EP1664727A1 - Vorrichtung und verfahren zur automatisierten durchführung v on laborarbeitsschritten - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur automatisierten durchführung v on laborarbeitsschritten

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Publication number
EP1664727A1
EP1664727A1 EP04787010A EP04787010A EP1664727A1 EP 1664727 A1 EP1664727 A1 EP 1664727A1 EP 04787010 A EP04787010 A EP 04787010A EP 04787010 A EP04787010 A EP 04787010A EP 1664727 A1 EP1664727 A1 EP 1664727A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
station
unit
tissue samples
sample
media
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04787010A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter RÖHNERT
Frank Striggow
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KeyNeurotek AG
Original Assignee
KeyNeurotek AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by KeyNeurotek AG filed Critical KeyNeurotek AG
Publication of EP1664727A1 publication Critical patent/EP1664727A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/028—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having reaction cells in the form of microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00326—Analysers with modular structure
    • G—PHYSICS
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    • G01N35/04—Details of the conveyor system
    • G01N2035/0401—Sample carriers, cuvettes or reaction vessels
    • G01N2035/0418—Plate elements with several rows of samples
    • G01N2035/0422—Plate elements with several rows of samples carried on a linear conveyor
    • G—PHYSICS
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    • G01N2035/046—General conveyor features
    • G01N2035/0467—Switching points ("aiguillages")
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0099—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor comprising robots or similar manipulators

Definitions

  • the present invention relates to a device for the automated implementation of laboratory work steps on line or tissue samples, which has a plurality of modular stations, each carrying out at least one work step in a total sequence of work steps, and at least one conveyor unit for conveying sample containers to and between the stations ,
  • WO 02/49761 proposes an automated laboratory system, in particular for carrying out the PCR method.
  • the device comprises a plurality of modular stations, each of which carries out at least one work step in a total sequence of work steps, and a modular station which passes material to another station without human intervention.
  • DE 198 53 184 A1 discloses a device for conveying a carrier element, in particular a titer plate, which has a plurality of sample wells to and between storage and / or processing stations, with a linear and in particular linearly connecting a loading and / or storage unit with at least one processing station Conveyor unit for transporting the carrier element, the processing station being equipped in a modular manner with at least one functional unit designed to carry out an automatable processing function on the carrier element or its test troughs, and for transferring a carrier element between the conveyor unit and functional unit, the processing station has a pivoting device which has at least one turntable or rotating arm , which is designed such that, in response to an electronic control signal, a support element held by the pivoting device by a predetermined angle by a rotation pivoted and can be transferred from the swivel device to an adjacent unit by moving.
  • the known laboratory automation devices are less suitable for handling line or tissue samples, since the cultivation and processing of line and tissue samples requires special conditions over a longer period of time. It is therefore an object of the present invention to provide a device for the automated execution of laboratory work steps on cell or tissue samples, with which these samples can also be cultivated over a longer period of time.
  • a device for the automated execution of laboratory work steps on line or tissue samples which has a plurality of modular stations, each carrying out at least one work step in a total sequence of work steps, and at least one conveyor unit for conveying samples to and between the stations and is characterized in that it has at least one station for automatically changing liquid media in the sample containers (media changing station).
  • the laboratory work steps can be part of complex and highly complex test procedures.
  • the device according to the invention has several modular stations, which can be known automatic pipetting, dosing or analysis machines, such as are described for example in WO 02/49761 or DE 198 53 184.
  • the conveyor unit disclosed in DE 198 53 184 is suitable as a conveyor unit for conveying sample containers to and between the stations.
  • the device according to the invention preferably comprises a
  • Sample injection station at least one incubator station, one
  • the cell or tissue samples for example juvenile cell tissue samples, in particular juvenile brain tissue samples (for example as hippocampus tissue sections), but also heart or liver tissue samples, such as cardiac atrial sections, are introduced into the device according to the invention in the sample introduction station.
  • Sample containers in the form of plates with one or more recesses, which can contain membrane inserts, the plates each having a cover plate.
  • Corresponding sample containers are commercially available, for example, as so-called 6-hole plates (also multi-dishes) and are used as tissue culture plates. These plates consist of a base plate and a removable cover. The base plate contains six wells. A membrane insert can be inserted into each recess.
  • the bottom of which is designed as a membrane, for example in the form of a glass frit.
  • the membrane inserts are loaded with tissue samples, especially manually.
  • the tissue samples can be hippocampal sections from juvenile rats or heart or liver sections. Both animal and human tissue samples can be used.
  • the device according to the invention provides a sample container at the sample introduction station on request by the operator, the recesses of which are already filled with a desired medium in a suitable amount.
  • the sample container preferably contains water, in particular bidistilled water, between the wells in order to set a desired atmospheric humidity in the container.
  • the tissue sections are then placed in the membrane inserts, and the sample container is then automatically transferred to the conveyor unit of the device.
  • the device according to the invention had already taken an empty sample container from a storage container, for example, and filled the wells with the desired medium in a suitable amount and, if desired, the space between the wells with water in the media changing station.
  • the multishell can then be equilibrated in an incubator station, in particular an oxygen incubator station, before being made available at the sample introduction station. This happens automatically for a predetermined period of time.
  • the device can take over the empty sample container at the sample introduction station instead of from a storage container.
  • the sample container which is preferably designed as a multishell, is then conveyed by the conveyor unit, for example, to an incubation station and stored there under controlled conditions (for example temperature and gas composition).
  • the device according to the invention comprises at least two different incubator stations, an oxygen incubator station and a nitrogen incubator station.
  • the climatic conditions in the oxygen incubator can be, for example, 95% air and 5% CO 2 at 36 ° C, the climatic conditions in the nitrogen incubator 95% N 2 and 5% CO 2 at 36 ° C.
  • the media used for storing the samples must be changed regularly.
  • the sample containers are conveyed from the conveyor unit to the media changing station.
  • the media changing station can have a unit for removing a liquid medium from the wells of the plate of a sample container and a unit for adding one or more liquid media into the wells of the plate of the sample container. Since the sample containers can be provided with a cover plate, the media changing station can also comprise a unit for removing and fitting such a cover plate.
  • the media change station can therefore additionally be equipped with a unit for removing and inserting the membrane inserts from the recesses in the plate of a sample container.
  • the media changing station has a unit for mixing liquid media in the recesses of a plate of a sample container.
  • the media change station therefore preferably works as follows:
  • a sample container preferably a multi-tray, is transferred from the conveyor unit of the device according to the invention to the media changing station.
  • the media change station automatically recognizes whether the sample container has a cover plate. If the sample container has a cover plate, this is removed by the unit for removing the cover plate. This can be done, for example, by a robot gripper that can be used with a pair of pliers to grip the cover plate or, for example equipped with a suction device for suctioning the cover plate by means of vacuum.
  • the membrane inserts are then automatically removed from the recesses in the plate of the sample container.
  • This can be done, for example, by robot grippers that can grip one or more of the membrane inserts simultaneously or one after the other and can remove them from the recesses.
  • the robot gripper can have a link that engages in the membrane inserts and spreads gripping elements apart there.
  • the unit for removing the membrane inserts preferably has as many grippers as the sample containers used have membrane inserts so that the unit can grip and remove all membrane inserts of a sample container at the same time.
  • the unit for removing and inserting the membrane inserts should advantageously be able to selectively remove only one of the several membrane inserts from a sample container, so that, for example, samples identified as unusable can be sorted out during the experiment. This also enables samples from different origins, for example, to be mixed (pooled) in a sample container during an ongoing experiment.
  • the media changing station also has a unit for the intermediate storage of membrane inserts under controlled conditions.
  • This can be, for example, a multi-dish which contains suitable nutrient medium in the wells at a desired temperature.
  • the unit for removing the membrane inserts can then insert the membrane inserts, which are removed from the sample container that has been transferred to the media changing station, into the recesses of the multi-dish, so that the tissue samples only have to remain separated from a nutrient medium for a short time.
  • the device according to the invention can furthermore have a unit for removing liquid medium from membrane inserts.
  • a unit for removing liquid medium from membrane inserts can be, for example, a filter paper, a fabric or a sponge on which the membrane inserts are set down and dried before being inserted into or after being removed from the unit for temporarily storing the membrane inserts.
  • the membrane inserts After the membrane inserts have been removed from the plate of a sample container, the latter is conveyed in the media changing station to a unit for removing the liquid medium from the recesses of the plate of the sample container. This can be done, for example, using an automatic robot gripper or an assembly line. Alternatively, in the case of a stationary sample container, the unit for removing the membrane inserts can be exchanged for the unit for removing the liquid medium.
  • the liquid medium can be removed from the wells of the plate, for example, by automatically tipping the liquid medium out of the wells or by suctioning off the liquid medium. It has proven to be advantageous if the plate is inclined, for example, by approximately 45 ° to remove the liquid medium, and the medium is then suctioned off. As a result, the medium can be removed from the depressions largely without residue.
  • the suction can take place, for example, by means of one or more pipes which automatically sink into the recesses from above and suck off the medium by means of a pump.
  • the unit for removing the liquid medium preferably has as many tubes for suction as the sample container used has depressions so that the medium can be sucked out of all the depressions of the sample container used at the same time. It may also be desirable for the liquid medium removal unit to have several different suction tubes for each well of the sample container, which can optionally be used for suction, so that different media can be collected separately from one another, for example in different collecting containers.
  • the medium changing station can have several units for removing the liquid medium, which are automatically selected depending on the liquid medium that is to be removed from the sample container in order to collect different liquid media in different collecting containers separately from one another.
  • the unit for adding one or more liquid media into the wells of the sample container is conveyed further to a unit for adding one or more liquid media into the wells of the sample container.
  • a unit for adding one or more liquid media can be done either by automatically conveying the sample container, for example by a robot gripper, or by means of an assembly line.
  • the unit for removing the liquid medium can be exchanged for the unit for adding one or more liquid media.
  • the unit for adding one or more liquid media can be, for example, a pipetting unit with which a predetermined amount of one or more liquid media is introduced from one or more storage containers into a recess in the sample container.
  • the unit can have one or more corresponding pipetting devices in order to be able to fill several different liquid media into the wells without a pipetting unit coming into contact with different media.
  • the addition can take place simultaneously or in succession.
  • the unit can also have as many pipetting units or combinations of pipetting units as the sample containers used have depressions in order to be able to fill all the depressions of a sample container at the same time. Alternatively, the unit can have fewer pipetting units or combinations of pipetting units than the sample container has depressions. In this case, the wells of a sample container are filled one after the other.
  • the media changing station of the device according to the invention additionally has a unit for mixing the liquid media in the recesses of the sample container.
  • This can be, for example, stirrers which engage in the depressions from above and mix the introduced liquid media by stirring.
  • it can preferably be a vibrating table on which the sample containers are automatically placed. The various liquid media in the wells of the sample container are then mixed by shaking the container.
  • the unit for inserting the membrane inserts After adding the liquid medium or the liquid media into the wells of the sample container, the unit for inserting the membrane inserts reinserts them into the wells of the sample container. If necessary, the membrane inserts are removed from the intermediate storage unit for this purpose and, if desired, cleaned from the membrane inserts by the liquid medium removal unit.
  • the device according to the invention inserts the membrane inserts in such a way that no air bubbles form between the surface of the filled liquid medium and the underside of the membrane insert, since these form the Exchange of substances between the medium and, for example, the tissue sections on the surface of the membrane could hinder.
  • the cover plate After inserting the membrane inserts into the wells of the sample container, the cover plate is possibly replaced and the multiplate is returned from the media change station to the conveyor unit, which automatically conveys the sample container to the next modular station, for example an incubator station.
  • the cell or tissue samples can, for example, be exposed to disease-simulating conditions in order to then examine the effects of these conditions on the samples and / or the influence of test substances on the samples under these conditions.
  • a nutrient medium is exchanged for another medium that does not contain the nutrients required by the tissue, in order to simulate a nutrient deficiency.
  • the samples can also be incubated in a nitrogen incubator, for example, instead of in an oxygen incubator, in order to simulate an oxygen deficiency.
  • one or more test substances can be added to the liquid media in the wells of the sample containers.
  • the station for adding reagents is preferably coupled to the media changing station in order to avoid unnecessary work steps.
  • the desired substance can then be introduced in a suitable quantity into the wells of the sample container, for example by means of an automatic pipette.
  • the substances added can, for example, also be specific substances for inducing or simulating different disease-related events (for example lipopolysaccharides (LPS) and / or specific cytokines for inducing inflammatory events).
  • LPS lipopolysaccharides
  • cytokines for inducing inflammatory events.
  • molecular biological tools e.g. small interference RNA (siRNA) or antisense sequences
  • molecular biological constructs e.g. viral vectors
  • a substance which supports the recording of measurement data of the cell tissue samples can optionally be added from the station for adding reagents to the wells of the sample containers.
  • a substance can be, for example, propidium iodide (PI), which is suitable for staining nucleic acids.
  • PI propidium iodide
  • Appropriately stained samples can then be examined in the data acquisition station using fluorescence microscopy.
  • markers / readouts for example, specific apoptosis markers, proliferation markers, cellular differentiation markers and fluorescence-labeled antibodies are suitable for the visualization of distinct proteins.
  • the device according to the invention preferably also includes a data acquisition station in which, for example, a microscope unit (e.g. a confocal, non-confocal or Infrared microscopy unit) relevant data of the samples can be recorded at the beginning, during or at the end of the overall sequence of work steps.
  • a microscope unit e.g. a confocal, non-confocal or Infrared microscopy unit
  • relevant data of the samples can be recorded at the beginning, during or at the end of the overall sequence of work steps.
  • transmission images and / or fluorescence images of corresponding tissue sections can be taken under the microscope and / or after staining with PI.
  • a comparison of the different recordings before, during and after the corresponding treatment steps then enables the operator to determine whether and, if appropriate, to what extent the test substances used and / or changes in the incubation conditions have effects on the tissue cultures.
  • the transmission microscope unit can take transmission pictures fully automatically. For this purpose, a picture of the complete membrane insert is first made and the position of the individual tissue sections in a membrane insert is automatically recognized by suitable software. The individual tissue sections are then individually enlarged to record the transmission images. The same can be done for the acquisition of the fluorescence images.
  • Suitable data acquisition stations can be selected by the person skilled in the art depending on the experiment carried out and the markers used.
  • the sample containers are preferably conveyed by the conveyor unit to a sample ejection station and collected there, for example, in order to later be able to be either disposed of or recycled.
  • the device according to the invention can also have several, for example two, sample ejection stations for sample containers, for example with different liquid media, if these media are to be collected and disposed of separately from one another.
  • the device according to the invention has a combination of the following stations: a sample introduction station in which cell tissue samples are introduced manually into membrane dishes which are located in depressions of a multi-dish, the depressions containing a nutrient medium for the cell tissue samples, an oxygen incubator station in which the Cell tissue samples are cultured, a media change station in which the nutrient medium in the multi-dishes is changed after predetermined time intervals, a reagent addition station in which one or more test substances, the effects of which on the cell tissue samples are to be tested and / or, if appropriate, one or more substances which increase the uptake Support of measurement data of the cell tissue samples, into which wells of the multi-dishes are added, optionally a nitrogen incubator station, in which the cell tissue samples are additionally incubated as needed in the course of the experiment t, a data acquisition station in which measurement data of the cell tissue samples are recorded, for example before and after addition of a test substance and / or cultivation in the nitrogen incubator, in order to determine their influence
  • the device according to the invention has the advantage that, for example, tissue sections can be cultivated fully automatically and the effects of test substances and disease-simulating conditions on these tissue sections can be examined.
  • the device according to the invention thus enables functional, tissue-based screening, in particular on the basis of disease-related effects. This overcomes a bottleneck between the very fast HTS processes, which deliver a large number of possible drug candidates, and the comparatively slow and, in particular, costly in vivo tests.
  • the present invention thus also relates to the use of the device according to the invention for carrying out investigations of chemical, biological and / or physical influences on physiological or pathophysiological processes on samples such as cell tissue samples.
  • the device can be used to test the effect of substances on samples, preferably on cell tissue samples. Corresponding uses are described, for example, with reference to vital mammary heart tissue cells kept ex vivo in DE 103 22 986.8 from KeyNeurotek AG.
  • a method for testing the effect of substances on samples preferably on cell tissue samples, which comprises introducing samples into a device according to the invention and evaluating measurement data recorded in the data acquisition station.
  • This method has the particular advantage that only the samples have to be prepared manually and the measurement data have to be evaluated manually.
  • the laborious, time-consuming and cost-intensive intermediate steps, even of the most complex test sequences, are carried out fully automatically by the device according to the invention. A large number of different samples and test substances can therefore be examined simultaneously.
  • Another advantage of the device according to the invention is its modular structure, which makes it possible, depending on the course of the desired experiment, to exchange individual modular stations for others, or the device, for example to increase capacity with additional incubators or e.g. can also be provided with an additional media change station.
  • the device according to the invention is not subject to any capacity limits, since its capacity can be increased at any time by adding further modular stations.
  • FIG. 1 shows schematically a top view of a possible embodiment of the device according to the invention.
  • Figure 2 shows the perspective view of another possible embodiment of the device according to the invention.
  • FIG. 1 and 2 show a sample injection station 1, two oxygen incubation stations 2 and 2 ", a nitrogen incubator station 3, a media change station 4, a data acquisition station 5, a sample container supply station 6 and (only in FIG. 1) two sample discharge stations 7 and 7 'and a conveyor unit 8 for conveying the sample containers to and between the stations.
  • the use of the device according to the invention for screening possible active substances against cerebral ischemia is described by way of example below.
  • Normal brain functions depend largely on the constant supply of glucose and oxygen.
  • An interruption in cerebrospinal blood flow due to a stroke, brief heart failure or as a side effect of cardiac surgery quickly leads to ischemic conditions in the brain and then neuronal cell death.
  • hippocampal sections can first be cultivated according to known protocols and then exposed to ischemic conditions through oxygen and glucose deprivation. Damage to neuronal cells from these conditions can then e.g. can be visualized by the intracellular fluorescence of added propidium iodide (Pl), which is only incorporated into damaged cells.
  • Pl propidium iodide
  • a possible positive effect of substances to be tested on the ability of neuronal cells to survive ischemic conditions is determined in a comparative experiment under the same conditions with simultaneous addition of the test substance to the sewing medium.
  • the laboratory work steps required for this can be carried out by the device according to the invention as follows, for example.
  • First, empty multishells with membrane inserts inserted into the depressions are introduced into the device via the sample introduction station 1.
  • the conveyor unit 8 conveys the multishells to the media changing station 4, in which bidistilled water between the wells and glucose medium is filled into all the wells of the multishells.
  • the multishells are conveyed by the conveyor unit 8 into an oxygen incubator 2 or 2 ', where they remain between 20 minutes and 24 hours for equilibration.
  • the multishells are then conveyed from the oxygen incubator 2 or 2 'to the sample introduction station 1.
  • the membrane inserts of the multi-shells are loaded by the operator with hippocampal sections that were previously prepared manually.
  • the conveyor unit 8 then conveys the loaded multi-dishes back into an oxygen incubator 2 or 2 '.
  • the multishells are preferably marked, for example with a barcode, which can then be read at any time by the conveyor unit and also by the various stations of the device according to the invention and compared with the database.
  • the hippocampal sections are cultivated in an oxygen incubator 2 or 2 'for a period between six hours and 13 days or longer. During this dwell time, cyclic media changes are carried out (e.g. changing the glucose medium). For this purpose, the multi-dishes are conveyed to the media changing station 4 at intervals of 60 to 72 hours and back into the incubator after the media has been changed. Cultures are cultivated until the operator requests them for inspection, usually after six to 13 days.
  • the samples are pre-checked.
  • a multishell is conveyed from an oxygen incubator 2 or 2 'to the data acquisition station 5. There, transmission images of the complete membrane inserts and the individual sections of a membrane insert are made in a microscope unit. The multishell is then conveyed back into an oxygen incubator 2 or 2 '.
  • the individual tissue sections are then evaluated on the basis of the transmission recordings and an experiment specific is assigned to each individual membrane insert of the multishells and communicated to the device according to the invention, for example, via a computer terminal.
  • the membrane inserts of the multi-dishes are either removed if they have been identified as unsuitable, or they are put together again in multi-dishes, such membrane inserts which are to be subjected to the same cultivation conditions being combined in one multi-dish.
  • This "pooling" can take place, for example, in the media changing station by means of the unit for removing and inserting membrane inserts from multi-shells and the intermediate storage of multi-shells in the unit for the intermediate storage of membrane inserts under controlled conditions.
  • the database of the device is updated accordingly, so that the individual samples in the multishells can be clearly assigned even after the membrane inserts have been pooled.
  • each membrane insert is assigned, for example, one of three possible conditions via the experiment specifics:
  • OTD oxygen and glucose deprivation
  • the individual conditions can be further specified, e.g. by specifying the type and amount of the test substance to be used, the duration of the OGD, etc.
  • the multishells with membrane inserts which are intended for condition 2 or condition 3, are conveyed from the conveyor unit 8 to the media changing station 4. There, the glucose medium is exchanged for a glucose / test substance medium, and the multishells are then conveyed back into an oxygen incubator 2 or 2 '.
  • empty multishells without membrane inserts are also introduced into the device either via the sample container supply station 6 or via the sample introduction station 1 and conveyed from the conveyor unit 8 to the media changing station 4.
  • Exactly the number of new multi-shells is introduced which corresponds to the number of multi-shells which contain membrane inserts for the upcoming experiment, which are assigned to condition 1 or condition 2.
  • a system-internal complementary assignment of the new multi-shells takes place, with exactly one newly introduced multi-shell being uniquely assigned to one multi-shell, which is for the upcoming one Experiment contains membrane inserts that are intended for condition 1 or condition 2.
  • double-distilled water is filled between the wells of the newly introduced multi-dishes.
  • a mannitol medium is placed in those wells of the newly introduced multishells in which there are membrane inserts on the complementary multishell intended for condition 1, and a mannitol / test substance medium in those wells of the newly introduced multishells in which there are complementary multi-shell membrane inserts, which are intended for condition 2, filled.
  • the newly introduced multishells are then conveyed by the conveyor unit 8 into a nitrogen incubator 3, where they are equilibrated between 20 minutes and 24 hours.
  • those multishells containing the membrane inserts with the tissue sections intended for condition 1 or condition 2 and the respective complementary multishells with the mannitol medium are conveyed from the conveyor unit 8 to the media change station 4.
  • the membrane inserts, which are intended for condition 1 or condition 2 are converted from the multishells with the glucose medium into the complementary multishells with the mannitol medium.
  • the multishells with the mannitol medium are conveyed to the OGD in the nitrogen incubator 3 and the multishells with the glucose medium in an oxygen incubator 2 or 2 '.
  • the multishells with the mannitol medium remain in the nitrogen incubator 3, for example, for five to 90 minutes or longer, depending on the experiment specificity.
  • the membrane inserts, which are intended for condition 1 or condition 2 are converted from the multishells with the mannitol medium into the complementary wells of the complementary multishells with the glucose medium, and the multishells with the glucose medium are transferred from the delivery unit 8 into an oxygen incubator 2 or 2 'promoted.
  • the empty multi-dishes with the mannitol medium are discharged via the sample ejection station 7 or 7 '.
  • Multishells with membrane inserts which are intended for condition 2 or condition 3 are conveyed from conveyor unit 8 to incubator station 4 approximately one hour after OGD and in those wells of the multishell which contain membrane inserts for condition 2 or condition 3, a media change with glucose medium is carried out.
  • the multi-dishes are then conveyed into an oxygen incubator 2 or 2 'by incubating for a period of between two and 72 hours.
  • the multishell is conveyed from the conveying unit 8 from an oxygen incubator 2 or 2 'to the media changing station 4 approximately two hours before the data acquisition, and propidium iodide (PI) is added to the wells of the multishell in a predetermined concentration.
  • PI propidium iodide
  • the multi-dishes are returned to an oxygen incubator 2 or 2 'and remain there for about two hours.
  • Pl can again be added in the media changing station 4 in the same or a different concentration to the recesses of the multishell.
  • the multishells are then conveyed to the data acquisition station and automatically transferred to the microscope unit there. There, transmission and fluorescence images of the complete membrane insert and the individual sections of a membrane insert are made under the microscope.
  • the multishells are then taken over from the data acquisition station 5 by the conveyor unit 8 and, depending on the medium, are discharged via a sample ejection station 7 or 7 '.
  • the experiment can be evaluated manually by the operator using the transmission and fluorescence images.
  • the present invention is not limited to the above embodiment.
  • the device can be supplemented with additional stations or individual stations can be exchanged for others in order to adapt them to a corresponding test sequence.
  • the device according to the invention enables a large number of test substances to be tested sequentially or in parallel with little manual effort for their effect on a tissue sample under normal conditions or under disease-simulating conditions in vitro.
  • the preclinical development of pharmaceuticals or the preclinical development of potential pharmaceuticals is significantly accelerated, so that they can be carried out more cost-effectively for a large number of substances.
  • constant test conditions are ensured by the automated work steps, so that the measurement data obtained are highly reproducible and meaningful.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von Laborarbeitsschritten an Zell­- oder Gewebeproben, die eine Mehrzahl von modularen Stationen, die jeweils mindestens einen Arbeitsschritt in einer Gesamtfolge von Arbeitsschritten ausführen, und mindestens eine Trägereinheit zum Fördern von Probenbehälter zu und zwischen den Stationen aufweist, wobei die Vorrichtung mindestens eine Station zum automatischen Wechseln von flüssigen Medien in den Probenbehältern aufweist.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur automatisierten Durchführung von Laborarbeitsschritten
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von Laborarbeitsschritten an Zeil- oder Gewebeproben, die eine Mehrzahl von modularen Stationen, die jeweils mindestens einen Arbeitsschritt in einer Gesamtfolge von Arbeitsschritten ausführen, und mindestens eine Fördereinheit zum Fördern von Probenbehältern zu und zwischen den Stationen aufweist.
Die Entwicklung neuer Arzneimittelwirkstoffe ist extrem zeit- und kostenaufwendig. Innerhalb des herkömmlichen Wirkstoffentwicklungsprozesses beinhalten insbesondere die Identifizierung und Validierung therapeutischer Angriffspunkte (Targets), das Auffinden potentieller Wirkstoffe sowie die präklinische Phase Schritte, die zu optimieren sind, um Zeit, Kosten und das Risiko von Produktausfällen in späteren Entwicklungsphasen zu verringern. Die Engpässe in der präklinischen Phase sind in jüngerer Zeit durch Fortschritte beim sogenannten "High-throughput screening" (HTS), der kombinatorischen Chemie, der Computer-gestützten Biochemie und der virtuellen Pharmakologie, die eine große Zahl möglicher Kandidaten für einen neuen Wirkstoff liefern, verschärft worden. Da die große Zahl möglicher Wirkstoffkandidaten praktisch nicht mehr oder nur mit unzumutbarem Aufwand in Tierversuchen weiterevaluiert werden kann, gewinnt die Vorauswahl aussichtsreicher Wirkstoffkandidaten durch in vitro-Untersuchungen an Zellen oder Zellgewebeproben zunehmend an Bedeutung. Die in vitro-Vorevaluierung hilft, ungeeignete Wirkstoffkandidaten bereits vor dem in vivo-Screening auszusortieren oder besonders geeignete Targets und Wirkstoffkandidaten schneller zu erkennen.
Auch wenn entsprechende in vitro-Verfahren für das Wirkstoffscreening im Vergleich zu in vivo-Verfahren relativ zeit- und kostengünstig sind, verbleibt das Problem, daß Zellgewebeproben aufwendig und über einen längeren Zeitraum kultiviert werden müssen, so daß aufgrund der großen Anzahl simultan zu bearbeitender Proben, die jeweils einer langen Abfolge komplexer, chemischer oder analytischer Bearbeitungsschritte unterworfen werden müssen, das Bedürfnis nach einer Automatisierung der Laborarbeitsschritte besteht.
Die WO 02/49761 schlägt ein automatisiertes Laborsystem insbesondere zur Durchführung des PCR-Verfahrens vor. Die Vorrichtung umfaßt eine Mehrzahl von modularen Stationen, die jeweils mindestens einen Arbeitsschritt in einer Gesamtfolge von Arbeitsschritten ausführen, und eine modulare Station, die ohne menschliches Zutun Material an eine andere Station weitergibt.
Die DE 198 53 184 A1 offenbart eine Vorrichtung zum Fördern eines eine Mehrzahl von Probenmulden aufweisenden Trägerelements, insbesondere Titerplatte, zu und zwischen Lager- und/oder Bearbeitungsstationen, mit einem eine Aufgabe- und/oder Lagereinheit mit mindestens einer Bearbeitungsstation verbindenden, insbesondere linear wirkenden Fördereinheit zum Transportieren des Trägerelements, wobei die Bearbeitungsstation modulartig mit mindestens einer zum Ausführen einer automatisierbaren Bearbeitungsfunktion auf das Trägerelement bzw. dessen Probemulden ausgebildeten Funktionseinheit bestückbar eingerichtet ist und zum Übergeben eines Trägerelements zwischen Fördereinheit und Funktionseinheit die Bearbeitungsstation eine mindestens einen Drehteller oder Dreharm aufweisende Schwenkeinrichtung aufweist, die so ausgebildet ist, daß als Reaktion auf ein elektronisches Steuersignal ein von der Schwenkeinrichtung gehaltenes Trägerelement um einen vorbestimmten Winkel um eine Drehachse verschwenkt und von der Schwenkeinrichtung zu einem benachbarten Aggregat durch Verschieben übertragen werden kann. Als Funktionseinheiten schlägt dieses Dokument einen Inkubator, einen Dispenser, einen Pipettor und eine Leseeinheit für eine am Trägerelement vorgesehene, bevorzugt optisch ablesbare Kennzeichnung vor.
Für eine Handhabung von Zeil- oder Gewebeproben sind die bekannten Laborautomatisierungsvorrichtungen weniger geeignet, da die Kultivierung und Bearbeitung von Zeil- und Gewebeproben über einen längeren Zeitraum besondere Bedingungen erfordert. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, eine Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von Laborarbeitsschritten an Zeil- oder Gewebeproben zur Verfügung zu stellen, mit der diese Proben auch über einen längeren Zeitraum kultiviert werden können.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von Laborarbeitsschritten an Zeil- oder Gewebeproben gelöst, die eine Mehrzahl von modularen Stationen, die jeweils mindestens einen Arbeitsschritt in einer Gesamtfolge von Arbeitsschritten ausführen, und mindestens eine Fördereinheit zum Fördern von Proben zu und zwischen den Stationen aufweist und dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens eine Station zum automatischen Wechseln von flüssigen Medien in den Probenbehältern (Medienwechselstation) aufweist.
Die Laborarbeitsschritte können Teil komplexer und hochkomplexer Versuchsabläufe sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist mehrere modulare Stationen auf, bei denen es sich um bekannte Pipettier-, Dosier- oder Analyseautomaten handeln kann, wie sie beispielsweise in der WO 02/49761 oder dem DE 198 53 184 beschrieben sind. Als Fördereinheit zum Fördern von Probenbehältern zu und zwischen den Stationen eignet sich beispielsweise die in DE 198 53 184 offenbarte Fördereinheit.
Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung eine
Probeneinschleusungsstation, mindestens eine Inkubatorstation, eine
Medienwechselstation, eine Datenerfassungsstation und eine
Probenausschleusungsstation.
In der Probeneinschleusungsstation werden die Zeil- oder Gewebeproben, beispielsweise juvenile Zellegewebeproben, insbesondere juvenile Hirngewebeproben (z.B. als Hippocampus-Gewebeschnitte), aber auch Herz- oder Lebergewebeproben, wie kardiale Vorhofschnitte, in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingebracht. Hierfür eignen sich Probenbehälter in Form von Platten mit einer oder mehreren Vertiefungen, die Membraneinsätze enthalten können, wobei die Platten jeweils eine Deckelplatte aufweisen können. Entsprechende Probenbehälter sind beispielsweise als sogenannte 6-Lochplatten (auch Multischale) im Handel erhältlich und werden als Gewebekulturplatten verwendet. Diese Platten bestehen aus einer Grundplatte und einem abnehmbaren Deckel. Die Grundplatte enthält sechs Vertiefungen (Wells). In jede Vertiefung kann ein Membraneinsatz eingelegt werden. Hierbei handelt es sich um Schalen, deren Boden als Membran, z.B. in Form einer Glasfritte ausgebildet ist. An der Probeneinschleusungsstation werden die Membraneinsätze mit Gewebeproben bestückt, insbesondere manuell. Beispielsweise kann es sich bei den Gewebeproben um Hippocampus-Schnitte juveniler Ratten oder um Herz- oder Leberschnitte handeln. Es können sowohl tierische als auch humane Gewebeproben eingesetzt werden.
Üblicherweise stellt die erfindungsgemäße Vorrichtung an der Probeneinschleusungsstation auf Anforderung durch den Bediener einen Probenbehälter zur Verfügung, dessen Vertiefungen bereits mit einem gewünschten Medium in einer geeigneten Menge befüllt sind. Vorzugsweise enthält der Probenbehälter zwischen den Vertiefungen Wasser, insbesondere bidestilliertes Wasser, um in dem Behälter eine gewünschte Luftfeuchtigkeit einzustellen. An der Probeneinschleusungsstation werden dann die Gewebeschnitte in die Membraneinsätze gegeben, und anschließend wird der Probenbehälter automatisch an die Fördereinheit der Vorrichtung übergeben.
Zuvor hat die erfindungsgemäße Vorrichtung bereits beispielsweise einem Vorratsbehälter einen leeren Probenbehälter entnommen und in der Medienwechselstation dessen Vertiefungen mit dem gewünschten Medium in geeigneter Menge sowie, wenn gewünscht, den Raum zwischen den Vertiefungen mit Wasser befüllt. Die Multischale kann dann noch vor dem Zurverfügungstellen an der Probeneinschleusungsstation in einer Inkubatorstation, insbesondere einer Sauerstoffinkubatorstation, äquilibriert werden. Dies geschieht automatisch für einen vorbestimmten Zeitraum. Alternativ kann die Vorrichtung den leeren Probenbehälter an der Probeneinschleusungsstation statt aus einem Vorratsbehälter übernehmen.
Der vorzugsweise als Multischale ausgebildete Probenbehälter wird dann von der Fördereinheit beispielsweise zu einer Inkubationsstation gefördert und in dieser unter kontrollierten Bedingungen (beispielsweise Temperatur und Gaszusammensetzung) gelagert. In einer möglichen Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens zwei verschiedene Inkubatorstationen, eine Sauerstoffinkubatorstation und eine Stickstoffinkubatorstation. Die klimatischen Verhältnisse in dem Sauerstoffinkubator können beispielsweise 95% Luft und 5% CO2 bei 36°C betragen, die klimatischen Verhältnisse in dem Stickstoffinkubator 95% N2 und 5% CO2 bei 36°C.
Zur erfolgreichen Kultivierung von Zeil- und Gewebeproben müssen die für die Lagerung der Proben eingesetzten Medien, insbesondere Nährmedien, regelmäßig gewechselt werden. Hierfür werden die Probenbehälter von der Fördereinheit zu der Medienwechselstation gefördert. Die Medienwechselstation kann eine Einheit zum Entfernen eines flüssigen Mediums aus den Vertiefungen der Platte eines Probenbehälters und eine Einheit zum Zugeben eines oder mehrerer flüssiger Medien in die Vertiefungen der Platte des Probenbehälters aufweisen. Da die Probenbehälter mit einer Deckelplatte versehen sein können, kann die Medienwechselstation darüber hinaus eine Einheit zum Abnehmen und Aufsetzen einer solchen Deckelplatte umfassen.
Insbesondere bei der Verwendung von Multischalen mit Membraneinsätzen als Probenbehälter ergibt sich darüber hinaus das Problem, daß sich das flüssige Medium unterhalb des Membraneinsatzes in den Vertiefungen der Multischale befindet. Um das Entfernen des flüssigen Mediums aus den Vertiefungen der Multischale zu erleichtern, kann die Medienwechselstation daher zusätzlich mit einer Einheit zum Herausnehmen und Einsetzen der Membraneinsätze aus den Vertiefungen der Platte eines Probenbehälters ausgerüstet sein.
Insbesondere wenn mehrere verschiedene flüssige Medien in eine Vertiefung der Platte des Probenbehälters zugegeben werden, hat es sich darüber hinaus als vorteilhaft erwiesen, wenn die Medienwechselstation über eine Einheit zum Mischen flüssiger Medien in Vertiefungen einer Platte eines Probenbehälters verfügt.
Vorzugsweise arbeitet die Medienwechselstation daher wie folgt:
Von der Fördereinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird ein Probenbehälter, vorzugsweise eine Multischale, an die Medienwechselstation übergeben. Die Medienwechselstation erkennt automatisch, ob der übergebene Probenbehälter eine Deckelplatte aufweist. Falls der Probenbehälter eine Deckelplatte aufweist, wird diese von der Einheit zum Abnehmen der Deckelplatte abgenommen. Dies kann beispielsweise durch einen Robotergreifer, der mit einer Zange zum Greifen der Deckelplatte oder beispielsweise mit einer Ansaugvorrichtung zum Ansaugen der Deckelplatte mittels Vakuum ausgerüstet ist, geschehen.
Anschließend werden die Membraneinsätze, sofern vorhanden, aus den Vertiefungen der Platte des Probenbehälters automatisch herausgenommen. Dies kann beispielsweise durch Robotergreifer geschehen, die eine oder mehrere der Membraneinsätze gleichzeitig oder nacheinander greifen und aus den Vertiefungen herausnehmen können. Beispielsweise kann der Robotergreifer ein Glied aufweisen, das in die Membraneinsätze hereingreift und dort Greifelemente auseinanderspreitzt. Vorzugsweise verfügt die Einheit zum Herausnehmen der Membraneinsätze über so viele Greifer, wie die eingesetzten Probenbehälter Membraneinsätze aufweisen, damit die Einheit alle Membraneinsätze eines Probenbehälters gleichzeitig ergreifen und herausnehmen kann.
Vorteilhaft sollte die Einheit zum Herausnehmen und Einsetzen der Membraneinsätze in der Lage sein, gezielt nur einzelne der mehrere Membraneinsätze aus einem Probenbehälter herauszunehmen, so daß während des Experiments beispielsweise als unbrauchbar erkannte Proben aussortiert werden können. Außerdem ermöglicht dies, daß während eines laufenden Experiments Proben beispielsweise verschiedener Herkunft in einem Probenbehälter gemischt (gepoolt) werden können.
Da die Membraneinsätze äußerst empfindliche Gewebeproben enthalten können, hat es sich darüber hinaus als vorteilhaft erwiesen, wenn die Medienwechselstation ferner eine Einheit zur Zwischenlagerung von Membraneinsätzen unter kontrollierten Bedingungen aufweist. Hierbei kann es sich beispielsweise um eine Multischale handeln, die geeignetes Nährmedium bei einer gewünschten Temperatur in den Vertiefungen enthält. Die Einheit zum Herausnehmen der Membraneinsätze kann dann die Membraneinsätze, die aus dem Probenbehälter entnommen werden, der an die Medienwechselstation übergeben wurde, in die Vertiefungen der Multischale einsetzen, so daß die Gewebeproben nur kurze Zeit von einem Nährmedium getrennt verweilen müssen.
Um ein Verschleppen von Medien aus einem Probenbehälter in die Einheit zur Zwischenlagerung von Membraneinsätzen oder aus dieser Einheit in einen anderen Probenbehälter zu vermeiden, kann die erfindungsgemäße Vorrichtung ferner eine Einheit zum Entfernen flüssigen Mediums von Membraneinsätzen aufweisen. Hierbei kann es sich beispielsweise um ein Filterpapier, eine Stoffbahn oder einen Schwamm handeln, auf die die Membraneinsätze vor dem Einsetzen in bzw. nach dem Herausnehmen aus der Einheit zur Zwischenlagerung der Membraneinsätze abgesetzt und getrocknet werden.
Nach dem Entfernen der Membraneinsätze aus der Platte eines Probenbehälters wird dieser in der Medienwechselstation an eine Einheit zum Entfernen des flüssigen Mediums aus den Vertiefungen der Platte des Probenbehälters gefördert. Dies kann beispielsweise durch einen automatischen Robotergreifer oder ein Fließband erfolgen. Alternativ kann bei stationärem Probenbehälter die Einheit zum Herausnehmen der Membraneinsätze gegen die Einheit zum Entfernen des flüssigen Mediums ausgewechselt werden. Das Entfernen des flüssigen Mediums aus den Vertiefungen der Platte kann beispielsweise durch ein automatisches Auskippen des flüssigen Mediums aus den Vertiefungen oder durch Absaugen des flüssigen Mediums erfolgen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Platte zum Entfernen des flüssigen Mediums beispielsweise um ca. 45° geneigt und das Medium dann abgesaugt wird. Hierdurch kann das Medium weitgehend rückstandfrei aus den Vertiefungen entfernt werden.
Das Absaugen kann beispielsweise mittels eines oder mehrerer Rohre erfolgen, die sich automatisch von oben in die Vertiefungen senken und das Medium mittels einer Pumpe absaugen. Vorzugsweise weist die Einheit zum Entfernen des flüssigen Mediums so viele Rohre zum Absaugen auf, wie der verwendete Probenbehälter Vertiefungen hat, damit das Medium aus allen Vertiefungen des verwendeten Probenbehälters gleichzeitig abgesaugt werden kann. Ferner kann es wünschenswert sein, daß die Einheit zum Entfernen des flüssigen Mediums über mehrere verschiedene Absaugrohre für jede Vertiefung des Probenbehälters verfügt, die wahlweise zum Absaugen eingesetzt werden können, damit unterschiedliche Medien beispielsweise in unterschiedlichen Sammelbehältern getrennt voneinander aufgefangen werden können. Alternativ kann die Mediumwechselstation über mehrere Einheiten zum Entfernen des flüssigen Mediums verfügen, die in Abhängigkeit von dem flüssigen Medium, das aus dem Probenbehälter entfernt werden soll, automatisch ausgewählt werden, um verschiedene flüssige Medien in verschiedenen Sammelbehältern getrennt voneinander aufzufangen.
Nach dem Entfernen des flüssigen Mediums aus den Vertiefungen des Probenbehälters wird dieser zu einer Einheit zum Zugeben eines oder mehrerer flüssiger Medien in die Vertiefungen des Probenbehälters weitergefördert. Dies kann entweder dadurch geschehen, daß der Probenbehälter beispielsweise durch eine Robotergreifer oder mittels eines Fließbands automatisch weiterbefördert wird. Alternativ kann bei stationärem Probenbehälter die Einheit zum Entfernen des flüssigen Mediums gegen die Einheit zum Zugeben eines oder mehrerer flüssiger Medien ausgewechselt werden.
Bei der Einheit zum Zugeben eines oder mehrerer flüssiger Medien kann es sich beispielsweise um eine Pipettiereinheit handeln, mit der eine vorbestimmte Menge eines oder mehrerer flüssiger Medien aus einem oder mehreren Vorratsbehältern in eine Vertiefung des Probenbehälters eingebracht wird. Die Einheit kann über eine oder mehrere entsprechende Pipettiervorrichtungen verfügen, um mehrere unterschiedliche flüssige Medien in die Vertiefungen einfüllen zu können, ohne daß eine Pipettiereinheit mit unterschiedlichen Medien in Kontakt kommt. Die Zugabe kann gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die Einheit kann darüber hinaus über so viele Pipettiereinheiten bzw. Kombinationen von Pipettiereinheiten verfügen, wie die eingesetzten Probenbehälter Vertiefungen aufweisen, um alle Vertiefungen eines Probenbehälters gleichzeitig befüllen zu können. Alternativ kann die Einheit über weniger Pipettiereinheiten bzw. Kombinationen von Pipettiereinheiten verfügen, als der Probenbehälter über Vertiefungen. In diesem Fall werden die Vertiefungen eines Probenbehälters nacheinander befüllt.
Insbesondere wenn mehrere verschiedene flüssige Medien in eine Vertiefung eines Probenbehälters eingefüllt worden sind, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Medienwechselstation der erfindungsgemäßen Vorrichtung zusätzlich über eine Einheit zum Mischen der flüssigen Medien in den Vertiefungen des Probenbehälters verfügt. Hierbei kann es sich beispielsweise um Rührer handeln, die von oben in die Vertiefungen eingreifen und die eingebrachten flüssigen Medien durch Rühren vermischen. Vorzugsweise kann es sich alternativ um einen Rütteltisch handeln, auf dem die Probenbehälter automatisch abgestellt werden. Die verschiedenen flüssigen Medien in den Vertiefungen des Probenbehälters werden dann durch Rütteln des Behälters vermischt.
Nach Zugabe des flüssigen Mediums bzw. der flüssigen Medien in die Vertiefungen des Probenbehälters werden von der Einheit zum Einsetzen der Membraneinsätze diese wieder in die Vertiefungen des Probenbehälters eingesetzt. Gegebenenfalls werden die Membraneinsätze hierfür aus der Einheit zur Zwischenlagerung herausgenommen, und, falls gewünscht, von der Einheit zum Entfernen flüssigen Mediums von den Membraneinsätzen gereinigt. Beim Einsetzen der Membraneinsätze in die Vertiefungen des Probenbehälters ist es wichtig, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung die Membraneinsätze so einsetzt, daß sich zwischen der Oberfläche des eingefüllten flüssigen Mediums und der Unterseite des Membraneinsatzes keine Luftblasen bilden, da diese den Austausch von Substanzen zwischen dem Medium und beispielsweise den Gewebeschnitten auf der Oberfläche der Membran behindern könnten.
Nach dem Einsetzen der Membraneinsätze in die Vertiefungen des Probenbehälters wird gegebenenfalls die Deckelplatte wieder aufgesetzt und die Multiplatte wird von der Medienwechselstation an die Fördereinheit zurück übergeben, die den Probenbehälter automatisch an die nächste modulare Station, beispielsweise eine Inkubatorstation, weiterfördert.
Im Laufe der Gesamtfolge von Arbeitsschritten können die Zeil- oder Gewebeproben beispielsweise krankheitssimulierenden Bedingungen ausgesetzt werden, um dann die Auswirkungen dieser Bedingungen auf die Proben und/oder den Einfluß von Testsubstanzen auf die Proben unter diesen Bedingungen zu untersuchen. Hierfür kann z.B. in der Medienwechselstation ein Nährmedium gegen ein anderes Medium ausgetauscht werden, das nicht die von dem Gewebe benötigten Nährstoffe enthält, um so einen Nährstoffmangel zu simulieren. Auch können die Proben beispielsweise statt in einem Sauerstoffinkubator in einem Stickstoffinkubator inkubiert werden, um einen Sauerstoffmangel zu simulieren.
Gleichzeitig oder alternativ können in einer Station zum Zugeben von Reagenzien zu den Probenbehältern eine oder mehrere Testsubstanzen, deren Wirkung auf die Zellgewebeproben getestet werden soll, zu den flüssigen Medien in die Vertiefungen der Probenbehälter zugegeben werden. Die Station zum Zugeben von Reagenzien ist vorzugsweise mit der Medienwechselstation gekoppelt, um unnötige Arbeitsschritte zu vermeiden. Gleichzeitig oder unabhängig mit dem Medienwechsel kann dann die gewünschte Substanz in geeigneter Menge mit in die Vertiefungen des Probenbehälters eingegeben werden, beispielsweise mittels einer automatischen Pipette.
Bei den zugegebenen Substanzen kann es sich beispielsweise auch um spezifische Substanzen zur Induktion oder Simulation unterschiedlicher krankheitsrelevanter Ereignisse (z.B. Lipopolysaccharide (LPS) und/oder spezifische Zytokine zur Induktion inflammatorischer Ereignisse) handeln. Außerdem können molekularbiologische Tools (z.B. small interference RNA (siRNA) oder antisense Sequenzen) oder molekularbiologische Konstrukte (z.B. virale Vektoren) zur Manipulation der gewebespezifischen Genexpression mit dem Ziel zugegeben werden, entweder krankheitsrelevante Situationen (z.B. Alzheimer- ähnliche Pathophysiologie) zu induzieren oder Pharmaka-relevante Zielstrukturen (Targets) zu identifizieren bzw. zu validieren.
Alternativ oder zusätzlich zu der Testsubstanz, deren Wirkung auf die Zellgewebeproben getestet werden soll, kann gegebenenfalls auch eine Substanz, die die Aufnahme von Meßdaten der Zellgewebeproben unterstützt, von der Station zum Zugeben von Reagenzien in die Vertiefungen der Probenbehälter zugegeben werden. Bei einer solchen Substanz kann es sich beispielsweise um Propidium-Iodid (Pl) handeln, das zum Anfärben von Nukleinsäuren geeignet ist. Entsprechend angefärbte Proben können dann mittels Fluoreszenzmikroskopie in der Datenerfassungsstation untersucht werden. Als weitere Substanzen zur Unterstützung der Aufnahme von Meßdaten (Marker/readouts) eignen sich beispielsweise spezifische Apoptosemarker, Proliferationsmarker, zelluläre Differenzierungsmarker und fluoreszenzmarkierte Antikörper zur Visualisierung distinkter Proteine.
Um den Einfluß der Inkubationsbedingungen (z.B. Zusammensetzung des flüssigen oder gasförmigen Mediums) und/oder von Testsubstanzen auf die Gewebeproben ermitteln zu können, umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise auch eine Datenerfassungsstation, in der beispielsweise mit Hilfe einer Mikroskopiereinheit (z.B. einer konfokalen, nicht konfokalen oder Infrarot-Mikroskopiereinheit) relevante Daten der Proben zu Beginn, während oder am Ende der Gesamtfolge von Arbeitsschritten erfaßt werden können. Beispielsweise können von entsprechenden Gewebeschnitten unter dem Mikroskop Transmissionsbilder und/oder nach Anfärben mit Pl Fluoreszenzbilder aufgenommen werden. Ein Vergleich der verschiedenen Aufnahmen vor, während und nach entsprechenden Behandlungsschritten ermöglicht dann dem Bediener zu ermitteln, ob und gegebenenfalls in welchem Ausmaß die eingesetzte Testsubstanzen und/oder Änderungen der Inkubationsbedingungen Auswirkungen auf die Gewebekulturen haben.
Die Anfertigung von Transmissionsaufnahmen durch die Mikroskopiereinheit kann vollautomatisch erfolgen. Hierzu wird zunächst eine Aufnahme des kompletten Membraneinsatzes angefertigt und die Lage der einzelnen Gewebeschnitte in einem Membraneinsatz wird durch eine geeignete Software automatisch erkannt. Die einzelnen Gewebeschnitte werden anschließend zur Aufnahme der Transmissionsbilder einzeln vergrößert. Entsprechend kann für die Aufnahme der Fluoreszenzbilder verfahren werden. Als zusätzliche oder alternative Datenerfassungsstation eignen sich beispielsweise auch Geräte für die Durchflußzytometrie (FACS-Analyse), Laser-basierte Mikrodissection, Massenspektrometrie (z.B. MALDI/TOF Analyse), Spektroskopie (z.B. IR-Spektroskopie, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie) und Elektrophysiologie (z.B.
Multielektrodenarrays). Geeignete Datenerfassungsstationen können vom Fachmann in Abhängigkeit von dem durchgeführten Experiment und den eingesetzten Markern gewählt werden.
Nach Abschluß des Experiments werden die Probenbehälter von der Fördereinheit vorzugsweise zu einer Probenausschleusungsstation gefördert und beispielsweise dort gesammelt, um später entweder entsorgt oder recycelt werden zu können. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch mehrere, beispielsweise zwei Probenausschleusungsstationen für Probenbehälter beispielsweise mit unterschiedlichen flüssigen Medien aufweisen, wenn diese Medien getrennt voneinander gesammelt und entsorgt werden sollen.
In einer möglichen Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Kombination folgender Stationen auf: eine Probeneinschleusungsstation, in der Zellgewebeproben manuell in Membranschalen eingebracht werden, die sich in Vertiefungen einer Multischale befinden, wobei die Vertiefungen ein Nährmedium für die Zellgewebeproben enthalten, eine Sauerstoffinkubatorstation, in der die Zellgewebeproben kultiviert werden, eine Medienwechselstation, in der das Nährmedium in den Multischalen nach vorbestimmten Zeitintervallen gewechselt wird, eine Reagenzienzugabestation, in der eine oder mehrere Testsubstanzen, deren Wirkungen auf die Zellgewebeproben getestet werden sollen und/oder gegebenenfalls eine oder mehrere Substanzen, die die Aufnahme von Meßdaten der Zellgewebeproben unterstützen, in die Vertiefungen der Multischalen zugegeben werden, gegebenenfalls eine Stickstoffinkubatorstation, in der die Zellgewebeproben im Laufe des Experiments zusätzlich bedarfsweise inkubiert werden, eine Datenerfassungsstation, in der Meßdaten der Zellgewebeproben beispielsweise vor und nach Zugabe einer Testsubstanz und/oder Kultivierung in dem Stickstoffinkubator erfaßt werden, um deren Einfluß auf die Zellgewebeproben zu bestimmen, eine Probenausschleusungsstation, in der Multischalen nach Abschluß der Untersuchungen aus der Vorrichtung ausgeschleust werden, und eine Fördereinheit zum Fördern der Multischalen von der Probeneinschleusungsstation zu und zwischen den Stationen bis zur Probenausschleusungsstation. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist den Vorteil auf, daß mit ihr vollautomatisch beispielsweise Gewebeschnitte kultiviert und die Einflüsse von Testsubstanzen sowie krankheitssimulierenden Bedingungen auf diese Gewebeschnitte untersucht werden können. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht somit ein funktionelles, gewebebasiertes Screening, insbesondere anhand krankheitsrelevanter Effekte. Hierdurch wird ein Engpaß zwischen den sehr schnellen HTS-Verfahren, die eine Vielzahl möglicher Wirkstoffkandidaten liefern, und den vergleichsweise langsamen und insbesondere kostenintensiven in vivo-Untersuchungen überwunden. Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung von Untersuchungen chemischer, biologischer und/oder physikalischer Einflüsse auf physiologische oder pathophysiologische Prozesse an Proben wie Zellgewebeproben. Insbesondere kann die Vorrichtung Verwendung zum Testen der Wirkung von Substanzen auf Proben, vorzugsweise auf Zellgewebeproben finden. Entsprechende Verwendungen sind beispielsweise anhand ex-vivo gehaltener, vitaler Mammalia-Herzgewebe-Zellen in der DE 103 22 986.8 der KeyNeurotek AG beschrieben.
Außerdem wird ein Verfahren zum Testen der Wirkung von Substanzen auf Proben, vorzugsweise auf Zellgewebeproben, zur Verfügung gestellt, das das Einschleusen von Proben in eine erfindungsgemäße Vorrichtung und das Auswerten von in der Datenerfassungsstation erfaßten Meßdaten umfaßt. Dieses Verfahren hat den besonderen Vorteil, daß nur noch die Proben manuell vorbereitet und die Meßdaten manuell ausgewertet werden müssen. Die arbeits-, zeit- und kostenintensiven Zwischenschritte auch komplexester Versuchsabläufe werden von der erfindungsgemäßen Vorrichtung vollautomatisch durchgeführt. Es kann daher eine große Anzahl verschiedener Proben und Testsubstanzen gleichzeitig untersucht werden.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht in ihrem modularen Aufbau, der es ermöglicht, je nach Ablauf des gewünschten Experiments einzelne modulare Stationen gegen andere auszutauschen oder die Vorrichtung beispielsweise zur Erhöhung der Kapazität mit zusätzlichen Inkubatoren oder z.B. auch mit einer zusätzlichen Medienwechselstation zu versehen. Im Prinzip sind der erfindungsgemäßen Vorrichtung damit keine Kapazitätsgrenzen gesetzt, da deren Kapazität durch Hinzufügung weiterer modularer Stationen jederzeit erhöht werden kann.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand eines konkretes Ausführungsbeispiels näher erläutert, ohne sie jedoch hierauf einzuschränken. Die anliegende Figur 1 zeigt schematisch in Aufsicht eine mögliche Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Figur 2 zeigt die perspektivische Darstellung einer anderen möglichen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Man erkennt in Figuren 1 und 2 eine Probeneinschleusungsstation 1 , zwei Sauerstoffinkubationsstationen 2 und 2", eine Stickstoffinkubatorstation 3, eine Medienwechselstation 4, eine Datenerfassungsstation 5, eine Probenbehältervorratsstation 6 und (nur in Figur 1 ) zwei Probenausschleusungsstationen 7 und 7' sowie eine Fördereinheit 8 zum Fördern der Probenbehälter zu und zwischen den Stationen.
Nachfolgend wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Screenen möglicher Wirkstoffe gegen zerebrale Ischämie beispielhaft beschrieben. Normale Gehirnfunktionen hängen wesentlich von der permanenten Zufuhr von Glukose und Sauerstoff ab. Eine Unterbrechung des zerebrospinalen Blutflusses durch einen Schlaganfall, kurzzeitiges Aussetzen des Herzens oder als eine Nebenwirkung von herzchirurgischen Maßnahmen führt schnell zu ischämischen Bedingungen im Gehirn und anschließend zum Absterben neuronaler Zellen. Zur Ermittlung der Wirkung von Testsubstanzen auf zerebrale Ischämie können Hippocampus-Schnitte zunächst gemäß bekannten Protokollen kultiviert und dann ischämischen Bedingungen durch Sauerstoff- und Glukoseentzug ausgesetzt werden. Schäden an neuronalen Zellen durch diese Bedingungen können dann z.B. durch die intrazellulare Fluoreszenz von zugegebenem Propidium-Iodid (Pl) sichtbar gemacht werden, das nur in geschädigte Zellen inkorporiert wird. Eine mögliche positive Wirkung von zu testenden Substanzen auf die Fähigkeit von neuronalen Zellen, ischämische Bedingungen zu überleben, wird in einem Vergleichsexperiment unter denselben Bedingungen bei gleichzeitiger Zugabe der Testsubstanz zu dem Nähermedium bestimmt.
Die hierfür benötigten Laborarbeitsschritte können von der erfindungsgemäßen Vorrichtung beispielsweise wie folgt ausgeführt werden. Zunächst werden leere Multischalen mit in die Vertiefungen eingesetzten Membraneinsätzen über die Probeneinschleusungsstation 1 in die Vorrichtung einschleust. Die Fördereinheit 8 fördert die Multischalen zu der Medienwechselstation 4, in der bidestilliertes Wasser zwischen die Vertiefungen und Glukosemedium in alle Vertiefungen der Multischalen eingefüllt wird. Anschließend werden die Multischalen von der Fördereinheit 8 in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2' gefördert, wo sie zwischen 20 Minuten und 24 Stunden zum Äquilibrieren verbleiben. Anschließend werden die Multischalen aus dem Sauerstoffinkubator 2 oder 2' zu der Probeneinschleusungsstation 1 gefördert. Dort werden die Membraneinsätze der Multischalen von dem Bediener mit Hippocampus-Schnitten, die zuvor manuell präpariert wurden, bestückt. Die Fördereinheit 8 fördert die bestückten Multischalen dann zurück in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2'.
Damit die Proben jederzeit eindeutig zusortierbar sind, werden die Multischalen vorzugsweise markiert, beispielsweise mit einem Barcode, der dann sowohl von der Fördereinheit als auch von den verschiedenen Stationen der erfindungsgemäßen Vorrichtung jederzeit abgelesen und mit dem Datenbestand verglichen werden kann.
Die Hippocampus-Schnitte werden in einem Sauerstoffinkubator 2 oder 2' für einen Zeitraum zwischen sechs Stunden und 13 Tagen oder länger kultiviert. Während dieser Verweilzeit erfolgt die Durchführung von zyklischen Medienwechseln (z.B. Wechsel des Glukosemediums). Hierzu werden in Intervallen von jeweils 60 bis 72 Stunden die Multischalen zur Medienwechselstation 4 und nach erfolgtem Medienwechsel zurück in den Inkubator gefördert. Die Kulturen werden solange kultiviert, bis sie von dem Bediener zur Kontrolle angefordert werden, üblicherweise nach sechs bis 13 Tagen.
Im nächsten Schritt findet eine Vorkontrolle der Proben statt. Hierzu wird eine Multischale aus einem Sauerstoffinkubator 2 oder 2' zu der Datenerfassungsstation 5 gefördert. Dort werden in einer Mikroskopiereinheit Transmissionsaufnahmen der kompletten Membraneinsätze sowie der einzelnen Schnitte eines Membraneinsatzes angefertigt. Die Multischale wird anschließend in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2' zurückgefördert.
Die einzelnen Gewebeschnitte werden anhand der Transmissionsaufnahmen anschließend evaluiert und jedem einzelnen Membraneinsatz der Multischalen wird ein Experiment- Spezifik zugeordnet und der erfindungsgemäßen Vorrichtung beispielsweise über ein Computerterminal mitgeteilt.
Entsprechend der betroffenen Zuordnung werden die Membraneinsätze der Multischalen entweder ausgeschleust, wenn sie als ungeeignet erkannt wurden, oder in Multischalen neu zusammengestellt, wobei solche Membraneinsätze, die gleichen Kultivierungsbedingungen unterworfen werden sollen, in einer Multischale zusammengefaßt werden. Dieses "Poolen" kann beispielsweise in der Medienwechselstation durch die Einheit zum Herausnehmen und Einsetzen von Membraneinsätzen aus Multischalen sowie das Zwischenlagern von Multischalen in der Einheit zur Zwischenlagerung von Membraneinsätzen unter kontrollierten Bedingungen erfolgen. Gleichzeitig wird der Datenbestand der Vorrichtung entsprechend aktualisiert, damit auch nach dem Poolen der Membraneinsätze die einzelnen Proben in den Multischalen eindeutig zugeordnet werden können.
Zur Durchführung der Experimente wird jedem Membraneinsatz über die Experiment- Spezifik beispielsweise eine von drei möglichen Konditionen zugeordnet:
Kondition 1 OGD ohne Zugabe von Substanz(en), Kondition 2 OGD unter Zugabe von Substanz(en), Kondition 3 Zugabe von Substanz(en) ohne OGD.
"OGD" bedeutet vorliegend, daß die Kulturen ischämischen Bedingungen, d.h. einem Sauerstoff- und Glukoseentzug ("oxygen and glucose deprivation OGD") unterworfen werden.
Die einzelnen Konditionen können weiter spezifiziert werden, z.B. durch Angabe der Art und Menge der einzusetzenden Testsubstanz, Dauer der OGD, etc.
Ca. eine Stunde vor OGD werden die Multischalen mit Membraneinsätzen, welche für die Kondition 2 oder die Kondition 3 bestimmt sind, von der Fördereinheit 8 zu der Medienwechselstation 4 gefördert. Dort wird das Glukosemedium gegen ein Glukose/Testsubstanz-Medium gewechselt, und die Multischalen werden anschließend in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2' zurückgefördert.
Vor OGD werden außerdem leere Multischalen ohne Membraneinsätze in den Vertiefungen entweder über die Probenbehältervorratsstation 6 oder über die Probeneinschleusungsstation 1 in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingeschleust und von der Fördereinheit 8 zu der Medienwechselstation 4 gefördert. Dabei wird genau die Anzahl an neuen Multischalen eingeschleust, die der Anzahl Multischalen entspricht, welche für das bevorstehende Experiment Membraneinsätze enthalten, die der Kondition 1 oder der Kondition 2 zugeordnet sind. Außerdem findet eine systeminterne komplementäre Zuordnung der neuen Multischalen statt, wobei genau eine neu eingeschleuste Multischale jeweils einer Multischale eindeutig zugeordnet wird, welche für das bevorstehende Experiment Membraneinsätze enthält, die für die Kondition 1 oder die Kondition 2 bestimmt sind.
In der Medienwechselstation 4 wird bidestilliertes Wasser zwischen die Vertiefungen der neu eingeschleusten Multischalen gefüllt. Außerdem wird ein Mannitolmedium in diejenigen Vertiefungen der neu eingeschleusten Multischalen, in denen sich auf der komplementären Multischalen Membraneinsätze befinden, welche für die Kondition 1 bestimmt sind, und ein Mannitol/Testsubstanz-Medium in diejenigen Vertiefungen der neu eingeschleusten Multischalen, in denen sich auf der komplementären Multischale Membraneinsätze befinden, welche für die Kondition 2 bestimmt sind, gefüllt. Die neu eingeschleusten Multischalen werden anschließend von der Fördereinheit 8 in einen Stickstoffinkubator 3 gefördert, wo sie zwischen 20 Minuten und 24 Stunden äquilibriert werden.
Ca. ein bis fünf Minuten vor OGD werden diejenigen Multischalen, die die Membraneinsätze mit den Gewebeschnitten enthalten, die für die Kondition 1 oder die Kondition 2 bestimmt sind, sowie die jeweiligen komplementären Multischalen mit dem Mannitolmedium von der Fördereinheit 8 zu der Medienwechselstation 4 gefördert. Dort werden die Membraneinsätze, welche für die Kondition 1 oder die Kondition 2 bestimmt sind, aus den Multischalen mit dem Glukosemedium in die komplementären Multischalen mit dem Mannitolmedium umgesetzt. Die Multischalen mit dem Mannitolmedium werden zur OGD in den Stickstoffinkubator 3 und die Multischalen mit dem Glukosemedium in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2' gefördert.
Zur OGD verweilen die Multischalen mit dem Mannitolmedium je nach Experiment-Spezifik beispielweise fünf bis 90 Minuten oder länger in dem Stickstoffinkubator 3. Unmittelbar nach OGD werden die Multischalen mit Mannitolmedium aus dem Stickstoffinkubator 3 sowie die jeweiligen komplementären Multischalen mit dem Glukosemedium aus einem Sauerstoffinkubator 2 oder 2' zur Medienwechselstation 4 gefördert. Dort werden die Membraneinsätze, welche für die Kondition 1 oder die Kondition 2 bestimmt sind, aus den Multischalen mit dem Mannitolmedium in die komplementären Vertiefungen der komplementären Multischalen mit dem Glukosemedium umgesetzt, und die Multischalen mit dem Glukosemedium werden von der Fördereinheit 8 in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2' gefördert. Die leeren Multischalen mit dem Mannitolmedium werden über die Probenausschleusungsstation 7 oder 7' ausgeschleust. Multischalen mit Membraneinsätzen, welche für die Kondition 2 oder die Kondition 3 bestimmt sind, werden ca. eine Stunde nach OGD von der Fördereinheit 8 zur Inkubatorstation 4 gefördert und in denjenigen Vertiefungen der Multischale, welche Membraneinsätze für die Kondition 2 oder die Kondition 3 enthalten, wird ein Medienwechsel mit Glukosemedium durchgeführt. Die Multischalen werden anschließend in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2' gefördert, indem für einen Zeitraum zwischen zwei und 72 Stunden inkubiert werden.
Falls gemäß der Experiment-Spezifik für einige Multischalen die OGD mehrmalig durchgeführt werden soll, werden die vorstehend beschriebenen Schritte des Experimentzyklus entsprechend wiederholt.
Für die Auswertung des Experiments wird die Multischale ca. zwei Stunden vor der Datenerfassung von der Fördereinheit 8 aus einem Sauerstoffinkubator 2 oder 2' zu der Medienwechselstation 4 gefördert und Propidium-Iodid (Pl) wird in vorgegebener Konzentration zu den Vertiefungen der Multischale zugegeben. Die Multischalen werden in einen Sauerstoffinkubator 2 oder 2' zurückgefördert und verweilen dort für ca. zwei Stunden. Unmittelbar vor der Datenerfassung kann gegebenenfalls in der Medienwechselstation 4 noch einmal Pl in gleicher oder anderer Konzentration zu den Vertiefungen der Multischale zugegeben werden.
Anschließend werden die Multischalen zur Datenerfassungsstation gefördert und dort automatisch der Mikroskopiereinheit übergeben. Dort werden Transmission- und Fluoreszenzaufnahmen der kompletten Membraneinsätze und der einzelnen Schnitte eines Membraneinsatzes unter dem Mikroskop gefertigt. Anschließend werden die Multischalen von der Datenerfassungsstation 5 durch die Fördereinheit 8 übernommen und je nach Medium über eine Probenausschleusungsstation 7 oder 7' ausgeschleust.
Die Experimentauswertung anhand der Transmissions- und Fluoreszenzaufnahmen kann manuell durch den Bediener erfolgen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die vorstehende Ausführungsform beschränkt. Beispielsweise kann die Vorrichtung durch zusätzliche Stationen ergänzt oder einzelne Stationen können gegen andere ausgetauscht werden, um sie einem entsprechenden Versuchsablauf anzupassen. Auch ist innerhalb einer jeweiligen Station die Möglichkeit gegeben, durch geringen Rüst- bzw. Umrüstaufwand diese flexibel an einen gewünschten Versuchsablauf anzupassen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht es, eine Vielzahl von Testsubstanzen mit geringem manuellen Aufwand sequentiell oder parallel auf deren Wirkung auf eine Gewebeprobe unter Normalbedingungen oder unter krankheitssimulierenden Bedingungen in vitro zu testen. Hierdurch wird beispielsweise die präklinische Pharmakaentwicklung oder die präklinische Entwicklung potentieller Pharmaka deutlich beschleunigt, so daß diese kostengünstiger für eine Vielzahl von Substanzen durchgeführt werden können. Außerdem sind durch die automatisierten Arbeitsschritte gleichbleibende Versuchsbedingungen sichergestellt, so daß die gewonnen Meßdaten über eine hohe Reproduzierbarkeit und Aussagekraft verfügen.

Claims

Patentansprüche:
1. Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von Laborarbeitsschritten an Zelloder Gewebeproben, die eine Mehrzahl von modularen Stationen, die jeweils mindestens einen Arbeitsschritt in einer Gesamtfolge von Arbeitsschritten ausführen, und mindestens eine Fördereinheit zum Fördern von Probenbehältern zu und zwischen den Stationen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung mindestens eine Station zum automatischen Wechseln von flüssigen Medien in den Probenbehältern (Medienwechselstation) aufweist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , die eine Probeneinschleusungsstation, mindestens eine Inkubatorstation, eine Medienwechselstation, eine Datenerfassungsstation und eine Probenausschleusungsstation aufweist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, die eine Sauerstoffinkubatorstation und gegebenenfalls eine Stickstoffinkubatorstation aufweist.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine Station zum Zugeben von Reagenzien zu den Probenbehältern aufweist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die Probenbehälter aufweist in Form von Platten mit einer oder mehrerer Vertiefungen, die Membraneinsätze enthalten können, wobei die Platten jeweils eine Deckelplatte aufweisen können.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Medienwechselstation gegebenenfalls eine Einheit zum Abnehmen und Aufsetzen einer Deckelplatte eines Probenbehälters, gegebenenfalls eine Einheit zum Herausnehmen und Einsetzen von Membraneinsätzen aus Vertiefungen einer Platte eines Probenbehälters, eine Einheit zum Entfernen eines flüssigen Mediums aus Vertiefungen einer Platte eines Probenbehälters, eine Einheit zum Zugeben eines oder mehrerer flüssiger Medien in Vertiefungen einer Platte eines Probenbehälters und gegebenenfalls eine Einheit zum Mischen flüssiger Medien in Vertiefungen einer Platte eines Probenbehälters aufweist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Medienwechselstation ferner eine Einheit zur Zwischenlagerung von Membraneinsätzen unter kontrollierten Bedingungen aufweist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Medienwechselstation ferner eine Einheit zum Entfernen flüssigen Mediums von Membraneinsätzen aufweist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei die Datenerfassungsstation eine Mikroskopiereinheit, ein Durchflußzytometer, ein Massenspektrometer, ein Spektroskop und/oder Geräte zur Laser-basierten Mikrodissection und/oder Elektrophysiologie aufweist.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die aufweist: eine Probeneinschleusungsstation, in der Zellgewebeproben manuell in Membranschalen eingebracht werden, die sich in Vertiefungen einer Multischale befinden, wobei die Vertiefungen ein Nährmedium für die Zellgewebeproben enthalten, eine Sauerstoffinkubatorstation, in der die Zellgewebeproben kultiviert werden, eine Medienwechselstation, in der das Nährmedium in den Multischalen nach vorbestimmten Zeitintervallen gewechselt wird, eine Reagenzienzugabestation, in der eine oder mehrere Testsubstanzen, deren Wirkung auf die Zellgewebeproben getestet werden sollen und/oder gegebenenfalls eine oder mehrere Substanzen, die die Aufnahme von Meßdaten der Zellgewebeproben unterstützen, in die Vertiefungen der Multischalen zugegeben werden, gegebenenfalls eine Stickstoffinkubatorstation, in der die Zellgewebeproben im Laufe des Experiments zusätzlich bedarfsweise inkubiert werden können, eine Datenerfassungsstation, in der Meßdaten der Zellgewebeproben beispielsweise vor und nach Zugabe einer Testsubstanz und/oder Kultivierung in dem Stickstoffinkubator erfaßt werden, um deren Einfluß auf die Zellgewebeproben zu bestimmen, eine Probenausschleusungsstation, in der Multischalen nach Abschluß der Untersuchungen aus der Vorrichtung ausgeschleust werden, und eine Fördereinheit zum Fördern der Multischalen von der Probeneinschleusungsstation zu und zwischen den Stationen bis zur Probenausschleusungsstation.
1 1. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Durchführung von Untersuchungen chemischer, biologischer und/oder physikalischer Einflüsse auf physiologische oder pathophysiologische Prozesse an Proben, vorzugsweise Zellgewebeproben.
12. Verwendung nach Anspruch 11 zum Testen der Wirkung von Substanzen auf Proben, vorzugsweise auf Zellgewebeproben.
13. Verwendung nach Anspruch 11 zur Identifizierung und Validierung therapeutischer Angriffspunkte (Targets).
14. Verfahren zum Testen der Wirkung von Substanzen auf Proben, vorzugsweise auf Zellgewebeproben, das das Einschleusen von Proben in eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und das Auswerten von in der Datenerfassungsstation erfaßten Meßdaten umfaßt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, das ein Wirkstoffscreening ist.
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