DE102014111210B3 - Verfahren und Vorrichtung zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten Proben - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten Proben, insbesondere Blutproben. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens und die entsprechenden Verwendungen. Das Verfahren und demzufolge auch die Vorrichtung kann insbesondere zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT) zur Testung von Blutspenden und Blutprodukten angewendet werden.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten Proben, insbesondere Blutproben. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens und die entsprechenden Verwendungen. Das Verfahren und demzufolge auch die Vorrichtung kann insbesondere zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT) zur Testung von Blutspenden und Blutprodukten angewendet werden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Menschliches Blut ist für die Medizin ein sehr wertvoller und bisher unverzichtbarer Rohstoff, aus dem heute eine Vielzahl von Komponenten und Produkten gewonnen bzw. hergestellt wird. Der sogenannte AIDS-Skandal Anfang der 90er Jahre hat die Virussicherheit von Blut und Blutprodukten in der Öffentlichkeit wie in Fachkreisen schlagartig in den Mittelpunkt des Interesses gerückt.
  • Die Nukleinsäure Amplifikationstechnologie (NAT) verringert das Infektionsrisiko bei Bluttransfusionen.
  • Das Risiko, sich durch eine Bluttransfusion mit viralen Krankheitserregern, wie HIV 1/2, HCV, HBV oder HAV, zu infizieren, konnte in den letzten Jahren durch verbesserte Methoden bei der Untersuchung der Blutspenden erheblich gesenkt werden. Es wurde gezeigt, dass durch die Einführung der NAT die Chance, infizierte Blutkonserven zu entdecken, deutlich gestiegen ist.
  • Bevor gespendetes Blut an einen Patienten weitergegeben wird, muss es auf Krankheitserreger hin überprüft werden. Vor Einführung der NAT wurden beispielsweise HIV- und Hepatitis-Viren in Blutkonserven in erster Linie durch den Nachweis von Antikörpern entdeckt. Da solche Antikörper als Reaktion auf eine erfolgte Infektion erst nach einer gewissen Zeit vom Immunsystem gebildet werden, bestand bei den Kontrollen ein offenes Zeitfenster (diagnostisches Fenster): In der Anfangsphase einer Infektion war es nicht möglich, die Erreger in der entsprechenden Blutspende zu entdecken, infiziertes Blut konnte somit in die medizinische Versorgung gelangen. Das Risiko, infizierte Blutprodukte zu transfundieren, ließ sich für therapeutisches Frischplasma nur dadurch minimieren, dass alle Blutspender zu einer zweiten Spende aufgefordert wurden, die nach einem Mindestabstand von 2–3 Monaten erfolgte. Damit konnten im Falle einer Infektion die in der Zwischenzeit gebildeten Antikörper beim Spender nachgewiesen werden. Das zuerst gespendete Plasma wurde so lange eingefroren, bis der Antiköpertest der zweiten Spende negativ ausgefallen war, und erst dann für eine medizinische Behandlung verwendet. Für Blutprodukte mit geringer Haltbarkeit von nur wenigen Tagen, wie Erythrozyten und Thrombozyten ist dieser Ansatz nicht möglich. Hier muss unmittelbar nach der Spende das Produkt, sofern negativ getestet, freigegeben werden. Deshalb sollte so früh wie möglich nach einer Infektion bei einem Blutspender der Test positiv reagieren, um das diagnostische Fenster so weit wie möglich zu schließen. Dies ist mit Einführung NAT als Screening Test zum sensitiven Direktnachweis einer Viruskontamination von Blutspenden gelungen.
  • Seit Mitte der 1990er Jahre wird erfolgreich an Methoden gearbeitet, mit deren Hilfe Viren anhand ihrer Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Durch die Plasma-verarbeitende Industrie angeregt, die ihre Produktionspools für Plasmaprodukte wie z.B. Gerinnungsfaktor VIII oder IX vor hohen Virusbelastungen schützen wollte, wurde Mitte der 90er Jahre die NAT für die transfusionsrelevanten Viren HIV-1/2, HCV, HBV und später auch für Parvovirus B19 (PB 19) und HAV als Qualitätskontrollmaßnahmen eingeführt. 1999 wurde schließlich die HCV NAT-Testung für Plasma und zelluläre Blutbestandteile vom Paul-Ehrlich-Institut (PEI) in Deutschland verbindlich eingeführt. Die Blutspendedienste des Deutschen Roten Kreuzes (DRK) haben jedoch von Anfang an, die ersten 1997 beginnend, alle Spenden auf die transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV und HBV mit Hilfe der NAT getestet. Sie waren auch die ersten, die im Jahre 2000 die NAT-Testung auf Parvovirus PB 19 und HAV ausweiteten, was heute bei den DRK-Blutspendediensten Standard ist. Seit Mai 2004 hat das PEI außerdem die HIV-1 NAT angeordnet.
  • So wurden zwischen 1997 und 2002 in einer Studie insgesamt 3,6 Mio Blutspendeproben in Mitteleuropa auf HCV und HIV-1 (Roth, WK et al. Transfusion 2002; 42:862–868.) und HBV (Roth, WK et al. Transfusion 2002; 42:869–875) mittels NAT getestet. Dabei konnten 6 HCV und 2 HIV-1 PCR-positive Spenden mit negativem Antikörper-Test (Häufigkeit 1 in 600.000 bzw. 1 in 1,8 Mio) und 6 HBV PCR-positive Spenden, die aber HBsAg-negativ waren, identifiziert werden.
  • Das virologische Restrisiko ist aufgrund der verschiedenen Maßnahmen, wie Spenderselektion, ELISA-Testung und NAT-Testung, für die untersuchten transfusionsrelevanten Viren auf ein bisher nicht gekanntes, unvorstellbar geringes Maß gesunken. So ist das Restrisiko, das in Deutschland nach Einführung der PCR für die drei transfusionsrelevanten Viren HCV, HIV, HBV noch verbleibt, mit < 1:20 Mio. für HCV, 1:4 Mio. für HIV-1 und < 1:1 Mio. für HBV so gering geworden, dass man fast von keinem wirklichen virologischen Restrisiko mehr sprechen kann.
  • Generell führte die Einführung der aufwendigen und teuren NAT zu einer zusätzlichen finanziellen Belastung der Blutspendedienste. Ein Weg zur Reduzierung der Kosten ist dabei die Zusammenfassung vieler einzelner Spenderproben zu einer einzigen durch Bildung von sogenannten Minipools (siehe Roth, WK und Seifried, E, Transfusion Medicine 2002; 12:255–258.). Insbesondere große DRK Blutspendedienste mit 2000–4000 Spenden pro Tag profitieren von diesem Ansatz. Das Testen einer solch großen Anzahl von Spenderproben auf aktuell 6 Viren würde bei Einzeltestung die Durchführung von bis zu 24.000 einzelnen NAT-Tests pro Tag erfordern. Derzeit bestehen noch unüberwindliche technische Grenzen in einer 8-Stunden-Schicht eine derart hohe Zahl von einzelnen NAT Tests durchzuführen. Weder sind entsprechende Thermocycler/Analysatoren noch Verfahren verfügbar, die es erlauben würden, diesen Durchsatz zu erzielen.
  • Erst das Pooling reduziert die Anzahl der Tests auf ein technisch machbares und finanzierbares Maß. So werden bis zu 96 Blutspendeproben zu einem Pool zusammengeführt, was einen hohen Durchsatz an Proben mit einer kleinen Anzahl an Tests ermöglicht. (Roth, WK et al. The Lancet 1999; Roth, WK et al. Vox Sang 2000; 78 (suppl 2):257–259.).
  • Dennoch ist auch die Pool-NAT für die Blutspendentestung zurzeit noch ein teilmanuelles Verfahren mit dem zwar die immensen Kosten für die potenziell großen Probenzahlen auf eine erträgliches Maß reduziert werden können, aber das Pooling und die folgenden Schritte erlauben es noch nicht, den Gesamtprozess zu automatisieren. Dies wäre aber in Hinsicht auf die Prozesssicherheit ein großer und wichtiger Fortschritt.
  • Für Blutspendedienste mit kleinem bis mittlerem Spenderaufkommen und für Länder mit hoher Virus Prävalenz kann sich das Zusammenführen von Spenderproben in größere Minipools als unvorteilhaft erweisen. Steigt die Prävalenz der Viren über ein bestimmtes Maß, müssen zu viele positiv testende – im schlechtesten Falle alle – Minipools aufgelöst und auf die positive Einzelspende heruntergebrochen werden. Dies führt initial dazu, dass alle Proben in diesen positiven Pools – auch die negativen – zunächst gesperrt sind und die darin repräsentierten Blutprodukte erst mit einer Verzögerung von 1–3 Tagen für die Anwendung zur Verfügung stehen. Somit eignet sich das Verfahren der Erstellung von Minipools mit bis zu 96 Blutspenderproben nur bedingt für die NAT-Testung in Ländern mit hoher Prävalenz im Spenderkollektiv.
  • Aus der DE 102 58 258 A1 ist ein NAT-Verfahren bekannt, das einen sehr hohen Durchsatz erzielt, um die Anforderungen großer Blutspendedienste mit abzudecken, dieses erfordert jedoch immer noch manuelle Interaktionen.
  • Ein Zusammenführen von magnetischen Partikeln, an die Nukleinsäuren gebunden sind, ob aus Einzelproben oder gepoolten Proben, ist grundsätzlich vorteilhaft. Dieser Prozess ist theoretisch endlos durchführbar, aber in der Realität kommen nach 3 bis 4 Schritten so viele Beads zusammen, dass die Elution der Nukleinsäuren immer größere Volumina an Puffer erfordert und ein nachteilhafter Verdünnungseffekt in Bezug auf die einzelne Ausgangsprobe hingenommen werden muss.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zu entwickeln, das einerseits eine schnellere und verbesserte Durchführung der Nukleinsäure-Amplifikationstechniken für Länder mit hoher Prävalenz erlaubt, das es andererseits aber auch ermöglicht, einen sehr hohen Durchsatz zu erzielen, um die Anforderungen großer Blutspendedienste mit abzudecken.
  • Ferner soll das Pooling, bezogen auf die Einzelspende, die Sensitivität nicht mehr wie bisher zwangsläufig beeinträchtigen, sondern der Einzelprobentestung ebenbürtig sein. Damit würde ein schwerwiegender Einwand entfallen, der bisher gegen das Pooling erhoben wurde.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zum – bevorzugterweise automatisierten – Bearbeiten von gepoolten oder einzelnen Proben gemäß der vorliegenden Erfindung gelöst. Das Verfahren umfasst dabei folgende Schritte:
    • a) zur Verfügung stellen von zu untersuchenden Proben in Gefäßen, die je mit einer maschinenlesbaren Markierung versehen sind,
    • b) gegebenenfalls, Zusammenführung (Pooling) der Proben aus a) zu mindestens einem Probenpool in Gefäßen, die ebenfalls je mit einer maschinenlesbaren Markierung versehen sind,
    • c) Zugabe einer Lösung, die zur Lyse von Zellen geeignet ist zusammen mit magnetischen Beads, die zur Bindung von Nukleinsäuren geeignet sind, zu der Probe aus a) oder b),
    • d) Bindung der Nukleinsäuren in der Probe an die magnetischen Beads,
    • e) Bindung der magnetischen Beads in der Probe an einen Magneten,
    • f) Pooling der Beads aus e) durch Überführung der Magnetpartikel aus mindestens 2 Proben in ein gemeinsames neues Gefäß,
    • g) Wiederholung der Schritte a) bis f) mit mindestens einem zweiten Set von zu untersuchenden Proben,
    • h) Pooling der Beads aus den Probenpools aus den Schritten f) und g) zu einem gemeinsamen Pool an Beads aus mindestens 4 Probenpools,
    • i) Wiederholung der Schritte a) bis h) mit mindestens einem zweiten Set von zu untersuchenden Proben,
    • j) Überführen der Beads der Probenpools aus den Schritten h) und i) zu einem mindestens 8-fachen Beads Pool,
    • k) Eluieren des Pools aus j) mit Elutionspuffer, und
    • l) Zuführen der eluierten Nukleinsäure aus Schritt k) zu einem oder mehreren weiteren Nachweisverfahren.
  • Bevorzugterweise umfasst das Verfahren einen oder mehrere Waschschritte mit Waschpuffer und Hilfe eines Magneten.
  • Weiter bevorzugt ist ein Verfahren, wobei in Schritt b) 2 bis 15 Proben pro Probenpool zusammengeführt werden können, also 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15.
  • An Stelle von gepoolten Proben können auch Einzelproben dem Beads Pooling zugeführt werden, womit eine für Einzelproben typische höhere Sensitivität mit höherem Durchsatz erzielt werden kann.
  • Die Aufgabe wird somit erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen eines Verfahrens zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten oder einzelnen Proben sowie das Zusammenführen von jeweils 2 oder mehr Einzelproben oder Proben Pools durch Beads Pooling gelöst. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer Erhöhung des Probendurchsatzes in Ländern mit hoher Prävalenz, Verringerung der Zeit zur Probenvorbereitung und Probenbearbeitung und/oder Steigerung der Zuverlässigkeit der Probenvorbereitung und Probenbearbeitung.
  • Das vorliegende Verfahren vermeidet den Verlust der Sensitivität in Bezug auf die Ausgangsprobe, da große Ausgangsvolumina eingesetzt werden können, z.B. bei Einzelspenden, und trotzdem ein Poolingeffekt erreicht wird, indem die Beads, an die die Nukleinsäuren gebunden haben, zu 2er, 4er, 8er Pools usw. zusammengeführt werden.
  • Erst im Elutionsschritt werden die Nukleinsäuren von den Beads gelöst und der Nachweisreaktion zugeführt. Dadurch gelangen natürlich 2, 4, 8, ..., n mal mehr Beads in den Elutionspuffer. Wenn trotzdem die Konzentration der Nukleinsäure, bezogen auf die einzelne Probe, nicht verändert werden soll, muss die Menge (Volumen) des Elutionspuffers konstant gehalten werden und darf nicht entsprechend erhöht werden (2-fach, 4-fach, 8-fach, usw.). Dadurch wird die Konzentration der Beads im Elutionspuffer entsprechend zunehmen und die verfügbare Menge an Elutionspuffer abnehmen, da der Zwischenraum zwischen den Beads auch verdoppelt, vervierfacht usw. wird. Dies wird allgemein als nachteilhaft angesehen.
  • Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass dies tolerabel ist. Die Erfinder konnten in vergleichenden Untersuchungen bei 2-fach Beads Pooling keine Verluste in der Sensitivität sehen, und nur eine geringe Zunahme des Elutionsvolumens bis 8-fach Beads Pooling.
  • Dass man die Proben selbst auch poolen kann, erhöht nochmals den Durchsatz, mit den bekannten Nachteilen der Reduktion der Sensitivität, da abhängig von der Poolgröße, weniger Material von den individuellen Proben in den Prozess eingebracht wird. In einem aktuellen Plan wird von 1,5 ml Probenvolumen ausgegangen, das in den Prozess eingebracht wird. Das erlaubt die Extraktion von 1,5 ml Einzelprobenvolumen oder z.B. von 100µl Einzelprobenvolumen in einem 15er Pool, 150µl in einem 10er Pool, 300µl in einem 5er Pool. In Bezug auf den Durchsatz multipliziert sich das Proben Pooling mit dem Beads Pooling, z. B. auf 60 Proben pro "Pool", wenn 15er Probenpools mit 4-fach Beads Pooling kombiniert wird. Daraus ergibt sich in Verbindung mit der Prozessdauer und der Anzahl von Läufen pro 8h der max. Durchsatz pro Schicht.
  • Es soll dem Anwender ermöglicht werden, Einzelspenden und/oder Pools zu extrahieren, möglichst parallel, wobei die neue Plattform nicht nur das Beads Pooling, sondern auch das vorgeschaltete Proben Pooling für bis zu 15 Proben Pools automatisch durchführt. Dieses auf der Extraktions-/PCR Plattform automatisiert durchgeführte Probenpooling ist bisher nicht realisiert und verschafft entscheidende Vorteile. Pooling (bis 8-fach durch Beads Pooling) wird so sensitiv wie die Einzelspendentestung gemacht und bietet zusätzlich den Vorteil, dass das Probenpooling für den Hochdurchsatz auf derselben Plattform durchgeführt werden kann, und somit separate Poolinggeräte (wie im Stand der Technik) nicht mehr nötig sind. Der Anwender lädt wie bei der Einzelspendentestung nur Primär-Probenröhrchen vom einzelnen Spender und erhält auch ein Ergebnis pro Spender, obwohl ein Pooling (automatisch) durchgeführt wurde. Er kann das Pooling "vergessen" und muss bei einem positiven Poolergebnis nur die betroffenen Einzelröhrchen nochmals auf das Gerät stellen, damit die positive Einzelprobe identifiziert werden kann.
  • Bevorzugterweise handelt es sich bei den in Schritt a) zur Verfügung gestellten Proben um flüssige oder verflüssigte Proben.
  • Bei den Proben handelt es sich bevorzugt um Blutproben und anderen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Plasma, Serum, zellulären Blutbestandteilen und/oder weiteren Blutprodukten. Bevorzugt handelt es sich bei einer Blutprobe um eine Bestandteile des Blutes enthaltende Probe. Bevorzugt werden Proben verwendet, die in der Blutspende und in der Transfusionsmedizin vorkommen und verwendet werden. Dabei kann es sich auch um folgende Blutpräparate aus Vollblut- und Apherese-Spenden handeln:
    • – Produkte aus Einzelspenden, wie Erythrozytenkonzentrate (EK), Thrombozytenkonzentrate (TK), Stammzellpräparate, Granulozyten oder Lymphozyten aus Apherese, Gefrorenes Frischplasma (GFP)
    • – gepoolte Blutplättchenprodukte, wie Pool-TK aus Buffy-Coat
    • – Produkte aus Plasmapools, wie GFP mit SD (solvent/detergent) Pathogen-Inaktivierung, Albumin, Gerinnungsfaktoren, Fibrinkleber, Inhibitoren, Immunglobuline.
  • Bevorzugterweise können die Schritte c), d) und e) des Verfahrens mehrfach durchgeführt werden.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Poolen der Blutproben direkt in mit Barcodes versehenen Gefäßen oder in Vertiefungen von Platten durchgeführt wird. Das bei bisherigen Verfahren unter Einbeziehung von manuellen Teilschritten zur Virusanreicherung bestehende Risiko von Probenverwechslungen lässt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren effektiv beseitigen. Zu diesem Zweck erfolgt das Pooling der Blutproben direkt in mit Barcodes versehene Gefäße oder Vertiefungen von Platten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um einen einzigen homogenen Prozess ohne manuelles Eingreifen.
  • Bevorzugterweise handelt es ich bei der zugegebenen Lösung in Schritt c) um Reagenzien zur Lyse von Viren, wie beispielsweise Lyse- bzw. kombinierte Lyse/Bindepuffer unter Verwendung von Detergenzien, Proteasen, chaotropen Salzen, organischen Lösungsmitteln sowie weiteren dem Fachmann bekannten Lösungen und Suspensionen, die zur Extraktion von Nukleinsäure geeignet sind, und Extraktionsreagenzien. Puffer können alkalischen, neutralen oder sauren pH-Werts sein. Den Puffern können Festphasen zur Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren beigefügt sein. Die Festphasen können paramagnetisch, eisenhaltig, unbeschichtet oder beschichtet sein, mit funktionellen Gruppen versehen sein, oder nicht.
  • Weiterhin ist bevorzugt, dass die Proben, insbesondere die Blutproben, auf die Anwesenheit von Nukleinsäure untersucht werden. Bei den Nukleinsäuren kann es sich bevorzugt um DNA, RNA handeln. Weiterhin handelt es sich bevorzugterweise um die Nukleinsäure eines Virus.
  • Die Viren können dabei ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus: humanes Immundefizienz-Virus 1 und 2 (HIV-1 und HIV-2), sowie die HIV-1-Untergruppen M, N und O. Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis B-Virus (HBV), Cytomegalie-Virus (CMV, HHV 5), Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatits E Virus, Parvovirus B19 (PB 19), Humanes T-Zell-Leukämie-Virus I/II (HTLV I/II), West-Nil-Virus (WNV), SARS Coronavirus (SARS CoV), MERS Coronavirus, Dengue und sonstigen Viren, wie EBV, HHV 8, HGV/GBVC, TTV oder Chikungunya. Es kann ebenso die Anwesenheit der Nukleinsäuren bisher unbekannter Viren untersucht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine simultane Untersuchung auf die Anwesenheit der Nukleinsäure von mehreren Viren. Bevorzugt wird das Verfahren zur simultanen Untersuchung auf 7 Viren verwendet, wie HCV, HIV-1, -2, HBV, HAV HEV und PB 19.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann die Untersuchung auf freie, z.B. im Plasma zirkulierende, Nukleinsäuren erfolgen. Bei dieser Ausführungsform wird bevorzugt eine großvolumige Probe eines Blutbestandteils eines Patienten verwendet. Enthaltene Nukleinsäuren werden dem beschriebenen Verfahren zugeführt.
  • Bei bevorzugten Extraktionsverfahren handelt es sich um Lyse mit Hilfe von Detergenzien, Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren unter sauren Bedingungen an Magnetpartikel, Verwendung von Extraktionsreagenzien auf Basis chaotroper Salze (wie in Verbindung mit Membranen oder Magnetpartikeln als Festphase) oder weiterer dem Fachmann bekannter Extraktionsmethoden.
  • Weiterhin ist bevorzugt, dass der/die Probenpools auf einen ggf. bevorzugten nachfolgenden Amplifizierungsschritt vorbereitet werden. Bevorzugt erfolgt dabei eine Aufreinigung der Nukleinsäuren durch Bindung an eine Festphase, ein bis mehrere Waschschritte und Elution der aufgereinigten und aufkonzentrierten Nukleinsäuren.
  • Insbesondere erfolgt die Extraktion und PCR-Vorbereitung für 7 Viren simultan, wie HCV, HIV-1, -2, HBV, HAV, HEV, PB 19.
  • Bevorzugterweise können in einem erfindungsgemäßen Verfahren bei einer maximalen Poolgröße von n = 15 und bei maximal 4fachem (2stufigem) Beads Pooling in 3 Durchgängen 3780 Proben in 8 Stunden analysiert werden.
  • Bevorzugt werden 2 bis 15 Proben pro Probenpool zusammengeführt (Schritt b) des Verfahrens). Bevorzugterweise können erfindungsgemäß 2, 5, 10 oder 15 Proben zu einem Probenpool zusammengeführt werden (Schritt a). So können bevorzugt 15 Proben von jeweils 100 µl, 5 Proben von jeweils 300 µl oder 2 Proben von jeweils 750 µl zusammengeführt werden. Das bevorzugte Gesamtvolumen eines Probenpools beträgt 1,5 ml.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren bietet eine vorteilhafte hohe Flexibilität für ein potentielles Hochskalieren ("scaling up"). So kann, wenn eine höhere Sensitivität erforderlich ist, das Ausgangsvolumen der Proben erhöht werden. Es ist bevorzugt, dass 15 Proben von jeweils 100 µl, 5 Proben von jeweils 300 µl oder 2 Proben von jeweils 750 µl verwendet werden.
  • Weiterhin bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, den Probendurchsatz durch das Zusammenführen ("Beads Pooling") von jeweils mindestens 2 Probenpools im Verlaufe der Aufreinigung in bis zu drei Schritten um das doppelte, vierfache bzw. achtfache zu erhöhen.
  • Bevorzugterweise handelt es sich bei einem weiteren Nachweisverfahren um eine Amplifizierung von Nukleinsäuren. Eine erfindungsgemäße Amplifizierung von Nukleinsäuren kann eine PCR, TaqMan PCR, Real Time-PCR, TMA, NASBA, SDA oder LCR umfassen.
  • Weiter ist bevorzugt, dass der Amplifizierung ein Verfahren zur Detektion der amplifizierten Nukleinsäure nachgeschaltet ist. Es ist auch eine Zuführung des Probenpools zu einem Detektionsverfahren möglich, das keine vorherige Amplifikation benötigt.
  • In einer sehr bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Verfahren zur Amplifizierung der Nukleinsäure um eine Real Time-PCR, die zugleich eine online Detektion der amplifizierten Nukleinsäure ermöglicht.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Vorrichtung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie sich für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich bevorzugt zur Erstellung der Probenpools, der automatischen Nukleinsäureextraktion inklusive BeadsPooling, PCR-Vorbereitung und Analyse der Rohdaten. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht die vorteilhafte Verknüpfung der Gefäße, in denen sich die Probenpools befinden, mit einem automatischen Extraktionsverfahren.
  • Eine erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst mehrere Komponenten:
    • – mindestens eine automatisierte Pipettier-Station,
    • – mindestens einen Magnetseparator,
    • – mindestens einen Flüssigkeitsbearbeitungsarm, und
    • – mindestens einen Roboter-Arm, und gegebenenfalls und bevorzugt
    • – mindestens eine Amplifikationseinheit und
    • – mindestens eine Detektionseinheit.
  • Entsprechende Komponenten sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Dabei kann der Magnetseparator in die automatisierte Pipettierstation integriert sein. Nach Zugabe einer Flüssigkeit (mit Zusatz von magnetischen Festphasen) zu Probenpools oder Einzelproben erfolgt ein Durchmischen (z.B. durch Auf- und Abpippetieren). Anschließend wird die Flüssigkeit durch den Flüssigkeitsbearbeitungsarm in Reaktionsgefäße auf einen Magnetseparator oder optional durch Elektro- oder Permanentmagneten die magnetischen Festphasen in Reaktionsgefäße überführt ("Eintauchverfahren"). Hierbei können die magnetischen Festphasen von jeweils 2 Probenpools oder Einzelproben durch Transfer in dasselbe Reaktionsgefäß zusammengeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind alle Komponenten als eine integrierte Vorrichtung ausgelegt und befinden sich in einem Gehäuse.
  • Als Komponenten der erfindungsgemäßen Vorrichtung eignen sich beispielsweise Geräte der Firma Hamilton, Schweiz. So eignet sich als Pipettierautomat beispielsweise ein Pipettierautomat vom Typ Hamilton Star oder Hamilton Vantage und als Magnetseparator beispielsweise ein Gerät vom Typ King Fischer. Geeignete Komponenten sind auch Geräte anderer Hersteller, wie z.B. Tecan, Beckman, Xiril, Sias, ThermoFisher, Qiagen.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist weiterhin bevorzugt Software-gesteuert. Der Extraktionsprozess kann durch eine erfindungsgemäße Software gesteuert werden. Die Überwachung des Gesamtprozesses (Pooling, Extraktion, Beads Pooling, Detektion, Auswertung) kann durch Software erreicht werden. Die Software überwacht den Gesamtprozess. Die Software gibt dabei den Softwareprogrammen der einzelnen Teilprozesse Arbeitslisten vor und verarbeitet, bewertet und archiviert z.B. Fehlermeldungen und Ergebnisse der Teilprozesse. Die erfindungsgemäße Software kann bevorzugt zur Integration von Pooling, Extraktion, Beadspooling, PCR-Vorbereitung und Real Time-PCR programmiert werden.
  • Daher ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Computerprogramm zur Steuerung und Überwachung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Es wird außerdem besonders bevorzugt, dass eine Probe, wie eine Blutspendeprobe, bis zum Ergebnis durch eine Barcode-Markierung verfolgt wird und damit identifiziert werden kann. Das direkte Pooling in mit Barcodes versehene Gefäße, sowie die im Anschluss an den Anreicherungsprozess erfolgende automatisierte, barcodekontrollierte Nukleinsäureextraktion, Amplifikation und Detektion schließt eine Probenverwechslung während des gesamten Prozesses der NAT-Testung aus. Somit lassen sich durch das erfindungsgemäße Verfahren der hohe Durchsatz und die hohen Sensitivitäten eines Verfahrens welches einen Anreicherungsschritt beinhaltet mit der hohen Sicherheit eines automatisierten und vollständig barcodekontrollierten Prozesses kombinieren.
  • Das bei bisherigen Verfahren unter Einbeziehung von manuellen Teilschritten zur Virusanreicherung bestehende Risiko von Probenverwechslungen lässt sich durch das erfindungsgemäße Verfahren effektiv beseitigen. Zu diesem Zweck erfolgt das Pooling der Proben, insbesondere von Blutproben, direkt in mit Barcodes versehene Gefäße. Diese Gefäße werden einem Extraktionsverfahren zugeführt, das durch Barcodeüberwachung bzw. physikalisch feste Zuordnung keine Probenverwechslungen zulässt. Bevorzugt handelt es sich dabei um einen vollautomatisierten homogenen Prozess ohne manuelles Eingreifen. Dem Extraktionsprozess inklusive Beads Pooling schließen sich ein automatisiertes und Software-überwachtes PCR-Setup, Amplifikation sowie Software-gestützte Detektion und Auswertung an.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft dann die Verwendung einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten oder einzelnen Proben gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben.
  • Die Möglichkeit, vorab gepoolte Proben ebenfalls zu prozessieren und nochmals im vorgesehenen nachfolgenden Prozess in größere Pools zusammenzuführen wäre ebenfalls möglich, inklusive der Option dieses Vorpooling auf demselben Automaten durchzuführen. Dadurch wäre es auch in diesem Fall möglich, ohne separate Poolingautomaten Primärröhrchen direkt auf die Plattform zu laden und das Vorpooling im gleichen Prozess automatisiert durchzuführen.
  • Bei kleinem Blutaufkommen und hoher Prävalenz ist die Einzelspendentestung die Methode Wahl. Bei größerem ist die Zusammenführung von jeweils mindestens 2 Einzelproben oder die Bildung von kleineren Minipools aus z.B. nur noch 10 oder weniger Blutspenderproben im Verlaufe der Extraktion in mehreren folgenden Schritten vorzuziehen. Durch dieses Verfahren kann selbst bei hoher Prävalenz ein ausreichender Durchsatz erreicht werden. Bei niedriger Prävalenz ist sogar eine Hochdurchsatz-NAT möglich.
  • Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren verdeutlicht werden, ohne jedoch auf die Beispiele beschränkt zu sein.
  • Figuren
  • 1 Eine Vorrichtung und ein Flussdiagramm der Option 1 aus Beispiel 1.
  • 2 Eine Vorrichtung und ein Flussdiagramm der Option 2 aus Beispiel 2.
  • Beispiele
  • In den folgen Beispielen 1 und 2 sind zwei mögliche Optionen des beschriebenen Prinzips als 8-fach, bzw. 4-fach Beads Pooling dargestellt, wobei die drei Segmente alle auf einer einzigen Testplattform in einem kontinuierlichen Prozess zusammengefasst sind. Anstelle der Einzelspender Proben können auch „vor“gepoolte Proben zur Verfügung gestellt werden, die separat, oder auf derselben Plattform pipettiert werden.
  • Anstelle von Einzelspenden können auch Probenpools und anstelle von jeweils 2 Proben (Probenplatten), wie hier dargestellt, können auch 3 und mehr Proben oder Probenpools zusammengefasst werden.
  • Beispiel 1: Prozessierung von 48 Proben (Dauer ca. 4 h)
  • Das Pooling erfolgt auf derselben automatisierten Pipettier-Station wie Extraktion und PCR-Setup.
  • Dazu werden bis zu 48 mit Barcodes versehene Primärröhrchen (EDTA-Vacuette, Greiner, Frickenhausen), die zuvor bei 5.500 × g für 15 min zur Trennung von Plasma und zellulären Blutbestandteilen zentrifugiert (Multifuge, Kendro, Osterode) wurden, auf Stripracks dem Pipettierroboter zugeführt. Zusätzlich werden bis 48 barcodierte Poolgefäße (z.B. Röhrchen) auf der Arbeitsfläche des Pipettierroboters platziert. Zur Automatisierung der Nukleinsäureisolierung ist der Pipettierautomat mit einem Magnetseparator versehen. Für die Extraktion der viralen Nukleinsäuren wird z.B. eine auf Magnetpartikeln basierende Extraktionschemie verwendet, die in der deutschen Patentanmeldung DE 102 58 258 A1 offenbart ist. Zusätzlich zu den 48 barcodierten Röhrchen wird der Extraktionsautomat mit Verbrauchsmaterialien (Einweg-Tips, Reaktionsgefäßen), Extraktionsreagenzien (autoX Extraktionskit, GFE Blut) und PCR-Reagenzien für HIV, HCV, HBV, HAV und PB19 (sogenannten Mastermixen) versehen.
  • Nach dem Start des vollautomatischen Extraktionsprozesses werden die Barcodes der Primärröhrchen eingelesen aus jedem Primärröhrchen 100 µl Plasma entnommen und in das Zentrifugenröhrchen (Poolgefäß) abgegeben. Die Probenpools werden mit je 800 µl Bindepuffer versetzt. Anschließend werden diese für 10 min agitiert. Nachfolgend wird das Lysat aus je 2 Röhrchen in einem Reaktionsgefäß vereinigt und der Lysatrest von den magnetischen Partikeln separiert und nur die magnetischen Partikel mit den gebundenen Nukleinsäuren weiter prozessiert. Es folgen zwei Waschschritte mit Protease-haltigem Waschpuffer und die Elution der Nukleinsäuren in einem Puffer niedriger Ionenstärke bei 80°C (Heizblock des Magnetseparators). Trennung von Flüssigkeit und Nukleinsäurebindender Matrix erfolgt dabei jeweils durch magnetische Separation auf dem Magnetseparator.
  • Nach erfolgter Nukleinsäureisolierung schließt sich das vollautomatisierte PCR-Setup an. Dieses erfolgt, ebenso wie die Nukleinsäureextraktion vollständig Barcode-kontrolliert und nach einer Arbeitsliste, die von einer Software erstellt wird. Zu diesem Zweck werden die jeweiligen virusspezifischen PCR-Mastermixe, die zuvor auf der Arbeitsfläche des Extraktionsautomaten positioniert wurden, in die jeweiligen PCR-Platten vorgelegt und die Extrakte nachfolgend hinzugefügt. Die Gesamtdauer für Extraktion und PCR-Setup beträgt ca. 2,5 h.
  • Als Pipettierautomat und dessen Komponenten eignen sich beispielsweise Geräte der Firma Tecan, Crailsheim. So eignet sich als Pipettierautomat beispielsweise ein Pipettierautomat vom Typ Freedom EVO, als Magnetseparator beispielsweise ein Gerät vom Typ TeMagS und als Schüttler beipielsweise ein Gerät vom Typ IKA KS control 130.
  • Als Magnetpartikeln eignen sich beispielsweise MagPrep®-Silica der Firma Merck, Darmstadt.
  • Die Barcode-Kontrolle sowie die Steuerung und Überwachung der Extraktion und des PCR-Setups ist Software-gesteuert.
  • Abschließend erfolgt manuelles oder automatisiertes Versiegeln der PCR-Platten und der Transfer selbiger in Real Time-PCR-Thermocycler. Die Amplifizierung wird wie bereits veröffentlicht durchgeführt, für HIV-1 siehe Drosten C. et al. (J. Clin. Microbiol., 2001, 39: 4302–4308), für HBV siehe Drosten C. et al. (Transfusion, 2000, 40: 718–427) oder für HCV, HBV und HIV-1 siehe Roth WK et al. (Lancet, 1999, 353: 359–363). Bevorzugt handelt es sich um einen TaqMan PCR-Assay mit einer kompetitiven internen Kontrolle.
  • Die obige Amplifikation und Detektion beansprucht ca. 2 h.
  • Als Thermocycler eignen sich beispielsweise Geräte vom Typ LightCycler® 480 (Roche Diagnostics).
  • Ergebnisse: Bei dem beschriebenen Versuch wurde vollständige Barcode-Kontrolle des Prozesses der NAT-Testung erzielt. Eine Probenverwechslung konnte so sicher ausgeschlossen werden. Für die einzelnen Viren wurden bezogen auf die Einzelspende die für das autoX-System der GFE Blut erzielten 95%-Nachweisgrenzen (997 IU/ml für HCV, 1029 IU/ml für HIV-1, 59 IU/ml für HBV, 1099 IU/ml für HAV und 362 IU/ml für PB19) in der 3fachen Konzentration eingesetzt. Es wurden keine Ausfälle beobachtet, so dass von einer vergleichbaren Sensitivität des beschriebenen Verfahrens ausgegangen werden kann.
  • Beispiel 2: Prozessierung von 192 Proben (Dauer ca. 3 Stunden)
  • Die Vorbereitung der Proben erfolgte manuell, kann aber auch auf einer Pipettierplattform durchgeführt werden. Die Extraktion erfolgt auf dem KingFischer Flex der Fa. ThermoFisher und das PCR-Setup im vorliegenden Beispiel manuell (kann auch auf einer Pipettierplattform durchgeführt werden.
  • Dazu werden bis zu 192 mit Barcodes versehene Primärröhrchen (EDTA-Vacuette, Greiner, Frickenhausen), die zuvor bei 5.500 × g für 15 min zur Trennung von Plasma und zellulären Blutbestandteilen zentrifugiert (Multifuge, Kendro, Osterode) wurden, auf Stripracks dem Pipettierroboter zugeführt. Zusätzlich werden bis zu 2 barcodierte Poolgefäße (z.B. 96 well Platte) auf der Arbeitsfläche des Pipettierrobotters platziert. Zur Automatisierung der Nukleinsäureisolation soll der Pipettierautomat mit einem Magnetseparator (KingFisher) versehen werden, da dies noch nicht realisiert ist, erfolgt die Extraktion auf einem separaten KingFisher Modul. Für die Extraktion der viralen Nukleinsäuren wird z.B. eine auf Magnetpartikeln basierende Extraktionschemie verwendet, die in der deutschen Patentanmeldung DE 102 58 258 A1 offenbart ist. Zusätzlich zu den 4 barcodierten 96well Platten wird der Extraktionsautomat mit Verbrauchsmaterialien (Einweg-Tips, Reaktionsgefäßen, Deepwell-Platten), Extraktionsreagenzien (autoX Extraktionskit, GFE Blut) und PCR-Reagenzien für HIV, HCV, HBV, HAV und PB19 (sogenannten Mastermixen) versehen.
  • Nach dem Start des Prozesses zur Probenvorbereitung (auch für Pooling) werden die Barcodes der Primärröhrchen eingelesen aus jedem Primärröhrchen 100 µl Plasma entnommen und in die 96well Platte abgegeben. Die Probenpools werden mit je 800 µl Bindepuffer versetzt und auf das King Fischer Modul verbracht. Anschließend werden die Proben für 10 min agitiert. Nachfolgend wird der Lysatrest von den magnetischen Partikeln separiert und nur die magnetischen Partikel mit den gebundenen Nukleinsäuren aus je 2 Plattenpositionen in einer Position einer 96well Platte vereinigt und weiter prozessiert. Es folgen zwei Waschschritte mit Protease-haltigem Waschpuffer und die Elution der Nukleinsäuren in einem Puffer niedriger Ionenstärke bei 80°C (Heizblock des Magnetseparators). Trennung von Flüssigkeit und nukleinsäurebindender Matrix erfolgt dabei jeweils durch magnetische Separation mittels Magnetseparator (Eintauchverfahren mit Permanentmagnet-Kopf).
  • Nach erfolgter Nukleinsäureisolierung kann das vollautomatisierte PCR-Setup gestartet werden (in diesem Beispiel erfolgte dies manuell). Dieses erfolgt ebenso wie die Nukleinsäureextraktion vollständig Barcode-kontrolliert und nach einer Arbeitsliste, die von einer Software erstellt wird. Zu diesem Zweck werden die jeweiligen virusspezifischen PCR-Mastermixe, die zuvor auf der Arbeitsfläche des Extraktionsautomaten positioniert wurden, in die jeweiligen PCR-Platten vorgelegt und die Extrakte nachfolgend hinzugefügt. Die Gesamtdauer für Extraktion und PCR-Setup beträgt ca. 1 h.
  • Als Pipettierautomat und dessen Komponenten eignen sich beispielsweise Geräte der Firma Tecan, Crailsheim. So eignet sich als Pipettierautomat beispielsweise ein Pipettierautomat vom Typ Freedom EVO, als Magnetseparator beispielsweise ein Gerät vom Typ KingFisher Flex.
  • Als Magnetpartikeln eignen sich beispielsweise MagPrep®-Silica der Firma Merck, Darmstadt.
  • Die Barcode-Kontrolle sowie die Steuerung und Überwachung der Extraktion und des PCR-Setups ist Software-gesteuert.
  • Abschließend erfolgt manuelles oder automatisiertes Versiegeln der PCR-Platten und der Transfer selbiger in Real Time-PCR-Thermocycler. Die Amplifizierung wird wie bereits veröffentlicht durchgeführt, für HIV-1 siehe Drosten C. et al. (J. Clin. Microbiol., 2001, 39: 4302–4308), für HBV siehe Drosten C. et al. (Transfusion, 2000, 40: 718–427) oder für HCV, HBV und HIV-1 siehe Roth WK et al. (Lancet, 1999, 353: 359–363). Bevorzugt handelt es sich um einen TaqMan PCR-Assay mit einer kompetitiven internen Kontrolle.
  • Die obige Amplifikation und Detektion beansprucht ca. 2 h.
  • Als Thermocycler eignen sich beispielsweise Geräte vom Typ LightCycler® 480 (Roche Diagnostics).
  • Ergebnisse: Bei dem beschriebenen Versuch wurde vollständige Barcode-Kontrolle des Prozesses der NAT-Testung erzielt. Eine Probenverwechslung konnte so sicher ausgeschlossen werden. Für die einzelnen Viren wurden bezogen auf die Einzelspende die für das autoX-System der GFE Blut erzielten 95%-Nachweisgrenzen (997 IU/ml für HCV, 1029 IU/ml für HIV-1, 59 IU/ml für HBV) in der 3fachen Konzentration eingesetzt und jeweils mit einer negativen Probe durch Beads Pooling zusammengeführt. Es wurden keine Ausfälle beobachtet, so dass von einer vergleichbaren Sensitivität des beschriebenen Verfahrens ausgegangen werden kann.

Claims (16)

  1. Verfahren zum automatisierten Bearbeiten von zu untersuchenden Proben, umfassend folgende Schritte: a) zur Verfügung stellen von zu untersuchenden Proben in Gefäßen, die je mit einer maschinenlesbaren Markierung versehen sind, b) gegebenenfalls, Zusammenführung (Pooling) der Proben aus a) zu mindestens einem Probenpool in Gefäßen, die ebenfalls je mit einer maschinenlesbaren Markierung versehen sind, c) Zugabe einer Lösung, die zur Lyse von Zellen geeignet ist zusammen mit magnetischen Beads, die zur Bindung von Nukleinsäuren geeignet sind, zu der Probe aus a) oder b), d) Bindung der Nukleinsäuren in der Probe an die magnetischen Beads, e) Bindung der magnetischen Beads in der Probe an einen Magneten, f) Pooling der Beads aus e) durch Überführung der Magnetpartikel aus mindestens 2 Proben in ein gemeinsames neues Gefäß, g) Wiederholung der Schritte a) bis f) mit mindestens einem zweiten Set von zu untersuchenden Proben, h) Pooling der Beads aus den Probenpools aus den Schritten f) und g) zu einem gemeinsamen Pool an Beads aus mindestens 4 Probenpools, i) Wiederholung der Schritte a) bis h) mit mindestens einem zweiten Set von zu untersuchenden Proben, j) Überführen der Beads der Probenpools aus den Schritten h) und i) zu einem mindestens 8-fachen Beads Pool, k) Eluieren des Pools aus j) mit Elutionspuffer, und l) Zuführen der eluierten Nukleinsäure aus Schritt k) zu einem oder mehreren weiteren Nachweisverfahren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren einen oder mehrere Waschschritte mit Waschpuffer und Hilfe eines Magneten umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt b) 2 bis 15 Proben pro Probenpool zusammengeführt werden.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die zu untersuchenden Proben ausgewählt sind aus Blutproben und anderen Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Plasma, Serum, zellulären Blutbestandteilen und/oder weiteren Blutprodukten.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Poolen der Blutproben direkt in mit Barcodes versehenen Gefäßen durchgeführt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei dieses vollständig ohne manuelles Eingreifen durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Proben auf die Anwesenheit von Nukleinsäure hin untersucht werden, bevorzugterweise auf die Anwesenheit der Nukleinsäure eines Virus, wie HCV, HIV, HBV, HAV und PB 19.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei freie, z.B. im Plasma zirkulierende, Nukleinsäuren nachgewiesen werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei 15 Proben von jeweils 100 µl oder 2 Proben von jeweils 750 µl zusammengeführt werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das weitere Nachweisverfahren in Schritt l) eine Amplifizierung von Nukleinsäuren umfasst, wie zum Beispiel eine PCR, TaqMan PCR, Real Time-PCR, TMA, NASBA, SDA oder LCR.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, weiter umfassend ein Verfahren zur Detektion der amplifizierten Nukleinsäure oder der Detektion der Nukleinsäure des Probenpools ohne vorherige Amplifikation.
  12. Vorrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich für die Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 eignet.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie sich zur Erstellung der Probenpools, der automatischen Nukleinsäureextraktion inklusive Beads Pooling, PCR-Vorbereitung und/oder der Analyse der Rohdaten eignet.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie folgende Komponenten umfasst: – mindestens eine automatisierte Pipettier-Station, – mindestens einen Magnetseparator, – mindestens einen Flüssigkeitsbearbeitungsarm, und – mindestens einen Roboter-Arm, sowie gegebenenfalls – mindestens eine Amplifikationseinheit und – mindestens eine Detektionseinheit.
  15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass alle Komponenten als eine integrierte Vorrichtung ausgelegt sind und sich in einem Gehäuse befinden.
  16. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15 zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten oder einzelnen Proben nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
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US15/326,894 US10378008B2 (en) 2014-08-06 2015-08-05 Method and apparatus for automated processing of pooled samples
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JP2017526763A JP2017529098A (ja) 2014-08-06 2015-08-05 プールサンプルの自動処理のための方法及び装置
EP15750677.5A EP3177934A1 (de) 2014-08-06 2015-08-05 Verfahren und vorrichtung zur automatisierten verarbeitung von gepoolten proben
AU2015298962A AU2015298962B2 (en) 2014-08-06 2015-08-05 Method and apparatus for automated processing of pooled samples
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180135040A1 (en) 2016-02-16 2018-05-17 Life Magnetics, Inc. Methods for separating nucleic acids with graphene coated magnetic beads
JP6771903B2 (ja) * 2016-02-29 2020-10-21 シスメックス株式会社 検体前処理装置、検体前処理カートリッジおよび検体前処理方法
JP2018171029A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 倉敷紡績株式会社 核酸分離装置
WO2021233996A1 (en) * 2020-05-19 2021-11-25 Alacris Theranostics Gmbh Method and system for fighting pandemic
WO2022031360A2 (en) * 2020-06-04 2022-02-10 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for analyte detection using electromagnetically induced resonance
EP3945318B1 (de) * 2020-07-31 2023-12-20 Synlab Holding Deutschland GmbH Verfahren zur bündelung von proben für analytnachweis
CN116323972A (zh) * 2020-10-22 2023-06-23 K·高 样品汇集与处理的方法和系统
EP4261546A1 (de) * 2020-12-14 2023-10-18 Universal Bio Research Co., Ltd. Probenpooling-vorrichtung und probenpooling-system
KR20240004692A (ko) * 2021-04-29 2024-01-11 애벗트 라보라토리이즈 고-처리량 분석을 위한 샘플 풀링 시스템 및 방법
WO2023004253A1 (en) * 2021-07-19 2023-01-26 Verily Life Sciences Llc Sample pooling assay
WO2023007883A1 (ja) * 2021-07-28 2023-02-02 株式会社島津製作所 検体前処理装置及び検体プール検査方法
WO2023007814A1 (ja) * 2021-07-30 2023-02-02 株式会社島津製作所 検査システム
US11450412B1 (en) 2021-07-30 2022-09-20 Specialty Diagnostic (SDI) Laboratories, Inc. System and method for smart pooling
WO2024005455A1 (ko) * 2022-06-28 2024-01-04 주식회사 씨젠 자동 샘플 풀링 시스템 및 이를 이용한 샘플 풀링 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030723A1 (en) * 1997-01-06 1998-07-16 Alpha Therapeutic Corporation Method of pcr testing of pooled blood samples
DE102005054206A1 (de) * 2005-11-14 2007-07-12 Roth, Willi, Prof. Dr. Verfahren und Vorrichtung zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten Proben
DE102006033853B3 (de) * 2006-07-21 2008-03-06 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Verfahren und Vorrichtung zur Erhöhung der Sensitivität des HIV-Nachweises auf Nukleinsäureebene

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10258258A1 (de) 2002-12-13 2004-06-24 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
CN101457204A (zh) * 2007-12-10 2009-06-17 广达电脑股份有限公司 自动化遗传物质处理系统及方法
ES2617258T5 (es) * 2010-07-29 2023-11-15 Hoffmann La Roche Preparación de muestras genéricas
US10933417B2 (en) * 2013-03-15 2021-03-02 Nanobiosym, Inc. Systems and methods for mobile device analysis of nucleic acids and proteins
WO2015192331A1 (zh) * 2014-06-17 2015-12-23 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 核酸提取装置及其工作方法
AU2016262545B2 (en) * 2015-05-12 2022-06-16 Gen-Probe Incorporated Method of pooling blood samples

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998030723A1 (en) * 1997-01-06 1998-07-16 Alpha Therapeutic Corporation Method of pcr testing of pooled blood samples
DE102005054206A1 (de) * 2005-11-14 2007-07-12 Roth, Willi, Prof. Dr. Verfahren und Vorrichtung zum automatisierten Bearbeiten von gepoolten Proben
DE102006033853B3 (de) * 2006-07-21 2008-03-06 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Verfahren und Vorrichtung zur Erhöhung der Sensitivität des HIV-Nachweises auf Nukleinsäureebene

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