DE4123660C2

DE4123660C2 -

Info

Publication number: DE4123660C2
Application number: DE19914123660
Authority: DE
Inventors: Jens Dr. Basel Ch Bernhardt
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-07-17
Filing date: 1991-07-17
Publication date: 1993-07-29
Also published as: DE4123660A1

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebene Verwendung an sich bekannter Materialien als Trägermaterialien für die Zellkultur, sowie nach den Ansprüchen 5 bis 14 ein Verfahren zur Immobilisierung von Zellen.

Bei der Kultivierung tierischer und pflanzlicher Zellen in Zellkulturgefäßen aus Kunststoff- oder Glasmaterialien ist generell eine Entdifferenzierung von kultivierten Zellinien in der Zellkultur festzustellen. Dieser Prozeß kann bislang ent weder nur durch eine Änderung der Medienzusammensetzung, zum Beispiel durch Verringerung der Konzentration an fötalem Käl berserum, oder durch den Einsatz von Differenzierungsfaktoren, zum Beispiel durch TGF-β, verzögert werden. Dennoch ist eine Redifferenzierung von hochpassagigen Zellinien, zum Beispiel bei glatten Muskelzellen, welche anhand von Antikörpern, zum Beispiel gegen α-Actin von glatten Muskelzellen, charakteri siert wurden, noch nicht beobachtet worden.

Es gibt demnach in der derzeit praktizierten Zellkultur kein standardisierbares Grundmaterial, welches weitgehend medien unabhängig zur Redifferenzierung von Zellen, wie z. B. glatten Muskelzellen, führt.

Aus der FR 15 24 683 ist die Verwendung regenerierter Cellulo sefolien für Abziehbilder bekannt.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Trägermaterial für die Zellkultur und ein Verfahren für die Immobilisierung von Zel len bereitzustellen, welches die Entdifferenzierung von Zellen in der Kultur verhindert oder zumindest verzögert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß als Trägermaterial für die Zellkultur die an sich bekannte Cellu losefolie vorgeschlagen wird. Bevorzugt ist die Cellulosefolie eine Cellulosehydratfolie oder eine Folie aus regenerierter Cellulose oder eine Folie aus Viskose.

Zur Immobilisierung der Zellen wird der Boden einer Zellkul turschale mit einer Cellulosefolie versehen und die Zellen werden auf der Cellulosefolie aufgebracht.

Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei dem die Einsätze mit dem erfindungsgemäßen Trägermaterial locker umfaltet sind.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Trägermaterialien auf Einsätzen angebracht oder von diesen so geformt, daß sie den Boden herkömmlicher Kulturpetrischalen, beispielsweise von Multiwellplatten, vollständig bedecken. Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien (1) können mit den Einsätzen (2) entweder verschweißt oder verklebt oder auch nur locker umfaltet sein. Die Einsätze können in die Kulturpetrischalen oder die Vertie fungen (3) der Multiwellplatten (4) eingehängt oder gestellt werden (vgl. Fig. 1). Weiterhin bevorzugt werden die erfin dungsgemäßen Trägermaterialien direkt auf dem Boden der Kul turschale angebracht oder mit diesem verbunden, d. h. der Boden der Kulturschale besteht aus dem erfindungsgemäßen Cellulose material.

Bei den erfindungsgemäßen Trägermaterialien handelt es sich um an sich bekannte Cellulosefolien wie Cellulosehydratfolien oder Folien aus regenerierter Cellulose oder Viskose. Derarti ge Cellulosefolien sind beispielsweise von der Firma Serva unter der Bezeichnung Servapo® erhältlich. Erfindungsgemäß können selbstverständlich auch Cellulosefolien anderer Her steller verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien bestehen insbesondere aus Zellstoff, also β-glykosidisch gebundenen Polysacchariden unterschiedlicher Kettenlänge. Aus diesem Zellstoff wird ein Faden gesponnen, der entweder zur Herstellung von Kleidung dienen kann oder zu Folien gepreßt wird. Die Foliendicke be stimmt dabei die Engmaschigkeit des entstehenden Polysaccha ridnetzes. Auf die Differenzierung der Zellen hat weder die Verarbeitungsweise noch die Dicke der Folie einen Einfluß. Es wurden diesbezüglich diverse angebotene Materialien unter sucht. Es ist jedoch insbesondere günstig, Folien zu verwen den, die so engmaschig sind, daß Zellen diese nicht penetrie ren können, wie z. B. Dialyseschläuche aus Cellulosefolie.

Die erfindungsgemäß einsetzbaren Kulturplatten sind in keiner Weise beschränkt. Insbesondere bevorzugt können Petrischalen oder Multiwellplatten verwendet werden, wie sie von den unter schiedlichsten Herstellern angeboten werden. Bei der Verwen dung von Multiwellplatten können bevorzugt die vom Hersteller dieser Multiwellplatten angebotenen, passenden Einsätze ver wendet werden. Diese Einsätze werden überwiegend für die Kul tur von Epithelzellen verwendet. Aus diesen Einsätzen wird die vorhandene Kunststoffolie herausgetrennt und eine Cellulosefo lie um diesen Einsatz geschlagen. Es empfiehlt sich, Cellulo sefolien mit nicht zu großer Porengröße, z. B. Dialyseschläuche aus Cellulosefolie, zu verwenden. Einsätze und Multiwellplat ten sowie Petrischalen bestehen vorzugsweise aus Polystyrol. Die Verwendung von Glas ist ebenfalls möglich.

Die Desinfektion des nun nicht mehr sterilen Materials kann im Labor durch Ethanol, bevorzugt 70-80% (v/v) Ethanol, oder durch Gassterilisation, beispielsweise durch Ethylenoxid, er folgen. Insbesondere im industriellen Maßstab ist die Verwen dung der γ-Strahlensterilisation bevorzugt.

Nach erfolgter Sterilisation werden die Zellsuspensionen auf die Cellulosefolien ausgesät. Dies ist deshalb besonders gün stig, weil die Wachstumsfraktion auf den Cellulosefolien ge ringer ist. Unterhalb der Cellulosefolie würden die Zellen sehr schnell überkonfluent werden, wodurch die Wachstumsbedin gungen durch Änderung der Medienzusammensetzung gestört wür den. Eine Ausbringung der Zellen unterhalb der Cellulosefolie empfiehlt sich nur, wenn diese Interaktion untersucht werden soll.

Die Zellen werden vor dem Ausbringen auf die erfindungsgemäßen Trägermaterialien von herkömmlichen Zellkulturschalen in übli cher Weise, bevorzugt mechanisch oder durch die Verwendung von Enzymen wie Trypsin, abgeerntet. Nach der Entfernung störender Substanzen, wie z. B. des Trypsins, werden die Zellen durch Zentrifugation konzentriert und in einem geeigneten Medium resuspendiert.

Beispielsweise können bei glatten Muskelzellen aus Gefäßen als Medien MEM-Earl oder RPMI 1640 oder NCTC-135 oder deren Mi schungen verwendet werden. Bemerkenswert ist, daß höhere Kon zentrationen an fötalem Kälberserum (bis ca. 25%) zu besseren Adhäsionseigenschaften der Zellen an die Cellulosefolie füh ren, die Redifferenzierung der Zellen jedoch nicht beeinträch tigen. Nach bereits 48 Stunden ist eine geänderte Zellform und Zellanordnung erkennbar. Die Zellen konnten mindestens 10 Tage kultiviert und anschließend immunhistochemisch untersucht wer den.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Cellulosefolien hat wei terhin den Vorteil, daß diese in der Fluoreszenzmikroskopie weniger stören als die herkömmlichen Kunststoffolien; dies ist insbesondere für die Immunhistochemie mit fluoreszierenden Antikörpern von Bedeutung.

BEISPIEL

Nach Aussaat einer hochpassagigen Zellinie glatter Muskelzel len ( bis zur 20. Passage bislang beobachtet ) ergab sich aus nahmslos eine Reexpression von α-Actin der glatten Muskelzel len sowie eine Änderung des Wachstumsverhaltens der Zellen. Die Zahl der Zellteilungen der glatten Muskelzellen war deut lich vermindert. Ihre Form begann sich derjenigen von Primär isolaten anzunähern. Die Zellen beginnen gleichfalls Myosin zu bilden, das im allgemeinen nur bei Primärzellen anzutreffen ist. Gleichzeitig sind bei Untersuchungen mit muskeldilatati ven Pharmaka typische, in Blutgefäßen anzutreffende Reaktionen zu beobachten. Eine Redifferenzierung erscheint damit zwei felsfrei.

Kontrollen auf Einsätzen mit Kunststoffolien, wie sie derzeit im Handel erhältlich sind, waren ausnahmslos negativ bei der Untersuchung der Reexpression von α-Actin glatter Muskelzel len. Gleiches gilt für die Anwendung dieses Zelltypus auf nor malen Kunststoff- oder Glasmaterialien.

Als Negativkontrolle wurden humane Hautfibroblasten auf den erfindungsgemäßen Folien eingesetzt. Diese Zellen bildeten kein muskelspezifisches Alpha-actin. Die Negativkontrolle zeigte somit das gewünschte Ergebnis. Aus dieser Negativkon trolle ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Trägermateria lien auch zur Unterscheidung von Zellinien unbekannter Her kunft, in diesem Falle zwischen Hautfibroblasten und glatten Muskelzellen, die einander morphologisch sehr ähnlich sind, dienen können.

Claims

1. Verwendung von Cellulosefolien als Trägermaterial für die Zellkultur.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulosefolie eine Cellulosehydratfolie oder eine Folie aus regenerierter Cellulose oder eine Folien aus Viskose ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Celluosefolie ein Dialyseschlauch ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Dialyseschlauch eine Porengröße aufweist, die von den Zellen nicht penetrierbar ist.

5. Verfahren zur Immobilisierung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden einer Zellkulturschale mit einer Cellulose folie versehen ist und die Zellen auf der Cellulosefolie aufgebracht werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellkulturschale eine Petrischale oder eine Mul tiwellplatte verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulosefolie auf Einsätzen aufgebracht ist, die in die Zellkulturschale eingehängt oder gestellt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulosefolie mit den Einsätzen verklebt oder verschweißt ist oder die Einsätze von der Cellulosefolie locker umfaltet sind.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulosefolie mit dem Boden der Zellkulturschale verbunden ist.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Cellulosefolie tierische, menschliche oder pflanzliche Zellen aufgebracht werden.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulosefolie durch Ethanol, Glassterilisation oder γ-Strahlensterilisation sterilisiert wird.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulosefolie eine Cellulosehydratfolie oder eine Folie aus regenerierter Cellulose oder eine Folie aus Viskose ist.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Cellulosefolie ein Dialyseschlauch ist.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Dialyseschlauch eine Porengröße aufweist, die von den Zellen nicht penetrierbar ist.