MX2010013365A - Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad. - Google Patents

Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad.

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S Mara A Prieto Valtuea A Jesa
Susana Mouria O La Pez
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Proyecto Biomedicina Cima Sl
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Abstract

La invención se relaciona con un nuevo sistema de producción y empaquetamiento (encapsidación) para vectores adenovirales de alta capacidad que no requiere de la utilización de virus helper y que se caracteriza porque integra los genes adenovirales necesarios para el control, replicación y empaquetamiento de las partículas virales dentro del genoma de una célula hospedadora, lo cual mejora la estabilidad del sistema de producción a largo plazo.

Description

??. PARA EMPAQUETAMIENTO DE ADENOVIRUS DE ALTA CA o Técnico de la Invención La invención se encuadra dentro del campo ecnologia y, más concretamente, en el campo de la expresión de genes heterólogos en células d icular, la invención se refiere a un sistema ucción y empaquetamiento de vectores adenovirales cidad útiles para transferencia génica. cedentes de la Invención Los adenovirus de alta capacidad (HC) , ién como adenovirus gutless o adenovirus ndientes, tienen un gran atractivo como vecto pia génica porque in vivo presentan una inmuno iada muy reducida y poseen una alta eficie sducción y amplio tropismo, tanto en roedores ates. Estos vectores se caracterizan por mente las secuencias de ADN necesarias s las regiones virales codificantes, su propagac osible si las células se co-infectan con un segu minado virus helper o auxiliar, es decir, un vi codificar todas las proteínas necesarias icación de un virus defectivo y su encapsid ículas virales con capacidad infectiva. En el ca ucción de vectores adenovirales de alta capac s helper se caracteriza por tener delecionada l denoviral y proporcionar, in trans, todo el repe eínas virales necesarias para la replicación y e a progenie del virus gutless. Para la propagació ITIO también es necesaria la utilización de lares capaces de complementar la deleción de dic el virus helper, como son la línea 293 (Graham, , J. Gen. Virol., 36: 59-74) o la línea PerC6 (F 1998, Hum. Gene Ther., 9: 1909-1917).
Sin embargo con este sistema de propagación s ién partículas virales indeseables que encapsida Parks et al. (1996, Proc. Nati. Acad. Sci. 5-13570) han descrito la eliminación de la quetamiento ? del virus helper mediante un si mbinación Cre-loxP. En este sistema la señal queada por sitios loxP y la propagación del a a cabo en células 293 que expresan la recombi ulas 293Cre) . Cuando el virus helper entra en l ecombinasa escinde la señal ? impidiendo que p quetado pero manteniendo su capacidad de replic tanto, la expresión de las secuencias cod sarias para el empaquetamiento del adenovirus cidad.
Groth et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2 -6000) han propuesto la utilización de una re ireccional, en particular la recombinasa izando las secuencias attB/attP de recon cifico para flanquear la señal ?. Cuando la re 31 escinde la secuencia flanqueada por lo eíficamente por dicha recombinasa FLP. La efici ificación del virus gutless (108 bfu/ml en el como los niveles de contaminación de virus hel ia purificación en gradiente CsCl) , son muy si obtenidos con el sistema Cre-loxP anterior.
Para tratar de mejorar estos sistemas, Palm 3, Mol. Ther., 8: 846-852) han desarrollado un vado del sistema Cre-loxP, donde se ha ine rsión de la señal de empaquetamiento del virus e Por otra parte, Sargent et al. (2004, Gene T 511) han propuesto un sistema de restricción po l que se utiliza* un virus helper de más de cionado en el gen de la proteína IX, así como lar 293 capaz de complementar dicha deleción.
Sin embargo, a pesar de las mejoras, hasta el Adicionalmente, otra limitación importante par ico de los adenovirus de alta capacidad está re la dificultad para producirlos a gran escala. Ac tipo de producción es compleja, presenta una e y requiere de numerosos ciclos sucesivos de co- el virus helper.
Por todo ello es necesario perfecció edimientos, desarrollando también sistemas alte producir vectores adenovirales de alta capacid idades y con la calidad (libres de partículas aminantes) requeridas para su uso clínico.
La solución ideal a este problema sería el d una línea celular específica para la producció la de vectores adenovirales de alta capaci rgo, los sistemas de producción independiente icipación de un virus helper, plantean el probl WO0072887 describe un sistema de produc ovirus de alta capacidad independiente de a er basado en un sistema binario formado por (i) lar empaquetadora que comprende de forma es oma circular en un número reducido de copias y entos replicativos del virus de Epstein-Barr (E un genoma adenoviral delecionado en las regiones en los genes pTP y DBP, y (ii) un vector que elementos necesarios para la replica quetamiento del genoma adenoviral y que están au episoma (región E4, gen pTP y DBP) asi como rólogo. En este sistema el episoma no se empa ones puesto que (i) carece de la señal de empaqu i) su tamaño supera la capacidad de empaquétam adenovirus .
Por otra parte, O0042208 describe un si ucción de adenovirus independiente de virus he rende (i) un vector adenoviral delecionado replicación del virus Epstein-Barr, lo que pe enimiento en el núcleo de una linea celu ficada para la expresión estable del antigeno 1 (293EBNA) . Este episoma incluye las secuencias ovirus serotipo 5, los genes de la región tempra RF6 incluida en la región E4 del genoma adeno scripción de estos genes adenovirales se encuen ontrol de un promotor inducible mientras que el genes necesarios para la formación de la cápsi uidos dentro de la secuencia del adenovirus cidad.
En general, todos estos sistemas de produ I ores adenovirales independientes de helper se e tados por el tamaño de la secuencia de ADN a in ector, ya que en todos ellos el vector adenovira o más genes adenovirales necesarios para los pr icación o empaquetamiento de dicho vector. A est rle el hecho de que la presencia de est rio de la Invención En un primer aspecto, la invención se relacion nucleótido (primer polinucleótido de la invenci or de expresión que comprende: (a) un primer cásete de expresión que una secuencia nucleotidica que codi regulador transcripcional; (b) un segundo cásete de expresión que co secuencia nucleotidica que codifi endonucleasa de restricción, y que se bajo control operativo de una secuencia r de la transcripción activable por el transcripcional codificado por el polin definido en (a) .
En un segundo aspecto, la invención se relació nucleótido (segundo polinucleótido de la inve or de expresión que comprende: (a) un primer cásete de expresión que adenovirales E1A y E1B, y que se encuen control operativo de una secuencia regulad transcripción activable por el transcripcional (a) .
En otro aspecto, la invención se relaciona nucleótido (tercer polinucleótido de la inve or de expresión que comprende una secuencia nuc comprende el genoma de un adenovirus recombin ce de, al menos, la secuencia ? de empaquetamie encia que codifica la proteina E1A o E1A/E1B, a secuencia que comprende el genoma de un a mbinante se encuentra flanqueada por secue ocimiento especifico para una endonucl ricción.
En otro aspecto, la invención se relaciona ila hospedadora que comprende uno o varios polinu ictores de expresión de la invención. dicho polinucleótido en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevars ualquier orden o de forma simultánea y en dond las se transfectan en la etapa (i) con un polin cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, ent izan células que comprenden la secuencia que co eina adenoviral E1A y, opcionalmente, la oviral E1B.
En otro aspecto, la invención se relaciona la obtenible por un método de acuerdo a la invenc En otro aspecto, la invención se relaciona ema para la producción de adenovirus de alta comprende (a) una célula de acuerdo a la invención y (b) un adenovirus de alta capacidad.
En otro aspecto, la invención se relaciona r l roducción e ve r en virales adenovirus de alta capacidad y, opcionalmen (d) repetir las etapas (a) a (c) en d partículas virales de alta capacidad obte la etapa (c) se utilizan para infección en (a) del siguiente ciclo, en donde la célula hospedadora usada en la eta cciona del grupo de (i) una célula que comprende el polinucleótido de la invención y la secue codifica la proteína adenoviral ElA y, opció la proteína adenoviral E1B, en cuyo caso la va precedida de o se lleva a cabo simultánea una etapa de transfección con un polinucleótido y/o un vector de expres comprende dicho polinucleótido, (ii) una célula que comprende el polinucleótido de la invención, en cuyo caso (a) va precedida de o se lleva a cabo simult con una etapa de transfección con el (a) va precedida de o se lleva a cabo simult con una etapa de transfección con el polinucleótido de la invención y/o un v expresión que comprende dicho polinucleótido, (v) una célula que comprende el polinucleótido de la invención, el polinucleótido de la invención y una secue codifica la proteina adenoviral ElA y, opció la proteina adenoviral E1B, y (vi) una célula que comprende el polinucleótido de la invención y el polinucleótido de la invención. e Descripción de las Figuras de la Invención Figura 1. A. Representación esquemática del 4-2RÜ-El-SceI que comprende un polinucleótido A2 ción. Ai: secuencia nucleotidica que codi lador transcripcional, en este caso GAL4-hPR-encia nucleotidica que codifica las lador transcripcional GAL4-hPR-p65 comprende un mo de la timidina quinasa (Ptk) también as encias UAS {upstream activating sequences) de G de las 3 unidades transcripcionales (GAL4 1? y I-Scel) se completa con una s adenilación (pA) . pUCori: origen de replica mido pGeneV5-HisA utilizado como base trucción del plásmido pGal4-2RU-El-SceI . Amp: stencia a ampicilina para la selección de stentes en bacterias. Zeo: gen de resiste biótico Zeocina para la selección de clones re élulas eucariotas. SV40: promotor SV40 que d esión del gen de resistencia Zeor. B. Repre emática del plásmido pRc/Ad2 que compr nucleótido B según la invención. Bi: eotidica que codifica el genoma , del adenovirus, serotipo 5, a excepción de la región que codi einas E1A/E1B y la señal de empaquetamiento encia nucleotidica está delimitada por las secue dirige la expresión del gen de resistencia l de poliadenilación .
Figura 2: Sistema comercial GeneSwitch™ (In el control transcripcional de la expresió cida por mifepristona. A. Plásmido pSwitch de a proteina de fusión compuesta por el dominio de (GAL4-DBD) de la proteina GAL de levadura, el d n a ligando del receptor de progesterona humano dominio de activación de la proteina NF-?? hum La expresión del activador transcripcional GAL bajo el control del promotor mínimo de la asa (Ptk) . La unión de la forma activa de la pr secuencias GAL4-UAS asociadas al promotor r ía expresión. B. Plásmido pGeneV5-HisA diseñado aje del gen de interés. La expresión del gen a bajo el control del promotor constituido por de Elb (PEib) y las secuencias de unión al scripcional (GAL4-UAS) . C. Mecanismo de activa ™ ción de retroalimentación positiva.
Figura 3. Esquema de los sistemas de r ñados para el control transcripcional de los ge y I-Scel a partir del sistema GeneSwítc trucciones pGene-El-Scel y p2RU-El-SceI requ encia del plásmido pSwitch para la exprés lador transcripcional GAL4-hPR-p65. Por su p trucciones pRU-El-Scel y pGal4-2RU-SceI-El incl única construcción, los genes de la región El (E en I-Scel y el gen que codifica la proteina d ladora con su región promotora especifica. T s se encuentran bajo el control de promotores cas) con secuencias de unión al activador transc ) . Cada una de las unidades transcripcionales se una señal de poliadenilación (pA) .
Figura 4: Integración especifica de ADN exógen la integrasa PhiC31 del fago de Streptomyces . ir del plásmido pTG3602 mediante digestión con construcción pRC/A6-A7, linealizada con Xbal ros indican la posición dentro del genoma adeno una de las regiones homologas. Dentro del 6-?7 la secuencia adenoviral se encuentra flanq encias diana para la endonucleasa de restricció mientras que en el extremo 5' se ha inser encia attB para la integración del plásmido en a célula de mamífero. El plásmido pRcAd2 result eso de recombinación incluye el genoma a cionado entre las posiciones 190 y 3528, espondiente a la secuencia codificante de Ela y encias terminales de repetición invertidas inal repeats) . colEl: origen de replicación del RSV utilizado como base para la construcción del d2. Amp: gen de resistencia a ampicilina cción de clones resistentes en bacterias. Neo: stencia al antibiótico Neomicina utilizado cción de clones resistentes en células eucariot ficado del clon estable pRc-1. El resultad troforesis corresponde al análisis de las reacc ificación con los cebadores internos eíficamente para cada gen. El clon pRc-1 ta yó por PCR para la detección de la secuencia itado negativo de dicha amplificación conf gración especifica mediada por la recombinasa P ontrol negativo de PCR; (+) control positivo de ador de peso molecular (1 Kb Plus DNA trogen) .
Figura 7: RT-PCR de los genes adenovirales IVa RF de 34 Kd de la región E4. El cADN se obtuvo uestras de RNA total extraído de células incu ncia (1) y presencia (2) del inductor RU486. (+) tivo de PCR. : marcador de peso molecular (1 Kb er; Invitrogen) .
Figura 8: Detección del gen que codifica el control positivo de la proteína ElA se ensayó lar 293S. GADPH: Control positivo del ensayo de · Figura 10: Detección por Nested-PCR de l ovirales Illa, IV, la proteasa (Pr) y el gen que polimerasa viral (Pol) a partir del ADN ficado de los clones estables GAd-1 y GAd-ß. El la electroforesis corresponde al análisis ciones de amplificación con los cebadores ñados específicamente para cada gen. (-) : tivo de PCR; (+) control positivo de PCR; M: ma molecular (1 Kb Plus DNA Ladder; Invitrogen) .
Figura 11: Producción de adenovirus gutless KC ilizando como línea empaquetadora el clon establ extractos se recogieron a las 48, 12, 96 y 12 -transfección, y se titularon en la línea celul niveles de virus obtenidos son la media ripción Detallada de la Invención Los autores de la presente invención han dis o sistema de producción y empaquetamiento (encap vectores adenovirales de alta capacidad que no a utilización de virus helper y que se caracteri gra los genes adenovirales necesarios para el icación y empaquetamiento de las partículas ro del genoma de una célula hospedadora, lo cua estabilidad del sistema de producción a larg ismo el vector adenoviral de alta capacidad util incluye las secuencias necesarias para la repl quetamiento de los viriones (secuencias ITR y se que la capacidad de clonaje del vector es supe rada en otros sistemas de producción independi s helper u otros vectores auxiliares. Por úl cia de estos genes adenovirales en el vector cidad elimina el riesgo de cualquier respuest ra el vector durante su aplicación en clínica. bajo control operativo ele una secuencia r de la transcripción activable por el transcripcional codificado por el polin definido en (a) .
Por "regulador transcripcional" o "transactiv ende indistintamente, en el contexto de la nción, una proteina que es capaz de act scripción de un determinado gen mediante su ones especificas de reconocimiento para dicha pr región no codificante de dicho gen. En una ización particular, el transactivador o scripcional es un regulador transcripcional r "regulador transcripcional regulable" se entien exto de la presente invención, un scripcional cuya actividad puede ser modulada actores adicionales que pueden ser aportados o e unción de la necesidad de promover transcripció s que comprenden sitios de unión específicos p ifican en promotores Tet on/off (Gossen y Buja . Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Gossen , Science 268:1766-1769; Rossi y Blau, 1998, Cu echnol. 9:451-456); promotores Pip on/off (US otores dependientes de antiprogestin (US200 otores dependientes de ecdisona (Christopherson , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; No , Proc. Nati. Acad. Sic. USA, 93:3346-3351, Suh , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95:7999-8004; y W0 promotor dependiente de metalotioneina ( O86 otores dependientes de rapamicina {Rivera et a Med. 2:1028-32) .
Alternativamente, la invención contempla el ladores transcripcionales cuya inducción tiene ante un aumento de los niveles de expresión sino gente inductor que provoca un aumento de la scripcional, normalmente, originada por una tran regulador del citoplasma al núcleo. En este him. Biophys. Acta 989:25-48; Rosenfeld et al s Dev. 5:897-907) formados, por regla general, na de aproximadamente 61 amino ácidos que pres uctura secundaria compuesta por tres hélices al S de zinc formados por dos a tres docenas de ded órmula general Cys2His2 organizados en tándem (po IA, Zif268, Gli, and SRE-ZBP) en donde cad rende una hélice alfa capaz de contactar con u D de 3 a 5 pares de bases siendo necesarios al S de zinc para generar un sitio de unión a ADN idad y al menos dos dedos de zinc para generar n a ADN de baja afinidad, (iii) los dominios de denominados hélice-giro-hélice o HLH (helix-tu S como MAT1, MAT2, MATal, Antennapedia, Ultra ailed, Paired, Fushi tarazu, HOX, Unc86, Octl, 1, (iv) dominios de unión a ADN del tipo crema ina (leucine zipper) tales como GCN4, C/EBP, c- nB. Ejemplos de dominios de unión a ADN adecua enté invención incluyen el dominio de unión Las secuencias de unión a ligando capaces de ocalización nuclear de un activador transcripci contienen, adecuadas para el uso en la nción, incluyen la secuencia de localización de (receptores activados por activadores peroxi se translocan al núcleo en presencia de 1 ta] -prostaglandina J2, receptores del ácido reti ranslocan al núcleo en presencia de los isómer o gamma del ácido 9-cis-retinoico, recep esoid X, activables por ácido retinoico ptores X hepáticos activables por 24-hidroxico ptores de benzoato X, activables por lbenzoato, receptor constitutivo de an jptores de pregnano, inducibles por pregn >onitrilo, receptores de esteroides y xeno tcibles por rifampicina, receptores de prog icibles por medroxiprogesterona así como por ag igonistas de mifepristona y derivados . Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351), transac cibles por el ligando RSL1, como el sistema R ialmente descrito por Palli et al. (2003, hem.f 270: 1308-1315), un transactivador induc micina o análogos de la rapamicina (Ho et al re, 382: 822-826; Amara et al., 1997, Proc. Na USA, 94: 10618-10623), y un transactivador indu ermicina/novobiocina, que actúan competitivame ctor y represor respectivamente (Zhao et al., 2 Ther., 14: 1619-1629). En una forma pref ización, el LBD es un dominio de unión a lig ptor de la progesterona humana que puede ser act progestinas sintéticas incluyendo derivados esterona tales como RU486 o mifepristona y tran efecto alguno en pacientes tal y como rito por Wang et al., {Proc. Nati. Acad. Sci. U 8180-4) .
Por último, el dominio de activación transc Biol., 4: 260-267; armorstein et al., 1992, 408-414) , el dominio de unión a ligando del re esterona humano (Kastner et al., 1990, Embo J. , ; ang et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. -8184) y el dominio de activación de la protei na (Burcin et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. 360; Deloukas y van Loon, 1993, Hum. Mol. Ge -1900) . Este regulador transcripcional es indu pristona o su análogo RU487. En ausencia de mife expresa la proteina de fusión reguladora titutiva a partir del promotor mínimo de la asa. Esta proteina se localiza predominantemen eo y en una forma inactiva. En el momento de l inductor mifepristona, o su análogo RU486, ést alta afinidad a la región hPR-LBD de GAL4 rocando un cambio conformacional que result ;rización de la proteina y su conversión a .va. Estos homodimeros son capaces de unirse icificos (UAS: upstreajn activating sequences) pr icularmente fino. De forma general, la secue fica el transactivador o regulador transcripcio iada a un promotor apropiado que dirige su tran presión, y también a una señal de poliadenilac no es imprescindible controlar de forma e scripción de este tipo de reguladores, ésto ntrarse bajo el control de un promotor titutivo. Sin que esto suponga una limita otor mínimo puede ser, entre otros, un titutivo de virus, como CMV o RSV, o un titutivo de células eucariotas, como PGK rnativamente, es posible incluir en la región gen que codifica el regulador transcripcional un respuesta al propio regulador transcripcional, la expresión de éste provoque un aumento en la i mismo mediante un ciclo de retroalimentación una forma de realización, el regulador transc regulado por una región formada por uno ientos de unión al dominio de unión . a ADN itios específicos de dicho ADN. La endonucleasa efiere la invención es una endonucleasa que no os específicos en el genoma o ADN de células por tanto, no produce roturas en el genoma n as células. Sin que esto suponga limitación al nucleasa de restricción puede ser, entre otras, cel, I-Ppol, I-Dmol o PI-Tlil. En una re icular, la endonucleasa de restricción codifica nucleótido Al es I-Scel de Saccharomyces cerev nucleótido que contiene la secuencia codifican nucleasa de restricción se encuentra bajo ativo de una secuencia de unión al scripcional codificado por el primer elem nucleótido de la invención. De esta manera, el onde a la unión con el transactivador act imiendo la transcripción y expresión de la endo embargo, la capacidad del transactivador para ractuar con el promotor se modifica dependiendo or de regulación está unido a un ligando más preferida, el gen que codifica la endonuc ricción se encuentra en posición 3' con respe ento regulador compuesto por 6 secuencias de u or de transcripción GAL4 y la secuencia de la gen Elb (PEib) de adenovirus (Lillie y Gree ré, 338: 39-44) .
En una realización concreta del polinucleotid lador transcripcional es GAL4-hPR-p65 y la end estricción es I-Scel.
Segundo polinucleotido de la invención (polin En un segundo aspecto, la invención se relació nucleótido (en adelante el polinucleotido A2) o esión que comprende: (a) un primer cásete de expresión que una secuencia nucleotidica que codi control operativo de una secuencia regulad transcripción activable por el transcripcional (a) .
Los elementos (a) y (b) del polinucleó esponden esencialmente a los que forman parte d nucleótido de la invención y han sido descr lle con anterioridad.
El componente (c) del polinucleótido ?2 comp te de expresión que comprende una secuencia nuc codifica la proteina adenoviral seleccionada E einas adenovirales E1A y E1B. Los genes onalmente, E1B pueden proceder del genoma de a ualquier variedad o serotipo adenoviral humano aislado en humanos) , por ejemplo los serotipos ¾d5), 11 (Adll) ó 3 (Ad3) . En una realización IO componente incluye la secuencia delimitada e .ciones 505 y 3511 del genoma del adenovirus s ctor. En una forma de realización prefer onente (c) del polinucleótido A2 de la inve entra bajo control de un promotor híbrido compue encias de unión al factor de transcripción G encia de la caja TATA del gen Elb (PEib) de a lie y Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
El experto en la materia apreciará que la or los genes en el polinucleótido A2 que resp vador transcripcional no es esencial ionamiento del mismo. Así, en una forma pref ización, el segundo y tercer cásete se transe ido contrario. En otra forma preferida de rea secuencias reguladoras de la transcripción que egundo y tercer cásete comparten el mismo sitio el regulador transcripcional (a) . En una forma realización, los genes que codifican la endonu ricción y las proteínas adenovirales se encuen control de un mismo promotor híbrido compuest ndo cásete de expresión (b) comprende la secue fica la endonucleasa de restricción I-Scel rol de uno o varios sitios de unión de la protei ercer cásete de expresión (c) comprende las secu genes ElA y ElB bajo el control de uno o varios n de la proteina GAL4. En una forma de realiz preferida, los promotores regulables que di esión de la secuencia que codifica la endonuc ricción I-Scel y de las secuencias de los genes arten los mismos elementos de respuesta para Tercer polinucleótido de la invención (polin En otro aspecto, la invención se relaciona nucleótido (en adelante el polinucleótido B) o esión que comprende una secuencia nucleoti rende el genoma de un adenovirus recombinant Preferiblemente, las secuencias de reconocimie nucleasa de restricción se encuentran flanqu ma adenoviral en posición 5' y 3' respect encias ITR de los extremos, donde se encuen ones adecuadas para la replicación y transcri O genoma. El experto en la materia apreciará as de restricción utilizadas en el polinucl nderán de la endonucleasa de restricción codif polinucleótidos Al y A2 de la invención. encias diana que flanquean el genoma adenov encias de reconocimiento especifico para una end restricción con las mismas caracterist erimientos indicados anteriormente al desc nucleasa codificada por los polinucleótidos Al esto suponga limitación alguna, las secuencias p eificas para su reconocimiento, entre otras, nucleasa I-Scel, PI-SceI, I-Ppol, I-Dmol o PI- realización particular, son especifica nocimiento por la endonucleasa I-Scel.
Secuencias diana de integrasas adecuadas ización de la invención incluyen, sin limita encia diana de la recombinasa Cre del fago Pl { encia diana de la recombinasa FLP de S. cerevisi ecuencia diana de la integrasa del fago de Str {attB, attP) , la secuencia diana de la re 1-1, y la secuencia diana de la recombinasa encia diana de la integrasa lambda. En u erida de realización, las secuencias diana nción incluyen secuencias especificas para una agos que media la recombinación unidireccional OS o secuencias especificas del AD . Más particu integrasa pertenece a la . familia de integrasa na, que se caracterizan porque para la rotur na de ADN utilizan un residuo de serina c >rpe y Smith, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, ) . Los sitios de recombinación reconocidos p grasas {attB y attP) presentan secuencias dife de menor longitud que las secuencias de reco os sitios attP (pseudo-attP) . Sin que esto tación alguna, la secuencia diana de integrasa secuencia de reconocimiento especifico para la 31, TP901-1 o R4, entre otras. En una re icular, la secuencia diana de integrasa espondiente al sitio de anclaje en el ADN de eifico para la integrasa del fago PhiC31. Esta e mediar la recombinación unidireccional en encia attB y secuencias pseudo-attP localizad rna de células humanas.
Asi, en otra forma preferida de realiza nucleótido B incluye, en dirección 5' onalmente, la secuencia de reconocimiento grasa; la primera secuencia de reconocimiento nucleasa; el genoma del adenovirus (cuyos limi nidos por los ITR del propio adenovirus) ; y l encia para la endonucleasa de restricción. nucleótidos de la invención incluyen vect esión en procariotas tales como pUC18, pUC19, B s derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl fagos y vectores "shuttle" tales como pSA3 a ores de expresión en levaduras tales como vect de plásmidos de 2 mieras, plásmidos de int ores YEP, plásmidos centroméricos y similares, xpresión en células de insectos tales como los a serie pAC y de la serie pVL, vectores de exp tas tales como vectores de la serie pIBI, pEa f pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y sim ores de expresión en células eucariotas superi dos en vectores virales (adenovirus, virus aso adenovirus, asi como retrovirus y, en pa ivirus) asi como vectores no virales tales como CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, /His, pIND/GS, pRc/HC V2, pSV40/Zeo2, pTRA /VS-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, d y pTDTl. Vectores particularmente apropiados uyen, por ejemplo, uno o más genes clonados y rol transcripcional de secuencias reguladoras lo ' y 3', asi como un marcador de selección. Sin nga una limitación, dentro de las secuencias d ncluye un promotor (incluyendo el sitio de ini scripción) capaz de expresarse en células eucar o de unión a ribosomas, una señal de procesa un sitio de terminación de la transcripción l de poliadenilación.
Preferiblemente los vectores comprenden a rtero o de selección que confiere un fenotipo a lo expresa y que facilita la identificación y/o quellas células que han incorporado el vector t > puestas en contacto con éste. Es preferent tipo de selección no sea expresado en la célula ia a su transfección o infección. Genes reporter el contexto de la presente invención incluy ferasa, timidina quinasa, GFP y similares. furanosil adenina, el gen de la citosina deami ite a las células crecer en presencia fonacetil) -L-aspartato, el gen de la timidina permite a las células crecer en prese c-pterina, el gen de Xantin orribosiltransferasa, que permite a las células encia de xantina y ausencia de guanina, el gen t que permite a las células crecer en presencia ugar de triptófano, el gen hisD de E. coli, que células usar el histidinol en lugar de histidin elección se incorpora en un plásmido que puede ionalmente, un promotor adecuado para la expr 0 gen en células eucariotas (por ejemplo, los p o SV40) , un sitio optimizado de iniciació ucción (por ejemplo un sitio que sigue las de as de Kozak o un IRES) , un sitio de poliadenilac ejemplo, el sitio de poliadenilación del SV40 oglicerato quinasa, o intrones como, por eje :ón del gen de la beta-globulina. Alternativa emas comerciales que pueden facilitar la constr ores de expresión para los polinucleótidos nción. Asi por ejemplo, la construcción de un esión para células de mamíferos que inc nucleótido A se vería facilitada si se utilizan el sistema de expresión inducible Ge itrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos. Kl 0-2), que permite la construcción de un vector esión de un gen de . interés de manera induc pristona; el sistema de expresión inducible Rh England Biolabs, Beverly, A01915-5599 USA), qu xpresión de un gen de interés de manera inducib ndo RLSl; o cualquier otro sistema comercial equ Los polinucleótidos y vectores de la invenci ntrarse formando parte de células hospedadoras q o como vehículo de propagación de los vectores las empaquetadoras para la producción de a mbinantes. Así, en otro aspecto, la inve una línea celular estable. Sin que esto tación alguna, las células hospedadoras pu las HeLa, A549, KB, HuH7, o cualquier otr riota capaz de soportar el ciclo de vida del ad el caso de que los polipéptidos E1A o E1A/ tados por la propia célula (en los casos en ?? izan el polinucleotido Al de la invención) , su e estar bajo el control de un promotor regulable ? agente inductor, para un mayor control del ini esión de los genes adenovirales incluidos nucleótido B y así limitar al máximo el riesg bles efectos citotóxicos derivados del ex esión proteínas virales. En este caso no será célula que exprese dichas proteínas de modo cons ejemplo una célula 293 o PerC6.
En una realización particular, la célula hospe inaría de mamífero, preferentemente de pr icialmente de humano. En una forma prefe En una forma preferida de realización, la inv ciona con una célula hospedadora que comp nucleótido Al de la invención o un vector que 0 polinucleótido . En una forma de realización erida, la célula comprende, adicionalmente una codifica la proteina adenoviral E1A y, opcionalm encia que codifica la proteina adenoviral ElB.
En otra forma preferida de realización, la inv ciona con una célula hospedadora que comp nucleótido A2 de la invención o un vector que 0 polinucleótido.
En otra forma de realización, la invención se una célula hospedadora que comprende el polinuc la invención o un vector que comprend nucleótido .
En otra forma de realización, la invención se Tanto las células que comprenden los polinucle de la invención como las células que compre nucleotidos A2 y B son particularmente adecuado ucción y empaquetamiento de vectores adenovirale cidad por lo que tanto las células que compre nucleotidos Al y B de la invención como las cé renden los polinucleótidos A2 y B pueden u edimientos y sistemas para la produc quetamiento de dichos vectores. Sin icularmente útiles para la producción de adeno llas en las que los sitios diana que flanquean oviral defectivo en el polinucleótido B se cor la endonucleasa de restricción codificada nucleotidos Al y A2, ya que, de otra ma nucleasa de restricción codificada p nucleotidos Al o A2 no podrían actuar nucleótido B liberando el genoma adenoviral, lo icial para la replicación y transcripción de dich .5 en Ausubel, F.M. et al., "Current Prot cular Biology", John Wiley & Sons Inc; ringbou ) . En particular, las células se pueden tr ante co-precipitación de ADN con fosfato cálci rano, polibreon, electroporación, microinyecció ada por liposomas, lipofección, infección por r ansfección biolistica.
Asi, en otro aspecto, la invención se relació do para la producción de células adecuadas ucción y empaquetamiento de partículas infectiv ovirus de alta capacidad que comprende (i) transfectar una célula polinucleotido Al de la invención y (ii) transfectar dicha célula polinucleotido B de la invención en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevars cualquier orden o de forma simultánea y en izan células que comprenden la secuencia que co eína adenoviral E1A o cionalmente la en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevars ualquier orden o de forma simultánea.
El experto en la materia apreciará que las eta en los métodos descritos anteriormente pueden 1 > de forma que los polinucleótidos o vec entren de forma transitoria en la cé rnativamente, pueden llevarse a cabo de form nga una expresión estable de los polinucleótid B. En el caso de que se desee obtener expresió os vectores de la invención en las células hosp necesario incluir durante la etapa de transf cción un gen que codifique para resistenc rminado antibiótico, de forma que se puedan se llas lineas celulares que han incorporado el A >ma de aquellas lineas celulares en las que e entra en posición extracromosómica . El gen que ccionar las células se puede aportar formando o vector que contiene la construcción objet rn iv m e a stencia. Preferiblemente, el gen de resist uye dentro de los propios vectores de la inven s de resistencia adecuados para la transfección ritos con anterioridad. Por tanto, en una forma realización, el método de obtención de cél renden los polinucleótidos Al y B o A2 y B de nvención incluyen una etapa adicional de selecc se seleccionan células que han integrado de form rimer y/o el segundo polinucleótido en base a m elección presentes en los polinucleótidos util etapas (i) y (ii) .
Por una parte, la transfección con un v esión que comprende el polinucleótido A2 ha ccionar clones de células que integran el polin odo estable (mantenimiento de las células hast cultivo) . Ventajosamente, se ha comprobado esión de las proteínas E1A/E1B y de la endonu ricción está reprimida, manteniendo unos nivele ecuencia de reconocimiento de la integrasa, para la integración del polinucleótido B en el geno la. Preferiblemente, en el caso de que el nocimiento de la integrasa sea el sitio attB, implica una co-transfección con un plásmido que ntegrasa del fago PhiC31, lo que permite la in polinucleótido B o del vector que contie nucleótido en el genoma de la célula medi mbinación entre la secuencia attB y secuencias presentes en los cromosomas de células human mbinación e integración unidireccional está me integrasa PhiC31. Para la expresión de las d ones virales y la posterior replicacion del gen enté en el polinucleótido B es necesario que los del virus estén libres además de ser necesaria t encia de las proteínas E1A/E1B virales. Consecue células generadas portan el genoma del a ctivo pero este no se puede expresar ni replicar posible que se produzcan también integraci m l ri la inte r t nucleótidos A2 y B, en donde dichos polinu en encontrarse integrados de forma estable en a célula o pueden encontrarse de forma transitori Sistemas y métodos para la producción y empaqu ectores adenovirales de la invención Las células empaquetadores obtenidas medi oducción en lineas celulares de los polinucleóti nción o de los vectores que las comprenden p izadas para la generación de vectores adenpvi capacidad mediante la introducción en dichas c mas adenovirales que comprenden el gen de inte ante transfección con polinucleótidos que comp ma adenoviral o bien mediante infección con a )mbinantes que comprenden dicho gen. scción/transfección con el adenovirus/polinucleó prende el genoma adenoviral y que comprende a s de interés, y la puesta en contacto de las célul los genes tempranos E1A y E1B que se e ficados bien por el polinucleótido A2, en c onden a la activación del regulador transcripc en la propia célula empaquetadora, también rol del regulador transcripcional.
En otro aspecto, la invención se relaciona ema para la producción de adenovirus de alta comprende (a) una célula de acuerdo a la invenc (b) un adenovirus de alta capacidad En otro aspecto, la invención se relaciona do para la producción y empaquetamiento de ovirales de alta capacidad, que comprende las et (a) transfectar o infectar una hospedadora con un polinucleótido que com genoma del adenovirus de alta capacida desea multiplicar y empaquetar o con un en donde la célula hospedadora usada en la lecciona del grupo de (i) una célula que compren polinucleótido Al' de la invención y la secu codifica la proteina adenoviral E1A y, opció la proteina adenoviral E1B, en cuyo caso la va precedida de o se lleva a cabo simultánea una etapa de transfección con el polinucleó la invención o un vector de expresión que dicho polinucleótido, (ii) una célula que compren polinucleótido A2 de la invención, en cuyo etapa (a) va precedida de o se lleva simultáneamente con una etapa de transfecci polinucleótido B de la invención o con un expresión que comprende dicho polinucleótido (iii) una célula que compren polinucleótido B de la invención, en cuyo etapa (a) va precedida de o se lleva (v) una célula que compren polinucleótido Al de la invención, polinucleótido B de la invención y una secu codifica la proteina adenoviral E1A y, opció la proteina adenoviral E1B, y (vi) una célula que compren polinucleótido A2 y B de la invención.
La etapa (a) del método para la prod quetamiento de vectores adenovirales de alta rende la puesta en contacto de una célula empa un adenovirus de alta capacidad o con un polinuc or que comprende el genoma de dicho adenovirus.
Por "adenovirus de alta capacidad" se entien invención, adenovirus recombinantes de los de ndientes de auxiliar o gutless, caracterizado cen de todos los genes del genoma adenoviral ex ones ITR 5' y 3' y la región de empaquetamiento tonina (MRH) , hormona inhibidora de prolactin tostatina, hormona adrenocorticotropa (ACTH) , totropa o del crecimiento (GH) , . hormona lut , hormona foliculoestimulante (FSH) , tirotropin ona estimulante del tiroides) , prolactina, o ona antidiurética (ADH o vasopresina) , melatonin bidor Mülleriano, calcitonina, hormona para :rina, colecistoquinina (CCK) , secretina, PBGD, :imiento de tipo insulina tipo I (IGF-I), f :imiento de tipo insulina tipo II (IGF-II), riurético atrial (PNA) , gonadotrofina coriónic i ) , insulina, glucagón, somatostatina, po reático (PP)/ leptina, neuropéptido Y, .otensina I, angiotensina II, factor VIII, fa ;or tisular, factor VII, factor X, trombina, :or XI, factor XIII, interleukina 1 (IL-1), ínte (IL-2), factor de necrosis tumoral Alfa írleuquina 6 (IL-6) , interleuquina 8 (IL-8 y chem ¡rleuquina 12 (IL-12) , interleuquina 16 - crecimiento endotelial, antitripsina 1 alfa, f osis tumoral, factor estimulante de colo ulocito y macrófagos (GM-CSF) , cardiotrofina 1 statina M (OSM) , anfiregulina (AR) , cicl inógeno, lactoferrina, activador de plasminóg lar (tPA) , quimotripsina, inmunoglobinas, róxido dismutasa, imiglucerasa, ß-Glucocereb osidasa-a, a-L-iduronidasa, iduronato-2-s ulfasa, a-galactosidasa A humana, inhibidor einasa a-1, lactasa, enzimas pancreáticas asa, proteasa) , adenosina deaminasa, inmunogl mina, toxinas botulinicas de tipo A y B, co cirribonucleasa I humana, hialouronidasa, pap raginasa, lepirudin, estreptoquinasa, bidores del factor de transformación celular bet 3s como los descritos en WO0331155, WO200 393293, cuyo contenido se incorpora en la unción por referencia, casetes de expresión a i la transcripción de moléculas de RNA de ínte ovirus controles que en lugar de dicho ADN de no comprenden el fragmento de 22 kb del fag rito en Parks et al. (1999, J. Virol., 73:8027-8 itud total del ADN de relleno humano puede va la entre 20 y 30 kb, preferiblemente de 20 a 25 preferiblemente, de 21 a 23 kb, por ejemplo 2 ro de secuencias que actúan en cis en dich eño puede variar entre 2, 3, 4 o más e incl tación, el dominio repetido alfoide de 16.2 kb Smith et al., 1995, Mol. Cell. Biol., 15:51 ones de adhesión a la matriz (MAR) como por ej mento de 4.2 kb que contiene el extremo izqui ovirus de tipo 6 o dos copias de la región de a matriz de la inmunoglobulina ? (según fue des et al., 1994, Cell, 77:239-248); una región d epatocitos (HCR) tales como el fragmento de 1. rende dicho HCR (según fue descrito por Miao , Molecular Therapy, 1:522-532); u otra r sión a matriz tales como el la región de 2.8 -ector que lo comprende mediante transfección med ipitación de ADN con fosfato cálcico, DEAE-breon, electroporación, microinyección, fusión liposomas, lipofección, infección por retr sfección biolistica. Alternativamente, es posib contacto las células con el adenovirus que ificar, en cuyo caso la propia capacidad del a nfectar células permite la introducción en la 0 genoma.
Por "célula empaquetadora" se entiende cualq células descritas en la presente invenció ienen, al menos el polinucleótido A1/A2 nucleótido B de la invención. El experto en l ciará que es posible el uso de distintas quetadoras. Sin embargo, dependiendo de la prese la célula empaquetadora de uno o más nucleótidos de la invención, la etapa (a) edida de o llevarse a cabo simultáneamente con ransfección en la ue las células se onen en etapa previa o simultánea a la etapa (a) consis ransfeccion de dicha célula con el polinucleotid nción o un vector de expresión que compren nucleótido.
En el caso de que se utilice una célula que olinucleotido A2 de la invención, la etapa (a) edida de o llevarse a cabo de forma simultánea a de transfeccion con el polinucleotido B de la con un vector de expresión que comprend nucleótido .
En el caso de que se utilice como célula empa célula que comprende el polinucleotido B de la i tapa (a) debe ir precedida de o llevarse a cabo ltánea con una etapa de transfeccion nucleótido Al de la invención y, en cuyo caso, comprender, adicionalmente, una secuencia que proteina adenoviral E1A y, opcionalmente, la oviral E1B. nción y una secuencia que codifique la oviral E1A y, opcionalmente, la proteina adeno alternativamente, una célula que compre nucleótidos A2 y B de la invención.
La etapa (b) del método de la invención com ener las células transfectadas/infectadas obteni >a (a) en condiciones que permitan la repli quetamiento del adenovirus de alta capacidad. P ecesario que dichas condiciones permitan la expr lador transcripcional codificado por el polinucl , de forma que éste actúe sobre sus sitios de un ?? reguladora del gen de la endonucleasa presen .nucleótido Al y A2 y sobre sus sitios de uni _ón reguladora de los genes adenovirales E1A sentes en el polinucleótido A2. Para ello, en los que el regulador transcripcional codificado .nucleótido Al o A2 sea un regulador activable, implica poner en contacto las células con el age a r e n . , 8:453-465) , o de modo indirecto mediante i al del efecto citopático en las células. Opció ultivo de las células puede incluir la adición ultivo fresco.
En la etapa (c) , los adenovirus generados á >a (b) son recuperados del cultivo celular. Para sario separar las células del medio de cul quier método conocido por los expertos en la psinización y centrifugación o filtración) , ro las en solución inerte (ciclo elación/descongelación, homogenización, so tación, uso de detergentes y similares) y puri :iculas' de adenovirus por métodos conocidos co la ultracentrifugación en gradiente de CsCl o :intos tipos de cromatografía tales como una co cromatografía de intercambio iónico y cromatog lidad con quelatos metálicos (Huyghe et al., 1 ? Ther., 6:1403-1416), una combinación de cromato La etapa (d) , que es opcional, consiste en re as de (a) a (c) una o varias veces. Para ello, a (a) del ciclo, se utiliza como material de iculas adenovirales obtenidas en la etapa (c) rior. De esta manera se puede repetir el proce nción sucesivas veces obteniendo un número iculas adenovirales en cada ciclo.
La invención se ilustra a continuación en ba ientes ejemplos que se proporcionan a modo ilus imitativo del alcance de la invención.
PLOS Ejemplo 1: Construcción del plásmido pGal4-2R la expresión inducible de los genes adeno iral y de la enzima de restricción I-Scel.
En la presente realización, el plásmido pGal , que contiene el polinucleotido A2 según se déf nción Fi . 1A se ha diseñado es ecíficamente uido en la presente invención, está mediado ema de la antiprogestina mifepristona (Burcin , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96: 355-360) lacien tiene lugar a través de una proteina d nsible a hormonas endógenas humanas pero a encia de antiprogestinas sintéticas (RU486) cientemente bajas como para evitar efectos secun nos .
Como base de la construcción del plásmido pGal se ha utilizado el sistema comercial Ge itrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos. Kl 0-2) . Este sistema proporciona todos los co ticos necesarios para el diseño del plásmido qu olinucleótido A2.
El primer componente del sistema GeneSwitch or pSwitch (Fig. 2A) , el cual codifica la pro ón GAL4-hPR-p65 que actúa como activador transcr roteina se divide en un dominio de unión a ADN rol de un promotor híbrido derivado de la unió encias de activación de GAL4 de Saecharomyees c : upstream activating sequences) (Giniger et a , 40: 767-774; ang et al., 1994, Proc. Nati. A 91: 8180-8184) y el promotor mínimo del gen asa (Ptk) del Virus Herpes Simplex. La r vación del promotor incluye 4 copias de la T/C) GGAGTACTGTCCTCCG-3 ' (SEQ ID NO:l). Cada una e como sitio de unión para dos moléculas del d n a ADN del factor de transcripción GAL4 (Marmor 1992, Nature, 356: 408-414).
El segundo componente del sistema GeneSwitc mido pGene/V5-HisA (Fig. 2B) , que controla la gen de interés. En este caso el promotor hí rola la transcripción se compone de secuencias factor de transcripción GAL4 y la secuencia de del gen Elb (PEi ) ele adenovirus (Lillie y Gre re, 338: 39-44) . lizadas en los plásmidos pGene/V5-HisA y vando así la transcripción del gen de interés codifica el propio factor de transcripción (Fig.
En base a la idea planteada en la presente inv r la región El de Ad5 y el gen de la endonuclea el control del sistema inducible Gen ialmente se diseñaron distintas combinaciones de egulación, la secuencia del genoma adenoviral ciones .505 · y 3511 (Ad5 (505-3511) ) (GenBank: AC gen codificante de I-Scel. En estas combinac nismo de regulación se basa en la utilización plásmidos y en los que los genes El y el ge an bajo el control de un único promotor o bien rol de promotores diferentes dispuestos, a su v a o distinta orientación (Fig. 3A) . Cada una inaciones se ensayó para determinar la capa lación de la expresión de la región El y el gen capacidad de integración estable dentro de llar. De todas ellas la construcción Gal4-2R a cepa DH5OÍ, y 30 °C para STBL2. Las bacteri tsformadas siguiendo el protocolo del CaCl2 ialmente por Hanahan (1983, J. Mol. Biol., 166: ello se mezclaron 10-20 ng de ADN plasmidico c élulas competentes y se mantuvo en hielo durant ntinuación, para aumentar la eficiencia del pr la se incubó a 42 °C durante 1 minuto e inmediat sfirió a hielo en donde se incubó otros 2 min. P ñadió 1 mi de medio LB y se incubó durante 1 h gitación.
Para la purificación de plásmidos, asi como ficación de fragmentos de ADN producto de la enzimas de restricción tras su separación en osa, se utilizaron los sistemas FX microplasmid Healthcare Europe, 8290 Barcelona, España) y QIA action kit (Qiagen, Valencia CA91355 ectivamente, siguiendo las recomendacion ricante. iamente a su introducción en la cepa de espondiente. Los clones recombinantes se selecci al marcador de resistencia codificado por el ve irmaron por digestión con endonucleasas de rest troforesis en gel de agarosa al 1%.
Todas las reacciones de PCR diseñadas en el p esis del plásmido pGal4-2RU-El-SceI se llevaron encia de 1 U del enzima Taq polimerasa {BioTaq, res N 2 6EW, UK) , tampón de PCR (Bioline) , Mg mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, AD onizada estéril hasta un volumen final de 50 iciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización de 4 minutos a 95 °C; 29 cicl indos a 94 °C de desnaturalización, 40 segundos a ridación con el cebador y 40 segundos a 7 igación; 1 ciclo de 5 minutos a 72 °C de elongaci i el análisis de los productos de amplifica »tras se mezclaron con 1.5 µ? de la solución il de bromofenol 0.25% en a ua destilada Glic uir el LinkerRU2. Éste se sintetizó previamente os cebadores LinkerRU-1: 5'-CACCAAGGATCCTCTAGAACCGTTTAAACACCACTAGTCCAACGCGTG CGCA-3' (SEQ ID NO: 2) LinkerRU-2: TCTGCGGCCGCGGTGATATCACGCGTTGGACTAGTGGTGTTTAAACGG TTGGTGGTCCTGCA3 ' (SEQ ID NO: 3) En la reacción de anillamiento se mezclaron cebador a una concentración 50 mM en soluci S-HCI 50 mM pH8.0; NaCl 100 mM; EDTA 1 r iciones de reacción fueron las siguientes: 95 ° inutos y 52 °C durante 10 minutos. Seguida mento LinkerRU2 se fosforiló con el en nucleótido kinasa siguiendo las recomendaci icante (New England Biolabs) . La reacción se tos a 37 °C se inactivo a 65 °C durante 15 mi minó pGene-LinkerRU2 y será la basé de la con vector pGal4-2RU-El-SceI . 2) Clonaje de la región El del adenovirus: A partir del vector pGL3-Basic (Groskreutz y S , Methods Mol. Biol., 63: 11-30) y mediante digé fl y Xbal se liberó un fragmento de 262 pb que i l de poliadenilación del SV40 (SV40pA) . Esta sec ó en el plásmido pBluescript II KS(+) (Strata a CA92037, USA), digerido previamente con esto .mas, para dar lugar al plásmido pBS-SV40pA.
Por su parte, la digestión secuencial del eV5-HisA con los enzima Salí (posición 151) ición 895) permitió el aislamiento de la adenilación de la hormona de crecimiento bovina s fragmento de 744 pb se clonó en el plásmido p balizado previamente con Salí y BamHl y cuyo extr píamente se hizo romo con Klenow siguie imendaci nes del fa r cante NA l r mido pGene-LinkerRU2. La orientación correcta de SV40pA-BGHpA-3 ' ) se confirmó por restricción con La región El del Ad5 se amplificó por PCR dores : adl9 5 ' -GAGTGCCAGCGAGTAGAGTT-3 ' (SEQ ID NO: ad22 5 ' -GAATTCTCAATCTGTATCTTCATC-3 ' (SEQ ID El producto resultante de 3 kb se clonó en cifico para productos de PCR pGemT-Easy (Promeg ica, 28108 Madrid, España) . Mediante digestión urificó dicha región El y se subclonó dentro de I del vector pGeneLinkerRU2-2pA y que se riente abajo" de la señal de poliadenilación mido resultante se denominó pGeneLinkerRU2-2pA-El 3) Clonaje del gen GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD ( iscripcional) y su región promotora autorregulada.
La di estión del vector Switch con los en Para recuperar esta segunda señal de poliade ecuencia SV40pA se purificó a partir de la con ial pGeneLinkerRU2-2pA por digestión con B mento de 0.2 kb se clonó dentro de la diana ún plásmido pGeneLinkerRU2-Gal4-BGHpA-El . 4) Clonaje del gen I-Scel El gen que codifica la endonucleasa I-Scel ante amplificación por PCR con los cebadores: Scel-bl 5 ' -AAACCATGGGATCAAGATCGC-3 ' (SEQ ID Scel-b2 5 ' -CCCTCTAGATTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGG *0:7), a partir del plásmido pl-Scel (Choulika, et a R. Acad. Sci. III, 317: 1013-1019). Tras su e a?-Easy se liberó mediante digestión con el e :ricción Notl. Los extremos del fragmento puri .eron romos con el fragmento Klenow sigui )mendaciones del fa ricante N w En l nd l gen Elb de adenovirus (PEIB) . El fragmento se ro de la diana compatible Spel localizada, de mido pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-El, entre la secu adenilación BGH y la región El. La con ltante se denominó pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI- 5) Clonaje del promotor inducible dual para e a transcripción de I-Scel y la región El del ade La región del vector pGeneV5-HisA que eng encias reguladoras de unión al activador transc ) y el promotor mínimo PEIB se obtuvo por ampl PCR con los cebadores: PRU-1 5 ' -AATACTAGTCCGAGCTCTTACGCGGGTC-3 ' ), y PRU-2 5 ' -AATACGCGTGGTGGCCTGTGAAGAGAAAAAA-3 ' ), se subclonó en el vector GemT-Eas . Poster Dentro de la secuencia que engloba el genoma a a delecionado la secuencia de empaquetamiento ón correspondiente a los genes tempranos Ela y mayor control de la expresión del resto de l les. Asimismo, la secuencia adenoviral se mitada en ambos extremos por secuencias de recon la endonucleasa de restricción I-Scel de Sacc visiae (Anglana y Bacchetti, 1999, Nucleic Aci 4276-4281) la cual, debido al tamaño de su a (TAGGGATAACAGGGTAA - SEQ ID NO: 8) y cificidad, no reconoce secuencias dentro del gen la a transfectar. La inserción de estas s lita la liberación del genoma viral sólo en pre roteina I-Scel. Esta digestión deja libres los del adenovirus, necesarios para la correcta tran plicación del ADN viral.
Por último, en el extremo 5' de la construcci uido n sec ncia a B e r m v r resultantes difieren de las secuencias attB inales, bloqueando posibles reacciones de reco ndarías . En células humanas, PhiC31 es capaz itos de recombinación en puntos del genoma en ten secuencias con identidad parcial a attP minan pseudo-attP (Fig. 4). Según Thyagarajan I, supra) el número total de secuencias ps ía estar entre 102 y 103 lo que hace que la frec gración sea de 2 a 3 veces mayor que en el cas graciones mediadas por recombinación homologa, 0 a 100 veces mayor que la integración mediada mbinasas específicas como la recombinasa Cre.
Las cepas bacterianas de E. coll utilizadas agación de las construcciones descritas a con on DH5 , STBL2 y BJ5183. Las bacterias sformadas siguiendo el protocolo del CaCl2 descr plo 1. El crecimiento se llevó a cabo en me ani (LB) (Sigma-Aldrich) suplementado con Ampici i Si ma-Aldrich como medio de selección a El vector pRcAd2 se diseñó en 4 pasos, des inuación: 1) Clonación de la secuencia a ttB-IScel-Ad ( 1-19 El primer paso en la construcción del vector p mplificación por PCR de la región attB con los c attB-Pl 5 ' -AGATCTGTCGACGATGTAGGTCACGGTCTC SEQ ID NO: 11) y attB-P2 TAATTAATTACCCTGTTATCCCTAGTCGACATGCCCGCCGTGA-3 ' 2) , utilizando como molde el plásmido pTA-attB ( . 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97: 5995-jmento amplificado se subclonó en el vector e i productos de PCR pGemT-Easy (Promega) , sigui smendaciones del fabricante. El cebador attB-P2 i :er con la secuencia de reconocimiento para el :ricción I-Scel de Saccharomyces cerevisiae. ad64: 5 ' -AGATCTCGGCGCACACCAAAAACGTC-3 ' (SEQ ID y su clonaje en el vector pGemT-Easy.
En la construcción resultante, pGemT/attB-?ß, estricción para I-Scel queda insertada entre 1 y la posición 1 del genoma del adenovirus. 2) Clonación de la región Ad (3528-4459) El inserto ttB-IScel-Ad (1-190) , de 512 pb, se ante digestión con BglII y se subclonó en e A4-A5. Este vector es producto de ' la amplificac encia del adenovirus comprendida entre las p y 4459 con los cebadores: ad57 5 ' -AGATCTCGTGGCTTAAGGGTGGGAAA-3 ' (SEQ I ad58 : 5 ' -TCTAGATTATATGGCTGGGAACATAGCC-3 ' ( 6) . y su clonaje en el vector de expresión RSV (Invitrogen) , el cual incluye, además de stencia a am icilina él en de resistencia a . 3) Clonación de la región Ad (34901-35938) El extremo 3' del genoma adenoviral (posicion 8) se amplificó con los cebadores: ad59: 5 ' -TCTAGATTAGCTATGCTAACCAGCGTAG-3 ' ( SEQ I ad65 : 5 ' -GGTACCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAA EQ ID NO:18) .
En el extremo 5' del cebador ad65 se in encia diana para el enzima de restricció rayado) . Ambos cebadores incluyen en su extrem as de restricción para Xbal (ad59) y Kpnl (a mento de 1060 pb, producto de esta amplifica ó con estos enzimas para facilitar su s riente abajo" de la región Ad (3528-4459) insert or pRC/A6-A5. La construcción resultante se A -A7. u recircularización se evitó mediante la desfosf us extremos con fosfatasa alcalina.
Tanto el vector linealizado pRC/A6-A7 como el rado del plásmido pTG3602 se utilizaron simult transformar la cepa bacteriana electrocompeten BJ5183 (BJ5183 Electroporation competent tagene) . Estas células están diseñadas especialm over procesos de recombinación entre secuencias n vector transférente, que contiene el gen de i ector que incluya el genoma adenoviral. En este ones homologas incluidas en ambos fragmentos iones Ad(3528-4459) y Ad (34901-35938 ) ) favore eso de recombinación cuya resolución conl rción del genoma adenoviral dentro del vector pR rtir de la posición 4459 del virus (Fig. 5) .
El proceso de electroporación se llevó iendo las recomendaciones del fabricante, tro orador Gene Pulser Biorad establ ci El análisis de restricción con HindlII con ecta inserción del genoma adenoviral en sólo un es obtenidos y que se denominó pRcAd2.
El plásmido pRcAd2 incluye el genoma comp ovirus, a excepción de la región localizada e ciones 190 y 3528 y que corresponde a la regió encia se encuentra delimitada por dianas de re I-Scel, y posee una secuencia attB en su ex . 5) .
Ejemplo 3: Construcción y caracterización d lares estables para la producción y empaqueta ores adenovirales de alta capacidad En la presente invención se ha propuesto la lineas celulares estables diseñadas para la pro quetamiento de vectores adenovirales de alta c s células serán capaces de producir todos los co proporciona un segundo nivel de control scripción. La inducción (y por tanto la produ iculas virales) se inicia en el momento de la a o de cultivo de mifepristona o su análogo RU486.
Al no ser necesaria la utilización de un vir nte el proceso de producción, el sistema desarro inventores permite la obtención de extractos vi contaminación residual indeseable de partículas contienen copias genómicas de dichos virus helpe En la presente realización se ha utilizado lar humana de carcinoma de pulmón A549 para el sistema de producción de vectores de alta ^pendiente de helper. Esta línea celular inic :d et al. (1973, J. Nati. Cáncer Inst. , 51: 141 :eriormente caracterizada en profundidad por Lieb ?6, Int. J. Cáncer., 17: 62-70) , presenta ibilidad a la infección por adenovirus lo que le elevado otencial como línea de roducción de vir quetamiento capaz de complementar la sint eínas virales implicadas en la replicación, for ápside y empaquetamiento de adenovirus de alta c células A549 se incubaron en placa de 10 cm2 a hasta alcanzar una confluencia del 80%. Las on co-transfectadas mediante lipofectamina con 3 trucción pRcAd2 (confiere resistencia a la r) ) y 1 g del plásmido pCMV-Int {Groth et al Nati. Acad. Sci. USA, 97: 5995-6000), que co grasa del fago PhiC31 de Streptomyces y que pr gración estable del plásmido en el genoma de . 6A) .
El ADN de ambos plásmidos se diluyó previamen de medio sin suero OPTI-MEM (Gibco®: Invitrogen, .008, USA) . Para favorecer la formación de los :e el ADN y lípidos catiónicos se añadió el reac jrent (Invitrogen) en una relación 1:0.75 (D jent) . Tras 5 minutos de incubación a temperatura añadieron ß ? de Li ofectamina LTX (Invitro células transfectadas se levantaron con psin-EDTA; Gibco®) y se centrifugaron a 1250 rp nutos a temperatura ambiente. El precipitado d esuspendió en 6 mi de medio de cultivo y se re placas de 60 cm2. Se añadió medio nuevo, en ementado con el antibiótico de selección G418, a eomicina, a una concentración de 600 pg/ml. Cada rocedió al cambio del medio de cultivo hasta la lones aislados resistentes al antibiótico (2-3 clones se levantaron con tripsina y se transf llos de 0.3 cm2 con medio de selección. La incu inuó hasta alcanzar el 80% de confluencia y seg transfirieron a pocilios de mayor superfic sivos pases se aisló un clon resistente a bió el nombre de pRc-1. Para probar la estábi las células se mantuvieron 4 meses en cultivo s rvaran cambios en su morfología o viabilidad.
Para confirmar la integración del plásmido pRc aislado, se extrajo el ADN genómico del clon en Cebador T P lla Illal 5 ' -AGAGCCAGCCGTCCGGCCTTA-3 55 IIIa2 5'-CGCGGTCGCCTGTGGGAGCCC-3 IIIa3 5 ' -GGTTGCACTAAACGCCTTCC-3 ' 54 • IIIa4 5 ' -AGCCCCTGCAAGTTTTTGAA-3 ' IV IV1 5'-CCTCTAGTTACCTCCAATGGC-3' 45 IV2 5 ' -AGTAACTTTAGTTTGCAAGGA-3 ' IV3 5'-GGGCAACACACTCACCATGC-3' 55 IV4 5 ' -ACATGCAAAGGAGCCCCGTA-3 ' teasa Prl 5'-ACAGCTGCCGCCATGGGCTCC-3' 55 Pr2 5 ' -GGGCGAGTGGCGCTCCAGGAA-3 ' Pr3 5 ' -GCTTTTCTGACCAGCGACT-3 ' 51 Pr4 5 ' -CACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3 ' merasa POLI 5 ' -CTGGCCTGGACGCGAGCCTTT-3 ' 55 P0L2 5 ' -CAGGGTCCTCGTCAGCGTAGT-3 ' P0L3 5 ' -TACGGGGACACGGACAGCCTT-3 ' 60 POL4 5 ' -CTTGGCGCGCAGCTTGCCCTT-3 ' e desnaturalización, 50 segundos de hibridació dor (Tm según el gen a amplificar, ver tabl ndos a 72 °C de elongación; 1 ciclo de 7 minuto longación final. Las reacciones de amplificació dores internos de Nested-PCR (cebadores 3 aron a cabo a partir de 2 µ? de las reaccione riores y en presencia de 1 U del enzima Taq p Taq, Bioline), tampón de PCR (Bioline) , gCl2 2. de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN onizada estéril hasta un volumen final de 50 µ?. las condiciones de amplificación fueron: 35 cic ndos a 94 °C de desnaturalización, 50 seg idación con el cebador (Tm según el gen a amplif a) y 50 segundos a 72 °C de elongación; 1 ci tos a 72 °C de elongación final.
La pérdida de la región attB también se Lante reacción de PCR utilizando los cebadores S-P2 (Ejemplo 2) . Las reacciones de PCR se llevar resencia de 1 U del ' enzima Ta olimeras tras se mezclaron con 1,5 µ? de la solución l de bromofenol 0.25% en agua destilada; Glice . 100 mM) y se analizaron por electroforesis en osa (1%) con tampón TAE IX (Tris Base 40 m ico glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizan ante tinción con bromuro de etidio (0.5 pg/ml) .
Los resultados obtenidos (Fig. 6B) confi ecta integración del polinucleótido B en el gen ia eucariota A549. La pérdida de la región attB ás, que dicha integración ha sido mediada esp ireccionalmente por la integrasa PhiC31.
A continuación, y para determinar la expresió 5s del adenovirus, el clon pRc-1 se incubó en pl a 37 °C, 5% CO2, hasta alcanzar una confluencia este momento las células fueron transfectadas ición de 5 µg de la construcción pGal4-2RU-SceI ent (1:0.75) y 12 µ? Lipofecta ina LTX, sigu ;edimiento descrito anteriormente. Las transfec en Cebador Secuencia a2 PRC1 5 ' -TGATCCAGTCGTAGCAGGAG-3' PRC 5 ' -ACGATCTCATCCTGGAACAC-3' II III1 5' -GCCAGTGGCGGCGGCGCTGGG--3' III2 5' -CCGATGTCGCTTTCCAGAACC--3' 4 E4-1 5' -CGTGCGAGGTCTTCCCTGCAG--3' E4-2 5' -CTACATGGGGGTAGAGTCATA--3' Para estos ensayos previamente se trató 1 d idad de DNasa (DNasal amplification grade; Invit ón de reacción (Tris-HCl 20 mM, pH 8.4; gCl2 2 M) y a un volumen final de 10 µ?. La reacción se eratura ambiente durante 15 minutos y la tivó añadiendo 1 µ? de solución EDTA 25 mM, e in C durante 10 min. En la reacción de síntesis de earon 625 ng de este RNA libre de ADN. La re rso-transcripción se inició mezclando la muestr del cebador específico, 1 µ? de dNTPs (10 mM ° S, se incluyó una reacción de amplificación u molde el RNA tratado con la DNasa. Las condi ificación utilizadas para las reacciones de PC obtenido de la reacción de reverso-transcripci mismas que las empleadas en las reacci ificación del ADN genómico.
Los resultados de estos ensayos, mostrados en confirman la capacidad de transcripción de l ovirales integrados de manera estable en el cror élula eucariota.
Finalmente, para confirmar la capacidad de la producir proteínas virales a partir del mRNA yó la detección de proteínas de la cápside viral yos de inmunocitoquímica. Para inducir la sín eínas, el clon pRc-1 se transfectó previament trucción pGal4-2RU-SceI-El . Las transfecci eron por duplicado para obtener células transf badas en resencia ausencia del inductor RU486 tos en PBS se procedió a la hibridación con el a ario {Mouse antí-adenovirus monoclonal antibod ipore Ibérica, 28050 Madrid, España) diluido pr BS (1:75). Dicha hibridación se llevó a cabo dur noche a 4 °C, en oscuridad y cámara húmeda, iente el exceso de anticuerpo se lavó en PBS ( 3 minutos) y se procedió a la hibridación cuerpo secundario ( Immunopure goat anti-mo xidase; Pierce Biotechnology, Rockford IL611 ido también en PBS (1:400). La hibridación se tos a temperatura ambiente y en oscuridad. De n tras se lavaron 3 veces en PBS IX y se pro lado con el cromógeno DAB {DakoCytoma tion Li trate Chromogen System; Dako Diagnósticos, S ern E-08960, Barcelona, España) siguie mendaciones del fabricante. Las muestras se cont Hematoxilina de Mayer (5 segundos) para la eifica de núcleos y, tras un lavado de 15 mi i, las muestras se deshidrataron sumergiéndolas il h l al 70% 96 1 1 min s en Xilen Ejemplo 3.2: Transfección de células A549 mido pGa!4-2RUSceI-El (polinucleótido A) ración de lineas celulares estables que int ón El y el gen I-Scel, ambos bajo control del s lación transcripcional inducible por mifepriston En una segunda realización, se diseñó una line ble en la que se ha integrado el polinucleótido efine en la invención (Fig. 1A) . Asi, la line inada cuenta con los genes necesarios para el rol de la expresión de los genes adenovirales l polinucleótido B. A su vez, estos genes, co que codifica la endonucleasa de restricción I-S ón adenoviral El que codifica, a su vez, las y ElB, se encuentran bajo el control de p lados por mifepristona . El propio factor de r -hPR-p65 está incluido en el polinucleótido A o, se integrará de manera simultánea en e L-Glu 1% y P/S 1% y el antibiótico Zeomici entración de 400 yg/ml. Tras sucesivos p ificación se aisló un clon resistente al antibi bió el nombre de Gal-13. Del mismo modo que par 1, la estabilidad del clon Gal-13 se testó me enimiento en cultivo durante un periodo superior S y más de 35 pases sucesivos.
Ensayos de PCR a partir del ADN genómico de "irmaron la presencia de los genes adenovirales E gen codificante de la endonucleasa I-Scel y del .fica la proteina de fusión GAL4- hPR-p65 regulad iscripción e inducible por mifepristona . Los .izados fueron: Gen Cebador Secuencia Ela RT-EA1 5 ' -TATCTGCCACGGAGGTGTTAT-3 ' RT-EA2 5 ' -TAGACAAACATGCCACAGGTC-3 ' Elb RT-EB3 5 ' -GCTTGGGAGTGTTTGGAAGAT-3 ' RT-EB4 5 ' -CTGCTCCTCCGTCGGTATTAT-3 ' Taq, Bioline) , tampón de PCR (Bioline) , MgCl2 4 de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN onizada estéril hasta un volumen final de 50 iciones de amplificación fueron las siguientes: esnaturalización de 4 minutos a 95 °C; 29 cicl ndos a 94 °C de desnaturalización, 40 segundos a idación con el cebador y 40 segundos a 7 gación; 1 ciclo de 5 minutos a 72 °C de elongaci el análisis de los productos de amplifica tras se mezclaron con 1.5 µ? de la solución l de bromofenol 0.25% en agua destilada; Glice 100 mM) y se analizaron por electroforesis en osa (1%) con tampón TAE IX (Tris Base 40 m ico glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizan ante tinción con bromuro de etidio (0.5 g/ itados de amplificación confirmaron la gración de los genes incluidos en el polinucle ro del genoma de la linea A549 (Fig. 8) .
Se i m n acrilamida-SDS y tampón de electroforesis Laeml 25 mM; Glicina 192 mM; SDS 0.1% p/v) . El gel ba compuesto por poliacrilamida al 12% en tampón M (pH 8.8) con SDS al 0.1%. Como cataliza izaron PSA al 0.1% y TEMED al 0.04%. Por su par oncentración estaba compuesto por poliacrilamida -HC1 0.125 M (pH6.8) con SDS al 0.1%, PSA 0.1% y %. Las muestras se transfirieron a membrana Hyb thcare Europe) en tampón de transferencia ( ; Glicina 186 mM; Metano! 20%) durante 2 horas idamente se procedió al bloqueo de la mem ción de leche 5% en PBS+Tween (0.05%) a 4 °C dur oche. La hibridación con el anticuerpo primario bo en solución de leche 1% + PBS-Tween durante mperatura ambiente. El exceso de anticuerpo s 3 lavados de 10 minutos en PBS-Tween. La híbrid nticuerpo secundario se realizó en leche 1% + nte 30 minutos a temperatura ambiente. En la dét roteína E1A se empleó el anticuerpo Anti-adenov C l och ® L as proteínas analizadas, así como un increment les de expresión de estas proteínas en prese ctor. Sin embargo hay que tener en cuenta ncia de inductor, existe una expresión basal eínas sometidas a regulación.
Ejemplo 3.3: Generación de líneas celulares ante doble transfección de células A549 con los 4-2RUSceI-El (polinucleótido A) y pRcAd2 (polin Para obtener una única línea celular con t S necesarios en la producción de partículas vi resistente a Zeomicina Gal-13 (ejemplo 3.2) sfectó con la construcción pRcAd2 (neor) , que i o de genes del adenovirus, y el plásmido pCM fica la integrasa PhiC31. Las condiciones de tra on las mismas que las empleadas en la obtención 13 y la selección se hizo en presencia bióticos G418 {600 pg/ml) y Zeomicina (400 iq selección resultó el aislamiento de dos tan de manera significativa a la estabilidad y v las células, tal y como se ha comprobado enimiento en cultivo durante un periodo superior Para confirmar la integración del plásmido p clones GAd-1 y GAd-ß, se extrajo el ADN genómic ema QIAmp DNA minikit (Qiagen) siguie mendaciones del fabricante. Este ADN se ut yos de Nested-PCR para detectar la presencia de ovirales Illa, IV, el gen codificante de la prot que codifica la polimerasa viral. Los .izados en esta detección fueron los mismos .eados en el apartado 3.1. Del mismo modo, las r implificación se llevaron a cabo en las mismas co las descritas en el apartado 3.1.
Los productos de amplificación se analiz :troforesis en geles de agarosa (1%) con tampó edió de igual modo que en el caso del clon pRc-1 . Como anticuerpo primario se utilizó el anticue -adenovirus monoclonal antíbody blend (Millipore) PBS (1:75) y como anticuerpo secundario el a opure goat anti-mouse IgG-Peroxidase echnology) también diluido en PBS (1:400).
La detección de coloración marrón en las irma la síntesis de proteínas de la cápside v rgo, no se detectan diferencias claras entre las ibadas en presencia del inductor RU486 y en aus o. Por tanto, la expresión basal de las proteín . escapa al control del regulador transcripcio -p65, es suficiente para iniciar la expresión del ¾s adenovirales integrados en el genoma de la cél Ejemplo 4 : Producción y empaquetamiento de p activas del virus g tless KCZ.
Ejemplo 4.1: Producción y empaquetamiento del la línea em a uetadora Rc-1 mediante sistema Para compensar la deficiencia de la región ema requiere la transfección de la linea celular, de los pasos de producción, con el plásmido p -El. Este plásmido de complementación expresa y Elb a partir del promotor inducible regu pristona (Fig. 1A) , lo que iniciará la expré o de los genes adenovirales . Además, la replic iria viral integrado sólo será posible en el mome esión de la endonucleasa de restricción I-Scel, l plásmido pGal4-2RU-SceI-El y también controlad scripcional por el regulador GAL4-hPR-p65. La l genoma viral y el inicio de su replicación perm nción de múltiples copias del mismo y, po cientes niveles de proteínas virales psidación. del adenovirus de alta capacida ficación en un alto titulo.
Para determinar la capacidad del sistema de ículas infectivas se incubaron 8xl05 células ema de internalización del ADN en la célula e el ADN de ambos plásmidos se diluyó previamente medio sin suero OPTI-MEM (Gibco®) . Para favo ación de los complejos entre el ADN y lipidos c añadió el reactivo Plus Reagent (Invitrogen) ción 1:0.75. Tras 5 minutos de incubación a te ente se añadieron 12 µ? de Lipofectamina LTX (In mezcla se incubó de nuevo a temperatura ambient inutos* Seguidamente la dilución se añadió got e el medio de cultivo de las células (DMEM sup suero fetal bovino 10%). Tras 4 horas de incuba 5% C02, el medio se sustituyó por medio DME ementado con suero fetal bovino 2% e inductor RU entración 10~8M.
Al no tener un efecto citopático claro, las c baron entre 48 y 120 horas y, posteriorm gieron a distintos tiempos en su propio medio. rifugación a 1250 rpm durante 5 minutos, el pr resus endió en 200 ? de Tris-HCl 0.1M H 8. bación de 4 horas a 37 °C, 5% CO2, se añadió med continuó la incubación otras 48 horas. Finalrr las se fijaron con una solución de glutaraldehid durante 10 minutos y a temperatura ambiente, se s en PBS y se tiñeron 4 horas a 37 °C con 1 mg ( 5-bromo- -cloro-3-indolil-p-galactopiranósido) ementado con MgCl2 20mM, K3Fe(CN6) 5mM y K4Fe(CN6) Según los resultados obtenidos, utilizando c roducción y empaquetamiento el clon pRc-1, la p ase 0 alcanza sus niveles máximos a las 48-72 en torno a 7xl05 unidades infectivas (ui)/ml ( os sucesivos pases de amplificación, estos ext izarán para la infección de nuevas célula iamente transfectadas con el plásmido pGal4-2RÜ sistema descrito permite, por tanto, la recupe actos de adenovirus de alta capacidad li iculas infectivas derivadas de un virus helper, btención a altos niveles de producción. iculas virales con capacidad infectiva.
El sistema integra los genes adenovirales n la éncapsidación y replicación del adenovirus cidad (polinucleótido B) , asi como los genes de la endonucleasa de restricción I-Scel (polin necesarios para la expresión controlada y les de las proteínas virales anteriores, en u la. Finalmente, el inicio del proceso de produc lado mediante la expresión de los genes de la re endonucleasa de restricción a partir espondientes promotores inducibles y el scripcional GAL4-hPR-p65.
En el presente ejemplo de producción de p ctivas, las lineas empaquetadoras GAd-ß y sfectaron con 12 µg del vector gutless KCZ que gen reportero de la ß-galactosidasa y que arizado previamente con el enzima de restricci como se indica en el e em lo 4.1. La transfe elación/descongelación, los restos celula rifugaron y el sobrenadante se tituló en la líne siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo an Utilizando como línea de producción y empaqu lon GAd-1, los niveles de producción a Pase 0 a l,7xl06 unidades infectivas (ui/ml) , mientras lon GAd-6 se obtuvo una titulación de 3xl06 ui Igual que en el ejemplo anterior, estos extr izarán para la infección de nuevas células empaq nte los sucesivos pases de amplificación. El rito en la presente realización se diferencia de rior de co-transfección con dos plásmidos (ejemp S sistemas de producción dependientes de helpe linación del proceso de transfección/infección las empaquetadoras en cada uno de los ificación del virus. Esta característica ificativamente el tiem o de roducción e incre

Claims (1)

  1. REIVI DICACIONES 1. Un polinucleótido o un vector de expr comprende : (a) un primer cásete de expres comprende una secuencia nucleotidica que un regulador transcripcional; (b) un segundo cásete de exprés comprende a secuencia nucleotidica que cod endonucleasa de restricción, y que se bajo control operativo de una secuencia r de la transcripción activable por el transcripcional codificado por el polin definido en (a) . 2. Polinucleótido o vector de expresi cualquiera de las reivindicación 1 donde el transcripcional codificado por el cásete (a) regulador transcripcional activable. es I-Scel. 5. Un polinucleótido o vector de expré comprende : (a) un primer cásete de expres comprende una secuencia nucleotidica que un regulador transcripcional; (b) un segundo cásete de expres comprende a secuencia nucleotidica que cod endonucleasa de restricción, y que se bajo control operativo de una secuencia r de la transcripción activable por el transcripcional (a) y (c) un tercer cásete de expres comprende una secuencia nucleotidica que la proteina adenoviral seleccionada E1 proteínas adenovirales E1A y E1B, y encuentra bajo control operativo de una reguladora de la transcripción activabl regulador transcripcional (a) . 8. Polinucleótido o vector de expresi cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 regulador transcripcional codificado por el case un regulador transcripcional activable. 9. Polinucleótido o vector, de expresión reivindicación 8 donde el regulador transc activable (a) está formado por el dominio de uni de GAL4, el dominio de unión a ligando del humano de progesterona y por el dominio de acti NF-kappaB p65. 10. Polinucleótido o vector de expresi cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 endonucleasa de restricción codificada por el cásete (b) es I-Scel. 11. Un polinucleótido o vector de expré comprende una secuencia nucleotidica que comp nucleotídica de reconocimiento especifico p integrasa, donde la secuencia de reconocimiento integrasa se encuentra en posición 5' respect primera secuencia de reconocimiento para la end de restricción. 13. Polinucleótido o vector de expresión reivindicaciones 12 en donde la secuencia nucleo reconocimiento para la integrasa es attBf especi la integrasa PhiC31. 14. Polinucleótido o vector de expresi cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en secuencias nucleotidicas de reconocimiento endonucleasa son especificas para la endonucleasa 15. Una célula hospedadora que compr polinucleótido o vector de expresión según cual las reivindicaciones 1 a 4. 15 a 17 que comprende, adicionalmente, un polin o vector de expresión según cualquiera reivindicaciones 11 a 14 o que es obtenible integración en una célula hospedadora según cual las reivindicaciones 15 a 17, de un polinucleót la reivindicaciones 11 a 14. 19. Una célula según la reivindicación 18 las dianas de restricción que flanquean el geno derivadas del polinucleotido o vector de expres cualquiera de las reivindicaciones 11 a reconocidas de forma especifica por la endonuc restricción que se encuentra bajo control oper una secuencia reguladora de la transcripción por el regulador transcripcional (a) deriv polinucleotido según cualquiera de las reivindic a 10. 20. Un método, para la producción de adecuadas para la producción y empaquetami polinucleótido según cualquiera d reivindicaciones 11 a 14 o con un ve comprende dicho polinucleótido en donde las etapas (i) y (ii) pueden li cabo en cualquier orden o de forma simultánea y si las células se transfectan en la etapa (i) polinucleótido según cualquiera de las reivindic a 4, entonces se utilizan células que compr secuencia que codifica la proteina adenoviral opcionalmente, la proteina adenoviral E1B. 21. Método según la reivindicación 20 en etapas (i) y/o (ii) incluyen una etapa adic selección en la que se seleccionan células integrado de forma estable el primer y/o el polinucleótido en base a marcadores de presentes en los polinucleótidos utilizados en l (i) y (ii) . 22. Método según' la reivindicación 20 Streptomyces y en donde el sitio de recon especifico es un sitio attB. 24. Célula obtenible mediante un méto cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23. 25. Un sistema para la producción de aden alta capacidad que comprende (a) una célula según cualquier reivindicaciones 15 a 19 y 24 y (b) un adenovirus de alta capaci 26. Método para la producción de adenovirales de alta capacidad, que comprende l de: (a) transfectar o infectar una hospedadora con un polinucleótido que com genoma del adenovirus de alta capacidad desea producir o con un vector de expré comprende dicho polinucleótido, en donde la célula hospedadora usada en la elecciona del grupo de (i) una célula que compren polinucleótido según cualquiera d reivindicaciones 1 a 4 y la secuencia que co proteina adenoviral E1A y, opcionalmente, la adenoviral E1B, en cuyo caso la etapa precedida de o se lleva a cabo simultánea una etapa de transfeccion con un polinucleót las reivindicaciones 11 a 14 y/o un v expresión que comprende dicho polinucleótido, (ii) una célula que compren polinucleótido según cualquiera d reivindicaciones 5 a 10, en cuyo caso la eta precedida de o se lleva a cabo simultánea una etapa de transfeccion con un polinucleót las reivindicaciones 11 a 14 y/o un v expresión que comprende dicho polinucleótido, (iii) una célula que compren polinucleótido según cualquiera d va precedida de o se lleva a cabo simultánea una etapa de transfeccion con un polinucleót las reivindicaciones 5 a 10 y/o un v expresión que comprende dicho polinucleótido, (v) una célula que compren polinucleótido según cualquiera d reivindicaciones 1 a 4, . un polinucleótido reivindicaciones 11 a 14 y una secuencia que la proteina adenoviral E1A y, opcionalm proteina adenoviral E1B, y (vi) una célula que compren polinucleótido según cualquiera d reivindicaciones 5 a 10 y un polinucleóti cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14. 27. Método según la reivindicación 26, cultivo de la etapa (b) se realiza en presenc agente inductor especifico del regulador transc codificado por la secuencia nucleotidica compr el polinucleótido según las reivindicaciones 1 a RESUMEN DE LA INVENCION La invención se relaciona con un nuevo si ucción y empaquetamiento (encapsidación) para ovlrales de alta capacidad que no requiere ización de virus helper y que se caracteriz gra los genes adenovirales necesarios para el icación y empaquetamiento de las partículas ro del genoma de una célula hospedadora, lo cu stabilidad del sistema de producción a largo plaz
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