DE60114389T2 - Verfahren zum konzentrieren und wiederfinden von viraler enzymaktivität in biologischen proben - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentration und Gewinnung einer viralen Enzymaktivität aus biologischen Proben. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Konzentration und Gewinnung einer Enzymaktivität aus umhüllten Viren, die in einer biologischen Probe vorliegen. Die Erfindung betrifft auch eine kommerzielle Verpackung, die bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung nützlich ist.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In einem Virion (Viruspartikel) ist die virale Nukleinsäure durch ein Proteincapsid bedeckt und in einigen der komplexeren tierischen Viren ist das Capsid selbst von einer Hülle umgeben, enthaltend Membranlipide und Glycoproteine. Unter diesen umhüllten Viren sind diejenigen, die heutzutage die meiste Aufmerksamkeit erfahren die unterschiedlichen Retroviren, insbesondere HIV (menschliches Immunodefizienzvirus). Der Name Retrovirus stammt von der Richtung des Flusses der genetischen Information bei diesen Viren, nämlich von RNA zur DNA der Zelle. Es wurde festgestellt, daß einige retrovirale Stämme in einer Art symbiotisch und in einer anderen pathogen sind. Diese Feststellungen zeigen ein potentiell schweres Problem bei der Xenotransplantation (Transplantation von tierischen Organen in Menschen). Sowohl endogene als auch exogene Retroviren können zu einer vertikalen und horizontalen Übertragung von genetischem Material innerhalb und zwischen Arten beitragen und stellen Mechanismen für die Evolution neuer pathogener Mittel bereit.
  • Während der letzten Dekade gab es einen steigenden Bedarf an Verfahren zur Diagnose und Überwachung von retroviralen Infektionen, wie auch einer Forschung an einer Pathogenese neuer Retroviren. Der Stand der Technik wird am besten durch die Verfahren illustriert, die gegenwärtig beim Management der HIV-Infektion verwendet werden. Im Labor wird die HIV-Infektion durch Messung von a) Antikörpern gegen das HIV-Antigen, b) zirkulierendes HIV-Antigen, c) Virusisolation, d) HIV-RNA in Zirkulation und e) Provirus-DNA integriert in Zellen nachgewiesen und überwacht. Das Verfahren der Wahl hängt von dem Zweck des Tests und dem Fortschritt der Erkrankung ab.
  • Der gegenwärtig akzeptierte Marker für eine virale Belastung in der klinischem Umgebung ist die Messung der Kopiezahl von HIV-RNA im Plasma. Dies kann entweder durch PCR, NASBA oder durch verzweigte DNA-Techniken (Revets et al., 1996) erreicht werden. Gegenwärtig verwendete Assays haben ein Nachweislimit von 20 RNA-Kopien/ml Plasma (Perrin et al., 1998). Da alle Techniken für den Nachweis viraler Nukleinsäuren auf der Bindung von sequenzspezifischen Primer basieren, gibt es ein signifikantes Risiko, daß sie nicht an neue Stämme oder Sequenzvarianten in einer Probe hybridisieren werden.
  • Ein anderer wichtiger Aspekt in bezug auf in vitro-Messungen von Infektionsparametern ergibt sich, wenn die Ergebnisse auf die in vivo-Situation extrapoliert werden. Etliche Labortechniken involvieren eine Amplifikationsstufe während derer ein Selektionsschritt auftritt. Im schlechtesten Fall sind die amplifizierten hauptviralen Varianten diejenigen, die den verwendeten Primern am besten entsprechen und nicht diejenigen, die in der in vivo-Situation überwiegend vorliegen.
  • Eine direkte Messung viraler Enzyme in Proben aus dem Blut des Patienten würde daher eine attraktive Alternative gegenüber einer Zellkultur oder auf Nukleinsäure basierenden Verfahren sowohl für die Quantifizierung der viralen Replikation als auch für Studien der Wirkung antiviraler Substanzen sein. Die zu überwindenden Hindernisse sind sowohl die Assayempfindlichkeit als auch das reproduzierbare Abtrennen des Enzyms aus wirtsspezifischen Enzymen und aktivitätsinhibierenden Substanzen.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Messung einer Enzymaktivität von einem umhüllten Virus, das in einer biologischen Probe vorliegt, durch Konzentrieren und Gewinnung der Enzymaktivität ohne Isolation der Virions.
  • Die Verfahren aus dem Stand der Technik, die auf eine Konzentration und Reinigung unterschiedlicher Viren abzielen, sind entweder spezifische Verfahren, die auf den antigenen Eigenschaften der Virusproteine basieren oder verallgemeinerte Verfahren, die auf den grundlegenden chemischen oder physikalischen Eigenschaften des Virus basieren. Nur die letzte Art von Verfahren kann als relevant für eine Reinigung von antigen hochvariablen Retroviren wie HIV betrachtet werden.
  • Viren wurden traditionell teilweise durch unterschiedliche Arten einer Zentrifugation gereinigt, entweder durch einfaches Pelletieren des Virus oder in Kombination mit einer Verwendung von Präzipitationsmitteln wie zum Beispiel Polyethylenglykol ( US 5661022 ). Eine Zentrifugation in Dichtegradienten führte zu reineren Viruspräparationen ( US 4729955 ).
  • Ein anderer Ansatz war das Binden des Virus an unterschiedliche Arten von Adsorbentien. Porath und Jansson ( US 3925152 ) verwendeten unlösliche organische makroporöse Polymere, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Agar, Agarose, Dextran und Cellulose, enthaltend amphotere Substituenten, bestehend aus sowohl basischen stickstoffhaltigen Gruppen als auch Carboxylat oder sulfonierten Gruppen. Adsorbierte Viren konnten in ihrem System mit Lösungen von aufeinanderfolgend unterschiedlicher Ionenstärke eluiert werden um eine Virusvariantenauftrennung zu erhalten. Auf ihre Pionierarbeit folgten während der letzten beiden Dekaden viele verwandte Reinigungstechniken, basierend auf einer Interaktion von Viren mit Gelen mit entweder anionischen oder kationischen Ionenaustauscherresten ( US 3655509 ). Retroviren und das verwandte Hepatitis B-Virus wurden zum Beispiel unter Verwendung von sowohl Kationenaustausch ( US 5447859 , US 4138287 )) als auch Anionenaustausch ( US 5837520 , US 5661023 ) gereinigt. Die oben zitierten Verfahren basieren alle auf der Bindung des Virus bei niedriger Ionenstärke und Elution bei hoher Ionenstärke.
  • Ein weiterer Ansatz zur Reinigung von Virus und viralen Nukleinsäuren basiert auf einer Bindung von Virus an ein wasserunlösliches vernetztes Polyhydroxypolycarbonsäure-Polymer ( US 5658779 ). Das Virus wird bei pH 6,0 bis 8,0 an das Polymer gebunden, vermutlich durch hydrophobe Wechselwirkungen und kann bei pH 8,0 bis 11,0 desorbiert werden. Eine interessante Anwendung dieser Technik betrifft die Isolierung viraler Nukleinsäuren. In einem solchen Beispiel werden Bakteriophagen von einem bakteriellen Lysat in einem ersten Schritt an das Polymer adsorbiert. Das Polymer wird dann gewaschen und das gebundene Virus wird unter Verwendung von entweder einem Chelatbildner wie EDTA oder einem denaturierenden Mittel wie SDS aufgebrochen. Die viralen Proteine adsorbieren sich ferner an das Polymer und eine virale Nukleinsäure, die im wesentlichen frei von interagierenden Proteinen ist, wird erhalten. Die Verwendung eines ähnlichen Ansatzes für die Reinigung von viralen Proteinen wird beansprucht, jedoch wird das beschriebene Verfahren die Freisetzung der viralen Proteine zusammen mit anderen zellulären und viralen Komponenten, adsorbiert an das Polymer, freisetzen.
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben intensive Untersuchungen an Messungen der Aktivität des viralen Enzyms reverse Transkriptase (RT) durchgeführt. Die RT-Aktivität wurde früher direkt in Serum oder Plasma gemessen (Awad, R.J.K. et al. 1997, Ekstrand et al. 1996). Ein bei diesen frühen Studien angetroffenes Problem war die Induktion von hohen Titern von die RT-Aktivität inhibierenden Antikörpern kurz nach der primären Infektion. Ein weiteres war das gelegentliche Auftreten von RT-Inhibitoren in Proben von HIV-negativen Kontrollen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung für die oben erwähnten Probleme im Stand der Technik bereit. Sie kann weiterhin für eine Konzentration einer viralen Enzymaktivität aus großen Volumina von Flüssigkeiten verwendet werden, d.h. Zellkulturüberständen, die sehr geringe Virusmengen enthalten. Eine andere Anwendung ist die Übertragung des viralen Enzyms aus Virions in hoch inhibitorischen Proben wie zum Beispiel Extrakten von Geweben oder kultivierten Zellen in eine Umgebung, die mit den Enzymassaybedingungen kompatibel ist.
  • So stellt die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Konzentration und Gewinnung viraler Enzymaktivität bereit, insbesondere von umhüllten Viren, aus rohen biologischen Proben wie zum Beispiel Blut, Plasma, Serum, Zellkulturflüssigkeit und Zellextrakten. Sie basiert auf einem Abtrennungsschritt, worin die Virions auf einer festen Matrix gefangen werden. Enzyminhibitorische Antikörper und andere inhibitorische Substanzen werden durch einen Waschschritt entfernt und die Enzyme werden durch Lyse der immobilisierten Virions freigesetzt. Sowohl die Bindungs- als auch die Lyseschritte sind kritisch. Der Bindungsschritt muß eine Fähigkeit haben, fast quantitativ geringe Mengen von Virions aus biologischen Flüssigkeiten, die sehr hohe Proteinkonzentrationen enthalten, wie zum Beispiel Serum oder Plasma, vorzugsweise ohne Bindung von Immunglobulin (Ig) oder anderen potentiell inhibitorischen Substanzen zu immobilisieren. Der Lyseschritt sollte fast quantitativ die viralen Enzyme in eine Umgebung freisetzen, die das Enzym an einer Bindung an die Auftrennmatrix hindert, das native Enzym stabilisiert und mit optimalen Assaybedingungen kompatibel ist.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Konzentration und zur Gewinnung einer Enzymaktivität von umhüllten Viren, die in einer biologischen Probe vorliegen, umfassend die folgenden Schritte:
    die biologische Probe wird in einer ersten Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz im Bereich von 100-500 mM und einem pH von 4,0-8,5 und wahlweise mit chaotropen Ionen in einer Ionenstärke von bis zu 2 M mit einer virenbindenden Matrix in Berührung gebracht, um in der Probe enthaltene Viruspartikel an die Matrix zu binden,
    die Matrix mit den Viruspartikeln wird mit einer zweiten Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 1-100 mM und mit einem Kationengehalt von 0,1-1 M und einem pH von 4-9 gewaschen, um Komponenten zu entfernen, welche die virale Enzymaktivität behindern,
    die immobilisierten Viruspartikel werden in einer dritten Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 10-500 mM und mit einem nicht-denaturierenden Detergens und einem pH von 6-9 lysiert, und
    die konzentrierte virale Enzymaktivität wird aus der dritten Pufferlösung zurückgewonnen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Virusbindungsmatrix eine Anionenaustauschmatrix, z.B. eine Anionenaustauschmatrix, enthaltend tertiäre und/oder quaternäre Amin-Gruppen, wie zum Beispiel Fractogel®, EMD DMAE und Fractogel® EMD TMAE, äquilibriert in 150 mM MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) pH 6,0.
  • In weiteren Ausführungsformen wird der erste Puffer gewählt aus der Gruppe, bestehend aus 150 mM MES pH 6,0 und 200 mM Kaliumiodid (KI), der zweite Puffer wird gewählt aus der Gruppe, bestehend aus 10 mM MES pH 6,0 und 500 mM Kaliumacetat (KAc) und der dritte Puffer wird gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem enzymassaykompatiblen Puffer, beinhaltend ein Detergens, z.B. 1 % Triton X 100 und einer Puffersubstanz, z.B. 100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (Hepes) pH 7,6.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die konzentrierte und gewonnene virale Enzymaktivität eine reverse Transkriptase (RT)-Aktivität.
  • Die biologische Probe wird vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Serum- und Plasmaproben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine kommerzielle Packung, die bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung nützlich ist. Die Packung enthält geschriebene Instruktionen und/oder Instruktionen auf einem Datenträger zur Durchführung der Laborschritte für die Konzentration und Gewinnung einer Enzymaktivität von umhüllten Viren, die in einer biologischen Probe vorliegen und mindestens eine der Komponenten
    einer Virusbindungsmatrix,
    einer ersten Pufferlösung bei einer Konzentration im Bereich 100-500 mM der Puffersubstanz und mit einem pH von 4,0-8,5 und mit chaotropen Ionen in einer Ionenstärke von bis zu 2 M,
    eine zweite Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 1-100 mM und mit einem Kationengehalt von 0,1-1 M und einem pH von 4-9,
    eine dritte Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 10-500 mM und mit einem nicht-denaturierenden Detergens und einem pH von 4-9,
    Minisäulen, und
    Kunststoffröhrchen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Handelspackung ist die Virus-bindende Matrix eine Anionenaustauschermatrix,
    der erste Puffer wird aus der Gruppe bestehend aus 150 mM MES pH 6,0, und 200 mM Kaliumiodid (KI) ausgewählt,
    der zweite Puffer wird aus der Gruppe bestehend aus 10 mM MES pH 6,0, und 500 mM Kaliumacetat (KAc) ausgewählt, und
    der dritte Puffer wird aus der Gruppe bestehend aus RT-Assay-kompatiblen Puffern mit einem Detergens, z.B. 1 % Triton X 100 und einer Puffersubstanz, z.B. 100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure (Hepes) pH 7,6 ausgewählt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Anionenaustauschermatrix eine Anionenaustauschermatrix, enthaltend tertiäre und/oder quaternäre Amin-Gruppen, wie zum Beispiel Fractogel® EMD DMAE und Fractogel® EMD TMAE äquilibriert in 150 mM MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) pH 6,0.
  • Betrachtungen im Hinblick auf die Wahl der Puffer
  • A) Bindungspuffer (der erste Puffer)
  • Der Bindungspuffer wird verwendet um den pH und die Ionenstärke in der Probe auf Werte einzustellen, die eine maximale Bindung der Viruspartikel und gleichzeitig eine minimale Bindung der Wirtskomponenten ergeben, wie zum Beispiel Plasma/Serum-Proteine und insbesondere Antikörper wie auch andere potentiell inhibitorische Substanzen.
  • I) pH
  • Mit einem Anionenaustauscher- und FIV-Virus fanden wir eine Bindung mit Puffern zwischen pH 7,5 und 5,0 in einem System ohne Plasmakomponenten. Im Hinblick auf den isoelektrischen Punkt (Ip) der Plasmakomponenten, die nicht binden sollten, sollte ein pH verwendet werden der so niedrig wie möglich ist. Frische EDTA-Plasmaproben hatten einen pH von ungefähr 8,5. Abhängig von der Behandlung (z.B. Lagerung) kann der pH in solchen Proben auf ungefähr 8,0 fallen.
  • Eine Anzahl von Puffern wurde im Hinblick auf die Fähigkeit zur Normalisierung des pHs in unterschiedlichen Plasmata auf einen definierten pH im Bereich von 3,0-7,5 hin untersucht.
  • Zwei Probleme wurden bei pH-Werten unter 6,0 angetroffen.
    • a) Es war nicht möglich pH-Werte unterhalb von 5,0 mit Konzentrationen des Puffers bis zu 0,5 M zu erreichen.
    • b) Wenn eine 1:1 Mischung von Plasma und Puffer verwendet wurde, traten Präzipitate bei pH-Werten unter 6,0 auf. Zentrifugationsexperimente bestätigten, daß ebenfalls eine Präzipitation von Viruspartikeln im Plasma bei einem pH unter 6,0 begann.
  • Gewählte Werte für den bevorzugten pH-Bereich liegen daher bei 4,0-8,5 und ein pH von 6,0 wird als optimal angesehen.
  • Die gewählte Konzentration des Puffers sollte in einem Bereich von 100-500 mM liegen und 150 mM wird als optimal angesehen.
  • Zwei Puffer, die in dem pH-Bereich von ungefähr 6,0 wirken, wurden untersucht, nämlich (Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan; 2-Bis(2-hydroxyethyl)amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Bis-Tris) und MES.
  • Bis-Tris ist basisch und benötigt eine pH-Einstellung mit großen Mengen Säure. Bei unterschiedlichen pH-Werten wird daher eine Mischung aus pH-Wirkung und Ionenstärke erhalten. MES ist sauer und benötigt weniger Einstellung um den benötigten pH zu ergeben. Bindungsexperimente zeigen an, daß der MES-Puffer etwas besser wirkt und dieser Puffer wurde für Studien im Hinblick auf die Signifikanz der Ionenstärke gewählt.
  • II) Ionenstärke
  • Nachdem man sich für einen pH-Bereich entschieden hatte, untersuchten wir bei welcher Ionenstärke und mit welchen negativen Ionen die Viruspartikel immer noch banden. Sulfat, Acetat, Chlorid und Iodid wurden vorrangig verwendet.
  • Zwei Ionen, die in der chaotropen Reihe weit entfernt lagen, Acetat (Ac) und Iodid wurden in einem breiteren Konzentrationsbereich untersucht. Die Wirkungen waren wie erwartet: Das Iodid begann, die Bindung von Virus bei niedrigerer Konzentrationen zu beeinflussen als das Acetat.
  • Die Bindung wurde mit 50 % durch 500 mM Iodid reduziert, jedoch wird 2 M Ac für diese Wirkung benötigt.
  • Die Menge an gebundenen Ig, die aus dem Gel eluiert werden konnte, wurde nach der Bindung und der Waschung von FIV im Plasma mit unterschiedlichen Kombinationen von Ac und Iodid in den Puffern untersucht.
  • Wenn bei der Bindung keine Salze vorlagen, ergaben sich höhere Restmengen von Ig nach der Lyse (obwohl das Gel bereits mit Salz gewaschen worden war). Iodid war effizienter als Ac, was ungefähr 1,5-fach höhere Mengen restliches Ig ergab. Durch Kombination unterschiedlicher Salze in den zwei Schritten wurde gezeigt, daß Iodid bei der Bindung jedoch Ac bei der Waschung gleich effizient wie Iodid während der ganzen Zeit waren.
  • Nützliche negative Ionen können schwache Eluentien wie Ac bis starke Eluentien wie Iodid sein, wie auch diejenigen Ionen, die zwischen diesen angetroffen werden, im Hinblick auf Eigenschaften in der chaotropen Reihe, vorzugsweise Ac, Cl und Iodid und insbesondere Iodid.
  • Gewählte Werte für die Ionenstärke können variiert werden und können bis zu 2M sein, vorzugsweise 0,1-1 M und insbesondere 200 mM für Iodid bzw. 1 M für Ac.
  • B) Waschpuffer (der zweite Puffer)
    • 1) Der Puffer sollte so effektiv wie möglich Faktoren entfernen, die die Messung/Gewinnung der viralen Enzyme aus dem Gel beeinflussen können. Es ist insbesondere wichtig Antikörper zu entfernen.
    • 2) Der Puffer darf keine Virions aus dem Gel entfernen oder Virions lysieren.
    • 3) Da die Komponenten des Puffers nach einer bestimmten Verdünnung (ungefähr um das 5- bis 9-fache) in dem Enzymassay vorliegen werden, dürfen die Komponenten das Enzym nicht deutlich inhibieren.
  • Kritische Faktoren für den Waschpuffer sind pH und Ionenstärke.
  • I) pH
  • Proteine binden an einen Anionenaustauscher bei einem pH oberhalb ihres isoelektrischen Punkts und bleiben gebunden. Der Ip unterschiedlicher Immunglobuline variiert, liegt jedoch im Durchschnitt bei pH 8,9.
  • Unsere Experimente mit FIV-Virions zeigten, daß Virus in einem Puffer, enthaltend 0,1 M KCl sehr gut an etliche unterschiedliche Anionenaustauscher in einem pH-Bereich von 5,8-7,6 band. Die Gewinnung bei der Lyse nach einem Waschen mit Puffer bei demselben pH war über den ganzen pH-Bereich hoch. Ip für FIV ist daher <5,8.
  • Der gewählte pH-Bereich für den Waschpuffer liegt bei pH 4-9 (obwohl möglicherweise niedrigere pH-Werte für die Verwendung ebenfalls möglich sein könnten).
  • Vorzugsweise liegt der pH-Bereich bei 5,5-8 (die Waschwirkung auf Ig ist vermutlich oberhalb von 8,0 schlecht) und insbesondere 6-7,5. Die Puffersubstanz sollte in relativ niedriger Konzentration vorliegen, die ausreicht, um den pH stabil zu erhalten, die jedoch keine zu hohe Konzentration der Puffersubstanz zu einer Veränderung des pHs im Lysestadium benötigt.
  • Der gewählte Bereich für die Konzentration der Puffersubstanz liegt bei 1-100 mM. Vorzugsweise 5-50 mM und optimal 10 mM.
  • II) Ionenstärke
  • Zu hohe Kationenkonzentrationen können Virus beim Waschen freisetzen, zu niedrige Konzentrationen ergeben restliches Ig und andere inhibierende Substanzen im Lysat.
  • Die Konzentrationsgrenzen werden durch die tatsächlich verwendeten chaotropen Kationen beeinflußt. Es ist wichtig eine so hoch wie mögliche Konzentration zu verwenden, die das Virus nicht freisetzt.
  • Die Konzentration ist auch durch die Wirkung des Ions im Enzym (z.B. RT)-Assay nach der Verdünnung (ungefähr das 5- bis 9-fache) begrenzt, siehe Beispiel 4.
  • Unterschiedliche Anionenaustauscher werden wahrscheinlich mehr oder weniger Rest-Ig ergeben, abhängig von den Eigenschaften der Matrix, bei einer gegebenen Salzkonzentration.
  • Das folgende gilt zum Beispiel, wenn Fractogel TMAE bei pH 6,0 gewaschen wird.
    • 1) Waschen mit Ac bis zu 0,5 M, kein Virusverlust. Bei 1 M Gewinnung von ungefähr 50 %. Bis zu 0,25 M immer noch ungefähr 0,2 % restliches Ig. Bei 0,5 M und höher <0,02 % Rest-Ig.
    • 2) Waschen mit Chlorid (Cl) bis zu 0,25 M kein Virusverlust, bei ungefähr 0,5 M ungefähr 50 %, bei 1 M geht das gesamte Virus verloren. Restliches Ig bei Cl von 0,25 M und höher <0,02 %.
    • 3) Hohe Konzentration von Iod in Abwesenheit von Serumprotein scheint das Virus irreversibel zu beeinflussen, so daß wir keinerlei Enzym(RT)-Aktivität gewinnen konnten. Iod ist daher auf der Bindungsstufe gut, sollte jedoch im Waschpuffer nicht verwendet werden.
  • Der gewählte Konzentrationsbereich für die Kationen im Waschpuffer liegt bei 0,1-1 M, vorzugsweise 0,2-0,6 M und insbesondere wird Ac oder Cl bei 0,2-0,6 M verwendet.
  • C) Lysepuffer (der dritte Puffer)
  • Der Lyseschritt sollte quantitativ die viralen Enzyme in eine Umgebung freisetzen, die das Enzym an einer Bindung an die Abtrennmatrix hindert, das native Enzym stabilisiert und mit optimalen Assay-Bedingungen kompatibel ist.
  • I) Detergens
  • Ein Detergens ist für Lyse des Virus notwendig. Es gibt eine große Anzahl von Detergentien und im gegenwärtigen Kontext sollte das Detergens ein "nicht denaturierendes Detergens" sein, z.B. Polyoxyethansorbitan (Tween) oder t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100). Unterschiedliche Detergentien sind mehr oder weniger effektiv für eine Lyse von Virions und ihre Interferenz in dem Enzym(RT)-Assay bei hohen Konzentrationen ist tatsächlich ziemlich minimal. Daher ist kein besonderer Bereich für die Konzentration notwendig. Es könnte erwähnt werden, daß Triton X100 bei 0,1 % nicht effektiv ist und bei 5 % damit beginnt, Probleme zu machen.
  • II) pH
  • Der pH muß mit dem pH des gewählten Enzymassays kompatibel sein. Weiterhin sollte der pH keine Bindung von viralen Enzymen an den Ionenaustauscher ermöglichen. Wir haben festgestellt, daß es keine Bindung von FIV oder HIV RT bei einem pH von 5,5-8,5 gibt und daß der Ip für HIV RT in der Nachbarschaft von 9,1 liegt. Die Wirkung des pHs auf einen Enzymassay ist daher von besonderer Wichtigkeit.
  • Der gewählte pH-Bereich liegt bei 4-9, bevorzugt 7-8 und optimal 7,6.
  • Die Puffersubstanz sollte in ausreichend hoher Konzentration zugefügt werden um den pH auf 6,0 bis 7,6 einzustellen. Die benötige Konzentration variiert natürlich mit der Konzentration im Waschpuffer. Eine zu hohe Konzentration kann daher in den Enzymassay eingreifen. Der gewählte Konzentrationsbereich der Puffersubstanz liegt bei 10-500 mM, bevorzugt 50-200 mM und optimal 100 mM.
  • Natürlich kann die Pufferlösung zusätzliche Komponenten enthalten, die für den gewählten Enzymassay günstig sind.
  • Die Erfindung wird nun durch die folgende Beschreibung der Ausführungsformen illustriert, insbesondere Verfahren die an die Bereitstellung von RT-Proben angepaßt sind, die akkurat im Hinblick auf die RT-Aktivität durch unsere (Cavidi Tech) kommerzielle colorimetrische RT-Assays analysiert werden können, wie zum Beispiel in unserer schwedischen Patentanmeldung 99024101-1 beschrieben. Diese Ausführungsformen und Beispiele sollen den Umfang der beanspruchten Erfindung nicht begrenzen.
  • Allgemeine Beschreibung der Leistung des erfindungsgemäßen Verfahrens
  • Zwei etwas unterschiedliche Ausführungsformen der Erfindung werden beschrieben.
  • I) Protokoll für eine Chargen-Abtrennung von Plasma
    • 1) Markiere die gewünschte Zahl von 15 ml Zentrifugen-Röhrchen um die zu analysierenden Proben zu identifizieren.
    • 2) Suspendiere das Trenngel vorsichtig in einer 1:1 Gelaufschlämmung und übertrage 400 μl Gelaufschlämmung auf jedes markierte Zentrifugenröhrchen. Zentrifugiere das Gel ab und entferne den Puffer.
    • 3) Mische 500 μl von jedem Plasma, das analysiert werden soll mit dem entsprechenden Volumenbindungspuffer (A). Übertrage jede Plasmapuffermischung in das korrespondierende markierte Zentrifugenröhrchen mit Gel. Füge einen Stopfen hinzu, schüttle die Röhrchen um das Gel in der Probe zu suspendieren und inkubiere eine Stunde auf einer Orbitalschüttelvorrichtung bei Raumtemperatur.
    • 4) Stelle den Waschpuffer (B) her, 30 ml Puffer/Probe wird benötigt.
    • 5) Erlaube es dem Gel sich abzusetzen und entferne den Überstand. Füge 10 ml Waschpuffer (B) hinzu. Füge wieder den Stopfen hinzu, resuspendiere das Gel in dem Waschpuffer durch Schütteln. Lasse das Gel ca. 10 Minuten sedimentieren. Entferne den Stopfen, aspiriere die Waschflüssigkeit vorsichtig, um ein Aspirieren von Gel zu vermeiden.
    • 6) Wiederhole das Waschen gemäß 6. 7) Wiederhole das Waschen gemäß 6.
    • 8) Zentrifugiere die Röhrchen bei ungefähr 500 g für 5- bis 10 Minuten. Aspiriere den gesamten Waschpuffer (B) oberhalb der Geloberfläche.
    • 9) Füge 180 μl Lysepuffer (C) zu jedem Röhrchen zu, füge den Stopfen zu und inkubiere 30 min auf einer Orbitalschüttelvorrichtung bei Raumtemperatur.
    • 10) Zentrifugiere die Röhrchen bei ungefähr 500 g 5- bis 10 Minuten.
  • Die RT-Aktivität, die im Überstand von Schritt 10 gewonnen wurde, kann mit einem sensitiven RT-Aktivitätsassay quantifiziert werden, z.B. den Cavidi®HS-Kits, die auf dem von Ekstrand et al. 1996 beschriebenen Verfahren basieren.
  • II) Protokoll für eine Plasmaauftrennung auf Minisäulen
    • 1) Markiere die gewünschte Menge von 15 ml Kunststoff-Minisäulen um die zu analysierenden Proben zu identifizieren.
    • 2) Stelle den Waschpuffer (B) her, es werden so 20 ml Puffer/Probe benötigt.
    • 3) Suspendiere das Trenngel vorsichtig in einer 1:1-Gelaufschlämmung und übertrage 1000 μl Gel-Aufschlämmung auf jede Säule.
    • 4) Das zu analysierende Plasma wird 1:1 in Bindungspuffer (A) verdünnt. Das System wird für die Analyse von 500 μl Plasma optimiert.
    • 5) Öffne die Säule an beiden Enden und lasse den Puffer in jeder Säule durchlaufen. Füge vorsichtig ein Maximum von 1000 μl Probe gemäß 4) auf die Spitze jeder Säule zu. Schließe die Säule, bevor sie trockengelaufen ist und lasse die Probe für 60 Minuten adsorbieren, bevor das Waschverfahren beginnt.
    • 6) Jede Säule wird mit 2 × 10 ml Waschpuffer (B) gewaschen.
    • 7) Wenn der ganze Waschpuffer durch die Säulen gelaufen ist, füge 200 μl Lysepuffer (C) zu jeder Säule zu, lasse die Säule trockenlaufen und inkubiere 30 min bei Raumtemperatur.
    • 8) Stelle die Säulen auf ein Gestell mit Probensammelröhrchen und füge weitere 300 μl Lysepuffer (C) zu jeder Säule zu. Sammle die Eluate, die die RT von Virions, die in ursprünglichen Proben vorlagen, enthalten.
  • Die in den Eluaten aus Schritt 8 gewonnene RT-Aktivität kann mit einem sensitiven RT-Aktivitätsassay, z.B. den Cavidi® HS-Kits, die auf dem von Ekstrand et al. 1996 beschriebenen Verfahren basieren, quantifiziert werden.
  • Materialien, die in einer bevorzugten Ausführungsform verwendet werden
  • Trenngel: z.B. Fractogel®EMD TMAE oder Fractogel® EMD DMAE äquilibriert in 150 mM MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) pH 6,0, Minisäulen z.B. von Biorad Poly-Prep® (7311553).
  • Kunststoffröhrchen
    • A) Bindungspuffer: 300 mM MES pH 6,0, 400 mM Kaliumiodid (Kl)
    • B) Waschpuffer: 10 mM MES pH 6,0, 500 mM Kaliumacetat (KAc)
    • C) Lysepuffer: Ein RT-Assay kompatibler Puffer, beinhaltend ein Detergens, z.B. 1 % Triton X-100 und eine Puffersubstanz, z.B. 100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (Hepes) pH 7,6.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt zwei Diagramme A und B, die die Wirkungen der Zugabe von unterschiedlichen Kationen zu der RT-Reaktionsmischung unter Standardassaybedingungen zeigen. Symbole: AC (♦), Cl (∎), Br (π), I (O), SCN (♢).
  • 2 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Menge von HIV RT, gewonnen gemäß der Erfindung und der Menge der viralen RNA, gemessen mit HIV 1 RNA-PCR darstellt.
    Symbole: gesammeltes Plasma von 100 gesunden Blutspendern. ♦, Plasma von HIV infizierten Individuen
    Figure 00130001
    .
  • 3 ist ein Diagramm, das den Nachweis von geringen Mengen Retrovirus durch Konzentration der RT-Aktivität aus einem großen Volumen von Zellkulturmedien zeigt.
    Symbole: 1 % Serum (offene Stange), 10 % Serum (geschlossene Stange).
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Screenen der Fähigkeit verschiedener chromatographischer Medien um Retrovirus zu immobilisieren (Tabelle 1)
  • 500 μl eines FIV-versetzten menschlichen Plasmas, verdünnt 1:1 in Bindungspuffer wurde mit 100 μl des angegebenen Gels vermischt. Nach einer Stunde wurden 450 μl Überstand von jeder Probe entnommen und durch 450 μl Lysepuffer ersetzt. Die Proben wurden dann für weitere 30 Minuten inkubiert und die Menge der RT-Aktivität in jedem Überstand und jeder Lysefraktion wurden bestimmt und als Prozentsatz der RT-Aktivität zugefügt zur ursprünglichen Probe berechnet. Es gab eine deutliche Variation der virusbindenden Kapazität unter den überprüften Medien. Die höchste Bindungskapazität wurde unter den anionischen Ionenaustauschmedien mit tertiären oder quaternären Aminen angetroffen. Die Gewinnung von RT-Enzym in der Lysefraktion unter Verwendung der Medien mit guter Bindungskapazität lag bei 53 bis 100 %, was anzeigt, daß keine Bindung der freigesetzten RT an den Anionenaustauscher während der Viruslyse auftrat. Unser Hauptkriterium zur Auswahl von Trennmedien war eine gute Virusbindungskapazität und hohe Gewinnung von FIV RT.
  • Beispiel 2: Rückgewinnung der RT-Aktivität von unterschiedlichen Retroviren, die menschlichem Plasma zugefügt wurden (Tabelle 2)
  • Vier Proben von menschlichem Plasma wurden jeweils mit einem von vier unterschiedlichen Retroviren versetzt. Die Proben wurden 1:1 in einem Probenverdünnungspuffer verdünnt und gemäß dem "Protokoll für die Plasma Trennung auf Minisäulen" unter Verwendung von 500 μl Fractogel TMAE highcap Gel verarbeitet. Jede RT wurde in 300 μl Lysepuffer wiedergewonnen und die Menge RT und Ig in den Lysaten wurde bestimmt und als Prozentsatz der korrespondierenden Mengen in der Ursprungsprobe wieder berechnet. Zwischen 39 und 74 % der RT-Aktivität, die in den ursprünglichen Virus-Präparationen vorlag, wurden in der 300 μl-Lysatfraktion wiedergewonnen. Die Reduktion der Ig-Konzentration lag zwischen dem 2000- und 12000-fachem für die unterschiedlichen Proben.
  • Beispiel 3: Die Wirkungen der Zugabe von unterschiedlichen Kationen zu der RT-Reaktionsmischung (1).
  • Chaotrope Kationen, die die angegebenen Endkonzentrationen ergaben, wurden zu Cavidi HS-Kit Lenti RT-Reaktionslösungen zugefügt. Die Wirkung von fünf unterschiedlichen Kationen auf die Aktivitäten von zwei RTs wurde bewertet: A) FIV-Virions, korrespondierend zu 0,4 μU RT-Aktivität, B) rekombinante HIV 1-RT, korrespondierend zu 0,6 μU RT-Aktivität. Die RT-Aktivität bei jeder Kationenkonzentration wurde in Prozent einer Kontrolle, gemessen unter Standardbedingungen, umgerechnet. Die inhibitorische Wirkung unterschiedlicher Kationen stand in bezug zu der chaotropen Wirkung der Ionen. Die am meisten chaotropen Kationen, SCN und I waren bei allen getesteten Konzentrationen inhibitorisch. Intermediäre Ionen Br und Cl stimulierten die retroviralen RTs bei Konzentrationen unterhalb von 100 mM, waren jedoch bei höheren Konzentrationen steigend inhibitorisch. Aus 1 kann geschlossen werden, daß Cl oder Br Ionen bei Konzentrationen von bis zu 70 mM und Ac Ionen bis zu 200 mM in der Reaktionsmischung eingeschlossen sein können, ohne nachteilige Wirkungen auszulösen.
  • Beispiel 4: Beziehung zwischen der Menge von HIV RT, gewonnen gemäß der Erfindung und Menge viraler RNA, gemessen mit HIV 1 RNA PCR (2)
  • 200 μl-Proben von EDTA-Plasma von HIV-infizierten Individuen und von einem Pool, erhalten von 100 gesunden Blutspendern wurden gemäß dem "Protokoll für die Chargentrennung von Plasma" verarbeitet. Die Menge der RT-Aktivität, die hier aus jeder Probe gewonnen wurde, wurde in einem Übernacht-RT-Assay unter Verwendung des Cavidi HS-Kit Lenti RT bestimmt. Die RT-Aktivitäten, die erhalten wurden, wurden in pg HIV 1 RT gemäß einer internen Standardkurve berechnet. Die Menge von HIV 1 RNA in jeder Probe wurde durch Standard HIV 1 RNA PCR (Roche, Cobas Amplicor HIV monitor version 1,5) gemessen. Werte von <50 RNA-Kopien/ml wurden als entsprechend 25 aufgetragen (2). Eine starke Korrelation wurde zwischen der Menge von Plasma-RT, gewonnen gemäß der Erfindung und der Menge an HIV RNA, gemessen mit PCR angetroffen (r = 0,85, p<0,001, Spearman-Korrelation durch Ranking).
  • Beispiel 5: Nachweis von kleinen Mengen Retroviren durch die Konzentration der RT-Aktivität aus einem großen Volumen von Zellkulturmedien (3).
  • Eagles-Minimal-Essentialmedium (MEM), enthaltend entweder 1 % (offene Stange) oder 10 % (gefüllte Stange) Kälberserum von neugeborenen Kälbern (Gibco) wurde hergestellt. Eine geringe Menge FIV-Virions, korrespondierend zu 0,6 mU RT-Aktivität wurde zu 1, 5 und 25 ml Proben von jeder MEM/Serummischung zugefügt. Jede Probe wurde durch eine 1 ml DEAE A25-Sephadex-Minisäule geführt, gefolgt von einer Waschung mit 20 ml Waschpuffer. Schließlich wurde die RT-Aktivität in einem 300 μl-Elutionspuffer gemäß dem "Protokoll für eine Plasmaabtrennung auf Minisäulen" eluiert. Mit diesem Verfahren gewannen wir mehr als 70 % der Virus-assoziierten RT aus 25 ml Medium solange die Serumkonzentration 1 % nicht überstieg. Die korrespondierende Zahl bei 10 % Serum war ungefähr 50 % (3).
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  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Tabelle 2: Gewinnung der RT-Aktivität von unterschiedlichen Retroviren, zugefügt zu menschlichem Plasma
    Figure 00190001
    • a Katzenimunodefizienzvirus
    • b Rinderleukämievirus
    • c Jaagsiekte-Schafretrovirus
    • d Muriner Leukämievirus

Claims (11)

  1. Verfahren zur Konzentration und Wiederherstellung einer Enzymaktivität aus in einer biologischen Probe enthaltenen umhüllten Viren, enthaltend folgende Schritte: die biologische Probe wird in einer ersten Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz im Bereich von 100-500 mM und einem pH von 4,0-8,5 und wahlweise mit chaotropen Ionen in einer Ionenstärke von bis zu 2 M mit einer virenbindenden Matrix in Berührung gebracht, um in der Probe enthaltene Viruspartikel an die Matrix zu binden, die Matrix mit den Viruspartikeln wird mit einer zweiten Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 1-100 mM und mit einem Kationengehalt von 0,1-1 M und einem pH von 4-9 gewaschen, um Komponenten zu entfernen, welche die virale Enzymaktivität behindern, die immobilisierten Viruspartikel werden in einer dritten Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 10-500 mM und mit einem nicht-denaturierenden Detergens und einem pH von 4-9 lysiert, und die konzentrierte virale Enzymaktivität wird aus der dritten Pufferlösung zurückgewonnen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die virusbindende Matrix eine Anionenaustauschermatrix ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Anionenaustauschermatrix tertiäre und/oder quaternäre Amingruppen enthält.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, worin der erste Puffer aus der Gruppe bestehend aus 150 mM MES pH 6,0, 200 mM Kaliumiodid (KI) ausgewählt ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin der zweite Puffer aus der Gruppe bestehend aus 10 mM MES pH 6,0, 500 mM Kaliumacetat (KAc) ausgewählt ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, worin der dritte Puffer aus der Gruppe bestehend aus enzymassaykompatiblen Puffern mit einem Detergens, z.B. 1 % Triton X 100 und einer Puffersubstanz, z.B. 100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)(Hepes) pH 7,6 ausgewählt ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, worin die konzentrierte und wiederhergestellte virale Enzymaktivität Reverse-Transcriptase- (RT-) Aktivität ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, worin die biologische Probe aus der Gruppe bestehend aus Serum- und Plasmaproben ausgewählt ist.
  9. Handelspackung zur Durchführung von Laborschritten zur Konzentration und Wiederherstellung einer Enzymaktivität aus in einer biologischen Probe enthaltenen umhüllten Viren, enthaltend folgende Komponenten: eine virusbindende Matrix, eine erste Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz im Bereich von 100-500 mM und einem pH von 4,0-8,5 und mit chaotropen Ionen in einer Ionenstärke von bis zu 2 M, eine zweite Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 1-100 mM und mit einem Kationengehalt von 0,1-1 M und einem pH von 4-9, eine dritte Pufferlösung mit einer Konzentration an Puffersubstanz von 10-500 mM und mit einem nicht-denaturierenden Detergens und einem pH von 4-9, optional Minisäulen, und Kunststoffröhrchen.
  10. Handelspackung nach Anspruch 9, worin die virusbindende Matrix eine Anionenaustauschermatrix ist, der erste Puffer aus der Gruppe bestehend aus 150 mM MES pH 6,0, 200 mM Kaliumiodid (KI) ausgewählt ist, der zweite Puffer aus der Gruppe bestehend aus 10 mM MES pH 6,0, 500 mM Kaliumacetat (KAc) ausgewählt ist, der dritte Puffer aus der Gruppe bestehend aus enzymassaykompatiblen Puffern mit einem Detergens, z.B. 1 % Triton X 100 und einer Puffersubstanz, z.B. 100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)(Hepes) pH 7,6 ausgewählt ist.
  11. Handelspackung nach Anspruch 10, worin die Anionenaustauschermatrix tertiäre und/oder quaternäre Amingruppen enthält.
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