EP1570077A1 - Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren

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Publication number
EP1570077A1
EP1570077A1 EP03779999A EP03779999A EP1570077A1 EP 1570077 A1 EP1570077 A1 EP 1570077A1 EP 03779999 A EP03779999 A EP 03779999A EP 03779999 A EP03779999 A EP 03779999A EP 1570077 A1 EP1570077 A1 EP 1570077A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acids
buffer
sample
carrier material
binding buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP03779999A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Uwe Michelsen
Willi Roth
Kai Hourfar
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1570077A1 publication Critical patent/EP1570077A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention relates to a process for the purification or isolation of nucleic acids, in particular from large-volume liquid samples using inorganic oxidic carrier materials in combination with suitable buffer systems for acidic binding and basic elution of the nucleic acids.
  • the effectiveness of the purification could be increased considerably compared to known processes by adding a proteinase to the washing buffer.
  • nucleic acids from complex biological starting materials, such as body fluids, is of great importance e.g. for the detection of viral diseases.
  • nucleic acid amplification techniques e.g. Polymerase chain reaction (PCR), branched DNA detection (bDNA) or nucleic acid sequence based amplification (NASBA) are used.
  • PCR Polymerase chain reaction
  • bDNA branched DNA detection
  • NASBA nucleic acid sequence based amplification
  • HBV Hepatitis B or C virus
  • HCV human immunodeficiency virus
  • DNA or RNA viral nucleic acids
  • the detection limit of the commercially available test systems is approximately 100 to 400 nucleic acid copies per ml of plasma. Most test systems are also only for one virus type and are designed for the use of relatively small sample volumes (100-500 l plasma).
  • preconcentration methods are currently used to achieve high sensitivity.
  • Cells or viruses from a sample are enriched by filtration, ultra-high centrifugation or by affinity binding to an antibody-solid phase complex from the sample.
  • the DNA or RNA is extracted and suitably purified for the detection reaction.
  • concentration processes are not only labor-intensive and costly, they are also not automated and also involve the potential risk of losses, cross-contamination and sample mix-ups.
  • the present invention therefore relates to a method for isolating nucleic acids from liquid samples, characterized by the following method steps: a) providing a liquid sample which contains nucleic acids; b) providing a carrier material made of an inorganic hydroxyl-containing oxidic material; c) mixing the sample from step a) with a binding buffer so that the pH of the mixture is below 7; d) treating the sample from step c) acidified by means of a binding buffer with the carrier material from step b), the nucleic acids being bound to the carrier material; e) separating the carrier material with the bound nucleic acids from the rest of the sample and the binding buffer; f) washing the carrier material with a washing buffer which contains at least one component which degrades proteins; g) Elution of the nucleic acids bound in step d) from the support material with an alkaline elution buffer.
  • the liquid sample provided in step a) consists of cell-free body fluid.
  • the binding buffer additionally contains at least one lysing component, such as a non-ionic detergent.
  • the binding buffer additionally contains at least one sulfate salt, e.g. Ammonium sulfate, potassium sulfate, cobalt sulfate or zinc sulfate.
  • sulfate salt e.g. Ammonium sulfate, potassium sulfate, cobalt sulfate or zinc sulfate.
  • the liquid sample provided in step a) has a volume of over 2 ml.
  • the sample provided in step a) consists of a mixture of at least 10 individual samples. Typically, aliquots are taken from each individual sample and mixed. In the same way, the individual samples can be completely mixed and the sample to be provided in step a) can be taken from this mixture.
  • the procedure of mixing several individual samples, ie the formation of sample pools, is particularly advantageous for applications in blood banks, since it offers the possibility of automatically mixing and testing, for example, usually 10 to 100 individual samples or aliquots of the individual samples before nucleic acid isolation ,
  • the volume of the elution buffer in step g) is less than 1/10 of the volume of the sample provided in step a).
  • one or more balls are added in step f) and or step g) to support the resuspension of the carrier material.
  • the present invention also relates to a test kit for carrying out the method according to the invention at least comprising a carrier material made from an inorganic hydroxyl-containing oxidic material, a binding buffer and a washing buffer which contains at least one component which degrades proteins.
  • the present invention also relates to the use of the method according to the invention for the isolation and detection of viral nucleic acids from body fluids.
  • the method according to the invention is so sensitive that samples can be used which contain viruses in a copy number of less than 200 per ml sample, particularly preferably in a copy number of less than 50 per ml sample. Further information on Figures 1 to 4 can be found in Examples 3 to 6.
  • Liquid samples in the sense of the present invention are e.g. Buffer solutions and homogenates or complex biological fluids, preferably samples of biological origin, in particular human and animal body fluids such as blood, plasma, serum, urine, feces and liquor. Cell-free body fluids such as plasma, serum, cerebrospinal fluid or urine are particularly preferred.
  • the method according to the invention is particularly well suited for the isolation of nucleic acids from large-volume samples, i.e. not only from samples between 50 ⁇ l and 1 to 2 ml, but in particular from samples with a volume of more than 2 ml, especially from samples with a volume between 2 and 10 ml.
  • a material which carries hydroxyl groups on the surface in particular inorganic oxidic materials, can be used as the solid phase or carrier material.
  • Suitable materials are, for example, silica gel, silicates, metal oxides such as iron hydroxides, hydroxyapatite or glass. Materials which have Si-OH groups on the surface are preferred.
  • the carrier materials can be porous or non-porous, in the form of, for example, particles, fibers, membranes, filters or appropriately modified vessel walls. Particulate materials are generally preferred because they have greater binding capacity and kinetics, particularly in larger sample volumes. Magnetizable particles are particularly preferred since their separation from a suspension is easy to automate.
  • a according to the invention particularly suitable solid phase is magnetizable silica particles such as silica particles MagPrep ® (Merck KGaA, Darmstadt).
  • silica particles MagPrep ® Merck KGaA, Darmstadt.
  • One of the binding buffers mentioned below is preferably used as the equilibration buffer for the carrier material.
  • components that break down proteins are, in particular, enzymes such as proteinases, particularly preferably proteinase K.
  • nucleic acids are ribonucleic acids (RNA) or deoxyribonucleic acids (DNA), such as e.g. genomic DNA or RNA, especially viral genomic DNA and / or RNA.
  • RNA ribonucleic acids
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • the nucleic acids from the sample are bound to the carrier material by simply lowering the pH to below pH 7, preferably below pH 6.
  • a binding buffer which has a pH range from 1 to 6, preferably from 3 to 5. can maintain.
  • Suitable buffers are e.g. Formate, acetate, citrate buffers or other buffer systems that have sufficient buffer capacity in the pH range mentioned.
  • the buffer concentration is selected depending on the volume and buffer capacity of the sample liquid to be examined.
  • a binding buffer with a concentration of 100-200 mM which has a pH between 4 and 5, e.g. a buffer of acetic acid, which was adjusted to a pH between 4 and 5 with sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution or with Tris base.
  • Nuclease inhibitors can be added to the binding buffer; suitable nuclease inhibitors are known to the person skilled in the art.
  • a binding buffer according to the present invention contains neither ionic detergents nor other ions in high concentrations, so that there are no chaotropic conditions during the binding of the nucleic acids to the carrier material.
  • the binding buffer preferably contains no ionic detergents or chaotropic substances. If such connections are nevertheless contained, then the Concentration of the ionic detergents and chaotropic substances is selected such that the mixture of sample and binding buffer contains neither ionic detergents nor chaotropic substances in concentrations> 500 mM, preferably> 200 mM.
  • the binding buffer particularly preferably contains neither ionic detergents nor chaotropic substances in concentrations> 500 mM, preferably> 200 mM.
  • the binding buffer additionally contains at least one lysing component, such as, for example, nonionic detergents.
  • NP are preferred as the lysing component Triton ®, Tween ®, used 40 or mixtures thereof.
  • the addition of the lysing component is particularly important if the sample has not previously been subjected to any lysing conditions and can therefore, for example, still contain intact viruses etc.
  • the viral particles In order to enable quantitative isolation of the entire viral nucleic acids, the viral particles must first be destroyed by adding the lysing component. The amount of lysing component required is known to the person skilled in the art.
  • the binding buffer additionally contains one or more sulfate salts, such as cobalt sulfate, zinc sulfate or preferably ammonium sulfate or potassium sulfate. It has been found that this additive improves the binding and thus also the isolation of RNA in particular.
  • concentration of the sulfate salts in the mixture of binding buffer and sample is preferably below 300 mM.
  • the binding buffer particularly preferably contains between 100 and 200 mM ammonium sulfate.
  • the carrier material with the nucleic acids bound to it is then washed at least once in a next step with at least one washing buffer.
  • the pH value of the wash buffer is typically between 4 and 7, preferably between 4.5 and 6.5.
  • the buffer concentration can be lower than with the binding buffer; it should be in the range of 1 to 50 mM, preferably about 5 to 15 mM.
  • one of the washing buffers can contain additives, for example chelating agents such as EDTA, chaotropic substances and / or nonionic detergents.
  • the washing buffers disclosed according to the invention do not elute the bound nucleic acids, even if they have been adsorbed onto the carrier material with the addition of chaotropic substances.
  • an essential component of the washing buffer is at least one component that degrades proteins, such as a proteinase. It has been found that the effectiveness of nucleic acid isolation can be greatly improved by adding such a component to the washing buffer. Proteinase K is particularly preferably added to the washing buffer.
  • the wash buffer contains 0.1 to
  • an enzyme such as Proteinase K, particularly preferably between 0.2 and 1 mg / ml.
  • the elution i.e. the detachment of the bound nucleic acids from the carrier material then takes place by simply increasing the pH to above 7.5.
  • the elution buffer used for this purpose should maintain a pH range of 7.5 to 9, preferably 8 to 8.5.
  • Suitable buffers are e.g. Tris-HCl buffer, Tricin, Bicin and other buffers that buffer in this pH range, preferably Tris / HCl.
  • the buffer concentration should be used for this purpose.
  • the elution buffer can optionally contain chelating agents such as EDTA and / or other inhibitors of nucleases.
  • the volume of the elution buffer is less than 1/10 of the volume of the original used liquid sample. In this way, the isolated nucleic acids are simultaneously concentrated.
  • the eluted nucleic acids are directly, without further purification steps, for molecular biological applications, e.g. for amplification reactions, can be used.
  • the method according to the invention for the isolation and purification of nucleic acids is typically carried out in such a way that e.g. a plasma containing the nucleic acids is mixed with the binding buffer and placed in a sample tube.
  • the sample tube may already contain the preferred carrier material.
  • the carrier material can also be added after the liquid sample has been filled in. After an incubation period of typically 1 to 10 minutes, the carrier-nucleic acid complex is separated from the supernatant and the supernatant is discarded. It is resuspended with a washing buffer, separated again and the supernatant is discarded again.
  • washing steps can optionally be carried out in succession with washing buffers of different compositions. Accordingly, a reagent assembly according to the invention, i.e.
  • a test kit also containing several wash buffers.
  • the elution buffer is added to the support material-nucleic acid complex and, after the support material has been separated off, the supernatant containing the nucleic acids is transferred to a new empty tube.
  • This eluate can then be used directly for further analysis methods (PCR, NASBA).
  • PCR e.g. Corresponding magnetic particles
  • the centrifugation frequently used to remove the supernatant can be replaced by the application of a magnetic field.
  • the Carrier material is homogeneously resuspended in the buffers after separation.
  • one or more balls are therefore additionally added. These balls consist of solid materials which are inert in the buffers, preferably of glass, a hard plastic or metal. The material of the spheres does not interact with nucleic acids.
  • the balls are larger than the particles of the carrier material, preferably between 100 and 1000 times larger.
  • the present invention furthermore relates to a test kit for carrying out the method according to the invention.
  • the test kit contains at least one solid phase, preferably a silica solid phase, a binding buffer and a washing buffer, which contains at least one component that degrades proteins.
  • Other optional components include:
  • a suitable dosage form e.g. in buffer or water, which are used for effective resuspension of the carrier material in washing and / or elution buffer
  • the present invention makes it possible to extract and enrich a small number of viral genome copies from a large volume, such as a pool of donor plasmas, with relatively simple and inexpensive manipulations, so that the subsequent detection reaction provides reliable results.
  • a large volume such as a pool of donor plasmas
  • magnetic silica particles the entire process can automatically extract highly pure viral nucleic acids from many primary tubes in less than an hour in a high-throughput process and replaces the preconcentration process.
  • the method according to the invention opens up the possibility of using a very small number of copies ( ⁇ 50 copies) of e.g. Detect viruses in liquid samples.
  • a very small number of copies ( ⁇ 50 copies) of e.g. Detect viruses in liquid samples In blood banks, several individual samples of body fluids, such as plasma or serum, are often combined to form so-called sample pools. In order that small copy numbers of viruses can also be detected in this sample pool, it is usually not sufficient to examine a sample of 100 ⁇ l.
  • copy numbers of e.g. among 50 viruses can be detected in large-volume samples over 2 ml.
  • the elution volume after isolation of the nucleic acids is preferably less than 1/10 of the sample volume originally used, so that at the same time a large reduction in the sample volume and thus a concentration of the nucleic acids is possible.
  • MagPrep ® silica particles (Merck KGaA) are resuspended in 900 // I binding buffer TAAN (200mM acetate-Tris pH 4.0, 0.5% NP40, 200mM ammonium sulfate). This binding buffer mix also contains internal control RNA and / or DNA.
  • 100 ⁇ l plasma sample are mixed homogeneously with 900 / I binding buffer mix. After incubation for 1-10 minutes, magnetization is carried out and the supernatant is carefully separated. After removal of the magnetic field, the particles are resuspended with 500 I wash buffer (10mM Tris-HCl pH 6.6; 0.5mg / ml Proteinase K) and incubated for up to 10 minutes at room temperature.
  • 500 I wash buffer (10mM Tris-HCl pH 6.6; 0.5mg / ml Proteinase K)
  • a plasma pool is produced in which 0.1 ml of 24 plasma samples are taken and combined in a suitable sample tube.
  • One of the plasma samples contains virus particles.
  • 7.5 mg MagPrep ® silica particles are resuspended in 7.6 ml binding buffer TA (200mM acetate-Tris pH 4.0, 0.5% NP40, 200mM ammonium sulfate).
  • the binding buffer TA also contains internal control RNA and / or DNA.
  • the 2.4 ml of the plasma pool are mixed homogeneously with a 7.6 ml binding buffer mix. After incubation for 1-10 minutes, magnetization is carried out and the supernatant is carefully separated. After removal of the magnetic field, the particles are resuspended with 5 ml washing buffer (1 OmM Tris-HCl pH 6.6; 0.5 mg / ml Proteinase K) and incubated for up to 10 minutes at room temperature.
  • the supernatant is carefully removed and 5 ml of washing buffer are added again. After removing the magnetic field, the particles are resuspended, magnetized and the supernatant discarded.
  • the nucleic acids are eluted from the particles after 10 minutes of incubation in 10O / - / I elution buffer (10mM Tris / HCl pH 8.5) at 80 ° C. After magnetization, the eluate is transferred to a new, sterile vessel.
  • the nucleic acids of the eluates obtained are amplified by (RT) PCR and appropriate gene probes and detected (eg, using a thermal cycler such as the ABI Prism 7000 (TaqMan ®) manufactured by Applied Biosystems or the LightCycler ® from Roche).
  • the results of this example are shown graphically in Figure 1.
  • the Y axis shows the yield of the copy number of the viruses in%.
  • the 4 approaches explained below are listed on the X axis.
  • 100 / I virus-positive plasma (mixed with 600 copies of HIV: striped bars and 200 copies of HBV: dotted bars - in Figure 1) were either extracted directly (sample A and Q) or were treated with 2.3 ml (sample 24P) or 4.7 ml (sample 48P) virus-free plasma mixed and the entire large volume extracted.
  • sample A the basic protocol S according to example 1 was used
  • the samples 24P and 48P the basic protocol XL according to example 2 was used.
  • Sample Q was extracted in accordance with the QIA & Viral RNA Extraction Kit from QIAGEN. Found for sample A sensitivities (copy number in the eluates detected in quantitative TaqMan ® PCR) equal to 100% has been set.
  • Example # 1 Four 100 ⁇ l plasma samples are provided. A plasma sample is pre-incubated with Proteinase K at a concentration of 0.5mg / ml for 4 hours (Sample # 1). Then virus particles (HIV and HBV; 1000 copies / ml each) are added to all four plasma samples. The four samples are extracted analogously to basic protocol S (example 1), with the washing buffer containing no proteinase K in sample # 1, # 2 and # 3. In sample # 3, 0.5 mg / ml Proteinase K is added to the binding buffer. In sample # 4, 0.5 mg / ml Proteinase K is added to the wash buffer.
  • Each 100 / I HIV-positive plasma (approx. 1000 copies) is either extracted according to basic protocol S (example 1) (striped bars) or mixed with 2.3 ml virus-free plasma and extracted according to basic protocol XL (example 2) ( gray bars).
  • MagPrep ® silica particles are used as the carrier material. The amount of the carrier material is varied. The amount used per ml of plasma is shown in Figure 4 on the X axis.
  • the yield of isolated nucleic acids is given in% on the Y axis. The yield for 15 mg / ml was set to 100%.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen, insbesondere grossvolumigen Proben unter Verwendung eines anorganischen Trägermaterials. Die Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial erfolgt unter sauren Bedingungen, die Elution unter basischen Bedingungen. Die Ausbeute der isolierten Nukleinsäuren wird erfindungsgemäss stark erhöht, indem dem Waschpuffer eine Proteinase zugesetzt wird.

Description

Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere aus großvolumigen flüssigen Proben unter Einsatz anorganischer oxidischer Trägermaterialien in Kombination mit geeigneten Puffersystemen zur sauren Bindung und basischen Elution der Nukleinsäuren. Die Effektivität der Aufreinigung konnte gegenüber bekannten Verfahren durch Zugabe einer Proteinase zum Waschpuffer erheblich gesteigert werden.
Die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Startmateriaiien, wie Körperflüssigkeiten, ist von großer Bedeutung z.B. zum Nachweis viraler Erkrankungen.
Klassische Methoden für die Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Startmaterialen wie Blut oder Plasma beginnen mit der Lyse des biologischen Materials mittels eines Detergenz und/oder eines chaotropen Salzes. Diese Substanzen ermöglichen die Inaktivierung und Denaturierung von Proteinen und Enzymen. Nachfolgend werden mittels organischer Lösungsmittel wie z.B. Phenol und/oder Chloroform, Ethanolfällung und Zentrifugationsschritten die Nukleinsäuren gereinigt . Diese Methoden sind nicht nur sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig, sondern auch schwer zu automatisieren.
Modernere Methoden basieren auf dem Gebrauch von Festphasen bzw. Trägermaterialien. In US 5,234,809 wird eine Methode beschrieben, bei der die Nukleinsäuren in Gegenwart von chaotropen Agentien wie Guanidiniumsalzen an eine Silika Festphase gebunden werden. WO 99/40098 offenbart eine Methode, bei der die Nukleinsäuren unter sauren Pufferbedingungen an Silika Festphasen gebunden werden. Es besteht jedoch noch immer der Bedarf, Nukleinsäuren nicht nur schnell und einfach sondern auch quantitativ insbesondere aus großen Probenvolumina zu isolieren. Besonders effektive Verfahren werden vor allem dann benötigt, wenn die Probe biologischen Ursprungs ist und nur sehr wenige der nachzuweisenden Nukleinsäuren enthält. Ein Beispiel hierfür ist der Nachweis von viralen Nukleinsäuren in Körperflüssigkeiten, wie Plasma oder Blut.
Für den Nachweis der isolierten viralen Nukleinsäuren werden z.B. bekannte Nukleinsäureamplifikationstechniken, wie z.B. Polymerase- Kettenreaktion (PCR), branched-DNA Detection (bDNA) oder Nucleic Acid Sequence based Amplification (NASBA) verwendet.
Voraussetzung für einen erfolgreichen und sensitiven Nachweis viraler Partikel in Körperflüssigkeiten, wie z.B. Hepatitis B- oder C-Virus, (HBV, HCV) oder Humanes Immundefizienz Virus (HIV), über die genannten Nukleinsäureamplifikationstechniken ist die effiziente, quantitative Isolierung der viralen Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in möglichst reiner und nativer Form. Die Nachweisgrenze der kommerziell erhältlichen Testsysteme liegt bei etwa 100 bis 400 Nukleinsäure-Kopien pro ml Plasma. Die meisten Testsysteme sind zudem nur für einen Virustyp und auf den Einsatz von relativ kleinen Probenvolumina ausgerichtet (100-500 l Plasma).
Daraus ergibt sich z.B. für zwei wichtige Anwendungsfelder noch immer ein Problem aufgrund der zu geringen Empfindlichkeit der Nachweissysteme: 1.) Blutbanken, die durch hohe Probenaufkommen und Kostendruck bedingt sogenannte Mini-Pools bilden (aus bis zu 100 individuellen Spenderproben), müssen die potentiell aus einem einzelnen Serum herrührenden Viren im Pool erfassen können.
2.) Die Therapie von HCV und AIDS-Kranken erfordert das hochsensitive Monitoring der Viruskonzentration im Blut, da diese Viren in sehr geringer Kopienzahl (< 10 Kopien/ml) trotz Therapie persistieren können und deren Nachweis für die Therapiefortsetzung entscheidend ist.
Versuche, das Probenvolumen zu erhöhen, schlagen zumeist aufgrund der begrenzten Bindungskapazität und/oder der Bindungsspezifität der eingesetzten Festphasen fehl.
Als Alternative werden gegenwärtig Vorkonzentrierungsverfahren benutzt, um eine hohe Sensitivität zu erlangen. Zellen oder Viren aus einer Probe werden über Filtration, Ultrahochzentrifugation oder über Affinitätsbindung an einen Antikörper-Festphasen-Komplex aus der Probe angereichert. Nach diesem Konzentrierungsschritt wird die DNA oder RNA extrahiert und in geeigneterweise für die Nachweisreaktion aufgereinigt. Diese bekannten Konzentrierungsverfahren sind nicht nur arbeitsaufwendig und kostspielig sondern auch nicht automatisiert und zudem mit der potentiellen Gefahr von Verlusten, Kreuzkontaminationen und Probenverwechslungen behaftet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren insbesondere aus großvolumigen biologischen Proben zur Verfügung zu stellen, das kein Vorkonzentrierungsverfahren benötigt und die bislang bekannten Methoden insbesondere in der Empfindlichkeit und Effektivität der Isolierung übertrifft.
Es wurde gefunden, dass das aus WO 99/40098 bekannte Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren durch Bindung an feste Trägermaterialien unter sauren Pufferbedingungen erheblich verbessert werden kann, indem dem Waschpuffer eine Proteinase zugesetzt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Isolierung von Nukleinsäuren aus großvolumigen Proben. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer flüssigen Probe, die Nukleinsäuren enthält; b) Bereitstellen eines Trägermaterials aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material; c) Vermischen der Probe aus Schritt a) mit einem Bindepuffer, so dass der pH-Wert des Gemisches unter 7 liegt; d) Behandeln der mittels eines Bindungspuffers angesäuerten Probe aus Schritt c) mit dem Trägermaterial aus Schritt b), wobei die Nukleinsäuren an das Trägermaterial gebunden werden; e) Abtrennen des Trägermaterials mit den gebundenen Nukleinsäuren von dem Rest der Probe und dem Bindungspuffer; f) Waschen des Trägermaterials mit einem Waschpuffer der zumindest eine Komponente enthält, die Proteine abbaut; g) Elution der in Schritt d) gebundenen Nukleinsäuren von dem Trägermaterial mit einem alkalischen Elutionspuffer.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe aus zellfreier Körperflüssigkeit.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente, wie ein nicht-ionisches Detergenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens ein Sulfatsalz, wie z.B. Ammoniumsulfat, Kaliumsulfat, Kobaltsulfat oder Zinksulfat.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe ein Volumen von über 2 ml. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die in Schritt a) bereitgestellte Probe aus einer Mischung von mindestens 10 Einzelproben. Typischerweise werden dazu Aliquots aus jeder Einzelprobe entnommen und diese gemischt. Genauso können die Einzelproben vollständig gemischt werden und aus diesem Gemisch die in Schritt a) bereitzustellende Probe entnommen werden. Die Vorgehensweise des Mischens mehrerer Einzelproben, d.h. die Bildung von Proben-Pools, ist insbesondere für Anwendungen in Blutbanken vorteilhaft, da sie die Möglichkeit bietet, zumeist automatisch z.B. 10 bis 100 Einzelproben oder Aliquots der Einzelproben vor der Nukleinsäureisolierung zu mischen und auf einmal zu testen.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Volumen des Elutionspuffers in Schritt g) weniger als 1/10 des Volumens der in Schritt a) bereitgestellten Probe.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt f) und oder Schritt g) eine oder mehrere Kugeln zur Unterstützung der Resuspension des Trägermaterials zugegeben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zumindest enthaltend ein Trägermaterial aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung und zum Nachweis von viralen Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei so empfindlich, dass Proben eingesetzt werden können, die Viren in einer Kopienzahl von weniger als 200 pro ml Probe, besonders bevorzugt in einer Kopienzahl von weniger als 50 pro ml Probe enthalten. Nähere Angaben zu den Abbildungen 1 bis 4 finden sich in den Beispielen 3 bis 6.
Flüssige Proben im Sinne der vorliegenden Erfindung sind z.B. Pufferlösungen und Homogenate oder komplexe biologische Flüssigkeiten, bevorzugt Proben biologischen Ursprungs, insbesondere humane und tierische Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Harn, Feces und Liquor. Besonders bevorzugt sind zellfreie Körperflüssigkeiten, wie Plasma, Serum, Liquor oder Harn.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut geeignet zur Isolierung von Nukleinsäuren aus großvolumigen Proben, d.h. nicht nur aus Proben zwischen 50 μl und 1 bis 2 ml, sondern insbesondere aus Proben mit einem Volumen von über 2 ml, vor allem aus Proben mit einem Volumen zwischen 2 und 10 ml.
Als Festphase bzw. Trägermaterial kann erfindungsgemäß ein Material verwendet werden, das an der Oberfläche Hydroxyl-Gruppen trägt, insbesondere anorganische oxidische Materialien. Geeignete Materialien sind z.B. Silikagel, Silikate, Metalloxide wie Eisenhydroxide, Hydroxylapatit oder Glas. Bevorzugt sind Materialien, die an der Oberfläche Si-OH Gruppen tragen. Die Trägermaterialien können porös oder unporös sein, in Form von z.B. Partikeln, Fasern, Membranen, Filtern oder entsprechend modifizierten Gefässwänden. Partikuläre Materialien werden im allgemeinen bevorzugt, da sie eine größere Bindungskapazität und -kinetik insbesondere in größeren Probenvolumina aufweisen. Besonders bevorzugt werden magnetisierbare Partikel, da deren Abtrennung aus einer Suspension einfach zu automatisieren ist. Eine erfindungsgemäß besonders gut geeignete Festphase sind magnetisierbare Silika-Partikel, wie MagPrep® Silica Partikel (Merck KGaA, Darmstadt). Als Äquilibrierungspuffer für das Trägermaterial wird vorzugsweise einer der im folgenden genannten Bindepuffer verwendet.
Komponenten, die Proteine abbauen, sind erfindungsgemäß insbesondere Enzyme wie Proteinasen, besonders bevorzugt Proteinase K.
Nukleinsäuren sind erfindungsgemäß Ribonukleinsäuren (RNA) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNA), wie z.B. genomische DNA oder RNA, insbesondere virale genomische DNA und/oder RNA.
Die Bindung der Nukleinsäuren aus der Probe an das Trägermaterial erfolgt durch einfaches Absenken des pH-Wertes auf unter pH 7, bevorzugt unter pH 6. Dazu wird ein Bindepuffer verwendet, der einen pH-Bereich von 1 bis 6, vorzugsweise von 3 bis 5, aufrechterhalten kann. Geeignete Puffer sind z.B. Formiat-, Acetat-, Citratpuffer oder andere Puffersysteme, die in dem genannten pH-Bereich ausreichende Pufferkapazität besitzen.
Die Pufferkonzentration wird je nach Volumen und Pufferkapazität der zu untersuchenden Probenflüssigkeit ausgewählt. Vorzugsweise wird ein Bindepuffer mit einer Konzentration von 100-200 mM verwendet, der einen pH-Wert zwischen 4 und 5 hat, z.B. ein Puffer aus Essigsäure, der mit Natronlauge, Kalilauge oder mit Tris-Base auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 eingestellt wurde. Dem Bindepuffer können Nukleaseinhibitoren zugesetzt werden; geeignete Nukleaseinhibitoren sind dem Fachmann bekannt.
Ein Bindepuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung enthält weder ionische Detergenzien noch andere Ionen in hohen Konzentrationen, so dass während der Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial keine chaotropen Bedingungen vorliegen. Bevorzugt enthält der Bindepuffer keine ionischen Detergenzien oder chaotropen Substanzen. Sollten dennoch derartige Verbindungen enthalten sein, dann wird die Konzentration der ionischen Detergenzien und chaotropen Substanzen so gewählt, dass das Gemisch aus Probe und Bindepuffer weder ionische Detergenzien noch chaotrope Substanzen in Konzentrationen > 500 mM, bevorzugt > 200 mM enthält. Besonders bevorzugt enthält dazu der Bindepuffer weder ionische Detergenzien noch chaotrope Substanzen in Konzentrationen > 500 mM, bevorzugt > 200 mM.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente, wie z.B. nicht-ionische Detergezien. Bevorzugt werden als lysierende Komponente Triton®, Tween®, NP 40 oder Mischungen davon eingesetzt. Der Zusatz der lysierenden Komponente ist vor allem von Bedeutung, wenn die Probe zuvor noch keinen lysierenden Bedingungen unterworfen worden ist und daher beispielsweise noch intakte Viren etc. enthalten kann. Um eine quantitative Isolierung der gesamten viralen Nukleinsäuren zu ermöglichen, müssen daher durch Zugabe der lysierenden Komponente die viralen Partikel zunächst zerstört werden. Die benötigte Menge an lysierender Komponente ist dem Fachmann bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer erfindungsgemäß zusätzlich ein oder mehrere Sulfatsalze, wie Kobaltsulfat, Zinksulfat oder bevorzugt Ammoniumsulfat oder Kaliumsulfat. Es wurde gefunden, dass dieser Zusatz die Bindung und somit auch die Isolierung von insbesondere RNA verbessert. Bevorzugt liegt die Konzentration der Sulfatsalze im Gemisch von Bindepuffer und Probe unter 300 mM. Besonders bevorzugt enthält der Bindepuffer zwischen 100 und 200 mM Ammoniumsulfat.
Das Trägermaterial mit den daran gebundenen Nukleinsäuren wird dann in einem nächsten Schritt mit mindestens einem Waschpuffer mindestens einmal gewaschen. Der pH-Wert der Waschpuffer liegt typischerweise zwischen 4 und 7, vorzugsweise zwischen 4,5 und 6,5. Die Pufferkonzentration kann geringer sein als beim Bindepuffer; sie sollte im Bereich von 1 bis 50 mM, vorzugsweise bei etwa 5 bis 15 mM liegen. Gegebenenfalls kann einer der Waschpuffer Zusatzstoffe, beispielsweise Chelatbildner wie EDTA, chaotrope Substanzen und/oder nichtionische Detergenzien enthalten. Die erfindungsgemäß offenbarten Waschpuffer eluieren die gebundenen Nukleinsäuren nicht, selbst wenn diese unter Zusatz von chaotropen Substanzen an das Trägermaterial adsorbiert wurden. In einem Waschpuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung sind Zusätze von organischen Lösungsmitteln und/oder chaotropen Substanzen nicht notwendig, um die vorzeitige Elution von Nukleinsäuren zu vermeiden. Wesentlicher Bestandteil des Waschpuffers ist erfindungsgemäß mindestens eine Komponente, die Proteine abbaut, wie z.B. eine Proteinase. Es wurde gefunden, dass durch den Zusatz einer solchen Komponente zum Waschpuffer die Effektivität der Nukleinsäureisolierung stark verbessert werden kann. Besonders bevorzugt wird dem Waschpuffer Proteinase K zugesetzt. Typischerweise enthält der Waschpuffer 0,1 bis
4 mg/ml eines Enzyms wie Proteinase K, besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 1 mg/ml.
Die Elution, d.h. das Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren vom Trägermaterial, erfolgt dann durch eine einfache Erhöhung des pH-Wertes auf über 7,5. Der dazu verwendete Elutionspuffer sollte einen pH-Bereich von 7,5 bis 9, vorzugsweise 8 bis 8,5 aufrechterhalten. Geeignete Puffer sind z.B. Tris-HCI-Puffer, Tricin, Bicin und andere Puffer, die in diesem pH-Bereich puffern, vorzugsweise Tris/HCI. Die Pufferkonzentration sollte
5 bis 10 mM, vorzugsweise etwa 8 bis 10 mM betragen. Gegebenenfalls kann der Elutionspuffer Chelatbildner wie EDTA und/oder andere Inhibitoren von Nukleasen enthalten.
In einer bevorzugtem Ausführungsform beträgt das Volumen des Elutionspuffers weniger als 1/10 des Volumens der ursprünglich eingesetzten flüssigen Probe. Auf diese Weise werden die isolierten Nukleinsäuren zugleich aufkonzentriert.
Die eluierten Nukleinsäuren sind direkt, ohne weitere Reinigungsschritte, für molekularbiologische Anwendungen, wie z.B. für Ampli- fikationsreaktionen, einsetzbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren wird typischerweise so durchgeführt, daß z.B. ein die Nukleinsäuren enthaltendes Plasma mit dem Bindepuffer versetzt und in ein Probenröhrchen gegeben wird. Das Probenröhrchen kann bereits das bevorzugte Trägermaterial enthalten. Genauso kann die Zugabe des Trägermaterials nach dem Einfüllen der flüssigen Probe erfolgen. Nach einer Inkubationszeit von typischerweise 1 bis 10 Minuten wird der Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplex vom Überstand abgetrennt und der Überstand verworfen. Mit einem Waschpuffer wird resuspendiert, erneut abgetrennt und der Überstand erneut verworfen. Es können auch mehrere dieser Waschschritte gegebenenfalls mit Waschpuffem unterschiedlicher Zusammensetzung nacheinander ausgeführt werden. Dementsprechend kann eine erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung, d.h. ein Test-Kit, auch mehrere Waschpuffer enthalten. Schließlich wird der Elutionspuffer zum Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplex hinzugefügt und nach Abtrennung des Trägermaterials der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand in ein neues leeres Röhrchen überführt. Dieses Eluat kann dann direkt für weitere Analysenmethoden (PCR, NASBA) eingesetzt werden. Bei der Verwendung von z.B. entsprechenden magnetischen Partikeln kann die zur Abtrennung des Überstands häufig eingesetzte Zentrifugation durch das Anlegen eines magnetischen Felds ersetzt werden.
Für ein effektives Waschen des Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplexes und für eine effektive Elution der Nukleinsäuren vom Trägermaterial, ist es bei der Verwendung von partikulären Trägermaterialien wichtig, dass das Trägermaterial nach der Abtrennung homogen in den Puffern resuspendiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden bei Zugabe des Waschpuffers und/oder des Elutionspuffers daher zusätzlich ein oder bevorzugt mehrere Kugeln zugegeben. Diese Kugeln bestehen aus in den Puffern inerten, festen Materialien, bevorzugt aus Glas, einem harten Kunststoff oder Metall. Das Material der Kugeln geht keine Wechselwirkung mit Nukleinsäuren ein. Die Kugeln sind größer als die Partikel des Trägermaterials, bevorzugt zwischen 100 und 1000-fach größer. Diese Kugeln bewirken bei sanftem Schütteln des Reaktionsgefäßes eine homogene Verteilung des Trägermaterials in der Pufferlösung und dieser Prozesschritt ist sehr einfach zu automatisieren. Insbesondere wird das Trägermaterial effektiv von der Gefäßwandung gelöst und Verklumpungen werden aufgelöst. Als besonders effektiv hat sich die Zugabe der Kugeinbei der Verwendung magnetisierbarer Trägermaterialien und in Automationsprozessen erwiesen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Test-Kit enthält zumindest eine Festphase, bevorzugt eine Silika-Festphase, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut. Weitere optionale Bestandteile sind z.B.:
- einen oder mehrere weitere Waschpuffer
- ein Elutionspuffer zum Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren vom Trägermaterial
- ein oder bevorzugt mehrere Kugeln in geeigneter Darreichungsform, z.B. in Puffer oder Wasser, die zur effektiven Resuspension des Trägermaterials in Wasch- und/oder Elutionspuffer benutzt werden
- eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Die bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens angeführten bevorzugten Zusammensetzungen der Reagenzien gelten auch für die Bestandteile des erfindungemäßen Test-Kits.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, mit relativ einfachen und kostengünstigen Handhabungen eine geringe Anzahl von viralen Genomkopien aus einem großen Volumen - wie zum Beispiel einem Pool von Spenderplasmen - zu extrahieren und anzureichern, so daß die nachgeschaltete Nachweisreaktion gesicherte Ergebnisse liefert. Der gesamte Prozess kann mit Hilfe von magnetischen Silika Partikeln automatisiert in weniger als einer Stunde aus vielen Primärröhrchen parallel in einem Hochdurchsatz-Verfahren hochreine virale Nukleinsäuren extrahieren und ersetzt das Vorkonzentrierungsverfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet erstmals die Möglichkeit, eine sehr geringe Kopienzahl (< 50 Kopien) von z.B. Viren in flüssigen Proben nachzuweisen. In Blutbanken werden häufig mehrere Einzelproben von Körperflüssigkeiten, wie Plasma oder Serum, zu sogenannten Proben- Pools vereinigt. Damit auch in diesem Probenpools geringe Kopienzahlen von Viren nachgewiesen werden können, ist es zumeist nicht ausreichend, eine Probe von 100 μl zu untersuchen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können nun auch Kopienzahlen von z.B. unter 50 Viren in großvolumigen Proben über 2 ml nachgewiesen werden. Zudem beträgt das Elutionsvolumen nach der Isolierung der Nukleinsäuren bevorzugt weniger als 1/10 des ursprünglich eingesetzten Probenvolumens, so dass zugleich eine große Verringerung des Probenvolumens und somit eine Aufkonzentrierung der Nukleinsäuren möglich ist.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, sowie der korrespondierenden Anmeldung DE 102 58258.0, eingereicht am 13.12.2002, sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiele
Beispiel 1 , Basisprotokoll S für kleine Plasmaproben
1 ,5mg MagPrep® Silica Partikel (Merck KGaA) werden in 900//I Bindepuffer TAAN (200mM Acetat-Tris pH 4.0, 0,5% NP40, 200mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Dieser Bindepuffer-Mix enthält zudem interne KontrolI-RNA und/oder -DNA.
100μl Plasmaprobe werden mit 900 /I Bindepuffer-Mix homogen gemischt. Nach 1-10 Minuten Inkubation wird magnetisiert und der Überstand sorgfältig abgetrennt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel mit 500//I Waschpuffer (10mM Tris-HCI pH 6.6; 0,5mg/ml Proteinase K) resuspendiert und bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Magnetisierung wird der Überstand sorgfältig entfernt und wieder mit 500 /I Waschpuffer versetzt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel resuspendiert, magnetisiert und der Überstand verworfen. Die Elution der Nukleinsäuren von den Partikeln erfolgt nach 10-minütiger Inkubation in 100 tl Elutionspuffer (10mM Tris/HCI pH 8,5) bei 80°C. Nach Magnetisierung wird das Eluat in ein neues, steriles Gefäß transferiert. Beispiel 2, Basisprotokoll XL für Pools und qroßvolumiqe Einzelproben
Es wird ein Plasmapool hergestellt, in dem von 24 Plasmaproben jeweils 0,1ml entnommen und in einem geeigneten Probenröhrchen vereinigt werden. Eine der Plasmaproben enthält Virus-Partikel. 7,5mg MagPrep® Silica Partikel werden in 7,6ml Bindepuffer TA (200mM Acetat-Tris pH 4.0, 0,5% NP40, 200mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Der Bindepuffer TA enthält zudem interne Kontroll-RNA und/oder -DNA. Die 2,4ml des Plasmapools werden mit 7,6ml Bindepuffer-Mix homogen gemischt. Nach 1-10 Minuten Inkubation wird magnetisiert und der Überstand sorgfältig abgetrennt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel mit 5ml Waschpuffer (1 OmM Tris-HCI pH 6.6; 0,5mg/ml Proteinase K) resuspendiert und bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Magnetisierung wird der Überstand sorgfältig entfernt und wieder mit 5ml Waschpuffer versetzt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel resuspendiert, magnetisiert und der Überstand verworfen. Die Elution der Nukleinsäuren von den Partikeln erfolgt nach 10-minütiger Inkubation in 10O/-/I Elutionspuffer (10mM Tris/HCI pH 8,5) bei 80°C. Nach Magnetisierung wird das Eluat in ein neues, steriles Gefäß transferiert.
Die Nukleinsäuren der gewonnenen Eluate werden durch (RT)-PCR und geeignete Gensonden amplifiziert und nachgewiesen (z.B. mit Hilfe eines Thermocyclers wie des ABI Prism 7000 (TaqMan®) der Firma Applied Biosystems oder des LightCycler® der Firma Röche).
Beispiel 3) Einfluss von qrossen Probenvolumina auf die Sensitivität
Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in Abbildung 1 graphisch dargestellt. Dabei zeigt die Y-Achse die Ausbeute der Kopienzahl der Viren in % an. Auf der X-Achse sind die 4 im folgenden erläuterten Ansätze aufgeführt. 100 /I Virus-positives Plasma (versetzt mit 600 Kopien HIV: -gestreifte Balken- und 200 Kopien HBV:-gepunktete Balken - in Abbildung 1) wurden entweder direkt extrahiert (Probe A und Q) oder wurden mit 2,3 ml (Probe 24P) bzw. 4,7 ml (Probe 48P) virusfreiem Plasma gemischt und das gesamte Großvolumen extrahiert. Für Probe A wurde das Basisprotokoll S gemäß Beispiel 1 , für die Proben 24P und 48P das Basisprotokol XL gemäß Beispiel 2 angewendet. Probe Q wurde entsprechend dem QIA amp Viral RNA Extraction Kit der Firma QIAGEN extrahiert. Die für Probe A gefundenen Sensitivitäten (Kopienzahl in den Eluaten detektiert in der quantitativen TaqMan® PCR) wurde gleich 100% gesetzt.
Wie die Abbildung 1 zeigt, können trotz 23facher bzw. 47facher Verdünnung der Virus-positiven Probe mit Virus-freiem Plasma die wenigen viralen DNAVRNA-Molküle aus dem Pool fast ohne Verlust quantitativ nachgewiesen werden.
Beispiel 4) Auswirkung von Sulfat-Salzen auf die Isolierung von RNA
100 /I von HBV- und HIV-positivem Plasma (jeweils ca. 1000 Kopien) werden mit MagPrep® Silica Partikeln und 900/ I eines Bindepuffers inkubiert, der entweder kein Ammoniumsulfat (Probe #1) oder 200mM Ammoniumsulfat (Probe # 2) enthält. Die weitere Isolierung erfolgt gemäß Beispiel 1.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 2 dargestellt. Auf der Y- Achse ist die Ausbeute an Nukleinsäuren in % angegeben. Die Bindung von 100% entspricht dabei der Signalstärke der quantitativen Amplifikation von 1000 Molekülen gereinigter HBV-DNA oder HIV-RNA. Auf der X-Achse sind die oben erläuterten Ansätze 1 und 2 aufgetragen. (HBV: schraffierter Balken; HIV: grauer Balken)
Es zeigt sich deutlich, dass die Ausbeute von RNA-Molekülen durch Zugabe von Ammoniumsulfat zum Bindepuffer bis zur gewünschten Sensititvität verbessert werden kann.
Beispiel 5) Auswirkung der Zugabe von Proteinase K
Vier Plasmaproben a 100μl werden bereitgestellt. Eine Plasmaprobe wird mit Proteinase K bei einer Konzentration von 0.5mg/ml für 4 Stunden vorinkubiert (Probe#1). Dann werden alle vier Plasmaproben mit Viruspartikeln (HIV und HBV; jeweils 1000 Kopien/ml) versetzt. Die vier Proben werden analog des Basisprotokolls S (Beispiel 1) extrahiert, wobei bei Probe #1 , #2 und #3 der Waschpuffer keine Proteinase K enthält. Bei Probe #3 werden dem Bindepuffer 0,5mg/ml Proteinase K zugesetzt. Bei Probe #4 werden dem Waschpuffer 0,5mg/ml Proteinase K zugesetzt.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 3 dargestellt. Auf der Y- Achse ist die Ausbeute an Nukleinsäuren in % angegeben. Die für Probe #3 gefundene Sensitivität (Kopienzahl in den Eluaten detektiert in der quantitativen TaqMan® PCR) ist dabei gleich 100% gesetzt. Auf der X- Achse sind die vier oben erläuterten Ansätze 1 bis 4 aufgetragen.
Die Ergebnisse zeigen, dass nur bei Zugabe der Proteinase zum Waschpuffer die gewünschte Effektivität der Isolierung der Nukleinsäuren erzielt werden kann.
Die Zugabe von Proteinase K zum Bindepuffer oder die Vorinkubation der Probe mit Proteinase K zeigt keine wesentliche Verbesserung. Beispiel 6) optimale Konzentration des Trägermaterials bei großem und kleinem Probenvolumen
Je 100 /I HIV-positives Plasma (ca. 1000 copies) wird entweder gemäß Basisprotokoll S (Beispiel 1) extrahiert (gestreifte Balken) oder mit 2,3 ml virus-freiem Plasma gemischt und gemäß des Basisprotokolls XL (Beispiel 2) extrahiert (graue Balken). Als Trägermaterial werden MagPrep® Silica Partikel eingesetzt. Die Menge des Trägermaterials wird variiert. Die jeweils pro ml Plasma eingesetzte Menge ist in Abbildung 4 auf der X-Achse angegeben.
Auf der Y-Achse ist die Ausbeute an isolierten Nukleinsäuren in % angegeben. Die Ausbeute für 15mg/ml wurde gleich 100% gesetzt.
Die Ergebnisse zeigen, dass beim Einsatz großer Probenvolumina über 2 ml die Menge des Trägermaterials im Verhältnis zu der bei kleinen Probenvolumina benötigten Menge reduziert werden kann. Weiterhin wird deutlich, dass die Menge des eingesetzten Trägermaterials bei großen Probenvolumina weniger Einfluß auf die Ausbeute hat. Eine geringere Konzentration an Trägermaterial von etwa 2 bis 3 mg/ml führt zu leicht besseren Ausbeuten als die doppelte Menge von ca. 6 mg/ml.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer flüssigen Probe, die Nukleinsäuren enthält; b) Bereitstellen eines Trägermaterials aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material; c) Vermischen der Probe aus Schritt a) mit einem Bindepuffer, so dass der pH-Wert des Gemisches unter 7 liegt; d) Behandeln der mittels eines Bindungspuffers angesäuerten Probe aus Schritt c) mit dem Trägermaterial aus Schritt b), wobei die Nukleinsäuren an das Trägermaterial gebunden werden; e) Abtrennen des Trägermaterials mit den gebundenen Nukleinsäuren von dem Rest der Probe und dem Bindungspuffer; f) Waschen des Trägermaterials mit einem Waschpuffer, der zumindest eine Komponente enthält, die Proteine abbaut; g) Elution der in Schritt d) gebundenen Nukleinsäuren von dem Trägermaterial mit einem alkalischen Elutionspuffer.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe aus zellfreier Körperflüssigkeit besteht.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente enthält.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindepuffer zusätzlich mindestens ein Sulfatsalz enthält.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe ein Volumen von über 2 ml hat.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe aus einer Mischung von mindestens 10 Einzelproben besteht.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumen des Elutionspuffers in Schritt g) weniger als 1/10 des Volumens der in Schritt a) bereitgestellten Probe beträgt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt f) und/oder Schritt g) eine oder mehrere Kugeln zur Unterstützung der Resuspension des Trägermaterials zugegeben werden.
9. Test-Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 zumindest enthaltend ein Trägermaterial aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut.
10. Verwendung des Verfahrens gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 8 zur Isolierung von viralen Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten.
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