ES2330826B1 - Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. - Google Patents
Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2330826B1 ES2330826B1 ES200801682A ES200801682A ES2330826B1 ES 2330826 B1 ES2330826 B1 ES 2330826B1 ES 200801682 A ES200801682 A ES 200801682A ES 200801682 A ES200801682 A ES 200801682A ES 2330826 B1 ES2330826 B1 ES 2330826B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- polynucleotide
- cell
- sequence
- adenoviral
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/861—Adenoviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
- C07K2319/715—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16 containing a domain for ligand dependent transcriptional activation, e.g. containing a steroid receptor domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/40—Systems of functionally co-operating vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Sistema para empaquetamiento de adenovirus de
alta capacidad.
La invención se relaciona con un nuevo sistema
de producción y empaquetamiento (encapsidación) para vectores
adenovirales de alta capacidad que no requiere de la utilización de
virus helper y que se caracteriza porque integra los genes
adenovirales necesarios para el control, replicación y
empaquetamiento de las partículas virales dentro del genoma de una
célula hospedadora, lo cual mejora la estabilidad del sistema de
producción a largo plazo.
Description
Sistema para empaquetamiento de adenovirus de
alta capacidad.
La invención se encuadra dentro del campo de la
biotecnología y, más concretamente, en el campo de vectores para la
expresión de genes heterólogos en células diana. En particular, la
invención se refiere a un sistema para la producción y
empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad útiles
para transferencia génica.
Los adenovirus de alta capacidad (HC), conocidos
también como adenovirus gutless o adenovirus
helper-
dependientes, tienen un gran atractivo como vectores para terapia génica porque in vivo presentan una inmunogenicidad asociada muy reducida y poseen una alta eficiencia de transducción y amplio tropismo, tanto en roedores como en primates. Estos vectores se caracterizan por contener solamente las secuencias de ADN necesarias para su replicación y empaquetamiento y carecer del resto de genes adenovirales, lo que hace que puedan acomodar secuencias de hasta 36 kb. Para la replicación del ADN viral y su empaquetamiento en partículas virales, las únicas secuencias adenovirales requeridas en cis por estos vectores son las secuencias ITR (inverted terminal repeats), localizadas en ambos extremos del ADN lineal, y la señal de empaquetamiento (\psi) (Gräble y Hearing, 1992, J. Virol., 66: 723-731; Hearing y Shenk, 1983, Cell, 33: 695-703).
dependientes, tienen un gran atractivo como vectores para terapia génica porque in vivo presentan una inmunogenicidad asociada muy reducida y poseen una alta eficiencia de transducción y amplio tropismo, tanto en roedores como en primates. Estos vectores se caracterizan por contener solamente las secuencias de ADN necesarias para su replicación y empaquetamiento y carecer del resto de genes adenovirales, lo que hace que puedan acomodar secuencias de hasta 36 kb. Para la replicación del ADN viral y su empaquetamiento en partículas virales, las únicas secuencias adenovirales requeridas en cis por estos vectores son las secuencias ITR (inverted terminal repeats), localizadas en ambos extremos del ADN lineal, y la señal de empaquetamiento (\psi) (Gräble y Hearing, 1992, J. Virol., 66: 723-731; Hearing y Shenk, 1983, Cell, 33: 695-703).
Dado que los adenovirus de alta capacidad
carecen de todas las regiones virales codificantes, su propagación
sólo es posible si las células se co-infectan con un
segundo virus denominado virus helper o auxiliar, es decir,
un virus capaz de codificar todas las proteínas necesarias para la
replicación de un virus defectivo y su encapsidación en partículas
virales con capacidad infectiva. En el caso de la producción de
vectores adenovirales de alta capacidad, el virus helper se
caracteriza por tener delecionada la región E1 adenoviral y
proporcionar, in trans, todo el repertorio de proteínas
virales necesarias para la replicación y ensamblaje de la progenie
del virus gutless. Para la propagación de este último
también es necesaria la utilización de líneas celulares capaces de
complementar la deleción de dicha región E1 en el virus
helper, como son la línea 293 (Graham, et al., 1977,
J. Gen. Virol., 36: 59-74) o la línea PerC6
(Fallaux et al., 1998, Hum. Gene Ther., 9:
1909-1917).
Sin embargo con este sistema de propagación se
generan también partículas virales indeseables que encapsidan
genomas de virus helper y contaminan las preparaciones
finales de los adenovirus de alta capacidad. Hasta la fecha se han
desarrollado y descrito diferentes sistemas para tratar de eliminar
dichas contaminaciones bloqueando el proceso de empaquetamiento del
virus helper. En general, estos sistemas están basados en la
incorporación de mutaciones en la señal de empaquetamiento del virus
helper, en el aumento del tamaño de su genoma y, más
particularmente, en una eliminación específica de la señal de
empaquetamiento durante el proceso de producción viral.
Parks et al. (1996, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93: 13565-13570) han descrito la
eliminación de la señal de empaquetamiento \psi del virus
helper mediante un sistema de recombinación
Cre-loxP. En este sistema la señal \psi está
flanqueada por sitios loxP y la propagación del virus se lleva a
cabo en células 293 que expresan la recombinasa Cre (células
293Cre). Cuando el virus helper entra en la célula, la
recombinasa escinde la señal \psi impidiendo que pueda ser
empaquetado pero manteniendo su capacidad de replicación y, por
tanto, la expresión de las secuencias codificantes necesarias para
el empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad.
Groth et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 2000, 97: 5995-6000) han propuesto la
utilización de una recombinasa unidireccional, en particular la
recombinasa \Phi C31, utilizando las secuencias attB/attP
de reconocimiento específico para flanquear la señal \psi. Cuando
la recombinasa PhiC31 escinde la secuencia flanqueada por los sitios
attB/attP, modifica las secuencias de reconocimiento y las
convierte en secuencias attR/attL evitando que vuelva a
producirse el reconocimiento y, por tanto, la reintroducción de la
señal \psi.
Ng et al. (2001, Mol. Ther., 3:
809-815) proponen un sistema de recombinación
alternativo FLP/frt, en el que la propagación del adenovirus de alta
capacidad se lleva a cabo en células 293 capaces de expresar la
recombinasa FLP de levaduras (línea 293FLP y 293CreFLP) y en el que
la señal \psi del virus helper está flanqueada por sitios
frt reconocidos específicamente por dicha recombinasa FLP. La
eficiencia de amplificación del virus gutless (10^{8}
bfu/ml en el pase 3), así como los niveles de contaminación de
virus helper (0.5% previa purificación en gradiente CsCl),
son muy similares a los obtenidos con el sistema
Cre-loxP anterior.
Para tratar de mejorar estos sistemas, Palmer y
Ng (2003, Mol. Ther., 8: 846-852) han
desarrollado un sistema derivado del sistema
Cre-loxP, donde se ha incluido la inversión de la
señal de empaquetamiento del virus helper.
Por otra parte, Sargent et al. (2004,
Gene Ther., 11: 504-511) han propuesto un
sistema de restricción por tamaño, en el que se utiliza un virus
helper de más de 35 kb y delecionado en el gen de la
proteína IX, así como una línea celular 293 capaz de complementar
dicha deleción.
Sin embargo, a pesar de las mejoras, hasta el
momento ninguno de estos sistemas ha conseguido evitar las
recombinaciones entre las secuencias de los dos virus incluidos en
el proceso de producción y, por consiguiente, la contaminación de la
muestra con adenovirus replicativos. En una reciente revisión Alba
et al. (2005, Gene Ther., 12 Suppl 1:
S18-27) recogen que los niveles de contaminación
pueden oscilar, dependiendo del sistema utilizado, entre un 0.02% y
un 1% respecto al número de partículas virales de adenovirus de
alta capacidad producidas. Estos niveles de contaminación se
consideran demasiado altos para su posible utilización en
procedimiento clínicos de terapia
génica.
génica.
Adicionalmente, otra limitación importante para
el uso clínico de los adenovirus de alta capacidad está relacionada
con la dificultad para producirlos a gran escala. Actualmente este
tipo de producción es compleja, presenta una eficiencia baja y
requiere de numerosos ciclos sucesivos de
co-infección con el virus helper.
Por todo ello es necesario perfeccionar los
procedimientos, desarrollando también sistemas alternativos, para
producir vectores adenovirales de alta capacidad en las cantidades y
con la calidad (libres de partículas virales contaminantes)
requeridas para su uso clínico.
La solución ideal a este problema seria el
desarrollo de una línea celular específica para la producción a
gran escala de vectores adenovirales de alta capacidad. Sin embargo,
los sistemas de producción independientes de la participación de un
virus helper, plantean el problema de la citotoxicidad
derivada de altos niveles de expresión de los genes adenovirales lo
cual, hasta el momento, ha limitado enormemente el desarrollo de
este tipo de sistemas de producción. A esto hay que sumarle el
hecho de que resulta extremadamente complicado reproducir la
secuencia correcta de los eventos necesarios para coordinar la
replicación del ADN con la expresión de las proteínas estructurales
que permitan la producción masiva de partículas virales durante la
fase tardía de la infección (Farley, et al., 2004, J.
Virol., 78: 1782-1791).
WO0072887 describe un sistema de producción de
adenovirus de alta capacidad independiente de adenovirus
helper basado en un sistema binario formado por (i) una
línea celular empaquetadora que comprende de forma estable un
episoma circular en un número reducido de copias y basado en
elementos replicativos del virus de Epstein-Barr
(EBV) junto con un genoma adenoviral delecionado en las regiones E1,
E3, E4 y en los genes pTP y DBP, y (ii) un vector que comprende los
elementos necesarios para la replicación y empaquetamiento del
genoma adenoviral y que están ausentes en el episoma (región E4,
gen pTP y DBP) así como el gen heterólogo. En este sistema el
episoma no se empaqueta en viriones puesto que (i) carece de la
señal de empaquetamiento y (ii) su tamaño supera la capacidad de
empaquetamiento de los adenovirus.
Por otra parte, WO0042208 describe un sistema de
producción de adenovirus independiente de virus helper que
comprende (i) un vector adenoviral delecionado en las regiones E1,
E3 y el gen codifica la proteína de la fibra (L5), la cual está
implicada en el proceso de ensamblaje de los viriones, y (ii) una
línea celular específica capaz de complementar la replicación y el
empaquetamiento de dicho vector. Todos los genes necesarios para
los procesos de replicación y empaquetamiento de las partículas
virales están incluidos dentro de la secuencia del vector
adenoviral.
Por último, recientemente el sistema descrito
por Catalucci et al. (2005, J. Virol., 79:
6400-6409) plantea la utilización de un plásmido
episomal compuesto por el origen de replicación del virus
Epstein-Barr, lo que permite su mantenimiento en el
núcleo de una línea celular 293 modificada para la expresión
estable del antígeno nuclear EBNA1 (293EBNA). Este episoma incluye
las secuencias ITR del Adenovirus serotipo 5, los genes de la
región temprana (E2) y la ORF6 incluida en la región E4 del genoma
adenoviral. La transcripción de estos genes adenovirales se
encuentran bajo el control de un promotor inducible mientras que el
resto de los genes necesarios para la formación de la cápside están
incluidos dentro de la secuencia del adenovirus de alta
capacidad.
En general, todos estos sistemas de producción
de vectores adenovirales independientes de helper se
encuentran limitados por el tamaño de la secuencia de ADN a insertar
en el vector, ya que en todos ellos el vector adenoviral incluye
uno o más genes adenovirales necesarios para los procesos de
replicación o empaquetamiento de dicho vector. A esto hay que
sumarle el hecho de que la presencia de estos genes adenovirales
conlleva el riesgo de posibles efectos inmunogénicos a la hora de
su aplicación en clínica.
Por todo ello, se establece la existencia de una
necesidad en la técnica de obtener sistemas de producción de
adenovirus de alta capacidad que no requieran el uso de vectores
adenovirales auxiliares y que superen los inconvenientes de los
sistemas independientes de estos vectores auxiliares conocidos
hasta la fecha.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con un polinucleótido (primer polinucleótido de la invención) o un
vector de expresión que comprende:
- (a)
- un primer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
- (b)
- un segundo casete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional codificado por el polinucleótido definido en (a).
En un segundo aspecto, la invención se relaciona
con un polinucleótido (segundo polinucleótido de la invención) o
vector de expresión que comprende:
- (a)
- un primer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
- (b)
- un segundo casete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) y
- (c)
- un tercer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína adenoviral seleccionada E1A o las proteínas adenovirales E1A y E1B, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polinucleótido (tercer polinucleótido de la invención) o vector
de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que comprende
el genoma de un adenovirus recombinante que carece de, al menos, la
secuencia \psi de empaquetamiento y la secuencia que codifica la
proteína E1A o E1A/E1B, en donde dicha secuencia que comprende el
genoma de un adenovirus recombinante se encuentra flanqueada por
secuencias de reconocimiento específico para una endonucleasa de
restricción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora que comprende uno o varios polinucleótidos o
vectores de expresión de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la producción de células adecuadas para la
producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un
adenovirus de alta capacidad que comprende
- (i)
- transfectar una célula con un primer polinucleótido o con un vector que comprende dicho polinucleótido, o con un segundo polinucleótido o con un vector que comprende dicho polinucleótido y
- (ii)
- transfectar dicha célula con un tercer polinucleótido o con un vector que comprende dicho polinucleótido
en donde las etapas (i) y (ii)
pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea y
en donde si las células se transfectan en la etapa (i) con un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
entonces se utilizan células que comprenden la secuencia que
codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína
adenoviral
E1B.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula obtenible por un método de acuerdo a la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un sistema para la producción de adenovirus de alta capacidad que
comprende
- (a)
- una célula de acuerdo a la invención y
- (b)
- un adenovirus de alta capacidad.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la producción de vectores adenovirales de alta
capacidad, que comprende las etapas de:
- (a)
- transfectar o infectar una célula hospedadora con un polinucleótido que comprende el genoma del adenovirus de alta capacidad que se desea producir o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (b)
- cultivar las células transfectadas/infectadas en condiciones que permitan la replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad,
- (c)
- recuperar las partículas virales del adenovirus de alta capacidad y, opcionalmente,
- (d)
- repetir las etapas (a) a (c) en donde las partículas virales de alta capacidad obtenidas en la etapa (c) se utilizan para infección en la etapa (a) del siguiente ciclo,
en donde la célula hospedadora
usada en la etapa (a) se selecciona del grupo
de
- (i)
- una célula que comprende el primer polinucleótido de la invención y la secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un tercer polinucleótido y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (ii)
- una célula que comprende el segundo polinucleótido de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el tercer polinucleótido de la invención y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (iii)
- una célula que comprende un el tercer polinucleótido de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un primer polinucleótido y en donde la célula comprende una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B,
- (iv)
- una célula que comprende el tercer polinucleótido de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el segundo polinucleótido de la invención y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (v)
- una célula que comprende el primer polinucleótido de la invención, el tercer polinucleótido de la invención y una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B, y
- (vi)
- una célula que comprende el segundo polinucleótido de la invención y el tercer polinucleótido de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. A. Representación esquemática del
plásmido
pGal4-2RU-E1-SceI
que comprende un polinucleótido A2 según la invención. A_{I}:
secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional,
en este caso GAL4-hPR-p65. A_{II}:
secuencia nucleotídica que codifica las proteínas adenovirales
E1A/E1B. A_{III}: secuencia nucleotídica que codifica una
endonucleasa de restricción, en este caso I-SceI de
Sacharomyces cerevisiae. rP_{II} y rP_{III}: promotores
regulables por el regulador transcripcional,
GAL4-hPR-p65, que dirigen la
transcripción y expresión de las proteínas E1A/E1B y de la
endonucleasa I-SceI respectivamente. En esta
realización cada región promotora comprende una secuencia de la
caja TATA del gen E1b (P_{E1b}) adenoviral, asociada a secuencias
UAS (upstream activating sequences) de GAL4, y donde ambos
promotores comparten las mismas secuencias de unión UAS. En este
caso la región promotora que dirige la transcripción y expresión
del regulador transcripcional
GAL4-hPR-p65 comprende un promotor
mínimo de la timidina quinasa (P_{tk}) también asociado a
secuencias UAS (upstream activating sequences) de GAL4. Cada
una de las 3 unidades transcripcionales
(GAL4-hPR-p65, E1A/E1B y
I-SceI) se completa con una señal de
poliadenilación (pA). pUCori: origen de replicación del plásmido
pGeneV5-HisA utilizado como base para la
construcción del plásmido
pGal4-2RU-E1-SceI.
Amp: gen de resistencia a ampicilina para la selección de clones
resistentes en bacterias. Zeo: gen de resistencia al antibiótico
Zeocina para la selección de clones resistentes en células
eucariotas. SV40: promotor SV40 que dirige la expresión del gen de
resistencia Zeo^{r}. B. Representación esquemática del plásmido
pRc/Ad2 que comprende un polinucleótido B según la invención.
B_{I}: secuencia nucleotídica que codifica el genoma del
adenovirus, en este caso serotipo 5, a excepción de la región que
codifica las proteínas E1A/E1B y la señal de empaquetamiento
(\psi). La secuencia nucleotídica está delimitada por las
secuencias ITR (inverted terminal repeats). B_{II}:
Secuencias dianas específicas para una endonucleasa de restricción,
en este caso I-SceI. B_{III}: secuencia
nucleotídica attB que facilita la integración del plásmido en
el genoma de la célula eucariota. Este proceso está mediado por la
recombinasa específica y unidireccional PhiC31. colE1: origen de
replicación del plásmido pRC/RSV utilizado como base para la
construcción del plásmido pRcAd2. Amp: gen de resistencia a
ampicilina para la selección de clones resistentes en bacterias;
Neo: gen de resistencia al antibiótico Neomicina para la selección
de clones resistentes en células eucariotas; SV40: promotor SV40
que dirige la expresión del gen de resistencia Neo^{r}. pA: señal
de poliadenilación.
Figura 2: Sistema comercial
GeneSwitch^{TM} (Invitrogen) para el control
transcripcional de la expresión génica inducida por mifepristona.
A. Plásmido pSwitch de expresión de la proteína de fusión compuesta
por el dominio de unión a ADN (GAL4-DBD) de la
proteína GAL4 de levadura, el dominio de unión a ligando del
receptor de progesterona humano (hPR-LBD) y el
dominio de activación de la proteína NF-\kappaB
humana (p65-AD). La expresión del activador
transcripcional GAL4-hPR-p65 está
bajo el control del promotor mínimo de la timidina quinasa
(P_{tk}). La unión de la forma activa de la proteína a las
secuencias GAL4-UAS asociadas al promotor regula su
propia expresión. B. Plásmido pGeneV5-HisA diseñado
para el clonaje del gen de interés. La expresión del gen donado
queda bajo el control del promotor constituido por la caja TATA de
E1b (P_{E1b}) y las secuencias de unión al activador
transcripcional (GAL4-UAS). C. Mecanismo de
activación del sistema GeneSwitch^{TM}. La presencia del
inductor provoca un cambio conformacional de la proteína de fusión
que actúa como activador transcripcional y que es expresada de
forma constitutiva por el plásmido pSwitch. Este cambio
conformacional consiste en la dimerización de la molécula que pasa
de un estado inactivo a su forma activa. El homodímero tiene
capacidad de unirse a secuencias específicas
(GAL4-UAS) localizadas en la región promotora del
gen de interés activando su expresión (plásmido
pGeneV5-HisA) y en la región promotora que controla
la propia expresión del regulador transcripcional (plásmido pSwitch)
iniciando en este caso una reacción de retroalimentación
positiva.
Figura 3. Esquema de los sistemas de regulación
diseñados para el control transcripcional de los genes E1a, E1b y
I-SceI a partir del sistema
GeneSwitch^{TM}. Las construcciones
pGene-E1-SceI y
p2RU-E1-SceI requieren la presencia
del plásmido pSwitch para la expresión del regulador
transcripcional GAL4-hPR-p65. Por su
parte las construcciones
pRU-E1-SceI y
pGal4-2RU-SceI-E1
incluyen, en una única construcción, los genes de la región E1
(E1a, E1b), el gen I-SceI y el gen que codifica la
proteína de fusión reguladora con su región promotora específica.
Todos los genes se encuentran bajo el control de promotores
(flechas blancas) con secuencias de unión al activador
transcripcional (UAS). Cada una de las unidades transcripcionales se
completa con una señal de poliadenilación (pA).
Figura 4: Integración específica de ADN exógeno
mediada por la integrasa PhiC31 del fago de Streptomyces. En
las células de mamífero esta integrasa se utiliza para promover la
recombinación entre la secuencia attB insertada en el vector
con el gen de interés y una secuencia pseudo-attP presente
en el cromosoma de la célula. Como resultado se pierden las
secuencias de recombinación originales y el vector integrado queda
flanqueado por las regiones attR y attL.
Figura 5. Proceso de recombinación entre
secuencias homólogas del genoma del Adenovirus serotipo 5,
purificado a partir del plásmido pTG3602 mediante digestión con
PacI (P), y la construcción pRC/A6-A7,
linealizada con XbaI (X). Los números indican la posición
dentro del genoma adenoviral de cada una de las regiones homólogas.
Dentro del plásmido pRC/A6-A7 la secuencia
adenoviral se encuentra flanqueada por secuencias diana para la
endonucleasa de restricción I-SceI (S), mientras
que en el extremo 5' se ha insertado una secuencia attB para
la integración del plásmido en el genoma de la célula de mamífero.
El plásmido pRcAd2 resultante del proceso de recombinación incluye
el genoma adenoviral delecionado entre las posiciones 190 y 3528,
región correspondiente a la secuencia codificante de E1a y E1b. ITR:
Secuencias terminales de repetición invertidas (inverted
terminal repeats). colE1: origen de replicación del plásmido
pRC/RSV utilizado como base para la construcción del plásmido
pRcAd2. Amp: gen de resistencia a ampicilina para la selección de
clones resistentes en bacterias. Neo: gen de resistencia al
antibiótico Neomicina utilizado en la selección de clones
resistentes en células eucariotas. SV40: promotor SV40. pA: señal
de poliadenilación.
Figura 6. A. Integración estable del plásmido
pRcAd2 en la línea celular eucariota mediada por la recombinasa
PhiC31. El inserto queda flanqueado por las secuencias attL
y attR, producto de la recombinación entre la región
attB del plásmido y la secuencia pseudo-attP del
genoma celular. S: diana para la endonucleasa
I-SceI; Zeo: gen de resistencia a Zeomicina. B.
Detección por Nested-PCR de los genes adenovirales
IIIa, IV, la proteasa (Pr) y el gen que codifica la polimerasa viral
(Pol) a partir del ADN genómico purificado del clon estable
pRc-1. El resultado de la electroforesis
corresponde al análisis de las reacciones de amplificación con los
cebadores internos diseñados específicamente para cada gen. El clon
pRc-1 también se ensayó por PCR para la detección
de la secuencia attB. El resultado negativo de dicha
amplificación confirma la integración específica mediada por la
recombinasa PhiC31. (-): control negativo de PCR; (+) control
positivo de PCR; M: marcador de peso molecular (1 Kb Plus DNA
Ladder; Invitrogen).
Figura 7: RT-PCR de los genes
adenovirales IVa2, III y la ORF de 34 Kd de la región E4. El cADN
se obtuvo a partir de muestras de RNA total extraído de células
incubadas en ausencia (1) y presencia (2) del inductor RU486. (+):
control positivo de PCR. M: marcador de peso molecular (1 Kb
Plus DNA Ladder; Invitrogen).
Figura 8: Detección del gen que codifica el
regulador transcripcional GAL4, la endonucleasa de restricción
I-Scel y los genes de la región E1 del adenovirus
(E1a y E1b) mediante amplificación por PCR a partir del ADN
genómico del clon estable Gal-13. (-): control
negativo de PCR; (+): control positivo de PCR; M: marcador de peso
molecular (1 Kb Plus DNA Ladder; Invitrogen).
Figura 9: Ensayo de Western Blot para la
detección de la proteína E1A (A) y la endonucleasa
I-SceI (B). Los extractos de proteínas se recogieron
a partir de células incubadas en ausencia (-) y presencia (+) del
inductor RU486. Como control positivo de la proteína E1A se ensayó
la línea celular 2935. GADPH: Control positivo del ensayo de
Western Blot.
Figura 10: Detección por
Nested-PCR de los genes adenovirales IIIa, IV, la
proteasa (Pr) y el gen que codifica la polimerasa viral (Pol) a
partir del ADN genómico purificado de los clones estables
GAd-1 y GAd-6. El resultado de la
electroforesis corresponde al análisis de las reacciones de
amplificación con los cebadores internos diseñados específicamente
para cada gen. (-): control negativo de PCR; (+) control positivo
de PCR; M: marcador de peso molecular (1 Kb Plus DNA Ladder;
Invitrogen).
Figura 11: Producción de adenovirus
gutless KCZ a Pase 0 utilizando como línea empaquetadora el
clon estable pRc-1. Los extractos se recogieron a
las 48, 72, 96 y 120 horas, post-transfección, y se
titularon en la línea celular 293S. Los niveles de virus obtenidos
son la media de tres experimentos independientes y se expresan en
unidades infectivas (UI)/ml.
Figura 12: Producción de adenovirus
gutless KCZ a Pase 0 utilizando como línea empaquetadora los
clones estables GAd-1 y GAd-6. Los
extractos de virus se recogieron a las 48, 72, 96 y 120 horas,
post-transfección, y se titularon en la línea 293S.
Los niveles de virus obtenidos son la media de tres experimentos
independientes y se expresan en unidades infectivas (UI)/ml.
Los autores de la presente invención han
diseñado un nuevo sistema de producción y empaquetamiento
(encapsidación) para vectores adenovirales de alta capacidad que no
requiere de la utilización de virus helper y que se
caracteriza porque integra los genes adenovirales necesarios para
el control, replicación y empaquetamiento de las partículas virales
dentro del genoma de una célula hospedadora, lo cual mejora la
estabilidad del sistema de producción a largo plazo. Asimismo el
vector adenoviral de alta capacidad utilizado tan sólo incluye las
secuencias necesarias para la replicación y empaquetamiento de los
viriones (secuencias ITR y señal \psi) de modo que la capacidad
de clonaje del vector es superior a la mostrada en otros sistemas de
producción independientes de virus helper u otros vectores
auxiliares. Por último, la ausencia de estos genes adenovirales en
el vector de alta capacidad elimina el riesgo de cualquier
respuesta inmune contra el vector durante su aplicación en
clínica.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con un polinucleótido (en adelante polinucleótido A1 de la
invención) o un vector de expresión que comprende:
- (a)
- un primer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
- (b)
- un segundo casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional codificado por el polinucleótido definido en (a).
Por "regulador transcripcional" o
"transactivador" se entiende indistintamente, en el contexto
de la presente invención, una proteína que es capaz de activar la
transcripción de un determinado gen mediante su unión a regiones
específicas de reconocimiento para dicha proteína en la región no
codificante de dicho gen. En una forma de realización particular,
el transactivador o regulador transcripcional es un regulador
transcripcional regulable. Por "regulador transcripcional
regulable" se entiende, en el contexto de la presente invención,
un regulador transcripcional cuya actividad puede ser modulada por
medio de factores adicionales que pueden ser aportados o eliminados
en función de la necesidad de promover transcripción de los genes
que comprenden sitios de unión específicos para tales reguladores.
El experto en la materia apreciará que la invención contempla
cualquier método para regular la expresión del regulador
transcripcional siempre que permita la expresión de forma regulada
y con un mínimo de transcripción basal regulada. Así, es posible
regular la expresión del activador transcripcional mediante el uso
de promotores inducibles que responden a un agente inductor, que
muestran una expresión basal nula o despreciable en ausencia de
agente inductor y que son capaces de promover la activación del gen
localizado en posición 3'. En función del tipo de agente inductor,
los promotores inducibles se clasifican en promotores Tet on/off
(Gossen y Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:5547-5551; Gossen et al., 1995,
Science 268:1766-1769; Rossi y Blau, 1998,
Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456);
promotores Pip on/off (US6287813); promotores dependientes de
antiprogestin (US2004132086), promotores dependientes de ecdisona
(Christopherson et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89:6314-6318; No et al., 1996,
Proc. Natl. Acad. Sic. USA, 93:3346-3351,
Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95:7999-8004; y WO9738117), un promotor dependiente
de metalotioneina (WO8604920) y promotores dependientes de
rapamicina (Rivera et al., 1996, Nat. Med.
2:1028-32).
Alternativamente, la invención contempla el uso
de reguladores transcripcionales cuya inducción tiene lugar no
mediante un aumento de los niveles de expresión sino mediante un
agente inductor que provoca un aumento de la actividad
transcripcional, normalmente, originada por una translocación del
regulador del citoplasma al núcleo. En este tipo de reguladores
transcripcionales suelen estar formados por un dominio de unión a
ADN o DBD (DNA binding domain), un dominio de unión a un
ligando o LBD (ligand binding domain), y un dominio de
activación de la transcripción o AD (activating domain).
El dominio de unión de ADN puede ser cualquier
dominio para el que exista un elemento de unión específico
conocido, incluyendo dominios de unión a ADN sintéticos, quiméricos
o análogos. Dominios de unión a ADN adecuados para la presente
invención incluyen (i) homeodominios (Scott et al., 1989,
Biochim. Biophys. Acta 989:25-48; Rosenfeld
et al., 1991, Genes Dev. 5:897-907)
formados, por regla general, por una cadena de aproximadamente 61
amino ácidos que presenta una estructura secundaria compuesta por
tres hélices alfa, (ii) dedos de zinc formados por dos a tres
docenas de dedos de ADN de fórmula general Cys_{2}His_{2}
organizados en tándem (por ejemplo TFIIIA, Zif268, Gli, and
SRE-ZBP) en donde cada módulo comprende una hélice
alfa capaz de contactar con una región de ADN de 3 a 5 pares de
bases siendo necesarios al menos 3 dedos de zinc para generar un
sitio de unión a ADN de alta afinidad y al menos dos dedos de zinc
para generar sitios de unión a ADN de baja afinidad, (iii) los
dominios de unión a ADN denominados
hélice-giro-hélice o HLH
(helix-turn-helix) tales como
MAT1, MAT2, MATa1, Antennapedia, Ultrabithorax, Engrailed, Paired,
Fushi tarazu, HOX, Unc86, Oct1, Oct2 y Pit-1, (iv)
dominios de unión a ADN del tipo cremalleras de leucina (leucine
zipper) tales como GCN4, C/EBP,
c-Fos/c-Jun y JunB. Ejemplos de
dominios de unión a ADN adecuados en la presente invención incluyen
el dominio de unión a ADN de GAL4, de LexA, de factores de
transcripción, de receptores nucleares del grupo H, receptores
nucleares de la superfamilia de las esteroides/hormonas tiroideas.
El experto en la materia apreciará que la invención contempla el
uso de dominios de unión a ADN híbridos formados por varios motivos
de unión a ADN que pueden reconocer sitios de unión a ADN distintos
a los de los elementos que los componen. Así, es posible el uso de
dominios de unión de ADN formados por la unión de un dedo de zinc y
un homeobox. En una forma preferida de realización, el
dominio de unión a ADN es el procedente de la proteína GAL4 de S.
cerevisiae.
Las secuencias de unión a ligando capaces de
promover la localización nuclear de un activador transcripcional
que los contienen, adecuadas para el uso en la presente invención,
incluyen la secuencia de localización derivada de PPAR (receptores
activados por activadores peroxisomales), que se translocan al
núcleo en presencia de
15-desoxy-[Delta]-prostaglandina J2,
receptores del ácido retinoico que se translocan al núcleo en
presencia de los isómeros alfa, beta o gamma del ácido
9-cis-retinoico, receptores de
farnesoid X, activables por ácido retinoico y TTNPB, receptores X
hepáticos activables por 24-hidroxicolesterol,
receptores de benzoato X, activables por
4-amino-butilbenzoato, receptor
constitutivo de androstano, receptores de pregnano, inducibles por
pregnolono-16-carbonitrilo,
receptores de esteroides y xenobióticos, inducibles por
rifampicina, receptores de progesterona, inducibles por
medroxiprogesterona así como por agonistas y antagonistas de
mifepristona y derivados de 19-nortestosterona,
receptores de glucocorticoides actibables por glucocorticoides,
receptores de hormonas tiroideas, activables por T3 y/o T4, y
receptores de estrógenos, activables por estrógenos y sus derivados
tales como el 17-betaestradiol y el estradiol,
transactivadores tTA inducibles por tetraciclina/doxiciclina
"tet-off" (Gossen y Bujard, 1992, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551),
transactivadores rtTA inducibles por tetraciclinas
"tet-on" (Gossen et al., 1995,
Science, 268: 1766-1769), transactivador
inducible por muristerona A o ligandos análogos del receptor de la
ecdisona (No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93: 3346-3351), transactivadores inducibles
por el ligando RSL1, como el sistema RheoSwitch inicialmente
descrito por Palli et al. (2003, Eur. J. Biochem.,
270: 1308-1315), un transactivador inducible por
rapamicina o análogos de la rapamicina (Ho et al., 1996,
Nature, 382: 822-826; Amara et al., 1997,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10618-10623),
y un transactivador inducible por coumermicina/novobiocina, que
actúan competitivamente como inductor y represor respectivamente
(Zhao et al., 2003, Hum. Gene Ther., 14:
1619-1629). En una forma preferida de realización,
el LBD es un dominio de unión a ligando del receptor de la
progesterona humana que puede ser activado con antiprogestinas
sintéticas incluyendo derivados de la progesterona tales como RU486
o mifepristona y que no muestran efecto alguno en pacientes tal y
como ha sido descrito por Wang et al., (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1994, 91: 8180-4).
Por último, el dominio de activación
transcripcional puede ser el dominio de activación de los
receptores nucleares del grupo H, de los receptores nucleares de
hormonas tiroideas o esteroideas, el dominio de activación de VP16,
de GAL4, de NF-\kappaB, de B42, de BP64, o de
p65. En una forma preferida de realización, el activador
transcripcional es del derivado de la proteína
NF-\kappaB humana.
En una forma preferida de realización, el
activador transcripcional es la proteína de fusión denominada
GAL4-hPR-p65 que comprende el
dominio de unión a ADN de GAL4 de Saccharomyces cerevisiae
(Laughon y Gesteland, 1984, Mol. Cell Biol., 4:
260-267; Marmorstein et al., 1992,
Nature, 356: 408-414), el dominio de unión a
ligando del receptor de progesterona humano (Kastner et al.,
1990, Embo J., 9: 1603-1614; Wang et
al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:
8180-8184) y el dominio de activación de la
proteína NF-\kappaB humana (Burcin et al.,
1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:
355-360; Deloukas y van Loon, 1993, Hum. Mol.
Genet., 2: 1895-1900). Este regulador
transcripcional es inducible por mifepristona o su análogo RU487. En
ausencia de mifepristona, se expresa la proteína de fusión
reguladora de forma constitutiva a partir del promotor mínimo de la
timidina quinasa. Esta proteína se localiza predominantemente en el
núcleo y en una forma inactiva. En el momento de la adición del
inductor mifepristona, o su análogo RU486, éste se une con alta
afinidad a la región hPR-LBD de
GAL4-hPR-p65, provocando un cambio
conformacional que resulta en la dimerización de la proteína y su
conversión a la forma activa. Estos homodímeros son capaces de
unirse a sitios específicos (UAS: upstream activating
sequences) promoviendo la transcripción de genes localizados en
orientación 3' con respecto a dichas secuencias de activación y
activando así la transcripción del gen de interés y del gen que
codifica el propio factor de transcripción (Fig. 2C).
El experto en la materia apreciará que este tipo
de reguladores transcripcionales, cuya actividad se regula mediante
la adición de compuestos exógenos que promueven la translocación de
los reguladores al núcleo o su cambio conformacional a una forma
activa, no requieren que su transcripción esté sujeta a un control
transcripcional particularmente fino. De forma general, la
secuencia que codifica el transactivador o regulador
transcripcional está asociada a un promotor apropiado que dirige su
transcripción y expresión, y también a una señal de poliadenilación.
Dado que no es imprescindible controlar de forma exacta la
transcripción de este tipo de reguladores, éstos pueden encontrarse
bajo el control de un promotor mínimo constitutivo. Sin que esto
suponga una limitación, el promotor mínimo puede ser, entre otros,
un promotor constitutivo de virus, como CMV o RSV, o un promotor
constitutivo de células eucariotas, como PGK o EF1.
Alternativamente, es posible incluir en la región promotora del gen
que codifica el regulador transcripcional un elemento de respuesta
al propio regulador transcripcional, de forma que la expresión de
éste provoque un aumento en la expresión de si mismo mediante un
ciclo de retroalimentación positiva. En una forma de realización,
el regulador transcripcional está regulado por una región formada
por uno o varios elementos de unión al dominio de unión a ADN de
GAL4, preferiblemente 4 elementos de unión al dominio de unión de
ADN de GAL4, acoplados al promotor mínimo del gen timidina quinasa
(Ptk) del Virus Herpes Simplex.
El segundo elemento del polinucleótido A1
comprende un casete de expresión que codifica una endonucleasa de
restricción que se encuentra bajo control operativo del regulador
transcripcional codificado en el primer casete de expresión presente
en el primer polinucleótido de la invención. La endonucleasa de
restricción es un enzima que corta el ADN de doble cadena mediante
reconocimiento y rotura en sitios específicos de dicho ADN. La
endonucleasa a la que se refiere la invención es una endonucleasa
que no reconoce sitios específicos en el genoma o ADN de células
humanas y que, por tanto, no produce roturas en el genoma nativo de
dichas células. Sin que esto suponga limitación alguna, la
endonucleasa de restricción puede ser, entre otras,
I-SceI, PI-SceI,
I-PpoI, I-DmoI o
PI-TliI. En una realización particular, la
endonucleasa de restricción codificada por el polinucleótido A1 es
I-SceI de Saccharomyces cerevisiae. El
polinucleótido que contiene la secuencia codificante de la
endonucleasa de restricción se encuentra bajo control operativo de
una secuencia de unión al regulador transcripcional codificado por
el primer elemento del polinucleótido de la invención. De esta
manera, el promotor responde a la unión con el transactivador
activando o reprimiendo la transcripción y expresión de la
endonucleasa. Sin embargo, la capacidad del transactivador para
unirse e interactuar con el promotor se modifica dependiendo de si
el factor de regulación está unido a un ligando o agente inductor.
En consecuencia, es posible regular la transcripción del gen de
interés mediante el control de la disponibilidad del agente
inductor. En unos casos el agente inductor actúa activando y
favoreciendo la transcripción y expresión del gen, mientras que en
otros casos la presencia del agente inductor reprime su expresión.
En la forma de realización preferida en la que el regulador
transcripcional es GAL4-hPR-p65, el
polinucleótido que codifica la endonucleasa de restricción se
encuentra en posición 3' con respecto a un número variable de
secuencias de unión al dominio de unión a ADN de GAL4. En una forma
de realización aún más preferida, el gen que codifica la
endonucleasa de restricción se encuentra en posición 3' con respecto
a un elemento regulador compuesto por 6 secuencias de unión del
factor de transcripción GAL4 y la secuencia de la Caja TATA del gen
E1b (P_{E1b}) de adenovirus (Lillie y Green, 1989, Nature,
338: 39-44).
En una realización concreta del polinucleótido
A1, el regulador transcripcional es
GAL4-hPR-p65 y la endonucleasa de
restricción es I-SceI.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona
con un polinucleótido (en adelante el polinucleótido A2) o vector
de expresión que comprende:
- (a)
- un primer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
- (b)
- un segundo casete de expresión que comprende una secuencia nucleotidica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) y
- (c)
- un tercer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotidica que codifica la proteína adenoviral seleccionada E1A o las proteínas adenovirales E1A y E1B, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a).
Los elementos (a) y (b) del polinucleótido A2
corresponden esencialmente a los que forman parte del primer
polinucleótido de la invención y han sido descritos con detalle con
anterioridad.
El componente (c) del polinucleótido A2
comprende un casete de expresión que comprende una secuencia
nucleotidica que codifica la proteína adenoviral seleccionada E1A o
las proteínas adenovirales E1A y E1B. Los genes E1A y,
opcionalmente, E1B pueden proceder del genoma de adenovirus de
cualquier variedad o serotipo adenoviral humano (que haya sido
aislado en humanos), por ejemplo los serotipos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 11
(Ad11) ó 3 (Ad3). En una realización concreta, dicho componente
incluye la secuencia delimitada entre las posiciones 505 y 3511 del
genoma del adenovirus serotipo 5 (GenBank: AO000008). Esta
secuencia se encuentra bajo control operativo de una secuencia
reguladora de la transcripción activable por el regulador
transcripcional (a). De esta manera, el promotor responde a la unión
con el transactivador activando o reprimiendo la transcripción y
expresando los genes estructurales E1A y E1B. Sin embargo, la
capacidad del transactivador para unirse e interactuar con el
promotor se modifica dependiendo de si el factor de regulación está
unido a un ligando o agente inductor. En consecuencia, es posible
regular la transcripción de los genes E1A y, opcionalmente, E1B
mediante el control de la disponibilidad del agente inductor. En
una forma de realización preferida, el componente (c) del
polinucleótido A2 de la invención se encuentra bajo control de un
promotor híbrido compuesto por 6 secuencias de unión al factor de
transcripción GAL4 y la secuencia de la caja TATA del gen E1b
(P_{E1b}) de adenovirus (Lillie y Green, 1989, Nature,
338: 39-44).
El experto en la materia apreciará que la
orientación de los genes en el polinucleótido A2 que responden al
activador transcripcional no es esencial para el funcionamiento del
mismo. Así, en una forma preferida de realización, el segundo y
tercer casete se transcriben en sentido contrario. En otra forma
preferida de realización, las secuencias reguladoras de la
transcripción que controlan el segundo y tercer casete comparten el
mismo sitio de unión para el regulador transcripcional (a). En una
forma preferida de realización, los genes que codifican la
endonucleasa de restricción y las proteínas adenovirales se
encuentran bajo el control de un mismo promotor híbrido compuesto
por 6 secuencias de unión al factor de transcripción GAL4 y la
secuencia de la caja TATA del gen E1b (P_{E1b}) de adenovirus
(Lillie y Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
En una forma de realización aún más preferida, el segundo y tercer
casete del polinucléotido A2 de la invención se transcriben en
dirección opuesta y comparten las secuencias de unión al dominio de
unión de ADN del factor de transcripción GAL4.
En una realización concreta del polinucleótido
A2, el primer casete de expresión (a) comprende la secuencia que
codifica el regulador transcripcional
GAL4-hPR-p65, el segundo casete de
expresión (b) comprende la secuencia que codifica la endonucleasa
de restricción I-SceI bajo el control de uno o
varios sitios de unión de la proteína GAL4 y el tercer casete de
expresión (c) comprende las secuencias de los genes E1A y E1B bajo
el control de uno o varios sitios de unión de la proteína GAL4. En
una forma de realización aún más preferida, los promotores
regulables que dirigen la expresión de la secuencia que codifica la
endonucleasa de restricción I-SceI y de las
secuencias de los genes E1A y E1B comparten los mismos elementos de
respuesta para GAL4-hPR-p65.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polinucleótido (en adelante el polinucleótido B) o vector de
expresión que comprende una secuencia nucleotídica que comprende el
genoma de un adenovirus recombinante y que carece de, al menos, la
secuencia \psi de empaquetamiento y la secuencia que codifica la
proteína E1A o E1A/E1B, en donde dicha secuencia que comprende el
genoma de un adenovirus recombinante se encuentra flanqueada por
secuencias de reconocimiento específico para una endonucleasa de
restricción. La secuencia del genoma adenoviral puede obtenerse a
partir de un genoma de un adenovirus de cualquier variedad o
serotipo adenoviral humano (que haya sido aislado en humanos), por
ejemplo los serotipos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 11 (Ad11) ó 3 (Ad3).
Preferiblemente, las secuencias de
reconocimiento de la endonucleasa de restricción se encuentran
flanqueando el genoma adenoviral en posición 5' y 3' respecto a las
secuencias ITR de los extremos, donde se encuentran las regiones
adecuadas para la replicación y transcripción de dicho genoma. El
experto en la materia apreciará que las dianas de restricción
utilizadas en el polinucleótido B dependerán de la endonucleasa de
restricción codificada en los polinucleótidos A1 y A2 de la
invención. Así, las secuencias diana que flanquean el genoma
adenoviral son secuencias de reconocimiento específico para una
endonucleasa de restricción con las mismas características y
requerimientos indicados anteriormente al describir la endonucleasa
codificada por los polinucleótidos A1 y A2. Sin que esto suponga
limitación alguna, las secuencias pueden ser específicas para su
reconocimiento, entre otras, por la endonucleasa
I-SceI, PI-SceI,
I-PpoI, I-DmoI o
PI-TliI. En una realización particular, son
específicas para reconocimiento por la endonucleasa
I-SceI.
Adicionalmente, en otra forma preferida de
realización, el polinucleótido B de acuerdo a la invención
comprende secuencias que facilitan la inserción de dicho
polinucleótido en el genoma de la célula empaquetadora. En una
forma aún más preferida de realización, dicha secuencias
favorecedoras de la integración en el genoma son secuencias de
reconocimiento específico para una integrasa. Preferiblemente, la
secuencia diana de la integrasa se encuentra en posición 5'
respecto de la primera secuencia de reconocimiento para la
endonucleasa.
Secuencias diana de integrasas adecuadas para la
realización de la invención incluyen, sin limitación, la secuencia
diana de la recombinasa Cre del fago P1 (LoxP), la secuencia
diana de la recombinasa FLP de S. cerevisiae (Frt), la
secuencia diana de la integrasa del fago de Streptomyces
\PhiC31 (attB, attP), la secuencia diana de la recombinasa
TP901-1, y la secuencia diana de la recombinasa R4,
o la secuencia diana de la integrasa lambda. En una forma preferida
de realización, las secuencias diana de la invención incluyen
secuencias específicas para una integrasa de fagos que media la
recombinación unidireccional entre dos sitios o secuencias
específicas del ADN. Más particularmente, la integrasa pertenece a
la familia de integrasas de la serina, que se caracterizan porque
para la rotura de la cadena de ADN utilizan un residuo de serina
catalítico (Thorpe y Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95: 5505-5510). Los sitios de recombinación
reconocidos por estas integrasas (attB y attP) presentan
secuencias diferentes y son de menor longitud que las secuencias de
recombinación reconocidas por otras recombinasas. La integración
mediada por este tipo de integrasas es un proceso unidireccional y
estrictamente controlado por las secuencias de recombinación
(Thorpe et al., 2000, Mol. Microbiol., 38:
232-241). Otra característica importante es que la
recombinación entre attP y attB en el huésped, no
requiere de otros cofactores para operar. Estas integrasas se
utilizan actualmente en procedimientos de manipulación génica en
células de mamíferos y se ha comprobado que pueden mediar la
integración eficiente de material genético en sitios attP
introducidos exógenamente o en secuencias nativas que tienen una
identidad parcial con dichos sitios attP
(pseudo-attP). Sin que esto suponga limitación alguna, la
secuencia diana de integrasa puede ser una secuencia de
reconocimiento específico para la integrasa PhiC31,
TP901-1 o R4, entre otras. En una realización
particular, la secuencia diana de integrasa es attB,
correspondiente al sitio de anclaje en el ADN de bacterias
específico para la integrasa del fago PhiC31.
Esta integrasa puede mediar la recombinación
unidireccional entre esta secuencia attB y secuencias
pseudo-attP localizadas en el genoma de células humanas.
Así, en otra forma preferida de realización, el
polinucleótido B incluye, en dirección 5' a 3': opcionalmente, la
secuencia de reconocimiento para la integrasa; la primera secuencia
de reconocimiento para la endonucleasa; el genoma del adenovirus
(cuyos límites están definidos por los ITR del propio adenovirus);
y la segunda secuencia para la endonucleasa de restricción.
Los polinucleótidos de la invención pueden
encontrarse aislados o formando parte de vectores que permitan la
propagación de dichos polinucleótidos en células huésped adecuadas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector,
tal como un vector de expresión, que comprende el polinucleótido
A1, A2 o B de la invención.
Vectores adecuados para la inserción de los
polinucleótidos de la invención incluyen vectores de expresión en
procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados,
mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIE1, pCR1, RP4, fagos y vectores
"shuttle" tales como pSA3 and pAT28, vectores de expresión en
levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 micras,
plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y
similares, vectores de expresión en células de insectos tales como
los vectores de la serie pAC y de la serie pVL, vectores de
expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI,
pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares
y vectores de expresión en células eucariotas superiores bien
basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados a los
adenovirus, así como retrovirus y, en particular, lentivirus) así
como vectores no virales tales como pSilencer
4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo,
pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2,
pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1,
pleoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10,
pBPV-1, pML2d y pTDTl. Vectores particularmente
apropiados para la inserción de dichos polinucleótidos son vectores
de expresión en células eucariotas superiores, bien basados en
vectores virales (tales como virus adenoasociados, retrovirus,
lentivirus, herpesvirus, SV40 y alfavirus) o también basados en
vectores no virales (tales como plásmidos), capaces de ser
mantenidos y/o replicados y/o expresados en la célula hospedadora.
En una realización más particular dicho vector de expresión es
adecuado para transfectar o infectar células de mamífero ex
vivo, particularmente células humanas.
Típicamente, los vectores de expresión eucariota
incluyen, por ejemplo, uno o más genes clonados y bajo el control
transcripcional de secuencias reguladoras localizadas en 5' y 3',
así como un marcador de selección. Sin que ello suponga una
limitación, dentro de las secuencias de control se incluye un
promotor (incluyendo el sitio de inicio de la transcripción) capaz
de expresarse en células eucariotas, un sitio de unión a ribosomas,
una señal de procesamiento de RNA, un sitio de terminación de la
transcripción y/o una señal de poliadenilación.
Preferiblemente los vectores comprenden algún
gen reportero o de selección que confiere un fenotipo a la célula
que lo expresa y que facilita la identificación y/o selección de
aquellas células que han incorporado el vector tras haber sido
puestas en contacto con éste. Es preferente que el fenotipo de
selección no sea expresado en la célula eucariota previa a su
transfección o infección. Genes reporteros útiles en el contexto de
la presente invención incluyen lacZ, luciferasa, timidina
quinasa, GFP y similares. Genes de selección útiles en el contexto
de la presente invención incluyen por ejemplo el gen de resistencia
a la neomicina, que confiere resistencia al aminoglucósido G418, el
gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a
higromicina, el gen ODC, que confiere resistencia al inhibidor de
la ornitina descarboxilasa
(2-(difluorometil)-DL-ornitina:
DFMO), el gen de la dihidrofolato reductasa que confiere
resistencia a metrotexato, el gen de la
puromicina-N-acetil transferasa, que
confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere
resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que
confiere resistencia a
9-beta-D-xilofuranosil
adenina, el gen de la citosina deaminasa, que permite a las células
crecer en presencia de
N-(fosfonacetil)-L-aspartato,
el gen de la timidina quinasa, que permite a las células crecer en
presencia de aminopterina, el gen de Xantina-guanina
fosforribosiltransferasa, que permite a las células crecer en
presencia de xantina y ausencia de guanina, el gen trpB de
E. coli que permite a las células crecer en presencia de
indol en lugar de triptófano, el gen hisD de E. coli,
que permite a las células usar el histidinol en lugar de histidina.
El gen de selección se incorpora en un plásmido que puede incluir,
adicionalmente, un promotor adecuado para la expresión de dicho gen
en células eucariotas (por ejemplo, los promotores CMV o SV40), un
sitio optimizado de iniciación de la traducción (por ejemplo un
sitio que sigue las denominadas reglas de Kozak o un IRES), un sitio
de poliadenilación como, por ejemplo, el sitio de poliadenilación
del SV40 o de la fosfoglicerato quinasa, o intrones como, por
ejemplo, el intrón del gen de la beta-globulina.
Alternativamente es posible usar una combinación de gen reportero y
gen de selección simultáneamente en el mismo vector.
Los polinucleótidos de la invención y los
vectores de expresión que los contienen puede obtenerse por
técnicas convencionales de biología molecular e ingeniería genética
conocidas por cualquier persona del oficio, y que aparecen recogidas
en compendios y manuales tales como "Molecular Cloning: a
Laboratory manual", de J. Sambrook y D.W. Russel, Eds.,
Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press, tercera
edición, 2001 (ISBN 978-0879695774). Existen
igualmente sistemas comerciales que pueden facilitar la
construcción de vectores de expresión para los polinucleótidos de la
invención. Así por ejemplo, la construcción de un vector de
expresión para células de mamíferos que incluya el polinucleótido A
se vería facilitada si se utilizan sistemas como el sistema de
expresión inducible GeneSwitch^{TM} (Invitrogen, Carlsbad
CA92008 USA, Catalog nos. K1060-01 y
K1060-2), que permite la construcción de un vector
para la expresión de un gen de interés de manera inducible por
mifepristona; el sistema de expresión inducible RheoSwitch^{TM}
(New England Biolabs, Beverly, MA01915-5599 USA),
que permite la expresión de un gen de interés de manera inducible
por el ligando RLS1; o cualquier otro sistema comercial
equivalente.
Los polinucleótidos y vectores de la invención
pueden encontrarse formando parte de células hospedadoras que
sirven tanto como vehículo de propagación de los vectores como de
células empaquetadoras para la producción de adenovirus
recombinantes. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora que comprende un polinucleótido A1, A2 o B
de la invención o un vector de expresión que comprende cualquiera
de los polinucleótidos anteriormente citados. En el caso de que las
células se utilicen como células empaquetadoras para la producción
de adenovirus, éstas han de ser capaces de soportar la producción e
infección de adenovirus. Según esta realización, será una célula
eucariota adecuada cualquier célula permisiva para la infección y
replicación de adenovirus.
En una forma preferida de realización, la línea
celular será una línea celular estable. Sin que esto suponga
limitación alguna, las células hospedadoras pueden ser células HeLa,
A549, KB, HuH7, o cualquier otra célula eucariota capaz de soportar
el ciclo de vida del adenovirus. En el caso de que los polipéptidos
E1A o E1A/E1B sean aportados por la propia célula (en los casos en
los que se utilizan el polinucleótido A1 de la invención), su
expresión puede estar bajo el control de un promotor regulable a
través de un agente inductor, para un mayor control del inicio de
la expresión de los genes adenovirales incluidos en el
polinucleótido B y así limitar al máximo el riesgo de los posibles
efectos citotóxicos derivados del exceso de expresión proteínas
virales. En este caso no será adecuada una célula que exprese
dichas proteínas de modo constitutivo, por ejemplo una célula 293 o
PerC6.
En una realización particular, la célula
hospedadora es originaria de mamífero, preferentemente de primate y
especialmente de humano. En una forma preferida de realización, la
línea celular es una línea de carcinoma de pulmón. En una forma de
realización aún más preferida, las células hospedadoras son células
de la línea A549. Esta línea celular iniciada por Giard et
al. (1973, J. Natl. Cancer Inst., 51:
1417-1423) y posteriormente caracterizada en
profundidad por Lieber et al. (1976, Int. J. Cancer.,
17: 62-70), presenta una gran sensibilidad a la
infección por adenovirus lo que le confiere un elevado potencial
\hbox{como línea de producción de virus (Smith et al .,
1986, J. Clin. Microbiol ., 24:
265-268).}
En una forma preferida de realización, la
invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende el
polinucleótido A1 de la invención o un vector que comprende dicho
polinucleótido. En una forma de realización aún más preferida, la
célula comprende, adicionalmente una secuencia que codifica la
proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, una secuencia que
codifica la proteína adenoviral E1B.
En otra forma preferida de realización, la
invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende el
polinucleótido A2 de la invención o un vector que comprende dicho
polinucleótido.
En otra forma de realización, la invención se
relaciona con una célula hospedadora que comprende el
polinucleótido B de la invención o un vector que comprende dicho
polinucleótido.
En otra forma de realización, la invención se
relaciona con una célula hospedadora que comprende el
polinucleótido A1 y el polinucleótido B de la invención. En una
forma de realización aún más preferida, dicha célula comprende,
adicionalmente una secuencia que codifica la proteína adenoviral
E1A y, opcionalmente, una secuencia que codifica la proteína
adenoviral E1B.
En otra forma de realización, la invención se
relaciona con una célula hospedadora que comprende el
polinucleótido A2 y el polinucleótido B de la invención.
Tanto las células que comprenden los
polinucleótidos A1 y B de la invención como las células que
comprenden los polinucleótidos A2 y B son particularmente adecuados
para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de
alta capacidad por lo que tanto las células que comprenden los
polinucleótidos A1 y B de la invención como las células que
comprenden los polinucleótidos A2 y B pueden usarse en
procedimientos y sistemas para la producción y empaquetamiento de
dichos vectores. Sin embargo, particularmente útiles para la
producción de adenovirus son aquellas en las que los sitios diana
que flanquean el genoma adenoviral defectivo en el polinucleótido B
se corresponden con la endonucleasa de restricción codificada por
los polinucleótidos A1 y A2, ya que, de otra manera, la
endonucleasa de restricción codificada por los polinucleótidos A1 o
A2 no podrían actuar sobre el polinucleótido B liberando el genoma
adenoviral, lo cual es esencial para la replicación y transcripción
de dicho genoma.
Las células hospedadoras de la invención pueden
obtenerse bien mediante la introducción de los polinucleótidos o
vectores de la invención de forma transitoria o bien,
preferiblemente, mediante la introducción de dichos polinucléotidos
o vectores de forma estable. Para ello, es necesario poner en
contacto los vectores de la invención con las células hospedadoras
en condiciones adecuadas para la entrada del ADN en la célula. Los
vectores de la invención se introducen en las células objeto de
estudio usando cualquiera de los métodos de transfección conocidos
para el experto en la materia (véase secciones 9.1 a 9.5 en
Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols in Molecular
Biology", John Wiley & Sons Inc; ringbou edition
2003). En particular, las células se pueden transfectar mediante
co-precipitación de ADN con fosfato cálcico,
DEAE-dextrano, polibreon, electroporación,
microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección,
infección por retrovirus y transfección biolística.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona
con un método para la producción de células adecuadas para la
producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un
adenovirus de alta capacidad que comprende
- (i)
- transfectar una célula con el polinucleótido A1 de la invención y
- (ii)
- transfectar dicha célula con el polinucleótido B de la invención
en donde las etapas (i) y (ii)
pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea y
en donde se utilizan células que comprenden la secuencia que
codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína
adenoviral
E1B.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona
con un método para la producción de células adecuadas para la
producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un
adenovirus de alta capacidad que comprende
- (i)
- transfectar una célula con el polinucleótido A2 de la invención y
- (ii)
- transfectar dicha célula con el polinucleótido B de la invención
en donde las etapas (i) y (ii)
pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma
simultánea.
El experto en la materia apreciará que las
etapas (i) y (ii) en los métodos descritos anteriormente pueden
llevarse a cabo de forma que los polinucleótidos o vectores se
encuentren de forma transitoria en la célula o, alternativamente,
pueden llevarse a cabo de forma que se obtenga una expresión
estable de los polinucleótidos A1/A2 y/o B. En el caso de que se
desee obtener expresión estable de los vectores de la invención en
las células hospedadoras, es necesario incluir durante la etapa de
transfección o infección un gen que codifique para resistencia a un
determinado antibiótico, de forma que se puedan seleccionar
aquellas líneas celulares que han incorporado el ADN en el genoma
de aquellas líneas celulares en las que el ADN se encuentra en
posición extracromosómica. El gen que permite seleccionar las
células se puede aportar formando parte del mismo vector que
contiene la construcción objeto de la invención o,
alternativamente, se puede aportar separadamente mediante
co-transfección con un segundo plásmido que
contiene dicho gen de resistencia. En este último caso, el plásmido
que contiene la construcción de ADN se aporta a la mezcla de
transfección en un exceso molar con respecto al gen de resistencia
de forma que por cada evento de integración del gen de resistencia
exista una alta probabilidad de integración del gen que contiene el
promotor objeto de estudio. Preferiblemente, el plásmido que
contiene la construcción de ADN se aporta en un exceso de al menos
5 veces con respecto al vector que contiene el gen reportero de
resistencia. Preferiblemente, el gen de resistencia se incluye
dentro de los propios vectores de la invención. Los genes de
resistencia adecuados para la transfección han sido descritos con
anterioridad. Por tanto, en una forma preferida de realización, el
método de obtención de células que comprenden los polinucleótidos
A1 y B o A2 y B de acuerdo a la invención incluyen una etapa
adicional de selección en la que se seleccionan células que han
integrado de forma estable el primer y/o el segundo polinucleótido
en base a marcadores de selección presentes en los polinucleótidos
utilizados en las etapas (i) y (ii).
Por una parte, la transfección con un vector de
expresión que comprende el polinucleótido A2 ha permitido
seleccionar clones de células que integran el polinucleótido de
modo estable (mantenimiento de las células hasta 4 meses en
cultivo). Ventajosamente, se ha comprobado que la expresión de las
proteínas E1A/E1B y de la endonucleasa de restricción está
reprimida, manteniendo unos niveles basales de expresión que no
resultan perjudiciales para la célula, y que dicha expresión puede
ser inducida y activada mediante la adición al cultivo de una
cantidad adecuada de un agente inductor apropiado para la
construcción concreta empleada.
Adicionalmente, en el caso particular de que se
utilice una variante del polinucleótido B que comprende un sitio de
reconocimiento de una integrasa, es necesario llevar a cabo la etapa
(ii) mediante una co-transfección del vector de
expresión que comprende el polinucleótido B junto con un plásmido
que codifica y expresa una integrasa y que reconoce la secuencia de
reconocimiento de la integrasa, para permitir así la integración
del polinucleótido B en el genoma de la célula. Preferiblemente, en
el caso de que el sitio de reconocimiento de la integrasa sea el
sitio attB, la etapa (ii) implica una
co-transfección con un plásmido que codifica la
integrasa del fago PhiC31, lo que permite la integración del
polinucleótido B o del vector que contiene dicho polinucleótido en
el genoma de la célula mediante una recombinación entre la
secuencia attB y secuencias pseudo-attP presentes en
los cromosomas de células humanas. Esta recombinación e integración
unidireccional está mediada por la integrasa PhiC31. Para la
expresión de las diferentes regiones virales y la posterior
replicación del genoma viral presente en el polinucleótido B es
necesario que los extremos ITR del virus estén libres además de ser
necesaria también la presencia de las proteínas E1A/E1B virales.
Consecuentemente, las células generadas portan el genoma del
adenovirus defectivo pero este no se puede expresar ni replicar. Si
bien es posible que se produzcan también integraciones del
polinucleótido B de modo aleatorio, la integración en secuencias
pseudo-attP es mayoritaria y sin pérdidas de material
genético.
Los métodos descritos anteriormente permiten la
obtención de líneas celulares adecuadas para el empaquetamiento de
vectores adenovirales de alta capacidad. Así, en otro aspecto, la
invención se relaciona con células obtenidas mediante cualquiera de
los métodos descritos anteriormente. En particular, la invención
contempla células que comprenden los polinucleótidos A1 y B o los
polinucleótidos A2 y B, en donde dichos polinucleótidos pueden
encontrarse integrados de forma estable en el genoma de la célula o
pueden encontrarse de forma transitoria.
Las células empaquetadores obtenidas mediante la
introducción en líneas celulares de los polinucleótidos de la
invención o de los vectores que las comprenden pueden ser
utilizadas para la generación de vectores adenovirales de alta
capacidad mediante la introducción en dichas células de genomas
adenovirales que comprenden el gen de interés, bien mediante
transfección con polinucleótidos que comprenden el genoma
adenoviral o bien mediante infección con adenovirus recombinantes
que comprenden dicho gen. Tras la infección/transfección con el
adenovirus/polinucleótido que comprende el genoma adenoviral y que
comprende a su vez el gen de interés, y la puesta en contacto de
las células con el agente que promueve la expresión de los genes
incluidos en el polinucleótido A1 o A2, se comienza a producir en la
célula el regulador transcripcional que, a su vez, activa la
transcripción del gen que codifica la endonucleasa de restricción.
Ésta, a su vez, actúa sobre los sitios diana que flanquean el
genoma adenoviral deficiente comprendido en el polinucleótido B,
provocando la escisión de éste del genoma celular, lo que es
condición necesaria para la posterior transcripción de los genes
adenovirales que forman parte de dicho genoma. La transcripción de
los genes adenovirales a partir del polinucleótido B requiere
también de la expresión de los genes tempranos E1A y E1B que se
encuentran codificados bien por el polinucleótido A2, en cuyo caso
responden a la activación del regulador transcripcional, o bien en
la propia célula empaquetadora, también bajo el control del
regulador transcripcional.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un sistema para la producción de adenovirus de alta capacidad que
comprende
- (a)
- una célula de acuerdo a la invención y
- (b)
- un adenovirus de alta capacidad.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la producción y empaquetamiento de vectores
adenovirales de alta capacidad, que comprende las etapas de:
- (a)
- transfectar o infectar una célula hospedadora con un polinucleótido que comprende el genoma del adenovirus de alta capacidad que se desea multiplicar y empaquetar o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (b)
- cultivar las células transfectadas/infectadas en condiciones que permitan la replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad, y
- (c)
- recuperar las partículas virales del adenovirus de alta capacidad y, opcionalmente,
- (d)
- repetir las etapas (a) a (c) en donde las partículas virales de alta capacidad obtenidas en la etapa (c) se utilizan para infección en la etapa (a) del siguiente ciclo,
en donde la célula hospedadora
usada en la etapa (a) se selecciona del grupo
de
- (i)
- una célula que comprende el polinucleótido A1 de la invención y la secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el polinucleótido B de la invención o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (ii)
- una célula que comprende el polinucleótido A2 de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el polinucleótido B de la invención o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (iii)
- una célula que comprende el polinucleótido B de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el polinucleótido A1 de la invención y en donde la célula comprende una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B,
- (iv)
- una célula que comprende el polinucleótido B de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de una etapa de transfección o se lleva a cabo simultáneamente con el polinucleótido A2 de la invención o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (v)
- una célula que comprende el polinucleótido A1 de la invención, el polinucleótido B de la invención y una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B, y
- (vi)
- una célula que comprende los polinucleótido A2 y B de la invención.
La etapa (a) del método para la producción y
empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad
comprende la puesta en contacto de una célula empaquetadora con un
adenovirus de alta capacidad o con un polinucleótido o vector que
comprende el genoma de dicho adenovirus.
Por "adenovirus de alta capacidad" se
entiende, según la invención, adenovirus recombinantes de los
denominados dependientes de auxiliar o gutless,
caracterizados porque carecen de todos los genes del genoma
adenoviral excepto las regiones ITR 5' y 3' y la región de
empaquetamiento \psi, tal y como se ha descrito, por ejemplo, por
Alba et al. (2005, Gene Therapy,
12:S18-S27). Estos adenovirus admiten secuencias
heterólogas de hasta 36 kb puesto que carecen de secuencias propias
del genoma adenoviral. Genes heterólogos que pueden incorporarse en
los vectores gutless de acuerdo con los métodos de la
invención incluyen los genes que codifican eritropoietina (EPO),
leptinas, hormona liberadora de hormona adrenocorticotropa (CRH),
hormona liberadora de hormona somatotropa (GHRH), hormona
liberadora de gonadotrofinas (GnRH), hormona liberadora de
tirotropina (TRH), hormona liberadora de prolactina (PRH), hormona
liberadora de melatonina (MRH), hormona inhibidora de prolactina
(PIH), somatostatina, hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona
somatotropa o del crecimiento (GH), hormona luteinizante (LH),
hormona foliculoestimulante (FSH), tirotropina (TSH u hormona
estimulante del tiroides), prolactina, oxitocina, hormona
antidiurética (ADH o vasopresina), melatonina, factor inhibidor
Mülleriano, calcitonina, hormona paratifoidea, gastrina,
colecistoquinina (CCK), secretina, PBGD, factor de crecimiento de
tipo insulina tipo I (IGF-I), factor de crecimiento
de tipo insulina tipo II (IGF-II), péptido
natriurético atrial (PNA), gonadotrofina coriónica humana (GCH),
insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático (PP),
leptina, neuropéptido Y, renina, angiotensina I, angiotensina II,
factor VIII, factor IX, factor tisular, factor VII, factor X,
trombina, factor V, factor XI, factor XIII, interleukina 1
(IL-1), interleuquina 2 (IL-2),
factor de necrosis tumoral Alfa (TNF-\alpha),
interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8
(IL-8 y chemoquinas), interleuquina 12
(IL-12), interleuquina 16 (IL-16),
interleuquina 15 (IL-15), interleuquina 24
(IL-24), interferones alfa, beta, gamma, CD3,
ICAM-1, LFA-1,
LFA-3, quimioquinas incluyendo RANTES 1\alpha,
MIP-1\alpha, MIP-1\beta, factor
de crecimento neuronal (NGF), factor de crecimiento derivado de las
plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta
(TGF-beta), proteínas morfogenéticas del hueso
(BMPs), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF y KGF),
factor de crecimiento epidérmico (EGF y relacionados), factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de
colonias de granulocitos (G-CSF), factor de
crecimiento glial (GDNF), factor de crecimiento de queratinocitos,
factor de crecimiento endotelial, antitripsina 1 alfa, factor de
necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocito y
macrófagos (GM-CSF), cardiotrofina 1
(CT-1), oncostatina M (OSM), anfiregulina (AR),
ciclosporina, fibrinógeno, lactoferrina, activador de plasminógeno
tipo tisular (tPA), quimotripsina, inmunoglobinas, hirudina,
superóxido dismutasa, imiglucerasa,
\beta-Glucocerebrosidasa,
glucosidasa-\alpha,
\alpha-L-iduronidasa,
iduronato-2-sulfatasa, galsulfasa,
\alpha-galactosidasa A humana, inhibidor de la
proteinasa \alpha-1, lactasa, enzimas
pancreáticas (lipasa, amilasa, proteasa), adenosina deaminasa,
inmunoglobulinas, albúmina, toxinas botulínicas de tipo A y B,
colagenasa, deoxirribonucleasa I humana, hialouronidasa, papaina,
L-asparaginasa, lepirudin, estreptoquinasa,
péptidos inhibidores del factor de transformación celular beta
(TGF-\beta) tales como los descritos en
WO0331155, WO200519244 y WO0393293, cuyo contenido se incorpora en
la presente invención por referencia, casetes de expresión
apropiados para la transcripción de moléculas de RNA de
interferencia (shRNA, siRNA, miRNA, RNA de ribonucleoproteínas U1
modificadas). Además de dichos genes heterólogos, los adenovirus
gutless utilizados en la invención pueden contener regiones
de relleno o stuffer, tales como la secuencias de relleno
derivadas del genoma del fago lambda descritas por Parks et
al. (1999, J. Virol., 73:8027-8034) o el
ADN de relleno que aparece en pSTK120 según ha sido descrito por
Sandig et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
97:1002-1007). Estas regiones contienen
habitualmente secuencias presentes en el genoma humano y capaces de
aumentar la expresión de los genes heterólogos con respecto a los
adenovirus controles que en lugar de dicho ADN de relleno humano
comprenden el fragmento de 22 kb del fago lambda descrito en Parks
et al. (1999, J. Virol.,
73:8027-8034). La longitud total del ADN de relleno
humano puede variar pero oscila entre 20 y 30 kb, preferiblemente de
20 a 25 kb o, aún más preferiblemente, de 21 a 23 kb, por ejemplo
22 kb. El número de secuencias que actúan en cis en dicho
ADN de relleno puede variar entre 2, 3, 4 o más e incluye, sin
limitación, el dominio repetido alfoide de 16.2 kb (descrito en
Smith et al., 1995, Mol. Cell. Biol.,
15:5165-5172); regiones de adhesión a la matriz
(MAR) como por ejemplo el fragmento de 4.2 kb que contiene el
extremo izquierdo del adenovirus de tipo 6 o dos copias de la
región de adhesión a la matriz de la inmunoglobulina \kappa (según
fue descrito por Betz et al., 1994, Cell,
77:239-248); una región de control de hepatocitos
(HCR) tales como el fragmento de 1.2 kb que comprende dicho HCR
(según fue descrito por Miao et al., 2000, Molecular
Therapy, 1:522-532); u otra región de adhesión a
matriz tales como el la región de 2.8 kb de la lisozima de pollo
(según ha sido descrito por Phi-Van et al.,
1990, Mol. Cell. Biol. 10:2302-2307, región
de adhesión a matriz de la región 5' del interferón \beta (según
ha sido descrito por Bode et al. 1992, Science,
10:195-197) u otras secuencias humanas no
codificantes tales como secuencias teloméricas o centroméricas.
La puesta en contacto de las células
hospedadoras con el polinucleótido que comprende el genoma
adenoviral se lleva a cabo usando técnicas conocidas para el experto
en la materia, tales como transfección de dicho polinucleótido o de
un vector que lo comprende mediante transfección mediante
co-precipitación de ADN con fosfato cálcico,
DEAE-dextrano, polibreon, electroporación,
microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección,
infección por retrovirus y transfección biolística.
Alternativamente, es posible poner en contacto las células con el
adenovirus que se desea amplificar, en cuyo caso la propia
capacidad del adenovirus de infectar células permite la
introducción en la célula de dicho genoma.
Por "célula empaquetadora" se entiende
cualquiera de las células descritas en la presente invención y que
contienen, al menos el polinucleótido A1/A2 o el polinucleótido B
de la invención. El experto en la materia apreciará que es posible
el uso de distintas células empaquetadoras. Sin embargo,
dependiendo de la presencia o no en la célula empaquetadora de uno
o más de los polinucleótidos de la invención, la etapa (a) debe ir
precedida de o llevarse a cabo simultáneamente con una etapa de
transfección en la que las células se ponen en contacto con aquellos
polinucleótidos de la invención que no aparezcan en las células
empaquetadoras y que son necesarias para aportar los elementos
esenciales para la replicación del genoma adenoviral así como para
la producción en las células de los polipéptidos necesarios para el
ensamblaje de los adenovirus. Así, es posible utilizar como célula
empaquetadora una célula que comprenda el polinucleótido A1 de la
invención y una secuencia que codifique la proteína adenoviral E1A
y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B. Sin embargo, el uso
de esta célula empaquetadora requiere de una etapa previa o
simultánea a la etapa (a) consistente en la transfección de dicha
célula con el polinucleótido B de la invención o un vector de
expresión que comprende dicho polinucleótido.
En el caso de que se utilice una célula que
comprenda el polinucleótido A2 de la invención, la etapa (a) debe
ir precedida de o llevarse a cabo de forma simultánea con una etapa
de transfección con el polinucleótido B de la invención o con un
vector de expresión que comprende dicho polinucleótido.
En el caso de que se utilice como célula
empaquetadora una célula que comprende el polinucleótido B de la
invención, la etapa (a) debe ir precedida de o llevarse a cabo de
forma simultánea con una etapa de transfección con el polinucleótido
A1 de la invención y, en cuyo caso, la célula debe comprender,
adicionalmente, una secuencia que codifica la proteína adenoviral
E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B.
En el caso de que se utilice una célula que
comprende el polinucleótido B de la invención, la etapa (a) debe ir
precedida de o llevarse a cabo de forma simultánea con una etapa de
transfección con el polinucleótido A2 de la invención o con un
vector de expresión que comprende dicho polinucleótido.
También es posible utilizar una célula que
comprenda el polinucleótido A1 de la invención, el polinucleótido B
de la invención y una secuencia que codifique la proteína
adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B o,
alternativamente, una célula que comprenda los polinucleótidos A2 y
B de la invención.
\newpage
La etapa (b) del método de la invención
comprende el mantener las células transfectadas/infectadas
obtenidas en la etapa (a) en condiciones que permitan la
replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad. Para
ello, es necesario que dichas condiciones permitan la expresión del
regulador transcripcional codificado por el polinucleótido A1 o A2,
de forma que éste actúe sobre sus sitios de unión en la región
reguladora del gen de la endonucleasa presente en el polinucleótido
A1 y A2 y sobre sus sitios de unión en la región reguladora de los
genes adenovirales E1A y E1B, presentes en el polinucleótido A2.
Para ello, en los casos en los que el regulador transcripcional
codificado por el polinucleótido A1 o A2 sea un regulador activable,
la etapa (b) implica poner en contacto las células con el agente
capaz de activar el regulador transcripcional. En una forma
preferida de realización, el regulador transcripcional codificado
por el polinucleótido A1 o A2 es
GAL4-hPR-p65, según se ha descrito
anteriormente, en cuyo caso, el agente inductor es mifepristona.
La etapa (b) se lleva a cabo durante el tiempo
necesario para que la concentración de partículas virales sea lo
suficientemente alta, según se determina mediante medios estándar
tales como el método Resource Q basado en HPLC, según ha sido
descrito por Shabram et al., (1997, Hum. Gene Ther.,
8:453-465), o de modo indirecto mediante inspección
visual del efecto citopático en las células. Opcionalmente, el
cultivo de las células puede incluir la adición de medio de cultivo
fresco.
En la etapa (c), los adenovirus generados
durante la etapa (b) son recuperados del cultivo celular. Para ello
será necesario separar las células del medio de cultivo por
cualquier método conocido por los expertos en la técnica
(tripsinización y centrifugación o filtración), romper las células
en solución inerte (ciclos de congelación/descongelación,
homogenización, sonicación, cavitación, uso de detergentes y
similares) y purificar las partículas de adenovirus por métodos
conocidos como pueden ser la ultracentrifugación en gradiente de
CsCl o mediante distintos tipos de cromatografia tales como una
combinación de cromatografia de intercambio iónico y cromatografia
de afinidad con quelatos metálicos (Huyghe et al., 1996,
Hum. Gene Ther., 6:1403-1416), una
combinación de cromatografia de intercambio iónico y cromatografía
de fraccionamiento en gel (WO07059473), cromatografía en
dietilaminoetil (DEAE) celulosa (Haruna et al., 1961,
Virology 13, 264-267), cromatografia en
hidroxiapatito (US2002/0064860) y cromatografia en otras resinas
tales como geles blandos (agarosa), polímeros macroporosos basados
en polímeros sintéticos que incluyen cromatografia de permisión
(fractogel) y materiales basados en un gel blando en una cápsula
dura (por ejemplo, Ceramic HyperD® F) (Rodrigues, 1997, J.
Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl.,
699:47-61).
La etapa (d), que es opcional, consiste en
repetir las etapas de (a) a (c) una o varias veces. Para ello, en
cada etapa (a) del ciclo, se utiliza como material de partida
partículas adenovirales obtenidas en la etapa (c) del ciclo
anterior. De esta manera se puede repetir el proceso de la
invención sucesivas veces obteniendo un número mayor de partículas
adenovirales en cada ciclo.
La invención se ilustra a continuación en base a
los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo ilustrativo y no
limitativo del alcance de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En la presente realización, el plásmido
pGal4-2RU-El-SceI,
que contiene el polinucleótido A2 según se define en la invención
(Fig. 1A), se ha diseñado específicamente para el control, a nivel
transcripcional, de la expresión de los genes adenovirales E1a y
E1b. Dentro de esta construcción, y bajo el mismo sistema de
control transcripcional, se ha incluido el gen que codifica la
endonucleasa de restricción I-SceI. El regulador
transcripcional que controla la expresión de los genes E1a, E1b y
I-SceI, se expresa de manera constitutiva a partir
de una secuencia nucleotídica incluida dentro del mismo
polinucleótido A2.
El mecanismo de regulación de la transcripción,
incluido en la presente invención, está mediado por el sistema de
la antiprogestina mifepristona (Burcin et al., 1999, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 96: 355-360). Dicha
regulación tiene lugar a través de una proteína de fusión
insensible a hormonas endógenas humanas pero activa en presencia de
antiprogestinas sintéticas (RU486) a dosis suficientemente bajas
como para evitar efectos secundarios en humanos.
Como base de la construcción del plásmido
pGal4-2RU-E1-SceI se
ha utilizado el sistema comercial GeneSwitch^{TM}
(Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos.
K1060-01 y K1060-2). Este sistema
proporciona todos los componentes genéticos necesarios para el
diseño del plásmido que incluye el polinucleótido A2.
El primer componente del sistema
GeneSwitch^{TM} es el vector pSwitch (Fig. 2A), el cual
codifica la proteína de fusión
GAL4-hPR-p65 que actúa como
activador transcripcional. La proteína se divide en un dominio de
unión a ADN (DBD) de la proteína GAL4 de Saccharomyces
cerevisiae (Laughon y Gesteland, 1984, Mol. Cell Biol.,
4: 260-267; Marmorstein, et al., 1992,
Nature, 356: 408-414), un dominio truncado de
unión a ligando del receptor de progesterona humano
(hPR-LBD) (Kastner, et al., 1990, Embo
J., 9: 1603-1614; Wang, et al., 1994,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8180-8184) y
el dominio de activación de la proteína
NF-\kappaB humana (AD) (Burcin, et al.,
1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:
355-360; Deloukas y van Loon, 1993, Hum. Mol.
Genet., 2: 1895-1900). La expresión de la
proteína reguladora se encuentra bajo el control de un promotor
híbrido derivado de la unión de las secuencias de activación de GAL4
de Saccharomyces cerevisiae (UAS: upstream activating
sequences) (Giniger et al., 1985, Cell, 40:
767-774; Wang et al., 1994, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91: 8180-8184) y el promotor
mínimo del gen timidina quinada (P_{tk}) del Virus Herpes Simplex.
La región de activación del promotor incluye 4 copias de la
secuencia 5'-(T/C)GGAGTACTGTCCTCCG-3' (SEQ
ID NO:1). Cada una de ellas sirve como sitio de unión para dos
moléculas del dominio de unión a ADN del factor de transcripción
GAL4 (Marmorstein, et al., 1992, Nature, 356:
408-414).
408-414).
El segundo componente del sistema
GeneSwitch^{TM} es el plásmido
pGene/V5-HisA (Fig. 2B), que controla la expresión
del gen de interés. En este caso el promotor híbrido que controla
la transcripción se compone de 6 secuencias de unión del factor de
transcripción GAL4 y la secuencia de la Caja TATA del gen E1b
(P_{E1b}) de adenovirus (Lillie y Green, 1989, Nature,
338: 39-44).
El sistema en ausencia de mifepristona va a
expresar constitutivamente la proteína de fusión reguladora
GAL4-hPR-p65 a partir del promotor
mínimo de la timidina quinasa. Esta proteína se localiza
predominantemente en el núcleo y en una forma inactiva. En el
momento de la adición del inductor mifepristona, o su análogo RU486,
éste se une con alta afinidad a la región hPR-LBD
de GAL4-hPR-p65, provocando un
cambio conformacional que resulta en la dimerización de la proteína
y su conversión a la forma activa. Estos homodímeros interaccionan
con las secuencias de unión de GAL4 (UAS) localizadas en los
plásmidos pGene/V5-HisA y pSwitch, activando así la
transcripción del gen de interés y del gen que codifica el propio
factor de transcripción (Fig. 2C).
En base a la idea planteada en la presente
invención de poner la región E1 de Ad5 y el gen de la endonucleasa
I-SceI bajo el control del sistema inducible
GeneSwitch^{TM}, inicialmente se diseñaron distintas
combinaciones del sistema de regulación, la secuencia del genoma
adenoviral entre las posiciones 505 y 3511
(Ad5(505-3511)) (GenBank: AC000008) y el gen
codificante de I-SceI. En estas combinaciones el
mecanismo de regulación se basa en la utilización de uno o dos
plásmidos y en los que los genes E1 y el gen I-SceI quedan
bajo el control de un único promotor o bien bajo el control de
promotores diferentes dispuestos, a su vez, en la misma o distinta
orientación (Fig. 3A). Cada una de estas combinaciones se ensayó
para determinar la capacidad de regulación de la expresión de la
región E1 y el gen I-SceI y su capacidad de
integración estable dentro del genoma celular. De todas ellas, la
construcción
pGa14-2RU-E1-SceI
fue considerada la más adecuada para su aplicación en el diseño de
un sistema de producción de adenovirus de alta capacidad
independiente de helper.
Las cepas bacterianas utilizadas para la
propagación de las construcciones descritas a continuación fueron
Escherichia coli DH5\alpha y E. coli STBL2. El
crecimiento se llevó a cabo en medio Luria Bertani (LB)
(Sigma-Aldrich, 28760 Madrid, España) suplementado
con Ampicilina (100 \mug/ml) (Sigma-Aldrich) como
medio de selección y a 37ºC, en el caso de la cepa DH5\alpha, y
30ºC para STBL2. Las bacterias fueron transformadas siguiendo el
protocolo del CaCl_{2} descrito inicialmente por Hanahan (1983,
J. Mol. Biol., 166: 557-580). Para ello se
mezclaron 10-20 ng de ADN plasmídico con 100 \mul
de células competentes y se mantuvo en hielo durante 30 min. A
continuación, para aumentar la eficiencia del proceso, la mezcla se
incubó a 42ºC durante 1 minuto e inmediatamente se transfirió a
hielo en donde se incubó otros 2 min. Por último se añadió 1 ml de
medio LB y se incubó durante 1 h a 37ºC y en
agitación.
agitación.
Para la purificación de plásmidos, así como para
la purificación de fragmentos de ADN producto de la digestión con
enzimas de restricción tras su separación en geles de agarosa, se
utilizaron los sistemas FX microplasmid prep kit (GE
Healthcare Europe, 8290 Barcelona, España) y QIAquick Gel
extraction kit (Qiagen, Valencia CA91355, USA) respectivamente,
siguiendo las recomendaciones del fabricante.
En el clonaje de fragmentos de ADN, las
reacciones de ligación se diseñaron para un volumen final de 20
\mul con 1 U de T4-ADN ligasa (New England
Biolabs, Beverly MA01915-5599, USA) y 2 \mul de
tampón de reacción 10X (New England Biolabs). En el caso de
fragmentos con extremos romos, las reacciones se diseñaron para un
volumen final de 20 \mul con 1 U de T4-ADN ligasa
(New England Biolabs), 2 \mu tampón de reacción 10X (New England
Biolabs) y 2 \mul de PEG 4000 al 50%. En cualquier caso, todas
las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y
se inactivaron a 65ºC/10 minutos previamente a su introducción en
la cepa de E. coli correspondiente. Los clones recombinantes
se seleccionaron en base al marcador de resistencia codificado por
el vector y se confirmaron por digestión con endonucleasas de
restricción y electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Todas las reacciones de PCR diseñadas en el
proceso de síntesis del plásmido
pGal4-2RU-E1-SceI se
llevaron a cabo en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa
(BioTaq, Bioline, Londres NW2 6EW, UK), tampón de PCR
(Bioline), MgCl_{2} 4 mM, 0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada
cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta un volumen final de
50 \mul. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1
ciclo de desnaturalización de 4 minutos a 95ºC; 29 ciclos de 50
segundos a 94ºC de desnaturalización, 40 segundos a 50ºC de
hibridación con el cebador y 40 segundos a 72ºC de elongación; 1
ciclo de 5 minutos a 72ºC de elongación final. Para el análisis de
los productos de amplificación las muestras se mezclaron con 1.5
\mul de la solución de carga (azul de bromofenol 0.25% en agua
destilada; Glicerol 40%; EDTA 100 mM) y se analizaron por
electroforesis en geles de agarosa (1%) con tampón TAE 1X (Tris Base
40 mM; ácido acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizando
el ADN mediante tinción con bromuro de etidio (0.5 \mug/ml).
\newpage
El plásmido de regulación
pGal4-2RU-E1-SceI se
diseñó en cinco pasos descritos a continuación:
El plásmido pSwitch fue linealizado con los
enzimas de restricción SbfI (posición 38) y BamHI
(posición 2484) para incluir el LinkerRU2. Éste se sintetizó
previamente a partir de los cebadores
\hskip0,1cm
En la reacción de anillamiento se mezclaron 10
\mul de cada cebador a una concentración 50 mM en solución tampón
(Tris-HCl 50 mM pH8.0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM). Las
condiciones de reacción fueron las siguientes: 95ºC durante 2
minutos y 52ºC durante 10 minutos. Seguidamente el fragmento
LinkerRU2 se fosforiló con el enzima T4 polinucleótido kinasa
siguiendo las recomendaciones del fabricante (New England Biolabs).
La reacción se incubó 30 minutos a 37ºC y se inactivó a 65ºC durante
15 minutos. A continuación se procedió a la ligación del LinkerRU2
con el vector pSwitch y su transformación en E. coli
DH5\alpha. La construcción resultante se denominó
pSwitch-LinkerRU2.
Seguidamente, la digestión del vector
pSwitch-LinkerRU2 con los enzimas FspI
(posición 6623 de pSwitch) y ApaI (posición 2721 de pSwitch)
liberó el LinkerRU2 arrastrando parte de las secuencias adyacentes
del vector pSwitch. Este fragmento se subclonó en el vector
pGeneV5-HisA digerido previamente con estos mismos
enzimas. El vector resultante se denominó
pGene-LinkerRU2 y será la base de la construcción
del vector pGa14-2RU-E
1-SceI.
A partir del vector pGL3-Basic
(Groskreutz y Schenborn, 1997, Methods Mol. Biol., 63:
11-30) y mediante digestión con BamHI y
XbaI se liberó un fragmento de 262 pb que incluía la señal
de poliadenilación del SV40 (SV40pA). Esta secuencia se clonó en el
plásmido pBluescript II KS(+) (Stratagene, La Jolla CA92037, USA),
digerido previamente con estos mismos enzimas, para dar lugar al
plásmido pBS-SV40pA.
Por su parte, la digestión secuencial del
plásmido pGeneV5-HisA con los enzima SalI
(posición 151) y PvuII (posición 895) permitió el aislamiento
de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina
(BGHpA). Este fragmento de 744 pb se clonó en el plásmido
pBS-SV40pA linealizado previamente con SalI y
BamHI y cuyo extremo BamHI previamente se hizo romo
con Klenow siguiendo las recomendaciones del fabricante
(DNA Polymerase I, Large (Klenow) fragment; New England
Biolabs). De este modo se obtiene un inserto que comprende las
señales de poliadenilación BGH y SV40 unidas por una secuencia
diana para el enzima de restricción BamHI.
Seguidamente, se procedió a la síntesis del
plásmido pGeneLinkerRU2-2pA. Para ello, la
digestión del vector
pBS-BGHpA-SV40pA con XbaI
liberó un fragmento de 623 pb que incluye las dos secuencias de
poliadenilación y que se clon dentro de la diana única XbaI
presente en el LinkerRU2 del plásmido
pGene-LinkerRU2. La orientación correcta del
inserto
(5'-SV40pA-BGHpA-3')
se confirmó por restricción con PmeI.
La región E1 del Ad5 se amplificó por PCR con
los cebadores:
El producto resultante de 3 kb se clon en el
vector específico para productos de PCR pGemT-Easy
(Promega Biotech Ibérica, 28108 Madrid, España). Mediante digestión
con EcoRI se purificó dicha región E1 y se subclonó dentro de
la diana EcoRI del vector pGeneLinkerRU2-2pA
y que se localiza "corriente abajo" de la señal de
poliadenilación BGHpA. El plásmido resultante se denominó
pGeneLinkerRU2-2pA-E1.
La digestión del vector pSwitch con los enzimas
de restricción SbfI (posición 38) y BamHI (posición
2485) aisló las secuencias de unión al regulador transcripcional
(región UAS), el promotor mínimo de la proteína quinasa (Ptk) y el
gen codificante del activador transcripcional
GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD.
Este fragmento SbfI-BamHI, de 2.4 kb, se clonó en el
plásmido pGeneLinkerRU2-2pA digerido previamente con
estos mismos enzimas y provocando la pérdida de la secuencia de
poliadenilación SV40pA. La construcción resultante recibió el
nombre de
pGeneLinkerRU2-Gal4-BGHpA-E1.
Para recuperar esta segunda señal de
poliadenilación, la secuencia SV40pA se purificó a partir de la
construcción inicial pGeneLinkerRU2-2pA por
digestión con BamHI. El fragmento de 0.2 kb se clonó dentro
de la diana única BamHI del plásmido
pGeneLinkerRU2-Gal4-BGHpA-E1.
El gen que codifica la endonucleasa
I-SceI se obtuvo mediante amplificación por PCR con
los cebadores:
a partir del plásmido
pI-SceI (Choulika, et al., 1994, C. R.
Acad. Sci. III, 317: 1013-1019). Tras su
clonaje en pGemT-Easy se liberó mediante digestión
con el enzima de restricción NotI. Los extremos del
fragmento purificado se hicieron romos con el fragmento
Klenow siguiendo las recomendaciones del fabricante (New
England Biolabs) y a continuación se sometió a una segunda
digestión con el enzima de restricción SpeI. Por último el
fragmento purificado, de 0.8 kb, se clonó entre las dianas
SpeI (posición 478) y NotI (posición 522, tratada con
Klenow) del vector pGeneV5-HisA. El
tratamiento con Klenow conlleva la pérdida de la diana
NotI. El plásmido resultante se denominó
pGene-ISceI.
La digestión del plásmido
pGene-ISceI con XbaI liberó un fragmento de
1.2 kb que incluye el gen de la endonucleasa I-SceI
bajo el control transcripcional del promotor mínimo del gen E1b de
adenovirus (P_{E1B}). El fragmento se subclonó dentro de la diana
compatible SpeI localizada, dentro del plásmido
pGeneLinkerRU2-Ga14-2pA-E1,
entre la secuencia de poliadenilación BGH y la región E1. La
construcción resultante se denominó
pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI-E1.
La región del vector
pGeneV5-HisA que engloba las secuencias reguladoras
de unión al activador transcripcional (UAS) y el promotor mínimo
P_{E1B} se obtuvo por amplificación por PCR con los
cebadores:
y se subclonó en el vector
pGemT-Easy. Posteriormente, el inserto se liberó por
digestión con NotI y se subclonó en la construcción
pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI-E1,
dentro de la diana NotI localizada entre el promotor mínimo
P_{E1B} de I-SceI y la . región E1 del
adenovirus. La construcción resultante se denominó
pGal4-2RU-SceI-E1
(Fig.
3B).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Dentro de la secuencia que engloba el genoma
adenoviral se ha delecionado la secuencia de empaquetamiento
(\psi) y la región correspondiente a los genes tempranos E1a y
E1b para un mayor control de la expresión del resto de los genes
virales. Asimismo, la secuencia adenoviral se encuentra delimitada
en ambos extremos por secuencias de reconocimiento para la
endonucleasa de restricción I-SceI de
Saccharomyces cerevisiae (Anglana y Bacchetti, 1999,
Nucleic Acids Res., 27: 4276-4281) la cual,
debido al tamaño de su secuencia diana (TAGGGATAACAGGGTAA -
SEQ ID NO:8) y su alta especificidad, no reconoce secuencias dentro del genoma de la célula a transfectar. La inserción de estas secuencias facilita la liberación del genoma viral sólo en presencia de la proteína I-SceI. Esta digestión deja libres los extremos ITR del adenovirus, necesarios para la correcta transcripción y replicación del ADN
viral.
SEQ ID NO:8) y su alta especificidad, no reconoce secuencias dentro del genoma de la célula a transfectar. La inserción de estas secuencias facilita la liberación del genoma viral sólo en presencia de la proteína I-SceI. Esta digestión deja libres los extremos ITR del adenovirus, necesarios para la correcta transcripción y replicación del ADN
viral.
Por último, en el extremo 5' de la construcción
se ha incluido una secuencia attB que promueve la
integración del plásmido dentro del genoma celular, proceso mediado
por la recombinasa PhiC31 del fago de Streptomyces. Este
enzima posee un gran potencial como sistema de integración de ADN
exógeno en células de mamífero ya que da lugar a una reacción
específica y unidireccional y posee unas frecuencias netas de
integración superiores a las observadas con otras recombinasas
(Thyagarajan et al., 2001, Mol. Cell. Biol., 21:
3926-3934). Las secuencias de reconocimiento para la
integrasa PhiC31 se denominan attB y attP y son
diferentes en su secuencia. Tras la reacción de integración, las
secuencias att resultantes difieren de las secuencias
attB y attP originales, bloqueando posibles
reacciones de recombinación secundarias. En células humanas, PhiC31
es capaz de mediar eventos de recombinación en puntos del genoma en
los que existen secuencias con identidad parcial a attP y
que se denominan pseudo-attP (Fig. 4). Según Thyagarajan
et al. (2001, supra) el número total de secuencias
pseudo-attP podría estar entre 10^{2} y 10^{3} lo que
hace que la frecuencia de integración sea de 2 a 3 veces mayor que
en el caso de las integraciones mediadas por recombinación homóloga,
e incluso de 10 a 100 veces mayor que la integración mediada por
otras recombinasas específicas como la recombinasa Cre.
Las cepas bacterianas de E. coli
utilizadas para la propagación de las construcciones descritas a
continuación fueron DH5\alpha, STBL2 y BJ5183. Las bacterias
fueron transformadas siguiendo el protocolo del CaCl_{2} descrito
en el Ejemplo 1. El crecimiento se llevó a cabo en medio Luria
Bertani (LB) (Sigma-Aldrich) suplementado con
Ampicilina (100 \mug/ml) (Sigma-Aldrich) como
medio de selección y a 37ºC, en el caso de las cepas DH5\alpha y
BJ5183, y 30ºC para E. coli STBL2.
Todas las reacciones de PCR diseñadas en el
proceso de síntesis del plásmido pRcAd2 se llevaron a cabo en las
mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 1. Los
procedimientos generales aplicados en la purificación y manipulación
de ácidos nucleicos también se describen en el Ejemplo 1.
El vector pRcAd2 se diseñó en 4 pasos, descritos
a continuación:
El primer paso en la construcción del vector
pRcAd2 fue la amplificación por PCR de la región attB con
los cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
utilizando como molde el plásmido
pTA-attB (Groth, et al., 2000, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 97: 5995-6000). El fragmento
amplificado se subclonó en el vector específico para productos de
PCR pGemT-Easy (Promega), siguiendo las
recomendaciones del fabricante. El cebador attB-P2
incluye un Linker con la secuencia de reconocimiento para el enzima
de restricción I-SceI de Saccharomyces
cerevisiae.
El fragmento attB-ISceI (316 pb) se
liberó del vector pGemT-Easy mediante digestión con
los enzimas de restricción NcoI y PacI y se subclonó
en el plásmido pGemT/A6, digerido previamente con estos mismos
enzimas. pGemT/A6 deriva de la amplificación por PCR de la región
del genoma del adenovirus serotipo 5 comprendida entre las
posiciones 1 y 190, con los cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y su clonaje en el vector
pGemT-Easy.
En la construcción resultante,
pGemT/attB-A6, la diana de restricción para
I-SceI queda insertada entre la región attB
y la posición 1 del genoma del adenovirus.
El inserto
attB-ISceI-Ad(1-190),
de 512 pb, se escindió mediante digestión con BglII y se
subclonó en el vector pRC/A4-A5. Este vector es
producto de la amplificación de la secuencia del adenovirus
comprendida entre las posiciones 3528 y 4459 con los cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y su clonaje en el vector de
expresión eucariota pRC/RSV (Invitrogen), el cual incluye, además
del gen de resistencia a ampicilina, el gen de resistencia a
neomicina para su selección en células de mamífero. Para la
inserción de la secuencia Ad(3528-4459) en
pRC/RSV, se incluyeron secuencias diana para BglII y
XbaI el extremo 5' de los cebadores ad57 y ad58,
respectivamente. El inserto queda integrado entre las posiciones 13
y 701 del
vector.
La construcción resultante de la ligación del
fragmento
attB-SceI-Ad(1-190)
al vector pRC/A4-A5 se denominó
pRC/A6-A5. De este modo queda delecionada la región
E1 del adenovirus y que se localizaría entre las posiciones 190 y
3528.
El extremo 3' del genoma adenoviral (posiciones
34901-35938) se amplificó con los cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En el extremo 5' del cebador ad65 se incluyó la
secuencia diana para el enzima de restricción
I-SceI (subrayado). Ambos cebadores incluyen en su
extremo 5' las dianas de restricción para XbaI (ad59) y
KpnI (ad65). El fragmento de 1060 pb, producto de esta
amplificación, se cortó con estos enzimas para facilitar su
subclonaje "corriente abajo" de la región
Ad(3528-4459) insertada en el vector
pRC/A6-A5. La construcción resultante se denominó
pRC/A6-A7.
El plásmido pRC/A6-A7 fue
linealizado con XbaI y desfosforilado con Fosfatasa Alcalina
siguiendo las recomendaciones del fabricante (Alkaline
Phosphatase, Calf Intestinal (CIP); New England Biolabs).
Simultáneamente, la digestión del plásmido
pTG3602 (Chartier, et al., 1996, J. Virol., 70:
4805-4810) con PacI liberó una copia completa
del genoma del adenovirus serotipo 5. Su recircularización se evitó
mediante la desfosforilación de sus extremos con fosfatasa
alcalina.
Tanto el vector linealizado
pRC/A6-A7 como el inserto liberado del plásmido
pTG3602 se utilizaron simultáneamente para transformar la cepa
bacteriana electrocompetente de E. coli BJ5183 (BJ5183
Electroporation competent cells; Stratagene). Estas células
están diseñadas especialmente para promover procesos de
recombinación entre secuencias homólogas de un vector transferente,
que contiene el gen de interés, y un vector que incluya el genoma
adenoviral. En este caso las regiones homólogas incluidas en ambos
fragmentos de ADN (regiones Ad(3528-4459) y
Ad(34901-35938)) favorece dicho proceso de
recombinación cuya resolución conlleva la inserción del genoma
adenoviral dentro del vector pRC/A6-A7 y a partir de
la posición 4459 del virus (Fig. 5).
El proceso de electroporación se llevó a cabo,
siguiendo las recomendaciones del fabricante, en un electroporador
Gene Pulser (Biorad) y estableciendo los siguientes
parámetros: voltaje: 2.5 kV; resistencia: 200 \Omega;
capacitancia: 25 \muF; duración del pulso: 5 ms. Por último se
añadió 1 ml de medio LB y la suspensión se incubó en agitación
durante 1 hora a 37ºC. Seguidamente se prepararon diluciones
seriadas de las células transformadas. Éstas se sembraron en placas
de medio de cultivo suplementado con ampicilina (100 \mug/ml)
como antibiótico de selección para el plásmido
pRC/A6-A7. La incubación se continuó a 37ºC hasta
la aparición de clones resistentes.
El análisis de restricción con HindIII
confirmó la correcta inserción del genoma adenoviral en sólo uno de
los clones obtenidos y que se denominó pRcAd2.
El plásmido pRcAd2 incluye el genoma completo
del adenovirus, a excepción de la región localizada entre las
posiciones 190 y 3528 y que corresponde a la región E1. La
secuencia se encuentra delimitada por dianas de restricción para
I-SceI, y posee una secuencia attB en su
extremo 5' (Fig. 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
En la presente invención se ha propuesto la
obtención de líneas celulares estables diseñadas para la producción
y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad. Estas
células serán capaces de producir todos los componentes necesarios
para la replicación, ensamblaje y funcionamiento del virus.
Debido a la citotoxicidad de niveles elevados de
proteínas virales, un sistema de regulación transcripcional
inducible por mifepristona controla la expresión de los genes E1a y
E1b, los cuales a su vez dirigen la expresión y replicación del
resto del genoma adenoviral. Este mismo sistema controla, a su vez,
la producción de la endonucleasa de restricción
I-SceI necesaria para la liberación del genoma
adenoviral integrado en el genoma de la célula eucariota, lo que
proporciona un segundo nivel de control de la transcripción. La
inducción (y por tanto la producción de partículas virales) se
inicia en el momento de la adición al medio de cultivo de
mifepristona o su análogo RU486.
Al no ser necesaria la utilización de un virus
helper durante el proceso de producción, el sistema
desarrollado por los inventores permite la obtención de extractos
virales sin la contaminación residual indeseable de partículas
virales que contienen copias genómicas de dichos virus
helper.
En la presente realización se ha utilizado la
línea celular humana de carcinoma de pulmón A549 para el diseño de
un sistema de producción de vectores de alta capacidad
independiente de helper. Esta línea celular iniciada por
Giard et al. (1973, J. Natl. Cancer Inst., 51:
1417-1423) y posteriormente caracterizada en
profundidad por Lieber et al. (1976, Int. J. Cancer.,
17: 62-70), presenta una gran sensibilidad a la
infección por adenovirus lo que le confiere un elevado potencial
como línea de producción de virus (Smith et al., 1986, J.
Clin. Microbiol., 24: 265-268). Las células son
fácilmente cultivables sin variaciones en su morfología y se
mantienen viables entre 10 y 14 días sin mostrar señales
importantes de degeneración.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.1
Para la obtención de una línea celular de
empaquetamiento capaz de complementar la síntesis de proteínas
virales implicadas en la replicación, formación de la cápside y
empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad, las células A549 se
incubaron en placa de 10 cm^{2} a 37ºC, 5% CO_{2}, hasta
alcanzar una confluencia del 80%. Las células fueron
co-transfectadas mediante lipofectamina con 3 \mug
de la construcción pRcAd2 (confiere resistencia a la Neomicina
(neo^{r})) y 1 \mug del plásmido pCMV-Int (Groth
et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:
5995-6000), que codifica la integrasa del fago
PhiC31 de Streptomyces y que promueve la integración estable
del plásmido en el genoma de la célula (Fig. 6A).
El ADN de ambos plásmidos se diluyó previamente
en 500 \mul de medio sin suero OPTI-MEM
(Gibco®: Invitrogen, Carlsbad CA92008, USA). Para favorecer la
formación de los complejos entre el ADN y lípidos catiónicos se
añadió el reactivo Plus Reagent (Invitrogen) en una relación
1:0.75 (DNA: Plus Reagent). Tras 5 minutos de incubación a
temperatura ambiente se añadieron 6 \mul de Lipofectamina
LTX (Invitrogen) y la mezcla se incubó de nuevo a temperatura
ambiente durante 25 minutos. Seguidamente la dilución se añadió
gota a gota sobre el medio de cultivo de las células: DMEM
suplementado con suero fetal bovino 10% (Gibco®);
L-Glutamina 1% (200 mM en NaCl 0.85%; Lonza
Ibérica, 08006 Barcelona, España); y Penicilina/Estreptomicina 1%
(10 mg/ml en NaCl 0.85%; Gibco®). Tras 4 horas de incubación a 37ºC,
5% CO_{2}, el medio se sustituyó por medio DMEM fresco y se
continuó la incubación otras 24 horas. Finalmente se retiró el
medio y, tras un lavado con tampón fosfato salino 1X (PBS)
(Gibco®), las células transfectadas se levantaron con tripsina
(Trypsin-EDTA; Gibco®) y se centrifugaron a
1250 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El precipitado
de células se resuspendió en 6 ml de medio de cultivo y se repartió
en tres placas de 60 cm^{2}. Se añadió medio nuevo, en este caso
suplementado con el antibiótico de selección G418, análogo de la
Neomicina, a una concentración de 600 \mug/ml. Cada dos días se
procedió al cambio del medio de cultivo hasta la aparición de clones
aislados resistentes al antibiótico (2-3 semanas).
Los clones se levantaron con tripsina y se transfirieron a pocillos
de 0.3 cm^{2} con medio de selección. La incubación se continuó
hasta alcanzar el 80% de confluencia y seguidamente se transfirieron
a pocillos de mayor superficie. Tras sucesivos pases se aisló un
clon resistente a G418 que recibió el nombre de
pRc-1. Para probar la estabilidad del clon las
células se mantuvieron 4 meses en cultivo sin que se observaran
cambios en su morfología o viabilidad.
Para confirmar la integración del plásmido
pRcAd2 en el clon aislado, se extrajo el ADN genómico del clon
pRc-1 con el sistema QIAmp DNA minikit
(Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este ADN se
utilizó en ensayos de Nested-PCR para detectar la
presencia de los genes adenovirales IIIa, IV, el gen codificante de
la proteasa y el gen que codifica la polimerasa viral. Los
cebadores utilizados en esta detección fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de PCR con los cebadores externos
de Nested-PCR (cebadores 1 y 2) se llevaron a cabo
en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa (BioTaq,
Bioline), tampón de PCR (Bioline), MgCl_{2} 1.5 mM, 0.4 mM de
cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua desionizada estéril
hasta un volumen final de 50 \mul. Las condiciones de
amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de 2 minutos a 94ºC, 50
segundos a 94ºC de desnaturalización, 50 segundos de hibridación
con el cebador (Tm según el gen a amplificar, ver tabla) y 50
segundos a 72ºC de elongación; 35 ciclos de 50 segundos a 94ºC de
desnaturalización, 50 segundos de hibridación con el cebador (Tm
según el gen a amplificar, ver tabla) y 50 segundos a 72ºC de
elongación; 1 ciclo de 7 minutos a 72ºC de elongación final. Las
reacciones de amplificación con los cebadores internos de
Nested-PCR (cebadores 3 y 4) se llevaron a cabo a
partir de 2 \mul de las reacciones de PCR anteriores y en
presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa (BioTaq,
Bioline), tampón de PCR (Bioline), MgCl_{2} 2.5 mM, 0.4 mM de cada
dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta
un volumen final de 50 \mul. En este caso las condiciones de
amplificación fueron: 35 ciclos de 50 segundos a 94ºC de
desnaturalización, 50 segundos de hibridación con el cebador (Tm
según el gen a amplificar, ver tabla) y 50 segundos a 72ºC de
elongación; 1 ciclo de 7 minutos a 72ºC de elongación final.
La pérdida de la región attB también se
comprobó mediante reacción de PCR utilizando los cebadores
attB-P1; attB-P2 (Ejemplo 2). Las
reacciones de PCR se llevaron a cabo en presencia de 1 U del enzima
Taq polimerasa (BioTaq, Bioline), tampón de PCR
(Bioline), MgCl_{2} 4 mM, 0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada
cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta un volumen final de
50 \mul. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes:
1 ciclo de desnaturalización de 4 minutos a 95ºC; 29 ciclos de 50
segundos a 94ºC de desnaturalización, 40 segundos a 50ºC de
hibridación con el cebador y 40 segundos a 72ºC de elongación; 1
ciclo de 5 minutos a 72ºC de elongación final.
Para el análisis de los productos de
amplificación las muestras se mezclaron con 1,5 \mul de la
solución de carga (azul de bromofenol 0.25% en agua destilada;
Glicerol 40%; EDTA 100 mM) y se analizaron por electroforesis en
geles de agarosa (1%) con tampón TAE 1X (Tris Base 40 mM; ácido
acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizando el ADN
mediante tinción con bromuro de etidio (0.5 \mug/ml).
Los resultados obtenidos (Fig. 6B) confirman la
correcta integración del polinucleótido B en el genoma de la célula
eucariota A549. La pérdida de la región attB confirma,
además, que dicha integración ha sido mediada específica y
unidireccionalmente por la integrasa PhiC31.
A continuación, y para determinar la expresión
de los genes del adenovirus, el clon pRc-1 se
incubó en placa de 20 cm^{2} a 37ºC, 5% CO_{2}, hasta alcanzar
una confluencia del 80%. En este momento las células fueron
transfectadas con una dilución de 5 \mug de la construcción
pGal4-2RU-SceI-E1,
Plus Reagent (1:0.75) y 12 \mul Lipofectamina LTX,
siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Las
transfecciones se llevaron a cabo por duplicado incubando una de
las placas en presencia del inductor RU486 a una concentración de
10^{-8}M. Tras 48 horas de incubación las células se lisaron con 1
ml de TRIZOL (Invitrogen) para proceder a la extracción del RNA
total siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este RNA fue
utilizado para ensayos de retrotranscripción
(RT)-PCR con cebadores específicos para los genes
adenovirales
Para estos ensayos previamente se trató 1 \mug
de RNA con 1 unidad de DNasa (DNasal amplification grade;
Invitrogen) en tampón de reacción (Tris-HCl 20 mM,
pH 8.4; MgCl_{2} 2 mM; KCl 50 mM) y a un volumen final de 10
\mul. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 15
minutos y la DNasa se inactivó añadiendo 1 \mul de solución EDTA
25 mM, e incubando a 65ºC durante 10 min. En la reacción de síntesis
del cDNA se emplearon 625 ng de este RNA libre de ADN. La reacción
de reverso-transcripción se inició mezclando la
muestra con 10 pmol del cebador específico, 1 \mul de dNTPs (10
mM) y agua hasta un volumen final de 13 \mul. Tras incubar a 65ºC
durante 5 minutos, la mezcla se enfrió en hielo y se añadieron 2
\mul de DTT 0.1 M y 4 \mul de tampón de reacción
(Tris-HCl 250 mM, pH 8.3; KCl 375 mM; MgCl_{2} 15
mM). Finalmente tras una nueva incubación a 37ºC durante 2 minutos
se añadieron 200 U de M-MLV
Reverse-Transcriptase (Invitrogen) y se continuó
la incubación a 37ºC durante 50 min. Seguidamente el cDNA resultante
se utilizó como molde en reacciones de PCR con objeto de amplificar
el producto de la transcripción de los genes bajo estudio. Como
control negativo y para comprobar la ausencia de contaminación por
ADN genómico, en todos los casos, se incluyó una reacción de
amplificación utilizando como molde el RNA tratado con la DNasa.
Las condiciones de amplificación utilizadas para las reacciones de
PCR con el ADNc obtenido de la reacción de
reverso-transcripción fueron las mismas que las
empleadas en las reacciones de amplificación del ADN genómico.
Los resultados de estos ensayos, mostrados en la
Figura 7, confirman la capacidad de transcripción de los genes
adenovirales integrados de manera estable en el cromosoma de la
célula eucariota.
Finalmente, para confirmar la capacidad de las
células de producir proteínas virales a partir del mRNA viral, se
ensayó la detección de proteínas de la cápside viral mediante
ensayos de inmunocitoquímica. Para inducir la síntesis de proteínas,
el clon pRc-1 se transfectó previamente con la
construcción
pGal4-2RU-SceI-E1.
Las transfecciones se hicieron por duplicado para obtener células
transfectadas e incubadas en presencia y ausencia del inductor
RU486. Tras 24 horas de incubación, las células se levantaron con
tripsina y 8x10^{4} células se transfirieron a un portaobjeto de
cultivo de cuatro celdas (BD Falcon Cultureslide; BD
Biosciences, Erembodegem 9320, Bélgica), añadiendo nuevo medio de
cultivo con y sin inductor RU486. Al día siguiente se retiró el
medio y las células se lavaron con PBS. Seguidamente se procedió a
su fijación con una solución Acetona:Metanol (1:1) previamente
enfriada a -20ºC. La solución de fijado se dejó evaporar a
temperatura ambiente (30 minutos) y los portaobjetos se sumergieron
en PBS 1X. Tras 3 lavados de 3 minutos en PBS se procedió a la
hibridación con el anticuerpo primario (Mouse
anti-adenovirus monoclonal antibody blend;
Millipore Ibérica, 28050 Madrid, España) diluido previamente en PBS
(1:75). Dicha hibridación se llevó a cabo durante toda la noche a
4ºC, en oscuridad y cámara húmeda. Al día siguiente el exceso de
anticuerpo se lavó en PBS (3 lavados de 3 minutos) y se procedió a
la hibridación con el anticuerpo secundario (Immunopure goat
anti-mouse IgG-Peroxidase;
Pierce Biotechnology, Rockford IL61105, USA) diluido también en PBS
(1:400). La hibridación se incubó 45 minutos a temperatura ambiente
y en oscuridad.
De nuevo, las muestras se lavaron 3 veces en PBS
1X y se procedió al revelado con el cromógeno DAB
(DakoCytomation Liquid DAB Substrate Chromogen System; Dako
Diagnósticos, Sant Just Desvern E-08960, Barcelona,
España) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las muestras
se contratiñeron con Hematoxilina de Mayer (5 segundos) para la
tinción específica de núcleos y, tras un lavado de 15 minutos en
agua, las muestras se deshidrataron sumergiéndolas 1 minuto en
alcohol al 70%, 96% y 100%, y 10 minutos en Xileno.
La coloración marrón detectada en las muestra
confirma la síntesis de proteínas de la cápside viral. Aunque se
detecta una ligera producción basal de estas proteínas en la
muestra sin inductor, los resultados de la inmunocitoquímica revelan
una clara diferencia con respecto a los niveles de expresión de las
proteínas virales en presencia del inductor RU486, confirmando que
el sistema de regulación por mifepristona funciona en el control de
la expresión de los genes virales integrados en el genoma del clon
pRc-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.2
En una segunda realización, se diseñó una línea
celular estable en la que se ha integrado el polinucleótido A2,
según se define en la invención (Fig. 1A). Así, la línea celular
originada cuenta con los genes necesarios para el inicio y control
de la expresión de los genes adenovirales incluidos en el
polinucleótido B. A su vez, estos genes, como son el gen que
codifica la endonucleasa de restricción I-SceI y la
región adenoviral El que codifica, a su vez, las proteínas E1A y
E1B, se encuentran bajo el control de promotores regulados por
mifepristona. El propio factor de regulación
GAL4-hPR-p65 está incluido en el
polinucleótido A2 y, por tanto, se integrará de manera simultánea en
el genoma celular. Dicho transactivador será expresado de manera
constitutiva por las células modificadas.
Para la obtención de esta línea celular se
incubaron células A549 en placa de 10 cm^{2} a 37ºC, 5% CO_{2},
hasta alcanzar una confluencia del 80%. Las células se transfectaron
por el método de la lipofectamina con la construcción
pGal4-2RUSceI-E1 (gen de
resistencia a la Zeomicina (zeo^{r})) y siguiendo el procedimiento
descrito en el apartado 3.1 para la obtención del clon
pRc-1. Las células se incubaron en medio DMEM
suplementado con suero fetal bovino 10%, L-Glu 1% y
P/S 1% y el antibiótico Zeomicina a una concentración de 400
\mug/ml. Tras sucesivos pases de amplificación se aisló un clon
resistente al antibiótico que recibió el nombre de
Gal-13. Del mismo modo que para el clon
pRc-1, la estabilidad del clon
Gal-13 se testó mediante su mantenimiento en
cultivo durante un periodo superior a los 4 meses y más de 35 pases
sucesivos.
Ensayos de PCR a partir del ADN genómico de la
célula confirmaron la presencia de los genes adenovirales E1a y
E1b, del gen codificante de la endonucleasa I-SceI y
del gen que codifica la proteína de fusión GAL4-
hPR-p65 reguladora de la transcripción e inducible
por mifepristona. Los cebadores utilizados fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico de las células se extrajo con el
sistema QIAmp DNA minikit (Qiagen) siguiendo las
recomendaciones del fabricante y las reacciones de PCR se llevaron a
cabo en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa
(BioTaq, Bioline), tampón de PCR (Bioline), MgCl_{2} 4 mM,
0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua
desionizada estéril hasta un volumen final de 50 \mul. Las
condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de
desnaturalización de 4 minutos a 95ºC; 29 ciclos de 50 segundos a
94ºC de desnaturalización, 40 segundos a 50ºC de hibridación con el
cebador y 40 segundos a 72ºC de elongación; 1 ciclo de 5 minutos a
72ºC de elongación final. Para el análisis de los productos de
amplificación las muestras se mezclaron con 1.5 \mul de la
solución de carga (azul de bromofenol 0.25% en agua destilada;
Glicerol 40%; EDTA 100 mM) y se analizaron por electroforesis en
geles de agarosa (1%) con tampón TAE 1X (Tris Base 40 mM; ácido
acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizando el ADN
mediante tinción con bromuro de etidio (0.5 \mug/ml). Los
resultados de amplificación confirmaron la correcta integración de
los genes incluidos en el polinucleótido A2 dentro del genoma de la
línea A549 (Fig. 8).
Seguidamente, para comprobar la capacidad de
regulación de la expresión génica del sistema inducible por
mifepristona se analizó, por Western blot, la síntesis de las
proteínas E1A y I-SceI partiendo de muestras de
proteínas obtenidas de cultivos incubados en presencia y ausencia
del inductor RU486 a una concentración de 10^{-8}M. Los extractos
proteicos se purificaron en 500 \mul de Passive Lysis
Buffer 1X (Promega) y los niveles de proteína total fueron
determinados usando la técnica de Bradford para cuantificación de
proteínas (Bradford, 1976, Anal. Biochem., 72:
248-254). Las muestras se analizaron por
electroforesis en gel discontinuo de
poliacrilamida-SDS y tampón de electroforesis
Laemli (Tris-HCl 25 mM; Glicina 192 mM; SDS
0.1% p/v). El gel separador estaba compuesto por poliacrilamida al
12% en tampón Tris-HCl 0.39 M (pH 8.8) con SDS al
0.1%. Como catalizadores se utilizaron PSA al 0.1% y TEMED al
0.04%. Por su parte el gel de concentración estaba compuesto por
poliacrilamida al 5% en Tris-HCl 0.125 M (pH6.8)
con SDS al 0.1%, PSA 0.1% y TEMED al 0.01%. Las muestras se
transfirieron a membrana Hybond-P (GE
Healthcare Europe) en tampón de transferencia
(Tris-Base 0.3%; Glicina 186 mM; Metanol 20%)
durante 2 horas a 4ºC. Seguidamente se procedió al bloqueo de la
membrana en solución de leche 5% en PBS+Tween (0.05%) a 4ºC durante
toda la noche. La hibridación con el anticuerpo primario se llevó a
cabo en solución de leche 1% + PBS-Tween durante 1.5
horas a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo se eliminó
con 3 lavados de 10 minutos en PBS-Tween. La
hibridación con el anticuerpo secundario se realizó en leche 1% +
PBS-Tween durante 30 minutos a temperatura ambiente.
En la detección de la proteína E1A se empleó el anticuerpo
Anti-adenovirus2 E1A (Mouse) (1:500)
(Calbiochem®: EMD, La Jolla CA92039-2087, USA) y
como anticuerpo secundario el Immunopure goat
anti-mouse IgG-Peroxidase
(1:5000) (Pierce Biotechnology). En el caso de la proteína
I-SceI se empleó como único anticuerpo el
Anti-HA-Peroxidase High
affinity (1:500) (Roche Diagnostics, 08174 Barcelona, España).
Tras 3 lavados de la membrana en PBS-Tween durante
10 minutos, se procedió al revelado. Para ello se empleó el sistema
Western lightning chemiluminescence reagent
(Perkin-Elmer, 28760 Madrid, España) siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Los resultados obtenidos se
muestran en la figura 9 y demuestran la correcta producción de las
proteínas analizadas, así como un incremento en los niveles de
expresión de estas proteínas en presencia del inductor. Sin embargo
hay que tener en cuenta que, en ausencia de inductor, existe una
expresión basal de las proteínas sometidas a regulación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3.3
Para obtener una única línea celular con todos
los genes necesarios en la producción de partículas virales, el
clon resistente a Zeomicina Gal-13 (ejemplo 3.2) se
co-transfectó con la construcción pRcAd2
(neo^{r}), que incluye el resto de genes del adenovirus, y el
plásmido pCMV-Int que codifica la integrasa PhiC31.
Las condiciones de transfección fueron las mismas que las empleadas
en la obtención del clon Gal-13 y la selección se
hizo en presencia de los antibióticos G418 (600 \mug/ml) y
Zeomicina (400 \mug/ml). De esta selección resultó el aislamiento
de dos clones doblemente resistentes (zeo^{r}+neo^{r}) y que se
denominaron GAd-1 y GAd-6
respectivamente. Las características morfológicas de ambos clones
difieren enormemente de la línea parental A549 y su derivado
Gal-13. Los nuevos clones transfectantes tienden a
una forma esférica y son de menor tamaño. Este cambio morfológico
posiblemente sea debido a la transcripción basal de los genes El
detectada anteriormente en el clon Gal-13, lo que
conlleva la transcripción del resto de genes adenovirales clonados
en el plásmido pRcAd2 e insertados en el genoma de la célula. Sin
embargo los niveles de proteínas virales no afectan de manera
significativa a la estabilidad y viabilidad de las células, tal y
como se ha comprobado tras su mantenimiento en cultivo durante un
periodo superior a los 4 meses.
Para confirmar la integración del plásmido
pRcAd2 en los clones GAd-1 y GAd-6,
se extrajo el ADN genómico con el sistema QIAmp DNA minikit
(Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este ADN se
utilizó en ensayos de Nested-PCR para detectar la
presencia de los genes adenovirales IIIa, IV, el gen codificante de
la proteasa y el gen que codifica la polimerasa viral. Los
cebadores utilizados en esta detección fueron los mismos que los
empleados en el apartado 3.1. Del mismo modo, las reacciones de
amplificación se llevaron a cabo en las mismas condiciones que las
descritas en el apartado 3.1.
Los productos de amplificación se analizaron por
electroforesis en geles de agarosa (1%) con tampón TAE 1X (Tris
Base 40 mM; ácido acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) y
visualizando el ADN mediante tinción con bromuro de etidio (0.5
\mug/ml) (Fig. 10).
Para confirmar la síntesis de proteínas virales
se diseñaron ensayos de inmunocitoquímica contra proteínas de la
cápside viral. En este caso los clones GAd1 y GAd6 se incubaron
durante 48 horas tanto en presencia como en ausencia del inductor
RU486 a una concentración 10^{-8}M. Seguidamente se transfirieron
6x10^{4} células a un portaobjeto de cultivo de cuatro celdas
(BD Falcon Cultureslide; BD) y se procedió de igual modo que
en el caso del clon pRc-1 (ejemplo 3.1). Como
anticuerpo primario se utilizó el anticuerpo Mouse
anti-adenovirus monoclonal antibody blend
(Millipore) diluido en PBS (1:75) y como anticuerpo secundario el
anticuerpo Immunopure goat anti-mouse
IgG-Peroxidase (Pierce Biotechnology) también
diluido en PBS (1:400).
La detección de coloración marrón en las células
confirma la síntesis de proteínas de la cápside viral. Sin embargo,
no se detectan diferencias claras entre las muestras incubadas en
presencia del inductor RU486 y en ausencia del mismo. Por tanto, la
expresión basal de las proteínas El, la cual escapa al control del
regulador transcripcional
GAL4-hPR-p65, es suficiente para
iniciar la expresión del resto de genes adenovirales integrados en
el genoma de la célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Ejemplo
4.1
En el presente ejemplo, el clon seleccionado de
la línea celular generada en el ejemplo 3.1 se utilizó para la
producción y empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad o
adenovirus gutless. Este sistema de producción permite la
obtención de extractos virales de adenovirus de alta capacidad sin
necesidad de la utilización de un virus helper como
complemento de los genes delecionados en el plásmido pRcAd2 e
integrado de manera estable en el cromosoma de la célula
eucariota.
Para compensar la deficiencia de la región E1,
el sistema requiere la transfección de la línea celular, en cada
uno de los pasos de producción, con el plásmido
pGal4-2RU-SceI-E1.
Este plásmido de complementación expresa los genes E1 a y E1b a
partir del promotor inducible regulado por mifepristona (Fig. 1A),
lo que iniciará la expresión del resto de los genes adenovirales.
Además, la replicación del genoma viral integrado sólo será posible
en el momento de la expresión de la endonucleasa de restricción
I-SceI, incluida en el plásmido
pGal4-2RU-SceI-E1 y
también controlada a nivel ; transcripcional por el regulador
GAL4-hPR-p65. La liberación del
genoma viral y el inicio de su replicación permitirán la obtención
de múltiples copias del mismo y, por tanto, suficientes niveles de
proteínas virales para la encapsidación del adenovirus de alta
capacidad y su purificación en un alto título.
Para determinar la capacidad del sistema de
producir partículas infectivas, se incubaron 8x10^{5} células del
clon pRc-1, en placa de 20 cm^{2} a 37ºC, 5%
CO_{2}, hasta alcanzar una confluencia del 80%. Seguidamente las
células se co-transfectaron con 5 \mug del
plásmido
pGal4-2RU-SceI-E1 y
12 \mug del vector gutless KCZ, digerido con el enzima de
restricción PmeI para eliminar el origen de replicación, el
gen de resistencia a la ampicilina y dejar los extremos ITR del
vector libres. Como gen reportero, el vector KCZ lleva el gen de la
\beta-galactosidasa bacteriana
(lacZ).
(lacZ).
En la co-transfección se empleó
la lipofectamina como sistema de internalización del ADN en la
célula eucariota. Así, el ADN de ambos plásmidos se diluyó
previamente en 1 ml de medio sin suero
OPTI-MEM (Gibco®). Para favorecer la
formación de los complejos entre el ADN y lípidos catiónicos se
añadió el reactivo Plus Reagent (Invitrogen) en una relación
1:0.75. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se
añadieron 12 \mul de Lipofectamina LTX (Invitrogen) y la
mezcla se incubó de nuevo a temperatura ambiente durante 25
minutos. Seguidamente la dilución se añadió gota a gota sobre el
medio de cultivo de las células (DMEM suplementado con suero fetal
bovino 10%). Tras 4 horas de incubación a 37ºC, 5% CO_{2}, el
medio se sustituyó por medio DMEM fresco suplementado con suero
fetal bovino 2% e inductor RU486 a una concentración
10^{-8}M.
Al no tener un efecto citopático claro, las
células se incubaron entre 48 y 120 horas y, posteriormente, se
recogieron a distintos tiempos en su propio medio. Tras una
centrifugación a 1250 rpm durante 5 minutos, el precipitado se
resuspendió en 200 \mul de Tris-HCl 0.1M (pH 8.0)
y las células fueron lisadas mediante tres ciclos de
congelación/descongelación. Los restos celulares se centrifugaron y
el título del sobrenadante se determinó por tinción
X-gal de células 293S infectadas con las
preparaciones del vector KCZ. Para ello, las células 293S se
crecieron en pocillos de 2 cm^{2} hasta alcanzar una confluencia
del 80% en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino 2% y
Na-Piruvato 1%. Seguidamente, el medio de cultivo se
retiró y las células se infectaron con diluciones seriadas del
extracto viral en DMEM + FBS 2% + Na-Piruvato 1%.
Tras una incubación de 4 horas a 37ºC, 5% CO_{2}, se añadió medio
fresco y se continuó la incubación otras 48 horas. Finalmente las
células se fijaron con una solución de glutaraldehido 0.5% en PBS
durante 10 minutos y a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces en
PBS y se tiñeron 4 horas a 37ºC con 1 mg/ml de X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactopiranósido)
en PBS suplementado con MgCl_{2} 20 mM,
K_{3}Fe(CN_{6}) 5 mM y K_{4}Fe(CN_{6}) 5
mM.
Según los resultados obtenidos, utilizando como
línea de producción y empaquetamiento el clon
pRc-1, la producción a Pase 0 alcanza sus niveles
máximos a las 48-72 horas y están en torno a
7x10^{5} unidades infectivas (ui)/ml (Fig. 11). En los sucesivos
pases de amplificación, estos extractos se utilizarán para la
infección de nuevas células pRc-1, previamente
transfectadas con el plásmido
pGal4-2RU-SceI-E1.
El sistema descrito permite, por tanto, la recuperación de extractos
de adenovirus de alta capacidad libres de partículas infectivas
derivadas de un virus helper, así como su obtención a altos
niveles de producción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4.2
El sistema de producción descrito a continuación
utiliza como célula empaquetadora una línea modificada en la que se
ha integrado de manera estable los polinucleótidos A2 y B,
descritos en la invención (Fig. 1A, 1B). Salvo el polinucleótido
correspondiente al vector adenoviral de alta capacidad, esta línea
celular no requiere ningún elemento adicional (plásmido o virus
helper) para la producción de partículas virales con
capacidad infectiva.
El sistema integra los genes adenovirales
necesarios para la encapsidación y replicación del adenovirus de
alta capacidad (polinucleótido B), así como los genes de la región
E1 y la endonucleasa de restricción I-SceI
(polinucleótido A2), necesarios para la expresión controlada y a
altos niveles de las proteínas virales anteriores, en una única
célula. Finalmente, el inicio del proceso de producción está
regulado mediante la expresión de los genes de la región E1 y la
endonucleasa de restricción a partir de sus correspondientes
promotores inducibles y el activador transcripcional
GAL4-hPR-p65.
En el presente ejemplo de producción de
partículas infectivas, las líneas empaquetadoras
GAd-6 y GAd-1 se transfectaron con
12 \mug del vector gutless KCZ que codifica el gen
reportero de la \beta-galactosidasa y que se ha
linearizado previamente con el enzima de restricción PmeI,
tal y como se indica en el ejemplo 4.1. La transfección con el
vector de alta capacidad se llevó a cabo siguiendo el procedimiento
descrito en el sistema de producción con la línea empaquetadora
pRc-1 (ejemplo 4.1).
Las células se incubaron entre 48 y 120 horas en
medio DMEM suplementado con suero fetal bovino 2% y en presencia
del inductor RU486 a una concentración 10^{-8}M. Las células se
recogieron a distintos tiempos, se centrifugaron a 1250 rpm durante
5 minutos y, finalmente, se resuspendieron en 200 \mul de
Tris-HCl 0.1M. Tras su lisis con tres ciclos de
congelación/descongelación, los restos celulares se centrifugaron y
el sobrenadante se tituló en la línea celular 293S siguiendo el
protocolo descrito en el ejemplo anterior.
Utilizando como línea de producción y
empaquetamiento el clon GAd-1, los niveles de
producción a Pase 0 fueron de hasta 1,7x10^{6} unidades infectivas
(ui/ml), mientras que para el clon GAd-6 se obtuvo
una titulación de 3x10^{6} ui/ml (Fig. 12).
Igual que en el ejemplo anterior, estos
extractos se utilizarán para la infección de nuevas células
empaquetadoras durante los sucesivos pases de amplificación. El
sistema descrito en la presente realización se diferencia del
sistema anterior de co-transfección con dos
plásmidos (ejemplo 4.1) u otros sistemas de producción dependientes
de helper, en la eliminación del proceso de
transfección/infección de las células empaquetadoras en cada uno de
los pasos de amplificación del virus. Esta característica reduce
significativamente el tiempo de producción e incrementa el
rendimiento de la misma. La otra gran ventaja es la ausencia de
contaminaciones con virus helper, lo que simplifica el
proceso de purificación del virus y permite la obtención de
cantidades suficientes para su utilización en procedimientos de
terapia génica en humanos.
<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA
S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SISTEMA PARA EMPAQUETAMIENTO DE
ADENOVIRUS DE ALTA CAPACIDAD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P3918ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia reconocida por el dominio
de unión de ADN de GAL4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> c
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linker RU-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Linker RU-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Ad19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Ad22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SceI-b1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SceI-b2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PRU-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PRU-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia diana de la endonucleasa
SceI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador attB-P1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador attb-P2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Ad63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ad64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ad57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ad58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ad59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ad65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IIIa1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IIIa2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IIIa3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IIIa4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IV1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IV2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IV3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador IV4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Pr1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Pr2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Pr3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Pr4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador POL1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador POL2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador POL3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador POL4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PRC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PRC4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador III1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador III2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador E4-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador E4-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RT-EA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RT-EA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RT-EB3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RT-EB4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SceI-3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SceI-4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Gal-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Gal-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (28)
1. Un polinucleótido o un vector de expresión
que comprende:
- (a)
- un primer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
- (b)
- un segundo casete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional codificado por el polinucleótido definido en (a).
2. Polinucleótido o vector de expresión según
cualquiera de las reivindicación 1 donde el regulador
transcripcional codificado por el casete (a) es un regulador
transcripcional activable.
3. Polinucleótido o vector de expresión según la
reivindicación 2 donde el regulador transcripcional activable (a)
está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio de
unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el
dominio de activación de NF-kappaB p65.
4. Polinucleótido o vector de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la endonucleasa de
restricción codificada por el casete (b) es
I-SceI.
5. Un polinucleótido o vector de expresión que
comprende:
- (a)
- un primer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
- (b)
- un segundo casete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) y
- (c)
- un tercer casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína adenoviral seleccionada E1A o las proteínas adenovirales E1A y E1B, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a).
6. Polinucleótido o vector de expresión según
la reivindicación 5 dónde el segundo y tercer casete se transcriben
en sentido contrario.
7. Polinucleótido o vector de expresión según
la reivindicación 6 dónde la secuencia reguladora de la
transcripción que controla el segundo y tercer casete comparten el
mismo sitio de unión para el regulador transcripcional (a).
8. Polinucleótido o vector de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 donde el regulador
transcripcional codificado por el casete (a) es un regulador
transcripcional activable.
9. Polinucleótido o vector de expresión según
la reivindicación 8 donde el regulador transcripcional activable
(a) está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio
de unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el
dominio de activación de NF-kappaB p65.
10. Polinucleótido o vector de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 donde la endonucleasa de
restricción codificada por el segundo casete (b) es
I-SceI.
11. Un polinucleótido o vector de expresión que
comprende una secuencia nucleotídica que comprende el genoma de un
adenovirus recombinante que carece de, al menos, la secuencia
\psi de empaquetamiento y la secuencia que codifica la proteína
E1A o E1A/E1B, en donde dicha secuencia que comprende el genoma de
un adenovirus recombinante se encuentra flanqueada por secuencias de
reconocimiento específico para una endonucleasa de restricción.
12. Polinucleótido o vector de expresión según
la reivindicación 11 que comprende además una secuencia
nucleotídica de reconocimiento específico para una integrasa, donde
la secuencia de reconocimiento para la integrasa se encuentra en
posición 5' respecto de la primera secuencia de reconocimiento para
la endonucleasa de restricción.
13. Polinucleótido o vector de expresión según
la reivindicaciones 12 en donde la secuencia nucleotídica de
reconocimiento para la integrasa es attB, específica para la
integrasa PhiC31.
14. Polinucleótido o vector de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en donde las secuencias
nucleotídicas de reconocimiento para la endonucleasa son
específicas para la endonucleasa I-SceI.
15. Una célula hospedadora que comprende un
polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
16. Una célula hospedadora según la
reivindicación 15 que comprende, adicionalmente, una secuencia que
codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, una secuencia
que codifica la proteína adenoviral E1B.
17. Una célula hospedadora que comprende un
polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 10.
18. Una célula hospedadora según la
reivindicación 15 a 17 que comprende, adicionalmente, un
polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14 o que es obtenible mediante integración en
una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 15
a 17, de un polinucleótido según la reivindicaciones 11 a 14.
19. Una célula según la reivindicación 18 en
donde las dianas de restricción que flanquean el genoma viral
derivadas del polinucleótido o vector de expresión según cualquiera
de las reivindicaciones 11 a 14 son reconocidas de forma específica
por la endonucleasa de restricción que se encuentra bajo control
operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable
por el regulador transcripcional (a) derivado del polinucleótido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
20. Un método para la producción de células
adecuadas para la producción y empaquetamiento de partículas
infectivas de un adenovirus de alta capacidad que comprende
- (i)
- transfectar una célula con un primer polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o con un vector que comprende dicho polinucleótido, o con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 o con un vector que comprende dicho polinucleótido y
- (ii)
- transfectar dicha célula con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o con un vector que comprende dicho polinucleótido
en donde las etapas (i) y (ii)
pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea y
en donde si las células se transfectan en la etapa (i) con un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
entonces se utilizan células que comprenden la secuencia que
codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína
adenoviral
E1B.
21. Método según la reivindicación 20 en donde
las etapas (i) y/o (ii) incluyen una etapa adicional de selección
en la que se seleccionan células que han integrado de forma estable
el primer y/o el segundo polinucleótido en base a marcadores de
selección presentes en los polinucleótidos utilizados en las etapas
(i) y (ii).
22. Método según la reivindicación 20 ó 21 en
donde el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11
a 14 comprende adicionalmente una secuencia nucleotídica de
reconocimiento específico para una integrasa y en donde la
transfección realizada en la etapa (ii) incluye, adicionalmente, un
polinucleótido que codifica una integrasa específica para dichas
secuencias de reconocimiento.
23. Método según la reivindicación 22 en donde
la integrasa específica es la integrasa del fago PhiC31 de
Streptomyces y en donde el sitio de reconocimiento específico
es un sitio attB.
24. Célula obtenible mediante un método según
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
25. Un sistema para la producción de adenovirus
de alta capacidad que comprende
- (a)
- una célula según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 y 24 y
- (b)
- un adenovirus de alta capacidad.
26. Método para la producción de vectores
adenovirales de alta capacidad, que comprende las etapas de:
- (a)
- transfectar o infectar una célula hospedadora con un polinucleótido que comprende el genoma del adenovirus de alta capacidad que se desea producir o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (b)
- cultivar las células transfectadas/infectadas en condiciones que permitan la replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad,
- (c)
- recuperar las partículas virales del adenovirus de alta capacidad y, opcionalmente,
- (d)
- repetir las etapas (a) a (c) en donde las partículas virales de alta capacidad obtenidas en la etapa (c) se utilizan para infección en la etapa (a) del siguiente ciclo,
\newpage
en donde la célula hospedadora
usada en la etapa (a) se selecciona del grupo
de
- (i)
- una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y la secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 11 a 14 y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (ii)
- una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 11 a 14 y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (iii)
- una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 4 y en donde la célula comprende una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B,
- (iv)
- una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 5 a 10 y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
- (v)
- una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un polinucleótido según las reivindicaciones 11 a 14 y una secuencia que codifica la proteína adenoviral E1A y, opcionalmente, la proteína adenoviral E1B, y
- (vi)
- una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 y un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.
27. Método según la reivindicación 26, donde el
cultivo de la etapa (b) se realiza en presencia de un agente
inductor específico del regulador transcripcional codificado por la
secuencia nucleotídica comprendida en el polinucleótido según las
reivindicaciones 1 a 4 y 5 a 10.
28. Método según las reivindicación 27 en donde
el regulador transcripcional está formado por el dominio de unión a
ADN de GAL4, el dominio de unión a ligando del receptor humano de
progesterona y por el dominio de activación de
NF-kappaB p65 y donde el agente inductor es una
antiprogestina sintética, preferiblemente mifepristona.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801682A ES2330826B1 (es) | 2008-06-04 | 2008-06-04 | Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. |
| AU2009254522A AU2009254522A1 (en) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | System for packaging high-capacity adenoviruses |
| PCT/ES2009/070194 WO2009147271A2 (es) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad |
| US12/996,346 US20110081718A1 (en) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | System for packaging high-capacity adenoviruses |
| BRPI0913383A BRPI0913383A2 (pt) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | sistema para embalagem de adenovirus de alta capacidade |
| JP2011512159A JP2011521663A (ja) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | 高容量アデノウイルスをパッケージングするための系 |
| RU2010154410/10A RU2010154410A (ru) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | Система для упаковки аденовируса с большой емкостью |
| EP09757650A EP2298925B1 (en) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | System for packaging of high-capacity adenoviruses |
| MX2010013365A MX2010013365A (es) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. |
| CN2009801300439A CN102112616A (zh) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | 高容量腺病毒的包装系统 |
| CA2727104A CA2727104A1 (en) | 2008-06-04 | 2009-06-01 | System for packaging high-capacity adenoviruses |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801682A ES2330826B1 (es) | 2008-06-04 | 2008-06-04 | Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330826A1 ES2330826A1 (es) | 2009-12-15 |
| ES2330826B1 true ES2330826B1 (es) | 2010-07-26 |
Family
ID=41259582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200801682A Expired - Fee Related ES2330826B1 (es) | 2008-06-04 | 2008-06-04 | Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110081718A1 (es) |
| EP (1) | EP2298925B1 (es) |
| JP (1) | JP2011521663A (es) |
| CN (1) | CN102112616A (es) |
| AU (1) | AU2009254522A1 (es) |
| BR (1) | BRPI0913383A2 (es) |
| CA (1) | CA2727104A1 (es) |
| ES (1) | ES2330826B1 (es) |
| MX (1) | MX2010013365A (es) |
| RU (1) | RU2010154410A (es) |
| WO (1) | WO2009147271A2 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI775096B (zh) | 2012-05-15 | 2022-08-21 | 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 | 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd) |
| EP2878674A1 (en) * | 2013-11-28 | 2015-06-03 | Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) | Stable episomes based on non-integrative lentiviral vectors |
| SG10201810150UA (en) | 2014-03-17 | 2018-12-28 | Adverum Biotechnologies Inc | Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells |
| CN107405507B (zh) | 2015-03-02 | 2022-05-03 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法 |
| GB2545763A (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Adverum Biotechnologies Inc | Mutant viral capsid libraries and related systems and methods |
| IL296544A (en) * | 2019-04-12 | 2022-11-01 | Freeline Therapeutics Ltd | Plasmid system |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA92008A (en) | 1904-04-28 | 1905-03-07 | Josiah Byram Millet | Submarine signalling |
| CA91355A (en) | 1904-11-22 | 1905-02-07 | John Jay Tonkin | Steam boiler |
| CA92037A (en) | 1904-11-25 | 1905-03-07 | The Hooven, Owens, Rentchler Company | Turbine bearings |
| WO1979000514A1 (en) | 1978-01-18 | 1979-08-09 | Chubb Electronics Ltd | Cash registers |
| EP0217822B1 (en) | 1985-02-13 | 1993-05-12 | Scios Nova Inc. | Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system |
| CA2251466A1 (en) | 1996-04-05 | 1997-10-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto |
| AU772630B2 (en) * | 1999-01-14 | 2004-05-06 | Novartis Ag | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| JP2004501602A (ja) * | 1999-02-18 | 2004-01-22 | メルク アンド カンパニー インコーポレイテッド | エンドヌクレアーゼの使用に基づくヘルパー依存アデノウイルスベクターの生産のためのシステム |
| US6287813B1 (en) | 1999-04-23 | 2001-09-11 | Cistronics Cell Technology Gmbh | Antibiotic-based gene regulation system |
| AU5451300A (en) * | 1999-05-28 | 2000-12-18 | Mount Sinai School Of Medicine, The | A novel packaging cell line for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors |
| US6750015B2 (en) | 2000-06-28 | 2004-06-15 | Kathryn B. Horwitz | Progesterone receptor-regulated gene expression and methods related thereto |
| US20020064860A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-05-30 | Schering Corporation | Method for purifying adenoviruses |
| EP1379281A4 (en) * | 2001-03-26 | 2005-05-18 | Univ Leland Stanford Junior | HELPER-DEPENDENT ADENOVIRUS VECTOR SYSTEM AND METHOD FOR ITS USE |
| DE10148294C1 (de) | 2001-09-29 | 2003-01-16 | Unicor Rohrsysteme Gmbh | Formbackenhälfte für einen Corrugator zum Herstellen von Querrippenrohren |
| EP1534737A4 (en) | 2002-04-29 | 2007-10-31 | Univ Saint Louis | PEPTIDE ANTAGONISTS OF TGF-BETA FAMILY ELEMENTS AND THERAPEUTIC USES OF THESE ANTAGONISTS |
| ES2304069B1 (es) | 2003-08-22 | 2009-08-12 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Peptidos con capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento beta 1 (tgf-b1). |
| WO2007059473A2 (en) | 2005-11-12 | 2007-05-24 | Introgen Therapeutics, Inc. | Methods for the production and purification of adenoviral vectors |
-
2008
- 2008-06-04 ES ES200801682A patent/ES2330826B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-06-01 CA CA2727104A patent/CA2727104A1/en not_active Abandoned
- 2009-06-01 AU AU2009254522A patent/AU2009254522A1/en not_active Abandoned
- 2009-06-01 RU RU2010154410/10A patent/RU2010154410A/ru not_active Application Discontinuation
- 2009-06-01 US US12/996,346 patent/US20110081718A1/en not_active Abandoned
- 2009-06-01 BR BRPI0913383A patent/BRPI0913383A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-06-01 CN CN2009801300439A patent/CN102112616A/zh active Pending
- 2009-06-01 MX MX2010013365A patent/MX2010013365A/es active IP Right Grant
- 2009-06-01 EP EP09757650A patent/EP2298925B1/en active Active
- 2009-06-01 WO PCT/ES2009/070194 patent/WO2009147271A2/es active Application Filing
- 2009-06-01 JP JP2011512159A patent/JP2011521663A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROBIN J. PARKS et al. "{}A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal"{}. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Applied Biological Sciences. 1996. Vol. 93, páginas 13565-13570. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2298925A2 (en) | 2011-03-23 |
| EP2298925B1 (en) | 2013-02-20 |
| US20110081718A1 (en) | 2011-04-07 |
| AU2009254522A1 (en) | 2009-12-10 |
| CN102112616A (zh) | 2011-06-29 |
| RU2010154410A (ru) | 2012-07-20 |
| WO2009147271A3 (es) | 2010-04-22 |
| BRPI0913383A2 (pt) | 2016-07-05 |
| ES2330826A1 (es) | 2009-12-15 |
| WO2009147271A2 (es) | 2009-12-10 |
| JP2011521663A (ja) | 2011-07-28 |
| MX2010013365A (es) | 2011-01-25 |
| CA2727104A1 (en) | 2009-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2714259C2 (ru) | Нетоксичные векторы на основе впг для применений в эффективной доставке генов и комплементирующие клетки для их продуцирования | |
| ES2330826B1 (es) | Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. | |
| Ross et al. | Assembly of helper-dependent adenovirus DNA into chromatin promotes efficient gene expression | |
| AU2018217935B2 (en) | Potent and short promoter for expression of heterologous genes | |
| US20230039169A1 (en) | Modified EC7 Cells Having Low Toxicity to Viral Production Payloads | |
| ES2337973B2 (es) | Adenovirus auxiliares auto-inactivantes para la produccion de adenovirus recombinantes de alta capacidad. | |
| US20060257371A1 (en) | Adenoviral vectors for treating diseases | |
| de Vrij et al. | Enhanced transduction of CAR-negative cells by protein IX-gene deleted adenovirus 5 vectors | |
| Sanders et al. | Development of cell lines that provide tightly controlled temporal translation of the human cytomegalovirus IE2 proteins for complementation and functional analyses of growth-impaired and nonviable IE2 mutant viruses | |
| AU781775B2 (en) | Adenoviral vectors for treating disease | |
| JP2004517610A (ja) | 自己再編成性ｄｎａベクター | |
| Herbst et al. | Regulation of adenovirus and cellular gene expression and of cellular transformation by the E1B-encoded 175-amino-acid protein | |
| KR20080007832A (ko) | Ｃａｇ 프로모터를 포함하는 아데노바이러스용 재조합 셔틀벡터 | |
| WO2005007832A2 (en) | System for external control of oncolytic virus replication | |
| AU2005209653B2 (en) | Adenoviral vectors for treating disease | |
| Herod | Oncolytic adenovirus vectors for nitroreductase suicide gene therapy of prostate cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20091215 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2330826B1 Country of ref document: ES |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180924 |