DE102005054206B4

DE102005054206B4 - Verfahren und Vorrichtung zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten Proben

Info

Publication number: DE102005054206B4
Application number: DE102005054206A
Authority: DE
Inventors: Willi Roth; Kai Hourfar
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2005-11-14
Publication date: 2010-07-15
Anticipated expiration: 2025-11-15
Also published as: DE102005054206A1

Abstract

Automatisiertes Verfahren zum Barcode-kontrollierten Bearbeiten von gepoolten Proben, umfassend folgende Schritte:
a) zur Verfügung stellen von Proben,
b) Zusammenführung (Pooling) der Proben zu mindestens einem Probenpool in mit Barcodes versehene Gefäße,
c) Anreicherung des mindestens einen Probenpools durch Zentrifugation mittels einer Zentrifuge mit Festwinkelrotor,
d) Zugabe einer Lösung, die zur Lyse von Zellen geeignet ist, zu dem mindestens einen angereicherten Probenpool,
e) Resuspendieren des mindestens einen Probenpools in der zugegebenen Lösung durch Durchmischen auf einem Schüttler,
f) Extraktion von Nukleinsäure und Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren an Magnetpartikel, und
g) Zuführen des mindestens einen Probenpools zu einem oder mehreren weiteren Nachweisverfahren.

Description

Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten Proben, insbesondere Blutproben. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens. Das Verfahren und demzufolge auch die Vorrichtung kann insbesondere zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT) zur Testung von Blutspenden und Blutprodukten angewendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Menschliches Blut ist für die Medizin ein sehr wertvoller und bisher unverzichtbarer Rohstoff, aus dem heute eine Vielzahl von Komponenten und Produkten gewonnen bzw. hergestellt wird. Der sogenannte AIDS-Skandal Anfang der 90er Jahre hat die Virussicherheit von Blut und Blutprodukten in der Öffentlichkeit wie in Fachkreisen schlagartig in den Mittelpunkt des Interesses gerückt.
NAT-Technik verringert Infektionsrisiko bei Bluttransfusionen
Das Risiko, sich durch eine Bluttransfusion mit viralen Krankheitserregern, wie HIV 1/2, HCV, HBV oder HAV, zu infizieren, konnte in den letzten Jahren durch verbesserte Methoden bei der Untersuchung der Blutkonserven erheblich gesenkt werden. Es wurde zeigt, daß durch die Einführung der so genannten Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT) die Chance, infizierte Blutkonserven zu entdecken, weiter gestiegen ist.
Bevor gespendetes Blut an einen Patienten weitergegeben wird, muß es auf Krankheitserreger hin überprüft werden. Vor Einführung der NAT wurden beispielsweise HIV- und Hepatitis-Viren in Blutkonserven in erster Linie durch den Nachweis von Antikörpern entdeckt. Da solche Antikörper als Reaktion auf eine erfolgte Infektion erst nach einer gewissen Zeit vom Immunsystem gebildet werden, bestand bei den Kontrollen ein offenes Zeitfenster (diagnostisches Fenster): In der Anfangsphase einer Infektion war es nicht möglich, die Erreger in der entsprechenden Blutspende zu entdecken, infiziertes Blut konnte somit in die medizinische Versorgung gelangen. Das Risiko, Blut von frisch infizierten Spender weiterzugeben, ließ sich für Plasma nur dadurch minimieren, daß alle Blutspender zu einer zweiten Spende aufgefordert wurden, die nach einem Mindestabstand von 2–3 Monaten erfolgte. Damit konnten im Falle einer Infektion die in der Zwischenzeit gebildeten Antikörper beim Spender nachgewiesen werden. Das zuerst gespendete Plasma wurde so lange eingefroren, bis der Antiköpertest der zweiten Spende negativ ausgefallen war, und erst dann für eine medizinische Behandlung verwendet.
Seit Mitte der 1990er Jahre wird erfolgreich an Methoden gearbeitet, mit deren Hilfe Viren anhand ihrer Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Durch die Plasma-verarbeitende Industrie angeregt, die ihre Produktionspools vor hohen Virusbelastungen schützen wollte, wurden Mitte der 90er Jahre Nukleinsäuretestungen (NAT) für die transfusionsrelevanten Viren und später auch für Parvovirus B19 (PB 19) und HAV als Qualitätskontrollmaßnahmen eingeführt. 1999 wurde schließlich die HCV NAT-Testung für Plasma und zelluläre Bestandteile vom Paul-Ehrlich-Institut (PEI) in Deutschland verbindlich eingeführt. Die Blutspendedienste des Deutschen Roten Kreuzes (DRK) haben jedoch von Anfang an, die ersten 1997 beginnend, alle Spenden auf die transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV und HBV getestet. Sie waren auch die ersten, die im Jahre 2000 die NAT-Testung auf PB 19 und HAV ausweiteten, was heute bei den DRK-Blutspendediensten Standard ist. Seit Mai 2004 hat das PEI außerdem die HIV-NAT angeordnet.
So wurden zwischen 1997 und 2002 in einer Studie insgesamt 3,6 Mio Blutspendeproben in Mitteleuropa auf HCV und HIV-1 (Roth, WK et al. Transfusion 2002; 42: 862–868.) und HBV (Roth, WK et al. Transfusion 2002; 42: 869–875.) mittels NAT getestet. Dabei konnten 6 HCV und 2 HIV-1 PCR-positive Spenden mit negativem Antikörper-Test (Häufigkeit 1 in 600.000 bzw. 1 in 1,8 Mio) und 6 HBV PCR-positive Spenden, die aber HBsAg-negativ waren, identifiziert werden.
Das virologische Restrisiko ist aufgrund der verschiedenen Maßnahmen, wie Spenderselektion, ELISA-Testung und NAT-Testung, für die untersuchten transfusionsrelevanten Viren auf ein bisher nicht gekanntes, unvorstellbar geringes Maß gesunken. So ist das Restrisiko, das in Deutschland nach Einführung der PCR für die drei transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV, HBV noch verbleibt, mit < 1:20 Mio. für HCV und HIV und < 1:1 Mio für HBV so gering geworden, daß man fast von keinem wirklichen virologischen Restrisiko mehr sprechen kann.
Demgegenüber rücken nun die Restrisiken, die durch bakterielle Kontamination von Blutprodukten entstehen, zwangsläufig in den Vordergrund des Interesses. Während ca. 0,1 bis 0,05% der Blutkomponenten bakteriell kontaminiert sind, kommt es nur bei 1:10.000 Fällen zu einer Transfusionskomplikation und bei 1:600.000 zu einer tödlichen Transfusionskomplikation. Damit rückt das bakterielle Risiko, das vor der Einführung der Nukleinsäuretestung deutlich unter dem virologischen Risiko lag, nach vorne und ist um Größenordnungen höher geworden, als das verbleibende virologische Restrisiko (Roth, WK und Seifried, E, hämotherapie 2003; 1: 22–35.).
Generell führte die Einführung der aufwendigen und teuren NAT-Technologie zu einer zusätzlichen finanziellen Belastung der Blutspendedienste. Ein Weg zur Reduzierung der Kosten ist dabei die Zusammenfassung vieler einzelner Spenderproben zu einer einzigen durch Bildung von sogenannten Minipools (siehe Roth, WK und Seifried, E, Transfusion Medicine 2002; 12: 255–258.). So werden bis zu 96 Blutspendeproben zu einem Pool zusammengeführt, was zu einem Durchsatz von 2.000 bis 4.000 Proben pro Tag führt (Roth, WK et al. Vox Sang 2000; 78 (suppl 2): 257–259.).
Dennoch ist NAT zur Zeit ein hauptsächlich manuelles Verfahren mit geringem Durchsatz und hohen Kosten. Dies ist der Hauptgrund für das Pooling von Proben, da das Testen von bis zu 3.000 Proben pro Tag auf 3 bis 5 Viren eine Zahl von 9.000 bis 15.000 NAT-Tests pro Tag erforderlich machen würde. Derzeit sind jedoch, noch keine Verfahren und keine Thermocycler/Analysatoren erhältlich, die es erlauben würden, in einer 8-Stunden-Schicht eine derart hohe Zahl von Tests durchzuführen. Nur das Pooling erlaubt Hochdurchsatz-NAT durch die Verringerung der Anzahl von durchzuführenden Tests (Roth, WK und Seifried, E, Transfus. Clin. Biol. 2001; 8: 282–284.).
Aus dem europäischen Patent EP 0 769 954 B1 sind Verfahren zum Bearbeiten von gepoolten Proben bekannt, welche das zur Verfügung stellen von Proben; eine Zusammenführung (Pooling) der Proben zu mindestens einem Probenpool; eine Anreicherung des mindestens einen Probenpools durch Zentrifugation; die Zugabe einer Lösung, die zur Lyse von Zellen geeignet ist, zu dem mindestens einen angereicherten Probenpool; das Resuspendieren des mindestens einen Probenpools in der zugegebenen Lösung, wobei danach eine Extraktion von Nukleinsäure erfolgt; und das Zuführen des mindestens einen Probenpools zu einem oder mehreren weiteren Nachweisverfahren umfasst.
Ein Vergleich eines manuellen Verfahrens mit einem automatisierbaren Verfahren zum Bearbeiten von Minipools für die NAT-Testung wird in Hourfar et al., 2005 gezeigt (Hourfar et al., Vox Sanguinis 2005, 89, 71–76). Das darin beschriebene automatisierte Chemagic-Verfahren verzichtet auf eine Anreicherung der Probenpools. Durch diesen Verzicht auf die Anreicherung wird eine Automation der Extraktion von Minipools erst ermöglicht.
US 6,063,563 A offenbart Verfahren und Vorrichtungen zur Testung von Blut und Plasmaproben auf Viruskontaminationen. Insbesondere erlauben die beschriebenen Vorrichtung und Verfahren ein vereinfachtes Pooling der einzelnen Proben mit anschließender Analyse auf Anwesenheit von Viren.
Eine modulare Vorrichtung zur automatisierten Durchführung von Laborarbeitsschritten, insbesondere in der Zellkultur, wird in der deutschen Anmeldung DE 103 44 284 A1 offenbart. Plattformen zur automatisierten Durchführung von Hochdurchsatz Testungen chemischer Verbindungen sind zudem aus US 2002/0012611 A1 bekannt.
US 2002/000934 A1 beschreibt ein modulares System, worin voll automatisiert Probenvorbereitung, Instrumentierung und Analyse von biopolymeren Substanzen, bspw. Nukleinsäuren, Proteinen, Peptiden oder auch Kohlenhydraten, durchgeführt wird. Die dargestellte Robotik des Systems erlaubt eine Verarbeitung sehr kleiner Volumina bis in den Picoliterbereich
Verfahren zur voll automatisierten Homogenisierung von Gemischen ist in der Schrift DE 100 6 389 A1 beschrieben. Das System umfasst das Herstellen eines Gemisches aus zumindest drei Komponenten mit nachfolgender Homogenisation und Charakterisierung. Aus WO 00/25925 A1 ist wiederum ein Verfahren bekannt wodurch warmes Gas oder Flüssigkeit in bewegte Probengefäße mittels höhenverstellbarer Kanülen geführt werden kann. Das System umfasst im Weiteren eine Zentrifuge mit integriertem Schüttler. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu entwickeln, das eine schnellere und verbesserte Durchführung der Nukleinsäure-Amplifikationstechniken erlaubt. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, das Verfahren auch für die Testung auf bakterielle Kontaminationen anwendbar zu machen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines automatisierten Verfahrens zum Barcode-kontrollierten Bearbeiten von gepoolten Proben gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer Erhöhung des Probendurchsatzes, Verringerung der Zeit zur Probenvorbereitung und Probenbeabeitung und/oder Steigerung der Zuverlässigkeit der Probenvorbereitung und Probenbeabeitung.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt dabei bevorzugt folgende Schritte:

a) zur Verfügung stellen von Proben,
b) Zusammenführung (Pooling) der Proben zu mindestens einem Probenpool in mit Barcodes versehene Gefäße,
c) Anreicherung des mindestens einen Probenpools durch Zentrifugation mittels einer Zentrifuge mit Festwinkelrotor,
d) Zugabe einer Lösung, die zur Lyse von Zellen geeignet ist, zu dem mindestens einen angereicherten Probenpool,
e) Resuspendieren des mindestens einen Probenpools in der zugegebenen Lösung durch Durchmischen auf einem Schüttler,
f) Extraktion von Nukleinsäure und Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren an Magnetpartikel, und
g) Zuführen des mindestens einen Probenpools zu einem oder mehreren weiteren Nachweisverfahren.

Bei den Proben handelt es sich bevorzugt um Blutproben oder andere Körperflüssigkeiten, aber auch um Lebensmittel oder Bakterienkulturen.
Bevorzugt handelt es sich bei einer Blutprobe um eine Bestandteile des Blutes enthaltende Probe. Bevorzugt werden Proben verwendet, die in der Blutspende und in der Transfusionsmedizin vorkommen und verwendet werden. Bevorzugte Proben werden aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, zellulären Blutbestandteilen und/oder weiteren Blutprodukten ausgewählt. Dabei kann es sich auch um folgende Blutpräparate aus Vollblut- und Apherese-Spenden handeln:

– Produkte aus Einzelspenden, wie Erythrozytenkonzentrate (EK), Thrombozytenkonzentrate (TK), Stammzellpräparate, Granulozyten oder Lymphozyten aus Apherese, Gefrorenes Frischplasma (GFP)
– gepoolte Blutplättchenprodukte, wie Pool-TK aus Buffy-Coat
– Produkte aus Plasmapools, wie GFP mit SD (solvent/detergent) Pathogen-Inaktivierung, Albumin, Gerinnungsfaktoren, Fibrinkleber, Inhibitoren, Immunglobuline.

Es kann sich bei den in Schritt a) zur Verfügung gestellten Proben um flüssige oder verflüssigte Proben handeln.
Gemäß der Beschreibung handelt es ich bei der zugegebenen Lösung in Schritt d) um Wasser, Reagenzien zur Lyse von Viren, Bakterien und anderen Mikroorganismen, wie beispielsweise Lyse- bzw. kombinierte Lyse/Bindepuffer unter Verwendung von Detergenzien, Proteasen, chaotropen Salzen, organischen Lösungsmitteln sowie weiteren dem Fachmann bekannten Lösungen und Suspensionen, die zur Extraktion von Nukleinsäure geeignet sind, und Extraktionsreagenzien. Puffer können alkalischen, neutralen oder sauren pH-Werts sein. Den Puffer können Festphasen zur Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren beigefügt sein.
Schritte d) und e) können auch mehrfach durchgeführt werden.
Das bei bisherigen Verfahren unter Einbeziehung von manuellen Teilschritten zur Virus- bzw. Bakterienanreicherung bestehende Risiko von Probenverwechslungen läßt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren effektiv beseitigen. Zu diesem Zweck erfolgt das Pooling der Blutproben direkt in mit Barcodes versehene Gefäße, bevorzugt Zentrifugenröhrchen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um einen einzigen homogenen Prozeß ohne manuelles Eingreifen.
Weiterhin ist bevorzugt, daß die Proben, insbesondere die Blutproben, auf die Anwesenheit von Nukleinsäure oder Protein(en) untersucht werden. Bei den Nukleinsäuren kann es sich um DNA, RNA, wie rRNA, insbesondere 16S oder 23S rRNA handeln. Bei den Proteinen kann es sich um Prionen-Proteine handeln.
Weiterhin handelt es sich bevorzugterweise um die Nukleinsäure eines Virus, eines Bakteriums oder die Nukleinsäue von Protozoen und Zellen.
Die Viren können dabei ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus: humanes Immundefizienz-Virus 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2), sowie die HIV-1-Untergruppen M, N und O. Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis B-Virus (HBV), Cytomegalie-Virus (CMV, HHV 5), Hepatitis A-Virus (HAV), Parvovirus B19 (PB 19), Humanes T-Zell-Leukämie-Virus I/II (HTLV I/II), West-Nil-Virus (WNV), SARS Coronavirus (SARS CoV) und sonstigen Viren, wie EBV, HHV 8, HGV/GBVC, TTV. Es kann ebenso die Anwesenheit der Nukleinsäuren bisher unbekannter Viren untersucht werden.
Die Bakterien können dabei aus der Gruppe bestehend aus grampositiven und gramnegativen Bakterien ausgewählt sein. Es wird beschrieben, die Anwesenheit bakterieller 16S oder 23S rRNA zu untersuchen. Es können Bakterien-Spezies mit transfusionsmedizinischer Relevanz wie Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptomyces pyogenes, Bacillus cereus, Klebsiella oxytoca, E. coli, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Salmonella choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsielle pneumoniae, und Propionibacterium acnes nachgewiesen werden.
Weiter kann eine simultane Untersuchung auf die Anwesenheit der Nukleinsäure von mehreren Viren erfolgen. Das Verfahren kann zur simultanen Untersuchung auf 5 Viren verwendet werden, wie HCV, HIV, HBV, HAV und PB 19.
Alternativ kann die Untersuchung auf freie, z. B. im Plasma zirkulierende, Nukleinsäuren erfolgen. Dabei wird bevorzugt eine großvolumige Probe eines Blutbestandteils eines Patienten verwendet. Enthaltene Nukleinsäuren werden durch Zentrifugation angereichert und dem beschriebenen Verfahren zugeführt.
Bevorzugterweise handelt es sich bei einem weiteren Nachweiserfahren aus Schritt g) um eine Amplifizierung von Nukleinsäuren oder einen Protein-Nachweis. Eine erfindungsgemäße Amplifizierung von Nukleinsäuren kann eine PCR, TaqMan PCR, Real Time-PCR, TMA, NASBA, SDA oder LCR umfassen.
Weiter ist bevorzugt, daß der Amplifizierung ein Verfahren zur Detektion der amplifizierten Nukleinsäure nachgeschaltet ist. Es ist auch eine Zuführung des Probenpools zu einem Detektionsverfahren möglich, das keine vorherige Amplifikation benötigt.
Gemäß der Beschreibung handelt es sich bei dem Verfahren zur Amplifizierung der Nukleinsäure um eine Real Time-PCR, die zugleich eine online Detektion der amplifizierten Nukleinsäure ermöglicht.
Es ist weiter bevorzugt, daß nach der Zusammenführung (Pooling) der Proben zu mindestens einem Probenpool eine Behandlung des mindestens einen Probenpools (Schritt c) in Form einer Anreicherung erfolgt. Eine erfindungsgemäße Anreicherung umfaßt bevorzugterweise eine Zentrifugation (mit oder ohne Zusatz von dem Fachmann bekannten Pelletionshilfen), Präzipitation oder die Bindung an eine feste Phase.
Weiter ist bevorzugt, daß nach Schritt e) eine Extraktion von Nukleinsäure erfolgt. Bei bevorzugten Extraktionsverfahren handelt es sich um Lyse mit Hilfe von Detergenzien, Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren unter sauren Bedingungen an Magnetpartikel, Verwendung von Extraktionsreagenzien auf Basis chaotroper Salze (wie in Verbindung mit Membranen oder Magnetpartikeln als Festphase) oder weiterer dem Fachmann bekannter Extraktionsmethoden.
Weiterhin ist bevorzugt, daß der/die Probenpools auf den nachfolgenden Amplifizierungsschritt vorbereitet werden. Dabei erfolgt eine Aufreinigung der Nukleinsäuren durch Bindung an eine Festphase, ein bis mehrere Waschschritte und Elution der aufgereinigten und aufkonzentrierten Nukleinsäuren.
Insbesondere erfolgt die Extraktion und PCR-Vorbereitung für 5 Viren simultan, wie HCV, HIV, HBV, HAV, PB 19.
Außerdem ist bevorzugt, daß in Schritt b) eine Zusammenführung (Pooling) von mindestens 2 Proben durchgeführt wird.
Es werden 2 bis 96 Proben pro Probenpool zusammengeführt (Schritt b) des Verfahrens). Bevorzugterweise können erfindungsgemäß 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 oder 96 Proben zu einem Probenpool zusammengeführt werden (Schritt a). Es können auch 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 Proben zu einem Probenpool zusammengeführt werden. So können 96 Proben von jeweils 100 μl, 48 Proben von jeweils 200 μl, 24 Proben von jeweils 400 μl, 12 Proben von jeweils 800 μl oder 6 Proben von jeweils 1600 μl zusammengeführt werden. Das Gesamtvolumen eines Probenpools beträgt 10 ml.
Das beschriebene Verfahren bietet eine vorteilhafte hohe Flexibilität für ein potentielles Hochskalieren („scaling up”). So kann, wenn eine höhere Sensititvität erforderlich ist, das Ausgangsvolumen der Proben erhöht werden. Es können 96 Proben von jeweils 100 μl, 48 Proben von jeweils 200 μl, 24 Proben von jeweils 400 μl, 12 Proben von jeweils 800 μl, 6 Proben von jeweils 1600 μl verwendet werden.
Gemäß der Beschreibung werden 43 Probenpools und 5 Kontrollen, wie Positivkontrollen und Negativkontrollen, im Verfahren verwendet.
Die maximale Kapazität des Verfahrens können 4128 Proben pro Durchgang, d. h. 96 Proben pro Probenpool, sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Vorrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie sich für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet und eine automatisierte Pipettier-Station mit einem darin integrierten Magnetseparator und einem darin integrierten Schüttler umfasst. Die Vorrichtung eignet sich zur automatischen Nukleinsäureextraktion und PCR-Vorbereitung.
Die Vorrichtung ermöglicht die vorteilhafte Verknüpfung der Gefäße, in denen sich die angereicherte Probenpools befinden, mit einem automatischen Extraktionsverfahren.
Eine Vorrichtung gemäß der Beschreibung kann mehrere Komponenten umfassen, bevorzugt

– eine automatisierte Pipettier-Station,
– einen Magnetseparator,
– einen Flüssigkeitsbearbeitungsarm,
– einen Roboter-Arm,
– einen Schüttler,
– optional SPE-Säulen (SPE: solid Phase extraction) auf einer optionalen Vakuum-Station.

Dabei können Magnetseparator und Schüttler in die automatisierte Pipettierstation integriert sein. Nach Zugabe einer Flüssigkeit (mit oder ohne Zusatz von magnetischen Festphasen) zu Zentrifugenröhrchen erfolgt ein Durchmischen auf dem Schüttler. Anschließend wird die Flüssigkeit durch den Flüssigkeitsbearbeitungsarm in Reaktionsgefäße auf einen Magnetseparator oder optional auch in SPE-Säulen auf einer Vacuum-Station überführt. Alternativ kann das initiale Durchmischen auch ohne Verwendung eines Schüttlers erfolgen (z. B. durch Auf- und Abpippetieren).
Eine weitere Vorrichtung umfaßt SPE-Säulen auf einer Vakuum-Station, aber keinen Schüttler oder keinen Magnetseparator.
In einer Vorrichtung gemäß der Beschreibung sind alle Komponenten als eine integrierte Vorrichtung ausgelegt und befinden sich in einem Gehäuse.
Als Komponenten der Vorrichtung eignen sich beispielsweise Geräte der Firma Tecan, Crailsheim. So eignet sich als Pipettierautomat beispielsweise ein Pipettierautomat vom Typ Freedom EVO, wie ein Tecan EVO 150-Gerät, als Magnetseparator beispielsweise ein Gerät vom Typ TeMagS und als Schüttler beipielsweise ein Gerät vom Typ TeShake.
Geeignete Komponenten sind auch Geräte anderer Hersteller, wie z. B. Hamilton, Beckman, Xiril, Sias.
Die Vorrichtung kann weiterhin Software-gesteuert sein. Der Extraktionsprozeß kann durch eine Software gesteuert werden. Die Überwachung des Gesamtprozesses (Pooling, Zentrifugation, Extraktion, Detektion, Auswertung) kann durch Software erreicht werden. Die Software überwacht den Gesamtprozeß. Die Software gibt dabei den Softwareprogrammen der einzelnen Teilprozesse Arbeitslisten vor und verarbeitet, bewertet und archiviert z. B. Fehlermeldungen und Ergebnisse der Teilprozesse. Die Software kann zur Integration von Pooling, Extraktion, PCR-Vorbereitung und Real Time-PCR programmiert werden.
Daher ist ein weiterer Aspekt der Offenbarung ein Computerprogramm zur Steuerung und Überwachung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Es wird außerdem besonders bevorzugt, daß eine Probe, wie eine Blutspendeprobe, bis zum Ergebnis durch eine Barcode-Markierung verfolgt wird und damit identifiziert werden kann. Das direkte Pooling in mit Barcodes versehene Gefäße, wie Zentrifugenröhrchen, sowie die im Anschluß an den Anreicherungsprozeß erfolgende automatisierte, barcodekontrollierte Nukleinsäureextraktion, Amplifikation und Detektion schließt eine Probenverwechslung während des gesamten Prozesses der NAT-Testung aus. Somit lassen sich durch das erfindungsgemäße Verfahren der hohe Durchsatz und die hohen Sensitivitäten eines Verfahrens welches einen Anreicherungsschritt beinhaltet mit der hohen Sicherheit eines automatisierten und vollständig barcodekontrollierten Prozesses kombinieren.
Das bei bisherigen Verfahren unter Einbeziehung von manuellen Teilschritten zur Virus- bzw. Bakterienanreicherung bestehende Risiko von Probenverwechslungen läßt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren effektiv beseitigen. Zu diesem Zweck erfolgt das Pooling der Proben, insbesondere von Blutproben, direkt in mit Barcodes versehene Gefäße, wie Zentrifugenröhrchen. Nach der sich anschließenden Anreicherung der potentiell enthaltenen Viren und dem Dekantieren des Überstandes werden diese Gefäße einem Extraktionsverfahren zugeführt, daß durch Barcodeüberwachung bzw. physikalisch feste Zuordnung keine Probenverwechslungen zuläßt. Bevorzugt handelt es sich dabei um ein vollautomatisierten homogenen Prozeß ohne manuelles Eingreifen. Dem Extraktionsprozeß schließen sich ein automatisiertes und Software-überwachtes PCR-Setup, Amplifikation sowie Software-gestützte Detektion und Auswertung ab.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise ein maximaler Durchsatz von 4128 Proben in 6 Stunden und 30 min in einem Durchgang und 8256 Proben in 9 Stunden (2 Durchgänge) erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren verdeutlicht werden, ohne jedoch auf die Beispiele beschränkt zu sein.
Figuren
In den Figuren zeigen
1 den Prozeßablauf der automatisiertem NAT in einem Flußdiagramm.
2A und 2B die Arbeitsschritte und die Vorrichtungen, die im automatisiertem NAT zum Einsatz kommen.
Beispiele
Beispiel: Prozessierung von 4128 Proben
(Dauer: 6,5 h nach erfolgtem Pooling)
Das Zusammenfassen von jeweils 96 Einzelproben zu einem Pool erfolgt auf einer automatisierten Pipettier-Station. Dazu werden 96 mit Barcodes versehene Primärröhrchen (EDTA-Vacuette, Greiner, Frickenhausen), die zuvor bei 3.500 xg für 10 min zur Trennung von Plasma und zellulären Blutbestandteilen zentrifugiert (Multifuge, Kendro, Osterode) wurden, auf Stripracks dem Pipettierroboter zugeführt. Zusätzlich werden zwei mit Barcodes versehene 2 ml Deepwell-Platten und ein barcodiertes 16 ml Zentrifugenröhrchen (Nalgene, Hereford, UK) auf der Arbeitsfläche des Pipettierrobotters platziert. Nach Start der Pooling-Software werden aus jedem Primärröhrchen 1,8 ml Plasma entnommen. 100 μl davon werden in das Zentrifugenröhrchen (Poolgefäß) abgegeben und 800 bzw. 900 μl den beiden Deepwell-Platten zugeführt (Rückstellmaterial).
Als Pipettier-Station und deren Steuersoftware eignen sich beispielsweise Produkte der Firma Tecan, Crailsheim. So eignet sich als Pipettier-Station ein Gerät vom Typ Genesis und als Pooling-Software das Produkt Logic.
Nach beendetem Pooling werden die Zentrifugenröhrchen verschlossen und einer einstündigen Zentrifugation bei 22.000 U/min (oder auch mindestens 48.000 xg) und 4°C zugeführt (Avanti J-25, Beckman, Krefeld, Deutschland). Je 22 Probenpools und 2 Positivkontrollen (9,1 ml Plasma + 500 μl virushaltiges Plasma) werden dabei in einem Festwinkel-Zentrifugenrotor platziert. Nach beendeter Zentrifugation werden die Poolröhrchen entnommen und der Überstand manuell dekantiert. Anschließend werden die Poolröhrchen auf Stripracks dem Extraktionsautomaten zugeführt.
Hierbei handelt es sich um einen Pipettierautomaten. Zur Automatisierung der Nukleinsäureisolation ist dieser mit einem Magnetseparator und einem Schüttler versehen. Für die Extraktion der viralen Nukleinsäuren wird eine auf Magnetpartikeln basierende Extraktionschemie verwendet, die in der deutschen Patentanmeldung DE 102 58 258 A1 offenbart ist. Zusätzlich zu den 48 barcodierten Zentrifugenröhrchen wird der Extraktionsautomat mit Verbrauchsmaterialien (Einweg-Tips, Reaktionsgefäßen, Deepwell-Platten), Extraktionsreagenzien (Lyse/Bindepuffer TAAN versetzt mit Magnetpartikeln, Waschpuffer WBN, Elutionspuffer WBN) und PCR-Reagenzien für HIV, HCV, HBV, HAV und PB19 (sogenannten Mastermixen) versehen.
Nach dem Start des vollautomatischen Extraktionsprozesses werden die Barcodes der Poolröhrchen eingelesen und die Röhrchen mit je 900 μl Bindepuffer versetzt. Anschließend werden diese für 10 min bei 800 U/min auf dem Magnetseparator agitiert. Nachfolgend wird der Bindepuffer (inklusive Magnetpartikeln und festgelegten Volumina an internen Kontroll-Sequenzen) in die 2 ml Reaktionsgefäße überführt. Es folgen zwei Waschschritte mit Protease-haltigem Waschpuffer und die Elution der Nukleinsäuren in einem Puffer niedriger Ionenstärke bei 80°C (Heizblock des Magnetseparators). Trennung von Flüssigkeit und nukleinsäurebindender Matrix erfolgt dabei jeweils durch magnetische Separation auf dem Magnetseparator.
Nach erfolgter Nukleinsäureisolierung schließt sich das vollautomatisierte PCR-Setup an. Dieses erfolgt, ebenso wie die Nukleinsäureextraktion vollständig Barcode-kontrolliert und nach einer Arbeitsliste, die von einer Software erstellt wird. Zu diesem Zweck werden die jeweiligen virusspezifischen PCR-Mastermixe, die zuvor auf der Arbeitsfläche des Extraktionsautomaten positioniert wurden, in die jeweiligen PCR-Platten vorgelegt und die Extrakte nachfolgend hinzugefügt. Die Gesamtdauer für Extraktion und PCR-Setup beträgt ca. 2,5 h.
Als Pipettierautomat und dessen Komponenten eignen sich beispielsweise Geräte der Firma Tecan, Crailsheim. So eignet sich als Pipettierautomat beispielsweise ein Pipettierautomat vom Typ Freedom EVO, als Magnetseparator beispielsweise ein Gerät vom Typ TeMagS und als Schüttler beipielsweise ein Gerät vom Typ TeShake.
Als Magnetpartikeln eignen sich beispielsweise MagPrep^®-Silica der Firma Merck, Darmstadt.
Die Barcode-Kontrolle sowie die Steuerung und Überwachung der Extraktion und des PCR-Setups ist Software-gesteuert.
Abschließend erfolgt manuelles oder automatisiertes Versiegeln der PCR-Platten und der Transfer selbiger in Real Time-PCR-Thermocycler. Die Amplifizierung wird wie bereits veröffentlicht durchgeführt, für HIV-1 siehe Drosten C. et al. (J. Clin. Microbiol., 2001, 39: 4302–4308), für HBV siehe Drosten C. et al. (Transfusion, 2000, 40: 718–427) oder für HCV, HBV und HIV-1 siehe Roth WK et al. (Lancet, 1999, 353: 359–363). Bevorzugt handelt es sich um einen TaqMan PCR-Assay mit einer kompetitiven internen Kontrolle.
Die obige Amplifikation und Detektion beansprucht ca. 2,5 h.
Als Thermocycler eignen sich beispielsweise Geräte vom Typ ABI 7000 SDS (Applera, Darmstadt).
Ergebnisse: Bei dem beschriebenen Versuch wurde vollständige Barcode-Kontrolle des Prozesses der NAT-Testung erzielt. Eine Probenverwechslung konnte so sicher ausgeschlossen werden. Die für die einzelnen Viren erzielten 95%-Nachweisgrenzen bezogen auf die Einzelspende waren 997 IU/ml für HCV, 1029 IU/ml für HIV-1, 59 IU/ml für HBV, 1099 IU/ml für HAV und 362 IU/ml für PB19.

Claims

Automatisiertes Verfahren zum Barcode-kontrollierten Bearbeiten von gepoolten Proben, umfassend folgende Schritte: a) zur Verfügung stellen von Proben, b) Zusammenführung (Pooling) der Proben zu mindestens einem Probenpool in mit Barcodes versehene Gefäße, c) Anreicherung des mindestens einen Probenpools durch Zentrifugation mittels einer Zentrifuge mit Festwinkelrotor, d) Zugabe einer Lösung, die zur Lyse von Zellen geeignet ist, zu dem mindestens einen angereicherten Probenpool, e) Resuspendieren des mindestens einen Probenpools in der zugegebenen Lösung durch Durchmischen auf einem Schüttler, f) Extraktion von Nukleinsäure und Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren an Magnetpartikel, und g) Zuführen des mindestens einen Probenpools zu einem oder mehreren weiteren Nachweisverfahren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Proben um Blutproben oder um Bestandteile des Blutes enthaltende Proben handelt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum oder zellulären Blutbestandteilen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Proben auf die Anwesenheit von Nukleinsäure oder Protein untersucht werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure die Nukleinsäure eines Virus, eines Bakteriums oder von Protozoen ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Virus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HIV 1/2, HCV, HBV, CMV, HAV, PB 19, HTLV I/II, WNV oder SARS Coronavirus.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure DNA oder RNA ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei einem weiteren Nachweisverfahren aus Schritt g) um eine Amplifizierung von Nukleinsäuren oder einen Protein-Nachweis handelt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Amplifizierung von Nukleinsäuren eine PCR, TaqMan PCR, Real Time-PCR, TMA, NASBA, SDA oder LCR umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, wobei der Amplifizierung ein Verfahren zur Detektion der amplifizierten Nukleinsäure nachgeschaltet ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anreicherung in Schritt b) eine Präzipitation oder die Bindung an eine feste Phase umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach dem Schritt e) der mindestens eine Probenpool auf einen nachfolgenden Amplifizierungsschritt vorbereitet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens 2 Proben zusammengeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 oder 96 Proben zu einem Probenpool zusammengeführt werden.
Vorrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die Schritte a) bis g) eines automatisierten Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 ausführt und eine automatisierte Pipettierstation mit – einem darin integrierten Magnetseparator und – einem darin integrierten Schüttler umfasst.