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TECHNISCHER
BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die effiziente Reinigung von Adenovirus.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Traditionell
sind adenovirale Partikel bisher durch die Verwendung von Dichtegradienten-Reinigungsprotokollen
isoliert worden, so etwa durch die Verwendung von Cäsiumchlorid-(CsCl-)Gradienten. Obschon
für Zubereitungen
im kleinen Maßstab
geeignet, ist die Dichtegradientenreinigung mühsam und zeitaufwändig und
lässt sich
nicht leicht upscalen. Der Prozess wird daher häufig als kommerziell unerwünscht angesehen.
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Eine
alternative Methode zur Reinigung von Adenovirus ist die Verwendung
von Säulen-
oder Batch-Chromatographie. Frühe
Versuche, Viruspartikel durch chromatographische Techniken unter
Verwendung von Diethylaminoethyl-(DEAE-)-Chromatographieharzen
zu isolieren, wurden zum ersten Mal in den Jahren von 1959 bis 1961
berichtet. Haruna et al. (Virology 13: 264–267 (1961)) berichteten die
Verwendung von DEAE-Ionenaustauschchromatographie für die Reinigung
von Adenoviren vom Typ 1, 3 und 8, während Klemperer & Pereira (Virology
9: 536–545
(1959)) und Philipson (Virology 10: 459–465 (1960)) Schwierigkeiten
bei der Verwendung derselben Methode mit anderen Adenovirustypen
berichteten. In den Jahren nach etwa 1965 wurden diese Techniken
nicht breit angewandt, höchstwahrscheinlich
als eine Folge der Neigung der chromatographischen Matrix, während des
Gebrauchs zu kollabieren. Ferner machte die Selektivität der Chromatographieharze,
die zu der Zeit zur Verfügung
standen, die chromatographische Reinigung von Viren den Dichtegradienten-Reinigungstechniken
unterlegen. Bigwood et al. (
EP
0213719 ) lehren Chromatographieharze, welche mit Polyaminen
funktionalisiert sind, die 2–4
Amingruppen enthalten, welche durch 2–4 Methylengruppen voneinander
getrennt sind. Bigwood et al. lehren jedoch nicht die Verwendung
derartiger Harze zur Reinigung von Viren oder anderem biologischem
Material.
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Jüngst ist
das Interesse an der Reinigung von Viren mittels Chromatographie
wieder neu erwacht. So offenbaren z.B. Guillaume et al. (WO 98/00524),
Shabram et al. (Human Gene Therapy 8: 453–65 (1997)), Shabram et al.
(WO 96/27677) und Huyghe et al. (Human Gene Therapy 6: 1403–1416 (1995))
Verfahren zur Verwendung von Chromatographieharzen zur Reinigung
von Viren. Ferner sind in den letzten eineinhalb Jahrzehnten neuere
Packungsmaterialien für
die Chromatographie entwickelt worden. Diese Packungsmaterialien
lassen sich in vier Gruppen einteilen: (i) homogene vernetzte Polysaccharide,
die weiche Gele (z.B. Agarose) mit guter Kapazität, aber schlechter Auflösung und
Kompressionsneigung umfassen; (ii) makroporöse Polymere auf Basis von synthetischen
Polymeren, die Perfusionschromatographieharze mit großen "Durchgangsporen" umfassen, welche
eine bessere Diffusivität
erlauben und zu einer verbesserten Säuleneffizienz, Geschwindigkeit
und Auflösung
führen;
(iii) "tentakuläre" Sorbenzien, welche
Tentakel aufweisen, die für
schnellere Interaktionen mit Proteinen ausgebildet waren (z.B. Fractogel);
und (iv) Materialien auf der Basis eines weichen Gels in einer steifen
Hülle, welche
die hohe Kapazität
von weichen Gelen und die Steifigkeit von Composite-Materialien
ausnutzen (z.B. Ceramic HyperDTMF) (siehe
Boschetti, J. Chromatogr. 658: 207 (1994); Rodriguez, J. Chromatogr. 699:
47–61
(1997)).
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Es
ist wünschenswert,
die Geschwindigkeit, die leichte Verwendbarkeit und die Effizienz
der Reinigung, insbesondere der kommerziellen Reinigung im großen Maßstab, dieser
Techniken nach dem Stand der Technik zu erhöhen. Die vor liegende Erfindung
stellt ein derartiges Verfahren zur Reinigung von Adenovirus bereit.
Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie weitere
erfindungsgemäße Merkmale
ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Anreicherung
einer Lösung
an einem Adenovirus. Das Verfahren umfasst: (i) Erhalten einer gemischten
Lösung,
die Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst; (ii)
Aufbringen der gemischten Lösung
auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz, das eine Bindungseinheit
enthält,
welche ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl,
Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl; und (iii) Eluieren
des Adenovirus von dem Reinigungschromatographieharz mit einem Eluenten.
Das Verfahren kann ferner umfassen: Aufbringen der gemischten Lösung, die
Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst,
auf ein Anionenaustausch-Vorharz vor dem Aufbringen des Adenovirus
auf das Anionenaustausch-Chromatographieharz.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur genauen
Quantifizierung der Anzahl an adenoviralen Partikeln in einer Adenovirus-Lösung, z.B.
in einer aus einem rohen Lysat von mit Adenovirus infizierten Zellen
erhaltenen Lösung, umfassend:
(i) Aufbringen einer Probelösung
von Adenovirus auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz, das
eine Bindungseinheit enthält,
welche ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl,
Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl, und Eluieren der
Probelösung
von demselben, (ii) Bestimmen der Absorption der von dem Chromatographieharz
eluierten Probelösung
von Adenovirus und der Absorption einer Standardlösung von
Adenovirus, (iii) Vergleichen der Absorption der von dem Chromatographieharz
eluierten Probelösung
von Adenovirus mit der Absorption der Standardlösung von Adenovirus und Quantifizieren
der Anzahl an adenoviralen Partikeln in der Probelösung.
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Am
besten verdeutlicht wird die Erfindung anhand der beigefügten zeichnerischen
Darstellung und der folgenden Detailbeschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 ist
ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert
von einem quartären
Amin-Chromatographieharz (Q Ceramic HyperDTMF),
worin die y-Achse die Absorption (260 und 280 nm) zeigt, die x-Achse
die Elutionszeit (min) angibt und die parallele y-Achse (rechts)
das Elutionsmittel in der Säule
angibt, wie über
die Leitfähigkeit gemessen
(unterbrochene Linie; ms).
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2 ist
ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, geklärt durch
Tangentialflussfiltration, behandelt mit einer DNase/RNase (Benzonase®)
und eluiert von einem quartären Amin-Chromatographieharz
(Q Ceramic HyperDTMF), worin die y-Achse
die Absorption (260 und 280 nm) zeigt, die x-Achse die Elutionszeit
(min) angibt und die parallele y-Achse (rechts) das Elutionsmittel
in der Säule
angibt, wie über
die Leitfähigkeit
gemessen (unterbrochene Linie; ms).
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3 ist
ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert
von einem "expanded
bed"-Adsorptions-Chromatographieharz
(Streamline QXL®),
worin die y-Achse die Absorption (260 & 280 nm) zeigt, die x-Achse die Elutionszeit
(min) angibt und die parallele y-Achse (rechts) das Elutionsmittel
in der Säule
angibt, wie über
die Leitfähigkeit
(unterbrochene Linie) in Millisiemens (ms) gemessen.
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4 ist
ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, gereinigt
durch Zentrifugation in einem dreistufigen CsCl-Gradienten und quantifiziert
unter Verwendung einer Dimethylaminopropyl-Perfusions-(POROS® 5OD)-Analysensäule, worin
die y-Achse die Absorption (260 & 280
nm) zeigt und die x-Achse die Elutionszeit (min) angibt.
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5 ist
ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert
von einem "expanded
bed"-Adsorptions-Chromatographieharz
(Streamline QXL®)
und zweimal von einem Dimethylaminopropyl-Perfusions-Chroma tographieharz
(POROS® 5OD),
worin die y-Achse die Absorption (260 & 280 nm) zeigt und die x-Achse die
Elutionszeit (min) angibt.
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6 ist
ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert
von einem Dimethylaminopropyl-Perfusions-Chromatographieharz (POROS® 5OD),
worin die y-Achse die Absorption (260 und 280 nm) zeigt und die
x-Achse die Elutionszeit (min) angibt.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung einer
Lösung,
welche ein Adenovirus umfasst. Mit "Adenovirus" ist natürlich vorkommendes Adenovirus
und rekombinantes Adenovirus gemeint, wobei das rekombinante Adenovirus infektiös oder nichtinfektiös sein kann.
Das Verfahren umfasst das Erhalten einer gemischten Lösung, welche
Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst.
Mit "Biomolekül" ist ein beliebiges
Makromolekül
gemeint, z.B. ein beliebiges Protein, Kohlenhydrat, Lipid oder Nucleinsäure (z.B. DNA
und RNA) und dergleichen, sowie Fragmente hiervon. Im Sinne des
vorliegenden Textes soll "Lösung" die Bedeutung haben,
die ihr normalerweise auf dem Fachgebiet zugeschrieben wird und
soll auch ein Zelllysat umfassen. Eine beliebige Lösung, welche
Adenovirus umfasst, kann in Einklang mit dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung angereichert werden. Eine gemischte Adenovirus-Lösung wird
gewöhnlich
erhalten durch Infizieren eukaryotischer Zellen mit einem Adenovirus
wie hierin definiert, Aufrechterhaltung der Zellen für einen
ausreichenden Zeitabschnitt, um die Zahl adenoviraler Partikel zu
amplifizieren, Sammeln der infizierten Zellen und Lysieren (Aufbrechen)
derselben in einer gepufferten Lösung.
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"Anreichern" und "Reinigen" sowie "angereichert" und "gereinigt" werden im vorliegenden
Text austauschbar verwendet, um anzuzeigen, dass die Adenovirus-Konzentration
in einem gegebenen Lösungsvolumen
zunimmt bzw. zugenommen hat. Wünschenswerterweise
ist die angereicherte oder gereinigte Adenovirus-Lösung im
Wesentlichen so rein wie ein in einem Dreistufen-CsCl-Dichtegradienten
gereinigtes Adenovirus.
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Beim
Reinigen des Virus aus infizierten Zellen, d.h. eukaryotischen Zellen,
wird es bevorzugt, die Infektion nicht bis zu dem Punkt fortschreiten
zu las sen, wo das Virus selbst Lyse der Zellen verursacht, weil
unter diesen Bedingungen einzelne Zellen zu sehr unterschiedlichen
Zeiten lysieren und durch die lysierten Zellen freigesetzte degradative
Enzyme beginnen, das freigesetzte Virus anzugreifen. Ferner können die
kurz vor einer adenovirusvermittelten Zelllyse auf den Zellstoffwechsel
wirkenden Belastungen eine Verminderung der Genauigkeit der Virusreplikation
verursachen. Es ist deshalb bevorzugt, die Zellen zu lysieren, bevor
adenovirusvermittelte Lyse eintritt.
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Zur
Lyse kann ein beliebiges geeignetes Verfahren verwendet werden.
Beispielsweise können
die Zellen und das Kulturmedium zentrifugiert und das Medium durch
eine Lösung
starker Detergenzien und anderer Additive (z.B. TritonTMX-100,
Tween 20, Tween 80 oder Desoxycholat) ersetzt werden, und nach Inkubation
für einen
geeigneten Zeitabschnitt kann die Probe zur Weiterverarbeitung gesammelt werden.
Alternativ können
die Zellen durch sanftes Zentrifugieren gesammelt werden, um ein
Zellpellet zu bilden, und durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen
lysiert werden. Eine bevorzugte alternative Technik ist die Verwendung
einer French-Presse oder – noch
mehr bevorzugt – eines
Microfluidizers. French-Pressen und Microfluidizer lysieren eukaryotische
Zellen effizient durch das Aufbringen von Scherkräften, um
die Zellmembranen aufzubrechen. Der Scherkraftprozess ist schneller
und reproduzierbarer als andere geeignete Methoden zum Erhalt einer
ein Adenovirus umfassenden Lösung
aus einer infizierten Population von Zellen, d.h. eukaryotischen Zellen.
Somit kann eine gemischte Lösung,
umfassend ein Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art
von Biomolekül,
zur Reinigung oder Anreicherung in Einklang mit den Verfahren der
vorliegenden Erfindung erhalten werden durch Mikrofluidisieren einer
Population von Adenovirus-infizierten Zellen.
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Nachdem
die Lösung,
aus der das Adenovirus gereinigt werden soll, erhalten worden ist,
kann sie optional geklärt
werden. Falls gewünscht,
kann eine derartige Klärung
durchgeführt
werden durch einen mäßig sanften
Zentrifugationsschritt, um sehr große Stücke von Zelldebris und größere nicht
aufgebrochene Organellen (falls vorhanden) zu entfernen. Ferner
kann das Zelllysat durch Filtration geklärt werden. Insbesondere kann
das Zelllysat durch Tangentialflussfiltration (TFF) geklärt und konzentriert
werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden. Optional kann
die Lösung
dann mit einem Enzym behandelt werden, welches zur Verdauung von
DNA und RNA befähigt
ist (eine "DNase/RNase"), um jegliche DNA
oder RNA in dem geklärten
Zelllysat, die nicht innerhalb der adenoviralen Partikel enthalten ist,
zu entfernen.
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Optional
kann das Zelllysat nach seiner Klärung an einem Anionenaustausch-Vorharz chromatographiert
werden, bevor es gereinigt wird. Für das Vorharz kann ein beliebiges
geeignetes Anionenaustausch-Chromatographieharz verwendet werden. Bevorzugt
weist das Anionenaustausch-Chromatographieharz, welches für das Vorharz
verwendet werden soll, eine mit einem tertiären oder quartären Amin
(z.B. Diethylaminoethyl, Trimethylaminoethyl oder Trimethylaminopropyl)
derivatisierte Oberflächengruppe
auf. Die Oberflächengruppe
kann durch eine beliebige geeignete Linker-Gruppe an einen Matrixträger gekoppelt
sein, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Acrylpolymer-Linker gehören zu den
Linkern, welche im Kontext der vorliegenden Erfindung Verwendung
finden können.
Die Trägermatrix
kann aus einem beliebigen geeigneten Material bestehen; bevorzugt
ist der Matrixträger
aber ein Material, welches auf dem Konzept des "weichen Gels in steifer Hülle" basiert. Dieses "gelgefüllte" Chromatographieharz
erlaubt es, dass man sich die hohe Kapazität von weichen Gelen, z.B. Agarose,
und die Steifheit von Composite-Materialien für hohe Flussraten und erhöhte Toleranz
gegenüber
Kompression oder Schrumpfung und Schwellung der Medien, eine allgemeine
Charakteristik weicher Gele, zunutze machen kann. Diese "gelgefüllten" Chromatographieharze
sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind z.B. in den US-Patenten
Nr. 5 268 097 und Nr. 5 672 276 beschrieben.
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Ein
erwünschtes
Vorharz-Anionenaustausch-Chromatographieharz im Kontext der vorliegenden
Erfindung ist Q Ceramic HyperDTMF, kommerziell
erhältlich
von BioSepra, Villeneuve-La-Garenne, Frankreich. Q Ceramic HyperDTMF besteht aus einem hochporösen keramisierten
Kornmaterial, gefüllt
mit einem funktionalisierten flexiblen hydrophilen Hydrogel, mit
einer mittleren Korngröße von 50 μm (mit einem
Partikelbereich von 25–75 μm). Q Ceramic
HyperDTMF weist eine dynamische Kapazität von mindestens
85 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) bei 200 cm/h mit 50% Durchbruch
und von mindestens 80 mg/ml BSA bei 600 cm/h mit 50% Durchbruch
auf. Aufgrund der gelge füllten
Natur von Q Ceramic HyperDTMF steht eine
größere äußere Oberfläche für die Bindung
zur Verfügung
verglichen mit klassischen porösen
Medien, bei denen typisch mindestens 50% des Äußeren des Partikels aus dem Poreneintritt
gebildet sind, wo keine Bindung stattfindet. Als eine Folge tragen
100% der gesamten äußeren Oberfläche von
Q Ceramic HyperDTMF zur Bindung bei. Dieses
Merkmal macht dieses Chromatographieharz zu einem bevorzugten Vorharzmaterial.
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Alternativ
kann das Zelllysat optional an einem "expanded bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Vorharz chromatographiert
werden. Beispielsweise kann ein "expanded
bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Chromatographieharz
mit Bindungseinheiten, welche mit einem quartären Amin (z.B. Trimethylaminomethyl
oder DEAE) derivatisiert sind, verwendet werden. "Expanded bed"-Anionenaustausch-Chromatographieharze
sind gekennzeichnet durch größere Kornabmessungen,
z.B. größer als 30 μm
im Durchmesser, üblicherweise
aber nicht mehr als 500 μm
im Durchmesser. Wegen der großen
Korngröße können große Fragmente
von Zelldebris und ganze (unlysierte) Zellen frei durch das Chromatographieharz
(und dessen geeignet bemessene Fritte) strömen. Geeignete "expanded bed"-Adsorptions-Chromatographieharze
umfassen, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, Streamline QXL® (Pharmacia,
Uppsala, Schweden) und DEAE Cellthru-Big BeadsTM (Sterogene,
Carlsbad, CA, oder das Äquivalent
von UpFront Chromatography, Kopenhagen, Dänemark).
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Das
Zelllysat wird von dem Vorharz-Anionenaustausch-Chromatographieharz
mit einem beliebigen geeigneten Eluenten eluiert (z.B. 600 mM NaCl).
Die Lösung
wird geeignet verdünnt,
falls erforderlich, um die Konzentration des Elutionsmittels oder
anderer Agenzien in dem Elutionspuffer zu verringern. Die semi-gereinigte
und konzentrierte Zelllysatlösung
kann dann auf ein geeignetes Anionenaustausch-Chromatographieharz
zur Reinigung aufgebracht werden.
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Im
Hinblick auf das im Vorstehenden Gesagte stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung einer Lösung an einem Adenovirus bereit.
Das Verfahren umfasst: (i) Erhalten einer gemischten Lösung, die
ein Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst; (ii)
Aufbrin gen der gemischten Lösung
auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz und (iii) Eluieren
des Adenovirus von dem Chromatographieharz mit einem Eluenten, so
dass eine angereicherte Adenovirus-Lösung erhalten wird. Ferner
kann die gemischte Adenovirus-Lösung
optional durch Tangentialflussfiltration geklärt werden. Ferner kann die
geklärte
gemischte Adenovirus-Lösung
optional unter Verwendung eines Anionenaustausch-Vorharzes chromatographiert
werden.
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Ein
Adenovirus kann aus mit Adenovirus infizierten Zellen gereinigt
werden. Ein Verfahren zum Reinigen eines Adenovirus aus mit Adenovirus
infizierten Zellen umfasst das Lysieren von mit Adenovirus infizierten
Zellen, Aufbringen des Lysats auf ein einziges Chromatographieharz,
so dass das Adenovirus an das Chromatographieharz bindet, Eluieren des
Adenovirus von dem Chromatographieharz und Sammeln einer Fraktion,
welche das Adenovirus enthält.
Das Adenovirus in der Fraktion ist im Wesentlichen so rein wie ein
in einem Dreistufen-CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus.
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Es
kann ein beliebiges geeignetes einziges Chromatographieharz verwendet
werden, um das Adenovirus aus einem Zelllysat zu reinigen. Es kann ein
beliebiges geeignetes Anionenaustausch-Chromatographieharz, welches
eine Oberflächengruppe aufweist,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl,
Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, verwendet
werden, um das Adenovirus aus einer gemischten Lösung, welche Adenovirus und
mindestens eine unerwünschte
Art von Biomolekül
umfasst, zu reinigen. Die Oberflächengruppe
ist bevorzugt Dimethylaminopropyl. Die Oberfläche kann mittels einer beliebigen
geeigneten Linker-Gruppe an einen Matrixträger gekoppelt sein, wie auf
dem Fachgebiet bekannt. Sulphonamid- und Acrylat-Linker gehören zu den
Linkern, welche im Kontext der vorliegenden Erfindung Anwendung
finden können.
Der Matrixträger
kann aus einem beliebigen geeigneten Material bestehen; es ist jedoch
bevorzugt, wenn der Matrixträger
ein Perfusions-Anionenaustausch-Chromatographieharz
ist, derart, dass der Intrapartikel-Massentransport optimiert wird.
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Typische
Perfusions-Chromatographieharze weisen große Poren (z.B. 6000–8000 Å) auf,
welche die Partikel durchschneiden. Ein Netzwerk kleinerer Poren,
wodurch die Diffusionsweglängen
limitiert werden, vergrößert die
Oberfläche
der Großporen-Durchmesser.
Zum Teil infolge der bimodalen Verteilung der Porengrößen treten
die mobile Phase und Adenovirus in die Chromatographieharzpartikel ein
und durchströmen
sie unter Nutzung von sowohl konvektivem als auch diffusivem Transport.
Derartige Perfusions-Chromatoraphieharze sind auf dem Fachgebiet
wohlbekannt; eine ausführlichere
Beschreibung findet sich z.B. bei Afeyan et al. (J. Chromatogr.
519: 1–29
(1990)) und in den US-Patenten Nr. 5 384 042; Nr. 5 228 989; Nr.
5 552 041; Nr. 5 605 623 und Nr. 5 019 270).
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Ein
geeignetes Perfusions-Anionenaustausch-Chromatographieharz im Kontext
der vorliegenden Erfindung ist POROS® 5OD,
kommerziell erhältlich
von PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts. POROS® 5OD
ist ein makroporöses Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Chromatographieharz,
welches eine dynamische Kapazität
von mindestens 100 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) bei 100 cm/h mit
50% Durchbruch und von mindestens 80 mg/ml BSA bei 1000 cm/h mit
5% Durchbruch aufweist. POROS® 5OD zeigt einen Druckabfall
von weniger als 3 bar bei 1000 cm/h in einem 10 cm-Chromatographieharzbett,
und die nominale Partikelgröße des Chromatographieharzes
beträgt
ca. 50 μm (d.h.
die mittlere Partikelgröße liegt
zwischen 25 und 100 μm).
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Anionenaustausch-Chromatographieharze können entweder
als "Batch"-Chromatographieharze oder,
bevorzugt, als "Durchfluss"-Anordnungen verwendet
werden, bevorzugt in Form einer Säule, insbesondere für Perfusions-Chromatographieharze. Ferner
stellt die vorliegende Erfindung – im deutlichen Gegensatz zu
den Verfahren nach dem Stand der Technik – eine voll skalierbare, einfache
und schnelle Reinigung von Adenovirus mittels Chromatographie bereit.
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Ein
in Einklang mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren gereinigtes Adenovirus weist
kein wesentlich niedrigeres Partikel-zu-pfu-Verhältnis (pu/pfu) auf als ein
in einem CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus. Das heißt, der pu/pfu-Wert
des gereinigten Adenovirus beträgt
mindestens 50% desjenigen des in einem CsCl-Dichtegradienten gereinigten
Adenovirus, bevorzugt mindestens ca. 85% desjenigen des in einem
CsCl-Dichtegradienten gereinigten Adenovirus und mehr bevorzugt
mindestens ca. 96% desjenigen des in einem CsCl-Dichtegradienten
gereinigten Adenovirus. Weiter: die Reinheit des chromatographierten
Adenovirus überschreitet
bevorzugt diejenige einer identischen Adenovirus-Lösung, die
analytisch nicht unterscheidbar ist von Adenovirus, welches durch
eine standardmäßige Dreistufen-CsCl-Dichtegradientenreinigung
nach dem Stand der Technik gereinigt wurde (d.h. ist im Wesentlichen
so rein wie ein in einem Dreistufen-CsCl-Dichtegradienten gereinigtes
Adenovirus, z.B. mindestens 90% so rein, bevorzugt mindestens 97%
so rein und mehr bevorzugt mindestens 99% so rein wie ein in einem
Dreistufen-CsCl-Gradienten gereinigtes Adenovirus).
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Das
Adenovirus wird im Wesentlichen und geeignet in einer Lösung angereichert,
indem es von dem Anionenaustausch-Chromatographieharz mit einem
geeigneten Eluenten eluiert wird. Typische geeignete Eluenten sind
ionisch im Charakter, so dass sie mit dem Adenovirus um die Bindung
an das Chromatographieharz konkurrieren. Bevorzugt wird der Eluent
auf das Chromatographieharz in einem diskontinuierlichen Gradienten
aufgebracht, d.h. in zwei oder mehr Schritten, oder in einem kontinuierlichen Gradienten.
Derartige Gradienten können
linear, konkav oder konvex sein. Ein geeigneter Eluent ist Natriumchlorid
in einer gepufferten Lösung.
Beispielsweise eluiert Adenovirus von Q Ceramic HyperDTMF-Chromatographieharz
bei Konzentrationen zwischen ca. 360 und ca. 475 mM NaCl, insbesondere bei
ca. 415 mM NaCl, und von POROS® 5OD-Chromatographieharz
bei Konzentrationen zwischen ca. 360 und ca. 450 mM NaCl, insbesondere
bei ca. 400 mM NaCl.
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Das
Anionenaustausch-Chromatographieharz kann vorteilhaft bei hohen
Elutionsmittelkonzentrationen beladen werden (z.B. mindestens ca.
75% der Konzentration, die notwendig ist, um das Adenovirus von
dem Chromatographieharz zu eluieren, bevorzugt zwischen ca. 85%
bis ca. 90% der Konzentration, die notwendig ist, um das Virus von
dem Chromatographieharz zu eluieren). Durch Beladung des Anionenaustausch-Chromatographieharzes
bei hohen Elutionsmittelkonzentrationen binden gewisse Verunreinigungen
nicht an das Harz.
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Die
Elution des angereicherten Adenovirus kann bei einer beliebigen
geeigneten Flussrate erfolgen. Typische Flussraten für in dem
Vorharz verwendetes Anionenaustausch-Chromatographieharz liegen
im Bereich von ca. 100 cm/h bis ca. 1000 cm/h, bevorzugt ca. 200
cm/h bis ca. 500 cm/h. Beispielhafte Flussraten für Anionenaustausch-Chromatographieharz,
welches eine Bindungseinheit enthält, die ausgewählt ist
aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl,
Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, liegen im Bereich
von ca. 100 cm/h bis ca. 1500 cm/h, bevorzugt ca. 500 cm/h bis ca.
1250 cm/h.
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Um
die Anzahl an adenoviralen Partikeln entweder in einer Probelösung von
Adenovirus, z.B. in einer aus einem rohen Lysat von mit Adenovirus
infizierten Zellen erhaltenen Lösung,
genau zu quantifizieren, kann eine Probelösung von einem Adenovirus hergestellt
werden, wie bereits beschrieben. Die Probelösung von Adenovirus kann dann
angereichert und gereinigt werden, indem die Probelösung von Adenovirus
auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz aufgebracht und eluiert
wird, wie bereits beschrieben. Sodann wird die Absorption des von
dem Chromatographieharz eluierten Probe-Adenovirus bestimmt. Zum
Vergleich wird die Absorption einer Standardlösung von Adenovirus, d.h. einer
Adenovirus-Lösung
von bekannter Konzentration, bestimmt. Durch einen Vergleich der
Absorption der Probelösung
und der Absorption der Standardlösung
wird die Konzentration adenoviraler Partikel, d.h. die Anzahl an
adenoviralen Partikeln in einem gegebenen Volumen, in einer Probelösung bestimmt.
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Die
Standardabsorption kann eine einzige Standard-Absorption oder eine
Serie oder Gruppe von Standard-Absorptionen sein, welche einen Adenovirus-Konzentrationsbereich
anzeigen. Die Probe-Absorption und die Standard-Absorption können in ähnlichen
oder verschiedenen (doch bevorzugt ähnlichen) Formaten, Messungen
oder Einheiten präsentiert
werden, solange ein brauchbarer Vergleich durchgeführt werden
kann. Beispielsweise kann eine geeignete Standard-Absorption eine
Absorption sein, die bestimmt wird aus einer Standardlösung von
Adenovirus, welche in der gleichen Weise behandelt worden ist, wie
eine Probelösung
von Adenovirus gemäß den vorliegenden
erfindungsgemäßen Verfahren
behandelt worden ist.
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Die
Quantifizierung der Anzahl an adenoviralen Partikeln wird erzielt,
indem die Probe-Absorption mit der Standard-Absorption auf beliebige
geeignete Weise verglichen wird. Beispielsweise können Probe-Absorption
und Standard-Absorption
verglichen werden durch Berechnen einer Standardkurve der Fläche unter
dem Peak korrespondierend zu der Viruselution von dem Chromatographieharz
auf einem Chromatogramm, in dem die Absorption gegen die Zeit aufgetragen
ist. Die Absorption von verschiedenen bekannten Adenovirus-Konzentrationen kann auf
einem Graphen aufgetragen werden, so dass eine Standardkurve erzeugt
wird. Mittels linearer Regressionsanalyse kann dann die Probenkonzentration
bestimmt werden.
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Unter
Verwendung von Anionenaustausch-Chromatographieharzen in einer Lösung angereichertes
oder aus Adenovirus-infizierten Zellen gereinigtes Adenovirus kann
in Lösungen
erhalten werden, welche hohe Konzentrationen an Elutionsmittel,
z.B. NaCl, enthalten können.
Die Pufferzusammensetzung kann durch eine beliebige geeignete Technik
leicht in einen beliebigen gewünschten
Puffer geändert
werden, z.B. in einen sterilen, isotonischen Puffer zur Injektion
in den Säugetierkörper (z.B.
Ringer-Lactatlösung),
der geeignete Exzipienten (Stabilisatoren und Kryokonservierungsmittel)
für die
Langzeitlagerung des gereinigten Adenovirus enthält. Geeignete Techniken zum Ändern der
Pufferzusammensetzung umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein,
Dialyse, Diafiltration und Größenausschlusschromatographie.
Geeignete Größenausschlusschromatographiematrices
umfassen Toyopearl HW-40C und Toyopearl HW40F (TosoHaas, Montgomeryville,
PA); UniflowTM, SuperflowTM und
UltraflowTM (Sterogene, Carlsbad, CA), ShodexTM (Thomson Instruments, Chantilly, VA) sowie
Bio-SilTM und Bio-GelTM (Bio-Rad,
Hercules, CA). Jedes dieser Chromatographieharze weist ein geeignet
niedriges Proteinbindungspotential auf.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
Diese Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Erfindung und sollen
den Bereich der Erfindung in keiner Weise einschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel demonstriert die Reinigung von Adenovinus aus rohem Zelllysat.
Die Reinigung wurde erzielt, indem zunächst das Zelllysat geklärt wurde,
das Zelllysat auf ein Anionenaustausch-Vorharz aufgebracht und eluiert
wurde und schließlich das
Zelllysat auf ein Anionenaustauschharz, welches eine Bindungseinheit
enthält,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminopentyl,
Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, aufgebracht
und eluiert wurde.
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AdSEAP
und AdVEGF121 sind adenovirale Vektoren
mit Deletionen in der E1- und
E3-Region des adenoviralen Genoms, welche eine Genexpressionskassette
enthalten, in diesem Falle einen cytomegaloviralen (CMV-)Promotor,
der funktionell gekoppelt ist an ein fremdes Gen (Transgen), z.B.
sekretierte alkalische Phosphatase (AdSEAP) oder vaskulärer endothelialer
Wachstumsfaktor 121 (AdVEGF121), in der
E1-Region des adenovinalen Genoms. AdSEAP und AdVEGF121 wurden
in Spinner-Flasks, Rollerflaschen, Schüttelflaschen oder Bioreaktoren,
welche ca. 105–106 293-Zellen
pro ml enthielten, in Anwesenheit oder Abwesenheit von Serum in
dem Wachstumsmedium propagiert.
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Die
Zellen und Medien wurden nach einer der folgenden beiden Methoden
vor einer Chromatographie verarbeitet: (a) die Zellen wurden durch
Zentrifugation konzentriert, in einem geeigneten Puffer (25 mM Tris,
pH 7,8, 75 mM NaCl, 10 mM MgCl2) resuspendiert
zwecks optimaler Aktivität
der DNase/RNase, in einem Microfluidizen (Microfluidics, Newton,
Massachusetts) nach Angaben des Herstellers lysiert und durch Filtration
geklärt;
oder: (b) die Zellen wurden direkt in einem Microfluidizer nach
Angaben des Herstellers lysiert, durch Filtration geklärt und durch
Tangentialflussfiltration (TFF) zu dem oben beschriebenen geeigneten
Puffer konzentriert und diafiltriert. Bei beiden Methoden wurde
das geklärte
Zelllysat dann mit einer DNase/RNase, z.B. Benzonase® (Nycomed
Pharma A/S, Dänemark),
gemäß den Angaben
des Herstellers behandelt und zu einem geeigneten Puffer für das Anionenaustausch-Vorhanz
verdünnt.
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Das
Zelllysat wurde dann auf eine Q Ceramic HyperDTMF-Säule aufgebracht
und mit einem Stufengradienten von 360 bis 475 mM NaCl eluiert. 1, die
ein Chromatogramm darstellt von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat,
eluiert von einem quartären Amin-Chromatographieharz
(Q Ceramic HyperDTMF-Säule),
zeigt die Elution des Adenovirus von der Anionenaustausch-Vorsäule, Q Ceramic
HyperDTMF, wenn der DNase/RNase-Schritt
nicht durchgeführt
wurde. Der konzentrierte und partiell gereinigte Virus-Peak, der
bei ca. 415 mM NaCl eluiert, wenn mit Stufengradienten von 360,
450 und 1000 mM NaCl eluiert wird, war in einer Fraktion um 51 Minuten enthalten. 2,
die ein Chromatogramm darstellt von einem Adenovirus-infizierten
Zelllysat, geklärt durch
Tangentialflussfiltration, behandelt mit DNase/RNase und eluiert
von einem quartären Amin-Chromatographieharz,
zeigt die Elution des Adenovirus von der Anionenaustausch-Vorsäule, Q Ceramic
HyperDTMF, wenn eine DNase/RNase (Benzonase®)
verwendet wurde. Eine wesentliche Verringerung der Größe des nach
dem Virus-Peak eluierenden Nucleinsäure-Peaks wurde beobachtet.
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Der
Eluent aus der Anionenaustausch-Vorsäule wurde sodann um ca. 30%
verdünnt,
was notwendig ist, um das Elutionsmittel, in diesem Falle NaCl,
auf eine Konzentration zu verdünnen,
die unter der Elutionskonzentration für die Dimethylaminopropyl-Perfusionschromatographie-(POROS® 5OD)-Säule liegt,
die verwendet wurde, um die Reinigung des Adenovirus aus dem rohen
Zelllysat zu vervollständigen.
Die POROS® 5OD-Säule wurde
bei einer Konzentration von 300 mM NaCl beladen. Die Säule wurde
dann mit einem Stufengradienten von Natriumchlorid (360 mM bis 450
mM) eluiert.
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Ein
Chromatogramm von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat, geklärt durch
Tangentialflussfiltration, behandelt mit DNase/RNase und eluiert
von einer quartären
Amin-Chromatographiesäule
und einer Dimethylaminopropyl-Perfusionschromatographiesäule zeigt
die Elution des Adenovirus von der POROS® 5OD-Säule. Im
Wesentlichen wurde nur ein scharfer Peak bei ca. 35 min erhalten.
Eine analytische Charakterisierung des gereinigten Adenovirus zeigte
an, dass die Reinheit des Adenovirus im Wesentlichen nicht zu unterscheiden
war von einem in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigten
Adenovirus.
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Somit
wurde Adenovirus aus rohem Zelllysat gereinigt durch Filtern des
Zelllysats, Aufbringen des Zelllysats auf eine quartäre Amin-Anionenaustausch-Vorsäule und
Eluieren des Zelllysats von derselben und schließlich Aufbringen des Zelllysats
auf eine Anionenaustauschsäule,
welche eine Dimethylaminopropyl-Bindungseinheit
enthielt, und Eluieren des Zelllysats von derselben.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel demonstriert die Reinigung von Adenovirus aus rohem Zelllysat.
Die Reinigung wurde erzielt, indem zunächst das Zelllysat geklärt wurde,
das Zelllysat auf eine "expanded
bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Vorsäule aufgebracht und
von derselben eluiert wurde und schließlich das Zelllysat auf eine
Anionenaustauschsäule
aufgebracht wurde, welche eine Bindungseinheit enthält, die
ausgewählt
ist aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminopentyl,
Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, und von derselben
eluiert wurde.
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AdSEAP
(der adenovirale Vektor wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde in
Spinner-Flasks, welche ca. 105–106 293-Zellen pro ml enthielten, propagiert. Die
Zellen und Medien wurden in einem Microfluidizer nach Angaben des
Herstellers lysiert. Das Zelllysat wurde auf eine Streamline QXL® "expanded bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Vorsäule (Pharmacia,
Uppsala, Schweden) aufgebracht (um großstückiges Debris und unlysierte
Zellen zu entfernen). Die Streamline QXL®-Säule diente
teilweise auch zur Reinigung und Konzentrierung des Adenovirus. 3,
die ein Chromatogramm darstellt von einem Adenovirus-infizierten
Zelllysat, eluiert von einem "expanded
bed"-Adsorptions-Chromatographieharz,
zeigt die Elution des Adenovirus von der Streamline QXL®-Säule. Der
Virus-Peak war in der Fraktion 14 enthalten (eine Fraktion pro Minute),
die bei ca. 600 mM NaCl eluierte. Der Eluent von der Streamline
QXL®-Säule wurde
ca. 1:2 verdünnt.
Die Verdünnung
war notwendig, um das Elutionsmittel, in diesem Falle NaCl, auf
eine Konzentration zu verdünnen,
die unter der Elutionskonzentration für die POROS® 5OD-Säule liegt,
die als nächstes
verwendet wurde.
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Eine
POROS® 5OD-Säule wurde
verwendet, um die Reinigung des Adenovirus zu vervollständigen.
Die POROS® 5OD-Säule wurde
bei einer Konzentration von 300 mM NaCl beladen. Die Säule wurde
dann mit einem linearen Gradienten von Natriumchlorid (360 mM bis
450 mM) eluiert, wobei das Adenovirus von der POROS® 5OD
eluierte. Ein Chromatogramm von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat, eluiert
von einem "expanded-bed"-Adsorptions-Chromatographieharz
und einem Dimethylaminopropyl-Perfusionschromatographieharz zeigt
im Wesentlichen nur einen scharfen Peak bei ca. 15 min, wenn mit
einem linearen NaCl-Gradienten von 360 bis 450 mM eluiert wurde,
so dass das Virus bei ca. 400 mM NaCl eluierte. Eine analytische
Charakterisierung des gereinigten Adenovirus zeigte an, dass die
Reinheit des Adenovirus im Wesentlichen nicht zu unterscheiden war
von einem in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigten
Adenovirus (siehe 4).
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Somit
wurde Adenovirus aus rohem Zelllysat gereinigt durch Filtern des
Zelllysats, Aufbringen des Zelllysats auf eine "expanded bed"-Anionenaustausch-Vorsäule
und Eluieren des Zelllysats von derselben und schließlich Aufbringen
des Zelllysats auf eine Anionenaustauschsäule, welche eine Dimethylaminopropyl-Bindungseinheit
enthielt, und Eluieren des Zelllysats von derselben.
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel demonstriert – im
deutlichen Gegensatz zu Methoden nach dem Stand der Technik – eine Reinigung
eines Adenovirus durch eine einzige Chromatographiesäule aus
einem rohen Zelllysat, wobei die Reinigung mindestens 95% so rein wie
ein in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus
war. Ferner stellt diese Technik eine schnelle und genaue Methode
zum Quantifizieren der Gesamtzahl an viralen Partikeln in einem rohen
Lysat bereit.
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AdSEAP
(der adenovirale Vektor gemäß Beispiel
1) wurde wachsen gelassen und lysiert wie in Beispiel 1, Methode
(a). Das Ganzzelllysat wurde auf eine POROS® 5OD-Säule in 360
mM NaCl aufgebracht. Die Säule
wurde eluiert wie in Beispiel 1 angegeben, was zu dem in 6 gezeigten
Chromatogramm führte,
in dem die Absorption (260 nm und 280 nm) gegen die Zeit (min) aufgetragen
ist. Eine analytische Untersuchung der Peak-Fraktion zeigte, dass
die Reinheit nicht zu unterscheiden war von einem in einem dreistufigen
CsCl-Dichtegradienten
gereinigten Adenovirus (5 & 6), wobei
die obere horizontale Linie eine Inline-Messung der Leitfähigkeit
ist, welche die tatsächliche
NaCl-Konzentration angibt. Die beträchtliche Überlappung und das Verhältnis der
Peak-Absorption bei 260 nm (die höhere Spur in dem Chromatogramm)
zu 280 nm (die untere Spur in dem Chromatogramm), das 1,27 betrug
(1,25 ± 0,08
war das empirisch ermittelte Verhältnis des reinen Virus), zeigten,
dass das Virus im Wesentlichen rein war. Ferner zeigte das Fehlen
von nicht-überlagerten
Peaks (oder sekundären
Peaks) an, dass das Virus im Wesentlichen rein war.
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Verschiedene
Adenovirus-Lösungen
von bekannter Konzentration wurden auf eine POROS® 5OD-Säule in 360
mM NaCl aufgebracht. Die Säule wurde
eluiert, wie in Beispiel 1 angegeben, und die Absorption (260 & 280 nm) gegenüber der
Elutionszeit (min) chromatographiert. Die Fläche unter dem Peak korrespondierend
zu der Adenovirus-Elution wurde für jede unterschiedliche Konzentration
bestimmt und als ein Graph der Fläche gegen die Adenovirus-Konzentration aufgetragen.
Die Fläche
unter der Kurve des AdSEAP-Chromatogramms in 5 korrespondierend
zu der Adenovirus-Elution wurde berechnet und mit der Standardkurve
verglichen unter Verwendung linearer Regression, und es wurde bestimmt,
dass das rohe Lysat 4,64 × 1010 pu/mL enthielt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt also eine Ein-Schritt-Methode bereit
zum Reinigen von Adenovirus aus einem Ganzzelllysat. Somit wurde
Adenovirus, das mindestens 95% so rein wie ein in einem dreistufigen
CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus war, aus rohem Zelllysat
durch eine einzige Chromatographiesäule gereinigt. Ferner wurde
die Adenovirus-Gesamtzahl in einem rohen Zelllysat schnell und genau
quantifiziert.
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Beispiel 4
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Dieses
Beispiel demonstriert, dass die Pufferzusammensetzung von aus Anionenaustauschsäulen isoliertem
Adenovirus leicht geändert
werden kann (z.B. von einer hohen Salzkonzentration zu einer niedrigen
Salzkonzentration).
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Etwa
0,1 Säulenvolumina
(0,01 Säulenvolumina
bis ca. 0,25 Säulenvolumina)
der in Beispiel 1 isolierten adenovirushaltigen Lösung wurden
auf eine Toyopearl HW-40C-Säule
oder eine Uniflow 4-Säule
aufgebracht, die mit einem geeigneten sterilen isotonischen Puffer
zur Injektion in den Säugetierkörper (z.B.
Ringer-Lactatlösung) äquilibriert
war, der geeignete Exzipienten (Stabilisatoren und Kryokonservierungsmittel)
für die
Langzeitlagerung des gereinigten Adenovirus enthielt. Die das Adenovirus enthaltende
Säulenfraktion
wurde durch Inline-Spektroskopie identifiziert und zurückgehalten.
Das gereinigte Virus war in einem Puffer enthalten, der ca. 10 mM
Tris, pH 7,8, 75 mM NaCl und verschiedene Stabilisatoren enthielt.