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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentration und
Gewinnung einer viralen Enzymaktivität aus biologischen Proben.
Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Konzentration und
Gewinnung einer Enzymaktivität
aus umhüllten
Viren, die in einer biologischen Probe vorliegen. Die Erfindung
betrifft auch eine kommerzielle Verpackung, die bei der Durchführung des
Verfahrens der Erfindung nützlich
ist.
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Hintergrund
der Erfindung
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In
einem Virion (Viruspartikel) ist die virale Nukleinsäure durch
ein Proteincapsid bedeckt und in einigen der komplexeren tierischen
Viren ist das Capsid selbst von einer Hülle umgeben, enthaltend Membranlipide
und Glycoproteine. Unter diesen umhüllten Viren sind diejenigen,
die heutzutage die meiste Aufmerksamkeit erfahren die unterschiedlichen
Retroviren, insbesondere HIV (menschliches Immunodefizienzvirus).
Der Name Retrovirus stammt von der Richtung des Flusses der genetischen
Information bei diesen Viren, nämlich von
RNA zur DNA der Zelle. Es wurde festgestellt, daß einige retrovirale Stämme in einer
Art symbiotisch und in einer anderen pathogen sind. Diese Feststellungen
zeigen ein potentiell schweres Problem bei der Xenotransplantation
(Transplantation von tierischen Organen in Menschen). Sowohl endogene
als auch exogene Retroviren können
zu einer vertikalen und horizontalen Übertragung von genetischem
Material innerhalb und zwischen Arten beitragen und stellen Mechanismen
für die
Evolution neuer pathogener Mittel bereit.
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Während der
letzten Dekade gab es einen steigenden Bedarf an Verfahren zur Diagnose
und Überwachung
von retroviralen Infektionen, wie auch einer Forschung an einer
Pathogenese neuer Retroviren. Der Stand der Technik wird am besten
durch die Verfahren illustriert, die gegenwärtig beim Management der HIV-Infektion
verwendet werden. Im Labor wird die HIV-Infektion durch Messung von a) Antikörpern gegen
das HIV-Antigen, b) zirkulierendes HIV-Antigen, c) Virusisolation,
d) HIV-RNA in Zirkulation und e) Provirus-DNA integriert in Zellen
nachgewiesen und überwacht.
Das Verfahren der Wahl hängt
von dem Zweck des Tests und dem Fortschritt der Erkrankung ab.
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Der
gegenwärtig
akzeptierte Marker für
eine virale Belastung in der klinischem Umgebung ist die Messung
der Kopiezahl von HIV-RNA im Plasma. Dies kann entweder durch PCR,
NASBA oder durch verzweigte DNA-Techniken (Revets et al., 1996)
erreicht werden. Gegenwärtig
verwendete Assays haben ein Nachweislimit von 20 RNA-Kopien/ml Plasma
(Perrin et al., 1998). Da alle Techniken für den Nachweis viraler Nukleinsäuren auf
der Bindung von sequenzspezifischen Primer basieren, gibt es ein
signifikantes Risiko, daß sie nicht
an neue Stämme
oder Sequenzvarianten in einer Probe hybridisieren werden.
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Ein
anderer wichtiger Aspekt in bezug auf in vitro-Messungen von Infektionsparametern
ergibt sich, wenn die Ergebnisse auf die in vivo-Situation extrapoliert werden. Etliche
Labortechniken involvieren eine Amplifikationsstufe während derer
ein Selektionsschritt auftritt. Im schlechtesten Fall sind die amplifizierten
hauptviralen Varianten diejenigen, die den verwendeten Primern am
besten entsprechen und nicht diejenigen, die in der in vivo-Situation überwiegend
vorliegen.
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Eine
direkte Messung viraler Enzyme in Proben aus dem Blut des Patienten
würde daher
eine attraktive Alternative gegenüber einer Zellkultur oder auf
Nukleinsäure
basierenden Verfahren sowohl für
die Quantifizierung der viralen Replikation als auch für Studien
der Wirkung antiviraler Substanzen sein. Die zu überwindenden Hindernisse sind
sowohl die Assayempfindlichkeit als auch das reproduzierbare Abtrennen
des Enzyms aus wirtsspezifischen Enzymen und aktivitätsinhibierenden
Substanzen.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
die Messung einer Enzymaktivität
von einem umhüllten
Virus, das in einer biologischen Probe vorliegt, durch Konzentrieren
und Gewinnung der Enzymaktivität
ohne Isolation der Virions.
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Die
Verfahren aus dem Stand der Technik, die auf eine Konzentration
und Reinigung unterschiedlicher Viren abzielen, sind entweder spezifische
Verfahren, die auf den antigenen Eigenschaften der Virusproteine basieren
oder verallgemeinerte Verfahren, die auf den grundlegenden chemischen
oder physikalischen Eigenschaften des Virus basieren. Nur die letzte
Art von Verfahren kann als relevant für eine Reinigung von antigen hochvariablen
Retroviren wie HIV betrachtet werden.
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Viren
wurden traditionell teilweise durch unterschiedliche Arten einer
Zentrifugation gereinigt, entweder durch einfaches Pelletieren des
Virus oder in Kombination mit einer Verwendung von Präzipitationsmitteln wie
zum Beispiel Polyethylenglykol (
US
5661022 ). Eine Zentrifugation in Dichtegradienten führte zu
reineren Viruspräparationen
(
US 4729955 ).
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Ein
anderer Ansatz war das Binden des Virus an unterschiedliche Arten
von Adsorbentien. Porath und Jansson (
US
3925152 ) verwendeten unlösliche organische makroporöse Polymere,
gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Agar, Agarose, Dextran und Cellulose,
enthaltend amphotere Substituenten, bestehend aus sowohl basischen
stickstoffhaltigen Gruppen als auch Carboxylat oder sulfonierten
Gruppen. Adsorbierte Viren konnten in ihrem System mit Lösungen von
aufeinanderfolgend unterschiedlicher Ionenstärke eluiert werden um eine
Virusvariantenauftrennung zu erhalten. Auf ihre Pionierarbeit folgten
während
der letzten beiden Dekaden viele verwandte Reinigungstechniken,
basierend auf einer Interaktion von Viren mit Gelen mit entweder anionischen
oder kationischen Ionenaustauscherresten (
US 3655509 ). Retroviren und das verwandte
Hepatitis B-Virus wurden zum Beispiel unter Verwendung von sowohl
Kationenaustausch (
US 5447859 ,
US 4138287 )) als auch Anionenaustausch
(
US 5837520 ,
US 5661023 ) gereinigt. Die
oben zitierten Verfahren basieren alle auf der Bindung des Virus
bei niedriger Ionenstärke
und Elution bei hoher Ionenstärke.
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Ein
weiterer Ansatz zur Reinigung von Virus und viralen Nukleinsäuren basiert
auf einer Bindung von Virus an ein wasserunlösliches vernetztes Polyhydroxypolycarbonsäure-Polymer
(
US 5658779 ). Das Virus wird
bei pH 6,0 bis 8,0 an das Polymer gebunden, vermutlich durch hydrophobe
Wechselwirkungen und kann bei pH 8,0 bis 11,0 desorbiert werden.
Eine interessante Anwendung dieser Technik betrifft die Isolierung
viraler Nukleinsäuren.
In einem solchen Beispiel werden Bakteriophagen von einem bakteriellen
Lysat in einem ersten Schritt an das Polymer adsorbiert. Das Polymer
wird dann gewaschen und das gebundene Virus wird unter Verwendung
von entweder einem Chelatbildner wie EDTA oder einem denaturierenden
Mittel wie SDS aufgebrochen. Die viralen Proteine adsorbieren sich
ferner an das Polymer und eine virale Nukleinsäure, die im wesentlichen frei
von interagierenden Proteinen ist, wird erhalten. Die Verwendung
eines ähnlichen
Ansatzes für
die Reinigung von viralen Proteinen wird beansprucht, jedoch wird
das beschriebene Verfahren die Freisetzung der viralen Proteine
zusammen mit anderen zellulären
und viralen Komponenten, adsorbiert an das Polymer, freisetzen.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder haben intensive Untersuchungen an Messungen der Aktivität des viralen Enzyms
reverse Transkriptase (RT) durchgeführt. Die RT-Aktivität wurde
früher
direkt in Serum oder Plasma gemessen (Awad, R.J.K. et al. 1997,
Ekstrand et al. 1996). Ein bei diesen frühen Studien angetroffenes Problem
war die Induktion von hohen Titern von die RT-Aktivität inhibierenden
Antikörpern
kurz nach der primären Infektion.
Ein weiteres war das gelegentliche Auftreten von RT-Inhibitoren
in Proben von HIV-negativen Kontrollen.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Lösung für die oben erwähnten Probleme
im Stand der Technik bereit. Sie kann weiterhin für eine Konzentration
einer viralen Enzymaktivität
aus großen
Volumina von Flüssigkeiten
verwendet werden, d.h. Zellkulturüberständen, die sehr geringe Virusmengen
enthalten. Eine andere Anwendung ist die Übertragung des viralen Enzyms
aus Virions in hoch inhibitorischen Proben wie zum Beispiel Extrakten
von Geweben oder kultivierten Zellen in eine Umgebung, die mit den
Enzymassaybedingungen kompatibel ist.
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So
stellt die gegenwärtige
Erfindung ein Verfahren zur Konzentration und Gewinnung viraler
Enzymaktivität
bereit, insbesondere von umhüllten
Viren, aus rohen biologischen Proben wie zum Beispiel Blut, Plasma,
Serum, Zellkulturflüssigkeit
und Zellextrakten. Sie basiert auf einem Abtrennungsschritt, worin
die Virions auf einer festen Matrix gefangen werden. Enzyminhibitorische
Antikörper
und andere inhibitorische Substanzen werden durch einen Waschschritt
entfernt und die Enzyme werden durch Lyse der immobilisierten Virions freigesetzt.
Sowohl die Bindungs- als auch die Lyseschritte sind kritisch. Der
Bindungsschritt muß eine
Fähigkeit
haben, fast quantitativ geringe Mengen von Virions aus biologischen
Flüssigkeiten,
die sehr hohe Proteinkonzentrationen enthalten, wie zum Beispiel
Serum oder Plasma, vorzugsweise ohne Bindung von Immunglobulin (Ig)
oder anderen potentiell inhibitorischen Substanzen zu immobilisieren.
Der Lyseschritt sollte fast quantitativ die viralen Enzyme in eine
Umgebung freisetzen, die das Enzym an einer Bindung an die Auftrennmatrix
hindert, das native Enzym stabilisiert und mit optimalen Assaybedingungen
kompatibel ist.
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Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Konzentration
und zur Gewinnung einer Enzymaktivität von umhüllten Viren, die in einer biologischen
Probe vorliegen, umfassend die folgenden Schritte:
die biologische
Probe wird in einer ersten Pufferlösung mit einer Konzentration
an Puffersubstanz im Bereich von 100-500 mM und einem pH von 4,0-8,5
und wahlweise mit chaotropen Ionen in einer Ionenstärke von
bis zu 2 M mit einer virenbindenden Matrix in Berührung gebracht,
um in der Probe enthaltene Viruspartikel an die Matrix zu binden,
die
Matrix mit den Viruspartikeln wird mit einer zweiten Pufferlösung mit
einer Konzentration an Puffersubstanz von 1-100 mM und mit einem
Kationengehalt von 0,1-1 M und einem pH von 4-9 gewaschen, um Komponenten zu
entfernen, welche die virale Enzymaktivität behindern,
die immobilisierten
Viruspartikel werden in einer dritten Pufferlösung mit einer Konzentration
an Puffersubstanz von 10-500 mM und mit einem nicht-denaturierenden
Detergens und einem pH von 6-9 lysiert, und
die konzentrierte
virale Enzymaktivität
wird aus der dritten Pufferlösung
zurückgewonnen.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung ist die Virusbindungsmatrix eine Anionenaustauschmatrix, z.B.
eine Anionenaustauschmatrix, enthaltend tertiäre und/oder quaternäre Amin-Gruppen,
wie zum Beispiel Fractogel®, EMD DMAE und Fractogel® EMD
TMAE, äquilibriert
in 150 mM MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) pH 6,0.
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In
weiteren Ausführungsformen
wird der erste Puffer gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus 150 mM MES pH 6,0 und 200 mM Kaliumiodid
(KI), der zweite Puffer wird gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus 10 mM MES pH 6,0 und 500 mM Kaliumacetat
(KAc) und der dritte Puffer wird gewählt aus der Gruppe, bestehend aus
einem enzymassaykompatiblen Puffer, beinhaltend ein Detergens, z.B.
1 % Triton X 100 und einer Puffersubstanz, z.B. 100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (Hepes)
pH 7,6.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die konzentrierte und gewonnene virale Enzymaktivität eine reverse
Transkriptase (RT)-Aktivität.
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Die
biologische Probe wird vorzugsweise gewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Serum- und Plasmaproben.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine kommerzielle Packung, die
bei der Durchführung
des Verfahrens der Erfindung nützlich
ist. Die Packung enthält
geschriebene Instruktionen und/oder Instruktionen auf einem Datenträger zur
Durchführung
der Laborschritte für
die Konzentration und Gewinnung einer Enzymaktivität von umhüllten Viren,
die in einer biologischen Probe vorliegen und mindestens eine der
Komponenten
einer Virusbindungsmatrix,
einer ersten Pufferlösung bei
einer Konzentration im Bereich 100-500 mM der Puffersubstanz und mit einem pH
von 4,0-8,5 und mit chaotropen Ionen in einer Ionenstärke von
bis zu 2 M,
eine zweite Pufferlösung mit einer Konzentration
an Puffersubstanz von 1-100 mM und mit einem Kationengehalt von
0,1-1 M und einem pH von 4-9,
eine dritte Pufferlösung mit
einer Konzentration an Puffersubstanz von 10-500 mM und mit einem
nicht-denaturierenden Detergens und einem pH von 4-9,
Minisäulen, und
Kunststoffröhrchen.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Handelspackung ist die Virus-bindende Matrix eine Anionenaustauschermatrix,
der
erste Puffer wird aus der Gruppe bestehend aus 150 mM MES pH 6,0,
und 200 mM Kaliumiodid (KI) ausgewählt,
der zweite Puffer
wird aus der Gruppe bestehend aus 10 mM MES pH 6,0, und 500 mM Kaliumacetat
(KAc) ausgewählt,
und
der dritte Puffer wird aus der Gruppe bestehend aus RT-Assay-kompatiblen
Puffern mit einem Detergens, z.B. 1 % Triton X 100 und einer Puffersubstanz,
z.B. 100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure (Hepes) pH 7,6 ausgewählt.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die Anionenaustauschermatrix eine Anionenaustauschermatrix,
enthaltend tertiäre
und/oder quaternäre
Amin-Gruppen, wie zum Beispiel Fractogel® EMD DMAE
und Fractogel® EMD
TMAE äquilibriert
in 150 mM MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) pH 6,0.
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Betrachtungen im Hinblick
auf die Wahl der Puffer
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A) Bindungspuffer (der
erste Puffer)
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Der
Bindungspuffer wird verwendet um den pH und die Ionenstärke in der
Probe auf Werte einzustellen, die eine maximale Bindung der Viruspartikel
und gleichzeitig eine minimale Bindung der Wirtskomponenten ergeben,
wie zum Beispiel Plasma/Serum-Proteine und insbesondere Antikörper wie
auch andere potentiell inhibitorische Substanzen.
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I) pH
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Mit
einem Anionenaustauscher- und FIV-Virus fanden wir eine Bindung
mit Puffern zwischen pH 7,5 und 5,0 in einem System ohne Plasmakomponenten.
Im Hinblick auf den isoelektrischen Punkt (Ip) der Plasmakomponenten,
die nicht binden sollten, sollte ein pH verwendet werden der so
niedrig wie möglich
ist. Frische EDTA-Plasmaproben hatten einen pH von ungefähr 8,5.
Abhängig
von der Behandlung (z.B. Lagerung) kann der pH in solchen Proben
auf ungefähr
8,0 fallen.
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Eine
Anzahl von Puffern wurde im Hinblick auf die Fähigkeit zur Normalisierung
des pHs in unterschiedlichen Plasmata auf einen definierten pH im
Bereich von 3,0-7,5 hin untersucht.
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Zwei
Probleme wurden bei pH-Werten unter 6,0 angetroffen.
- a) Es war nicht möglich
pH-Werte unterhalb von 5,0 mit Konzentrationen des Puffers bis zu
0,5 M zu erreichen.
- b) Wenn eine 1:1 Mischung von Plasma und Puffer verwendet wurde,
traten Präzipitate
bei pH-Werten unter 6,0 auf. Zentrifugationsexperimente bestätigten,
daß ebenfalls
eine Präzipitation
von Viruspartikeln im Plasma bei einem pH unter 6,0 begann.
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Gewählte Werte
für den
bevorzugten pH-Bereich liegen daher bei 4,0-8,5 und ein pH von 6,0 wird als optimal
angesehen.
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Die
gewählte
Konzentration des Puffers sollte in einem Bereich von 100-500 mM
liegen und 150 mM wird als optimal angesehen.
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Zwei
Puffer, die in dem pH-Bereich von ungefähr 6,0 wirken, wurden untersucht,
nämlich
(Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan; 2-Bis(2-hydroxyethyl)amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Bis-Tris)
und MES.
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Bis-Tris
ist basisch und benötigt
eine pH-Einstellung mit großen
Mengen Säure.
Bei unterschiedlichen pH-Werten wird daher eine Mischung aus pH-Wirkung
und Ionenstärke
erhalten. MES ist sauer und benötigt weniger
Einstellung um den benötigten
pH zu ergeben. Bindungsexperimente zeigen an, daß der MES-Puffer etwas besser
wirkt und dieser Puffer wurde für
Studien im Hinblick auf die Signifikanz der Ionenstärke gewählt.
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II) Ionenstärke
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Nachdem
man sich für
einen pH-Bereich entschieden hatte, untersuchten wir bei welcher
Ionenstärke und
mit welchen negativen Ionen die Viruspartikel immer noch banden.
Sulfat, Acetat, Chlorid und Iodid wurden vorrangig verwendet.
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Zwei
Ionen, die in der chaotropen Reihe weit entfernt lagen, Acetat (Ac)
und Iodid wurden in einem breiteren Konzentrationsbereich untersucht.
Die Wirkungen waren wie erwartet: Das Iodid begann, die Bindung
von Virus bei niedrigerer Konzentrationen zu beeinflussen als das
Acetat.
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Die
Bindung wurde mit 50 % durch 500 mM Iodid reduziert, jedoch wird
2 M Ac für
diese Wirkung benötigt.
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Die
Menge an gebundenen Ig, die aus dem Gel eluiert werden konnte, wurde
nach der Bindung und der Waschung von FIV im Plasma mit unterschiedlichen
Kombinationen von Ac und Iodid in den Puffern untersucht.
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Wenn
bei der Bindung keine Salze vorlagen, ergaben sich höhere Restmengen
von Ig nach der Lyse (obwohl das Gel bereits mit Salz gewaschen
worden war). Iodid war effizienter als Ac, was ungefähr 1,5-fach höhere Mengen
restliches Ig ergab. Durch Kombination unterschiedlicher Salze in
den zwei Schritten wurde gezeigt, daß Iodid bei der Bindung jedoch
Ac bei der Waschung gleich effizient wie Iodid während der ganzen Zeit waren.
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Nützliche
negative Ionen können
schwache Eluentien wie Ac bis starke Eluentien wie Iodid sein, wie auch
diejenigen Ionen, die zwischen diesen angetroffen werden, im Hinblick
auf Eigenschaften in der chaotropen Reihe, vorzugsweise Ac, Cl und
Iodid und insbesondere Iodid.
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Gewählte Werte
für die
Ionenstärke
können
variiert werden und können
bis zu 2M sein, vorzugsweise 0,1-1 M und insbesondere 200 mM für Iodid
bzw. 1 M für
Ac.
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B) Waschpuffer (der zweite
Puffer)
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- 1) Der Puffer sollte so effektiv wie möglich Faktoren
entfernen, die die Messung/Gewinnung der viralen Enzyme aus dem
Gel beeinflussen können.
Es ist insbesondere wichtig Antikörper zu entfernen.
- 2) Der Puffer darf keine Virions aus dem Gel entfernen oder
Virions lysieren.
- 3) Da die Komponenten des Puffers nach einer bestimmten Verdünnung (ungefähr um das
5- bis 9-fache) in dem Enzymassay vorliegen werden, dürfen die
Komponenten das Enzym nicht deutlich inhibieren.
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Kritische
Faktoren für
den Waschpuffer sind pH und Ionenstärke.
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I) pH
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Proteine
binden an einen Anionenaustauscher bei einem pH oberhalb ihres isoelektrischen
Punkts und bleiben gebunden. Der Ip unterschiedlicher Immunglobuline
variiert, liegt jedoch im Durchschnitt bei pH 8,9.
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Unsere
Experimente mit FIV-Virions zeigten, daß Virus in einem Puffer, enthaltend
0,1 M KCl sehr gut an etliche unterschiedliche Anionenaustauscher
in einem pH-Bereich von 5,8-7,6 band. Die Gewinnung bei der Lyse
nach einem Waschen mit Puffer bei demselben pH war über den
ganzen pH-Bereich
hoch. Ip für
FIV ist daher <5,8.
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Der
gewählte
pH-Bereich für
den Waschpuffer liegt bei pH 4-9 (obwohl möglicherweise niedrigere pH-Werte
für die
Verwendung ebenfalls möglich
sein könnten).
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Vorzugsweise
liegt der pH-Bereich bei 5,5-8 (die Waschwirkung auf Ig ist vermutlich
oberhalb von 8,0 schlecht) und insbesondere 6-7,5. Die Puffersubstanz
sollte in relativ niedriger Konzentration vorliegen, die ausreicht,
um den pH stabil zu erhalten, die jedoch keine zu hohe Konzentration
der Puffersubstanz zu einer Veränderung
des pHs im Lysestadium benötigt.
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Der
gewählte
Bereich für
die Konzentration der Puffersubstanz liegt bei 1-100 mM. Vorzugsweise
5-50 mM und optimal 10 mM.
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II) Ionenstärke
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Zu
hohe Kationenkonzentrationen können
Virus beim Waschen freisetzen, zu niedrige Konzentrationen ergeben
restliches Ig und andere inhibierende Substanzen im Lysat.
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Die
Konzentrationsgrenzen werden durch die tatsächlich verwendeten chaotropen
Kationen beeinflußt.
Es ist wichtig eine so hoch wie mögliche Konzentration zu verwenden,
die das Virus nicht freisetzt.
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Die
Konzentration ist auch durch die Wirkung des Ions im Enzym (z.B.
RT)-Assay nach der Verdünnung
(ungefähr
das 5- bis 9-fache) begrenzt, siehe Beispiel 4.
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Unterschiedliche
Anionenaustauscher werden wahrscheinlich mehr oder weniger Rest-Ig
ergeben, abhängig
von den Eigenschaften der Matrix, bei einer gegebenen Salzkonzentration.
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Das
folgende gilt zum Beispiel, wenn Fractogel TMAE bei pH 6,0 gewaschen
wird.
- 1) Waschen mit Ac bis zu 0,5 M, kein
Virusverlust. Bei 1 M Gewinnung von ungefähr 50 %. Bis zu 0,25 M immer
noch ungefähr
0,2 % restliches Ig. Bei 0,5 M und höher <0,02 % Rest-Ig.
- 2) Waschen mit Chlorid (Cl–) bis zu 0,25 M kein
Virusverlust, bei ungefähr
0,5 M ungefähr
50 %, bei 1 M geht das gesamte Virus verloren. Restliches Ig bei
Cl– von
0,25 M und höher <0,02 %.
- 3) Hohe Konzentration von Iod in Abwesenheit von Serumprotein
scheint das Virus irreversibel zu beeinflussen, so daß wir keinerlei
Enzym(RT)-Aktivität
gewinnen konnten. Iod ist daher auf der Bindungsstufe gut, sollte
jedoch im Waschpuffer nicht verwendet werden.
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Der
gewählte
Konzentrationsbereich für
die Kationen im Waschpuffer liegt bei 0,1-1 M, vorzugsweise 0,2-0,6
M und insbesondere wird Ac– oder Cl– bei
0,2-0,6 M verwendet.
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C) Lysepuffer (der dritte
Puffer)
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Der
Lyseschritt sollte quantitativ die viralen Enzyme in eine Umgebung
freisetzen, die das Enzym an einer Bindung an die Abtrennmatrix
hindert, das native Enzym stabilisiert und mit optimalen Assay-Bedingungen
kompatibel ist.
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I) Detergens
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Ein
Detergens ist für
Lyse des Virus notwendig. Es gibt eine große Anzahl von Detergentien
und im gegenwärtigen
Kontext sollte das Detergens ein "nicht denaturierendes Detergens" sein, z.B. Polyoxyethansorbitan
(Tween) oder t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100). Unterschiedliche
Detergentien sind mehr oder weniger effektiv für eine Lyse von Virions und
ihre Interferenz in dem Enzym(RT)-Assay bei hohen Konzentrationen
ist tatsächlich
ziemlich minimal. Daher ist kein besonderer Bereich für die Konzentration
notwendig. Es könnte
erwähnt
werden, daß Triton
X100 bei 0,1 % nicht effektiv ist und bei 5 % damit beginnt, Probleme
zu machen.
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II) pH
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Der
pH muß mit
dem pH des gewählten
Enzymassays kompatibel sein. Weiterhin sollte der pH keine Bindung
von viralen Enzymen an den Ionenaustauscher ermöglichen. Wir haben festgestellt,
daß es
keine Bindung von FIV oder HIV RT bei einem pH von 5,5-8,5 gibt
und daß der
Ip für
HIV RT in der Nachbarschaft von 9,1 liegt. Die Wirkung des pHs auf
einen Enzymassay ist daher von besonderer Wichtigkeit.
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Der
gewählte
pH-Bereich liegt bei 4-9, bevorzugt 7-8 und optimal 7,6.
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Die
Puffersubstanz sollte in ausreichend hoher Konzentration zugefügt werden
um den pH auf 6,0 bis 7,6 einzustellen. Die benötige Konzentration variiert
natürlich
mit der Konzentration im Waschpuffer. Eine zu hohe Konzentration
kann daher in den Enzymassay eingreifen. Der gewählte Konzentrationsbereich
der Puffersubstanz liegt bei 10-500 mM, bevorzugt 50-200 mM und optimal
100 mM.
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Natürlich kann
die Pufferlösung
zusätzliche
Komponenten enthalten, die für
den gewählten
Enzymassay günstig
sind.
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Die
Erfindung wird nun durch die folgende Beschreibung der Ausführungsformen
illustriert, insbesondere Verfahren die an die Bereitstellung von
RT-Proben angepaßt
sind, die akkurat im Hinblick auf die RT-Aktivität durch unsere (Cavidi Tech)
kommerzielle colorimetrische RT-Assays analysiert werden können, wie
zum Beispiel in unserer schwedischen Patentanmeldung 99024101-1
beschrieben. Diese Ausführungsformen
und Beispiele sollen den Umfang der beanspruchten Erfindung nicht
begrenzen.
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Allgemeine Beschreibung
der Leistung des erfindungsgemäßen Verfahrens
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Zwei
etwas unterschiedliche Ausführungsformen
der Erfindung werden beschrieben.
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I) Protokoll für eine Chargen-Abtrennung
von Plasma
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- 1) Markiere die gewünschte Zahl von 15 ml Zentrifugen-Röhrchen um
die zu analysierenden Proben zu identifizieren.
- 2) Suspendiere das Trenngel vorsichtig in einer 1:1 Gelaufschlämmung und übertrage
400 μl Gelaufschlämmung auf
jedes markierte Zentrifugenröhrchen.
Zentrifugiere das Gel ab und entferne den Puffer.
- 3) Mische 500 μl
von jedem Plasma, das analysiert werden soll mit dem entsprechenden
Volumenbindungspuffer (A). Übertrage
jede Plasmapuffermischung in das korrespondierende markierte Zentrifugenröhrchen mit
Gel. Füge
einen Stopfen hinzu, schüttle
die Röhrchen
um das Gel in der Probe zu suspendieren und inkubiere eine Stunde
auf einer Orbitalschüttelvorrichtung
bei Raumtemperatur.
- 4) Stelle den Waschpuffer (B) her, 30 ml Puffer/Probe wird benötigt.
- 5) Erlaube es dem Gel sich abzusetzen und entferne den Überstand.
Füge 10
ml Waschpuffer (B) hinzu. Füge
wieder den Stopfen hinzu, resuspendiere das Gel in dem Waschpuffer
durch Schütteln.
Lasse das Gel ca. 10 Minuten sedimentieren. Entferne den Stopfen,
aspiriere die Waschflüssigkeit
vorsichtig, um ein Aspirieren von Gel zu vermeiden.
- 6) Wiederhole das Waschen gemäß 6. 7) Wiederhole das Waschen
gemäß 6.
- 8) Zentrifugiere die Röhrchen
bei ungefähr
500 g für
5- bis 10 Minuten. Aspiriere den gesamten Waschpuffer (B) oberhalb
der Geloberfläche.
- 9) Füge
180 μl Lysepuffer
(C) zu jedem Röhrchen
zu, füge
den Stopfen zu und inkubiere 30 min auf einer Orbitalschüttelvorrichtung
bei Raumtemperatur.
- 10) Zentrifugiere die Röhrchen
bei ungefähr
500 g 5- bis 10 Minuten.
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Die
RT-Aktivität,
die im Überstand
von Schritt 10 gewonnen wurde, kann mit einem sensitiven RT-Aktivitätsassay
quantifiziert werden, z.B. den Cavidi®HS-Kits,
die auf dem von Ekstrand et al. 1996 beschriebenen Verfahren basieren.
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II) Protokoll für eine Plasmaauftrennung
auf Minisäulen
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- 1) Markiere die gewünschte Menge von 15 ml Kunststoff-Minisäulen um
die zu analysierenden Proben zu identifizieren.
- 2) Stelle den Waschpuffer (B) her, es werden so 20 ml Puffer/Probe
benötigt.
- 3) Suspendiere das Trenngel vorsichtig in einer 1:1-Gelaufschlämmung und übertrage
1000 μl
Gel-Aufschlämmung
auf jede Säule.
- 4) Das zu analysierende Plasma wird 1:1 in Bindungspuffer (A)
verdünnt.
Das System wird für
die Analyse von 500 μl
Plasma optimiert.
- 5) Öffne
die Säule
an beiden Enden und lasse den Puffer in jeder Säule durchlaufen. Füge vorsichtig
ein Maximum von 1000 μl
Probe gemäß 4) auf
die Spitze jeder Säule
zu. Schließe
die Säule,
bevor sie trockengelaufen ist und lasse die Probe für 60 Minuten
adsorbieren, bevor das Waschverfahren beginnt.
- 6) Jede Säule
wird mit 2 × 10
ml Waschpuffer (B) gewaschen.
- 7) Wenn der ganze Waschpuffer durch die Säulen gelaufen ist, füge 200 μl Lysepuffer
(C) zu jeder Säule zu,
lasse die Säule
trockenlaufen und inkubiere 30 min bei Raumtemperatur.
- 8) Stelle die Säulen
auf ein Gestell mit Probensammelröhrchen und füge weitere
300 μl Lysepuffer
(C) zu jeder Säule
zu. Sammle die Eluate, die die RT von Virions, die in ursprünglichen
Proben vorlagen, enthalten.
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Die
in den Eluaten aus Schritt 8 gewonnene RT-Aktivität kann mit
einem sensitiven RT-Aktivitätsassay, z.B.
den Cavidi® HS-Kits,
die auf dem von Ekstrand et al. 1996 beschriebenen Verfahren basieren,
quantifiziert werden.
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Materialien, die in einer
bevorzugten Ausführungsform
verwendet werden
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Trenngel:
z.B. Fractogel®EMD
TMAE oder Fractogel® EMD DMAE äquilibriert
in 150 mM MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) pH 6,0, Minisäulen z.B.
von Biorad Poly-Prep® (7311553).
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Kunststoffröhrchen
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- A) Bindungspuffer: 300 mM MES pH 6,0, 400 mM
Kaliumiodid (Kl)
- B) Waschpuffer: 10 mM MES pH 6,0, 500 mM Kaliumacetat (KAc)
- C) Lysepuffer: Ein RT-Assay kompatibler Puffer, beinhaltend
ein Detergens, z.B. 1 % Triton X-100 und eine Puffersubstanz, z.B.
100 mM (N-(2-Hydroxyethylpiperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (Hepes)
pH 7,6.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
zwei Diagramme A und B, die die Wirkungen der Zugabe von unterschiedlichen
Kationen zu der RT-Reaktionsmischung unter Standardassaybedingungen
zeigen. Symbole: AC– (♦), Cl– (∎),
Br– (π), I– (O),
SCN– (♢).
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2 ist
ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Menge von HIV RT, gewonnen
gemäß der Erfindung
und der Menge der viralen RNA, gemessen mit HIV 1 RNA-PCR darstellt.
Symbole:
gesammeltes Plasma von 100 gesunden Blutspendern. ♦, Plasma
von HIV infizierten Individuen
.
-
3 ist
ein Diagramm, das den Nachweis von geringen Mengen Retrovirus durch
Konzentration der RT-Aktivität
aus einem großen
Volumen von Zellkulturmedien zeigt.
Symbole: 1 % Serum (offene
Stange), 10 % Serum (geschlossene Stange).
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Beispiele
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Beispiel 1: Screenen der
Fähigkeit
verschiedener chromatographischer Medien um Retrovirus zu immobilisieren
(Tabelle 1)
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500 μl eines FIV-versetzten
menschlichen Plasmas, verdünnt
1:1 in Bindungspuffer wurde mit 100 μl des angegebenen Gels vermischt.
Nach einer Stunde wurden 450 μl Überstand
von jeder Probe entnommen und durch 450 μl Lysepuffer ersetzt. Die Proben
wurden dann für
weitere 30 Minuten inkubiert und die Menge der RT-Aktivität in jedem Überstand
und jeder Lysefraktion wurden bestimmt und als Prozentsatz der RT-Aktivität zugefügt zur ursprünglichen
Probe berechnet. Es gab eine deutliche Variation der virusbindenden
Kapazität
unter den überprüften Medien.
Die höchste
Bindungskapazität
wurde unter den anionischen Ionenaustauschmedien mit tertiären oder
quaternären
Aminen angetroffen. Die Gewinnung von RT-Enzym in der Lysefraktion
unter Verwendung der Medien mit guter Bindungskapazität lag bei
53 bis 100 %, was anzeigt, daß keine
Bindung der freigesetzten RT an den Anionenaustauscher während der
Viruslyse auftrat. Unser Hauptkriterium zur Auswahl von Trennmedien
war eine gute Virusbindungskapazität und hohe Gewinnung von FIV
RT.
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Beispiel 2: Rückgewinnung
der RT-Aktivität
von unterschiedlichen Retroviren, die menschlichem Plasma zugefügt wurden
(Tabelle 2)
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Vier
Proben von menschlichem Plasma wurden jeweils mit einem von vier
unterschiedlichen Retroviren versetzt. Die Proben wurden 1:1 in
einem Probenverdünnungspuffer
verdünnt
und gemäß dem "Protokoll für die Plasma
Trennung auf Minisäulen" unter Verwendung
von 500 μl
Fractogel TMAE highcap Gel verarbeitet. Jede RT wurde in 300 μl Lysepuffer
wiedergewonnen und die Menge RT und Ig in den Lysaten wurde bestimmt
und als Prozentsatz der korrespondierenden Mengen in der Ursprungsprobe
wieder berechnet. Zwischen 39 und 74 % der RT-Aktivität, die in
den ursprünglichen
Virus-Präparationen
vorlag, wurden in der 300 μl-Lysatfraktion
wiedergewonnen. Die Reduktion der Ig-Konzentration lag zwischen
dem 2000- und 12000-fachem für
die unterschiedlichen Proben.
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Beispiel 3: Die Wirkungen
der Zugabe von unterschiedlichen Kationen zu der RT-Reaktionsmischung
(1).
-
Chaotrope
Kationen, die die angegebenen Endkonzentrationen ergaben, wurden
zu Cavidi HS-Kit Lenti RT-Reaktionslösungen zugefügt. Die
Wirkung von fünf
unterschiedlichen Kationen auf die Aktivitäten von zwei RTs wurde bewertet:
A) FIV-Virions, korrespondierend zu 0,4 μU RT-Aktivität, B) rekombinante HIV 1-RT, korrespondierend
zu 0,6 μU
RT-Aktivität.
Die RT-Aktivität bei jeder
Kationenkonzentration wurde in Prozent einer Kontrolle, gemessen
unter Standardbedingungen, umgerechnet. Die inhibitorische Wirkung
unterschiedlicher Kationen stand in bezug zu der chaotropen Wirkung
der Ionen. Die am meisten chaotropen Kationen, SCN– und
I– waren
bei allen getesteten Konzentrationen inhibitorisch. Intermediäre Ionen
Br– und
Cl– stimulierten
die retroviralen RTs bei Konzentrationen unterhalb von 100 mM, waren
jedoch bei höheren
Konzentrationen steigend inhibitorisch. Aus 1 kann geschlossen
werden, daß Cl– oder
Br– Ionen
bei Konzentrationen von bis zu 70 mM und Ac– Ionen
bis zu 200 mM in der Reaktionsmischung eingeschlossen sein können, ohne nachteilige
Wirkungen auszulösen.
-
Beispiel 4: Beziehung
zwischen der Menge von HIV RT, gewonnen gemäß der Erfindung und Menge viraler RNA,
gemessen mit HIV 1 RNA PCR (2)
-
200 μl-Proben
von EDTA-Plasma von HIV-infizierten Individuen und von einem Pool,
erhalten von 100 gesunden Blutspendern wurden gemäß dem "Protokoll für die Chargentrennung
von Plasma" verarbeitet.
Die Menge der RT-Aktivität,
die hier aus jeder Probe gewonnen wurde, wurde in einem Übernacht-RT-Assay
unter Verwendung des Cavidi HS-Kit Lenti RT bestimmt. Die RT-Aktivitäten, die
erhalten wurden, wurden in pg HIV 1 RT gemäß einer internen Standardkurve
berechnet. Die Menge von HIV 1 RNA in jeder Probe wurde durch Standard
HIV 1 RNA PCR (Roche, Cobas Amplicor HIV monitor version 1,5) gemessen.
Werte von <50 RNA-Kopien/ml
wurden als entsprechend 25 aufgetragen (2). Eine
starke Korrelation wurde zwischen der Menge von Plasma-RT, gewonnen
gemäß der Erfindung
und der Menge an HIV RNA, gemessen mit PCR angetroffen (r = 0,85,
p<0,001, Spearman-Korrelation
durch Ranking).
-
Beispiel 5: Nachweis von
kleinen Mengen Retroviren durch die Konzentration der RT-Aktivität aus einem
großen
Volumen von Zellkulturmedien (3).
-
Eagles-Minimal-Essentialmedium
(MEM), enthaltend entweder 1 % (offene Stange) oder 10 % (gefüllte Stange)
Kälberserum
von neugeborenen Kälbern
(Gibco) wurde hergestellt. Eine geringe Menge FIV-Virions, korrespondierend
zu 0,6 mU RT-Aktivität
wurde zu 1, 5 und 25 ml Proben von jeder MEM/Serummischung zugefügt. Jede
Probe wurde durch eine 1 ml DEAE A25-Sephadex-Minisäule geführt, gefolgt
von einer Waschung mit 20 ml Waschpuffer. Schließlich wurde die RT-Aktivität in einem
300 μl-Elutionspuffer
gemäß dem "Protokoll für eine Plasmaabtrennung
auf Minisäulen" eluiert. Mit diesem
Verfahren gewannen wir mehr als 70 % der Virus-assoziierten RT aus
25 ml Medium solange die Serumkonzentration 1 % nicht überstieg.
Die korrespondierende Zahl bei 10 % Serum war ungefähr 50 %
(3).
-
Referenzen
-
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-
-
-
Tabelle
2: Gewinnung der RT-Aktivität
von unterschiedlichen Retroviren, zugefügt zu menschlichem Plasma
-
- a Katzenimunodefizienzvirus
- b Rinderleukämievirus
- c Jaagsiekte-Schafretrovirus
- d Muriner Leukämievirus
