ES2283032T3 - Metodos para purificar virus. - Google Patents
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- C12N2710/10051—Methods of production or purification of viral material
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA LA PURIFICACION DE UN VIRUS EN UN MEDIO ACUOSO.
Description
Métodos para purificar virus.
El cultivo y la purificación de virus se han
hecho crecientemente importantes para el desarrollo de la terapia
con genes y vacunas. Huyghe et al. (Human Gene Therapy
6: 1403-1416 (1995)) describen una comparación de
diversos métodos para la purificación de adenovirus recombinantes,
incluyendo cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía
de exclusión por tamaño molecular, cromatografía de afinidad con
zinc inmovilizado y ultracentrifugación, concluyendo que el
procedimiento preferido para la purificación de una adenovirus
recombinante es el tratamiento con una nucleasa de un lisado
celular, seguido por filtración a través de filtros de membrana,
seguido por cromatografía DEAE, y finalmente por cromatografía de
afinidad con zinc.
El documento WO 97/08298 se refiere a un
procedimiento para purificar adenovirus y virus
adeno-asociados.
El documento WO 98/00524 se refiere a un método
para producir adenovirus recombinantes.
La patente EP 0593339 A se refiere a métodos
para preparar antígenos de la hepatitis B y vacunas.
La patente EP 0522291 A se refiere a un
procedimiento para purificar virus de la hepatitis B.
En vista de la necesidad continuamente creciente
de virus purificados, por ejemplo para su uso como vectores virales
para la terapia con genes, serían sumamente deseados métodos
mejorados de purificación.
Un aspecto de la invención es un método para
purificar adenovirus a partir de una preparación de virus, que
comprende las etapas sucesivas de:
- a)
- someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio de aniones, en donde el adenovirus se eluye desde un medio cromatográfico de intercambio de aniones; y
- b)
- someter el eluato de la etapa a) que contiene el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño molecular, en donde el adenovirus se eluye desde un medio cromatográfico de exclusión por tamaño molecular, en donde el medio cromatográfico de exclusión por tamaño molecular se selecciona del grupo que consiste en G6000PWXL, SB-806, SEPHACRYL^{RTM} S-400 HR, SEPHADEX G-200, SEPHAROSE^{RTM} CL-28, SUPERDEX^{RTM} 200 calidad preparativa, SUPEROSE^{RTM} 6 calidad preparativa, TSK 6000PWXL, y ULTRAHYDROGEL 200. La preparación de virus puede ser un lisado celular, que se puede filtrar antes de la etapa a). El adenovirus puede ser un adenovirus recombinante, tal como ACN53 (descrito en el documento WO 95/11984). (La abreviatura RTM significa Registered Trade Mark = marca comercial registrada).
El medio de intercambio de aniones puede
comprender grupos dietilaminometilo en una cadena principal
reticulada de agarosa, poliacrilamida o poliestireno, tal como
FRACTOGEL^{TM}-DEAE. El medio de exclusión por
tamaño molecular puede comprender un polisacárido reticulado y
puede ser un material compuesto de agarosa y dextrano reticulado.
Un medio ilustrativo para la cromatografía de exclusión por tamaño
molecular es Superdex^{RTM}-200. El medio
cromatográfico de intercambio de aniones se puede lavar
exhaustivamente antes de la aplicación de la preparación de
virus.
El medio de exclusión por tamaño molecular puede
estar dispuesto en una columna preparada con un gradiente de sal
decreciente en fuerza iónica desde la parte superior del medio
contenido en la columna hasta la parte inferior, teniendo la parte
superior de la columna un tampón que tiene una fuerza iónica
sustancialmente idéntica a la del producto de la etapa a).
La invención también se refiere a un virus
purificado por el método de la reivindicación 1.
La presente invención se refiere a la
purificación de un virus, concretamente a un adenovirus, que puede
haber sido producido por ejemplo por cultivo en un hospedante
celular y luego liberado por lisis de las células y separación de
los residuos celulares. El término "virus" incluye virus de
tipo silvestre, mutantes y recombinantes, especialmente vectores
adenovirales para la expresión de secuencias heterólogas de ácidos
nucleicos.
Las realizaciones de la invención forman parte
de la estrategia general de la cromatografía de adsorción de una
preparación de virus seguida por la cromatografía de exclusión por
tamaño molecular. Típicamente, se lleva a cabo la cromatografía de
intercambio de aniones sobre una resina de intercambio de aniones
que contiene grupos básicos en una cadena lateral unida a una
cadena principal macromolecular. Los grupos básicos son
preferiblemente grupos amino sustituidos, en particular grupos
(dialquilo inferior)-aminoalquilo en donde cada
grupo alquilo inferior tiene de 1 a 4, preferiblemente 2, átomos de
carbono, y cada grupo alquilo tiene de 2 a 4, preferiblemente 2,
átomos de carbono. La cadena principal base puede estar compuesta de
sílice o una matriz orgánica, por ejemplo agarosa, celulosa,
poliacrilamida o poliestireno reticulados; se prefiere usar
particularmente una resina de intercambio de aniones consistente en
grupos dimetilaminoetilo (grupos DMAE) o especialmente en grupos
dietilaminoetilo (grupos DEAE) en una cadena principal de agarosa
reticulada; las resinas especialmente preferidas de tipo DEAE son
las que se venden con el nombre comercial
"DEAE-Fractogel", por ejemplo
"FRACTOGEL^{TM} EMD DEAE-650M" y
FRACTOGEL^{TM} AE. En algunas realizaciones de la invención,
la"cadena principal" puede ser un soporte sólido, tal como una
perla o bolita.
La resina de intercambio de aniones se lava de
preferencia exhaustivamente antes de cargar la preparación de virus
para eliminar los conservantes, tales como azida de sodio y etanol,
y otros materiales extraños, lavando la columna con aproximadamente
5 a 10 volúmenes de columna de una solución básica, tal como NaOH
50 mM/NaCl 1 M, seguido por aproximadamente 5 a 10 volúmenes de
columna de una solución neutralizadora, tal como HCl a 50 mM/NaCl 1
M, seguido por aproximadamente 5 a 30 volúmenes de tampones de carga
y/o elución. Opcionalmente, la columna se lava con un tampón de
menor concentración de sal que el tampón de carga y/o elución antes
de lavar con tampón de carga y/o elución.
Típicamente, se carga una preparación de virus,
tal como un lisado celular, sobre un medio cromatográfico en una
solución tamponada a aproximadamente pH 7,0-8,5, con
una concentración de sal de aproximadamente 100-360
mM. La sal es típicamente NaCl. En algunas realizaciones, se usan
otros tampones, tales como fosfato o Tris. Se pueden eluir los
contaminantes lavando preferentemente la columna con un tampón en
una concentración de sal de aproximadamente 250-380
mM. Luego se puede eluir el adenovirus con una solución con una
concentración de sal de aproximadamente 360-600 mM.
La sal es típicamente NaCl. Típicamente se usan de aproximadamente
de 5 a 50, con más preferencia aproximadamente 30 volúmenes de
tampón, para eluir el virus. Se recogen, se reúnen y se analizan
las fracciones en cuanto a la presencia de virus, midiendo las
fracciones de pico A_{260} o A_{280} y reuniendo las fracciones
de los picos; alternativamente, se puede reunir el eluyente que
contiene el pico A_{260} o A_{280} en una fracción única. Esta
fracción única A_{260} o A_{280} o las fracciones reunidas en
el eluyente que contiene el virus se denominan en la presente
"mezcla de intercambio de aniones".
En la etapa de la cromatografía de exclusión por
tamaño molecular, se separan las moléculas de acuerdo con al tamaño
molecular en un lecho cargado de un medio poroso inerte,
especialmente un medio de gel inerte, el cual es preferiblemente un
compuesto mixto de polisacáridos reticulados, por ejemplo, agarosa y
dextrano reticulados en forma de perlas o bolitas esféricas. Las
moléculas más grandes que los poros más grandes de las bolitas de
gel hinchadas no entran en las bolitas de gel y por lo tanto se
mueven más rápidamente a través del lecho cromatográfico. Las
moléculas más pequeñas, que entran en las bolitas de gel en grado
variable dependiendo de su tamaño y forma son retardadas en su paso
a través del lecho. Se eluyen así las moléculas por lo general en
el orden del tamaño molecular decreciente. Los virus, a causa de su
tamaño grande, se eluyen generalmente en el volumen vacío. Por
ejemplo, los adenovirus tienen un diámetro de aproximadamente 80 nm.
Los medios apropiados para la cromatografía de exclusión por tamaño
molecular de las adenovirus incluyen, resinas tales como G6000PWXL
(TosoHass); SB-806 (Altech); Sephacryl^{RTM} S400
HR, Sephadex G-200, Sepharose CL-2B;
Superdex^{RTM} calidad preparativa 200, Superose calidad
preparativa 6 (Pharmacia); TSK 6000PWXL (Bodman) y Ultrahydrogel
2000 (Waters).
La cromatografía de "exclusión por tamaño
molecular" como se usa en la presente memoria pretende incluir la
cromatografía de filtración por gel. Un medio para cromatografía de
exclusión por tamaño molecular particularmente preferido es el que
se vende con el nombre comercial "Superdex^{RTM} 200"; véase
el Pharmacia Catalog, 1996, pp. 338-339. nº de
código 17-1043-01 (a granel) o
17-1069-01 o
17-1071-01 (columnas previamente
rellenas). Puesto que se logra una separación de grupos de virus de
las impurezas de peso molecular inferior, el volumen de carga de
los materiales de partida de la mezcla de intercambio de aniones
puede ser relativamente grande, por ejemplo hasta 20%, más
preferiblemente 15% del volumen del lecho.
En la Tabla 1 se detallan los materiales
ilustrativos para la práctica de las etapas cromatográficas de
intercambio de aniones y de exclusión por tamaño molecular de la
invención. En las Tablas II y III se proporcionan variables y
controles ilustrativos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la invención, se carga el
virus desde la mezcla de intercambio de aniones en una columna de
cromatografía de exclusión por tamaño molecular. En algunas
realizaciones, se prepara la columna con un gradiente de sal que
disminuye la fuerza iónica desde la parte superior hasta la parte
inferior de la columna. Después de cargar, el virus se mueve hacia
abajo a través del gradiente de sal (ya que el virus no es absorbido
preferentemente por la resina) y el cambio suave de fuerza iónica
evita el daño al virus. Después de sobrepasar el gradiente de sal,
se eluye el virus en un tampón de baja concentración de sal (por
ejemplo NaCl a 0-200 mM). Tales tampones de baja
concentración de sal incluyen, pero sin limitación, formulaciones
para conservación a largo plazo o administración a pacientes.
En algunas realizaciones, se añade glicerol a
los tampones cromatográficos, tal como tampón de elución, o las
fracciones reunidas que contienen virus. Típicamente, el glicerol
está presente en una concentración final del 5-20%
más típicamente del 10%. De esta manera, en algunas realizaciones,
el glicerol está presente en todas las soluciones durante todo el
procedimiento. En otras realizaciones, se pueden usar otros
excipientes, tales como sacarosa a aproximadamente
2-16% en lugar de glicerol.
En una realización preferida, se equilibra la
columna de cromatografía de exclusión por tamaño molecular con
tampón de baja concentración de sal, por ejemplo, NaCl
aproximadamente 100 a 150 mM, especialmente a aproximadamente 130
mM. Justo antes de cargar la alimentación, se carga un gradiente de
sal, equivalente a una fracción moderada del volumen de lecho, por
ejemplo al 10 a 20%, de preferencia aproximadamente 15%, de la baja
concentración de sal (NaCl aproximadamente 130 mM) a la más alta
concentración de sal de la alimentación (por ejemplo, NaCl 400 a
450 mM, en especialmente alrededor de 420 mM).
Se realiza un ensayo sencillo para determinar la
calidad de la mezcla de DEAE-Fractogel^{RTM} y por
consiguiente si se debe usar un gradiente de sal. Este ensayo
depende de la constancia de la relación A_{320}/A_{250} de la
mezcla DEAE-Fractogel^{RTM} con un tampón
apropiado a pH 7,5 durante un período de unos cuantos minutos (por
ejemplo, 5 minutos). Un tampón apropiado consiste en fosfato de
sodio 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, sin NaCl. Si
la relación de A_{320}/A_{230} permanece sustancialmente
constante en un período de 5 minutos (por ejemplo, si crece en no
más de 0,04), entonces esa muestra es adecuada para la cromatografía
ya sea isocrática o de exclusión por tamaño molecular con gradiente
de sal. Sí la relación de A_{320}/A_{260} aumenta en más de
aproximadamente 0,04 durante ese período, se realiza la
cromatografía por exclusión de tamaño molecular sobre la mezcla
DEAE-Fractogel preferiblemente con gradiente de sal
para mejorar el rendimiento. La Tabla IV proporciona materiales y
protocolos ilustrativos para el uso de la cromatografía de exclusión
por tamaño molecular con gradiente de sal.
El método de purificación de la presente
invención es adecuado para el aumento (o la reducción) de escala o
la realización a gran escala. Se pueden usar y seguir procedimientos
y directrices adecuados bien conocidos en la técnica para controlar
el virus y evitar situaciones de riesgo biológico: Véase, por
ejemplo, "Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories", 3rd Edition, editado por Richman and
McKinney, U.S. Department of Health and Human Services
publicado por el Center for Disease Control and the Nacional
Institute of Health, Washington, DC, U.S. Govermment Printing
Office, Mayo 1993.
Los adenovirus purificados por el método de la
presente invención son preferiblemente adenovirus recombinantes,
pero pueden incluir aislados clínicos, cepas de vacuna atenuadas,
etc.
De esta manera, por ejemplo, un adenovirus
recombinante ilustrativo que puede ser purificado por el método de
la invención es el ACN53, que se describe en la solicitud de patente
PCT No. W0 95/11984.
En la primera etapa, se purifica el vector
adenoviral ACN53 por cromatografía de intercambio de aniones en una
columna de DEAE. Para esto, se propaga el virus típicamente en
células de riñón 293, se cosecha y se somete a concentración y
ultrafiltración. Se congela y se conserva el concentrado a
aproximadamente -20ºC hasta su uso. Se descongela el concentrado
congelado, se clarifica por filtración a través de un filtro de 0,45
\mum, se ajusta la conductividad de la preparación a
aproximadamente NaCl 250-360 mM y se somete a
cromatografía sobre DEAE. Las soluciones usadas en la cromatografía
aparecen listadas en la Tabla 1.
En la segunda etapa se purifica el vector
adenoviral ACN53 por cromatografía de exclusión por tamaño molecular
en una columna de Superdex^{RTM}-200. Las
fracciones seleccionadas que contienen virus son identificadas por
A_{260} y A_{280} y se reúnen. Las fracciones reunidas contienen
el vector adenoviral ACN53 a granel purificado el cual se filtra
luego en condiciones estériles a través de un filtro de 0,2 \mum y
se conserva a aproximadamente -20ºC.
El virus de la mezcla de la mezcla
DEAE-Fractogel^{RTM} puede ser inestable debido a
la presencia de una alta concentración de sal (aproximadamente NaCl
420 mM). Se trata preferiblemente de inmediato o se conserva a
4-12ºC durante no más de aproximadamente 24
horas.
Se reúnen las fracciones de perfil de elución
que exhibe el pico del vector adenoviral ACN53 determinado por
A_{250} o A_{280} para su tratamiento posterior. Se filtra la
mezcla de fracciones de las fracciones eluídas de la cromatografía
de exclusión por tamaño molecular a través de un filtro de 0,2
\mum. Este filtrado, el vector adenoviral ACN53 a granel
purificado final, se transfiere luego a frascos de plástico
estériles (por ejemplo de Teflon) y se conserva a aproximadamente
-20ºC. Los controles en el proceso para esta etapa aparecen
recogidos en la Tabla III.
Se puede seguir el aumento de pureza del vector
adenoviral ACN53 en cada etapa del método de purificación por HPLC
con un aparato Resource Q (véase Huyghe et al., Human Gene
Therapy, Vol. 6 (noviembre de 1995), pp.
1403-1416 en la página 1405). Se monitoriza también
la calidad del virus en la primera y la segunda mezcla de
fracciones cromatográficas, por métodos espectroscópicos. La
relación característica de A_{260}/A_{230} es
1,23-1,31:1 para el virus purificado final. La
dispersión de luz que resulta del alto peso molecular del virus se
deriva de la relación de A_{320}/A_{350} nm y se usa también
para monitorizar las mezclas de fracciones cromatográficas. Las
partículas de virus libres purificadas exhiben una relación de
dispersión de luz de aproximadamente
0,22-0,30:1.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
presente invención. Los vectores y los hospedantes y otros
materiales seleccionados, la concentración de los reactivos, las
temperaturas y los valores de otras variables son solamente para
ejemplificar cómo se puede llevar a cabo la presente invención y no
se han de considerar limitaciones de la misma.
Se equilibró previamente una columna de
DEAE-EMD Fractogel^{RTM} 650 M (E. Merck) con 5
volúmenes de lecho (abreviadamente en lo sucesivo B.V. por la
expresión inglesa Bed Volume) de NaOH/NaCl 1 M seguido por 6
B.V. de HCl/NaOH 1 M, y luego por 20 B.V. de tampón A (NaCl 265 mM,
MgCl_{2} 2 mM sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM, a pH
7,5) a un caudal lineal de 2 cm/min. La alimentación para esta
columna procedía de 2 litros de solución de virus bruta congelada,
la cual se descongeló, se microfiltró a través de una membrana de
0,45 \mum y se ajustó con un volumen pequeño de NaCl 4 M a una
conductividad igual a la del tampón A. Se cargó la alimentación
sobre la columna a un caudal lineal de 1 cm/min. Se lavó la columna
con 4 B.V. de tampón A. Se lavó luego la columna con 8 B.V. de
tampón A al 94%/ tampón B al 6% (idéntico al tampón A excepto que el
NaCl fue 600 mM). Se eluyó la columna con 30 B.V. de un gradiente
lineal del tampón Al al 94%/tampón B hasta tampón B al 100%. Se
reunieron las fracciones que contenían virus sustancial para formar
la alimentación ("mezcla de DEAE") para la siguiente
columna.
columna.
La cromatografía de exclusión por tamaño
molecular se realizó en una columna
Superdex^{RTM}-200 (Pharmacia), de 5 x 73 cm,
equilibrada previamente con 0,5 B.V. de NaOH 0,5 M, 1 B.V. de
H_{2}O y 2 B.V. de tampón C (NaCl 130 mM, MgCl_{2} 2 mM,
sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM, a pH 7,5) a un caudal
lineal de 0,6 cm/min. La alimentación consistente en 220 ml de
mezcla de DEAE se cargó en la columna. Se eluyó el ACN53 con un
tampón C a un caudal lineal de 0,6 cm/min. Se reunieron las
fracciones con virus sustancial, se hicieron pasar a través un
microfiltro de 0,2 \mum y se conservaron. El concentrado de virus
se puede conservar a baja temperatura, por ejemplo,
0-10ºC, preferiblemente a aproximadamente 4ºC, o si
el volumen es pequeño, por ejemplo, menos de aproximadamente 50 ml,
congelado a -80ºC.
Se mezcló la mezcla
DEAE-Fractogel^{RTM} (0,4 ml) con un tampón
consistente en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 2 mM,
sacarosa al 2% (p/v) sin NaCl (0,8 ml) y se colocó inmediatamente en
una cubeta de cuarzo y se midió su absorbancia a 260 y 520 nm en un
espectrómetro UV equipado con una disposición de fotodiodos. Sin
retirar la muestra de la cubeta, se repitió la lectura a intervalos
de 1-2 minutos durante un periodo de 5 minutos. Si
la relación A_{320}/A_{260} fuera suficientemente constante
durante ese período, entonces la mezcla
DEAE-Fractogel^{RTM} era adecuada para
cromatografía isocrática de exclusión por tamaño molecular o con
gradiente de sal. Si la relación A_{320}/A_{260} aumentó más de
aproximadamente 4% durante ese periodo, entonces la mezcla
DEAE-Fractogel requería la cromatografía de
exclusión por tamaño molecular con gradiente de sal para mejorar el
rendimiento.
Se realizó la cromatografía con gradiente de sal
en una columna de Superdex^{RTM}-200 de 2,6 cm x
60 cm, se equilibró previamente con 0,5 B.V. de NaOH 0.5 M, 1 B.V.
de H_{2}O, y 2 B.V. del tampón C (fosfato sódico 20 mM, pH 8,0.
NaCl 130 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%). Inmediatamente antes
de cargar la mezcla de DEAE, se aplicó un gradiente lineal del
tampón D al 100% (fosfato sódico 20 mM, pH 8,0. NaCl 420 mM,
MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%) de 0,15 B.V. (48 ml) a una columna
de Superdex^{RTM}-200. La alimentación
consistente en 20 ml de una mezcla de DEAE que no había pasado el
ensayo anterior se cargó luego en la columna y se eluyó con tampón
D a un caudal lineal de 0,6 cm/min. Se reunieron las fracciones con
virus sustancial que eluyen en el volumen vacío o cerca de él, se
hicieron pasar a través de un filtro de esterilizante y se
conservaron a -80ºC. El rendimiento en esta etapa fue 60% y la
relación A_{320}/A_{260} fue 0,24:1.
Se descongeló el concentrado del vial congelado
de la etapa de fermentación y recuperación y se filtró a través de
una membrana hidrófila Durapore de 0,45 \mum en una cápsula
Millipore 10* Opticap. Se recogió el filtrado en un depósito
cerrado. Para reducir al mínimo las pérdidas, se lavó el cartucho de
filtro con aproximadamente 1,5 litros de tampón J-1
(fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 265 mM, cloruro de
magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v) suplementado con 5,4% (p/p) de
solución J-3 (cloruro de sodio 4 M). Se ajustó la
concentración de sal de filtrado añadiendo solución
J-3 (cloruro de sodio 4 M) al 5,4% (p/v). Está
solución de alimentación se aplicó luego a una columna de
Fractogel^{RTM} EMD DEAE-650 M (diámetro del
lecho 7 cm, altura de lecho 14,8 cm, volumen del lecho 570 mM)
equilibrada previamente con el tampón J-1 (fosfato
sódico 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 265 mM, cloruro de magnesio 2
mM, sacarosa al 2% (p/v). El adenovirus se une a la resina de
intercambio de iones, mientras que la mayoría de los medios de las
impurezas de las células hospedantes pasan a través de la columna
en la carga consumida. La columna se lavó inicialmente con 4
volúmenes de lecho de tampón J-1 al 94% y tampón
J-2 al 6% (fosfato sódico 50 mM, pH 7.5, cloruro de
sodio 600 mM, cloruro de magnesio 20 mM, sacarosa al 2% p/v) para
eliminar las impurezas adicionales. Se eluyó el virus de la columna
con un gradiente lineal de 30 volúmenes de lecho del tampón
J-2 de 6% -100%. Se recogieron y reunieron el pico
de adenovirus del perfil de elución determinado por A_{280} y se
mezclaron para su tratamiento posterior. Los parámetros de control
de operación en el proceso para la etapa de cromatografía de
intercambio de aniones aparecen recogidos en la Tabla V.
La mezcla de fracciones-DEAE se
aplicó inmediatamente a una columna de cromatografía de exclusión
por tamaño molecular Superdex^{RTM}-200 (diámetro
14 cm, altura de lecho 77 cm, volumen de lecho 11,9 litros)
equilibrada previamente con tampón K-1 (fosfato
sódico 20 mM, pH 8,0, cloruro de sodio 100 mM, cloruro de magnesio 2
mM, sacarosa al 2% (p/v)). La columna se eluyó con tampón
K-1. Se recogió y reunió las fracciones del pico de
adenovirus del perfil de elución determinado por A_{280}. La etapa
de cromatografía logró un intercambio de tampón y la separación de
impurezas de bajo peso molecular del producto de adenovirus. Los
parámetros de control y de operación en el proceso de la etapa de
cromatografía de exclusión por tamaño molecular aparecen recogidos
en la Tabla VI.
La mezcla de
fracciones-Superdex^{RTM} 200 se filtró a través
de una membrana hidrófila Durapore de 0,2 \mum (Stericup,
Millipore) a 2-15°C. Esta etapa se realizó en
condiciones estériles en una cabina de bioseguridad. Puesto que se
usaron varios dispositivos de filtración, los filtrados individuales
se reunieron y se tomaron luego partes alícuotas en recipientes
esterilizados en autoclave. Se congelaron los recipientes del
fármaco a granel en solución en un baño de hielo seco/etanol y se
conservaron a aproximadamente -20ºC.
Las modificaciones y las variaciones de esta
invención serán evidentes para los expertos en la técnica. Las
realizaciones específicas descritas en la presente memoria se
ofrecen solamente a manera de ejemplo y se ha de entender que la
invención no está limitada a las mismas.
Claims (13)
1. Un método para purificar adenovirus a partir
de una preparación de virus, que comprende las etapas sucesivas
de:
a) someter la preparación de virus a
cromatografía de intercambio de aniones, en donde el virus se eluye
desde un medio cromatográfico de intercambio de aniones; y
b) someter el eluato de la etapa a) que contiene
el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño molecular, en
donde el adenovirus se eluye desde un medio cromatográfico de
exclusión por tamaño molecular, en donde el medio cromatográfico de
exclusión por tamaño molecular se selecciona del grupo que consiste
en G6000PWXL, SB-806, SEPHACRYL
S-400 HR, SEPHADEX G-200, SEPHAROSE
CL-28, SUPERDEX 200 calidad preparativa, SUPEROSE 6
calidad preparativa, TSK 6000PWXL, y ULTRAHYDROGEL 200.
2. El método según la reivindicación 1, en donde
la preparación de virus es un lisado celular.
3. El método según la reivindicación 2, en donde
el lisado celular se filtra antes de la etapa a).
4. El método según la reivindicación 1, en donde
adenovirus es recombinante.
5. El método según la reivindicación 1, en donde
el adenovirus es ACN53.
6. El método según la reivindicación 1, en donde
el medio de intercambio de aniones comprende grupos
dimetilaminoetilo o dietilaminoetilo en una cadena principal
reticulada de agarosa, celulosa, poliacrilamida o poliestireno.
7. El método según la reivindicación 1, en donde
el medio de la cromatografía de intercambio de aniones es
dietialminoetil-FRACTOGEL.
8. El método según la reivindicación 1, en donde
el medio de la cromatografía de exclusión por tamaño molecular es
Superdex 200 de calidad preparativa.
9. El método según la reivindicación 1, en donde
el medio de la cromatografía de intercambio de aniones se lava
exhaustivamente antes de la etapa a).
10. El método según la reivindicación 1, en
donde la etapa b) comprende además eluir el adenovirus del medio de
la cromatografía de exclusión por tamaño molecular en un tampón con
baja concentración de sal, en donde el medio de la cromatografía de
exclusión por tamaño molecular está en una columna que contiene un
gradiente de sal que disminuye en fuerza iónica desde la parte
superior de la columna hasta el fondo de la columna.
11. El método según la reivindicación 1, en
donde el medio de la cromatografía de intercambio de aniones o el
medio de la cromatografía de exclusión por tamaño molecular está en
contacto con un tampón que comprende glicerol o sacarosa al 2%.
12. El método de la reivindicación 11, que en
donde el glicerol está presente en todos los tampones usados en el
método.
13. El método de la reivindicación 1, que
comprende además una etapa de añadir glicerol a una mezcla de
fracciones reunidas que contiene el adenovirus.
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