DE4123660A1 - Neue traegermaterialien fuer die zellkultur - Google Patents
Neue traegermaterialien fuer die zellkulturInfo
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- C12N5/0068—General culture methods using substrates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
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Description
Die Erfindung betrifft neue Trägermaterialien für die Zellkul
tur.
Bei der Kultivierung tierischer und pflanzlicher Zellen in
Zellkulturgefäßen aus Kunststoff- oder Glasmaterialien ist
generell eine Entdifferenzierung von kultivierten Zellinien in
der Zellkultur festzustellen. Dieser Prozeß kann bislang ent
weder nur durch eine Änderung der Medienzusammensetzung, zum
Beispiel durch Verringerung der Konzentration an fötalem Käl
berserum, oder durch den Einsatz von Differenzierungsfaktoren,
zum Beispiel durch TGF-β, verzögert werden. Dennoch ist eine
Redifferenzierung von hochpassagigen Zellinien, zum Beispiel
bei glatten Muskelzellen, welche anhand von Antikörpern, zum
Beispiel gegen α-Actin von glatten Muskelzellen, charakteri
siert wurden, noch nicht beobachtet worden.
Es gibt demnach in der derzeit praktizierten Zellkultur kein
standardisierbares Grundmaterial, welches weitgehend medien
unabhängig zur Redifferenzierung von Zellen, wie z. B. glatten
Muskelzellen, führt.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Trägermaterial für die
Zellkultur bereitzustellen, welches die Entdifferenzierung von
Zellen in der Kultur verhindert oder zumindest verzögert.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das
Trägermaterial für die Zellkultur eine Cellulosefolie ist.
Bevorzugt ist die Cellulosefolie eine Cellulosehydratfolie
oder eine Folie aus regenerierter Cellulose oder eine Folie
aus Viskose.
Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, bei dem
die Einsätze mit dem erfindungsgemäßen Trägermaterial locker
umfaltet sind.
Bevorzugt werden diese neuen, erfindungsgemäßen Trägermateria
lien auf Einsätzen angebracht oder von diesen so geformt, daß
sie den Boden herkömmlicher Kulturpetrischalen, beispielsweise
von Multiwellplatten, vollständig bedecken. Die erfindungsge
mäßen Trägermaterialien (1) können mit den Einsätzen (2) ent
weder verschweißt oder verklebt oder auch nur locker umfaltet
sein. Die Einsätze können in die Kulturpetrischalen oder die
Vertiefungen (3) der Multiwellplatten (4) eingehängt oder ge
stellt werden (vgl. Fig. 1). Weiterhin bevorzugt werden die
erfindungsgemäßen Trägermaterialien direkt auf dem Boden der
Kulturschale angebracht oder mit diesem verbunden, d. h. der
Boden der Kulturschale besteht aus dem erfindungsgemäßen Cel
lulosematerial.
Bei den erfindungsgemäßen Trägermaterialien handelt es sich um
Cellulosefolien wie Cellulosehydratfolien oder Folien aus re
generierter Cellulose oder Viskose. Derartige Cellulosefolien
sind beispielsweise von der Firma Serva unter der Bezeichnung
Servapor® erhältlich. Erfindungsgemäß können selbstverständ
lich auch Cellulosefolien anderer Hersteller verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Trägermaterialien bestehen insbesondere
aus Zellstoff, also β-glykosidisch gebundenen Polysacchariden
unterschiedlicher Kettenlänge. Aus diesem Zellstoff wird ein
Faden gesponnen, der entweder zur Herstellung von Kleidung
dienen kann oder zu Folien gepreßt wird. Die Foliendicke be
stimmt dabei die Engmaschigkeit des entstehenden Polysaccha
ridnetzes. Auf die Differenzierung der Zellen hat weder die
Verarbeitungsweise noch die Dicke der Folie einen Einfluß. Es
wurden diesbezüglich diverse angebotene Materialien unter
sucht. Es ist jedoch insbesondere günstig, Folien zu verwen
den, die so engmaschig sind, daß Zellen diese nicht penetrie
ren können, wie z. B. Dialyseschläuche aus Cellulosefolie.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Kulturplatten sind in keiner
Weise beschränkt. Insbesondere bevorzugt können Petrischalen
oder Multiwellplatten verwendet werden, wie sie von den unter
schiedlichsten Herstellern angeboten werden. Bei der Verwen
dung von Multiwellplatten können bevorzugt die vom Hersteller
dieser Multiwellplatten angebotenen, passenden Einsätze ver
wendet werden. Diese Einsätze werden überwiegend für die Kul
tur von Epithelzellen verwendet. Aus diesen Einsätzen wird die
vorhandene Kunststoffolie herausgetrennt und eine Cellulosefo
lie um diesen Einsatz geschlagen. Es empfiehlt sich, Cellulo
sefolien mit nicht zu großer Porengröße, z. B. Dialyseschläuche
aus Cellulosefolie, zu verwenden. Einsätze und Multiwellplat
ten sowie Petrischalen bestehen vorzugsweise aus Polystyrol.
Die Verwendung von Glas ist ebenfalls möglich.
Die Desinfektion des nun nicht mehr sterilen Materials kann im
Labor durch Ethanol, bevorzugt 70-80% (v/v) Ethanol, oder
durch Gassterilisation, beispielsweise durch Ethylenoxid, er
folgen. Insbesondere im industriellen Maßstab ist die Verwen
dung der y-Strahlensterilisation bevorzugt.
Nach erfolgter Sterilisation werden die Zellsuspensionen auf
die Cellulosefolien ausgesät. Dies ist deshalb besonders gün
stig, weil die Wachstumsfraktion auf den Cellulosefolien ge
ringer ist. Unterhalb der Cellulosefolie würden die Zellen
sehr schnell überkonfluent werden, wodurch die Wachstumsbedin
gungen durch Änderung der Medienzusammensetzung gestört wür
den. Eine Ausbringung der Zellen unterhalb der Cellulosefolie
empfiehlt sich nur, wenn diese Interaktion untersucht werden
soll.
Die Zellen werden vor dem Ausbringen auf die erfindungsgemäßen
Trägermaterialien von herkömmlichen Zellkulturschalen in übli
cher Weise, bevorzugt mechanisch oder durch die Verwendung von
Enzymen wie Trypsin, abgeerntet. Nach der Entfernung störender
Substanzen, wie z. B. des Trypsins, werden die Zellen durch
Zentrifugation konzentriert und in einem geeigneten Medium
resuspendiert.
Beispielsweise können bei glatten Muskelzellen aus Gefäßen als
Medien MEM-Earl oder RPMI 1640 oder NCTC-135 oder deren Mi
schungen verwendet werden. Bemerkenswert ist, daß höhere Kon
zentrationen an fötalem Kälberserum (bis ca. 25%) zu besseren
Adhäsionseigenschaften der Zellen an die Cellulosefolie füh
ren, die Redifferenzierung der Zellen jedoch nicht beeinträch
tigen. Nach bereits 48 Stunden ist eine geänderte Zellform und
Zellanordnung erkennbar. Die Zellen konnten mindestens 10 Tage
kultiviert und anschließend immunhistochemisch untersucht wer
den.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Cellulosefolien hat wei
terhin den Vorteil, daß diese in der Fluoreszenzmikroskopie
weniger stören als die herkömmlichen Kunststoffolien; dies ist
insbesondere für die Immunhistochemie mit fluoreszierenden
Antikörpern von Bedeutung.
Nach Aussaat einer hochpassagigen Zellinie glatter Muskelzel
len ( bis zur 20. Passage bislang beobachtet ) ergab sich aus
nahmslos eine Reexpression von α-Actin der glatten Muskelzel
len sowie eine Änderung des Wachstumsverhaltens der Zellen.
Die Zahl der Zellteilungen der glatten Muskelzellen war deut
lich vermindert. Ihre Form begann sich derjenigen von Primär
isolaten anzunähern. Die Zellen beginnen gleichfalls Myosin zu
bilden, das im allgemeinen nur bei Primärzellen anzutreffen
ist. Gleichzeitig sind bei Untersuchungen mit muskeldilatati
ven Pharmaka typische, in Blutgefäßen anzutreffende Reaktionen
zu beobachten. Eine Redifferenzierung erscheint damit zwei
felsfrei.
Kontrollen auf Einsätzen mit Kunststoffolien, wie sie derzeit
im Handel erhältlich sind, waren ausnahmslos negativ bei der
Untersuchung der Reexpression von α-Actin glatter Muskelzel
len. Gleiches gilt für die Anwendung dieses Zelltypus auf nor
malen Kunststoff- oder Glasmaterialien.
Als Negativkontrolle wurden humane Hautfibroblasten auf den
erfindungsgemäßen Folien eingesetzt. Diese Zellen bildeten
kein muskelspezifisches Alpha-actin. Die Negativkontrolle
zeigte somit das gewünschte Ergebnis. Aus dieser Negativkon
trolle ergibt sich, daß die erfindungsgemäßen Trägermateria
lien auch zur Unterscheidung von Zellinien unbekannter Her
kunft, in diesem Falle zwischen Hautfibroblasten und glatten
Muskelzellen, die einander morphologisch sehr ähnlich sind,
dienen können.
Claims (12)
1. Trägermaterial für die Zellkultur,
dadurch gekennzeichnet,
daß es eine Cellulosefolie ist.
2. Trägermaterial nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Cellulosefolie eine Cellulosehydratfolie oder
eine Folie aus regenerierter Cellulose oder eine Folie
aus Viskose ist.
3. Trägermaterial nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Cellulosefolie ein Dialyseschlauch ist.
4. Trägermaterial nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Dialyseschlauch eine Porengröße aufweist, die von
den Zellen nicht penetrierbar ist.
5. Verfahren zur Kultivierung von Zellen,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Boden einer Zellkulturschale mit einer Cellulose
folie nach einem der Ansprüche 1 bis 4 versehen ist und
die Zellen auf der Cellulosefolie aufgebracht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Zellkulturschale eine Petrischale oder eine Mul
tiwellplatte verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Cellulosefolie auf Einsätzen aufgebracht ist, die
in die Zellkulturschale eingehängt oder gestellt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Cellulosefolie mit den Einsätzen verklebt oder
verschweißt ist oder die Einsätze von der Cellulosefolie
locker umfaltet sind.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Cellulosefolie mit dem Boden der Zellkulturschale
verbunden ist.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß auf der Cellulosefolie tierische, menschliche oder
pflanzliche Zellen aufgebracht werden.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Cellulosefolie durch Ethanol, Gassterilisation
oder y-Strahlensterilisation sterilisiert wird.
12. Verwendung von Cellulosefolien als Trägermaterial für die
Zellkultur.
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DE19914123660 DE4123660A1 (de) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | Neue traegermaterialien fuer die zellkultur |
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Publications (2)
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