ES2337768T3 - Metodo para purificar adenovirus. - Google Patents
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Abstract
Un método para purificar adenovirus de contaminantes en un conjunto de muestras, que comprende: poner en contacto el conjunto de muestras con un medio de cromatografía de hidroxiapatita para que el adenovirus se una de manera reversible a la hidroxiapatita; y eluir de la hidroxiapatita el adenovirus unido, en el que la concentración de cloruro de sodio presente en los tampones usados es de al menos 150 mM.
Description
\global\parskip0.930000\baselineskip
Método para purificar adenovirus.
Esta invención se refiere a métodos para
purificar adenovirus de una muestra contaminada usando un medio de
cromatografía de hidroxiapatita.
En muchas aplicaciones de terapia génica los
adenovirus se prefieren como un vector para suministrar gen
terapéutico. El cultivo y la purificación de adenovirus que
contienen los genes terapéuticos, tales como los genes supresores
de tumores y otros modificadores de la respuesta biológica, se ha
vuelto cada vez más importante para la terapia génica y el
desarrollo de vacunas. A medida que los estudios de terapia génica
avanzan hacia ensayos clínicos, se necesitan grandes cantidades de
vectores virales purificados para suministrar gen terapéutico en el
tratamiento. El diámetro relativamente grande (aproximadamente 80
nm) y la frágil estructura de los adenovirus hacen difícil su
purificación usando métodos convencionales, por ejemplo,
centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio y
cromatografía de filtración en gel, que tienen limitaciones a
escala. Se conocen protocolos de cromatografía para purificar
adenovirus vivos, por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos Nº
5.837.520, sin embargo, en las preparaciones de virus que usan
estos protocolos se encuentran pequeñas cantidades de proteínas
contaminantes y de partículas virales incompletas, por ejemplo,
cápsides vacías. Este problema es significativo ya que las cápsides
vacías y otras proteínas contaminantes pueden ser inmunogénicas
in vivo. Por lo tanto, sería ventajoso tener un proceso
eficaz que proporcione una muestra de virus viable altamente
purificada, que reduzca significativamente al mismo tiempo niveles
de partículas virales incompletas. El documento WO 9 708 298
describe un método de purificación de adenovirus en hidroxiapatita
que tiene un rendimiento inferior al 10%. La pureza del virus
mejorada sin sacrificar el rendimiento del virus sería beneficiosa
en la producción del adenovirus a gran escala.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de
métodos de purificación mejorados para adenovirus que pueda
resolver virus vivos de partículas virales incompletas y otras
proteínas contaminantes en la preparación viral. La presente
invención aborda esta y otras necesidades en la técnica.
Esta invención proporciona un método para
purificar adenovirus biológicamente activos de una muestra
contaminada usando un medio de hidroxiapatita en condiciones que
permiten que el adenovirus se una de manera reversible a la
hidroxiapatita mientras que se pasan los contaminantes. El presente
método de purificación reduce en gran medida el nivel de
contaminantes y cápsides de adenovirus vacías de las muestras de
adenovirus purificando primero por métodos de purificación
convencionales. Para impedir que el adenovirus se una de manera
irreversible a la hidroxiapatita la concentración de cloruro de
sodio presente en los tampones usados durante el método es de al
menos 150 mM. Menores concentraciones de cloruro de sodio pueden
causar que el adenovirus se una de manera irreversible a la
hidroxiapatita.
Es una ventaja de un método de la invención que
las cápsides vacías, es decir, partículas virales incompletas, que
no son infecciosas y por tanto no útiles para la terapia génica u
otras aplicaciones, se separen de los virus intactos. De esta
manera, se proporciona una muestra de adenovirus infecciosa
altamente purificada y resuelta.
Por tanto, se proporciona un método para
purificar adenovirus biológicamente activos de un conjunto de
muestras contaminadas, que incluye las etapas de poner en contacto
el conjunto de muestras con un medio cromatográfico de
hidroxiapatita para unir de manera reversible el adenovirus
biológicamente activo a la hidroxiapatita, seguido de la elución
del adenovirus biológicamente activo unido de la hidroxiapatita.
En una realización específica, el conjunto de
muestras usado en un método de la invención contiene una solución
tamponada que incluye fosfato de sodio aproximadamente 50 mM, pH
aproximadamente 7,5, cloruro de sodio aproximadamente 400 mM,
sacarosa aproximadamente al 2%, MgCl_{2} aproximadamente 2 mM y
glicerol aproximadamente al 10%.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
emplear técnicas de biología molecular, microbiología o de ADN
recombinante dentro de la experiencia habitual de la técnica para
preparar, desarrollar y cultivar virus usados en un método de la
invención. Dichas técnicas se explican detalladamente en la
bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA
Cloning: A Practical Approach, Volumes I and 11 (D. N. Glover ed.
1985); Oligonucleotide Synthesis [M. J. Gait ed. (1984)]; Nucleic
Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)];
Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds.
(1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)];
Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; A Practical
Guide To Molecular Cloning [B. Perbal (1984)]; Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., F. M. Ausubel et
al., eds., 1994; Virology: A laboratory manual. Academic Press,
New York, (Burleson, ed., 1992).
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Esta invención proporciona un método para
purificar adenovirus biológicamente activos de viriones incompletos
y diversos contaminantes de proteínas no virales y virales en una
muestra usando un medio de hidroxiapatita.
El término "contaminante" significa una
impureza indeseable en una muestra que contiene adenovirus, por
ejemplo, una cápside vacía (que es una partícula viral inmadura sin
ADN viral y que contiene precursores para madurar proteínas virales
tales como pVIII, y que no es capaz de adherirse o penetrar en una
célula adecuada), una molécula de ácido nucleico, una proteína
viral libre (por ejemplo, proteínas virales III o hexones), una
proteína no viral (por ejemplo, proteínas derivadas de hospedadores
o medios tales como BSA, que es un componente de los cultivos
celulares habituales en sistemas de mamíferos). Una ventaja del
presente método de purificación es que el medio de hidroxiapatita
usado en condiciones salinas y de tampón de acuerdo con la invención
reduce el nivel de partículas virales incompletas en la muestra de
adenovirus.
El término "purificar" y las variaciones
gramaticales del mismo, cuando se utiliza en referencia a un método
de la presente invención, significa al menos una reducción del 50%
de contaminantes totales, en particular, proteínas no virales y
virales libres, en una muestra de adenovirus, cuantificada por
cromatografía en gel con SDS con tinción de plata, sobre una
muestra de adenovirus que se purifica usando un método de
purificación convencional (es decir, un método de purificación
conocido en la técnica que no sea el uso de hidroxiapatita, por
ejemplo, cromatografía con DEAE) antes de una etapa de purificación
de la presente invención. Preferiblemente la reducción de
contaminantes totales es al menos del 80%. Más preferiblemente, la
reducción de contaminantes totales es del 90% o superior. La
reducción de cápsides vacías es al menos del 50%, preferiblemente
del 75%, más preferiblemente del 80% y más preferiblemente del 85%
o superior, cuantificado usando HPLC de fase inversa midiendo un
precursor de proteína viral para la proteína VIII del adenovirus
("pVIII") [véase Galibert et al., Gene 6: 1 (1979) y
Herisse et al., Nucl. Acids Res. 8: 2173 (1980)], que no se
encuentra en adenovirus maduros infecciosos. Cabe señalar que un
método de la presente invención que se realiza a escala para la
producción comercial puede dar como resultado reducciones
porcentuales ligeramente inferiores, preferiblemente reducciones
inferiores no superiores del 5 al 10%.
Cualquier adenovirus puede purificarse mediante
la presente invención, tanto si se trata de tipo silvestre, mutante
o recombinante. Los vectores adenovirales de Tipo 2 y de Tipo 5 son
los preferidos. Los adenovirus pueden prepararse y cultivarse de
acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, véase
Wills et al., Hum. Gene Ther. 5: 1079-1088
(1994), Hughye et al. Hum. Gene Ther. 6:
1403-1416 (1995), y manuales de laboratorio según
se ha descrito, anteriormente.
Los adenovirus purificados mediante el presente
método son "infecciosos", que significa que comprenden una
cápside multi-subunitaria que encapsula una molécula
de ácido nucleico y que puede interaccionar con un receptor o una
célula adecuada para dar como resultado una transferencia del ácido
nucleico del adenovirus a la célula.
Una "cápside vacía" es una partícula viral
incompleta que no es infecciosa, por ejemplo, una partícula viral
que tiene una cápside, pero sin una molécula de ácido nucleico.
Un adenovirus usado en esta invención
preferiblemente no se replica bien de manera que el virus no puede
reproducirse después de infectar una célula. Estos virus se conocen
bien en la técnica.
Un adenovirus puede incluir una secuencia de
ácido nucleico heteróloga por ejemplo, un gen terapéutico, que
puede transferirse del vector viral a una célula hospedadora para
usar en terapia génica. Un "gen terapéutico" es una secuencia
de ADN que codifica una secuencia particular de aminoácidos que
comprende toda o parte de una o más proteínas y que tiene un efecto
terapéutico deseado. El gen terapéutico puede incluir o no
secuencias de ADN reguladoras, tales como secuencias promotoras,
que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa
el gen. Preferiblemente, un gen terapéutico reemplaza a un gen
ausente o mutado que causa un aumento en el crecimiento celular
patológico o proliferación de las células. Una vez en la célula
hospedadora, un gen terapéutico puede mostrar un efecto terapéutico
correspondiente mediante, por ejemplo, permaneciendo
extracromosómico de manera que la célula expresa el gen desde de la
localización extracromosómica, o incorporándose en el genoma de la
célula hospedadora en un suceso de recombinación con el gen
endógeno. En la técnica se conocen métodos para introducir
secuencias de ácidos nucleicos heterólogas en un vector viral.
Los ejemplos de genes terapéuticos incluyen
genes supresores de tumores, por ejemplo, Rb y mutantes del mismo,
p53 y mutantes del mismo, p21 y mutantes del mismo, DCC,
NF-1, tumores de Wilm, NM 23,
BRCA-1, BRCA-2,
BRUSH-1, p56, H-NUC, gen receptor
de la hormona tiroidea, gen receptor del ácido retinoico, genes que
codifican p130, p107 y p85. Otras estrategias de
re-emplazamiento o complementación de genes incluyen
adenosina desaminasa (ADA), timidina quinasa (TK), genes que
codifican diversas citocinas, por ejemplo,
\gamma-interferón,
\alpha-interferón, IL-2,
IL-10 y hormonas. Un gen terapéutico también incluye
ADN que codifica una ribozima, es decir, un constructo de ADN que
codifica una enzima de ARN que se une y destruye el ARN de genes
reguladores del crecimiento que actúan de manera positiva, tales
como oncogenes o protooncogenes incluyendo, pero sin limitación:
c-myc, c-fos,
c-jun, c-myb, c-ras,
KC y JE; y genes receptores del factor de crecimiento incluyendo
pero sin limitación: factor del crecimiento epidérmico, factor de
crecimiento derivado de plaquetas, transferrina e insulina. Más
preferiblemente, el gen terapéutico es un gen supresor de tumores,
por ejemplo, Rb, p53, BRUSH-1, p56,
BRCA-1, BRCA-2, p16 o p21 o un gen
mutante de los mismos. En una realización específica, el vector
adenoviral porta el gen p53 (por ejemplo, el vector adenoviral es
ACN53).
Sorprendentemente, se ha descubierto que el
adenovirus se purifica de manera eficaz de cápsides vacías y
contaminantes usando un medio de hidroxiapatita siempre que la
concentración mínima de cloruro de sodio sea al menos de 150 mM en
soluciones tamponadas usadas durante todo el método. La
concentración mínima de cloruro de sodio impide que el virus se una
de manera irreversible al medio de hidroxiapatita. Más
preferiblemente, las soluciones tamponadas usadas en esta invención
contienen de aproximadamente de 350 a 450 mM de cloruro de sodio.
Cabe señalar que concentraciones de 500 mM o superiores de cloruro
de sodio pueden causar que el virus se vuelva inestable y
preferiblemente no se usan en un método de la invención. Un
especialista en la materia puede sustituir otras sales por cloruro
de sodio, si se desea, en concentraciones adecuadas (que tengan
similar conductividad), incluyendo sales iónicas y catiónicas
monovalente, por ejemplo, KCI o NH_{4}Cl o sales aniónicas y
catiónicas divalentes, por ejemplo, Na_{2}SO_{4} o
(NH_{4})_{2}SO_{4}.
Una "solución tamponada" es una solución
acuosa que contiene cloruro de sodio en un tampón adecuado para
mantener el pH de la solución entre aproximadamente 6,8 a 9,0,
preferiblemente entre aproximadamente pH 7,0 a 8,0, más
preferiblemente entre aproximadamente pH 7,4 a 7,6. En una
realización específica de la invención, el pH es 7,5. Se prefieren
los tampones que tienen un pKa dentro del intervalo del pH deseado.
Una solución tamponada no causa que un adenovirus se una de manera
irreversible a un medio de hidroxiapatita. Las soluciones tamponadas
se usan, por ejemplo, en un conjunto de muestras que contiene el
adenovirus, para equilibrar y lavar (tampones de equilibrio y
lavado) el medio de hidroxiapatita y para eluir (tampones de
elución) el adenovirus unido a la hidroxiapatita.
Los ejemplos de tampones que pueden usarse en la
invención incluyen fosfato, MES, HEPES, MOPS, Borato, TRIS, BES,
ADA, ACES, PIPES, MOPSO, BIS-TRIS PROPANO, BES, TES,
DIPSO, TAPSO, TRIZMA, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, TRICINA,
CLICILGLICINA, BICINA, TAPS y similares. Se prefiere el tampón
fosfato con una concentración de aproximadamente de 25 a 100 mM,
más preferiblemente aproximadamente 50 mM.
Las soluciones tamponadas usadas en esta
invención también pueden formularse con un agente estabilizante o
ajustador de la tonicidad, por ejemplo, poli hidroxi hidrocarburos
tales como glicerol, disacáridos tales como sacarosa,
estabilizadores de sales metálicas divalentes tales como sal de
magnesio, zinc y calcio, y estabilizadores de sales metálicas
monovalentes tales como sales de potasio, sodio, litio y cesio.
Estos agentes adicionales son particularmente útiles cuando la
concentración de cloruro de sodio en el conjunto de muestras es
superior a 350 mM.
Las formulaciones de soluciones acuosas
tamponadas que pueden usarse en un método de esta invención se
describen en la publicación de Patente Internacional Nº WO
99/41416, que se incorpora en este documento por referencia en su
totalidad. Por ejemplo, dependiendo de la concentración del virus,
un tampón usado en la invención puede contener de menos del 1% de
glicerol a aproximadamente el 20% de glicerol y/o menos del 1% a
aproximadamente el 5% de sacarosa. A 1 x 10^{14} o inferior de
partículas virales por ml, las concentraciones de glicerol y
sacarosa pueden ser aproximadamente del 5 al 10% y aproximadamente
del 0,5 al 2% respectivamente.
Un "conjunto de muestras" es una solución
tamponada que contiene adenovirus y un contaminante, que puede
haberse preparado a partir de un método de purificación
convencional, a partir del cual se desea la purificación adicional
del adenovirus. Preferiblemente, un conjunto de muestras se formula
con agentes adicionales estabilizantes o ajustadores de la
tonicidad, como se ha descrito anteriormente. En una realización, un
conjunto de muestras contiene aproximadamente NaPO_{4} 50 mM (pH
7,5), NaCl 400 mM y glicerol al 10%.
Un conjunto de muestras contiene típicamente un
intervalo de concentración de adenovirus de aproximadamente 1 x
10^{9} a aproximadamente 1 x 10^{14} por ml. Preferiblemente, el
conjunto de muestras se formula con uno o más agentes
estabilizantes, tales como glicerol y sacarosa, como se ha descrito
anteriormente, particularmente cuando se usan concentraciones
mayores del virus.
A partir de un lisado celular puede preparase un
conjunto de muestras. Por ejemplo, células tales como células 293,
infectadas con adenovirus se retiran del medio de cultivo y sus
membranas se rompen, por ejemplo, por medios fisiológicos o
químicos, de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica
(véase Wills et al., anteriormente y Hughye et
al., anteriormente). El lisado celular que contiene el
adenovirus se somete preferiblemente en primer lugar a uno o más
métodos de cromatografía convencionales para proporcionar un
conjunto de muestras de virus, que se purifica adicionalmente de
acuerdo con un método de la invención. Por ejemplo, un lisado
celular que contiene adenovirus puede procesarse para degradar
enzimáticamente ADN y ARN seguido por un método de purificación
convencional, que incluye cromatografía de intercambio aniónico,
cromatografía de filtración en gel (exclusión por tamaño),
cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de afinidad
metálica inmovilizada. Si se desea pueden usarse combinaciones de
estos métodos, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.837.520, que se incorpora en este documento por referencia en su
totalidad. Preferiblemente, el método convencional usado es una
cromatografía de intercambio aniónico.
Los métodos cromatográficos convencionales
eliminan la mayoría de los residuos celulares y algunas de las
proteínas virales y proteínas no virales ensambladas contaminantes,
sin embargo, una diversidad de contaminantes, por ejemplo, BSA,
proteínas virales tales como hexones libres y viriones incompletos
sin ADN viral (cápsides vacías), puede permanecer en las muestras.
Sorprendentemente, estos contaminantes se eliminan eficazmente
mediante un método de purificación usando hidroxiapatita que mejora
la pureza, resolución y calidad del adenovirus en la muestra con
respecto a los métodos de purificación virales convencionales.
El método de hidroxiapatita usado en un método
de la invención puede prepararse como una columna cromatográfica de
acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Por
ejemplo, puede prepararse una columna de HA para cromatografía en
columna tradicional (gravedad), cromatografía de rápido rendimiento
o cromatografía líquida de alta presión usando columnas de lecho
fluidizado de flujo axial o radial, según se desee.
El medio de hidroxiapatita se lava y equilibra
preferiblemente usando una solución acuosa tamponada, como se ha
descrito anteriormente, antes de purificar el adenovirus de
acuerdo con esta invención. En una realización específica, un
tampón de equilibrio usado para equilibrar la hidroxiapatita
contiene aproximadamente NaPO_{4} 50 mM (pH 7,5), NaCl 400 mM,
sacarosa al 2%, glicerol al 10% y MgCl_{2} 2 mM. La columna puede
equilibrarse hasta que el eluente alcance el pH y la conductividad
del tampón, típicamente aproximadamente de cinco a diez volúmenes
de lecho.
Después de lavar la hidroxiapatita, el conjunto
de muestras se pone en contacto con el medio de hidroxiapatita para
permitir que el adenovirus se una de manera reversible a la
hidroxiapatita y los contaminantes pasen a través del medio,
separando de esta manera los contaminantes del virus.
La columna de hidroxiapatita, que contiene el
adenovirus unido, se lava con un tampón de lavado, que puede ser el
mismo tampón que el usado para equilibrar (tampón de equilibrio) la
hidroxiapatita. Después de lavar la columna de hidroxiapatita unida
al virus, el adenovirus puede eluirse de la hidroxiapatita usando
una elución en gradiente o una elución por etapas para fosfato en
tampón de equilibrio (tampón de elución). Si se desea la elución en
gradiente, el adenovirus puede eluirse usando, por ejemplo,
aproximadamente un gradiente de volumen de lecho de 5 a 30 para,
por ejemplo, fosfato sódico 200 mM en tampón de equilibrio.
Preferiblemente, se usa un gradiente de volumen de lecho de 10. Si
se desea la elución por etapas, el tampón de elución puede ser un
tampón de equilibrio que contenga preferiblemente aproximadamente
fosfato de 150 a 250 mM.
El presente método se realiza en un intervalo de
temperatura de aproximadamente 5 a 30ºC, más preferiblemente de
aproximadamente 15 a 27ºC. Más preferiblemente el método se realiza
a temperatura ambiente, por ejemplo, aproximadamente 20 a 27ºC.
Cabe señalar que aproximadamente a menos de 15ºC, el virus puede
comenzar a unirse de manera irreversible a la columna dependiendo
de las condiciones salinas y de la presencia de agentes
estabilizantes. Un experto en la materia puede optimizar las
condiciones de acuerdo con la invención si se desea.
Las proteínas no virales y los contaminantes de
elevado peso molecular se eluyen en la carga gastada y se lavan de
la columna. Las cápsides vacías se unen más estrechamente a la
hidroxiapatita que el virus biológicamente activo y por tanto las
cápsides vacías no se eluyen de la hidroxiapatita con el virus
biológicamente activo. Las fracciones fuera de la columna pueden
analizarse por absorbancia UV, HPLC analítica de recurso Q y
HPLC-rp y usarse para preparar un solo conjunto de
adenovirus purificado biológicamente activo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Este ejemplo demuestra un método de purificación
de la presente invención usando hidroxiapatita en comparación con
un método de purificación de virus convencional.
Adenovirus que contenían el gen p53 (ACN53),
cultivados a partir de células 293 de mamíferos, se capturaron de
lisados celulares usando un método cromatográfico convencional de
intercambio aniónico con DEAE. El conjunto de muestras en DEAE
contenía una proteína de 31 kDa (pVIII), que corresponde a un
precursor de proteína adenoviral VIII (proteína asociada a
hexón).
El conjunto en DEAE se preparó como un conjunto
de muestras para usar en un método de purificación de la invención
mediante tampón con NaPO4 50 mM (pH 7,5), NaCl 400 mM y del 5 al 10%
de glicerol. Se prepararon por rellenado columnas de hidroxiapatita
(0,5 x 10 cm, 0,5 x 20 cm y 1,6 x 15 cm), equilibradas en NaPO_{4}
50 mM (pH 7,5), NaCl 400 mM, sacarosa al 2% y MgCl_{2} 2 mM. El
conjunto en DEAE tamponado se aplicó a la columna de
hidroxiapatita, se lavó con tampón equilibrado como se ha descrito y
el adenovirus se eluyó usando una elución de gradiente hasta
fosfato 600 mM en tampón de equilibrado o mediante una elución por
etapas con fosfato 250 mM en tampón de equilibrado.
La HPLC de fase inversa y la HPLC de exclusión
por tamaño mostraron que el eluado de hidroxiapatita comparado con
el conjunto en DEAE tenía una reducción significativa de partículas
virales incompletas y de proteínas virales libres, por ejemplo,
reducciones de al menos el 75% en pVIII, reducción de penton libre a
niveles indetectables y reducción del 40% de hexón libre.
Los análisis densitométricos de
SDS-PAGE teñida con plata demostró que la
hidroxiapatita también eliminaba eficazmente los contaminantes
totales de proteínas no virales, es decir una reducción del 80 al
90% de proteínas que se resolvió de viriones intactos en gradientes
de CsCl (por ejemplo, reducciones del 70 al 85% en BSA) y proteínas
complejas de elevado peso molecular, es decir, una reducción del 25%
de proteínas no identificadas co-sedimentando con
el virus en gradientes CsCl. En experimentos en los que en el
suministro de la columna se aumentó la BSA, la BSA pasó a través de
la columna sin unirse a la hidroxiapatita en las condiciones de
tampón descritas, lo que demuestra que la cromatografía de
hidroxiapatita resuelve eficazmente BSA de la muestra.
El Análisis de la reacción en cadena de la
polimerasa del ácido nucleico presente en el eluato mostró una
reducción de fragmentos cortos de 8 veces y una reducción de
fragmentos medianos de 100 veces.
Por tanto, el uso de la cromatografía de
hidroxiapatita en las condiciones de tampón y salinas descritas para
purificar las muestras de adenovirus proporciona una muestra de
adenovirus que tiene gran resolución para usar en la terapia génica
u otras aplicaciones víricas que requieren elevada pureza.
La presente invención se ha descrito en este
documento con referencia a determinadas realizaciones preferidas y
un ejemplo. Dado que a los expertos en la materia las variaciones
les parecerán obvias, no debe considerarse que la invención las
limita, salvo únicamente mediante las siguientes
reivindicaciones.
Claims (19)
1. Un método para purificar adenovirus de
contaminantes en un conjunto de muestras, que comprende:
- \quad
- poner en contacto el conjunto de muestras con un medio de cromatografía de hidroxiapatita para que el adenovirus se una de manera reversible a la hidroxiapatita; y
- \quad
- eluir de la hidroxiapatita el adenovirus unido,
- \quad
- en el que la concentración de cloruro de sodio presente en los tampones usados es de al menos 150 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el conjunto de muestras comprende cloruro de sodio a una
concentración de 150 a 500 mM.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
el medio cromatográfico de hidroxiapatita se equilibra con un
tampón que comprende cloruro de sodio a una concentración de 150 a
500 mM antes de la etapa de poner en contacto el conjunto de
muestras con la hidroxiapatita.
4. El método de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la etapa de lavar la hidroxiapatita con un
tampón que comprende cloruro de sodio en una concentración de 150 a
500 mM, en el que la hidroxiapatita comprende un adenovirus unido a
ella.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
el adenovirus se eluye usando un tampón que comprende cloruro de
sodio en una concentración de 150 mM a 500 mM.
6. El método de la reivindicación 1 en el que la
concentración de cloruro de sodio en un tampón usado en el método
es de 350 mM a 450 mM.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
el conjunto de muestras se prepara a partir de un eluato de un
medio de cromatografía convencional.
8. El método de la reivindicación 7 en el que el
medio de cromatografía convencional es:
- \quad
- una resina de intercambio aniónico;
- \quad
- una resina de afinidad iónica de metal inmovilizada;
- \quad
- una resina de cromatografía de exclusión por tamaño; o
- \quad
- un medio usado en cromatografía de interacción hidrófoba.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El método de la reivindicación 1, en el que
la etapa de elución es una elución en gradiente con fosfato
600
mM.
mM.
10. El método de la reivindicación 1, en el que
la etapa de elución es una elución por etapas con fosfato
250
mM.
mM.
11. El método de la reivindicación 1, en el que
un tampón usado en el método comprende glicerol o sacarosa.
12. El método de la reivindicación 1, en el que
la concentración de adenovirus en el conjunto de muestras es igual
o inferior a 1 x 10^{14} partículas por ml.
13. El método de la reivindicación 1, en el que
el adenovirus comprende un gen terapéutico.
14. El método de la reivindicación 1, en el que
el adenovirus es ACN53.
15. El método de la reivindicación 1, en el que
el adenovirus comprende una secuencia de ácido nucleico del gen p53
o del gen p21.
16. Un método de la reivindicación 1, que reduce
la concentración de un contaminante en el conjunto de muestras al
menos un 80%.
17. Un método de la reivindicación 1, que reduce
la concentración de cápsides vacías al menos un 75%.
18. Un método de la reivindicación 1, que reduce
la concentración de BSA al menos un 70%.
19. Un método para purificar adenovirus de
contaminantes en un conjunto de muestras, que comprende:
- \quad
- poner en contacto el conjunto de muestras con un medio cromatográfico de hidroxiapatita para que el adenovirus se una de manera reversible a la hidroxiapatita;
- \quad
- lavar la hidroxiapatita unida al adenovirus con una solución tamponada; y
- \quad
- eluir de la hidroxiapatita el adenovirus unido, en el que el conjunto de muestras es una solución tamponada que comprende fosfato sódico 50 mM pH 7,5, cloruro de sodio 400 mM, sacarosa al 2%, MgCl_{2} 2 mM y glicerol al 10%, y la concentración de contaminantes totales se reduce al menos un 80%.
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