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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Kultivierung und Aufreinigung von Viren ist für die Gentherapie und für die Impfstoffentwicklung zunehmend
wichtig geworden. Huyghe et al. (Human Gene Therapy 6: 1403–1416 (1995))
offenbarten einen Vergleich von verschiedenen Verfahren zum Auf
reinigen von rekombinanten Adenoviren einschließlich der Anionenaustauschchromatographie,
der Größenausschlußchromatographie,
der Affinitätschromatographie mit
immobilisiertem Zink („immobilized
zinc affinity chromatography")
und der Ultrazentrifugation, und schlußfolgerten, daß das bevorzugten
Verfahren zum Auf reinigen eines rekombinanten Adenovirus eine Nukleasebehandlung
eines Zelllysats gefolgt von einer Filtration durch Membranfilter
gefolgt von DEAE-Chromatographie, gefolgt von Zinkaffinitätschromatographie
ist.
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Die
WO 97/08298 betrifft ein Verfahren zum Auf reinigen von Adenovirus
und Adeno-assoziiertem Virus.
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Die
WO 98/00524, betrifft ein Verfahren zum Herstellen von rekombinantem
Adenovirus.
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Die
EP 0 593 339 A betrifft
Verfahren zum Herstellen von Hepatitis A-Antigenen und -Impfstoffen.
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Die
EP 0 522,291 A betrifft
ein Verfahren zum Auf reinigen von Hepatitis A-Virus.
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Im
Hinblick auf den ständig
ansteigenden Bedarf nach aufgereinigten Viren, zum Beispiel für die Verwendung
als virale Vektoren für
die Gentherapie, wären
verbesserte Verfahren der Aufreinigung höchst wünschenswert.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Auf reinigen von Adenovirus
aus einer Virusaufbereitung, das die folgenden aufeinanderfolgenden
Schritte umfasst:
- a) Unterwerfen der Virusaufbereitung
einer Anionenaustauschchromatographie, wobei das Adenovirus aus einem
Anionenaustauschchromatographie-Medium eluiert wird, und
- b) Unterwerfen des Eluats aus Schritt a), welches das Adenovirus
enthält,
einer Größenausschlußchromatographie,
wobei das Adenovirus aus einem Größenausschlußchromatographie-Medium eluiert wird,
wobei
das Größenausschlußchromatographie-Medium
ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus G6000PWXL, SB-806, SEPHACRYLRTM S-400 HR, SEPHADEX G-200, SEPHAROSERTM CL-2B, SUPER-DEXRTM 200 mit
Präparationsgüte, SUPEROSERTM 6 mit Präparationsgüte, TSK 6000PWXL und ULTRAHYDROGEL
2000. Die Viruszubereitung kann ein Zelllysat sein, das vor Schritt
a) filtriert werden kann. Das Adenovirus kann ein rekombinantes
Adenovirus sein, wie beispielsweise ACN53 (offenbart in der WO 95/11984).
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Das
Anionenaustausch-Medium kann Diethylaminoethylgruppen auf einem
Grundgerüst
aus kreuzvernetzter Agarose, Cellulose, Polyacrylamid oder Polystyren
umfassen, wie beispielsweise FRACTOGELTM-DEAE.
Das Größenausschluß-Medium
kann ein kreuzvernetztes Polysaccharid umfassen, und kann ein Verbund
aus kreuzvernetzter Agarose und Dextran sein. Ein beispielhaftes
Größenausschluß-Medium
ist SuperdexRTM-200. Das Anionenaustausch-Medium
kann vor Anwendung auf die Viruszubereitung gründlich gewaschen werden.
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Das
Größenausschluß-Medium
kann in einer Säule
bereitgestellt werden, die als ein Salzgradient zubereitet wurde,
der hinsichtlich der Ionenstärke
von der Spitze des Mediums zum Boden hin abnimmt, wobei die Spitze
der Säule
einen Puffer aufweist, der eine Ionenstärke besitzt, die mit der des
Produktes aus Schritt a im Wesentlichen identisch ist.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Virus, das durch das Verfahren gemäß Anspruch
1 aufgereinigt wurde.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Aufreinigung eines Virus, und
zwar eines Adenovirus, das zum Beispiel durch Kultivierung in einem
zellulären
Wirt und dann durch Freisetzen mittels Lyse der Zellen und Abtrennung
von zellulären
Trümmern
hergestellt worden sein kann. Der Begriff "Virus" schließt Wildtyp-, Mutanten- und
rekombinante Viren, insbesondere adenovirale Vektoren für die Expression
von heterologen Nukleinsäuresequenzen,
ein.
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Die
Ausführungsformen
der Erfindung fallen unter die. allgemeine Strategie der Adsorptionschromatographie
einer Viruszubereitung gefolgt von Größenausschlußchromatographie. Üblicherweise
wird die Anionenaustauschchromatographie auf einem Anionenaustauschharz
durchgeführt,
das aus basischen Gruppen in Seitenketten besteht, die an ein makromolekulares
Grundgerüst
geheftet sind. Die basischen Gruppen sind bevorzugt substituierte
Aminogruppen, insbesondere di-(Niederalkyl)aminoalkylgruppen, bei
denen jede Niederalkylgruppe 1 bis 4, bevorzugt 2 Kohlenstoffatome
aufweist, und jede Alkylgruppe 2 bis 4, bevorzugt 2 Kohlenstoffatome
aufweist. Das Grundgerüst
kann aus Kieselsäure
oder einer organischen Matrix zusammengesetzt sein, zum Beispiel
kreuzvernetzter Agarose, Cellulose, Polyacrylamid oder Polystyren.
Es ist insbesondere bevorzugt, ein Anionenaustauschharz zu verwenden,
das aus Dimethylaminoethylgruppen (DMAE-Gruppen) oder insbesondere
aus Diethylaminoethylgruppen (DEAE-Gruppen) auf einem kreuzvernetzten
Agarose-Grundgerüst
besteht; besonders bevorzugte Harze des DEAE-Typs sind solche, die unter dem Handelsnamen "DEAE-Fractogel" verkauft werden,
zum Beispiel "FRACTOGELTM EMD DEAE-650M" und "FRACTOGELTM AE". In einigen, Ausführungsformen
der Erfindung kann das "Grundgerüst" ein fester Träger, wie
beispielsweise ein Kügelchen
sein.
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Das
Anionenaustauschharz wird vor dem Beladen mit der Viruszubereitung
gründlich
gewaschen, um Konservierungsmittel, wie beispielsweise Natriumazid
und Ethanol, und andere Fremdmaterialien zu entfernen, in dem die
Säule mit
ungefähr
5 bis 10 Säulenvolumen
einer basischen Lösung,
wie beispielsweise 50 mM NaOH/1 M NaCl gewaschen wird, gefolgt von
ungefähr
5 bis 10 Säulenvolumen
einer neutralisierenden Lösung,
wie beispielsweise 50 mM HCl/1 M NaCl, gefolgt von ungefähr 5 bis
30 Volumen von Ladungs- und/oder Elutionspuffern. Wahlweise wird
die Säule
mit einem Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration als die des Lade-
und/oder Elutionspuffers gewaschen, bevor sie mit Lade- und/oder
Elutionspuffer gewaschen wird.
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Üblicherweise
wird eine Viruszubereitung, wie beispielsweise ein Zelllysat, in
einer gepufferten Lösung von
ungefähr
pH 7,0–8,5
mit einer Salzkonzentration von ungefähr 100–360 mM auf das chromatographische Medium
geladen. Das Salz ist üblicherweise
NaCl. In einigen Ausführungsformen
werden andere Puffer, wie beispielsweise Phosphat oder Tris verwendet.
Kontaminationen können
bevorzugt durch Waschen der Säule mit
einem Puffer bei einer Salzkonzentration von ungefähr 250–380 mM
eluiert werden. Das Adenovirus kann durch eine Lösung mit einer Salzkonzentration
von ungefähr
360–600
mM eluiert werden. Das Salz ist üblicherweise
NaCl. Üblicherweise
werden ungefähr 5
bis 50, bevorzugter ungefähr
30 Puffervolumen verwendet, um das Virus zu eluieren. Die Fraktionen
können
gesammelt und auf die Anwesenheit von Virus hin durch Messen der
A260 oder der A280 und
Vereinen der Peakfraktionen getestet werden; alternativ kann das
Eluat, das den A260- oder den A280-Peak
enthält,
in einer einzelnen Fraktion gesammelt werden. Diese einzelne A260-oder A280-Fraktion oder die vereinten Fraktionen
in dem Eluat, die das Virus enthält/enthalten,
werden hier als "Anionenaustausch-Pool" bezeichnet.
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In
dem Größenausschlußchromatographieschritt
werden Moleküle
entsprechend ihrer Größe in einem Bett
getrennt, das mit einem inerten porösen Medium gepackt ist, insbesondere
einem inerten Gelmedium, das bevorzugt ein Verbund von kreuzvernetzten
Polysacchariden, zum Beispiel kreuzvernetzter Agarose und Dextran
in der Form von kugelförmigen
Kügelchen
ist. Moleküle,
die größer sind
als die größten Poren
in dem gequollenen Gelkügelchen,
gelangen nicht in die Gelkügelchen
und wandern daher am schnellsten durch das chromatographische Bett:
Kleinere Moleküle,
die in unterschiedlichem Ausmaß in
Abhängigkeit
von ihrer Größe und Form
in die Gelkügelchen
gelangen, werden bei ihrer Passage durch das Bett zurückgehalten.
Moleküle
werden daher im allgemeinen in der Reihenfolge einer abnehmenden
molekularen Größe eluiert.
Viren eluieren wegen ihrer großen
Größe im Allgemeinen
in dem Durchflussvolumen ("void
volume"). Beispielsweise haben
Adenoviren einen Durchmesser von ungefähr 80 nm. Für die Größenausschlußchromatographie von Adenoviren
geeignete Medien sind die Harze G6000PWXL (TosoHaas), SB-806 (Alltech),
SEPHACRYLRTM S-400 HR, SEPHADEX G-200, SEPHARO-SERTM CL-2B,
SUPERDEXRTM 200 in Präparationsgüte, SUPEROSERTM 6
in Präparationsgüte (Pharmacia),
TSK 6000PWXL (Bodman) und UL-TRAHYDROGEL
2000 (Waters).
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Die "Größenausschluß"-Chromatographie,
wie sie hier verwendet wird, soll eine Gelfiltrationschromatographie
einschlie ßen.
Das unter dem Handelsnamen "SUPERDEXRTM 200" verkaufte
Medium ist ein besonders bevorzugtes Größenausschluß-Medium; siehe den Pharmacia-Katalog
von 1996, Seiten 338–339,
Codenr. 17-1043-01 (lose) oder 17-1069-01 oder 17-1071-01 (vorgepackte
Säulen).
Da eine Gruppentrennung der Viren von Unreinheiten mit niedrigerem
Molekulargewicht erreicht wird, kann das Ladevolumen der Ausgangsmaterialien
aus dem Anionenaustausch-Pool verhältnismäßig groß sein, zum Beispiel bis zu
20 %, bevorzugter 15 % des Bettvolumens.
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Beispielhafte
Materialien für
die Ausführung
der Anionenaustausch- und Größenausschlußchromatographieschritte
der vorliegenden Erfindung werden in Tabelle I bereitgestellt. Beispielhafte
Variablen und Kontrollen werden in den Tabellen II und III bereitgestellt. Tabelle
2: Beispielhafte Materialien, die in der Anionenaustausch- und Größenausschlußchromatographie
verwendet werden
Tabelle
II: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsvariablen für die Anionenaustauschchromatographie
Tabelle
III: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsvariablen für die Größenausschlußchromatographie
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird das Virus aus dem Anionenaustausch-Pool auf eine
Größenausschlußsäule geladen.
In einigen Ausführungsformen
wird die Säule
mit einem Salzgradienten bereitgestellt, dessen Ionenstärke von
der Spitze zum Boden der Säule
hin abnimmt. Nach dem Beladen wandert das Virus durch den Salzgradienten
abwärts
(da das Virus bevorzugt durch das Harz nicht adsorbiert wird) und
die sanfte Veränderung
der Ionenstärke
verhindert Schaden an dem Virus. Nach Durchlaufen („overtaking") des Salzgradienten
wird das Virus in einen Niedrigsalz (zum Beispiel 0–200 mM
NaCl)-Puffer eluiert. Solche Niedrigsalz-Puffer schließen Formulierungen
für Langzeitlagerung
oder die Verabreichung an Patienten ein, sind aber nicht auf diese
beschränkt.
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In
einigen Ausführungsformen
wird Glycerin zu den chromatographischen Puffern, wie beispielsweise dem
Eluierungspuffer, oder zu den vereinten Fraktionen, die das Virus
enthalten, zugegeben. Üblicherweise liegt
das Glycerin in einer Endkonzentration von 5–20 %, noch üblicher
von 10 % vor. Folglich liegt in einigen Ausführungsformen Glycerin in allen
Lösungen
während
des gesamten Verfahrens vor. In weiteren Ausführungsformen können andere
Hilfsstoffe, wie beispielsweise ungefähr 2–16 % Saccharose anstelle des
Glycerins verwendet werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Größenausschlußchromatographiesäule mit
einem Puffer bei niedriger Salzkonzentration, zum Beispiel ungefähr 100 bis
150 mM, insbesondere ungefähr
130 mM NaCl äquilibriert.
Kurz vor Beladen mit der Beschickung wird ein Salzgradient von einer
niedrigen Salzkonzentration (ungefähr 130 mM NaCl) bis zur der
höheren
Salzkonzentration der Beschickung (zum Beispiel 400 bis 450 mM NaCl,
insbesondere ungefähr
420 mM NaCl), der einer mittleren Fraktion des Bettvolumens, zum
Beispiel 10 bis 20 %, bevorzugt ungefähr 15 % entspricht, geladen.
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Ein
einfacher Test wird durchgeführt,
um die Qualität
des DEAE-FractogelRTM-Pools zu bestimmen, und
um nachfolgend zu bestimmen, ob ein Salzgradient verwendet werden
sollte. Dieser Test hängt
von der Konstanz des A320/A260-Verhältnisses
des DEAE-FractogelRTM-Pools, der mit einem
geeigneten Puffer von pH 7,5 verdünnt wurde, über einen Zeitraum von einigen
wenigen Minuten (zum Beispiel 5 Minuten) ab. Ein geeigneter Puffer
besteht aus 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 2 mM MgCl2,
2 % Saccharose und keinem NaCl. Wenn das A320/A260-Verhältnis über einen
Zeitraum von 5 Minuten im Wesentlichen konstant bleibt (wenn es sich
zum Beispiel nicht um mehr als 0,04 erhöht), dann ist die Probe entweder
für isokratische
Größenausschlußchromatographie
oder Größenausschlußchromatographie
mit einem Salzgradienten geeignet. Wenn sich das Verhältnis von
A320/A260 während des
Zeitraums um mehr als ungefähr
0,04 erhöht,
dann wird dieser DEAE-Fractogel-Pool bevorzugt auf einer Größenausschlußchromatographie
mit einem Salzgradienten durchgeführt, um die Ausbeute zu verbessern.
Die Tabelle IV stellt exemplarische Materialien und Protokolle für die Verwendung
von Grö ßenausschlußchromatographie
mit einem Salzgradienten zur Verfügung.
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Tabelle
IV: Exemplarische Materialien und Protokolle für die Verwendung von Größenausschlußchromatographie
mit einem Salzgradienten
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Das
erfindungsgemäße Aufreinigungsverfahren
ist für
ein Hochskalieren (oder ein Herabskalieren) und für großtechnische
Sicherheitsbehälter
geeignet. Geeignete Verfahren und im Fachgebiet gut bekannte Richtlinien
können
verwendet und befolgt werden, um das Virus zu kontrollieren und
um biologisch riskante Situationen ("biohazardous situations") zu vermeiden: siehe
zum Beispiel "Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories", 3. Auflage, herausgegeben von Richman
und McKinney, US-Department of Health and Human Services, veröffentlicht
durch das Center for Disease Control und das National Institute
of Health, Washington, DC, US Government Printing Office, Mai 1993.
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Die
durch die erfindungsgemäßen Verfahren
aufgereinigten Adenoviren sind bevorzugt rekombinante Adenoviren,
können
jedoch klinische Isolate, attenuierte Impfstoffstämme und
so weiter einschließen.
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Folglich
ist beispielsweise ACN53, das in der PCT-Patentanmeldung Nr. WO 95/11984 offenbart
ist, ein beispielhaftes rekombinantes Adenovirus, das durch das
erfindungsgemäße Verfahren
auf gereinigt werden kann.
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In
dem ersten Schritt wird der ACN53-adenovirale Vektor durch Anionenaustauschchromatographie auf
einer DEAE-Säule
aufgereinigt. Dafür
wird das Virus üblicherweise
in 293-Nierenzellen
vermehrt, geerntet und einer Konzentration und Ultrafiltration unterzogen.
Das Konzentrat wird gefroren und bis zur Verwendung bei ungefähr –20 °C gelagert.
Gefrorenes Konzentrat wird aufgetaut, durch Filtration durch einen
Filter von 0,45 μm
geklärt,
die Leitfähigkeit
der Zubereitung auf ungefähr
250–360
mM NaCl eingestellt und einer DEAE-Chromatographie unterzogen. Die
in der Chromatographie verwendeten Lösungen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
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In
dem zweiten Schritt wird der ACN53-adenovirale Vektor durch Größenausschlußchromatographie auf
einer SuperdexRTM-200-Säule
aufgereinigt. Ausgewählte
Fraktionen, die Virus enthalten, werden über A260 oder
A280 identifiziert und vereint. Die vereinten
Fraktionen stellen die aufgereinigte Hauptmasse des ACN53-adenoviralen
Vektors dar, die dann durch einen Filter von 0,2 μm steril
filtriert und bei ungefähr –20 °C gelagert
wird.
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Das
Virus in dem DEAE-FractogelRTM-Pool kann
wegen des Vorliegens einer hohen Salzkonzentration (ungefähr 420 mM
NaCl) instabil sein. Es wird bevorzugt unmittelbar weiterverarbeitet oder
für nicht
mehr als ungefähr
24 Stunden bei 4–12 °C gelagert.
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Die
Fraktionen des Elutionsprofils, die den ACN53-adenoviralen Vektorpeak,
wie durch A260 oder A280 bestimmt
wurde, aufweisen, werden für
die Weiterverarbeitung vereint. Der Größenausschluß-Pool wird durch einen Filter
von 0,2 μm
filtriert. Dieses Filtrat, die endaufgereinigte Hauptmenge des ACN53-adenoviralen
Vektors wird dann in sterile Plastikflaschen (zum Beispiel Teflon) überführt und
bei ungefähr –20 °C gelagert.
Die prozessinternen Kontrollen für
diesen Schritt werden in Tabelle III aufgelistet.
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Die
Zunahme der Reinheit des ACN53-adenoviralen Vektors bei jedem Schritt
des Aufreinigungsverfahrens kann mittels Resource-HPLC verfolgt
werden (siehe Huyghe et al., Human Gene Therapy, Band 6 (November
1995), Seiten 1403–1416
auf S. 1405). Die Qualität
des Virus in dem ersten und dem zweiten chromatographischen Pool
wird ebenfalls durch spektroskopische Verfahren überwacht. Das charakteristische
Verhältnis
von A260/A280 beträgt 1,23–1,31:1
für das
endaufgereinigte Virus. Die Lichtstreuung, die von dem hohen Molekulargewicht
des Virus herrührt,
wird aus dem Verhältnis
von A320/A260 nm
abgeleitet und wird ebenfalls verwendet, um die chromatographischen
Pools zu überwachen.
Auf gereinigte, freie Viruspartikel zeigen ein Lichtstreuungsverhältnis von
ungefähr
0,22–0,30:1.
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Die
folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden
Erfindung. Die ausgewählten Vektoren
und Wirte und andere Materialien, die Kontzentration der Reagenzien,
die Temperaturen und die Werte von anderen Variablen dienen nur
der Veranschaulichung, wie die vorliegende Erfindung ausgeführt werden
kann, und sollen nicht als ihre Grenzen aufgefaßt werden.
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EXPERIMENTELLE BEISPIELE
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A. Aufreinigung von Adenovirus
im kleinen Maßstab
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(1) Anionenaustauschchromatographie
(DEAE-Fractogel)
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Eine
DEAE-EMD FractogelRTM 650 M-Säule (E.
Merck) von 5 × 18
cm wurde mit 5 Bettvolumen (BV) von 0,5 M NaOH/1 M NaCl gefolgt
von 6 BV 0,1 M HCl/1 M NaCl und dann mit 20 BV Puffer A (265 mM
NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % (w/v) Saccharose,
50 mM Natriumphosphat bei pH 7,5) mit einer linearen Flußrate von
2 cm/min prä-äquilibriert.
Die Beschickung für
diese Säule
wurde aus 2 Litern gefrorener, grober Viruslösung erhalten, die aufgetaut
wurde, durch eine Membran von 0,45 μ mikrofiltriert wurde und mit
einer kleinen Menge 4 M NaCl auf eine Leitfähigkeit eingestellt wurde,
die der von Puffer A entsprach. Die Beschickung wurde mit einer
linearen Flussrate von 1 cm/min auf die Säule geladen. Die Säule wurde
mit 4 BV von Puffer A gewaschen. Die Säule wurde dann mit 8 BV von
94 Puffer A/6 % Puffer B (identisch mit Puffer A abgesehen davon, dass
das NaCl 600 mM ausmachte) gewaschen. Die Säule wurde mit 30 BV eines linearen
Gradienten von 94 % Puffer A/6 % Puffer B hin zu 100 % Puffer B
eluiert. Die Fraktionen, die reichlich Virus enthalten, wurden vereint,
um die Beschickung ("DEAE-Pool") für die folgende
Säule zu
bilden.
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(2) Isokratische Größenausschlußchromatographie
(SuperdexRTM-200)
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Die
Größenausschlußchromatographie
wurde auf einer SuperdexRTM-200-Säule (Pharmacia)
von 5 × 73
cm durchgeführt,
die mit 0, 5 BV 0,5 M NaOH, 1 BV H2O und
2 BV Puffer C (130 mM NaCl, 2 mM MgCl2,
2 % (w/v) Saccharose, 50 mM Natriumphosphat bei pH 7,5) mit einer
linearen Flußrate
von 0,6 cm/min prääquilibriert
wurde. Die Beschickung, die aus 220 ml des DEAE- Pools bestand, wurde auf die Säule geladen.
Das ACN53 wurde mit Puffer C mit einer linearen Flußrate von
0,6 cm/min eluiert. Die Fraktionen, die reichlich Virus enthalten,
wurden vereint, durch einen Mikrofilter von 0,2 μ gegeben und gelagert. Das Viruskonzentrat
kann bei niedriger Temperatur, zum Beispiel bei 0–10 °C, bevorzugt
bei ungefähr
4 °C, oder
wenn das Volumen gering, zum Beispiel weniger als ungefähr 50 ml
beträgt,
gefroren bei –80 °C gelagert
werden.
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(3) Größenausschlußchromatographie mit einem
Salzgradienten
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(a) Salzverdünnungstest
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Der
DEAE-FractogelRTM-Pool (0,4 ml) wurde mit
einem Puffer bestehend aus 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 2 Saccharose und keinem NaCl (0,8 ml)
gemischt und sofort in eine Quarzküvette gegeben und die Absorption
bei 260 und bei 320 nm in einem W-Spektrometer gemessen, das mit
einem Photodiodenarray ausgestattet war Ohne die Probe aus der Küvette zu
entnehmen, wurde die Ablesung über
einen Zeitraum von 5 Minuten in Intervalen von 1–2 Minuten wiederholt. Wenn
das Verhältnis
von A320/A260 während des
Zeitraums im Wesentlichen konstant war, dann war dieser DEAE-FractogelRTM-Pool entweder für isokratische Größenausschlußchromatographie
oder für
Größenausschlußchromatographie
mit einem Salzgradienten geeignet. Wenn sich das Verhältnis von
A320/A260 während dieses
Zeitraums um mehr als ungefähr
4% erhöhte,
dann erforderte dieser DEAE-FractogelRTM-Pool eine Größenausschlußchromatographie mit einem Salzgradienten,
um die Ausbeute zu verbessern.
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(b) Größenausschlußchromatographie mit einem
Salzgradienten
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Eine
Chromatographie mit einem Salzgradienten wurde auf einer SuperdexRTM-200-Säule
von 2,6 cm × 60
cm durchgeführt,
die mit 0,5 BV 0,5 M NaOH, 1 BV H2O, und
2 BV Puffer C (20 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 130 mM NaCl, 2 mM
MgCl2, 2 % Saccharose) prä-äquilibriert
wurde. Unmittelbar vor dem Beladen mit dem DEAE-Pool wurde ein linearer
Gradient von 100 % Puffer C hin zu 100 % Puffer D (20 mM Natriumphosphat, pH
8,0, 420 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 2 % Saccharose)
von 0,15 BV (48ml) an die SuperdexRTM-200-Säule angelegt.
Die Beschickung, die aus 20 ml eines DEAE-Pools bestand, die den
oben beschriebenen Test nicht bestanden hatte, wurde dann auf die
Säule geladen
und mit Puffer D mit einer linearen Flußrate von 0,6 cm/min eluiert.
Fraktionen mit reichlich Virus, die in oder nahe dem Durchflussvolumen
eluierten, wurden vereint, durch einen sterilisierenden Filter gegeben
und bei –80 °C gelagert.
Die Ausbeute bei diesen Schritt betrug 60 % und das A230/A260-Verhältnis
betrug 0,24:1.
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B. Aufreinigung von Adenovirus
im großen
Maßstab
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(1) Anionenaustauschchromatographie
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Das
gefrorene Virenkonzentrat aus dem Fermentations- und Rückgewinnungsschritt
wurde aufgetaut und durch eine hydrophile Durapore-Membran von 0,45 μm in eine
Millipore 10° Opticap-Kapsel filtriert.
Das Filtrat wurde in einem geschlossenen Tank gesammelt. Um Verluste
zu minimieren, wurde die Filterkartusche mit ungefähr 1,5 1
von Puffer J-1 (50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 265 mM Natriumchlorid,
2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose), der mit 5,4 % (w/w)
von Lösung
J-3 (4 M Natriumchlorid) ergänzt
war, gewaschen. Die Salzkonzentration des Filtrats wurde durch Zugabe
von 5,4 % (w/v) von Lösung
J-3 (4 M Natriumchlorid) eingestellt. Diese Beschickungslösung wurde
dann auf eine Fractogel
RTM-IMD DEAE-650
M-Säule (7
cm Durchmesser, 14,8 cm Betthöhe,
570 ml Bettvolumen) gegeben, die mit Puffer J-1 (50 mM Natriumphosphat
pH 7,5, 265 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v)
Saccharose) prä-äquilibriert
war. Das Adenovirus bindet an das Anionenaustauschharz, während der
Großteil
des Mediums und der Wirtszellverunreinigungen in dem verbrauchten
Medium durch die Säule
passiert. Die Säule
wurde anfänglich
mit 4 Bettvolumen von Puffer J-1 gewaschen, gefolgt von einer zweiten
isokratischen Waschung mit 8 Bettvolumen von 94 % Puffer J-1 und
6 % Puffer J-2 (50 mM Natriumphosphat pH 7,5, 600 mM Natriumchlorid,
2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v) Saccharose), um zusätzliche
Verunreinigungen zu entfernen. Das Virus wurde mit 30 Bettvolumen
eines linearen Gradienten von 6 % bis 100 % Puffer J-2 aus der Säule eluiert.
Der Adenoviruspeak des Elutionsprofils, wie er mittels A
280 bestimmt wurde, wurde gesammelt und für die weitere
Verarbeitung vereint. Die prozessinternen Kontrollen und Betriebsparameter
für den
Anionenaustauschchromatographie-Schritt
sind in Tabelle V zusammengefaßt. Tabelle
V: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsparameter für die Anionenaustauschchromatographie
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(2) Größenausschlußchromatographie
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Der
DEAE-Pool wurde sofort auf eine Superdex
RTM-200-Größenausschlußsäule (14
cm Durchmesser, 77 cm Betthöhe,
11,9 l Bettvolumen) gegeben, die mit Puffer K-1 (20 mM Natriumphosphat
pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 % (w/v)
Saccharose) prä-äquilibriert
worden ist. Die Säule
wurde mit Puffer K-1 eluiert. Der Adenoviruspeak des Elutionsprofils,
wie es mittels A
280 bestimmt wurde, wurde
gesammelt und vereint. Dieser Chromatographieschritt erzielte einen
Pufferwechsel und die Trennung von Verunreinigungen mit niedrigem
Molekulargewicht von dem Adenovirusprodukt. Die prozessinternen
Kontrollen und Betriebsparameter für den Größenausschlußchromatographieschritt sind
in Tabelle VI zusammengefaßt. Tabelle
VI: Prozessinterne Kontroll- und Betriebsparameter für die Größenausschlußchromatographie
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(3) Letzte 0,2 μm-Filtration
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Der
SuperdexRTM-200-Pool wurde bei 2 bis 15 °C durch eine
hydrophile Durapore-Membran von 0,2 μm (Stericup, Millipore) filtriert.
Dieser Schritt wurde unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitszelle ("biosafety cabinet") durchgeführt. Da
verschiedene Filtrationsgeräte
verwendet wurden, wurden die einzelnen Filtrate vereint und dann
in autoklavierte Behälter
aliquotiert. Die Behälter
mit der Hauptmasse der Arzneimittelsubstanz in Lösung wurden in einem Trockeneis/Ethanol-Bad
gefroren und bei ungefähr –20 °C gelagert.
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Modifikationen
und Variationen dieser Erfindung werden für die Fachleute offensichtlich
sein. Die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen werden nur als
Beispiel dargestellt und die Erfindung soll nicht als durch sie
eingeschränkt
ausgelegt werden.