DE10258258A1

DE10258258A1 - Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10258258A1
Application number: DE2002158258
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr. Michelsen; Willi Kurt Prof. Dr. Roth; Kai Hourfar
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2004-06-24
Also published as: AU2003288124A1; WO2004055207A1; EP1570077A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen, insbesondere großvolumigen Proben unter Verwendung eines anorganischen Trägermaterials. Die Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial erfolgt unter sauren Bedingungen, die Elution unter basischen Bedingungen. Die Ausbeute der isolierten Nukleinsäuren wird erfindungsgemäß stark erhöht, indem dem Waschpuffer eine Proteinase zugesetzt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere aus großvolumigen flüssigen Proben unter Einsatz anorganischer oxidischer Trägermaterialien in Kombination mit geeigneten Puffersystemen zur sauren Bindung und basischen Elution der Nukleinsäuren. Die Effektivität der Aufreinigung konnte gegenüber bekannten Verfahren durch Zugabe einer Proteinase zum Waschpuffer erheblich gesteigert werden.
Die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Startmaterialien, wie Körperflüssigkeiten, ist von großer Bedeutung z.B. zum Nachweis viraler Erkrankungen.
Klassische Methoden für die Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Startmaterialen wie Blut oder Plasma beginnen mit der Lyse des biologischen Materials mittels eines Detergenz und/oder eines chaotropen Salzes. Diese Substanzen ermöglichen die Inaktivierung und Denaturierung von Proteinen und Enzymen. Nachfolgend werden mittels organischer Lösungsmittel wie z.B. Phenol und/oder Chloroform, Ethanolfällung und Zentrifugationsschritten die Nukleinsäuren gereinigt. Diese Methoden sind nicht nur sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig, sondern auch schwer zu automatisieren.
Modernere Methoden basieren auf dem Gebrauch von Festphasen bzw. Trägermaterialien. In US 5,234,809 wird eine Methode beschrieben, bei der die Nukleinsäuren in Gegenwart von chaotropen Agentien wie Guanidiniumsalzen an eine Silika Festphase gebunden werden. WO 99/40098 offenbart eine Methode, bei der die Nukleinsäuren unter sauren Pufferbedingungen an Silika Festphasen gebunden werden.
Es besteht jedoch noch immer der Bedarf, Nukleinsäuren nicht nur schnell und einfach sondern auch quantitativ insbesondere aus großen Probenvolumina zu isolieren. Besonders effektive Verfahren werden vor allem dann benötigt, wenn die Probe biologischen Ursprungs ist und nur sehr wenige der nachzuweisenden Nukleinsäuren enthält. Ein Beispiel hierfür ist der Nachweis von viralen Nukleinsäuren in Körperflüssigkeiten, wie Plasma oder Blut.
Für den Nachweis der isolierten viralen Nukleinsäuren werden z.B. bekannte Nukleinsäureamplifikationstechniken, wie z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), branched-DNA Detection (bDNA) oder Nucleic Acid Sequence based Amplification (NASBA) verwendet.
Voraussetzung für einen erfolgreichen und sensitiven Nachweis vitaler Partikel in Körperflüssigkeiten, wie z.B. Hepatitis B- oder C-Virus, (HBV, HCV) oder Humanes Immundefizienz Virus (HIV), über die genannten Nukleinsäureamplifikationstechniken ist die effiziente, quantitative Isolierung der viralen Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in möglichst reiner und nativer Form. Die Nachweisgrenze der kommerziell erhältlichen Testsysteme liegt bei etwa 100 bis 400 Nukleinsäure-Kopien pro ml Plasma. Die meisten Testsysteme sind zudem nur für einen Virustyp und auf den Einsatz von relativ kleinen Probenvolumina ausgerichtet (100-500μl Plasma).
Daraus ergibt sich z.B. für zwei wichtige Anwendungsfelder noch immer ein Problem aufgrund der zu geringen Empfindlichkeit der Nachweissysteme:

1.) Blutbanken, die durch hohe Probenaufkommen und Kostendruck bedingt sogenannte Mini-Pools bilden (aus bis zu 100 individuellen Spenderproben), müssen die potentiell aus einem einzelnen Serum herrührenden Viren im Pool erfassen können.
2.) Die Therapie von HCV und AIDS-Kranken erfordert das hochsensitive Monitoring der Viruskonzentration im Blut, da diese Viren in sehr geringer Kopienzahl (< 10 Kopien/ml) trotz Therapie persistieren können und deren Nachweis für die Therapiefortsetzung entscheidend ist.

Versuche, das Probenvolumen zu erhöhen, schlagen zumeist aufgrund der begrenzten Bindungskapazität und/oder der Bindungsspezifität der eingesetzten Festphasen fehl.
Als Alternative werden gegenwärtig Vorkonzentrierungsverfahren benutzt, um eine hohe Sensitivität zu erlangen. Zellen oder Viren aus einer Probe werden über Filtration, Ultrahochzentrifugation oder über Affinitätsbindung an einen Antikörper-Festphasen-Komplex aus der Probe angereichert. Nach diesem Konzentrierungsschritt wird die DNA oder RNA extrahiert und in geeigneter Weise für die Nachweisreaktion aufgereinigt. Diese bekannten Konzentrierungsverfahren sind nicht nur arbeitsaufwendig und kostspielig sondern auch nicht automatisiert und zudem mit der potentiellen Gefahr von Verlusten, Kreuzkontaminationen und Probenverwechslungen behaftet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren insbesondere aus großvolumigen biologischen Proben zur Verfügung zu stellen, das kein Vorkonzentrierungsverfahren benötigt und die bislang bekannten Methoden insbesondere in der Empfindlichkeit und Effektivität der Isolierung übertrifft.
Es wurde gefunden, dass das aus WO 99/40098 bekannte Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren durch Bindung an feste Trägermaterialien unter sauren Pufferbedingungen erheblich verbessert werden kann, indem dem Waschpuffer eine Proteinase zugesetzt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Isolierung von Nukleinsäuren aus großvolumigen Proben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

a) Bereitstellen einer flüssigen Probe, die Nukleinsäuren enthält;
b) Bereitstellen eines Trägermaterials aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material;
c) Vermischen der Probe aus Schritt a) mit einem Bindepuffer, so dass der pH-Wert des Gemisches unter 7 liegt;
d) Behandeln der mittels eines Bindungspuffers angesäuerten Probe aus Schritt c) mit dem Trägermaterial aus Schritt b), wobei die Nukleinsäuren an das Trägermaterial gebunden werden;
e) Abtrennen des Trägermaterials mit den gebundenen Nukleinsäuren von dem Rest der Probe und dem Bindungspuffer;
f) Waschen des Trägermaterials mit einem Waschpuffer der zumindest eine Komponente enthält, die Proteine abbaut;
g) Elution der in Schritt d) gebundenen Nukleinsäuren von dem Trägermaterial mit einem alkalischen Elutionspufter.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe aus zellfreier Körperflüssigkeit.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente, wie ein nicht-ionisches Detergenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens ein Sulfatsalz, wie z.B. Ammoniumsulfat, Kobaltsulfat oder Zinksulfat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe ein Volumen von über 2 ml.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die in Schritt a) bereitgestellte Probe aus einer Mischung von mindestens 10 Einzelproben. Typischerweise werden dazu Aliquots aus jeder Einzelprobe entnommen und diese gemischt. Genauso können die Einzelproben vollständig gemischt werden und aus diesem Gemisch die in Schritt a) bereitzustellende Probe entnommen werden. Die Vorgehensweise des Mischens mehrerer Einzelproben, d.h. die Bildung von Proben-Pools, ist insbesondere für Anwendungen in Blutbanken vorteilhaft, da sie die Möglichkeit bietet, zumeist automatisch z.B. 10 bis 100 Einzelproben oder Aliquots der Einzelproben vor der Nukleinsäureisolierung zu mischen und auf einmal zu testen.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Volumen des Elutionspuffers in Schritt g) weniger als 1/10 des Volumens der in Schritt a) bereitgestellten Probe.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt f) und oder Schritt g) eine oder mehrere Kugeln zur Unterstützung der Resuspension des Trägermaterials zugegeben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zumindest enthaltend ein Trägermaterial aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung und zum Nachweis von viralen Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei so empfindlich, dass Proben eingesetzt werden können, die Viren in einer Kopienzahl von weniger als 200 pro ml Probe, besonders bevorzugt in einer Kopienzahl von weniger als 50 pro ml Probe enthalten.
Nähere Angaben zu den 1 bis 4 finden sich in den Beispielen 3 bis 6.
Flüssige Proben im Sinne der vorliegenden Erfindung sind z.B. Pufferlösungen und Homogenate oder komplexe biologische Flüssigkeiten, bevorzugt Proben biologischen Ursprungs, insbesondere humane und tierische Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Harn, Feces und Liquor. Besonders bevorzugt sind zellfreie Körperflüssigkeiten, wie Plasma, Serum, Liquor oder Harn.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut geeignet zur Isolierung von Nukleinsäuren aus großvolumigen Proben, d.h. nicht nur aus Proben zwischen 50 μl und 1 bis 2 ml, sondern insbesondere aus Proben mit einem Volumen von über 2 ml, vor allem aus Proben mit einem Volumen zwischen 2 und 10 ml.
Als Festphase bzw. Trägermaterial kann erfindungsgemäß ein Material verwendet werden, das an der Oberfläche Hydroxyl-Gruppen trägt, insbesondere anorganische oxidische Materialien. Geeignete Materialien sind z.B. Silikagel, Silikate, Metalloxide wie Eisenhydroxide, Hydroxylapatit oder Glas. Bevorzugt sind Materialien, die an der Oberfläche Si-OH Gruppen tragen. Die Trägermaterialien können porös oder unporös sein, in Form von z.B. Partikeln, Fasern, Membranen, Filtern oder entsprechend modifizierten Gefässwänden. Partikuläre Materialien werden im allgemeinen bevorzugt, da sie eine größere Bindungskapazität und -kinetik insbesondere in größeren Probenvolumina aufweisen. Besonders bevorzugt werden magnetisierbare Partikel, da deren Abtrennung aus einer Suspension einfach zu automatisieren ist. Eine erfindungsgemäß besonders gut geeignete Festphase sind magnetisierbare Silika-Partikel, wie MagPrep^® Silica Partikel (Merck KGaA, Darmstadt).
Als Äquilibrierungspuffer für das Trägermaterial wird vorzugsweise einer der im folgenden genannten Bindepuffer verwendet.
Komponenten, die Proteine abbauen, sind erfindungsgemäß insbesondere Enzyme wie Proteinasen, besonders bevorzugt Proteinase K.
Nukleinsäuren sind erfindungsgemäß Ribonukleinsäuren (RNA) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNA), wie z.B. genomische DNA oder RNA, insbesondere virale genomische DNA und/oder RNA.
Die Bindung der Nukleinsäuren aus der Probe an das Trägermaterial erfolgt durch einfaches Absenken des pH-Wertes auf unter pH 7, bevorzugt unter pH 6. Dazu wird ein Bindepuffer verwendet, der einen pH-Bereich von 1 bis 6, vorzugsweise von 3 bis 5, aufrechterhalten kann. Geeignete Puffer sind z.B. Formiat-, Acetat-, Citratpuffer oder andere Puffersysteme, die in dem genannten pH-Bereich ausreichende Pufferkapazität besitzen.
Die Pufferkonzentration wird je nach Volumen und Pufferkapazität der zu untersuchenden Probenflüssigkeit ausgewählt. Vorzugsweise wird ein Bindepuffer mit einer Konzentration von 100–200 mM verwendet, der einen pH-Wert zwischen 4 und 5 hat, z.B. ein Puffer aus Essigsäure, der mit Natronlauge, Kalilauge oder mit Tris-Base auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 eingestellt wurde. Dem Bindepuffer können Nukleaseinhibitoren zugesetzt werden; geeignete Nukleaseinhibitoren sind dem Fachmann bekannt.
Ein Bindepuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung enthält weder ionische Detergenzien noch andere Ionen in hohen Konzentrationen, so dass während der Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial keine chaotropen Bedingungen vorliegen. Bevorzugt enthält der Bindepuffer keine ionischen Detergenzien oder chaotropen Substanzen. Sollten dennoch derartige Verbindungen enthalten sein, dann wird die Konzentration der ionischen Detergenzien und chaotropen Substanzen so gewählt, dass das Gemisch aus Probe und Bindepuffer weder ionische Detergenzien noch chaotrope Substanzen in Konzentrationen > 500 mM, bevorzugt > 200 mM enthält. Besonders bevorzugt enthält dazu der Bindepuffer weder ionische Detergenzien noch chaotrope Substanzen in Konzentrationen > 500 mM, bevorzugt > 200 mM.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente, wie z.B. nicht-ionische Detergezien. Bevorzugt werden als lysierende Komponente Triton^®, Tween^®, NP 40 oder Mischungen davon eingesetzt.
Der Zusatz der lysierenden Komponente ist vor allem von Bedeutung, wenn die Probe zuvor noch keinen lysierenden Bedingungen unterworfen worden ist und daher beispielsweise noch intakte Viren etc. enthalten kann. Um eine quantitative Isolierung der gesamten viralen Nukleinsäuren zu ermöglichen, müssen daher durch Zugabe der lysierenden Komponente die viralen Partikel zunächst zerstört werden. Die benötigte Menge an lysierender Komponente ist dem Fachmann bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer erfindungsgemäß zusätzlich ein oder mehrere Sulfatsalze, wie Kobaltsulfat, Zinksulfat oder bevorzugt Ammoniumsulfat. Es wurde gefunden, dass dieser Zusatz die Bindung und somit auch die Isolierung von insbesondere RNA verbessert. Bevorzugt liegt die Konzentration der Sulfatsalze im Gemisch von Bindepuffer und Probe unter 300 mM. Besonders bevorzugt enthält der Bindepuffer zwischen 100 und 200 mM Ammoniumsulfat.
Das Trägermaterial mit den daran gebundenen Nukleinsäuren wird dann in einem nächsten Schritt mit mindestens einem Waschpuffer mindestens einmal gewaschen. Der pH-Wert der Waschpuffer liegt typischerweise zwischen 4 und 7, vorzugsweise zwischen 4,5 und 6,5. Die Pufferkonzen tration kann geringer sein als beim Bindepuffer; sie sollte im Bereich von 1 bis 50 mM, vorzugsweise bei etwa 5 bis 15 mM liegen. Gegebenenfalls kann einer der Waschpuffer Zusatzstoffe, beispielsweise Chelatbildner wie EDTA, chaotrope Substanzen und/oder nichtionische Detergenzien enthalten. Die erfindungsgemäß offenbarten Waschpuffer eluieren die gebundenen Nukleinsäuren nicht, selbst wenn diese unter Zusatz von chaotropen Substanzen an das Trägermaterial adsorbiert wurden. In einem Waschpuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung sind Zusätze von organischen Lösungsmitteln und/oder chaotropen Substanzen nicht notwendig, um die vorzeitige Elution von Nukleinsäuren zu vermeiden. Wesentlicher Bestandteil des Waschpuffers ist erfindungsgemäß mindestens eine Komponente, die Proteine abbaut, wie z.B. eine Proteinase. Es wurde gefunden, dass durch den Zusatz einer solchen Komponente zum Waschpuffer die Effektivität der Nukleinsäureisolierung stark verbessert werden kann. Erstaunlicherweise bewirkt der Zusatz von Proteinasen zum Bindepuffer keinen derartigen Effekt. Besonders bevorzugt wird dem Waschpuffer Proteinase K zugesetzt.
Typischerweise enthält der Waschpuffer 0,1 bis 4 mg/ml eines Enzyms wie Proteinase K, besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 1 mg/ml.
Die Elution, d.h. das Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren vom Trägermaterial, erfolgt dann durch eine einfache Erhöhung des pH-Wertes auf über 7,5. Der dazu verwendete Elutionspufter sollte einen pH-Bereich von 7,5 bis 9, vorzugsweise 8 bis 8,5 aufrechterhalten. Geeignete Puffer sind z.B. Tris-HCl-Puffer, Tricin, Bicin und andere Puffer, die in diesem pH-Bereich puffern, vorzugsweise Tris/HCl. Die Pufferkonzentration sollte 5 bis 10 mM, vorzugsweise etwa 8 bis 10 mM betragen. Gegebenenfalls kann der Elutionspufter Chelatbildner wie EDTA und/oder andere Inhibitoren von Nukleasen enthalten.
In einer bevorzugtem Ausführungsform beträgt das Volumen des Elutionspuffers weniger als 1/10 des Volumens der ursprünglich eingesetzten flüssigen Probe. Auf diese Weise werden die isolierten Nukleinsäuren zugleich aufkonzentriert.
Die eluierten Nukleinsäuren sind direkt, ohne weitere Reinigungsschritte, für molekularbiologische Anwendungen, wie z.B. für Ampifikationsreaktionen, einsetzbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren wird typischerweise so durchgeführt, daß z.B. ein die Nukleinsäuren enthaltendes Plasma mit dem Bindepuffer versetzt und in ein Probenröhrchen gegeben wird. Das Probenröhrchen kann bereits das bevorzugte Trägermaterial enthalten. Genauso kann die Zugabe des Trägermaterials nach dem Einfüllen der flüssigen Probe erfolgen. Nach einer Inkubationszeit von typischerweise 1 bis 10 Minuten wird der Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplex vom Überstand abgetrennt und der Überstand verworfen. Mit einem Waschpuffer wird resuspendiert, erneut abgetrennt und der Überstand erneut verworfen. Es können auch mehrere dieser Waschschritte gegebenenfalls mit Waschpuffern unterschiedlicher Zusammensetzung nacheinander ausgeführt werden. Dementsprechend kann eine erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung, d.h. ein Test-Kit, auch mehrere Waschpuffer enthalten. Schließlich wird der Elutionspuffer zum Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplex hinzugefügt und nach Abtrennung des Trägermaterials der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand in ein neues leeres Röhrchen überführt. Dieses Eluat kann dann direkt für weitere Analysenmethoden (PCR, NASBA) eingesetzt werden. Bei der Verwendung von z.B. entsprechenden magnetischen Partikeln kann die zur Abtrennung des Überstands häufig eingesetzte Zentrifugation durch das Anlegen eines magnetischen Felds ersetzt werden.
Für ein effektives Waschen des Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplexes und für eine effektive Elution der Nukleinsäuren vom Trägermaterial, ist es bei der Verwendung von partikulären Trägermaterialien wichtig, dass das Trägermaterial nach der Abtrennung homogen in den Puffern resuspendiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden bei Zugabe des Waschpuffers und/oder des Elutionspuffers daher zusätzlich ein oder bevorzugt mehrere Kugeln zugegeben. Diese Kugeln bestehen aus in den Puffern inerten, festen Materialien, bevorzugt aus Glas, einem harten Kunststoff oder Metall. Das Material der Kugeln geht keine Wechselwirkung mit Nukleinsäuren ein. Die Kugeln sind größer als die Partikel des Trägermaterials, bevorzugt zwischen 100 und 1000-fach größer. Diese Kugeln bewirken bei sanftem Schütteln des Reaktionsgefäßes eine homogene Verteilung des Trägermaterials in der Pufferlösung und dieser Prozesschritt ist sehr einfach zu automatisieren. Insbesondere wird das Trägermaterial effektiv von der Gefäßwandung gelöst und Verklumpungen werden aufgelöst. Als besonders effektiv hat sich die Zugabe der Kugelnbei der Verwendung magnetisierbarer Trägermaterialien und in Automationsprozessen erwiesen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Test-Kit enthält zumindest eine Festphase, bevorzugt eine Silika-Festphase, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut.
Weitere optionale Bestandteile sind z.B.:

– einen oder mehrere weitere Waschpuffer
– ein Elutionspufter zum Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren vom Trägermaterial
– ein oder bevorzugt mehrere Kugeln in geeigneter Darreichungsform, z.B. in Puffer oder Wasser, die zur effektiven Resuspension des Trägermaterials in Wasch- und/oder Elutionspuffer benutzt werden
– eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens

Die bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens angeführten bevorzugten Zusammensetzungen der Reagenzien gelten auch für die Bestandteile des erfindungemäßen Test-Kits.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, mit relativ einfachen und kostengünstigen Handhabungen eine geringe Anzahl von viralen Genomkopien aus einem großen Volumen – wie zum Beispiel einem Pool von Spenderplasmen – zu extrahieren und anzureichern, so daß die nachgeschaltete Nachweisreaktion gesicherte Ergebnisse liefert. Der gesamte Prozess kann mit Hilfe von magnetischen Silika Partikeln automatisiert in weniger als einer Stunde aus vielen Primärröhrchen parallel in einem Hochdurchsatz-Verfahren hochreine virale Nukleinsäuren extrahieren und ersetzt das Vorkonzentrierungsverfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet erstmals die Möglichkeit, eine sehr geringe Kopienzahl (< 50 Kopien) von z.B. Viren in flüssigen Proben nachzuweisen. In Blutbanken werden häufig mehrere Einzelproben von Körperflüssigkeiten, wie Plasma oder Serum, zu sogenannten Proben-Pools vereinigt. Damit auch in diesem Probenpools geringe Kopienzahlen von Viren nachgewiesen werden können, ist es zumeist nicht ausreichend, eine Probe von 100 μl zu untersuchen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können nun auch Kopienzahlen von z.B. unter 50 Viren in großvolumigen Proben über 2 ml nachgewiesen werden. Zudem beträgt das Elutionsvolumen nach der Isolierung der Nukleinsäuren bevorzugt weniger als 1/10 des ursprünglich eingesetzten Probenvolumens, so dass zugleich eine große Verringerung des Probenvolumens und somit eine Aufkonzentrierung der Nukleinsäuren möglich ist.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiele
Beispiel 1) Basisprotokoll S für kleine Plasmaproben
1,5mg MagPrep^® Silica Partikel (Merck KGaA) werden in 900μl Bindepuffer TAAN (200mM Acetat-Tris pH 4.0, 0,5% NP40, 200mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Dieser Bindepuffer-Mix enthält zudem interne Kontroll-RNA und/oder -DNA.
100μl Plasmaprobe werden mit 900μl Bindepuffer-Mix homogen gemischt. Nach 1–10 Minuten Inkubation wird magnetisiert und der Überstand sorgfältig abgetrennt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel mit 500μl Waschpuffer (10mM Tris-HCl pH 6.6; 0,5mg/ml Proteinase K) resuspendiert und bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Magnetisierung wird der Überstand sorgfältig entfernt und wieder mit 500μl Waschpuffer versetzt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel resuspendiert, magnetisiert und der Überstand verworfen. Die Elution der Nukleinsäuren von den Partikeln erfolgt nach 10-minütiger Inkubation in 100μl Elutionspufter (10mM Tris/HCl pH 8,5) bei 80°C. Nach Magnetisierung wird das Eluat in ein neues, steriles Gefäß transferiert.
Beispiel 2) Basisprotokoll XL für Pools und großvolumige Einzelproben
Es wird ein Plasmapool hergestellt, in dem von 24 Plasmaproben jeweils 0,1ml entnommen und in einem geeigneten Probenröhrchen vereinigt werden. Eine der Plasmaproben enthält Virus-Partikel.
7,5mg MagPrep^® Silica Partikel werden in 7,6ml Bindepuffer TA (200mM Acetat-Tris pH 4.0, 0,5% NP40, 200mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Der Bindepuffer TA enthält zudem interne Kontroll-RNA und/oder -DNA. Die 2,4ml des Plasmapools werden mit 7,6ml Bindepuffer-Mix homogen gemischt. Nach 1–10 Minuten Inkubation wird magnetisiert und der Überstand sorgfältig abgetrennt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel mit 5ml Waschpuffer (10mM Tris-HCl pH 6.6; 0,5mg/ml Proteinase K) resuspendiert und bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Magnetisierung wird der Überstand sorgfältig entfernt und wieder mit 5ml Waschpuffer versetzt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel resuspendiert, magnetisiert und der Überstand verworfen. Die Elution der Nukleinsäuren von den Partikeln erfolgt nach 10-minütiger Inkubation in 100μl Elutionspufter (10mM Tris/HCl pH 8,5) bei 80°C. Nach Magnetisierung wird das Eluat in ein neues, steriles Gefäß transferiert.
Die Nukleinsäuren der gewonnenen Eluate werden durch (RT)-PCR und geeignete Gensonden amplifiziert und nachgewiesen (z.B. mit Hilfe eines Thermocyclers wie des ABI Prism 7000 (TagMan^®) der Firma Applied Biosystems oder des LightCycler^® der Firma Roche).
Beispiel 3) Einfluss von grossen Probenvolumina auf die Sensitivität
Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in 1 graphisch dargestellt. Dabei zeigt die Y-Achse die Ausbeute der Kopienzahl der Viren in % an. Auf der X-Achse sind die 4 im folgenden erläuterten Ansätze aufgeführt.
100μl Virus-positives Plasma (versetzt mit 600 Kopien HIV: -gestreifte Balken- und 200 Kopien HBV:-gepunktete Balken – in 1) wurden entweder direkt extrahiert (Probe A und Q) oder wurden mit 2,3 ml (Probe 24P) bzw. 4,7 ml (Probe 48P) virusfreiem Plasma gemischt und das gesamte Großvolumen extrahiert. Für Probe A wurde das Basisprotokoll S gemäß Beispiel 1, für die Proben 24P und 48P das Basisprotokol XL gemäß Beispiel 2 angewendet. Probe Q wurde entsprechend dem QIA amp Viral RNA Extraction Kit der Firma QIAGEN extrahiert. Die für Probe A gefundenen Sensitivitäten (Kopienzahl in den Eluaten detektiert in der quantitativen TagMan^® PCR) wurde gleich 100% gesetzt.
Wie die 1 zeigt, können trotz 23facher bzw. 47facher Verdünnung der Virus-positiven Probe mit Virus-freiem Plasma die wenigen viralen DNA-/RNA-Molküle aus dem Pool fast ohne Verlust quantitativ nachgewiesen werden.
Beispiel 4) Auswirkung von Sulfat-Salzen auf die Isolierung von RNA
100μl von HBV- und HIV-positivem Plasma (jeweils ca. 1000 Kopien) werden mit MagPrep^® Silica Partikeln und 900μl eines Bindepuffers inkubiert, der entweder kein Ammoniumsulfat (Probe #1) oder 200mM Ammoniumsulfat (Probe # 2) enthält. Die weitere Isolierung erfolgt gemäß Beispiel 1.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in 2 dargestellt. Auf der Y-Achse ist die Ausbeute an Nukleinsäuren in % angegeben. Die Bindung von 100% entspricht dabei der Signalstärke der quantitativen Amplifikation von 1000 Molekülen gereinigter HBV-DNA oder HIV-RNA. Auf der X-Achse sind die oben erläuterten Ansätze 1 und 2 aufgetragen. (HBV: schraffierter Balken; HIV: grauer Balken)
Es zeigt sich deutlich, dass die Ausbeute von RNA-Molekülen durch Zugabe von Ammoniumsulfat zum Bindepuffer bis zur gewünschten Sensititvität verbessert werden kann.
Beispiel 5) Auswirkung der Zugabe von Proteinase K
Vier Plasmaproben a 100μl werden bereitgestellt. Eine Plasmaprobe wird mit Proteinase K bei einer Konzentration von 0.5mg/ml für 4 Stunden vorinkubiert (Probe#1). Dann werden alle vier Plasmaproben mit Viruspartikeln (HIV und HBV; jeweils 1000 Kopien/ml) versetzt.
Die vier Proben werden analog des Basisprotokolls S (Beispiel 1) extrahiert, wobei bei Probe #1, #2 und #3 der Waschpuffer keine Proteinase K enthält. Bei Probe #3 werden dem Bindepuffer 0,5mg/ml Proteinase K zugesetzt. Bei Probe #4 werden dem Waschpuffer 0,5mg/ml Proteinase K zugesetzt.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in 3 dargestellt. Auf der Y-Achse ist die Ausbeute an Nukleinsäuren in % angegeben. Die für Probe #3 gefundene Sensitivität (Kopienzahl in den Eluaten detektiert in der quantitativen TagMan^® PCR) ist dabei gleich 100% gesetzt. Auf der X-Achse sind die vier oben erläuterten Ansätze 1 bis 4 aufgetragen.
Die Ergebnisse zeigen, dass nur bei Zugabe der Proteinase zum Waschpuffer die gewünschte Effektivität der Isolierung der Nukleinsäuren erzielt werden kann.
Die Zugabe von Proteinase K zum Bindepuffer oder die Vorinkubation der Probe mit Proteinase K zeigt keine wesentliche Verbesserung.
Beispiel 6) optimale Konzentration des Trägermaterials bei großem und kleinem Probenvolumen
Je 100μl HIV-positives Plasma (ca. 1000 copies) wird entweder gemäß Basisprotokoll S (Beispiel 1) extrahiert (gestreifte Balken) oder mit 2,3 ml virus-freiem Plasma gemischt und gemäß des Basisprotokolls XL (Beispiel 2) extrahiert (graue Balken). Als Trägermaterial werden MagPrep^® Silica Partikel eingesetzt. Die Menge des Trägermaterials wird variiert. Die jeweils pro ml Plasma eingesetzte Menge ist in 4 auf der X-Achse angegeben.
Auf der Y-Achse ist die Ausbeute an isolierten Nukleinsäuren in % angegeben. Die Ausbeute für 15mg/ml wurde gleich 100% gesetzt.
Die Ergebnisse zeigen, dass beim Einsatz großer Probenvolumina über 2 ml die Menge des Trägermaterials im Verhältnis zu der bei kleinen Probenvolumina benötigten Menge reduziert werden kann. Weiterhin wird deutlich, dass die Menge des eingesetzten Trägermaterials bei großen Probenvolumina weniger Einfluß auf die Ausbeute hat. Eine geringere Konzentration an Trägermaterial von etwa 2 bis 3 mg/ml führt zu leicht besseren Ausbeuten als die doppelte Menge von ca. 6 mg/ml.

Claims

Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer flüssigen Probe, die Nukleinsäuren enthält; b) Bereitstellen eines Trägermaterials aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material; c) Vermischen der Probe aus Schritt a) mit einem Bindepuffer, so dass der pH-Wert des Gemisches unter 7 liegt; d) Behandeln der mittels eines Bindungspuffers angesäuerten Probe aus Schritt c) mit dem Trägermaterial aus Schritt b), wobei die Nukleinsäuren an das Trägermaterial gebunden werden; e) Abtrennen des Trägermaterials mit den gebundenen Nukleinsäuren von dem Rest der Probe und dem Bindungspuffer; f) Waschen des Trägermaterials mit einem Waschpuffer, der zumindest eine Komponente enthält, die Proteine abbaut; g) Elution der in Schritt d) gebundenen Nukleinsäuren von dem Trägermaterial mit einem alkalischen Elutionspuffer.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe aus zellfreier Körperflüssigkeit besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindepuffer zusätzlich mindestens ein Sulfatsalz enthält.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe ein Volumen von über 2 ml hat.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe aus einer Mischung von mindestens 10 Einzelproben besteht.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Elutionspuffers in Schritt g) weniger als 1/10 des Volumens der in Schritt a) bereitgestellten Probe beträgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt f) und/oder Schritt g) eine oder mehrere Kugeln zur Unterstützung der Resuspension des Trägermaterials zugegeben werden.
Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 zumindest enthaltend ein Trägermaterial aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 8 zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten.