JP2005318898A - ウイルスの精製方法 - Google Patents
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- C12N2710/10011—Adenoviridae
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Abstract
【解決手段】 ウイルス調製物の精製方法であって、以下:a)該ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程;およびb)工程Aのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程を包含する、方法。
【選択図】 なし
Description
ウイルスの培養および精製は、遺伝子治療およびワクチン開発のためにますます重要になってきている。Huygheら(Human Gene Therapy 6: 1403−1416 (1995))は、組換えアデノウイルスの精製のためのいくつかの方法(これにはアニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、固定化亜鉛アフィニティークロマトグラフィー、超遠心が包含される)の比較を開示し、組換えアデノウイルスの精製のための好ましいプロセスは、細胞溶解物をヌクレアーゼで処理し、次いでメンブレンフィルターを通して濾過し、次いでDEAEクロマトグラフィーにかけ、次いで亜鉛アフィニティークロマトグラフィーにかけることであると結論している。
a)このウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでこのウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程;および
b)工程Aのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでこのウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程
を包含する、方法。
(項目2)上記ウイルス調製物が細胞溶解物である、項目1に記載の方法。
(項目3)上記細胞溶解物が工程aの前に濾過される、項目2に記載の方法。
(項目4)上記ウイルスが組換えアデノウイルスである、項目1に記載の方法。
(項目5)上記サイズ排除媒体が、イオン強度がカラムの頂部から底部に向かって減少する塩勾配となるように調製されたカラムの中に提供され、このカラムの頂部が工程aの生成物のイオン強度と実質的に等しいイオン強度を有する緩衝液を有する、項目1に記載の方法。
(項目6)上記ウイルスがACN53である、項目1に記載の方法。
(項目7)上記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、ウイルス調製物を適用する前に徹底的に洗浄される、項目1に記載の方法。
(項目8)項目1の方法で精製されるウイルス。
本発明の1つの局面は、ウイルス調製物の精製方法であって:
a)ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程;および
b)工程aのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程を包含する、方法である。ウイルス調製物は細胞溶解物であり得、これは工程Aの前に濾過され得る。ウイルスは組換えアデノウイルス、例えばACN53(WO 95/11984に開示されている)であり得る。
本発明は、ウイルスの精製に関し、このウイルスは例えば、細胞宿主中で培養され、そして次に細胞の溶解および細胞細片(debris)からの分離によって遊離されることによって生成されたものであり得る。用語「ウイルス」は、野生型、変異体、および組換えウイルスを包含し、特に異種核酸配列の発現のためのアデノウイルスベクターである。
(A.アデノウイルスの小規模精製)
(1) アニオン交換クロマトグラフィー(DEAE−Fractogel)
DEAE−EMD Fractogel 650Mカラム(E.Merck)(5×18cm)を5ベッド容量(B.V.)の0.5M NaOH/1M NaCl、次いで6B.V.の0.1M HCl/1M NaCl、そして次に20B.V.の緩衝液A(265mM NaCl、2mM MgCl2、2%(w/v)ショ糖、50mMリン酸ナトリウム、pH7.5)で、線形流速2cm/分で予備平衡化した。このカラムのフィードは2リットルの凍結粗ウイルス溶液から誘導され、これを解凍し、0.45μメンブレンを通して微量濾過し、そして小容量の4M NaClで調節して伝導度が緩衝液Aのものと等しくなるようにした。このフィードを線形流速1cm/分でカラムにロードした。カラムを4B.V.の緩衝液Aで洗浄した。次にカラムを8B.V.の94%緩衝液A/6%緩衝液B(NaClを600mMとしたこと以外は緩衝液Aと同じ)で洗浄した。カラムを30B.V.の、94%緩衝液A/6%緩衝液Bから100%緩衝液Bまでの線形勾配で溶離した。実質的なウイルスを含む画分をプールし、次のカラムのためのフィード(「DEAEプール」)を形成した。
サイズ排除クロマトグラフィーを、0.5B.V.の0.5M NaOH、1B.V.のH2O、および2B.V.の緩衝液C(130mMのNaCl、2mMのMgCl2、2%(w/v)ショ糖、50mMリン酸ナトリウム、pH7.5)で線形流速0.6cm/分で予備平衡化されたSuperdex−200カラム(Pharmacia)、5×73 cmで行った。フィードは220mlのDEAEプールから構成され、これをカラムにロードした。ACN53を緩衝液Cで線形流速0.6cm/分で溶離した。実質的なウイルスを含む画分をプールし、0.2μのミクロフィルターを通し、そして貯蔵した。ウイルス濃縮物は低温(例えば0〜10℃、好ましくは約4℃)で貯蔵され得、あるいは容量が小さい(例えば、約50ml未満)場合、−80℃で凍結され得る。
(a). 塩希釈試験
DEAE−Fractogelプール(0.4ml)を50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、2mM MgCl2、2%ショ糖から構成され、NaClを含まない緩衝液(0.8ml)と混合し、そしてすぐに石英キュベット中に入れ、そして260nmおよび320nmの吸光度を光ダイオードアレイを備えたUV分光器で測定した。試料をキュベットから取り出さずに、読みとりを1〜2分間隔で5分間にわたって繰り返した。A320/A260の比がこの期間の間実質的に一定であれば、このDEAE−Fractogelプールはアイソクラチックまたは塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーのいずれかに適する。A320/A260の比がこの期間の間に約4%を越えて増加する場合、DEAE−Fractogelプールは、収率を上げるために、塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーを必要とする。
塩勾配クロマトグラフィーを、0.5B.V.の0.5M NaOH、1B.V.のH2O、および2B.V.の緩衝液C(20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、130mM NaCl、2mM、MgCl2、2%ショ糖)で予備平衡化したSuperdex−200カラム(2.6 cm×60 cm)を用いて行った。DEAEプールをロードする直前に、100%緩衝液Cから100%緩衝液D(20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、420mM NaCl、2mM、MgCl2、2%ショ糖)の0.15B.V.(48ml)の線形勾配をSuperdex−200カラムに付与した。上記試験に不合格の20mlのDEAEプールからなるフィードを次にカラムにロードし、そして緩衝液Dで線形流速0.6cm/分で溶離した。空隙容積内またはその近傍で溶離した、実質的なウイルスを含む画分をプールし、滅菌フィルターを通し、そして−80℃で貯蔵した。この工程の収率は60%であり、そしてA320/A260比は0.24:1であった。
(1) アニオン交換クロマトグラフィー
発酵および回収工程からの凍結ウイルス濃縮物を解凍し、そしてMillipore 10” Opticapカプセル中の0.45μm親水性Duraporeメンブレンを通して濾過した。濾液を閉鎖タンク中に採取した。損失を最小限とするために、フィルターカートリッジを、約1.5Lの緩衝液J−1(50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、265mM塩化ナトリウム、2mM塩化マグネシウム、2%(w/v)ショ糖)に5.4%(w/w)の溶液J−3(4M塩化ナトリウム)を補充したもので洗浄した。濾液の塩濃度を5.4%(w/v)の溶液J−3(4M塩化ナトリウム)の添加により調節した。次にこのフィード溶液を、緩衝液J−1(50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、265mM塩化ナトリウム、2mM塩化マグネシウム、2%(w/v)ショ糖)で予備平衡化したFractogel EMD DEAE−650M カラム(直径7cm、ベッド高さ14.8cm、ベッド容量570ml)に付した。アデノウイルスはアニオン交換樹脂に結合し、他方、培地および宿主細胞の不純物の大部分はこの費やされたチャージの間にカラムを通過する。カラムを最初に4ベッド容量の緩衝液J−1で洗浄し、次に第2のアイソクラチック洗浄を8ベッド容量の94%緩衝液J−1および6%緩衝液J−2(50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、600mM塩化ナトリウム、2mM塩化マグネシウム、2%(w/v)ショ糖)で行い、さらなる不純物を除去した。ウイルスはカラムから30ベッド容量の6%〜100%緩衝液J−2の線形勾配で溶離した。A280で決定される溶離プロフィールのアデノウイルスピークを採取し、そしてさらなるプロセシングのためにプールした。アニオン交換クロマトグラフィー工程のインプロセス制御および操作パラメータを表Vにまとめる。
DEAEプールをすぐに、緩衝液K−1(20mMリン酸ナトリウム(pH8.0)、100mM塩化ナトリウム、2mM塩化マグネシウム、2%(w/v)ショ糖)で予備平衡化したSuperdex−200サイズ排除カラム(直径14 cm、ベッド高さ77 cm、ベッド容量11.9 L)に付した。カラムを緩衝液K−1で溶離した。A280で決定される溶離プロフィールのアデノウイルスピークを採取し、そしてプールした。このクロマトグラフィー工程により緩衝液の交換およびアデノウイルス生成物からの低分子量不純物の分離が達成される。サイズ排除クロマトグラフィー工程のためのインプロセス制御および操作パラメータを表VIにまとめる。
Superdex 200プールを、2〜15℃で0.2μm親水性Duraporeメンブレン(Stericup、Milliopore)を通して濾過した。この工程は、生物安全キャビネット(biosafety cabinet)中で滅菌条件下で行った。いくつかのの濾過装置を使用したので、個別の濾液をプールし、そして次にオートクレーブにかけた容器中にアリコートを採った。バルクの薬物物質の溶液の容器をドライアイス/エタノール浴中で凍結し、そして約−20℃で貯蔵した。
Claims (1)
- ウイルス調製物の精製方法であって:
a)該ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程;および
b)工程Aのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程
を包含する、方法。
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