrieben. Die Zellen, die zur Herstellung des menschlichen Interferon verwendet wurden, waren normale diploide menschliche Vorhaut-Fibroblasten der Bezeichnung FS-4. Diese Fibroblasten wurden auf Mikroträgerkulturen gezüchtet, indem man die in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsverfahren anwandte. Es wurden dabei Mikroträger verwendet, die in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt und titriert wurden, wobei eine Mikroträgerkonzentration von 5 g an trockenem, vernetztem Dextran pro Liter Nährmedium verwendet wurde. Das Nährmedium, das zur Durchführung der Zellzüchtung angewandt wurde, war das Medium Dulbecco Modified Eagle-Medium (abgekürzt DMEM), wobei dieses Medium unter Verwendung von 10% Kälberfötenserum ergänzt wurde.

Nach 8 bis 10 Tagen hörten die Kulturen zu wachsen auf. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Züchtungsmedium entfernt. Die Kulturen wurden dann 1- bis 4mal mit 100 ml an serumfreiem DMEM gewaschen. Die Zellen waren dann bereit für die Interferon-Induktion. Diese wurde erreicht, indem man zu den Kulturen 50 ml an serumfreiem DMEM-Medium zugab, die 50 jig pro Milliliter an Cyclohexamid sowie unterschiedliche Mengen an Poly I Poly C-Induktor enthielten. Nach 4 Stunden setzte man den Kulturen Actinomycin D zu, bis eine Endkonzentration von 1 |xg pro Milliliter erreicht war.

5 Stunden nach dem Beginnen der Induktion wurde das zur Induktion verwendete Medium dekantiert und die Kulturen wurden 3- bis 4mal mit je 100 ml an warmem serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Die Kulturen wurden mit 50 ml an DMEM-Medium, das 0,5% an menschlichem Plasmaprotein enthielt, wieder aufgefüllt. Dann wurden die Kulturen weitere 18 Stunden lang unter Standardbedingungen bebrütet. Zu diesem Zeitpunkt wurde das flüssige Material von den Kulturen abdekantiert, und dieses abdekantierte Medium wurde auf seine Interferon-Aktivität getestet. Die Interferon-Aktivität wurde getestet, indem man den 50%-Spiegel der Zellschützung bei den Proben und bei Standardlösungen bestimmte, wobei die Zellschützung anhand von FS-4-Fibro-blasten vorgenommen wurde, welche mit dem Virus der Bläschenentzündung der Mundschleimhaut, also dem Vesicular Stomatitis Virus, Indiana Stamm, herausgefordert worden waren. Für den Vesicular Stomatitis Virus wird in der Folge die Abkürzung VSV verwendet. Die Ergebnisse der Ansätze zur Herstellung von Interferon sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle

Konzentration des Induktors in (ig/ml

Zellkonzentration während der Herstellung in Zellen/ml

Interferon in Einheiten pro 106 Zellen

4

2,0 X106

39

5

2,6X10«

378

25

2,6 X106

886

50

2,0X10®

-5000

Diese Ergebnisse stammen alle von getrennten Versuchen, und sie sollen nicht irgendeinen Zusammenhang mit der Konzentration des Induktors zeigen.

Beispiel 6

Herstellung von Zellen auf den erfindungsgemässen Mikroträgern zum Zwecke der Herstellung von Viren Die Fähigkeit der auf Mikroträgern gezüchteten Zellen zur Herstellung eines Virus wird anhand des vorliegenden Beispiels erläutert. Primäre und sekundäre Kükenembryo-Fibroblasten werden in Mikroträgerkulturen nach der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise gezüchtet, wobei die Mikroträgerkonzentration bei der Züchtung der primären Zellen 10 g pro Liter war und bei der Züchtung der sekundären Zellen 5 g pro Liter betrug. Um die Bildung des Virus in Gang zu bringen, wurde das Wachstumsmedium entfernt und die Kulturen wurden 2mal mit 100 ml an serumfreiem DMEM-Medium gewaschen. Die Infektion der Zellen mit dem Sindbis-Virus fand in 50 ml DMEM-Medium, das mit 1% Kälberserum, 2% Tryp-tose-Phosphat-Brühe und dem Sindbis-Virus ergänzt war, statt. Die in dem DMEM-Medium anwesende Menge an Sindbis-Virus war ausreichend, um eine Multiplizität der Infektion, die als MOI abgekürzt wird, von 0,05 zu entsprechen.

Der Virus wurde 24 Stunden nach der Infektion gewonnen, bzw. geerntet, indem man die Zuchtbrühe sammelte, sie durch schwaches Zentrifugieren klärte und das darüberstehende Material einfror. Die Bildung des Virus wurde anhand der Fleckenbildung (Plaque-Bildung) in einem Feld von sekundären Küken-Fibroblasten getestet. Die Resultate bei der Infektion dieser Mikroträgerkulturen waren die folgenden:

Tabelle

Zellenart

Gesamtkonzentration für die Virusbildung in Zellen pro ml

(PFU/ml)

PFU/Zelle

Sekundäre

4,0X10«

8,4 xlO9

2100

Primäre

1,4X10«

2,3 X IO10

16 000

Primäre

6,0X10«

2,6 X1010

5 000

Die Virusbildung wurde auch für die folgenden Kombinationen von Virus und Zellen auf Mikroträger untersucht: Poliovi-rus/WI-38; Moloney MuLV/Cl-1 Maus; VSV/Kükenembryo-Fibroblasten.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wurde zu Vergleichszwecken das Wachstum der Zellen in zylindrischen Flaschen und unter Verwendung der erfindungsgemässen Mikroträger untersucht und zwar zum Zwecke der Herstellung der proviralen DNA (Desoxyribonukleinsäure) des Murin-Leukämie-Virus.

Es wurde die revers-übertragene DNA (reverse-transcribed DNA) des Moloney-Leukämie-Virus (M-MuLV) nach einer Infektion von JLS-V9-Zellen untersucht. Bei den verwendeten JLS-V9-Zellen handelt es sich um eine Zellart, die vom Knochenmark der Maus abgeleitet wurde.

Ein Arbeitsverfahren, das angewandt wurde, bestand darin, dass man die Zellen in zylindrischen Flaschen züchtete. Es wurden dazu Zellen in zylindrischen Flaschen gezüchtet, das

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Zuchtmedium wurde entfernt und es wurde der Virusimpfstoff in die Flaschen eingebracht. Bald später wurde den Kulturen frisches Medium zugesetzt und 8 bis 16 Stunden später wurde extrahiert um eine eventuelle Reinigung der vom Virus stam-nenden Desoxyribonukleinsäure (virale DNA) vorzunehmen. Die Kulturen wurden mit frischem Puffer gewaschen und die Zellen wurden mit einer Lösung zerstört, die das Waschmittel Natriumdodecylsulfat enthielt. Anschliessend wurde das Zel-■enlysat gekühlt und man gab Salz bis zur Erreichung von einer 1-molaren Lösung zu, was dazu führte, dass das Detergens gemeinsam mit der DNA, hohen Molekulargewichtes, ausfiel. Die DNA mit niedrigem Molekulargewicht blieben in dem darüberstehenden Material zurück und konnten dann vom Protein befreit werden (Deproteinisierung) und zur Durchführung weiterer Analysen konzentriert werden.

Die Zellkultur aus 50 zylindrischen Flaschen enthielt etwa 109 Zellen; diese Zellen wurden mit etwa 1 Liter eines Virus-Impfstoffes, der einen Titer von 3 X106 fleckenbildenden Einheiten pro ml aufwies, infiziert. Dies führte dazu, dass eine nominelle Multiplizität der Infektion von 1 bis 3 erreicht wurde, und die infizierten Zellen lieferten 5-20 Nanogramm der virusspezifischen DNA.

Es wurde ein einfacheres Arbeitsverfahren entwickelt,

indem man die erfindungsgemässen, verbesserten Mikroträger anwandte. Eine Kultur, die 10 g an entsprechenden Mikroträ-ger-Perlen in einem Liter Wachstumsmedium enthielt, wurde verwendet. Sobald das Zusammenfliessen erreicht war, wurden die 109 Zellen auf den Mikroträger-Perlen infiziert, indem man die Perlen sich absetzen liess und dann das Medium durch einen Liter Virus-Impfstoff ersetzte. Zur Extraktion wurden die Zellen auf den Perlen mit Pufferlösung gewaschen und dann in den das Natrium-Dodecylsulfat enthaltenden Puffer eingebracht. Nach der gemeinsamen Ausfällung der DNA mit hohem Molekulargewicht und des Detergens wurde der Niederschlag zusammen mit den Perlen abzentrifugiert, und die darüberstehende Lösung zur Durchführung weiterer Analysen extrahiert. Die Ausbeute an der vom Virus stammenden DNA war vergleichbar mit derjenigen, die unter Verwendung von Kulturen in zylindrischen Flaschen erzielt werden konnte. Die Arbeit, die mit dem zuletzt genannten Züchtungsverfahren verbunden war, betrug jedoch nur etwa 5 bis 10% derjenigen, die nötig war, wenn die Züchtung in den zylindrischen Flaschen durchgeführt wurde.

Beispiel 8

Herstellung verbesserter Mikroträger mit Dimethylaminoäthyl-Ladungsgruppen Es wurde ein geeigneter Mikroträger hergestellt, in dem eine andere Austauschergruppe an das Dextran-Grundgerüst gebunden wurde als diejenige, die in Beispiel 1 verwendet wurde. Die Dimethylaminoäthylgruppen mit der Abkürzung DMAE wurden an das Dextran-Grundgerüst nach dem folgenden Arbeitsverfahren gebunden:

1 g an Dextran-Perlen, nämlich dem Produkt Pharmacia G-50, die einen Durchmesser von 50 bis 75 [xm besassen, wurden in trockener Form zu 10 ml destilliertem Wasser gegeben, und man liess die Perlen quellen. Eine wässrige Lösung, die 0,01 Mol an dem Chlorid des Dimethylaminoäthylchlorides (das Produkt stammt von der Sigma Chemical Co.) sowie 0,015 Mol an Natriumhydroxyd enthielt, wurde in einem Volumen von 10 ml hergestellt. Diese wässrige Lösung wurde zu den gequollenen Dextran-Perlen zugegeben, und diese Suspension wurde dann wieder heftig 1 Stunde lang bei 60°C gerührt.

Nach der Umsetzung wurde die Perlenmasse wie in Beispiel 1 titriert. Durch diese Reaktion werden 1,0 Milliäquivalente an Dimethylaminoäthylgruppen an die Dextranmasse gebunden.

Um Mikroträger mit einem grösseren Substitutionsgrad herzustellen, wurde die oben beschriebene Reaktion ausgeführt und die Masse der Perlen wurde gründlich mit Wasser gewaschen. Dann wurde das überschüssige Wasser abfiltriert, und die Perlenmasse gewogen, um die Menge an Wasser zu bestimmen, die von der Perlenmasse zurückgehalten wird. Zu dieser Perlenmasse gab man dann eine geeignete Menge an frischen Reagenzien, d. h. dem Chlorid des Dimethylaminoäthylchlorides und Natronlauge, so dass die endgültige Konzentration an Dimethylaminoäthyl und Natronlauge in diesen nachfolgenden Reaktionsmischungen identisch mit der anfänglich eingesetzten war.

Auf diese Weise konnte eine Reihe von Mikroträgern hergestellt werden, wobei ihre Ladungskapazitäten 1,0 bzw. 2,0 bzw. 2,5 bzw. 3,5 Milliäquivalente an Dimethylaminoäthylgruppen pro Gramm unumgesetztem Dextran betrug. Es wurden Zellen, nämlich die Zellen HEL 299, in Mikroträger-Kulturen gezüchtet, wobei 5 g Mikroträger pro Liter angewandt wurden, und die in dem Verfahren gemäss Beispiel 2 erwähnten Züchtungsbedingungen wurden eingesetzt. Die bei diesem Versuch erzielten Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Tabelle

Ausmass der Substitution

Zell-

Gesamt in Milliäquivalenten pro Gramm ausbreitung wachstum

1,0

—

—

2,0

—

—

2,5

+

+

3,2

+

—

Wie zu erwarten war, ist das Zellwachstum von dem Ausmass der Substitution mit den ladungstragenden Gruppierungen abhängig. Wenn der Substitutionsgrad zu hoch ist, dann tritt kein Zell Wachstum auf, obwohl eine Verankerung der Zellen und eine Ausbreitung der Zellen stattfindet. Bei zu niedrigem Substitutionsgrad ist die Haftung der Zellen an der Oberfläche nicht ausreichend, um eine geeignete Ausbreitung und ein entsprechendes Wachstum zu ermöglichen.

Beispiel 9 Verbesserte Mikroträger, die positiv geladene Phosphoniumgruppen aufweisen Es wurden in diesem Falle verbesserte Mikroträger hergestellt, die als Austauschergruppen keine Amingruppen, sondern Phosphoniumgruppen aufwiesen. Die Herstellung wurde wie folgt durchgeführt:

1 g an trockenen Dextran-Perlen wurde hergestellt und mit Wasser gequollen, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Zu den gequollenen Perlen gab man 5 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Triäthyl-(äthyl-bromid)-phosphonium der Formel

C2H5 C2H5

C2H4Br C2H5

sowie 5 ml einer 3-molaren Lösung von Natriumhydroxyd zu. Das Ausgangsmaterial Triäthyl-(äthyl-bromid)-phosphonium s

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45

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65

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wird in der Folge auch mit TEP abgekürzt. Dieser Brei wurde bei 65°C reagieren gelassen.

Es wurde eine Reihe von Mikroträgern hergestellt, die Ladungskapazitäten von 1,1 bzw. 1,7 bzw. 2,9 Milliäquivalenten pro Gramm besassen. Die Mikroträger mit einer Ladungs- 5 kapazität von 1,1 Milliäquivalenten pro Gramm wurden hergestellt, indem man die oben angegebenen Bedingungen während 4 Minuten aufrechterhielt. Die Mikroträger mit einer Ladungskapazität von 1,7 Milliäquivalenten pro Gramm wurden durch Umsetzung während 1 Stunde erzeugt und die 10 Mikroträger mit einer Ladungskapazität von 2,9 Milliäquivalenten pro Gramm erhielt man, indem man 3mal hintereinander umsetzte, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist.

Es wurde eine Zellkultur unter Verwendung der Mikroträ- is ger in einer Konzentration von 5 g pro Liter für jeden dieser Träger hergestellt, wobei zur Zellzüchtung ein kontinuierlicher Zellentyp der Bezeichnung JLS-V9 verwendet wurde, und das Wachsen dieser Zellen wurde mit der Züchtung derselben auf den verbesserten Diäthylaminoäthyl-substituierten Mikroträ- 20 gern verglichen, die nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.

Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

615 947

Tabelle

Mit Diäthylaminoäthylgruppen substituierte Mikroträger

Milliäquivalente

Zellverankerung Gesamtwachstum pro Gramm und Ausbreitung

0,9

+ +

1,7

3,8

+ ~

MitTriäthyl-äthylphosphoniumgruppen

substituierter Mikroträger

Milliäquivalente

Zellverankerung Gesamtwachstum pro Gramm und Ausbreitung

1,1

+ +

1,7

+ +

2,9

+ -

In der vorangegangenen Beschreibung wurden bestimmte Äquivalente, spezielle Arbeitsverfahren und spezielle Materialien beschrieben. Es sei darauf hingewiesen, dass die erfindungsgemässen verbesserten Mikro träger zwar ganz besonders gut geeignet sind, um verankerungsabhängige Zellen zu züchten. Dennoch können sie natürlich auch für andere Verwendungszwecke, beispielsweise zur Züchtung anderer Zellarten, eingesetzt werden.

B

1 Blatt Zeichnungen

Claims (14)

1. 615 947

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen in einer Mikroträgerkultur, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroträger verwendet, die eine Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen auf sich besitzen, wobei die Anzahl der Gruppen so ausgewählt wird, dass eine Austauschkapazität gewährleistet ist, die in einem solchen Bereich liegt, dass ein gutes Wachstum der Zellen erzielt wird, und wobei die Austauschkapazität im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalen-ten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt, und man die verankerungsabhängigen Zellen in einer Suspension des Mikroträgers züchtet und diese Zellkultur unter solchen Bedingungen belässt, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird.
2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroträger vernetzte Dextran-Perlen enthält.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die positiv geladenen chemischen Gruppen auf den vernetzten Dextran-Perlen tertiäre oder quaternäre Amin-gruppen umfassen.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die positiv geladenen chemischen Gruppen auf den vernetzten Dextran-Perlen Diäthylaminoäthylgruppen umfassen.
5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Austauschkapazität im Bereich von 1,0 bis 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm an trockenem, unbehandeltem Dextran liegt.
6. 6. Verfahren nach Patentanspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroträger einen Durchmesser von 75 um im trockenen Zustand besitzen.
7. 7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die positiv geladenen Mikroträger in einem Medium zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen suspendiert,

   b) die Zellen in die Suspension des Mikroträgers einimpft, wobei sich eine Zellkultur bildet, und c) diese Zellkultur unter solchen Bedingungen belässt, dass ein Zellwachstum hervorgerufen wird.
8. 8. Mikroträger zur Durchführung des Verfahrens zur Züchtung von verankerungsabhängigen Zellen gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich auf den Mikroträ-gern eine solche Menge an positiv geladenen chemischen Gruppen befindet, dass eine Austauschkapazität der Mikroträger gewährleistet ist, die in einem solchen Bereich liegt, dass ein gutes Zellwachstum auftritt, wobei die Austauschkapazität im Bereich von 0,1 bis 4,5 Milliäquivalenten pro Gramm des trockenen, unbehandelten Mikroträgers liegt.
9. 9. Mikroträger nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie vernetzte Dextran-Perlen enthalten.
10. 10. Mikroträger nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Ladungskapazität aufweisen, die im Bereich von 1,0 bis 2,8 Milliäquivalenten pro Gramm an trok-kenem, unbehandeltem, vernetztem Dextran liegt.
11. 11. Mikroträger nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie vernetzte Dextran-Perlen aufweisen, und dass die positiv geladenen Gruppen, die an den Mikroträger gebunden sind, tertiäre oder quaternäre Aminogruppen sind.
12. 12. Mikroträger nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die positiv geladenen Gruppen Diäthylaminoäthylgruppen sind.
13. 13. Mikroträger nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Dextran-Perlen in hydratisiertem Zustand einen Durchmesser im Bereich von 120 bis 200 am besitzen.
14. 14. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1 auf die Gewinnung von Nebenprodukten des Wachstums der verankerungsabhängigen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Suspension der positiv geladenen Mikroträger in sinem Kulturmedium zur Züchtung der verankerungsabhängigen Zellen herstellt,

    b) dieses Kulturmedium mit den verankerungsabhängigen Zellen beimpft, wobei sich eine Zellkultur bildet,

    c) diese Zellkultur unter solchen Bedingungen aufrechterhält, dass die Bildung der Nebenprodukte des Zellenwachstums auftritt, und d) die Nebenprodukte des Zellenwachstums gewinnt.