WO2009147271A2 - Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad - Google Patents

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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Definitions

  • the invention falls within the field of biotechnology and, more specifically, in the field of vectors for the expression of heterologous genes in target cells.
  • the invention relates to a system for the production and packaging of high capacity adenoviral vectors useful for gene transfer.
  • High capacity adenoviruses also known as gutless adenovirus or adenovirus / ze //? Er-dependent, have great attractiveness as vectors for gene therapy because in vivo they have a very low associated immunogenicity and have high transduction efficiency and ample tropism, both in rodents and in primates.
  • These vectors are characterized by containing only the DNA sequences necessary for their replication and packaging and lacking the rest of adenoviral genes, which allows them to accommodate sequences of up to 36 kb.
  • the only adenoviral sequences required in cis by these vectors are the ITR (inverted terminal repeats) sequences, located at both ends of the linear DNA, and the packaging signal ( ⁇ ) ( Gráble and Hearing, 1992, J. Virol, 66: 723-731; Hearing and Shenk, 1983, CeIl, 33: 695-703).
  • helper virus a virus capable of encoding all the proteins needed to the replication of a defective virus and its encapsidation in viral particles with infective capacity.
  • helper virus is characterized by having the adenoviral region deleted and providing, in trans, all the repertoire of viral proteins necessary for the replication and assembly of the gutless virus progeny. The use of cell lines is also necessary for the propagation of the latter.
  • helper virus such as line 293 (Graham, et al, 1977, J. Gen. Virol., 36: 59-74) or the PerC6 line (Fallaux et al, 1998 , Hum. Gene Ther., 9: 1909-1917).
  • this propagation system also generates undesirable viral particles that encapsulate helper virus genomes and contaminate the final preparations of high-capacity adenoviruses.
  • different systems have been developed and described to try to eliminate such contamination by blocking the packaging process of the helper virus.
  • these systems are based on the incorporation of mutations in the helper virus packaging signal, in the increase in the size of its genome and, more particularly, in a specific elimination of the packaging signal during the viral production process.
  • the helper virus enters the cell, the recombinase cleaves the signal ⁇ preventing it from being packaged but maintaining its replication capacity and, therefore, the expression of the coding sequences necessary for the packaging of high capacity adenovirus.
  • Groth et al. have proposed the use of a unidirectional recombinase, in particular the ⁇ C31 recombinase, using the specific recognition attBIattP sequences to flank the ⁇ signal.
  • a unidirectional recombinase in particular the ⁇ C31 recombinase
  • the PhiC31 recombinase cleaves the sequence flanked by the attBIattP sites, it modifies the recognition sequences and converts them into attRlattL sequences preventing recognition from reoccurring and, therefore, the reintroduction of the ⁇ signal.
  • Ng et al. (2001, Mol. Ther., 3: 809-815) propose an alternative FLP / frt recombination system, in which the propagation of high capacity adenovirus is carried carried out in 293 cells capable of expressing yeast FLP recombinase (line 293FLP and 293CreFLP) and in which the ⁇ signal of the helper virus is flanked by frt sites specifically recognized by said FLP recombinase.
  • the amplification efficiency of the gutless virus (10 8 bfu / ml in step 3), as well as the levels of contamination of the helper virus (0.5% after purification in CsCl gradient), are very similar to those obtained with the Cre-loxP system previous.
  • WO0072887 describes a high capacity adenovirus production system independent of adenovirus helper based on a binary system formed by (i) a packaging cell line stably comprising a circular episome in a reduced number of copies and based on virus replicative elements of Epstein-Barr (EBV) together with an adenoviral genome deleted in the El, E3, E4 regions and in the pTP and DBP genes, and (ii) a vector comprising the elements necessary for the replication and packaging of the adenoviral genome and which they are absent in the episome (region E4, pTP and DBP gene) as well as the heterologous gene.
  • the episome is not packaged in virions since (i) it lacks the packaging signal and (ii) its size exceeds the adenovirus packaging capacity.
  • WO0042208 describes a helper virus independent adenovirus production system comprising (i) an adenoviral vector deleted in the El, E3 and gene regions encoding the fiber protein (L5), which is involved in the virion assembly process, and (ii) a specific cell line capable of complement the replication and packaging of said vector. All the genes necessary for the replication and packaging processes of the viral particles are included within the adenoviral vector sequence.
  • helper independent adenoviral vector production systems are limited by the size of the DNA sequence to be inserted into the vector, since in all of them the adenoviral vector includes one or more adenoviral genes necessary for the processes of replication or packaging of said vector. To this we must add the fact that the presence of these adenoviral genes carries the risk of possible immunogenic effects at the time of their clinical application.
  • the invention relates to a polynucleotide (first polynucleotide of the invention) or an expression vector comprising: (a) a first expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding a transcriptional regulator;
  • a second expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding a restriction endonuclease, and which is under operational control of a transcription regulatory sequence activatable by the transcriptional regulator encoded by the polynucleotide defined in (a).
  • the invention relates to a polynucleotide (second polynucleotide of the invention) or expression vector comprising:
  • a second expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding a restriction endonuclease, and which is under operational control of a transcription regulatory sequence activatable by the transcriptional regulator (a) and
  • a third expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding the selected adenoviral protein ElA or the adenoviral proteins ElA and ElB, and which is under operational control of a transcription regulatory sequence activatable by the transcriptional regulator (a) .
  • the invention relates to a polynucleotide (third polynucleotide of the invention) or expression vector comprising a nucleotide sequence comprising the genome of a recombinant adenovirus that lacks at least the ⁇ packaging sequence and the sequence encoding protein E lA or IB A / E, wherein said sequence comprising the genome of a recombinant adenovirus is flanked by specific recognition sequences for a restriction endonuclease.
  • the invention relates to a host cell comprising one or more polynucleotides or expression vectors of the invention.
  • the invention relates to a method for the production of cells suitable for the production and packaging of infective particles of a high capacity adeno virus comprising (i) transfecting a cell with a first polynucleotide or with a vector comprising said polynucleotide, or with a second polynucleotide or with a vector comprising said polynucleotide and (ii) transfecting said cell with a third polynucleotide or with a vector comprising said polynucleotide wherein steps (i) and (ii) can be carried out in any order or simultaneously and wherein if the cells are transfected in step (i) with a polynucleotide according to any one of claims 1 to 4, then cells comprising the sequence encoding the viral adeno protein ElA are used and, optionally, the viral adeno protein El
  • the invention relates to a cell obtainable by a method according to the invention.
  • the invention relates to a system for the production of high capacity adenovirus comprising
  • the invention relates to a method for the production of high capacity viral adeno vectors, comprising the steps of:
  • transfect or infect a host cell with a polynucleotide comprising the high capacity adenovirus genome that is desired to be produced or with an expression vector comprising said polynucleotide, (b) culturing the transfected / infected cells under conditions that allow high capacity adenovirus replication and packaging, (c) recover high-capacity adenovirus viral particles and, optionally,
  • step (d) repeat steps (a) to (c) where the high capacity viral particles obtained in step (c) are used for infection in stage (a) of the next cycle, where the host cell used in the step (a) is selected from the group of
  • step (i) a cell comprising the first polynucleotide of the invention and the sequence encoding the adenoviral protein ElA and, optionally, the adenoviral protein ElB, in which case step (a) is preceded by or carried out simultaneously with a stage of transfection with a third polynucleotide and / or an expression vector comprising said polynucleotide,
  • step (ii) a cell comprising the second polynucleotide of the invention, in which case step (a) is preceded by or carried out simultaneously with a stage of transfection with the third polynucleotide of the invention and / or an expression vector comprising said polynucleotide,
  • step (iii) a cell comprising a third polynucleotide of the invention, in which case step (a) is preceded by or carried out simultaneously with a transfection stage with a first polynucleotide and wherein the cell comprises a sequence that encodes the ElA adenoviral protein and, optionally, the ElB adenoviral protein,
  • step (iv) a cell comprising the third polynucleotide of the invention, in which case step (a) is preceded by or carried out simultaneously with a stage of transfection with the second polynucleotide of the invention and / or an expression vector comprising said polynucleotide,
  • FIG. 1 A. Schematic representation of plasmid pGal4-2RU-El-SceI comprising an A2 polynucleotide according to the invention.
  • a 1 nucleotide sequence encoding a transcriptional regulator, in this case GAL4-hPR-p65.
  • An nucleotide sequence encoding viral adeno proteins E 1A / E1B.
  • Am nucleotide sequence encoding a restriction endonuclease, in this case I-Scel from Sacharomyces cerevisiae.
  • each promoter region comprises a sequence of the TATA box of the EIb gene (P EU O viral adeno, associated with UAS sequences (upstream activating sequences) of GAL4, and where both promoters share the same UAS binding sequences.
  • the promoter region that directs the transcription and expression of the transcriptional regulator GAL4-hPR-p65 comprises a minimal thymidine kinase promoter (P t k) also associated with UAS ⁇ upstream activating sequences) sequences of GAL4.
  • P t k minimal thymidine kinase promoter
  • Each of the 3 transcription units (GAL4-hPR-p65, E1A / E1B and I-Scel) is completed with a polyadenylation (pA) signal.
  • pUCori origin of replication of plasmid pGeneV5-HisA used as a basis for the construction of plasmid pGal4-2RU-El-SceI.
  • Amp ampicillin resistance gene for the selection of resistant clones in bacteria.
  • Zeo Zeocin antibiotic resistance gene for the selection of resistant clones in eukaryotic cells.
  • SV40 SV40 promoter that directs the expression of the resistance gene Zeo r .
  • B Schematic representation of plasmid pRc / Ad2 comprising a polynucleotide B according to the invention.
  • B 1 nucleotide sequence that encodes the genome of the adeno virus, in this case serotype 5, with the exception of the region that encodes the A / E IB proteins and the packaging signal ( ⁇ ). The nucleotide sequence is delimited by the ITR (inverted terminal repeats) sequences.
  • Bn Specific target sequences for a restriction endonuclease, in this case I-Scel.
  • Bi n attB nucleotide sequence that facilitates the integration of the plasmid into the genome of the eukaryotic cell. This process is mediated by the specific and unidirectional PhiC31 recombinase.
  • colEl origin of replication of plasmid pRC / RSV used as a basis for the construction of plasmid pRcAd2.
  • Amp ampicillin resistance gene for selection of resistant clones in bacteria; Neo: Neomycin antibiotic resistance gene for the selection of resistant clones in eukaryotic cells; SV40: SV40 promoter that directs resistance gene expression Neo r .
  • pA polyadenylation signal.
  • FIG. 2 GeneSwitch ⁇ M commercial system (Invitrogen) for transcriptional control of mifepristone-induced gene expression.
  • A Fusion protein expression plasmid pSwitch composed of the DNA binding domain (GAL4-DBD) of the yeast GAL4 protein, the human progesterone receptor ligand binding domain (hPR-LBD) and the domain of activation of the human NF- ⁇ B protein (p65-AD).
  • the expression of the transcriptional activator GAL4-hPR-p65 is under the control of the minimum thymidine kinase promoter (Ptk).
  • Ptk minimum thymidine kinase promoter
  • the binding of the active form of the protein to the GAL4-UAS sequences associated with the promoter regulates its own expression.
  • B Fusion protein expression plasmid pSwitch composed of the DNA binding domain (GAL4-DBD) of the yeast GAL4 protein, the human progesterone receptor ligand binding domain (
  • Plasmid pGeneV5-HisA designed for cloning of the gene of interest.
  • the expression of the cloned gene is under the control of the promoter consisting of the TATA box of EIb (PEib) and the transcriptional activator binding sequences (GAL4-UAS).
  • the homodimer has the ability to bind to specific sequences (GAL4-UAS) located in the promoter region of the gene of interest by activating its expression (plasmid pGeneV5-HisA) and in the promoter region that controls the expression of the transcriptional regulator (plasmid pSwitch) by initiating in this case a positive feedback reaction.
  • Figure 3 Scheme of the regulation systems designed for the transcriptional control of the EIa, EIb and I-Scel genes from the GeneSwitch TM system.
  • the pGene-El-Scel and p2RU-El-SceI constructs require the presence of plasmid pSwitch for the expression of the transcriptional regulator GAL4-hPR-p65.
  • the pRU-El-Scel and pGal4-2RU-SceI-El constructs include, in a single construction, the genes of the El region (EIa, EIb), the I-Scel gene and the gene that encodes the protein of regulatory merger with its specific promoter region. All the genes are they are under the control of promoters (white arrows) with transcriptional activator binding sequences (UAS). Each of the transcriptional units is completed with a polyadenylation (pA) signal.
  • pA polyadenylation
  • Figure 4 Specific integration of exogenous DNA mediated by the PhiC31 integrase from the Streptomyces phage. In mammalian cells this integrase is used to promote recombination between the attB sequence inserted into the vector with the gene of interest and a pseudo- ⁇ ⁇ P sequence present in the cell chromosome. As a result, the original recombination sequences are lost and the integrated vector is flanked by the attR and attL regions.
  • FIG. 5 Recombination process between homologous sequences of the genome of the adeno virus serotype 5, purified from plasmid pTG3602 by digestion with Pac ⁇ (P), and the construction pRC / A6-A7, linearized with Xbal (X).
  • the numbers indicate the position within the viral adeno genome of each of the homologous regions.
  • the adenoviral sequence is flanked by target sequences for restriction endonuclease I-Scel (S), while at the 5 'end an attB sequence has been inserted for the integration of the plasmid into the genome of the mammalian cell.
  • the plasmid pRcAd2 resulting from the recombination process includes the adenoviral genome deleted between positions 190 and 3528, region corresponding to the coding sequence of EIa and EIb.
  • ITR Inverted terminal repeat repeats.
  • colE l origin of replication of plasmid pRC / RSV used as a basis for the construction of plasmid pRcAd2.
  • Amp ampicillin resistance gene for the selection of resistant clones in bacteria.
  • Neo Neomycin antibiotic resistance gene used in the selection of resistant clones in eukaryotic cells.
  • SV40 SV40 promoter.
  • pA polyadenylation signal.
  • FIG. 6 A. Stable integration of plasmid pRcAd2 into the eukaryotic cell line mediated by the PhiC31 recombinase. The insert is flanked by the attL and attR sequences, product of recombination between the attB region of the plasmid and the pseudo-attP sequence of the cellular genome. S: target for endonuclease I-Scel; Zeo: Zeomycin resistance gene. B. Nested-PCR detection of adenoviral genes Illa, IV, protease (Pr) and the gene encoding viral polymerase (PoI) from the purified genomic DNA of the stable clone pRc-1.
  • adenoviral genes Illa, IV, protease (Pr) and the gene encoding viral polymerase (PoI) from the purified genomic DNA of the stable clone pRc-1.
  • the result of the electrophoresis corresponds to the analysis of the amplification reactions with the internal primers designed specifically for each gene.
  • the pRc-1 clone was also assayed by PCR for the detection of the attB sequence.
  • the negative result of said amplification confirms the specific integration mediated by the PhiC31 recombinase.
  • Figure 7 RT-PCR of adenoviral genes IVa2, III and the 34 Kd ORF of the E4 region.
  • the cDNA was obtained from samples of total RNA extracted from cells incubated in the absence (1) and presence (2) of the RU486 inducer. (+): positive PCR control.
  • M molecular weight marker (1 Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen).
  • Figure 8 Detection of the gene encoding the transcriptional regulator GAL4, the restriction endonuclease I-Scel and the genes of the El region of adenovirus (EIa and EIb) by PCR amplification from the genomic DNA of the stable clone GaI-13.
  • Figure 9 Western Blot assay for the detection of ElA protein (A) and endonuclease I-Scel (B). Protein extracts were collected from cells incubated in the absence (-) and presence (+) of the RU486 inducer. The 293S cell line was tested as a positive control of the ElA protein. GADPH: Positive control of the Western Blot assay.
  • Figure 11 Production of adeno gutless virus KCZ to Pass 0 using the stable clone pRc-1 as the packaging line.
  • the extracts were collected at 48, 72, 96 and 120 hours, post-transfection, and were titled in the 293 S cell line.
  • the virus levels obtained are the average of three independent experiments and are expressed in infective units (IU). / ml
  • Figure 12 Production of KCZ gutless virus adeno to Pass 0 using the stable clones GAd-I and GAd-6 as the packaging line. Virus extracts were collected at 48, 72, 96 and 120 hours, post-transfection, and were titled on line 293 S. The virus levels obtained are the average of three independent experiments and are expressed in infective units (IU ) / ml.
  • the authors of the present invention have designed a new production and packaging system (encapsidation) for high-capacity adenoviral vectors that does not require the use of helper viruses and is characterized in that it integrates the adenoviral genes necessary for control, replication and packaging of the viral particles within the genome of a host cell, which improves the stability of the long-term production system.
  • the high capacity viral adeno vector used only includes the sequences necessary for the replication and packaging of the virions (ITR sequences and se ⁇ al signal) so that the cloning capacity of the vector is greater than that shown in other independent production systems of helper virus or other auxiliary vectors.
  • the absence of these adenoviral genes in the high capacity vector eliminates the risk of any immune response against the vector during clinical application.
  • First polynucleotide of the invention (Al polynucleotide)
  • the invention relates to a polynucleotide (hereinafter polynucleotide Al of the invention) or an expression vector comprising:
  • a first expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding a transcriptional regulator
  • a second expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding a restriction endonuclease, and which is under operational control of a transcription regulatory sequence activatable by the transcriptional regulator encoded by the polynucleotide defined in (a).
  • transcriptional regulator or “transactivator” is meant interchangeably, in the context of the present invention, a protein that is capable of activating the transcription of a particular gene by binding to specific recognition regions for said protein in the non-coding region. of said gene.
  • the transcriptional transactivator or regulator is an adjustable transcriptional regulator.
  • adjustable transcriptional regulator is meant, in the context of the present invention, a transcriptional regulator whose activity can be modulated by means of additional factors that can be contributed or eliminated based on the need to promote transcription of genes comprising sites specific binding for such regulators.
  • the invention contemplates any method for regulating the expression of the transcriptional regulator provided that it allows expression in a regulated manner and with a minimum of regulated basal transcription.
  • inducible promoters are classified into Tet on / off promoters (Gossen and Bujard, 1992, Proc. Nati. Acad. Sd.
  • the invention contemplates the use of transcriptional regulators whose induction takes place not by an increase in expression levels but by an inducing agent that causes an increase in transcriptional activity, normally, caused by a translocation of the cytoplasm regulator to the nucleus.
  • transcriptional regulators they are usually formed by a DNA binding domain or DBD (DNA binding domai ⁇ ), a ligand binding domain or LBD (ligand binding domai ⁇ ), and a transcription activation domain or AD ( activating domai ⁇ ).
  • the DNA binding domain can be any domain for which there is a known specific binding element, including synthetic, chimeric or analogous DNA binding domains.
  • DNA binding domains suitable for the present invention include (i) homeodomains (Scott et al., 1989, Biochim. Biophys. Acta 989: 25-48; Rosenfeld et al, 1991, Genes Dev.
  • DNA binding domains in the present invention include the DNA binding domain of GAL4, LexA, transcription factors, group H nuclear receptors, nuclear receptors. steroid / thyroid hormone superfamily.
  • the person skilled in the art will appreciate that the invention contemplates the use of hybrid DNA binding domains formed by various DNA binding motifs that can recognize DNA binding sites other than those of the elements that compose them. Thus, it is possible to use DNA binding domains formed by the union of a zinc finger and a homeobox.
  • the DNA binding domain is that derived from the S. cerevisiae GAL4 protein.
  • Ligand binding sequences capable of promoting the nuclear localization of a transcriptional activator containing them include the localization sequence derived from PPAR (receptors activated by peroxisomal activators), which are translocated to the nucleus.
  • retinoic acid receptors that are translocated to the nucleus in the presence of the alpha, beta or gamma isomers of 9-cis-retinoic acid, farnesoid X receptors, activated by retinoic acid and TTNPB, hepatic X receptors activated by 24-hydroxycholesterol, benzoate X receptors, activatable by 4-amino-butylbenzoate, constitutive androstane receptor, pregnan receptors, inducible by pregnolono-16-carbonitrile, steroid and xenobiotic receptors, inducible by rifampicin, progesterone receptors, inducible by medroxyprogesterone as well as by agonists and antagonists of mifepristone and der 19-nortestosterone ivates, glucocorticoid receptors of glucocorticoids, thyroid
  • the LBD is a ligand binding domain of the human progesterone receptor that can be activated with synthetic antiprogestins including progesterone derivatives such as RU486 or mifepristone and which show no effect in patients such as has been described by Wang et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1994, 91: 8180-4).
  • the transcriptional activation domain may be the activation domain of the group H nuclear receptors, of the thyroid or steroid hormone nuclear receptors, the activation domain of VP 16, GAL4, NF- ⁇ B, B42 , from BP64, or from p65.
  • the transcriptional activator is derived from the human NF- ⁇ B protein.
  • the transcriptional activator is the fusion protein called GAL4-hPR-p65 which comprises the GAL4 DNA binding domain of Saccharomyces cerevisiae (Laughon and Gesteland, 1984, Mol. CeIl Biol., 4: 260 267; Marmorstein et al., 1992, Nature, 356: 408-414), the ligand binding domain of the human progesterone receptor (Kastner et al., 1990, Embo J, 9: 1603-1614; Wang et al. ., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci.
  • the mifepristone inducer or its analogue RU486, it binds with high affinity to the hPR-LBD region of GAL4-hPR-p65, causing a conformational change that results in dimerization of the protein and its conversion to the active form
  • These homodimers are capable of binding to specific sites (UAS: upstream activating sequences) promoting the transcription of genes located in 3 'orientation with with respect to said activation sequences and thus activating the transcription of the gene of interest and of the gene encoding the transcription factor itself (Fig. 2C).
  • transcriptional regulators whose activity is regulated by the addition of exogenous compounds that promote the translocation of regulators to the nucleus or their conformational change to an active form, do not require that their transcription be subject to particularly fine transcriptional control.
  • sequence encoding the transcriptional transactivator or regulator is associated with an appropriate promoter that directs its transcription and expression, and also a polyadenylation signal. Since it is not essential to precisely control the transcription of these types of regulators, they can be under the control of a minimum constitutive promoter.
  • the minimum promoter can be, among others, a virus constitutive promoter, such as CMV or RSV, or a constitutive eukaryotic cell promoter, such as PGK or EFl.
  • a virus constitutive promoter such as CMV or RSV
  • a constitutive eukaryotic cell promoter such as PGK or EFl.
  • the transcriptional regulator is regulated by a region formed by one or more elements binding to the DNA binding domain of GAL4, preferably 4 elements binding to the DNA binding domain of GAL4, coupled to the minimum promoter of the Thymidine kinase (P t k) gene of Herpes Simplex Virus.
  • P t k Thymidine kinase
  • the second element of the polynucleotide Al comprises an expression cassette encoding a restriction endonuclease that is under operational control of the transcriptional regulator encoded in the first expression cassette present in the first polynucleotide of the invention.
  • Restriction endonuclease is an enzyme that cuts double stranded DNA by recognition and breakage at specific sites of that DNA.
  • the endonuclease referred to in the invention is an endonuclease that does not recognize specific sites in the genome or DNA of human cells and, therefore, does not cause breaks in the native genome of said cells.
  • the restriction endonuclease can be, among others, I-Scel, Pl-Scel, I-Ppol, I-Dmol or PI-TIiI.
  • the restriction endonuclease encoded by polynucleotide Al is I-Scel of Saccharomyces cerevisiae.
  • the polynucleotide containing the restriction endonuclease coding sequence is under operational control of a transcriptional regulatory binding sequence encoded by the first element of the polynucleotide of the invention. In this way, the promoter responds to the binding with the trans activator by activating or repressing the transcription and expression of the endonuclease.
  • the ability of the transactivator to bind and interact with the promoter is modified depending on whether the regulatory factor is bound to a ligand or inducing agent. Consequently, it is possible to regulate the transcription of the gene of interest by controlling the availability of the inducing agent. In some cases the inducing agent acts by activating and favoring the transcription and expression of the gene, while in other cases the presence of the inducing agent represses its expression.
  • the transcriptional regulator is GAL4-hPR-p65
  • the polynucleotide encoding the restriction endonuclease is in 3 'position with respect to a variable number of DNA binding domain binding sequences of GAL4.
  • the gene encoding the restriction endonuclease is in a 3 'position with respect to a regulatory element consisting of 6 binding sequences of the transcription factor GAL4 and the TATA Box sequence of the EIb gene (P mb ) of adenovirus (Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
  • the transcriptional regulator is GAL4-hPR-p65 and the restriction endonuclease is I-Scel.
  • Second polynucleotide of the invention (polynucleotide A2)
  • polynucleotide A2 a polynucleotide or expression vector comprising:
  • a second expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding a restriction endonuclease, and which is is under operational control of a transcriptional regulatory sequence activatable by the transcriptional regulator
  • a third expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding the selected adenoviral protein ElA or adenoviral proteins ElA and ElB, and which It is under operational control of a transcription regulatory sequence that can be activated by the transcriptional regulator (a).
  • Elements (a) and (b) of polynucleotide A2 correspond essentially to those that are part of the first polynucleotide of the invention and have been described in detail previously.
  • Component (c) of polynucleotide A2 comprises an expression cassette comprising a nucleotide sequence encoding the selected adenoviral protein ElA or adenoviral proteins ElA and ElB.
  • the ElA and, optionally, ElB genes can be derived from the adenovirus genome of any human adenoviral variety or serotype (which has been isolated in humans), for example serotypes 2 (Ad2), 5 (Ad5), 11 (AdI 1) or 3 (Ad3).
  • said component includes the sequence delimited between positions 505 and 3511 of the genotype of adenovirus serotype 5 (GenBank: AC000008).
  • This sequence is under operational control of a transcription regulatory sequence activatable by the transcriptional regulator (a).
  • the promoter responds to binding with the transactivator by activating or repressing transcription and expressing the structural genes ElA and ElB.
  • the ability of the transactivator to bind and interact with the promoter is modified depending on whether the regulatory factor is bound to a ligand or inducing agent. Consequently, it is possible to regulate the transcription of the ElA genes and, optionally, ElB by controlling the availability of the inducing agent.
  • component (c) of polynucleotide A2 of the invention is under the control of a hybrid promoter composed of 6 transcription factor binding sequences GAL4 and the TATA box sequence of the EIb gene (P E1I3 ) of adenovirus (Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
  • a hybrid promoter composed of 6 transcription factor binding sequences GAL4 and the TATA box sequence of the EIb gene (P E1I3 ) of adenovirus (Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
  • the orientation of the genes in polynucleotide A2 that respond to the transcriptional activator is not essential for its functioning.
  • the second and third cases are transcribed in the opposite direction.
  • the transcription regulatory sequences that control the second and third cassettes share the same binding site for the transcriptional regulator (a).
  • the genes encoding the restriction endonuclease and adenoviral proteins are under the control of the same hybrid promoter consisting of 6 sequences of binding to the transcription factor GAL4 and the sequence of the TATA box of the EIb gene (P mb ) of adenovirus (Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
  • the second and third cassette of polynucleotide A2 of the invention are transcribed in the opposite direction and share the DNA binding domain binding sequences of the transcription factor GAL4.
  • the first expression cassette (a) comprises the sequence encoding the transcriptional regulator GAL4-hPR-p65
  • the second expression cassette (b) comprises the sequence encoding the restriction endonuclease I-Scel under the control of one or more binding sites of the GAL4 protein
  • the third expression cassette (c) comprises the sequences of the ElA and ElB genes under the control of one or several binding sites of the GAL4 protein.
  • the promoters that direct the expression of the sequence encoding the restriction endonuclease I-Scel and the sequences of the ElA and ElB genes share the same response elements for GAL4-hPR-p65 .
  • the invention in another aspect, relates to a polynucleotide (hereinafter polynucleotide B) or expression vector comprising a nucleotide sequence comprising the genome of a recombinant adenovirus and lacking at least the ⁇ packaging sequence and the sequence encoding the protein E lA or E1A / E1B, wherein said sequence comprising the genome of an adenovirus Recombinant is flanked by specific recognition sequences for a restriction endonuclease.
  • polynucleotide B a polynucleotide
  • expression vector comprising a nucleotide sequence comprising the genome of a recombinant adenovirus and lacking at least the ⁇ packaging sequence and the sequence encoding the protein E lA or E1A / E1B, wherein said sequence comprising the genome of an adenovirus Recombinant is flanked by specific recognition sequences for a restriction endonuclease.
  • the adenoviral genome sequence can be obtained from a genome of an adenovirus of any human adenoviral variety or serotype (which has been isolated in humans), for example serotypes 2 (Ad2), 5 (Ad5), 11 (AdI1) or 3 (Ad3).
  • the restriction endonuclease recognition sequences are found flanking the adenoviral genome at 5 'and 3' position with respect to the ITR sequences of the ends, where the regions suitable for replication and transcription of said genome are located.
  • the person skilled in the art will appreciate that the restriction targets used in polynucleotide B will depend on the restriction endonuclease encoded in polynucleotides Al and A2 of the invention.
  • the target sequences flanking the adenoviral genome are specific recognition sequences for a restriction endonuclease with the same characteristics and requirements indicated above when describing the endonuclease encoded by polynucleotides AI and A2.
  • sequences can be specific for recognition, among others, by the endonuclease I-Scel, Pl-Scel, I-Ppol, I-Dmol or PI-TIiI. In a particular embodiment, they are specific for recognition by the I-Scel endonuclease.
  • polynucleotide B according to the invention comprises sequences that facilitate the insertion of said polynucleotide into the genome of the packaging cell.
  • said sequences favoring genome integration are specific recognition sequences for an integrase.
  • the integrase target sequence is in the 5 'position with respect to the first recognition sequence for the endonuclease.
  • Target sequences of integrases suitable for the realization of the invention include, without limitation, the target sequence of phage Cre l recombinase (LoxP), the FLP recombinase target sequence of S. cerevisiae (Frt), the target sequence of Streptomyces phage integrase ⁇ C31 (attB, attP), the target sequence of the TP901-1 recombinase, and the R4 recombinase target sequence, or the lambda integrase target sequence.
  • the target sequences of the invention include specific sequences for a phage integrase that mediates unidirectional recombination between two specific DNA sites or sequences.
  • integrase belongs to the serine integrase family, which is characterized in that for the breakage of the DNA chain they use a catalytic serine residue (Thorpe and Smith, 1998, Proc. Nati. Acad. ScL USA, 95 : 5505-5510).
  • the recombination sites recognized by these integrases (attB and attP) have different sequences and are shorter than the recombination sequences recognized by other recombinases. Integration mediated by this type of integrase is a unidirectional process and strictly controlled by recombination sequences (Thorpe et al, 2000, Mol. Microbiol, 38: 232-241).
  • AttP and attB in the host does not require other cofactors to operate.
  • These integrates are currently used in gene manipulation procedures in mammalian cells and it has been proven that they can mediate the efficient integration of genetic material into exogenously introduced attP sites or in native sequences that have a partial identity with said attP (pseudo-attP) sites.
  • the integrase target sequence can be a specific recognition sequence for the PhiC31, TP901-1 or R4 integrase, among others.
  • the integrase target sequence is attB, corresponding to the anchor site in the bacterial DNA specific for the phage integrase PhiC31.
  • This integrase can mediate unidirectional recombination between this attB sequence and pseudo-attP sequences located in the genome of human cells.
  • polynucleotide B includes, in the 5 'to 3' direction: optionally, the recognition sequence for integrase; the first recognition sequence for endonuclease; the adenovirus genome (whose limits are defined by the ITRs of the adenovirus itself); and the second sequence for restriction endonuclease.
  • polynucleotides of the invention may be isolated or as part of vectors that allow the propagation of said polynucleotides in suitable host cells.
  • a vector such as an expression vector, comprising the polynucleotide Al, A2 or B of the invention.
  • Suitable vectors for insertion of the polynucleotides of the invention include prokaryotic expression vectors such as pUC18, pUC 19, Bluescript and its derivatives, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, phage and shuttle vectors such such as pSA3 and pAT28, yeast expression vectors such as 2 micron plasmid type vectors, integration plasmids, YEP vectors, centromeric plasmids and the like, insect cell expression vectors such as pAC series vectors and pVL series, plant expression vectors such as pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE and the like vectors and expression vectors in upper eukaryotic cells well based on viral vectors (adeno virus , viruses associated with adenoviruses, as
  • vectors for the insertion of said polynucleotides are expression vectors in higher eukaryotic cells, either based on viral vectors (such as adeno-associated viruses, retroviruses, lentiviruses, herpesviruses, SV40 and alphaviruses) or also based on non-viral vectors (such as plasmids ), capable of being maintained and / or replicated and / or expressed in the host cell.
  • viral vectors such as adeno-associated viruses, retroviruses, lentiviruses, herpesviruses, SV40 and alphaviruses
  • non-viral vectors such as plasmids
  • said expression vector is suitable for transfecting or infecting mammalian cells ex vivo, particularly human cells.
  • eukaryotic expression vectors include, for example, one or more cloned genes and under the transcriptional control of regulatory sequences located at 5 'and 3', as well as a selection marker.
  • a promoter including the transcription initiation site capable of expressing itself in eukaryotic cells, a binding site to, is included within the control sequences ribosomes, an RNA processing signal, a transcription termination site and / or a polyadenylation signal.
  • the vectors comprise some reporter or selection gene that confers a phenotype to the cell that expresses it and that facilitates the identification and / or selection of those cells that have incorporated the vector after having been contacted with it. It is preferred that the selection phenotype is not expressed in the eukaryotic cell prior to its transfection or infection.
  • Reporter genes useful in the context of the present invention include lacZ, luciferase, thymidine kinase, GFP and the like.
  • Selection genes useful in the context of the present invention include, for example, the neomycin resistance gene, which confers resistance to aminoglycoside G418, the hygromycin phosphotransferase gene that confers hygromycin resistance, the ODC gene, which confers resistance to the inhibitor.
  • ornithine decarboxylase (2- (difluoromethyl) -DL-ornithine: DFMO), the dihydrofolate reductase gene that confers resistance to metrotexate, the puromycin-N-acetyl transferase gene, which confers puromycin resistance, the ble gene which confers resistance to zeocin, the adenosine deaminase gene that confers resistance to 9-beta-D-xylofuranosyl adenine, the cytosine deaminase gene, which allows cells to grow in the presence of N- (phosphonacetyl) -L-aspartate , the thymidine kinase gene, which allows cells to grow in the presence of aminopterin, the Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene, which allows cells to grow in the presence of xanthine and absence of guanine, the tr
  • the selection gene is incorporated into a plasmid which may additionally include a promoter suitable for the expression of said gene in eukaryotic cells (for example, CMV or SV40 promoters), an optimized translation initiation site (for example a site that follows the so-called Kozak rules or an IRES), a polyadenylation site such as, for example, the polyadenylation site of SV40 or phosphoglycerate kinase, or introns such as, for example, the intron of the beta-globulin gene .
  • a promoter suitable for the expression of said gene in eukaryotic cells for example, CMV or SV40 promoters
  • an optimized translation initiation site for example a site that follows the so-called Kozak rules or an IRES
  • a polyadenylation site such as, for example, the polyadenylation site of SV40 or phosphoglycerate kinase
  • introns such as, for example, the intron of the beta-glob
  • polynucleotides of the invention and the expression vectors containing them can be obtained by conventional techniques of molecular biology and genetic engineering known to any person of the trade, and which are included in compendiums and manuals such as "Molecular Cloning: a Laboratory manual", by J. Sambrook and DW Russel, Eds., Publisher: CoId Spring Harbor Laboratory Press, third edition, 2001 (ISBN 978-0879695774). There are also commercial systems that can facilitate the construction of expression vectors for the polynucleotides of the invention.
  • an expression vector for mammalian cells that includes polynucleotide A would be facilitated if systems such as the GeneSwitch TM inducible expression system (Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos. Kl 060-01 and Kl 060-2), which allows the construction of a vector for the expression of a gene of interest inducible by mifepristone; the RheoSwitch TM inducible expression system (New England Biolabs, Beverly, MA01915-5599 USA), which allows the expression of a gene of interest induciblely by the RLSl ligand; or any other equivalent trading system.
  • systems such as the GeneSwitch TM inducible expression system (Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos. Kl 060-01 and Kl 060-2), which allows the construction of a vector for the expression of a gene of interest inducible by mifepristone; the RheoSwitch TM inducible expression system (New England Biolabs,
  • the polynucleotides and vectors of the invention can be found as part of host cells that serve both as a propagation vehicle for vectors and as packaging cells for the production of recombinant adenoviruses.
  • the invention relates to a host cell comprising an Al, A2 or B polynucleotide of the invention or an expression vector comprising any of the aforementioned polynucleotides.
  • the cells are used as packaging cells for the production of adenovirus, they must be able to support the production and infection of adenovirus.
  • any permissive cell for adenovirus infection and replication will be a suitable eukaryotic cell.
  • the cell line will be a stable cell line.
  • the host cells can be HeLa, A549, KB, HuH7 cells, or any other eukaryotic cell capable of supporting the adenovirus life cycle.
  • the ElA or El A / E IB polypeptides are contributed by the cell itself (in cases where the Al polynucleotide of the invention)
  • its expression may be under the control of a promoter adjustable through an inducing agent, for greater control of the start of the expression of adenoviral genes included in polynucleotide B and thus limit the risk of possible effects to the maximum. Cytotoxic derived from excess viral protein expression.
  • a cell that expresses said proteins constitutively will not be suitable, for example a 293 or PerC6 cell.
  • the host cell is native to mammals, preferably primate and especially human.
  • the cell line is a lung carcinoma line.
  • the host cells are cells of the A549 line. This cell line initiated by Giard et al. (1973, J. Nati. Cancer Inst., 51: 1417-1423) and subsequently characterized in depth by Lieber et al. (1976, Int. J. Cancer., 17: 62-70), has a high sensitivity to adenovirus infection which gives it a high potential as a virus production line (Smith et al., 1986, J. Clin Microbiol, 24: 265-268).
  • the invention relates to a host cell comprising the Al polynucleotide of the invention or a vector comprising said polynucleotide.
  • the cell further comprises a sequence encoding the ElA adenoviral protein and, optionally, a sequence encoding the ElB adenoviral protein.
  • the invention relates to a host cell comprising polynucleotide A2 of the invention or a vector comprising said polynucleotide.
  • the invention relates to a host cell comprising polynucleotide B of the invention or a vector comprising said polynucleotide.
  • the invention relates to a host cell comprising polynucleotide Al and polynucleotide B of the invention.
  • said cell further comprises a sequence encoding the ElA viral adeno protein and, optionally, a sequence encoding the ElB viral adeno protein.
  • the invention relates to a host cell comprising polynucleotide A2 and polynucleotide B of the invention.
  • Both the cells comprising the Al and B polynucleotides of the invention and the cells comprising the A2 and B polynucleotides are particularly suitable for the production and packaging of high-capacity adenoviral vectors so that both the cells comprising the Al and B polynucleotides of the invention as the cells comprising polynucleotides A2 and B can be used in methods and systems for the production and packaging of said vectors.
  • adenovirus particularly useful for the production of adenovirus are those in which the target sites flanking the defective adenoviral genome in polynucleotide B correspond to the restriction endonuclease encoded by polynucleotides AI and A2, since, otherwise, The restriction endonuclease encoded by polynucleotides Al or A2 could not act on polynucleotide B releasing the adenoviral genome, which is essential for the replication and transcription of said genome.
  • the host cells of the invention can be obtained either by introducing the polynucleotides or vectors of the invention temporarily or, preferably, by introducing said polynucleotides or vectors stably. For this, it is necessary to contact the vectors of the invention with the host cells under conditions suitable for the entry of DNA into the cell.
  • the vectors of the invention are introduced into the cells under study using any of the transfection methods known to those skilled in the art (see sections 9.1 to 9.5 in Ausubel, F. M. et al., "Current Protocols in
  • the Cells can be transfected by co-precipitation of DNA with calcium phosphate, DEAE-dextran, polygon, electroporation, microinjection, liposome-mediated fusion, lipofection, retrovirus infection and biolistic transfection.
  • the invention relates to a method for the production of suitable cells for the production and packaging of infective particles of a high capacity adenovirus comprising
  • steps (i) and (ii) can be carried out in any order or simultaneously and wherein cells comprising the sequence encoding the viral adeno ElA protein and, optionally, the viral adeno protein ElB are used.
  • the invention relates to a method for the production of suitable cells for the production and packaging of infective particles of a high capacity adenovirus comprising
  • steps (i) and (ii) in the methods described above can be carried out so that the polynucleotides or vectors are transiently in the cell or, alternatively, can be carried out in a manner that stable expression of the A1 / A2 and / or B polynucleotides is obtained. If it is desired to obtain stable expression of the vectors of the invention in the host cells, it is necessary to include during the transfection or infection stage a gene coding for resistance to a certain antibiotic, so that those cell lines that have incorporated the DNA into the genome of those cell lines in which the DNA is in an extrachromosomal position can be selected.
  • the gene that allows the selection of cells can be provided as part of the same vector that contains the construction object of the invention or, alternatively, it can be provided separately by co-transfection with a second plasmid containing said resistance gene.
  • the plasmid containing the DNA construct is contributed to the transfection mixture in a molar excess with respect to the resistance gene so that for each event of integration of the resistance gene there is a high probability of integration of the gene. which contains the promoter under study.
  • the plasmid containing the DNA construct is provided in an excess of at least 5 times with respect to the vector containing the resistance reporter gene.
  • the resistance gene is included within the vectors of the invention. Resistance genes suitable for transfection have been described previously.
  • the method of obtaining cells comprising polynucleotides AI and B or A2 and B according to the invention include an additional selection step in which cells that have stably integrated are selected. the first and / or the second polynucleotide based on selection markers present in the polynucleotides used in steps (i) and (ii).
  • transfection with an expression vector comprising polynucleotide A2 has allowed to select clones of cells that integrate the polynucleotide stably (cell maintenance up to 4 months in culture).
  • the expression of the E1A / E1B proteins and the restriction endonuclease is repressed, maintaining basic levels of expression that are not harmful to the cell, and that said expression can be induced and activated by the addition to the cultivation of an adequate amount of an inducing agent suitable for the concrete construction employed.
  • step (ii) by co-transfection of the expression vector comprising polynucleotide B together with a plasmid that encodes and expresses an integrase and that recognizes the sequence of recognition of the integrase, thus allowing the integration of polynucleotide B into the genome of the cell.
  • step (ii) implies a co- transfection with a plasmid encoding phage PhiC31 integrase, which allows the integration of polynucleotide B or the vector containing said polynucleotide into the genome of the cell by recombination between the attB sequence and pseudo- ⁇ ⁇ P sequences present in the human cell chromosomes This recombination and unidirectional integration is mediated by the PhiC31 integrase.
  • the invention relates to cells obtained by any of the methods described above.
  • the invention contemplates cells comprising polynucleotides AI and B or polynucleotides A2 and B, wherein said polynucleotides can be stably integrated into the genome of the cell or can be found transiently.
  • the packaging cells obtained by introducing into cell lines the polynucleotides of the invention or the vectors comprising them can be used for the generation of high capacity adenoviral vectors by introducing into said cells adenoviral genomes comprising the gene of interest. , either by transfection with polynucleotides comprising the viral adeno genome or by infection with recombinant adenoviruses comprising said gene.
  • the transcriptional regulator After infection / transfection with the adenovirus / polynucleotide comprising the adenoviral genome and which in turn comprises the gene of interest, and the Putting the cells in contact with the agent that promotes the expression of the genes included in the Al or A2 polynucleotide, the transcriptional regulator begins to be produced in the cell, which in turn activates the transcription of the gene encoding the endonuclease of restriction.
  • adenoviral genome deficient included in polynucleotide B acts on the target sites that flank the adenoviral genome deficient included in polynucleotide B, causing its excision of the cellular genome, which is a necessary condition for the subsequent transcription of the adenoviral genes that are part of said genome
  • Transcription of adenoviral genes from polynucleotide B also requires the expression of the early ElA and ElB genes that are encoded either by polynucleotide A2, in which case they respond to the activation of the transcriptional regulator, or in the cell itself packing machine, also under the control of the transcriptional regulator.
  • the invention relates to a system for the production of high capacity adeno virus comprising
  • the invention relates to a method for the production and packaging of high capacity adenoviral vectors, comprising the steps of:
  • step (c) recovering the high capacity adenovirus viral particles and, optionally, (d) repeating steps (a) to (c) where the high capacity viral particles obtained in step (c) are used for infection in the step (a) of the next cycle, wherein the host cell used in step (a) is selected from the group of (i) a cell comprising the Al polynucleotide of the invention and the sequence encoding the adenoviral protein ElA and, optionally, the adenoviral protein ElB, in which in case step (a) is preceded by or carried out simultaneously with a transfection step with polynucleotide B of the invention or an expression vector comprising said polynucleotide,
  • step (ii) a cell comprising polynucleotide A2 of the invention, in which case step (a) is preceded by or carried out simultaneously with a transfection step with polynucleotide B of the invention or with an expression vector that comprises said polynucleotide,
  • step (iii) a cell comprising polynucleotide B of the invention, in which case step (a) is preceded by or carried out simultaneously with a transfection stage with polynucleotide Al of the invention and wherein the cell comprises a sequence encoding the adenoviral protein ElA and, optionally, the adenoviral protein ElB,
  • step (iv) a cell comprising polynucleotide B of the invention, in which case step (a) is preceded by a transfection stage or is carried out simultaneously with polynucleotide A2 of the invention or with an expression vector comprising said polynucleotide,
  • a cell comprising polynucleotide Al of the invention, polynucleotide B of the invention and a sequence encoding the adenoviral protein ElA and, optionally, adenoviral protein ElB, and (vi) a cell comprising polynucleotide A2 and B of the invention.
  • Step (a) of the method for the production and packaging of high capacity adenoviral vectors comprises contacting a packaging cell with a high capacity adenovirus or with a polynucleotide or vector comprising the genome of said adenovirus.
  • High capacity adenovirus means, according to the invention, recombinant adenoviruses of the so-called auxiliary or gutless dependent, characterized because they lack all the genes of the adenoviral genome except the 5 'and 3' ITR regions and the packaging region ⁇ , as described, for example, by Alba et al. (2005, Gene Therapy, 12: S 18-S27). These adenoviruses support heterologous sequences of up to 36 kb since they lack sequences specific to the adenoviral genome.
  • Heterologous genes that can be incorporated into gutless vectors according to the methods of the invention include genes encoding erythropoietin (EPO), leptins, adrenocorticotropic hormone releasing hormone (CRH), somatotropic hormone releasing hormone (GHRH), hormone releasing hormone gonado tro fines (GnRH), thyrotropin-releasing hormone (TRH), prolactin-releasing hormone (PRH), melatonin-releasing hormone (MRH), pro-lactin-inhibiting hormone (PIH), somato statine, adrenocorticotropic hormone (ACTH), hormone somatotropic or growth (GH), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), thyrotropin (TSH or thyroid stimulating hormone), prolactin, oxytocin, antidiuretic hormone (ADH or vasopressin), melatonin, Müllerian inhibiting factor, calcitonin , parat
  • the gutless adenoviruses used in the invention may contain filling or stuffer regions, such as the filling sequences derived from the lambda phage genome described by Parks et al. (1999, J. ViroL, 73: 8027-8034) or the filler DNA that appears in pSTK120 as described by Sandig et al. (2000, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 97: 1002-1007).
  • human filler DNA may vary but ranges from 20 to 30 kb, preferably from 20 to 25 kb or, even more preferably, from 21 to 23 kb, for example 22 kb.
  • the number of cis-acting sequences in said filler DNA may vary between 2, 3, 4 or more and includes, without limitation, the 16.2 kb alfoid repeated domain (described in Smith et al., 1995, Mol. CeIl. Biol, 15: 5165-5172); matrix adhesion regions (MAR) such as the 4.2 kb fragment containing the left end of adenovirus type 6 or two copies of the matrix adhesion region of immunoglobulin K (as described by Betz et al , 1994, CeIl, 77: 239-248); a hepatocyte control region (HCR) such as the 1.2 kb fragment comprising said HCR (as described by Miao et al., 2000, Molecular Therapy, 1: 522-532); or other matrix adhesion region such as the 2.8 kb region of chicken lysozyme (as described by Phi- Van et al, 1990, Mol.
  • MAR matrix adhesion regions
  • HCR
  • the contacting of the host cells with the polynucleotide comprising the adenoviral genome is carried out using techniques known to those skilled in the art, such as transfection of said polynucleotide or a vector comprising it by transfection by co-precipitation of DNA with calcium phosphate, DEAE-dextran, polibreon, electroporation, microinjection, liposome-mediated fusion, lipofection, retrovirus infection and biolistic transfection.
  • packaging cell any of the cells described in the present invention and containing at least the A1 / A2 polynucleotide or the B polynucleotide of the invention.
  • the person skilled in the art will appreciate that the use of different packaging cells is possible.
  • step (a) must be preceded by or carried out simultaneously with a transfection stage in which the cells are placed in contact with those polynucleotides of the invention that do not appear in the packaging cells and that are necessary to provide the essential elements for the replication of the adenoviral genome as well as for the production in the cells of the polypeptides necessary for the assembly of the adenoviruses.
  • a packaging cell a cell comprising the Al polynucleotide of the invention and a sequence encoding the ElA adenoviral protein and, optionally, the ElB adenoviral protein.
  • step (a) consisting of the transfection of said cell with polynucleotide B of the invention or an expression vector comprising said polynucleotide.
  • step (a) must be preceded by or carried out simultaneously with a transfection step with polynucleotide B of the invention or with a vector of expression comprising said polynucleotide.
  • step (a) In the event that a cell comprising polynucleotide B of the invention is used as the packaging cell, step (a) must be preceded or carried out simultaneously with a transfection stage with polynucleotide Al of the invention and , in which case, the cell must additionally comprise a sequence encoding the adenoviral protein ElA and, optionally, the adenoviral protein ElB.
  • step (a) In the case where a cell comprising polynucleotide B of the invention is used, step (a) must be preceded by or carried out simultaneously with a transfection step with polynucleotide A2 of the invention or with a vector of expression comprising said polynucleotide.
  • a cell comprising the polynucleotide Al of the invention, the polynucleotide B of the invention and a sequence encoding the adenoviral protein ElA and, optionally, the adenoviral protein ElB or, alternatively, a cell comprising polynucleotides A2 and B of the invention.
  • Step (b) of the method of the invention comprises maintaining the transfected / infected cells obtained in step (a) under conditions that allow replication and packaging of high capacity adenovirus. For this, it is necessary that these conditions allow the expression of the transcriptional regulator encoded by the Al or A2 polynucleotide, so that it acts on its binding sites in the regulatory region of the endonuclease gene present in the Al and A2 polynucleotide and over their binding sites in the regulatory region of the adenoviral genes ElA and ElB, present in polynucleotide A2.
  • step (b) involves contacting the cells with the agent capable of activating the transcriptional regulator.
  • the regulator Transcriptional encoded by polynucleotide Al or A2 is GAL4-hPR-p65, as described above, in which case, the inducing agent is mifepristone.
  • Step (b) is carried out for the time necessary for the concentration of viral particles to be sufficiently high, as determined by standard means such as the Resource Q method based on HPLC, as described by Shabram et al. , (1997, Hum. Gene Ther., 8: 453-465), or indirectly by visual inspection of the cytopathic effect on cells.
  • cell culture may include the addition of fresh culture medium.
  • stage (c) adenoviruses generated during stage (b) are recovered from cell culture.
  • adenoviruses generated during stage (b) are recovered from cell culture.
  • it will be necessary to separate the cells from the culture medium by any method known to those skilled in the art (trypsinization and centrifugation or filtration), break the cells in inert solution (freeze / thaw cycles, homogenization, sonication, cavitation, use of detergents and the like) and purify adenovirus particles by known methods such as CsCl gradient ultracentrifugation or by different types of chromatography such as a combination of ion exchange chromatography and affinity chromatography with metal chelates (Huyghe et al., 1996, Hum.
  • Step (d) which is optional, consists in repeating steps from (a) to (c) once or several times.
  • adenoviral particles obtained in stage (c) of the previous cycle are used as starting material. This way it You can repeat the process of the invention successively several times obtaining a larger number of adeno viral particles in each cycle.
  • Example 1 Construction of plasmid pGal4-2RU-El-SceI for inducible expression of adenoviral genes EIa and EIb and restriction enzyme I-Scel.
  • plasmid pGal4-2RU-El-SceI which contains polynucleotide A2 as defined in the invention (Fig. IA)
  • Fig. IA plasmid pGal4-2RU-El-SceI
  • the gene encoding the restriction endonuclease I-Scel has been included.
  • the transcriptional regulator that controls the expression of the EIa, EIb and I-Scel genes is constitutively expressed from a nucleotide sequence included within the same A2 polynucleotide.
  • the mechanism of transcription regulation is mediated by the mifepristone antiprogestin system (Burcin et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 96: 355-360). Such regulation takes place through a fusion protein insensitive to human endogenous hormones but active in the presence of synthetic antiprogestins (RU486) at doses low enough to avoid side effects in humans.
  • the GeneSwitch TM commercial system (Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos. Kl 060-01 and Kl 060-2) has been used as the basis for the construction of plasmid pGal4-2RU-El-SceI. This system provides all the genetic components necessary for the design of the plasmid that includes polynucleotide A2.
  • the first component of the GeneSwitch TM system is the pSwitch vector (Fig. 2A), which encodes the GAL4-hPR-p65 fusion protein that acts as a transcriptional activator.
  • the protein is divided into a DNA-binding domain (DBD) of the GAL4 protein from Saccharomyces cerevisiae (Laughon and Gesteland, 1984, Mol.
  • DBD DNA-binding domain
  • hP R-LBD human progesterone receptor
  • AD human NF- ⁇ B
  • the expression of the regulatory protein is under the control of a hybrid promoter derived from the binding of the GAL4 activation sequences of Saccharomyces cerevisiae (UAS: upstream activating sequences) (Giniger et al., 1985, CeIl, 40: 767- 774; Wang et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 8180-8184) and the minimal promoter of the thymidine kinase (P t k) gene of the Herpes Simplex Virus.
  • UAS upstream activating sequences
  • the promoter activation region includes 4 copies of the sequence 5 '- (T / C) GGAGT ACTGTCCTCCG-3' (SEQ ID NO: 1). Each serves as a binding site for two molecules of the DNA binding domain of the transcription factor GAL4 (Marmorstein, et al., 1992, Nature, 356: 408-414).
  • the second component of the GeneSwitch TM system is plasmid pGene / V5-HisA (Fig. 2B), which controls the expression of the gene of interest.
  • the hybrid promoter that controls transcription is composed of 6 binding sequences of the GAL4 transcription factor and the TATA Box sequence of the EIb gene (P EII O of adenovirus (Lillie and Green, 1989, Nature, 338: 39 -44).
  • the system in the absence of mifepristone will constitutively express the regulatory fusion protein GAL4-hPR-p65 from the minimum thymidine kinase promoter. This protein is predominantly located in the nucleus and in an inactive form.
  • the mifepristone inducer or its analogue RU486, it binds with high affinity to the hPR-LBD region of GAL4-hPR-p65, causing a conformational change that results in dimerization of the protein and its conversion to the active form
  • These homodimers interact with the GAL4 binding sequences (UAS) located in plasmids pGene / V5-HisA and pSwitch, thus activating the transcription of the gene of interest and the gene encoding the transcription factor itself (Fig. 2C).
  • the bacterial strains used for the propagation of the constructions described below were Escherichia coli DH5 ⁇ and E. coli STBL2.
  • the growth was carried out in Luria Bertani (LB) medium (Sigma-Aldrich, 28760 Madrid, Spain) supplemented with Ampicillin (100 ⁇ g / ml) (Sigma-Aldrich) as a selection medium and at 37 0 C, in the case of strain DH5 ⁇ , and 30 0 C for STBL2.
  • the bacteria were transformed following the protocol of CaCl 2 initially described by Hanahan (1983, J. Mol. Biol, 166: 557-580). For this, 10-20 ng of plasmid DNA was mixed with 100 ⁇ l of competent cells and kept on ice for 30 min.
  • the mixture was incubated at 42 0 C for 1 minute and immediately transferred to ice where incubated another 2 min. Finally he was added 1 ml of LB medium and incubated for 1 h at 37 0 C under stirring.
  • ligation reactions were designed for a final volume of 20 ⁇ l with 1 U of T4-DNA ligase (New England Biolabs, Beverly MA01915-5599, USA) and 2 ⁇ l of 1OX reaction buffer ( New England Biolabs).
  • the reactions were designed for a final volume of 20 ⁇ l with 1 U of T4-DNA ligase (New England Biolabs), 2 ⁇ l reaction buffer 10X (New England Biolabs) and 2 ⁇ l of PEG 4000 to 50%.
  • all reactions were incubated at room temperature for 2 hours and quenched at 65 0 C / 10 minutes prior to its introduction into the E. coli strain corresponding.
  • Recombinant clones were selected based on the resistance marker encoded by the vector and confirmed by restriction endonuclease digestion and 1% agarose gel electrophoresis.
  • the amplification conditions were the following: 1 denaturing cycle of 4 minutes at 95 0 C; 29 cycles of 50 seconds at 94 0 C denaturation, 40 seconds at 50 0 C with primer annealing 40 seconds at 72 0 C of elongation; 1 cycle of 5 minutes at 72 0 C of final elongation.
  • the samples were mixed with 1.5 ⁇ l of the loading solution (0.25% bromophenol blue in distilled water; 40% glycerol; 100 mM EDTA) and analyzed by agarose gels electrophoresis (1% ) with TAE IX buffer (40 mM Tris Base; 20 mM glacial acetic acid; 1 mM EDTA, pH 8.0) visualizing the DNA by staining with ethidium bromide (0.5 ⁇ g / ml).
  • the loading solution 0.25% bromophenol blue in distilled water; 40% glycerol; 100 mM EDTA
  • TAE IX buffer 40 mM Tris Base; 20 mM glacial acetic acid; 1 mM EDTA, pH 8.0
  • the regulation plasmid pGal4-2RU-El-SceI was designed in five steps described below: 1) Construction of the pGene-LinkerRU2 vector: Plasmid pSwitch was linearized with the restriction enzymes Sbfl (position 38) and BamHl (position 2484) to include the LinkerRU2. This was previously synthesized from the primers
  • LinkerRU-2 5' GATCTGCGGCCGCGGTGATATCACGCGTTGGACTAGTGGTGTTTAAACGGTTCTA GAGGATCCTTGGTGGTCCTGCA3 '(SEQ ID NO: 3)
  • each primer was mixed at a concentration of 50 mM in buffer solution (50 mM Tris-HCl pH8.0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA).
  • the reaction conditions were as follows: 95 0 C for 2 minutes and 52 0 C for 10 minutes.
  • the LinkerRU2 fragment was then phosphorylated with the enzyme T4 polynucleotide kinase following the manufacturer's recommendations (New England Biolabs).
  • the reaction was incubated 30 minutes at 37 0 C and 65 0 C inactive for roughly 15 minutes.
  • the LinkerRU2 was then ligation with the pSwitch vector and transformed into E. coli DH5 ⁇ . The resulting construction was called pSwitch-LinkerRU2.
  • Ad5 The El region of Ad5 was amplified by PCR with the primers: adl9 5 -GAGTGCCAGCGAGTAGAGTT-3 '(SEQ ID NO: 4), and ad22 5 -GAATTCTCAATCTGTATCTTCATC-3' (SEQ ID NO: 5).
  • the resulting 3 kb product was cloned into the specific vector for pGemT-Easy PCR products (Promega Biotech Ibérica, 28108 Madrid, Spain). By digestion with EcoRl, said El region was purified and subcloned into the EcoRl target of the pGeneLinkerRU2-2pA vector and located "downstream" of the BGHpA polyadenylation signal.
  • the resulting plasmid was named pGeneLinkerRU2-2pA-
  • the SV40pA sequence was purified from the initial construction pGeneLinkerRU2-2pA by digestion with BamHl. The 0.2 kb fragment was cloned into the single target BamHl of plasmid pGeneLinkerRU2-Gal4-BGHp A-E 1.
  • the gene encoding the endonuclease I-Scel was obtained by PCR amplification with the primers:
  • the resulting plasmid was called pGene-IScel.
  • Digestion of plasmid pGene-IScel with Xbal released a 1.2 kb fragment that includes the I-Scel endonuclease gene under the transcriptional control of the minimal promoter of the adenovirus EIb gene (P EIB ).
  • the fragment was subcloned into the localized Spel compatible target, within the plasmid pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-El, between the BGH polyadenylation sequence and the El region.
  • the resulting construct was named pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI-El.
  • the region of the pGeneV5-HisA vector that encompasses the transcriptional activator binding (UAS) regulatory sequences and the minimum P EIB promoter was obtained by PCR amplification with the primers:
  • Example 2 Construction of plasmid pRCAd2 for integration into mammalian cells of the genome of an adenovirus deleted in the packaging signal and EIa and EIb genes, and encoding the I-Scel endonuclease.
  • the packing sequence ( ⁇ ) and the region corresponding to the early A and Elb genes have been deleted for greater control of the expression of the rest of the viral genes.
  • the adenoviral sequence is delimited at both ends by recognition sequences for the restriction endonuclease I-Scel of Saccharomyces cerevisiae (Anglana and Bacchetti, 1999, Nucleic Acids Res., 27: 4276-4281) which, due to the size of its target sequence (T AGGGAT AACAGGGT AA - SEQ ID NO: 8) and its high specificity, does not recognize sequences within the genome of the cell to be transfected.
  • the insertion of these sequences facilitates the release of the viral genome only in the presence of the I-Scel protein. This digestion leaves the ITR ends of the adenovirus free, necessary for the correct transcription and replication of the viral DNA.
  • an attB sequence has been included at the 5 'end of the construction that promotes the integration of the plasmid into the cellular genome, a process mediated by the PhiC31 recombinase of the Streptomyces phage.
  • This enzyme has a great potential as an integration system for exogenous DNA in mammalian cells since it gives rise to a specific and unidirectional reaction and has net integration frequencies higher than those observed with other recombinases (Thyagarajan et al., 2001, Mol CeIl. Biol, 21: 3926-3934).
  • the recognition sequences for the PhiC31 integrase are called attB and attP and are different in sequence.
  • the resulting att sequences differ from the original attB and attP sequences, blocking possible secondary recombination reactions.
  • PhiC31 is capable of mediating recombination events at points in the genome in which sequences with partial identity to attP exist and are called pseudo- ⁇ ⁇ P (Fig. 4).
  • the total number of pseudo- ⁇ ⁇ P sequences could be between 10 2 and 10 3 which makes the integration frequency 2 to 3 times higher than in the case of homologous recombination-mediated integrations, and even 10 to 100 times greater than the integration mediated by other specific recombinases such as Cre recombinase.
  • the bacterial strains of E. coli used for the propagation of the constructions described below were DH5 ⁇ , STBL2 and BJ5 183.
  • the bacteria were transformed following the CaCl 2 protocol described in Example 1. Growth was carried out in Luria medium. Bertani (LB) (Sigma-Aldrich) supplemented with Ampicillin (100 ⁇ g / ml) (Sigma-Aldrich) as a selection medium at 37 0 C, in the case of strains DH5 ⁇ and BJ5183, and 30 0 C for E. coli STBL2. All PCR reactions designed in the synthesis process of plasmid pRcAd2 were carried out under the same conditions as described in Example 1. The general procedures applied in the purification and manipulation of nucleic acids are also described in Example 1.
  • the pRcAd2 vector was designed in 4 steps, described below:
  • the first step in the construction of the pRcAd2 vector was the PCR amplification of the attB region with the primers:
  • the amplified fragment was subcloned into the specific vector for pGemT-Easy PCR products (Promega), following the manufacturer's recommendations.
  • the attB-P2 primer includes a Linker with the recognition sequence for the restriction enzyme I-Scel of Saccharomyces cerevisiae.
  • the ⁇ tóMScel fragment (316 bp) was released from the pGemT-Easy vector by digestion with the restriction enzymes Ncol and Pac ⁇ and subcloned into the plasmid pGemT / A6, previously digested with these same enzymes.
  • pGemT / A6 derives from the PCR amplification of the genotype region of adenovirus serotype 5 between positions 1 and 190, with the primers:
  • ad63 5 '-AGATCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-S', (SEQ ID NO: 13) and ad64: 5 -AGATCTCGGCGCACACCAAAAACGTC-3 '(SEQ ID NO: 14),
  • pRC / RSV eukaryotic expression vector
  • Ad sequence 3528-4459
  • target sequences for BgHl and Xbal were included at the 5 'end of primers ad57 and ad58, respectively.
  • the insert is integrated between positions 13 and 701 of the vector.
  • the 3 'end of the adenoviral genome (positions 34901-35938) was amplified with the primers:
  • the target sequence for the restriction enzyme I-Scel was included at the 5 'end of the ad65 primer. Both primers include at their end 5 'the restriction targets for Xbal (ad59) and Kpnl (ad65).
  • the 1060 bp fragment, product of This amplification was cut with these enzymes to facilitate its "downstream" subcloning of the Ad region (3528-4459) inserted into the vector pRC / A6-A5.
  • the resulting construction was called pRC / A6-A7.
  • Plasmid pRC / A6-A7 was linearized with Xbal and dephosphorylated with Alkaline Phosphatase following the manufacturer's recommendations (Alkaline Phosphatase, Intestinal CaIf (CIP); New England Biolabs).
  • Both the linearized vector pRC / A6-A7 and the insert released from plasmid pTG3602 were used simultaneously to transform the electrocompetent bacterial strain of E. coli BJ5183 (BJ5I83 Electroporation competent cells; Stratagene). These cells are specially designed to promote recombination processes between homologous sequences of a transfer vector, which contains the gene of interest, and a vector that includes the adenoviral genome.
  • homologous regions included in both DNA fragments favor said recombination process whose resolution entails the insertion of the adenoviral genome into the vector pRC / A6-A7 and from position 4459 of the virus (Fig. 5).
  • the electroporation process was carried out, following the manufacturer's recommendations, in a Gene Pulser electroporator (Biorad) and establishing the following parameters: voltage: 2.5 kV; resistance: 200 ⁇ ; capacitance: 25 ⁇ F; Pulse duration: 5 ms. Finally, 1 ml of LB medium was added and the suspension was incubated with stirring for 1 hour at 37 ° C. Then serial dilutions of the transformed cells were prepared. These were seeded in plates of culture medium supplemented with ampicillin (100 ⁇ g / ml) as a selection antibiotic for plasmid pRC / A6-A7. Incubation was continued at 37 0 C until the appearance of resistant clones.
  • Plasmid pRcAd2 includes the complete adenovirus genome, with the exception of the region located between positions 190 and 3528 and corresponding to the El region. The sequence is delimited by restriction targets for I-Scel, and has an attB sequence in its 5 'end (Fig. 5).
  • Example 3 Construction and characterization of stable cell lines for the production and packaging of high capacity adenoviral vectors
  • a transcriptional regulation system inducible by mifepristone controls the expression of the EIa and EIb genes, which in turn direct the expression and replication of the rest of the adenoviral genome.
  • This same system controls, in turn, the production of the I-Scel restriction endonuclease necessary for the release of the adenoviral genome integrated into the eukaryotic cell genome, which provides a second level of transcription control. Induction (and therefore the production of viral particles) begins at the time of addition to the culture medium of mifepristone or its analogue RU486.
  • the human lung carcinoma cell line A549 has been used for the design of a helper independent high capacity vector production system. This cell line initiated by Giard et al. (1973, J. Nati. Cancer Inst., 51: 1417-1423) and subsequently characterized in depth by Lieber et al. (1976, Int. J. Cancer., 17: 62-70), has a high sensitivity to adenovirus infection which gives it a high potential as a virus production line
  • Example 3.1 Generation of cell lines by transfection of plasmid pRcAd2 for stable integration of the viral adeno genome (polynucleotide B).
  • A549 cells were incubated in 10 cm plate 2 at 37 0 C, 5% CO 2 , until reaching a confluence of 80%.
  • the cells were co-transfected by lipofectamine with 3 ⁇ g of the pRcAd2 construct (confers resistance to Neomycin (neo 1 )) and 1 ⁇ g of the plasmid pCMV-Int (Groth et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 97: 5995-6000), which encodes the Streptomyces phage PhiC31 integrase and promotes stable integration of the plasmid into the cell genome (Fig. 6A).
  • the DNA of both plasmids was previously diluted in 500 ⁇ l of OPTI-MEM serum-free medium (Gibco ® : Invitrogen, Carlsbad CA92008, USA).
  • OPTI-MEM serum-free medium Gibco ® : Invitrogen, Carlsbad CA92008, USA.
  • the Reagent Plus reagent (Invitrogen) was added in a 1: 0.75 ratio (DNA: Plus Reagent). After 5 minutes of incubation at room temperature 6 ⁇ l of Lipofectamine LTX (Invitrogen) was added and the mixture was incubated again at room temperature for 25 minutes.
  • DMEM fetal bovine serum
  • L-Glutamine 200 mM in 0.85% NaCl
  • Penicillin / Streptomycin 1% 10 mg / ml in 0.85% NaCl; Gibco ® .
  • the medium was removed and, after washing with phosphate buffered saline IX (PBS) (Gibco ® ), the transfected cells were raised with trypsin (Trypsin-EDTA; Gibco ® ) and centrifuged at 1250 rpm for 5 minutes at room temperature .
  • the precipitate of cells was resuspended in 6 ml of culture medium and distributed in three 60 cm 2 plates.
  • New medium was added, in this case supplemented with the G418 selection antibiotic, Neomycin analogue, at a concentration of 600 ⁇ g / ml.
  • the culture medium was changed every two days until the appearance of isolated antibiotic resistant clones (2-3 weeks).
  • the clones were lifted with trypsin and transferred to 0.3 cm 2 wells with selection medium. Incubation was continued until 80% confluence was reached and then transferred to wells with a larger surface area. After successive passes, a G418 resistant clone that was called pRc-1 was isolated. To test the stability of the clone, the cells were kept 4 months in culture without changes in their morphology or viability.
  • the genomic DNA of the pRc-1 clone was extracted with the QIAmp DNA minikit system (Qiagen) following the manufacturer's recommendations. This DNA was used in Nested-PCR assays to detect the presence of the Illa, IV adenoviral genes, the protease coding gene and the gene encoding the viral polymerase.
  • the primers used in this detection were:
  • PCR reactions with the Nested-PCR external primers were carried out in the presence of 1 U of the enzyme Taq polymerase (BioTaq, Bioline), PCR buffer (Bioline), MgCl 2 1.5 mM, 0.4 mM of each dNTP, 10 pmol of each primer, DNA and sterile deionized water to a final volume of 50 ⁇ l.
  • the amplification conditions were as follows: 1 cycle of 2 minutes at 94 0 C, 50 seconds at 94 0 C denaturation, 50 seconds of hybridization with the primer (Tm according to the gene to be amplified, see table) and 50 seconds at 72 0 C elongation; 35 cycles of 50 seconds at 94 0 C of denaturation, 50 seconds of hybridization with the primer (Tm according to the gene to be amplified, see table) and 50 seconds at 72 0 C of elongation; 1 cycle of 7 minutes at 72 0 C of final elongation.
  • Amplification reactions with the Nested-PCR internal primers were carried out from 2 ⁇ l of the previous PCR reactions and in the presence of 1 U of the enzyme Taq polymerase (BioTaq, Bioline), buffer PCR (Bioline), 2.5 mM MgCl 2 , 0.4 mM of each dNTP, 10 pmol of each primer, DNA and sterile deionized water to a final volume of 50 ⁇ l.
  • the amplification conditions were: 35 cycles of 50 seconds at 94 0 C denaturation, 50 seconds hybridization with the primer (Tm according to the gene to be amplified, see table) and 50 seconds at 72 0 C of elongation; 1 cycle of 7 minutes at 72 0 C of final elongation.
  • the loss of the attB region was also checked by PCR reaction using the attB-Pl primers; attB-P2 (Example 2).
  • PCR reactions were carried out in the presence of 1 U of the enzyme Taq polymerase (BioTaq, Bioline), PCR buffer (Bioline), 4 mM MgCl 2 , 0.4 mM of each dNTP, 10 pmol of each primer, DNA and water sterile deionized to a final volume of 50 ⁇ l.
  • the amplification conditions were the following: 1 denaturing cycle of 4 minutes at 95 0 C; 29 cycles of 50 seconds at 94 0 C denaturation, 40 seconds at 50 0 C with primer annealing 40 seconds at 72 0 C of elongation; 1 cycle of 5 minutes at 72 0 C of final elongation.
  • the samples were mixed with 1.5 ⁇ l of the loading solution (0.25% bromophenol blue in distilled water; 40% glycerol; 100 mM EDTA) and analyzed by agarose gels electrophoresis ( 1%) with TAE IX buffer (40 mM Tris Base; 20 mM glacial acetic acid; 1 mM EDTA, pH 8.0) visualizing the DNA by staining with ethidium bromide (0.5 ⁇ g / ml).
  • the loading solution 0.25% bromophenol blue in distilled water; 40% glycerol; 100 mM EDTA
  • TAE IX buffer 40 mM Tris Base; 20 mM glacial acetic acid; 1 mM EDTA, pH 8.0
  • Fig. 6B confirm the correct integration of polynucleotide B into the genome of the A549 eukaryotic cell.
  • the loss of the attB region further confirms that such integration has been mediated specifically and unidirectionally by the PhiC31 integrase.
  • the clone pRc-1 was incubated in plate 20 cm 2 at 37 0 C, 5% CO 2, until reaching a confluence of 80%. At this time the cells were transfected with a 5 ⁇ g dilution of the construction pGal4-2RU-SceI-El, Plus Reagent (1: 0.75) and 12 ⁇ l Lipofectamine LTX, following the procedure described above. The transfections were carried out in duplicate by incubating one of the plates in the presence of the RU486 inducer at a concentration of 10 "8 M.
  • RNA was used for retrotranscription (RT) -PCR assays with specific primers for adenoviral genes
  • III III 1 5 -GCCAGTGGCGGCGGCGCTGGG-3 '37
  • RNA was previously treated with 1 unit of DNase (DNasal amplification grade; Invitrogen) in reaction buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.4; 2 mM MgCl 2 ; 50 mM KCl) and at a final volume of 10 ⁇ l.
  • DNase DNasal amplification grade
  • reaction buffer 20 mM Tris-HCl, pH 8.4; 2 mM MgCl 2 ; 50 mM KCl
  • the reaction was incubated at room temperature for 15 minutes and the DNase was inactivated by adding 1 .mu.l of 25 mM EDTA solution, and incubating at 65 0 C for 10 min.
  • 625 ng of this DNA-free RNA was used.
  • the reverse transcription reaction was started by mixing the sample with 10 pmol of the specific primer, 1 ⁇ l of dNTPs (10 mM) and water to a final volume of 13 ⁇ l. After incubation at 65 0 C for 5 minutes, the mixture was cooled in ice and 2 .mu.l of DTT 0.1 M and 4 .mu.l of reaction buffer (Tris-HCl 250 mM, pH 8.3 was added; 375 mM KCl; MgCl2 15 mM ). Finally after a further incubation at 37 0 C for 2 minutes they were added 200 U of M-MLV Reverse Transcriptase-(Invitrogen) and incubation was continued at 37 0 C for 50 min.
  • the resulting cDNA was used as a template in PCR reactions in order to amplify the transcription product of the genes under study.
  • an amplification reaction was included using the DNase treated RNA as a template.
  • the amplification conditions used for the PCR reactions with the cDNA obtained from the reverse-transcription reaction were the same as those used in the amplification reactions of the genomic DNA.
  • clone pRc-1 was previously transfected with the pGal4-2RU-SceI-El construct. The transfections are made in duplicate to obtain transfected and incubated cells in the presence and absence of the RU486 inducer. After 24 hours of incubation, the cells were lifted with trypsin and 8x10 4 cells were transferred to a four-cell culture slide (BD Falcon Cultureslide; BD Biosciences, Erembodegem 9320, Belgium), adding new culture medium with and without RU486 inducer .
  • the samples were counterstained with Mayer's Hematoxylin (5 seconds) for specific staining of nuclei and, after a 15-minute wash in water, the samples were dehydrated by immersing them 1 minute in 70%, 96% and 100% alcohol, and 10 minutes in Xylene.
  • a stable cell line was designed into which polynucleotide A2 has been integrated, as defined in the invention (Fig. IA).
  • the originated cell line has the genes necessary for the initiation and control of the expression of adenoviral genes included in polynucleotide B.
  • these genes such as the gene encoding the restriction endonuclease I-Scel and the viral adeno region
  • the one that encodes, in turn, the ElA and ElB proteins are under the control of promoters regulated by mifepristone.
  • the regulation factor GAL4-hPR-p65 itself is included in polynucleotide A2 and, therefore, will be integrated simultaneously into the cellular genome. Said trans activator will be expressed constitutively by the modified cells.
  • A549 cells were incubated in 10 cm plate 2-37 0 C, 5% CO 2, until reaching a confluence of 80%.
  • the cells were transfected by the lipofectamine method with the construction pGal4-2RUSceI-El (Zeomycin resistance gene (zeo 1 )) and following the procedure described in section 3.1 to obtain the pRc-1 clone.
  • the cells were incubated in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% L-GIu and 1% P / S and the antibiotic Zeomycin at a concentration of 400 ⁇ g / ml. After successive amplification passes, an antibiotic resistant clone that was called Gal-13 was isolated.
  • the stability of the Gal-13 clone was tested by maintaining it in culture for a period exceeding 4 months and more than 35 successive passes.
  • PCR assays from the genomic DNA of the cell confirmed the presence of the adenoviral genes EIa and EIb, the gene encoding the endonuclease I-Scel and the gene encoding the transcriptional regulatory GAL4-hPR-p65 fusion protein Mifepristone inducible.
  • the primers used were: Sequence Sequence Gene SEQ ID NO:
  • the genomic DNA of the cells was extracted with the QIAmp DNA minikit system (Qiagen) following the manufacturer's recommendations and the PCR reactions were carried out in the presence of 1 U of the enzyme Taq polymerase (BioTaq, Bioline), PCR buffer ( Bioline), 4 mM MgCl 2 , 0.4 mM of each dNTP, 10 pmol of each primer, DNA and sterile deionized water to a final volume of 50 ⁇ l.
  • the amplification conditions were the following: 1 denaturing cycle of 4 minutes at 95 0 C; 29 cycles of 50 seconds at 94 0 C denaturation, 40 seconds at 50 0 C with primer annealing 40 seconds at 72 0 C of elongation; 1 cycle of 5 minutes at 72 0 C of final elongation.
  • the samples were mixed with 1.5 ⁇ l of the loading solution (0.25% bromophenol blue in distilled water; 40% glycerol; 100 mM EDTA) and analyzed by electro foresis in agarose gels (1 %) with TAE IX buffer (40 mM Tris Base; 20 mM glacial acetic acid; 1 mM EDTA, pH 8.0) visualizing the DNA by staining with ethidium bromide (0.5 ⁇ g / ml).
  • TAE IX buffer 40 mM Tris Base; 20 mM glacial acetic acid; 1 mM EDTA, pH 8.0
  • Samples were analyzed by polyacrylamide-SDS discontinuous gel electrophoresis and Laemli electrophoresis buffer (25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0.1% w / v SDS).
  • the separating gel was composed of 12% polyacrylamide in 0.39 M Tris-HCl buffer (pH 8.8) with 0.1% SDS.
  • As catalysts 0.1% PSA and 0.04% TEMED were used.
  • the concentration gel was composed of 5% polyacrylamide in 0.125 M Tris-HCl (pH6.8) with 0.1% SDS, 0.1% PSA and 0.01% TEMED.
  • Hybridization with the primary antibody was carried out in 1% milk solution + PBS-T ween for 1.5 hours at room temperature. Excess antibody was removed with 3 10 minute washes in PBS-Tween. Hybridization with the secondary antibody was performed in 1% milk + PBS-Tween for 30 minutes at room temperature.
  • the Anti-adenovirus2 ElA (Mouse) antibody (1: 500) (Calbiochem ® : EMD, La Jolla CA92039-2087, USA) was used and as the secondary antibody the Immunopure goat anti-mouse IgG-Peroxidase (1: 5000) (Pierce Biotechnology).
  • the Immunopure goat anti-mouse IgG-Peroxidase (1: 5000) (Pierce Biotechnology).
  • I-Scel protein Anti-H A-Per oxidase High affinity (1: 500) was used as the only antibody (Roche Diagnostics, 08174 Barcelona, Spain). After 3 washes of the membrane in PBS-Tween for 10 minutes, the development was carried out.
  • Example 3.3 Generation of stable cell lines by double transfection of A549 cells with plasmids pGa! 4-2RUSceI-El (polynucleotide A) and pRcAd2 (polynucleotide B).
  • the Zeomicina Gal-13 resistant clone (example 3.2) was co-transfected with the pRcAd2 (neo 1 ) construct, which includes the rest of the genes of the adenovirus, and the plasmid pCMV-Int encoding the PhiC31 integrase.
  • the transfection conditions were the same as those used to obtain the Gal-13 clone and the selection was made in the presence of antibiotics G418 (600 ⁇ g / ml) and Zeomycin (400 ⁇ g / ml).
  • genomic DNA was extracted with the QIAmp DNA minikit system (Qiagen) following the manufacturer's recommendations. This DNA was used in Nested-PCR assays to detect the presence of the Illa, IV adenoviral genes, the protease coding gene and the gene encoding the viral polymerase.
  • the primers used in this detection were the same as those used in section 3.1. In the same way, the amplification reactions were carried out under the same conditions as those described in section 3.1.
  • the amplification products were analyzed by electro foresis in agarose gels (1%) with TAE IX buffer (40 mM Tris Base; 20 mM glacial acetic acid; EDTA 1 mM, pH 8.0) and visualizing the DNA by staining with ethidium bromide (0.5 ⁇ g / ml) (Fig. 10).
  • RU486 at a concentration of 10 "8 M.
  • 6x10 4 cells were transferred to a four cell culture slide (BD Falcon Cultureslide; BD) and the same procedure was followed as in the case of clone pRc-1 (example 3.1).
  • the primary antibody used was the Mouse anti-adenovirus monoclonal antibody blend (Millipore) antibody diluted in PBS (1:75) and as the secondary antibody the Immunopure goat anti-mouse IgG-P er oxidase antibody (Pierce Biotechnology) also diluted in PBS ( 1: 400).
  • Example 4 Production and packaging of infectious particles of the KCZ gutless virus.
  • Example 4.1 Production and packaging of the KCZ virus in the pRc-1 packaging line by co-transfection system with two plasmids.
  • the clone selected from the cell line generated in Example 3.1 was used for the production and packaging of high capacity adeno virus or gutless adenovirus.
  • This production system allows obtaining high-capacity adenovirus viral extracts without the need for the use of a helper virus as a complement to the genes deleted in the plasmid pRcAd2 and stably integrated into the eukaryotic cell chromosome.
  • the system requires transfection of the cell line, in each of the production steps, with the plasmid pGal4-2RU-SceI-El.
  • This complementation plasmid expresses the EIa and EIb genes from the inducible promoter regulated by mifepristone (Fig. IA), which will initiate the expression of the rest of the adenoviral genes.
  • replication of the integrated viral genome will only be possible at the time of I-Scel restriction endonuclease expression, included in plasmid p Gal4-2RU-SceI-El and also transcriptionally controlled by the GAL4-hPR regulator -p65. The release of the viral genome and the beginning of its replication will allow obtaining multiple copies of it and, therefore, sufficient levels of viral proteins for encapsidation of the adeno virus of high capacity and its purification in a high titer.
  • the KCZ vector carries the bacterial ⁇ -galactosidase (lacZ) gene.
  • lipofectamine was used as a DNA internalization system in the eukaryotic cell.
  • the DNA of both plasmids was previously diluted in 1 ml of OPTI-MEM serum-free medium (Gibco ® ).
  • the Reagent Plus reagent (Invitrogen) was added in a 1: 0.75 ratio.
  • 12 ⁇ l of Lipofectamine LTX was added and the mixture was incubated again at room temperature for 25 minutes. Then the dilution was added dropwise on the cell culture medium (DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum).
  • the medium was replaced by fresh DMEM medium supplemented with 2% bovine serum and RU486 inducer at a concentration of 10 "8 M. Having no clear cytopathic effect, the cells were incubated for 48 to 120 hours and subsequently collected at different times in their own environment. After centrifugation at 1250 rpm for 5 minutes, the precipitate was resuspended in 200 ⁇ l of 0.1M Tris-HCl (pH 8.0) and the cells were used by three freeze / thaw cycles.
  • the cell debris was centrifuged and the supernatant titer was determined by X-gal staining of 293 S cells infected with KCZ vector preparations.
  • the 293S cells were grown in 2 cm 2 wells until reaching a confluence of 80% in DMEM medium supplemented with 2% bovine fetal serum and 1% Na-Pyruvate. Then, the culture medium was removed and the cells were infected with serial dilutions of the viral extract in DMEM + 2% FBS + 1% Na-Pyruvate. After incubation for 4 hours at 37 0 C, 5% CO 2, fresh medium was added and incubation was continued another 48 hours.
  • Example 4.2 Production and packaging of the KCZ virus in cells of clones GAd-I and GAd-6. Unique transfection system with the high capacity vector.
  • the production system described below uses as a packaging cell a modified line in which the A2 and B polynucleotides described in the invention have been stably integrated (Fig. IA, IB). Except for the polynucleotide corresponding to the high capacity adenoviral vector, this cell line does not require any element additional (plasmid or helper virus) for the production of viral particles with infective capacity.
  • the system integrates the adenoviral genes necessary for encapsidation and replication of the high capacity adenovirus (polynucleotide B), as well as the genes of the El region and the restriction endonuclease I-Scel (polynucleotide A2), necessary for controlled expression already high levels of the previous viral proteins, in a single cell.
  • the start of the production process is regulated by the expression of the genes of the E1 region and the restriction endonuclease from their corresponding inducible promoters and the transcriptional activator GAL4-hPR-p65.
  • the GAd-6 and GAd-I packaging lines were transfected with 12 ⁇ g of the KCZ gutless vector encoding the ⁇ -galactosidase reporter gene and which has previously been linearized with the enzyme of Pmel restriction, as indicated in example 4.1.
  • Transfection with the high capacity vector was carried out following the procedure described in the production system with the pRc-1 packing line (example 4.1).
  • the cells were incubated for 48 to 120 hours in DMEM medium supplemented with 2% fetal bovine serum and in the presence of the RU486 inducer at a concentration of 10 "8 M.
  • the cells were collected at different times, centrifuged at 1250 rpm for 5 minutes and finally resuspended in 200 ⁇ l of 0.1M Tris-HCl. After lysis with three freeze / thaw cycles, the cell debris was centrifuged and the supernatant was titrated in the 293 S cell line following the protocol described in the previous example.
  • these extracts will be used for the infection of new packaging cells during successive amplification passes.
  • the system described in the present embodiment differs from the previous co-transfection system with two plasmids (example 4.1) or other helper-dependent production systems, in eliminating the process of transfection / infection of the packaging cells in each of the steps of virus amplification This feature significantly reduces production time and increases its performance.
  • the other great advantage is the absence of contaminations with helper viruses, which simplifies the process of purification of the virus and allows obtaining sufficient quantities for use in human gene therapy procedures.

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Abstract

La invención se relaciona con un nuevo sistema de producción y empaquetamiento (encapsidación) para vectores adenovirales de alta capacidad que no requiere de la utilización de virus helper y que se caracteriza porque integra los genes adenovirales necesarios para el control, replicación y empaquetamiento de las partículas virales dentro del genoma de una célula hospedadora, lo cual mejora la estabilidad del sistema de producción a largo plazo.

Description

SISTEMA PARA EMPAQUETAMIENTO DE ADENO VIRUS DE ALTA
CAPACIDAD
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y, más concretamente, en el campo de vectores para la expresión de genes heterólogos en células diana. En particular, la invención se refiere a un sistema para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad útiles para transferencia génica.
ANTECEDENTES
Los adenovirus de alta capacidad (HC), conocidos también como adenovirus gutless o adenovirus /ze//?er-dependientes, tienen un gran atractivo como vectores para terapia génica porque in vivo presentan una inmunogenicidad asociada muy reducida y poseen una alta eficiencia de transducción y amplio tropismo, tanto en roedores como en primates. Estos vectores se caracterizan por contener solamente las secuencias de ADN necesarias para su replicación y empaquetamiento y carecer del resto de genes adenovirales, lo que hace que puedan acomodar secuencias de hasta 36 kb. Para la replicación del ADN viral y su empaquetamiento en partículas virales, las únicas secuencias adenovirales requeridas en cis por estos vectores son las secuencias ITR (inverted terminal repeats), localizadas en ambos extremos del ADN lineal, y la señal de empaquetamiento (ψ) (Gráble y Hearing, 1992, J. Virol, 66: 723-731; Hearing y Shenk, 1983, CeIl, 33: 695-703).
Dado que los adenovirus de alta capacidad carecen de todas las regiones virales codificantes, su propagación sólo es posible si las células se co-infectan con un segundo virus denominado virus helper o auxiliar, es decir, un virus capaz de codificar todas las proteínas necesarias para la replicación de un virus defectivo y su encapsidación en partículas virales con capacidad infectiva. En el caso de la producción de vectores adenovirales de alta capacidad, el virus helper se caracteriza por tener delecionada la región El adenoviral y proporcionar, in trans, todo el repertorio de proteínas virales necesarias para la replicación y ensamblaje de la progenie del virus gutless. Para la propagación de este último también es necesaria la utilización de líneas celulares capaces de complementar la deleción de dicha región El en el virus helper, como son la línea 293 (Graham, et al, 1977, J. Gen. Virol., 36: 59-74) o la línea PerC6 (Fallaux et al, 1998, Hum. Gene Ther., 9: 1909-1917).
Sin embargo con este sistema de propagación se generan también partículas virales indeseables que encapsidan genomas de virus helper y contaminan las preparaciones finales de los adenovirus de alta capacidad. Hasta la fecha se han desarrollado y descrito diferentes sistemas para tratar de eliminar dichas contaminaciones bloqueando el proceso de empaquetamiento del virus helper. En general, estos sistemas están basados en la incorporación de mutaciones en la señal de empaquetamiento del virus helper, en el aumento del tamaño de su genoma y, más particularmente, en una eliminación específica de la señal de empaquetamiento durante el proceso de producción viral.
Parks et al. (1996, Proc. Nati. Acad. ScL USA, 93: 13565-13570) han descrito la eliminación de la señal de empaquetamiento ψ del virus helper mediante un sistema de recombinación Cre-loxP. En este sistema la señal ψ está flanqueada por sitios loxP y la propagación del virus se lleva a cabo en células 293 que expresan la recombinasa Cre
(células 293Cre). Cuando el virus helper entra en la célula, la recombinasa escinde la señal ψ impidiendo que pueda ser empaquetado pero manteniendo su capacidad de replicación y, por tanto, la expresión de las secuencias codificantes necesarias para el empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad.
Groth et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 5995-6000) han propuesto la utilización de una recombinasa unidireccional, en particular la recombinasa Φ C31, utilizando las secuencias attBIattP de reconocimiento específico para flanquear la señal ψ. Cuando la recombinasa PhiC31 escinde la secuencia flanqueada por los sitios attBIattP, modifica las secuencias de reconocimiento y las convierte en secuencias attRlattL evitando que vuelva a producirse el reconocimiento y, por tanto, la reintroducción de la señal ψ.
Ng et al. (2001, Mol. Ther., 3: 809-815) proponen un sistema de recombinación alternativo FLP/frt, en el que la propagación del adenovirus de alta capacidad se lleva a cabo en células 293 capaces de expresar la recombinasa FLP de levaduras (línea 293FLP y 293CreFLP) y en el que la señal ψ del virus helper está flanqueada por sitios frt reconocidos específicamente por dicha recombinasa FLP. La eficiencia de amplificación del virus gutless (108 bfu/ml en el pase 3), así como los niveles de contaminación de virus helper (0.5% previa purificación en gradiente CsCl), son muy similares a los obtenidos con el sistema Cre-loxP anterior.
Para tratar de mejorar estos sistemas, Palmer y Ng (2003, Mol. Ther., 8: 846-852) han desarrollado un sistema derivado del sistema Cre-loxP, donde se ha incluido la inversión de la señal de empaquetamiento del virus helper.
Por otra parte, Sargent et al. (2004, Gene Ther. , 11 : 504-511) han propuesto un sistema de restricción por tamaño, en el que se utiliza un virus helper de más de 35 kb y delecionado en el gen de la proteína IX, así como una línea celular 293 capaz de complementar dicha deleción.
Sin embargo, a pesar de las mejoras, hasta el momento ninguno de estos sistemas ha conseguido evitar las recombinaciones entre las secuencias de los dos virus incluidos en el proceso de producción y, por consiguiente, la contaminación de la muestra con adenovirus replicativos. En una reciente revisión Alba et al. (2005, Gene Ther., 12 Supp l 1 : S 1 8-27) recogen que los niveles de contaminación pueden oscilar, dependiendo del sistema utilizado, entre un 0.02% y un 1% respecto al número de partículas virales de adenovirus de alta capacidad producidas. Estos niveles de contaminación se consideran demasiado altos para su posible utilización en procedimiento clínicos de terapia génica.
Adicionalmente, otra limitación importante para el uso clínico de los adenovirus de alta capacidad está relacionada con la dificultad para producirlos a gran escala. Actualmente este tipo de producción es compleja, presenta una eficiencia baja y requiere de numerosos ciclos sucesivos de co-infección con el virus helper. Por todo ello es necesario perfeccionar los procedimientos, desarrollando también sistemas alternativos, para producir vectores adenovirales de alta capacidad en las cantidades y con la calidad (libres de partículas virales contaminantes) requeridas para su uso clínico.
La solución ideal a este problema sería el desarrollo de una línea celular específica para la producción a gran escala de vectores adenovirales de alta capacidad. Sin embargo, los sistemas de producción independientes de la participación de un virus helper, plantean el problema de la citotoxicidad derivada de altos niveles de expresión de los genes adenovirales lo cual, hasta el momento, ha limitado enormemente el desarrollo de este tipo de sistemas de producción. A esto hay que sumarle el hecho de que resulta extremadamente complicado reproducir la secuencia correcta de los eventos necesarios para coordinar la replicación del ADN con la expresión de las proteínas estructurales que permitan la producción masiva de partículas virales durante la fase tardía de la infección (Farley, et al, 2004, J. Virol, 78: 1782-1791).
WO0072887 describe un sistema de producción de adenovirus de alta capacidad independiente de adenovirus helper basado en un sistema binario formado por (i) una línea celular empaquetadora que comprende de forma estable un episoma circular en un número reducido de copias y basado en elementos replicativos del virus de Epstein-Barr (EBV) junto con un genoma adenoviral delecionado en las regiones El, E3, E4 y en los genes pTP y DBP, y (ii) un vector que comprende los elementos necesarios para la replicación y empaquetamiento del genoma adenoviral y que están ausentes en el episoma (región E4, gen pTP y DBP) así como el gen heterólogo. En este sistema el episoma no se empaqueta en viriones puesto que (i) carece de la señal de empaquetamiento y (ii) su tamaño supera la capacidad de empaquetamiento de los adenovirus.
Por otra parte, WO0042208 describe un sistema de producción de adenovirus independiente de virus helper que comprende (i) un vector adenoviral delecionado en las regiones El, E3 y el gen codifica la proteína de la fibra (L5), la cual está implicada en el proceso de ensamblaje de los viriones, y (ii) una línea celular específica capaz de complementar la replicación y el empaquetamiento de dicho vector. Todos los genes necesarios para los procesos de replicación y empaquetamiento de las partículas virales están incluidos dentro de la secuencia del vector adenoviral.
Por último, recientemente el sistema descrito por Catalucci et al. (2005, J. Virol, 79: 6400-6409) plantea la utilización de un plásmido episomal compuesto por el origen de replicación del virus Epstein-Barr, lo que permite su mantenimiento en el núcleo de una línea celular 293 modificada para la expresión estable del antígeno nuclear EBNAl (293EBNA). Este episoma incluye las secuencias ITR del Adeno virus serotipo 5, los genes de la región temprana (E2) y la ORF6 incluida en la región E4 del genoma adenoviral. La transcripción de estos genes adenovirales se encuentran bajo el control de un promotor inducible mientras que el resto de los genes necesarios para la formación de la cápside están incluidos dentro de la secuencia del adenovirus de alta capacidad.
En general, todos estos sistemas de producción de vectores adenovirales independientes de helper se encuentran limitados por el tamaño de la secuencia de ADN a insertar en el vector, ya que en todos ellos el vector adenoviral incluye uno o más genes adenovirales necesarios para los procesos de replicación o empaquetamiento de dicho vector. A esto hay que sumarle el hecho de que la presencia de estos genes adenovirales conlleva el riesgo de posibles efectos inmunogénicos a la hora de su aplicación en clínica.
Por todo ello, se establece la existencia de una necesidad en la técnica de obtener sistemas de producción de adenovirus de alta capacidad que no requieran el uso de vectores adenovirales auxiliares y que superen los inconvenientes de los sistemas independientes de estos vectores auxiliares conocidos hasta la fecha.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido (primer polinucleótido de la invención) o un vector de expresión que comprende: (a) un primer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
(b) un segundo cásete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional co dificado por el polinucleótido definido en (a).
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido (segundo polinucleótido de la invención) o vector de expresión que comprende:
(a) un primer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
(b) un segundo cásete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) y
(c) un tercer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína adenoviral seleccionada ElA o las proteínas adenovirales ElA y ElB, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido (tercer polinucleótido de la invención) o vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que comprende el genoma de un adenovirus recombinante que carece de, al menos, la secuencia ψ de empaquetamiento y la secuencia que codifica la proteína E lA o El A/E IB, en donde dicha secuencia que comprende el genoma de un adenovirus recombinante se encuentra flanqueada por secuencias de reconocimiento específico para una endonucleasa de restricción.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende uno o varios polinucleótidos o vectores de expresión de la invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de células adecuadas para la producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un adeno virus de alta capacidad que comprende (i) transfectar una célula con un primer polinucleótido o con un vector que comprende dicho polinucleótido, o con un segundo polinucleótido o con un vector que comprende dicho polinucleótido y (ii) transfectar dicha célula con un tercer polinucleótido o con un vector que comprende dicho polinucleótido en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea y en donde si las células se transfectan en la etapa (i) con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, entonces se utilizan células que comprenden la secuencia que codifica la proteína adeno viral ElA y, opcionalmente, la proteína adeno viral ElB.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula obtenible por un método de acuerdo a la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un sistema para la producción de adenovirus de alta capacidad que comprende
(a) una célula de acuerdo a la invención y
(b) un adenovirus de alta capacidad.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de vectores adeno virales de alta capacidad, que comprende las etapas de:
(a) transfectar o infectar una célula hospedadora con un polinucleótido que comprende el genoma del adenovirus de alta capacidad que se desea producir o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido, (b) cultivar las células transfectadas/infectadas en condiciones que permitan la replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad, (c) recuperar las partículas virales del adenovirus de alta capacidad y, opcionalmente,
(d) repetir las etapas (a) a (c) en donde las partículas virales de alta capacidad obtenidas en la etapa (c) se utilizan para infección en la etapa (a) del siguiente ciclo, en donde la célula hospedadora usada en la etapa (a) se selecciona del grupo de
(i) una célula que comprende el primer polinucleótido de la invención y la secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un tercer polinucleótido y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(ii) una célula que comprende el segundo polinucleótido de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el tercer polinucleótido de la invención y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(iii) una célula que comprende un el tercer polinucleótido de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un primer polinucleótido y en donde la célula comprende una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB,
(iv) una célula que comprende el tercer polinucleótido de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el segundo polinucleótido de la invención y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(v) una célula que comprende el primer polinucleótido de la invención, el tercer polinucleótido de la invención y una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB, y (vi) una célula que comprende el segundo polinucleótido de la invención y el tercer polinucleótido de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. A. Representación esquemática del plásmido pGal4-2RU-El-SceI que comprende un polinucleótido A2 según la invención. A1: secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional, en este caso GAL4-hPR-p65. An: secuencia nucleotídica que codifica las proteínas adeno virales E 1A/E1B. Am: secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, en este caso I-Scel de Sacharomyces cerevisiae. rPπ y rPm: promotores regulables por el regulador transcripcional, GAL4-hPR-p65, que dirigen la transcripción y expresión de las proteínas El A/E IB y de la endonucleasa I-Scel respectivamente. En esta realización cada región promotora comprende una secuencia de la caja TATA del gen EIb (PEUO adeno viral, asociada a secuencias UAS (upstream activating sequences) de GAL4, y donde ambos promotores comparten las mismas secuencias de unión UAS. En este caso la región promotora que dirige la transcripción y expresión del regulador transcripcional GAL4-hPR-p65 comprende un promotor mínimo de la timidina quinasa (Ptk) también asociado a secuencias UAS {upstream activating sequences) de GAL4. Cada una de las 3 unidades transcripcionales (GAL4-hPR-p65, E1A/E1B y I-Scel) se completa con una señal de poliadenilación (pA). pUCori: origen de replicación del plásmido pGeneV5- HisA utilizado como base para la construcción del plásmido pGal4-2RU-El-SceI. Amp: gen de resistencia a ampicilina para la selección de clones resistentes en bacterias. Zeo: gen de resistencia al antibiótico Zeocina para la selección de clones resistentes en células eucariotas. SV40: promotor SV40 que dirige la expresión del gen de resistencia Zeor. B. Representación esquemática del plásmido pRc/Ad2 que comprende un polinucleótido B según la invención. B1: secuencia nucleotídica que codifica el genoma del adeno virus, en este caso serotipo 5, a excepción de la región que codifica las proteínas El A/E IB y la señal de empaquetamiento (ψ). La secuencia nucleotídica está delimitada por las secuencias ITR (inverted terminal repeats). Bn: Secuencias dianas específicas para una endonucleasa de restricción, en este caso I-Scel. Bin: secuencia nucleotídica attB que facilita la integración del plásmido en el genoma de la célula eucariota. Este proceso está mediado por la recombinasa específica y unidireccional PhiC31. colEl : origen de replicación del plásmido pRC/RSV utilizado como base para la construcción del plásmido pRcAd2. Amp: gen de resistencia a ampicilina para la selección de clones resistentes en bacterias; Neo: gen de resistencia al antibiótico Neomicina para la selección de clones resistentes en células eucariotas; SV40: promotor SV40 que dirige la expresión del gen de resistencia Neor. pA: señal de poliadenilación.
Figura 2: Sistema comercial GeneSwitchΥM (Invitrogen) para el control transcripcional de la expresión génica inducida por mifepristona. A. Plásmido pSwitch de expresión de la proteína de fusión compuesta por el dominio de unión a ADN (GAL4-DBD) de la proteína GAL4 de levadura, el dominio de unión a ligando del receptor de progesterona humano (hPR-LBD) y el dominio de activación de la proteína NF-κB humana (p65- AD). La expresión del activador transcripcional GAL4-hPR-p65 está bajo el control del promotor mínimo de la timidina quinasa (Ptk). La unión de la forma activa de la proteína a las secuencias GAL4-UAS asociadas al promotor regula su propia expresión. B. Plásmido pGeneV5-HisA diseñado para el clonaje del gen de interés. La expresión del gen clonado queda bajo el control del promotor constituido por la caja TATA de EIb (PEib) y las secuencias de unión al activador transcripcional (GAL4-UAS). C. Mecanismo de activación del sistema GeneSwitch™ . La presencia del inductor provoca un cambio conformacional de la proteína de fusión que actúa como activador transcripcional y que es expresada de forma constitutiva por el plásmido pSwitch. Este cambio conformacional consiste en la dimerización de la molécula que pasa de un estado inactivo a su forma activa. El homodímero tiene capacidad de unirse a secuencias específicas (GAL4-UAS) localizadas en la región promotora del gen de interés activando su expresión (plásmido pGeneV5-HisA) y en la región promotora que controla la propia expresión del regulador transcripcional (plásmido pSwitch) iniciando en este caso una reacción de retroalimentación positiva.
Figura 3. Esquema de los sistemas de regulación diseñados para el control transcripcional de los genes EIa, EIb y I-Scel a partir del sistema GeneSwitch™. Las construcciones pGene-El-Scel y p2RU-El-SceI requieren la presencia del plásmido pSwitch para la expresión del regulador transcripcional GAL4-hPR-p65. Por su parte las construcciones pRU-El-Scel y pGal4-2RU-SceI-El incluyen, en una única construcción, los genes de la región El (EIa, EIb), el gen I-Scel y el gen que codifica la proteína de fusión reguladora con su región promotora específica. Todos los genes se encuentran bajo el control de promotores (flechas blancas) con secuencias de unión al activador transcripcional (UAS). Cada una de las unidades transcripcionales se completa con una señal de poliadenilación (pA).
Figura 4: Integración específica de ADN exógeno mediada por la integrasa PhiC31 del fago de Streptomyces. En las células de mamífero esta integrasa se utiliza para promover la recombinación entre la secuencia attB insertada en el vector con el gen de interés y una secuencia pseudo-α^P presente en el cromosoma de la célula. Como resultado se pierden las secuencias de recombinación originales y el vector integrado queda flanqueado por las regiones attR y attL.
Figura 5. Proceso de recombinación entre secuencias homologas del genoma del Adeno virus serotipo 5, purificado a partir del plásmido pTG3602 mediante digestión con Pací (P), y la construcción pRC/A6-A7, linealizada con Xbal (X). Los números indican la posición dentro del genoma adeno viral de cada una de las regiones homologas. Dentro del plásmido pRC/A6-A7 la secuencia adenoviral se encuentra flanqueada por secuencias diana para la endonucleasa de restricción I-Scel (S), mientras que en el extremo 5 ' se ha insertado una secuencia attB para la integración del plásmido en el genoma de la célula de mamífero. El plásmido pRcAd2 resultante del proceso de recombinación incluye el genoma adenoviral delecionado entre las posiciones 190 y 3528, región correspondiente a la secuencia codificante de EIa y EIb. ITR: Secuencias terminales de repetición invertidas (inverted terminal repeats). colE l : origen de replicación del plásmido pRC/RSV utilizado como base para la construcción del plásmido pRcAd2. Amp: gen de resistencia a ampicilina para la selección de clones resistentes en bacterias. Neo: gen de resistencia al antibiótico Neomicina utilizado en la selección de clones resistentes en células eucariotas. SV40: promotor SV40. pA: señal de poliadenilación.
Figura 6. A. Integración estable del plásmido pRcAd2 en la línea celular eucariota mediada por la recombinasa PhiC31. El inserto queda flanqueado por las secuencias attL y attR, producto de la recombinación entre la región attB del plásmido y la secuencia pseudo-attP del genoma celular. S: diana para la endonucleasa I-Scel; Zeo: gen de resistencia a Zeomicina. B. Detección por Nested-PCR de los genes adenovirales Illa, IV, la proteasa (Pr) y el gen que codifica la polimerasa viral (PoI) a partir del ADN genómico purificado del clon estable pRc-1. El resultado de la electroforesis corresponde al análisis de las reacciones de amplificación con los cebadores internos diseñados específicamente para cada gen. El clon pRc-1 también se ensayó por PCR para la detección de la secuencia attB. El resultado negativo de dicha amplificación confirma la integración específica mediada por la recombinasa PhiC31. (-): control negativo de PCR; (+) control positivo de PCR; M: marcador de peso molecular (1 Kb Plus DNA Ladder; Invitrogen).
Figura 7: RT-PCR de los genes adenovirales IVa2, III y la ORF de 34 Kd de la región E4. El cADN se obtuvo a partir de muestras de RNA total extraído de células incubadas en ausencia (1) y presencia (2) del inductor RU486. (+): control positivo de PCR. M: marcador de peso molecular (1 Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen).
Figura 8: Detección del gen que codifica el regulador transcripcional GAL4, la endonucleasa de restricción I-Scel y los genes de la región El del adenovirus (EIa y EIb) mediante amplificación por PCR a partir del ADN genómico del clon estable GaI- 13. (-): control negativo de PCR; (+): control positivo de PCR; M: marcador de peso molecular (1 Kb Plus DNA Ladder, Invitrogen).
Figura 9: Ensayo de Western Blot para la detección de la proteína ElA (A) y la endonucleasa I-Scel (B). Los extractos de proteínas se recogieron a partir de células incubadas en ausencia (-) y presencia (+) del inductor RU486. Como control positivo de la proteína ElA se ensayó la línea celular 293S. GADPH: Control positivo del ensayo de Western Blot.
Figura 10: Detección por Nested-PCR de los genes adenovirales Illa, IV, la proteasa
(Pr) y el gen que codifica la polimerasa viral (PoI) a partir del ADN genómico purificado de los clones estables GAd-I y GAd-6. El resultado de la electroforesis corresponde al análisis de las reacciones de amplificación con los cebadores internos diseñados específicamente para cada gen. (-): control negativo de PCR; (+) control positivo de PCR; M: marcador de peso molecular (1 Kb Plus DNA Ladder; Invitrogen).
Figura 11: Producción de adeno virus gutless KCZ a Pase 0 utilizando como línea empaquetadora el clon estable pRc-1. Los extractos se recogieron a las 48, 72, 96 y 120 horas, post-transfección, y se titularon en la línea celular 293 S. Los niveles de virus obtenidos son la media de tres experimentos independientes y se expresan en unidades infectivas (UI)/ml.
Figura 12: Producción de adeno virus gutless KCZ a Pase 0 utilizando como línea empaquetadora los clones estables GAd-I y GAd-6. Los extractos de virus se recogieron a las 48, 72, 96 y 120 horas, post-transfección, y se titularon en la línea 293 S. Los niveles de virus obtenidos son la media de tres experimentos independientes y se expresan en unidades infectivas (UI)/ml.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han diseñado un nuevo sistema de producción y empaquetamiento (encapsidación) para vectores adenovirales de alta capacidad que no requiere de la utilización de virus helper y que se caracteriza porque integra los genes adenovirales necesarios para el control, replicación y empaquetamiento de las partículas virales dentro del genoma de una célula hospedadora, lo cual mejora la estabilidad del sistema de producción a largo plazo. Asimismo el vector adeno viral de alta capacidad utilizado tan sólo incluye las secuencias necesarias para la replicación y empaquetamiento de los viriones (secuencias ITR y señal ψ) de modo que la capacidad de clonaje del vector es superior a la mostrada en otros sistemas de producción independientes de virus helper u otros vectores auxiliares. Por último, la ausencia de estos genes adenovirales en el vector de alta capacidad elimina el riesgo de cualquier respuesta inmune contra el vector durante su aplicación en clínica.
Primer polinucleótido de la invención (polinucleótido Al) En un primer aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido (en adelante polinucleótido Al de la invención) o un vector de expresión que comprende:
(a) un primer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional; (b) un segundo cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional codificado por el polinucleótido definido en (a).
Por "regulador transcripcional" o "transactivador" se entiende indistintamente, en el contexto de la presente invención, una proteína que es capaz de activar la transcripción de un determinado gen mediante su unión a regiones específicas de reconocimiento para dicha proteína en la región no codificante de dicho gen. En una forma de realización particular, el transactivador o regulador transcripcional es un regulador transcripcional regulable. Por "regulador transcripcional regulable" se entiende, en el contexto de la presente invención, un regulador transcripcional cuya actividad puede ser modulada por medio de factores adicionales que pueden ser aportados o eliminados en función de la necesidad de promover transcripción de los genes que comprenden sitios de unión específicos para tales reguladores. El experto en la materia apreciará que la invención contempla cualquier método para regular la expresión del regulador transcripcional siempre que permita la expresión de forma regulada y con un mínimo de transcripción basal regulada. Así, es posible regular la expresión del activador transcripcional mediante el uso de promotores inducibles que responden a un agente inductor, que muestran una expresión basal nula o despreciable en ausencia de agente inductor y que son capaces de promover la activación del gen localizado en posición 3 '. En función del tipo de agente inductor, los promotores inducibles se clasifican en promotores Tet on/off (Gossen y Bujard, 1992, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 89:5547-5551; Gossen et al., 1995, Science 268:1766-1769; Rossi y Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:451- 456); promotores Pip on/off (US6287813); promotores dependientes de antiprogestin (US2004132086), promotores dependientes de ecdisona (Christopherson et al, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; No et al, 1996, Proc. Nati. Acad. Sic. USA, 93:3346-3351, Suhr et al, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 95:7999-8004; y WO9738117), un promotor dependiente de metalotioneina (WO8604920) y promotores dependientes de rapamicina (Rivera et al., 1996, Nat. Med. 2:1028-32).
Alternativamente, la invención contempla el uso de reguladores transcripcionales cuya inducción tiene lugar no mediante un aumento de los niveles de expresión sino mediante un agente inductor que provoca un aumento de la actividad transcripcional, normalmente, originada por una translocación del regulador del citoplasma al núcleo. En este tipo de reguladores transcripcionales suelen estar formados por un dominio de unión a ADN o DBD (DNA binding domaiή), un dominio de unión a un ligando o LBD (ligand binding domaiή), y un dominio de activación de la transcripción o AD (activating domaiή).
El dominio de unión de ADN puede ser cualquier dominio para el que exista un elemento de unión específico conocido, incluyendo dominios de unión a ADN sintéticos, quiméricos o análogos. Dominios de unión a ADN adecuados para la presente invención incluyen (i) homeodominios (Scott et al., 1989, Biochim. Biophys. Acta 989:25-48; Rosenfeld et al, 1991, Genes Dev. 5 :897-907) formados, por regla general, por una cadena de aproximadamente 61 amino ácidos que presenta una estructura secundaria compuesta por tres hélices alfa, (ii) dedos de zinc formados por dos a tres docenas de dedos de ADN de fórmula general CyS2HiS2 organizados en tándem (por ejemplo TFIIIA, Zif268, GIi, and SRE-ZBP) en donde cada módulo comprende una hélice alfa capaz de contactar con una región de ADN de 3 a 5 pares de bases siendo necesarios al menos 3 dedos de zinc para generar un sitio de unión a ADN de alta afinidad y al menos dos dedos de zinc para generar sitios de unión a ADN de baja afinidad, (iii) los dominios de unión a ADN denominados hélice-giro-hélice o HLH (helix-turn-helix) tales como MATl, MAT2, MATaI, Antennapedia, Ultrabithorax, Engrailed, Paired, Fushi tarazu, HOX, Unc86, Octl, Oct2 y Pit-1, (iv) dominios de unión a ADN del tipo cremalleras de leucina (leucine zipper) tales como GCN4, C/EBP, c-Fos/c-Jun y JunB. Ejemplos de dominios de unión a ADN adecuados en la presente invención incluyen el dominio de unión a ADN de GAL4, de LexA, de factores de transcripción, de receptores nucleares del grupo H, receptores nucleares de la superfamilia de las esteroides/hormonas tiroideas. El experto en la materia apreciará que la invención contempla el uso de dominios de unión a ADN híbridos formados por varios motivos de unión a ADN que pueden reconocer sitios de unión a ADN distintos a los de los elementos que los componen. Así, es posible el uso de dominios de unión de ADN formados por la unión de un dedo de zinc y un homeobox. En una forma preferida de realización, el dominio de unión a ADN es el procedente de la proteína GAL4 de S. cerevisiae.
Las secuencias de unión a ligando capaces de promover la localización nuclear de un activador transcripcional que los contienen, adecuadas para el uso en la presente invención, incluyen la secuencia de localización derivada de PPAR (receptores activados por activadores peroxisomales), que se translocan al núcleo en presencia de 15-desoxy-[Delta]-prostaglandina J2, receptores del ácido retinoico que se translocan al núcleo en presencia de los isómeros alfa, beta o gamma del ácido 9-cis-retinoico, receptores de farnesoid X, activables por ácido retinoico y TTNPB, receptores X hepáticos activables por 24-hidroxicolesterol, receptores de benzoato X, activables por 4-amino-butilbenzoato, receptor constitutivo de androstano, receptores de pregnano, inducibles por pregnolono-16-carbonitrilo, receptores de esteroides y xenobióticos, inducibles por rifampicina, receptores de progesterona, inducibles por medroxiprogesterona así como por agonistas y antagonistas de mifepristona y derivados de 19-nortestosterona, receptores de glucocorticoides actibables por glucocorticoides, receptores de hormonas tiroideas, activables por T3 y/o T4, y receptores de estrógenos, activables por estrógenos y sus derivados tales como el 17-betaestradiol y el estradiol, transactivadores tTA inducibles por tetraciclina/doxiciclina "tet-off ' (Gossen y Bujard, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551), transactivadores rtTA inducibles por tetraciclinas "tet-on" (Gossen et al., 1995, Science, 268: 1766-1769), transactivador inducible por muristerona A o ligandos análogos del receptor de la ecdisona (No et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351), transactivadores inducibles por el ligando RSLl, como el sistema RheoSwitch inicialmente descrito por Palli et al. (2003, Eur. J. Biochem., 270: 1308-1315), un transactivador inducible por rapamicina o análogos de la rapamicina (Ho et al., 1996, Nature, 382: 822-826; Amara et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 10618-10623), y un transactivador inducible por coumermicina/novobiocina, que actúan competitivamente como inductor y represor respectivamente (Zhao et al., 2003, Hum. Gene Ther., 14: 1619-1629). En una forma preferida de realización, el LBD es un dominio de unión a ligando del receptor de la progesterona humana que puede ser activado con antiprogestinas sintéticas incluyendo derivados de la progesterona tales como RU486 o mifepristona y que no muestran efecto alguno en pacientes tal y como ha sido descrito por Wang et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1994, 91 : 8180-4).
Por último, el dominio de activación transcripcional puede ser el dominio de activación de los receptores nucleares del grupo H, de los receptores nucleares de hormonas tiroideas o esteroideas, el dominio de activación de VP 16, de GAL4, de NF-κB, de B42, de BP64, o de p65. En una forma preferida de realización, el activador transcripcional es del derivado de la proteína NF-κB humana.
En una forma preferida de realización, el activador transcripcional es la proteína de fusión denominada GAL4-hPR-p65 que comprende el dominio de unión a ADN de GAL4 de Saccharomyces cerevisiae (Laughon y Gesteland, 1984, Mol. CeIl Biol., 4: 260-267; Marmorstein et al., 1992, Nature, 356: 408-414), el dominio de unión a ligando del receptor de progesterona humano (Kastner et al., 1990, Embo J, 9: 1603- 1614; Wang et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91 : 8180-8184) y el dominio de activación de la proteína NF-κB humana (Burcin et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96: 355-360; Deloukas y van Loon, 1993, Hum. Mol. Genet., 2: 1895-1900). Este regulador transcripcional es inducible por mifepristona o su análogo RU487. En ausencia de mifepristona, se expresa la proteína de fusión reguladora de forma constitutiva a partir del promotor mínimo de la timidina quinasa. Esta proteína se localiza predominantemente en el núcleo y en una forma inactiva. En el momento de la adición del inductor mifepristona, o su análogo RU486, éste se une con alta afinidad a la región hPR-LBD de GAL4-hPR-p65, provocando un cambio conformacional que resulta en la dimerización de la proteína y su conversión a la forma activa. Estos homodímeros son capaces de unirse a sitios específicos (UAS: upstream activating sequences) promoviendo la transcripción de genes localizados en orientación 3 ' con respecto a dichas secuencias de activación y activando así la transcripción del gen de interés y del gen que codifica el propio factor de transcripción (Fig. 2C).
El experto en la materia apreciará que este tipo de reguladores transcripcionales, cuya actividad se regula mediante la adición de compuestos exógenos que promueven la translocación de los reguladores al núcleo o su cambio conformacional a una forma activa, no requieren que su transcripción esté sujeta a un control transcripcional particularmente fino. De forma general, la secuencia que codifica el transactivador o regulador transcripcional está asociada a un promotor apropiado que dirige su transcripción y expresión, y también a una señal de poliadenilación. Dado que no es imprescindible controlar de forma exacta la transcripción de este tipo de reguladores, éstos pueden encontrarse bajo el control de un promotor mínimo constitutivo. Sin que esto suponga una limitación, el promotor mínimo puede ser, entre otros, un promotor constitutivo de virus, como CMV o RSV, o un promotor constitutivo de células eucariotas, como PGK o EFl. Alternativamente, es posible incluir en la región promotora del gen que codifica el regulador transcripcional un elemento de respuesta al propio regulador transcripcional, de forma que la expresión de éste provoque un aumento en la expresión de si mismo mediante un ciclo de retroalimentación positiva. En una forma de realización, el regulador transcripcional está regulado por una región formada por uno o varios elementos de unión al dominio de unión a ADN de GAL4, preferiblemente 4 elementos de unión al dominio de unión de ADN de GAL4, acoplados al promotor mínimo del gen timidina quinasa (Ptk) del Virus Herpes Simplex.
El segundo elemento del polinucleótido Al comprende un cásete de expresión que codifica una endonucleasa de restricción que se encuentra bajo control operativo del regulador transcripcional codificado en el primer cásete de expresión presente en el primer polinucleótido de la invención. La endonucleasa de restricción es un enzima que corta el ADN de doble cadena mediante reconocimiento y rotura en sitios específicos de dicho ADN. La endonucleasa a la que se refiere la invención es una endonucleasa que no reconoce sitios específicos en el genoma o ADN de células humanas y que, por tanto, no produce roturas en el genoma nativo de dichas células. Sin que esto suponga limitación alguna, la endonucleasa de restricción puede ser, entre otras, I-Scel, Pl-Scel, I-Ppol, I-Dmol o PI-TIiI. En una realización particular, la endonucleasa de restricción codificada por el polinucleótido Al es I-Scel de Saccharomyces cerevisiae. El polinucleótido que contiene la secuencia codificante de la endonucleasa de restricción se encuentra bajo control operativo de una secuencia de unión al regulador transcripcional codificado por el primer elemento del polinucleótido de la invención. De esta manera, el promotor responde a la unión con el trans activador activando o reprimiendo la transcripción y expresión de la endonucleasa. Sin embargo, la capacidad del transactivador para unirse e interactuar con el promotor se modifica dependiendo de si el factor de regulación está unido a un ligando o agente inductor. En consecuencia, es posible regular la transcripción del gen de interés mediante el control de la disponibilidad del agente inductor. En unos casos el agente inductor actúa activando y favoreciendo la transcripción y expresión del gen, mientras que en otros casos la presencia del agente inductor reprime su expresión. En la forma de realización preferida en la que el regulador transcripcional es GAL4-hPR-p65, el polinucleótido que codifica la endonucleasa de restricción se encuentra en posición 3 ' con respecto a un número variable de secuencias de unión al dominio de unión a ADN de GAL4. En una forma de realización aún más preferida, el gen que codifica la endonucleasa de restricción se encuentra en posición 3 ' con respecto a un elemento regulador compuesto por 6 secuencias de unión del factor de transcripción GAL4 y la secuencia de la Caja TATA del gen EIb (Pmb) de adenovirus (Lillie y Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
En una realización concreta del polinucleótido Al, el regulador transcripcional es GAL4-hPR-p65 y la endonucleasa de restricción es I-Scel.
Segundo polinucleótido de la invención (polinucleótido A2)
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido (en adelante el polinucleótido A2) o vector de expresión que comprende:
(a) un primer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
(b) un segundo cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) y (c) un tercer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína adenoviral seleccionada ElA o las proteínas adenovirales ElA y ElB, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a).
Los elementos (a) y (b) del polinucleótido A2 corresponden esencialmente a los que forman parte del primer polinucleótido de la invención y han sido descritos con detalle con anterioridad.
El componente (c) del polinucleótido A2 comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína adenoviral seleccionada ElA o las proteínas adenovirales ElA y ElB. Los genes ElA y, opcionalmente, ElB pueden proceder del genoma de adenovirus de cualquier variedad o serotipo adenoviral humano (que haya sido aislado en humanos), por ejemplo los serotipos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 11 (AdI 1) ó 3 (Ad3). En una realización concreta, dicho componente incluye la secuencia delimitada entre las posiciones 505 y 3511 del genoma del adenovirus serotipo 5 (GenBank: AC000008). Esta secuencia se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a). De esta manera, el promotor responde a la unión con el transactivador activando o reprimiendo la transcripción y expresando los genes estructurales ElA y ElB. Sin embargo, la capacidad del transactivador para unirse e interactuar con el promotor se modifica dependiendo de si el factor de regulación está unido a un ligando o agente inductor. En consecuencia, es posible regular la transcripción de los genes ElA y, opcionalmente, ElB mediante el control de la disponibilidad del agente inductor. En una forma de realización preferida, el componente (c) del polinucleótido A2 de la invención se encuentra bajo control de un promotor híbrido compuesto por 6 secuencias de unión al factor de transcripción GAL4 y la secuencia de la caja TATA del gen EIb (PE1I3) de adenovirus (Lillie y Green, 1989, Nature, 338: 39-44). El experto en la materia apreciará que la orientación de los genes en el polinucleótido A2 que responden al activador transcripcional no es esencial para el funcionamiento del mismo. Así, en una forma preferida de realización, el segundo y tercer cásete se transcriben en sentido contrario. En otra forma preferida de realización, las secuencias reguladoras de la transcripción que controlan el segundo y tercer cásete comparten el mismo sitio de unión para el regulador transcripcional (a). En una forma preferida de realización, los genes que codifican la endonucleasa de restricción y las proteínas adenovirales se encuentran bajo el control de un mismo promotor híbrido compuesto por 6 secuencias de unión al factor de transcripción GAL4 y la secuencia de la caja TATA del gen EIb (Pmb) de adenovirus (Lillie y Green, 1989, Nature, 338: 39-44). En una forma de realización aún más preferida, el segundo y tercer cásete del polinucleótido A2 de la invención se transcriben en dirección opuesta y comparten las secuencias de unión al dominio de unión de ADN del factor de transcripción GAL4.
En una realización concreta del polinucleótido A2, el primer cásete de expresión (a) comprende la secuencia que codifica el regulador transcripcional GAL4-hPR-p65, el segundo cásete de expresión (b) comprende la secuencia que codifica la endonucleasa de restricción I-Scel bajo el control de uno o varios sitios de unión de la proteína GAL4 y el tercer cásete de expresión (c) comprende las secuencias de los genes ElA y ElB bajo el control de uno o varios sitios de unión de la proteína GAL4. En una forma de realización aún más preferida, los promotores regulables que dirigen la expresión de la secuencia que codifica la endonucleasa de restricción I-Scel y de las secuencias de los genes ElA y ElB comparten los mismos elementos de respuesta para GAL4-hPR-p65.
Tercer polinucleótido de la invención (polinucleótido B)
En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido (en adelante el polinucleótido B) o vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que comprende el genoma de un adenovirus recombinante y que carece de, al menos, la secuencia ψ de empaquetamiento y la secuencia que codifica la proteína E lA o E1A/E1B, en donde dicha secuencia que comprende el genoma de un adenovirus recombinante se encuentra flanqueada por secuencias de reconocimiento específico para una endonucleasa de restricción. La secuencia del genoma adenoviral puede obtenerse a partir de un genoma de un adenovirus de cualquier variedad o serotipo adenoviral humano (que haya sido aislado en humanos), por ejemplo los serotipos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 11 (AdI l) ó 3 (Ad3).
Preferiblemente, las secuencias de reconocimiento de la endonucleasa de restricción se encuentran flanqueando el genoma adenoviral en posición 5 ' y 3 ' respecto a las secuencias ITR de los extremos, donde se encuentran las regiones adecuadas para la replicación y transcripción de dicho genoma. El experto en la materia apreciará que las dianas de restricción utilizadas en el polinucleótido B dependerán de la endonucleasa de restricción codificada en los polinucleótidos Al y A2 de la invención. Así, las secuencias diana que flanquean el genoma adenoviral son secuencias de reconocimiento específico para una endonucleasa de restricción con las mismas características y requerimientos indicados anteriormente al describir la endonucleasa codificada por los polinucleótidos AI y A2. Sin que esto suponga limitación alguna, las secuencias pueden ser específicas para su reconocimiento, entre otras, por la endonucleasa I-Scel, Pl-Scel, I-Ppol, I-Dmol o PI-TIiI. En una realización particular, son específicas para reconocimiento por la endonucleasa I-Scel.
Adicionalmente, en otra forma preferida de realización, el polinucleótido B de acuerdo a la invención comprende secuencias que facilitan la inserción de dicho polinucleótido en el genoma de la célula empaquetadora. En una forma aún más preferida de realización, dicha secuencias favorecedoras de la integración en el genoma son secuencias de reconocimiento específico para una integrasa. Preferiblemente, la secuencia diana de la integrasa se encuentra en posición 5 ' respecto de la primera secuencia de reconocimiento para la endonucleasa.
Secuencias diana de integrasas adecuadas para la realización de la invención incluyen, sin limitación, la secuencia diana de la recombinasa Cre del fago P l (LoxP), la secuencia diana de la recombinasa FLP de S. cerevisiae (Frt), la secuencia diana de la integrasa del fago de Streptomyces ΦC31 (attB, attP), la secuencia diana de la recombinasa TP901-1, y la secuencia diana de la recombinasa R4, o la secuencia diana de la integrasa lambda. En una forma preferida de realización, las secuencias diana de la invención incluyen secuencias específicas para una integrasa de fagos que media la recombinación unidireccional entre dos sitios o secuencias específicas del ADN. Más particularmente, la integrasa pertenece a la familia de integrasas de la serina, que se caracterizan porque para la rotura de la cadena de ADN utilizan un residuo de serina catalítico (Thorpe y Smith, 1998, Proc. Nati. Acad. ScL USA, 95: 5505-5510). Los sitios de recombinación reconocidos por estas integrasas (attB y attP) presentan secuencias diferentes y son de menor longitud que las secuencias de recombinación reconocidas por otras recombinasas. La integración mediada por este tipo de integrasas es un proceso unidireccional y estrictamente controlado por las secuencias de recombinación (Thorpe et al, 2000, Mol. Microbiol, 38: 232-241). Otra característica importante es que la recombinación entre attP y attB en el huésped, no requiere de otros cofactores para operar. Estas integrasas se utilizan actualmente en procedimientos de manipulación génica en células de mamíferos y se ha comprobado que pueden mediar la integración eficiente de material genético en sitios attP introducidos exógenamente o en secuencias nativas que tienen una identidad parcial con dichos sitios attP (pseudo-attP). Sin que esto suponga limitación alguna, la secuencia diana de integrasa puede ser una secuencia de reconocimiento específico para la integrasa PhiC31, TP901-1 o R4, entre otras. En una realización particular, la secuencia diana de integrasa es attB, correspondiente al sitio de anclaje en el ADN de bacterias específico para la integrasa del fago PhiC31. Esta integrasa puede mediar la recombinación unidireccional entre esta secuencia attB y secuencias pseudo-attP localizadas en el genoma de células humanas.
Así, en otra forma preferida de realización, el polinucleótido B incluye, en dirección 5 ' a 3 ' : opcionalmente, la secuencia de reconocimiento para la integrasa; la primera secuencia de reconocimiento para la endonucleasa; el genoma del adenovirus (cuyos límites están definidos por los ITR del propio adenovirus); y la segunda secuencia para la endonucleasa de restricción.
Vectores y células hospedadoras de la invención y métodos para su obtención Los polinucleótidos de la invención pueden encontrarse aislados o formando parte de vectores que permitan la propagación de dichos polinucleótidos en células huésped adecuadas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende el polinucleótido Al, A2 o B de la invención.
Vectores adecuados para la inserción de los polinucleótidos de la invención incluyen vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, pUC 19, Bluescript y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl , pCRl , RP4, fagos y vectores "shuttle" tales como pSA3 and pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 mieras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas superiores bien basados en vectores virales (adeno virus, virus asociados a los adeno virus, así como retrovirus y, en particular, lentivirus) así como vectores no virales tales como pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1 , pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL and pKSV-10, pBPV-1 , pML2d y pTDTl. Vectores particularmente apropiados para la inserción de dichos polinucleótidos son vectores de expresión en células eucariotas superiores, bien basados en vectores virales (tales como virus adenoasociados, retrovirus, lentivirus, herpesvirus, SV40 y alfavirus) o también basados en vectores no virales (tales como plásmidos), capaces de ser mantenidos y/o replicados y/o expresados en la célula hospedadora. En una realización más particular dicho vector de expresión es adecuado para transfectar o infectar células de mamífero ex vivo, particularmente células humanas.
Típicamente, los vectores de expresión eucariota incluyen, por ejemplo, uno o más genes clonados y bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras localizadas en 5 ' y 3 ', así como un marcador de selección. Sin que ello suponga una limitación, dentro de las secuencias de control se incluye un promotor (incluyendo el sitio de inicio de la transcripción) capaz de expresarse en células eucariotas, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento de RNA, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.
Preferiblemente los vectores comprenden algún gen reportero o de selección que confiere un fenotipo a la célula que lo expresa y que facilita la identificación y/o selección de aquellas células que han incorporado el vector tras haber sido puestas en contacto con éste. Es preferente que el fenotipo de selección no sea expresado en la célula eucariota previa a su transfección o infección. Genes reporteros útiles en el contexto de la presente invención incluyen lacZ, luciferasa, timidina quinasa, GFP y similares. Genes de selección útiles en el contexto de la presente invención incluyen por ejemplo el gen de resistencia a la neomicina, que confiere resistencia al aminoglucósido G418, el gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina, el gen ODC, que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa (2- (difluorometil)-DL-ornitina: DFMO), el gen de la dihidrofolato reductasa que confiere resistencia a metrotexato, el gen de la puromicina-N-acetil transferasa, que confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que confiere resistencia a 9-beta-D-xilofuranosil adenina, el gen de la citosina deaminasa, que permite a las células crecer en presencia de N- (fosfonacetil)-L-aspartato, el gen de la timidina quinasa, que permite a las células crecer en presencia de aminopterina, el gen de Xantina-guanina fosforribosiltransferasa, que permite a las células crecer en presencia de xantina y ausencia de guanina, el gen trpB de E. coli que permite a las células crecer en presencia de indol en lugar de triptófano, el gen hisD de E. coli, que permite a las células usar el histidinol en lugar de histidina. El gen de selección se incorpora en un plásmido que puede incluir, adicionalmente, un promotor adecuado para la expresión de dicho gen en células eucariotas (por ejemplo, los promotores CMV o SV40), un sitio optimizado de iniciación de la traducción (por ejemplo un sitio que sigue las denominadas reglas de Kozak o un IRES), un sitio de poliadenilación como, por ejemplo, el sitio de poliadenilación del SV40 o de la fosfoglicerato quinasa, o intrones como, por ejemplo, el intrón del gen de la beta- globulina. Alternativamente es posible usar una combinación de gen reportero y gen de selección simultáneamente en el mismo vector. Los polinucleótidos de la invención y los vectores de expresión que los contienen puede obtenerse por técnicas convencionales de biología molecular e ingeniería genética conocidas por cualquier persona del oficio, y que aparecen recogidas en compendios y manuales tales como "Molecular Cloning: a Laboratory manual", de J. Sambrook y D. W. Russel, Eds., Publisher: CoId Spring Harbor Laboratory Press, tercera edición, 2001 (ISBN 978-0879695774). Existen igualmente sistemas comerciales que pueden facilitar la construcción de vectores de expresión para los polinucleótidos de la invención. Así por ejemplo, la construcción de un vector de expresión para células de mamíferos que incluya el polinucleótido A se vería facilitada si se utilizan sistemas como el sistema de expresión inducible GeneSwitch™ (Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos. Kl 060-01 y Kl 060-2), que permite la construcción de un vector para la expresión de un gen de interés de manera inducible por mifepristona; el sistema de expresión inducible RheoSwitch™ (New England Biolabs, Beverly, MA01915-5599 USA), que permite la expresión de un gen de interés de manera inducible por el ligando RLSl; o cualquier otro sistema comercial equivalente.
Los polinucleótidos y vectores de la invención pueden encontrarse formando parte de células hospedadoras que sirven tanto como vehículo de propagación de los vectores como de células empaquetadoras para la producción de adeno virus recombinantes. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende un polinucleótido Al, A2 o B de la invención o un vector de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos anteriormente citados. En el caso de que las células se utilicen como células empaquetadoras para la producción de adenovirus, éstas han de ser capaces de soportar la producción e infección de adenovirus. Según esta realización, será una célula eucariota adecuada cualquier célula permisiva para la infección y replicación de adenovirus.
En una forma preferida de realización, la línea celular será una línea celular estable. Sin que esto suponga limitación alguna, las células hospedadoras pueden ser células HeLa, A549, KB, HuH7, o cualquier otra célula eucariota capaz de soportar el ciclo de vida del adenovirus. En el caso de que los polipéptidos ElA o El A/E IB sean aportados por la propia célula (en los casos en los que se utilizan el polinucleótido Al de la invención), su expresión puede estar bajo el control de un promotor regulable a través de un agente inductor, para un mayor control del inicio de la expresión de los genes adenovirales incluidos en el polinucleótido B y así limitar al máximo el riesgo de los posibles efectos citotóxicos derivados del exceso de expresión proteínas virales. En este caso no será adecuada una célula que exprese dichas proteínas de modo constitutivo, por ejemplo una célula 293 o PerC6.
En una realización particular, la célula hospedadora es originaria de mamífero, preferentemente de primate y especialmente de humano. En una forma preferida de realización, la línea celular es una línea de carcinoma de pulmón. En una forma de realización aún más preferida, las células hospedadoras son células de la línea A549. Esta línea celular iniciada por Giard et al. (1973, J. Nati. Cáncer Inst., 51 : 1417-1423) y posteriormente caracterizada en profundidad por Lieber et al. (1976, Int. J. Cáncer., 17: 62-70), presenta una gran sensibilidad a la infección por adenovirus lo que le confiere un elevado potencial como línea de producción de virus (Smith et al., 1986, J. Clin. Microbiol, 24: 265-268).
En una forma preferida de realización, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende el polinucleótido Al de la invención o un vector que comprende dicho polinucleótido. En una forma de realización aún más preferida, la célula comprende, adicionalmente una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElB.
En otra forma preferida de realización, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende el polinucleótido A2 de la invención o un vector que comprende dicho polinucleótido.
En otra forma de realización, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende el polinucleótido B de la invención o un vector que comprende dicho polinucleótido. En otra forma de realización, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende el polinucleótido Al y el polinucleótido B de la invención. En una forma de realización aún más preferida, dicha célula comprende, adicionalmente una secuencia que codifica la pro teína adeno viral ElA y, opcionalmente, una secuencia que codifica la proteína adeno viral ElB.
En otra forma de realización, la invención se relaciona con una célula hospedadora que comprende el polinucleótido A2 y el polinucleótido B de la invención.
Tanto las células que comprenden los polinucleótidos Al y B de la invención como las células que comprenden los polinucleótidos A2 y B son particularmente adecuados para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad por lo que tanto las células que comprenden los polinucleótidos Al y B de la invención como las células que comprenden los polinucleótidos A2 y B pueden usarse en procedimientos y sistemas para la producción y empaquetamiento de dichos vectores. Sin embargo, particularmente útiles para la producción de adenovirus son aquellas en las que los sitios diana que flanquean el genoma adenoviral defectivo en el polinucleótido B se corresponden con la endonucleasa de restricción codificada por los polinucleótidos AI y A2, ya que, de otra manera, la endonucleasa de restricción codificada por los polinucleótidos Al o A2 no podrían actuar sobre el polinucleótido B liberando el genoma adenoviral, lo cual es esencial para la replicación y transcripción de dicho genoma.
Las células hospedadoras de la invención pueden obtenerse bien mediante la introducción de los polinucleótidos o vectores de la invención de forma transitoria o bien, preferiblemente, mediante la introducción de dichos polinucleótidos o vectores de forma estable. Para ello, es necesario poner en contacto los vectores de la invención con las células hospedadoras en condiciones adecuadas para la entrada del ADN en la célula. Los vectores de la invención se introducen en las células objeto de estudio usando cualquiera de los métodos de transfección conocidos para el experto en la materia (véase secciones 9.1 a 9.5 en Ausubel, F. M. et al., "Current Protocols in
Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc; ringbou edition 2003). En particular, las células se pueden transfectar mediante co-precipitación de ADN con fosfato calcico, DEAE-dextrano, polibreon, electroporación, microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección, infección por retrovirus y transfección biolística.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de células adecuadas para la producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un adenovirus de alta capacidad que comprende
(i) transfectar una célula con el polinucleótido Al de la invención y (ii) transfectar dicha célula con el polinucleótido B de la invención en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea y en donde se utilizan células que comprenden la secuencia que codifica la proteína adeno viral ElA y, opcionalmente, la proteína adeno viral ElB.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción de células adecuadas para la producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un adenovirus de alta capacidad que comprende
(i) transfectar una célula con el polinucleótido A2 de la invención y (ii) transfectar dicha célula con el polinucleótido B de la invención en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea.
El experto en la materia apreciará que las etapas (i) y (ii) en los métodos descritos anteriormente pueden llevarse a cabo de forma que los polinucleótidos o vectores se encuentren de forma transitoria en la célula o, alternativamente, pueden llevarse a cabo de forma que se obtenga una expresión estable de los polinucleótidos A1/A2 y/o B. En el caso de que se desee obtener expresión estable de los vectores de la invención en las células hospedadoras, es necesario incluir durante la etapa de transfección o infección un gen que codifique para resistencia a un determinado antibiótico, de forma que se puedan seleccionar aquellas líneas celulares que han incorporado el ADN en el genoma de aquellas líneas celulares en las que el ADN se encuentra en posición extracromosómica. El gen que permite seleccionar las células se puede aportar formando parte del mismo vector que contiene la construcción objeto de la invención o, alternativamente, se puede aportar separadamente mediante co-transfección con un segundo plásmido que contiene dicho gen de resistencia. En este último caso, el plásmido que contiene la construcción de ADN se aporta a la mezcla de transfección en un exceso molar con respecto al gen de resistencia de forma que por cada evento de integración del gen de resistencia exista una alta probabilidad de integración del gen que contiene el promotor objeto de estudio. Preferiblemente, el plásmido que contiene la construcción de ADN se aporta en un exceso de al menos 5 veces con respecto al vector que contiene el gen reportero de resistencia. Preferiblemente, el gen de resistencia se incluye dentro de los propios vectores de la invención. Los genes de resistencia adecuados para la transfección han sido descritos con anterioridad. Por tanto, en una forma preferida de realización, el método de obtención de células que comprenden los polinucleótidos AI y B o A2 y B de acuerdo a la invención incluyen una etapa adicional de selección en la que se seleccionan células que han integrado de forma estable el primer y/o el segundo polinucleótido en base a marcadores de selección presentes en los polinucleótidos utilizados en las etapas (i) y (ii).
Por una parte, la transfección con un vector de expresión que comprende el polinucleótido A2 ha permitido seleccionar clones de células que integran el polinucleótido de modo estable (mantenimiento de las células hasta 4 meses en cultivo). Ventajosamente, se ha comprobado que la expresión de las proteínas E1A/E1B y de la endonucleasa de restricción está reprimida, manteniendo unos niveles básales de expresión que no resultan perjudiciales para la célula, y que dicha expresión puede ser inducida y activada mediante la adición al cultivo de una cantidad adecuada de un agente inductor apropiado para la construcción concreta empleada.
Adicionalmente, en el caso particular de que se utilice una variante del polinucleótido B que comprende un sitio de reconocimiento de una integrasa, es necesario llevar a cabo la etapa (ii) mediante una co-transfección del vector de expresión que comprende el polinucleótido B junto con un plásmido que codifica y expresa una integrasa y que reconoce la secuencia de reconocimiento de la integrasa, para permitir así la integración del polinucleótido B en el genoma de la célula. Preferiblemente, en el caso de que el sitio de reconocimiento de la integrasa sea el sitio attB, la etapa (ii) implica una co- transfección con un plásmido que codifica la integrasa del fago PhiC31 , lo que permite la integración del polinucleótido B o del vector que contiene dicho polinucleótido en el genoma de la célula mediante una recombinación entre la secuencia attB y secuencias pseudo-α^P presentes en los cromosomas de células humanas. Esta recombinación e integración unidireccional está mediada por la integrasa PhiC31. Para la expresión de las diferentes regiones virales y la posterior replicación del genoma viral presente en el polinucleótido B es necesario que los extremos ITR del virus estén libres además de ser necesaria también la presencia de las proteínas El A/E IB virales. Consecuentemente, las células generadas portan el genoma del adenovirus defectivo pero este no se puede expresar ni replicar. Si bien es posible que se produzcan también integraciones del polinucleótido B de modo aleatorio, la integración en secuencias pseudo-α^P es mayoritaria y sin pérdidas de material genético.
Los métodos descritos anteriormente permiten la obtención de líneas celulares adecuadas para el empaquetamiento de vectores adeno virales de alta capacidad. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con células obtenidas mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente. En particular, la invención contempla células que comprenden los polinucleótidos AI y B o los polinucleótidos A2 y B, en donde dichos polinucleótidos pueden encontrarse integrados de forma estable en el genoma de la célula o pueden encontrarse de forma transitoria.
Sistemas y métodos para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de la invención
Las células empaquetadores obtenidas mediante la introducción en líneas celulares de los polinucleótidos de la invención o de los vectores que las comprenden pueden ser utilizadas para la generación de vectores adenovirales de alta capacidad mediante la introducción en dichas células de genomas adenovirales que comprenden el gen de interés, bien mediante transfección con polinucleótidos que comprenden el genoma adeno viral o bien mediante infección con adenovirus recombinantes que comprenden dicho gen. Tras la infección/transfección con el adenovirus/polinucleótido que comprende el genoma adenoviral y que comprende a su vez el gen de interés, y la puesta en contacto de las células con el agente que promueve la expresión de los genes incluidos en el polinucleótido Al o A2, se comienza a producir en la célula el regulador transcripcional que, a su vez, activa la transcripción del gen que codifica la endonucleasa de restricción. Ésta, a su vez, actúa sobre los sitios diana que flanquean el genoma adenoviral deficiente comprendido en el polinucleótido B, provocando la escisión de éste del genoma celular, lo que es condición necesaria para la posterior transcripción de los genes adenovirales que forman parte de dicho genoma. La transcripción de los genes adenovirales a partir del polinucleótido B requiere también de la expresión de los genes tempranos ElA y ElB que se encuentran codificados bien por el polinucleótido A2, en cuyo caso responden a la activación del regulador transcripcional, o bien en la propia célula empaquetadora, también bajo el control del regulador transcripcional.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un sistema para la producción de adeno virus de alta capacidad que comprende
(a) una célula de acuerdo a la invención y
(b) un adenovirus de alta capacidad
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad, que comprende las etapas de:
(a) transfectar o infectar una célula hospedadora con un polinucleótido que comprende el genoma del adenovirus de alta capacidad que se desea multiplicar y empaquetar o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(b) cultivar las células transfectadas/infectadas en condiciones que permitan la replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad, y
(c) recuperar las partículas virales del adenovirus de alta capacidad y, opcionalmente, (d) repetir las etapas (a) a (c) en donde las partículas virales de alta capacidad obtenidas en la etapa (c) se utilizan para infección en la etapa (a) del siguiente ciclo, en donde la célula hospedadora usada en la etapa (a) se selecciona del grupo de (i) una célula que comprende el polinucleótido Al de la invención y la secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el polinucleótido B de la invención o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(ii) una célula que comprende el polinucleótido A2 de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el polinucleótido B de la invención o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(iii) una célula que comprende el polinucleótido B de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con el polinucleótido Al de la invención y en donde la célula comprende una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB,
(iv) una célula que comprende el polinucleótido B de la invención, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de una etapa de transfección o se lleva a cabo simultáneamente con el polinucleótido A2 de la invención o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(v) una célula que comprende el polinucleótido Al de la invención, el polinucleótido B de la invención y una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB, y (vi) una célula que comprende los polinucleótido A2 y B de la invención.
La etapa (a) del método para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad comprende la puesta en contacto de una célula empaquetadora con un adenovirus de alta capacidad o con un polinucleótido o vector que comprende el genoma de dicho adenovirus.
Por "adenovirus de alta capacidad" se entiende, según la invención, adenovirus recombinantes de los denominados dependientes de auxiliar o gutless, caracterizados porque carecen de todos los genes del genoma adenoviral excepto las regiones ITR 5 ' y 3 ' y la región de empaquetamiento ψ, tal y como se ha descrito, por ejemplo, por Alba et al. (2005, Gene Therapy, 12 :S 18-S27). Estos adenovirus admiten secuencias heterólogas de hasta 36 kb puesto que carecen de secuencias propias del genoma adenoviral. Genes heterólogos que pueden incorporarse en los vectores gutless de acuerdo con los métodos de la invención incluyen los genes que codifican eritropoietina (EPO), leptinas, hormona liberadora de hormona adrenocorticotropa (CRH), hormona liberadora de hormona somatotropa (GHRH), hormona liberadora de gonado tro finas (GnRH), hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona liberadora de prolactina (PRH), hormona liberadora de melatonina (MRH), hormona inhibidora de pro lactina (PIH), somato statina, hormona adrenocorticotropa (ACTH), hormona somatotropa o del crecimiento (GH), hormona luteinizante (LH), hormona folículo estimulante (FSH), tirotropina (TSH u hormona estimulante del tiroides), prolactina, oxitocina, hormona antidiurética (ADH o vasopresina), melatonina, factor inhibidor Mülleriano, calcitonina, hormona paratifoidea, gastrina, colecistoquinina (CCK), secretina, PBGD, factor de crecimiento de tipo insulina tipo I (IGF-I), factor de crecimiento de tipo insulina tipo II (IGF-II), péptido natriurético atrial (PNA), gonadotrofina coriónica humana (GCH), insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático (PP), leptina, neuropéptido Y, renina, angiotensina I, angiotensina II, factor VIII, factor IX, factor tisular, factor VII, factor X, trombina, factor V, factor XI, factor XIII, interleukina 1 (IL-I), interleuquina 2 (IL-2), factor de necrosis tumoral Alfa (TNF-α), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8 (IL-8 y chemoquinas), interleuquina 12 (IL- 12), interleuquina 16 (IL- 16), interleuquina 15 (IL- 15), interleuquina 24 (IL-24), interferones alfa, beta, gamma, CD3, ICAM-I, LFA-I, LFA-3, quimioquinas incluyendo RANTES lα, MIP- lα, MIP- l β, factor de crecimento neuronal (NGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF y relacionados), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento glial (GDNF), factor de crecimiento de quer atino cito s, factor de crecimiento endotelial, antitripsina 1 alfa, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de granulocito y macró fagos (GM-CSF), cardiotrofina 1 (CT-I), oncostatina M (OSM), anfíregulina (AR), ciclosporina, fibrinógeno, lactoferrina, activador de plasminógeno tipo tisular (tPA), quimotripsina, inmunoglobinas, hirudina, superóxido dismutasa, imiglucerasa, β-Glucocerebrosidasa, glucosidasa-α , α-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, galsulfasa, α-galactosidasa A humana, inhibidor de la proteinasa α-1, lactasa, enzimas pancreáticas (lipasa, amilasa, proteasa), adenosina deaminasa, inmunoglobulinas, albúmina, toxinas botulínicas de tipo A y B, colagenasa, deoxirribonucleasa I humana, hialouronidasa, papaina, L-asparaginasa, lepirudin, estreptoquinasa, péptidos inhibidores del factor de transformación celular beta (TGF-β) tales como los descritos en WO0331 155, WO200519244 y WO0393293, cuyo contenido se incorpora en la presente invención por referencia, casetes de expresión apropiados para la transcripción de moléculas de RNA de interferencia (shRNA, siRNA, miRNA, RNA de ribonucleoproteínas Ul modificadas). Además de dichos genes heterólogos, los adenovirus gutless utilizados en la invención pueden contener regiones de relleno o stuffer, tales como la secuencias de relleno derivadas del genoma del fago lambda descritas por Parks et al. (1999, J. ViroL, 73:8027-8034) o el ADN de relleno que aparece en pSTK120 según ha sido descrito por Sandig et al. (2000, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 97:1002-1007). Estas regiones contienen habitualmente secuencias presentes en el genoma humano y capaces de aumentar la expresión de los genes heterólogos con respecto a los adenovirus controles que en lugar de dicho ADN de relleno humano comprenden el fragmento de 22 kb del fago lambda descrito en Parks et al. (1999, J. ViroL, 73:8027-8034). La longitud total del ADN de relleno humano puede variar pero oscila entre 20 y 30 kb, preferiblemente de 20 a 25 kb o, aún más preferiblemente, de 21 a 23 kb, por ejemplo 22 kb. El número de secuencias que actúan en cis en dicho ADN de relleno puede variar entre 2, 3, 4 o más e incluye, sin limitación, el dominio repetido alfoide de 16.2 kb (descrito en Smith et al., 1995, Mol. CeIl. Biol, 15:5165-5172); regiones de adhesión a la matriz (MAR) como por ejemplo el fragmento de 4.2 kb que contiene el extremo izquierdo del adenovirus de tipo 6 o dos copias de la región de adhesión a la matriz de la inmunoglobulina K (según fue descrito por Betz et al, 1994, CeIl, 77:239-248); una región de control de hepatocitos (HCR) tales como el fragmento de 1.2 kb que comprende dicho HCR (según fue descrito por Miao et al., 2000, Molecular Therapy, 1 :522-532); u otra región de adhesión a matriz tales como el la región de 2.8 kb de la lisozima de pollo (según ha sido descrito por Phi- Van et al, 1990, Mol. CeIl. Biol. 10:2302-2307, región de adhesión a matriz de la región 5' del interferón β (según ha sido descrito por Bode et al. 1992, Science, 10:195- 197) u otras secuencias humanas no codificantes tales como secuencias teloméricas o centroméricas.
La puesta en contacto de las células hospedadoras con el polinucleótido que comprende el genoma adenoviral se lleva a cabo usando técnicas conocidas para el experto en la materia, tales como transfección de dicho polinucleótido o de un vector que lo comprende mediante transfección mediante co-precipitación de ADN con fosfato calcico, DEAE-dextrano, polibreon, electroporación, microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección, infección por retrovirus y transfección biolística. Alternativamente, es posible poner en contacto las células con el adenovirus que se desea amplificar, en cuyo caso la propia capacidad del adenovirus de infectar células permite la introducción en la célula de dicho genoma.
Por "célula empaquetadora" se entiende cualquiera de las células descritas en la presente invención y que contienen, al menos el polinucleótido A1/A2 o el polinucleótido B de la invención. El experto en la materia apreciará que es posible el uso de distintas células empaquetadoras. Sin embargo, dependiendo de la presencia o no en la célula empaquetadora de uno o más de los polinucleótidos de la invención, la etapa (a) debe ir precedida de o llevarse a cabo simultáneamente con una etapa de transfección en la que las células se ponen en contacto con aquellos polinucleótidos de la invención que no aparezcan en las células empaquetadoras y que son necesarias para aportar los elementos esenciales para la replicación del genoma adenoviral así como para la producción en las células de los polipéptidos necesarios para el ensamblaje de los adenovirus. Así, es posible utilizar como célula empaquetadora una célula que comprenda el polinucleótido Al de la invención y una secuencia que codifique la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB. Sin embargo, el uso de esta célula empaquetadora requiere de una etapa previa o simultánea a la etapa (a) consistente en la transfección de dicha célula con el polinucleótido B de la invención o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido. En el caso de que se utilice una célula que comprenda el polinucleótido A2 de la invención, la etapa (a) debe ir precedida de o llevarse a cabo de forma simultánea con una etapa de transfección con el polinucleótido B de la invención o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido.
En el caso de que se utilice como célula empaquetadora una célula que comprende el polinucleótido B de la invención, la etapa (a) debe ir precedida de o llevarse a cabo de forma simultánea con una etapa de transfección con el polinucleótido Al de la invención y, en cuyo caso, la célula debe comprender, adicionalmente, una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB.
En el caso de que se utilice una célula que comprende el polinucleótido B de la invención, la etapa (a) debe ir precedida de o llevarse a cabo de forma simultánea con una etapa de transfección con el polinucleótido A2 de la invención o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido.
También es posible utilizar una célula que comprenda el polinucleótido Al de la invención, el polinucleótido B de la invención y una secuencia que codifique la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB o, alternativamente, una célula que comprenda los polinucleótidos A2 y B de la invención.
La etapa (b) del método de la invención comprende el mantener las células transfectadas/infectadas obtenidas en la etapa (a) en condiciones que permitan la replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad. Para ello, es necesario que dichas condiciones permitan la expresión del regulador transcripcional codificado por el polinucleótido Al o A2, de forma que éste actúe sobre sus sitios de unión en la región reguladora del gen de la endonucleasa presente en el polinucleótido Al y A2 y sobre sus sitios de unión en la región reguladora de los genes adenovirales ElA y ElB, presentes en el polinucleótido A2. Para ello, en los casos en los que el regulador transcripcional codificado por el polinucleótido Al o A2 sea un regulador activable, la etapa (b) implica poner en contacto las células con el agente capaz de activar el regulador transcripcional. En una forma preferida de realización, el regulador transcripcional codificado por el polinucleótido Al o A2 es GAL4-hPR-p65, según se ha descrito anteriormente, en cuyo caso, el agente inductor es mifepristona.
La etapa (b) se lleva a cabo durante el tiempo necesario para que la concentración de partículas virales sea lo suficientemente alta, según se determina mediante medios estándar tales como el método Resource Q basado en HPLC, según ha sido descrito por Shabram et al., (1997, Hum. Gene Ther., 8:453-465), o de modo indirecto mediante inspección visual del efecto citopático en las células. Opcionalmente, el cultivo de las células puede incluir la adición de medio de cultivo fresco.
En la etapa (c), los adenovirus generados durante la etapa (b) son recuperados del cultivo celular. Para ello será necesario separar las células del medio de cultivo por cualquier método conocido por los expertos en la técnica (tripsinización y centrifugación o filtración), romper las células en solución inerte (ciclos de congelación/descongelación, homogenización, sonicación, cavitación, uso de detergentes y similares) y purificar las partículas de adenovirus por métodos conocidos como pueden ser la ultracentrifugación en gradiente de CsCl o mediante distintos tipos de cromatografía tales como una combinación de cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (Huyghe et al., 1996, Hum. Gene Ther., 6: 1403-1416), una combinación de cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de fraccionamiento en gel (WO07059473), cromatografía en dietilaminoetil (DEAE) celulosa (Haruna et a l, 1961, Virology 13, 264-267), cromatografía en hidroxiapatito (US2002/0064860) y cromatografía en otras resinas tales como geles blandos (agarosa), polímeros macroporosos basados en polímeros sintéticos que incluyen cromatografía de permisión (fractogel) y materiales basados en un gel blando en una cápsula dura (por ejemplo, Ceramic HyperD® F) (Rodrigues, 1997, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl, 699:47-61).
La etapa (d), que es opcional, consiste en repetir las etapas de (a) a (c) una o varias veces. Para ello, en cada etapa (a) del ciclo, se utiliza como material de partida partículas adenovirales obtenidas en la etapa (c) del ciclo anterior. De esta manera se puede repetir el proceso de la invención sucesivas veces obteniendo un número mayor de partículas adeno virales en cada ciclo.
La invención se ilustra a continuación en base a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Construcción del plásmido pGal4-2RU-El-SceI para la expresión inducible de los genes adenovirales EIa y EIb y de la enzima de restricción I-Scel.
En la presente realización, el plásmido pGal4-2RU-El-SceI, que contiene el polinucleótido A2 según se define en la invención (Fig. IA), se ha diseñado específicamente para el control, a nivel transcripcional, de la expresión de los genes adenovirales EIa y EIb. Dentro de esta construcción, y bajo el mismo sistema de control transcripcional, se ha incluido el gen que codifica la endonucleasa de restricción I-Scel. El regulador transcripcional que controla la expresión de los genes EIa, EIb y I- Scel, se expresa de manera constitutiva a partir de una secuencia nucleotídica incluida dentro del mismo polinucleótido A2.
El mecanismo de regulación de la transcripción, incluido en la presente invención, está mediado por el sistema de la antiprogestina mifepristona (Burcin et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 96: 355-360). Dicha regulación tiene lugar a través de una proteína de fusión insensible a hormonas endógenas humanas pero activa en presencia de antiprogestinas sintéticas (RU486) a dosis suficientemente bajas como para evitar efectos secundarios en humanos.
Como base de la construcción del plásmido pGal4-2RU-El-SceI se ha utilizado el sistema comercial GeneSwitch™ (Invitrogen, Carlsbad CA92008 USA, Catalog nos. Kl 060-01 y Kl 060-2) . Este sistema proporciona todos los componentes genéticos necesarios para el diseño del plásmido que incluye el polinucleótido A2. El primer componente del sistema GeneSwitch™ es el vector pSwitch (Fig. 2A), el cual codifica la proteína de fusión GAL4-hPR-p65 que actúa como activador transcripcional. La proteína se divide en un dominio de unión a ADN (DBD) de la proteína GAL4 de Saccharomyces cerevisiae (Laughon y Gesteland, 1984, Mol. CeIl Biol, 4: 260-267; Marmorstein, et al., 1992, Nature, 356: 408-414), un dominio truncado de unión a ligando del receptor de progesterona humano (hP R-LBD) (Kastner, et al., 1990, Embo J, 9: 1603-1614; Wang, et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91 : 8180-8184) y el dominio de activación de la proteína NF-κB humana (AD) (Burcin, et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96: 355-360; Deloukas y van Loon, 1993, Hum. Mol. Genet., 2: 1895-1900). La expresión de la proteína reguladora se encuentra bajo el control de un promotor híbrido derivado de la unión de las secuencias de activación de GAL4 de Saccharomyces cerevisiae (UAS: upstream activating sequences) (Giniger et al., 1985, CeIl, 40: 767-774; Wang et al, 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91 : 8180-8184) y el promotor mínimo del gen timidina quinasa (Ptk) del Virus Herpes Simplex. La región de activación del promotor incluye 4 copias de la secuencia 5 '-(T/C)GGAGT ACTGTCCTCCG-3 ' (SEQ ID NO: 1). Cada una de ellas sirve como sitio de unión para dos moléculas del dominio de unión a ADN del factor de transcripción GAL4 (Marmorstein, et al., 1992, Nature, 356: 408-414).
El segundo componente del sistema GeneSwitch™ es el plásmido pGene/V5-HisA (Fig. 2B), que controla la expresión del gen de interés. En este caso el promotor híbrido que controla la transcripción se compone de 6 secuencias de unión del factor de transcripción GAL4 y la secuencia de la Caja TATA del gen EIb (PEIIO de adenovirus (Lillie y Green, 1989, Nature, 338: 39-44).
El sistema en ausencia de mifepristona va a expresar constitutivamente la proteína de fusión reguladora GAL4-hPR-p65 a partir del promotor mínimo de la timidina quinasa. Esta proteína se localiza predominantemente en el núcleo y en una forma inactiva. En el momento de la adición del inductor mifepristona, o su análogo RU486, éste se une con alta afinidad a la región hPR-LBD de GAL4-hPR-p65, provocando un cambio conformacional que resulta en la dimerización de la proteína y su conversión a la forma activa. Estos homodímeros interaccionan con las secuencias de unión de GAL4 (UAS) localizadas en los plásmidos pGene/V5-HisA y pSwitch, activando así la transcripción del gen de interés y del gen que codifica el propio factor de transcripción (Fig. 2C).
En base a la idea planteada en la presente invención de poner la región El de Ad5 y el gen de la endonucleasa I-Scel bajo el control del sistema inducible GeneSwitchΥM, inicialmente se diseñaron distintas combinaciones del sistema de regulación, la secuencia del genoma adenoviral entre las posiciones 505 y 351 1 (Ad5(505-3511)) (GenBank: AC000008) y el gen codificante de I-Scel. En estas combinaciones el mecanismo de regulación se basa en la utilización de uno o dos plásmidos y en los que los genes El y el gen l-Scel quedan bajo el control de un único promotor o bien bajo el control de promotores diferentes dispuestos, a su vez, en la misma o distinta orientación (Fig. 3A). Cada una de estas combinaciones se ensayó para determinar la capacidad de regulación de la expresión de la región El y el gen l-Scel y su capacidad de integración estable dentro del genoma celular. De todas ellas, la construcción pGal4-2RU-El-SceI fue considerada la más adecuada para su aplicación en el diseño de un sistema de producción de adenovirus de alta capacidad independiente de helper.
Las cepas bacterianas utilizadas para la propagación de las construcciones descritas a continuación fueron Escherichia coli DH5α y E. coli STBL2. El crecimiento se llevó a cabo en medio Luria Bertani (LB) (Sigma-Aldrich, 28760 Madrid, España) suplementado con Ampicilina (100 μg/ml) (Sigma-Aldrich) como medio de selección y a 37 0C, en el caso de la cepa DH5α, y 30 0C para STBL2. Las bacterias fueron transformadas siguiendo el protocolo del CaCl2 descrito inicialmente por Hanahan (1983, J. Mol. Biol, 166: 557-580). Para ello se mezclaron 10-20 ng de ADN plasmídico con 100 μl de células competentes y se mantuvo en hielo durante 30 min. A continuación, para aumentar la eficiencia del proceso, la mezcla se incubó a 42 0C durante 1 minuto e inmediatamente se transfirió a hielo en donde se incubó otros 2 min. Por último se añadió 1 mi de medio LB y se incubó durante 1 h a 37 0C y en agitación.
Para la purificación de plásmidos, así como para la purificación de fragmentos de ADN producto de la digestión con enzimas de restricción tras su separación en geles de agarosa, se utilizaron los sistemas FX microplasmid prep kit (GE Healthcare Europe, 8290 Barcelona, España) y QlAquick GeI extraction hit (Qiagen, Valencia CA91355, USA) respectivamente, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
En el clonaje de fragmentos de ADN, las reacciones de ligación se diseñaron para un volumen final de 20 μl con 1 U de T4-ADN ligasa (New England Biolabs, Beverly MA01915-5599, USA) y 2 μl de tampón de reacción 1OX (New England Biolabs). En el caso de fragmentos con extremos romos, las reacciones se diseñaron para un volumen final de 20 μl con 1 U de T4-ADN ligasa (New England Biolabs), 2 μl tampón de reacción 10X (New England Biolabs) y 2 μl de PEG 4000 al 50%. En cualquier caso, todas las reacciones se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas y se inactivaron a 65 0C/ 10 minutos previamente a su introducción en la cepa de E. coli correspondiente. Los clones recombinantes se seleccionaron en base al marcador de resistencia codificado por el vector y se confirmaron por digestión con endonucleasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Todas las reacciones de PCR diseñadas en el proceso de síntesis del plásmido pGal4- 2RU-El-SceI se llevaron a cabo en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa (BioTaq, Bioline, Londres NW2 6EW, UK), tampón de PCR (Bioline), MgCl2 4 mM, 0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta un volumen final de 50 μl. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de desnaturalización de 4 minutos a 95 0C; 29 ciclos de 50 segundos a 94 0C de desnaturalización, 40 segundos a 50 0C de hibridación con el cebador y 40 segundos a 72 0C de elongación; 1 ciclo de 5 minutos a 72 0C de elongación final. Para el análisis de los productos de amplificación las muestras se mezclaron con 1.5 μl de la solución de carga (azul de bromofenol 0.25% en agua destilada; Glicerol 40%; EDTA 100 mM) y se analizaron por electroforesis en geles de agarosa (1%) con tampón TAE IX (Tris Base 40 mM; ácido acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizando el ADN mediante tinción con bromuro de etidio (0.5 μg/ml).
El plásmido de regulación pGal4-2RU-El-SceI se diseñó en cinco pasos descritos a continuación: 1) Construcción del vector pGene-LinkerRU2: El plásmido pSwitch fue linealizado con los enzimas de restricción Sbfl (posición 38) y BamHl (posición 2484) para incluir el LinkerRU2. Éste se sintetizó previamente a partir de los cebadores
LinkerRU-1 : 5'-
GGACCACCAAGGATCCTCTAGAACCGTTTAAACACCACTAGTCCAACGCGTGATAT CACCGCGGCCGC A-3' (SEQ ID NO: 2) LinkerRU-2: 5 'GATCTGCGGCCGCGGTGATATCACGCGTTGGACTAGTGGTGTTTAAACGGTTCTA GAGGATCCTTGGTGGTCCTGCA3' (SEQ ID NO: 3)
En la reacción de anillamiento se mezclaron 10 μl de cada cebador a una concentración 50 mM en solución tampón (Tris-HCl 50 mM pH8.0; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 95 0C durante 2 minutos y 52 0C durante 10 minutos. Seguidamente el fragmento LinkerRU2 se fosforiló con el enzima T4 polinucleótido kinasa siguiendo las recomendaciones del fabricante (New England Biolabs). La reacción se incubó 30 minutos a 37 0C y se inactivo a 65 0C durante 15 minuntos. A continuación se procedió a la ligación del LinkerRU2 con el vector pSwitch y su transformación en E. coli DH5α. La construcción resultante se denominó pSwitch-LinkerRU2.
Seguidamente, la digestión del vector pSwitch-LinkerRU2 con los enzimas Fspl (posición 6623 de pSwitch) y Apal (posición 2721 de pSwitch) liberó el LinkerRU2 arrastrando parte de las secuencias adyacentes del vector pSwitch. Este fragmento se subclonó en el vector pGeneV5-HisA digerido previamente con estos mismos enzimas. El vector resultante se denominó pGene-LinkerRU2 y será la base de la construcción del vector pGal4-2RU-El-SceI.
2) Clonaje de la región El del adenovirus:
A partir del vector pGL3-Basic (Groskreutz y Schenborn, 1997, Methods Mol. Biol, 63: 11-30) y mediante digestión con BamHl y Xbal se liberó un fragmento de 262 pb que incluía la señal de poliadenilación del SV40 (SV40pA). Esta secuencia se clonó en el plásmido pBluescript II KS(+) (Stratagene, La Jolla CA92037, USA), digerido previamente con estos mismos enzimas, para dar lugar al plásmido pBS-SV40pA.
Por su parte, la digestión secuencial del plásmido pGeneV5-HisA con los enzima Salí (posición 151) y Pvull (posición 895) permitió el aislamiento de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGHpA). Este fragmento de 744 pb se clonó en el plásmido pBS-SV40pA linealizado previamente con Salí y BamHl y cuyo extremo BamHl previamente se hizo romo con Klenow siguiendo las recomendaciones del fabricante (DNA Pofymerase I, Large (Klenow) fragment; New England Biolabs). De este modo se obtiene un inserto que comprende las señales de poliadenilación BGH y SV40 unidas por una secuencia diana para el enzima de restricción BamHl.
Seguidamente, se procedió a la síntesis del plásmido pGeneLinkerRU2-2pA. Para ello, la digestión del vector pBS-BGHpA-SV40pA con Xbal liberó un fragmento de 623 pb que incluye las dos secuencias de poliadenilación y que se clonó dentro de la diana única Xbal presente en el LinkerRU2 del plásmido pGene-LinkerRU2. La orientación correcta del inserto (5 -SV40pA-BGHpA-3 ') se confirmó por restricción con Pmel.
La región El del Ad5 se amplificó por PCR con los cebadores: adl9 5 -GAGTGCCAGCGAGTAGAGTT-3 ' (SEQ ID NO: 4), y ad22 5 -GAATTCTCAATCTGTATCTTCATC-3 ' (SEQ ID NO: 5).
El producto resultante de 3 kb se clonó en el vector específico para productos de PCR pGemT-Easy (Promega Biotech Ibérica, 28108 Madrid, España). Mediante digestión con EcoRl se purificó dicha región El y se subclonó dentro de la diana EcoRl del vector pGeneLinkerRU2-2pA y que se localiza "corriente abajo" de la señal de poliadenilación BGHpA. El plásmido resultante se denominó pGeneLinkerRU2-2pA-
El.
3) Clonaie del gen GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD (regulador transcripcional) y su región promotora autorregulada. La digestión del vector pSwitch con los enzimas de restricción Sbfl (posición 38) y BamHl (posición 2485) aisló las secuencias de unión al regulador transcripcional (región UAS), el promotor mínimo de la proteína quinasa (Ptk) y el gen codificante del activador transcripcional GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD. Este fragmento Sbfi-BamM, de 2.4 kb, se clonó en el plásmido pGeneLinkerRU2-2pA digerido previamente con estos mismos enzimas y provocando la pérdida de la secuencia de poliadenilación SV40pA. La construcción resultante recibió el nombre de pGeneLinkerRU2-Gal4- BGHpA-El.
Para recuperar esta segunda señal de poliadenilación, la secuencia SV40pA se purificó a partir de la construcción inicial pGeneLinkerRU2-2pA por digestión con BamHl. El fragmento de 0.2 kb se clonó dentro de la diana única BamHl del plásmido pGeneLinkerRU2-Gal4-BGHp A-E 1.
4) Clonaje del gen I-Scel
El gen que codifica la endonucleasa I-Scel se obtuvo mediante amplificación por PCR con los cebadores:
Scel-bl 5 -AAACCATGGGATCAAGATCGC-3 ' (SEQ ID NO:6), y
Scel-b2 5 -CCCTCT AGATTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGA-3 ' (SEQ ID NO:7),
a partir del plásmido pl-Scel (Choulika, et al., 1994, C. R. Acad. Sci. III, 317: 1013- 1019). Tras su clonaje en pGemT-Easy se liberó mediante digestión con el enzima de restricción Non. Los extremos del fragmento purificado se hicieron romos con el fragmento Klenow siguiendo las recomendaciones del fabricante (New England Biolabs) y a continuación se sometió a una segunda digestión con el enzima de restricción Spel. Por último el fragmento purificado, de 0.8 kb, se clonó entre las dianas Spel (posición 478) y Non (posición 522, tratada con Klenow) del vector pGeneV5-HisA. El tratamiento con Klenow conlleva la pérdida de la diana Non. El plásmido resultante se denominó pGene-IScel. La digestión del plásmido pGene-IScel con Xbal liberó un fragmento de 1.2 kb que incluye el gen de la endonucleasa I-Scel bajo el control transcripcional del promotor mínimo del gen EIb de adenovirus (PEIB). El fragmento se subclonó dentro de la diana compatible Spel localizada, dentro del plásmido pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-El, entre la secuencia de poliadenilación BGH y la región El. La construcción resultante se denominó pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI-El .
5) Clonaje del promotor inducible dual para el control de la transcripción de I-Scel y la región El del adenovirus.
La región del vector pGeneV5-HisA que engloba las secuencias reguladoras de unión al activador transcripcional (UAS) y el promotor mínimo PEIB se obtuvo por amplificación por PCR con los cebadores:
PRU-I 5 -AATACTAGTCCGAGCTCTTACGCGGGTC-3' (SEQ ID NO: 8), y
PRU-2 5 '-AATACGCGTGGTGGCCTGTGAAGAGAAAAAA-3 ' (SEQ ID NO:9),
y se subclonó en el vector pGemT-Easy. Posteriormente, el inserto se liberó por digestión con Not\ y se subclonó en la construcción pGeneLinkerRU2-Gal4-2pA-ISceI- El, dentro de la diana Not\ localizada entre el promotor mínimo PEIB de I-Scel y la región El del adenovirus. La construcción resultante se denominó pGal4-2RU-SceI-El (Fig. 3B).
Ejemplo 2: Construcción del plásmido pRCAd2 para la integración en células de mamífero del genoma de un adenovirus delecionado en la señal de empaquetamiento y genes EIa y EIb, y que codifica la endonucleasa I-Scel.
Dentro de la secuencia que engloba el genoma adenoviral se ha delecionado la secuencia de empaquetamiento (ψ) y la región correspondiente a los genes tempranos El a y Elb para un mayor control de la expresión del resto de los genes virales. Asimismo, la secuencia adenoviral se encuentra delimitada en ambos extremos por secuencias de reconocimiento para la endonucleasa de restricción I-Scel de Saccharomyces cerevisiae (Anglana y Bacchetti, 1999, Nucleic Acids Res., 27: 4276- 4281) la cual, debido al tamaño de su secuencia diana (T AGGGAT AACAGGGT AA - SEQ ID NO: 8) y su alta especificidad, no reconoce secuencias dentro del genoma de la célula a transfectar. La inserción de estas secuencias facilita la liberación del genoma viral sólo en presencia de la proteína I-Scel. Esta digestión deja libres los extremos ITR del adenovirus, necesarios para la correcta transcripción y replicación del ADN viral.
Por último, en el extremo 5 ' de la construcción se ha incluido una secuencia attB que promueve la integración del plásmido dentro del genoma celular, proceso mediado por la recombinasa PhiC31 del fago de Streptomyces. Este enzima posee un gran potencial como sistema de integración de ADN exógeno en células de mamífero ya que da lugar a una reacción específica y unidireccional y posee unas frecuencias netas de integración superiores a las observadas con otras recombinasas (Thyagarajan et al., 2001, Mol. CeIl. Biol, 21 : 3926-3934). Las secuencias de reconocimiento para la integrasa PhiC31 se denominan attB y attP y son diferentes en su secuencia. Tras la reacción de integración, las secuencias att resultantes difieren de las secuencias attB y attP originales, bloqueando posibles reacciones de recombinación secundarias. En células humanas, PhiC31 es capaz de mediar eventos de recombinación en puntos del genoma en los que existen secuencias con identidad parcial a attP y que se denominan pseudo-α^P (Fig. 4). Según Thyagarajan et al. (2001, supra) el número total de secuencias pseudo-α^P podría estar entre 102 y 103 lo que hace que la frecuencia de integración sea de 2 a 3 veces mayor que en el caso de las integraciones mediadas por recombinación homologa, e incluso de 10 a 100 veces mayor que la integración mediada por otras recombinasas específicas como la recombinasa Cre.
Las cepas bacterianas de E. coli utilizadas para la propagación de las construcciones descritas a continuación fueron DH5α, STBL2 y BJ5 183. Las bacterias fueron transformadas siguiendo el protocolo del CaCl2 descrito en el Ejemplo 1. El crecimiento se llevó a cabo en medio Luria Bertani (LB) (Sigma-Aldrich) suplementado con Ampicilina (100 μg/ml) (Sigma-Aldrich) como medio de selección y a 37 0C, en el caso de las cepas DH5α y BJ5183, y 30 0C para E. coli STBL2. Todas las reacciones de PCR diseñadas en el proceso de síntesis del plásmido pRcAd2 se llevaron a cabo en las mismas condiciones que las descritas en el Ejemplo 1. Los procedimientos generales aplicados en la purificación y manipulación de ácidos nucleicos también se describen en el Ejemplo 1.
El vector pRcAd2 se diseñó en 4 pasos, descritos a continuación:
1) Clonación de la secuencia αtfi?-ISceI-Ad(l-190)
El primer paso en la construcción del vector pRcAd2 fue la amplificación por PCR de la región attB con los cebadores:
attB-Pl 5'-AGATCTGTCGACGATGTAGGTCACGGTCTCCGAAGC-S ' (SEQ ID NO: l l) y attB-P2 5 '-TTAATTAATTACCCTGTTATCCCTAGTCGACATGCCCGCCGTGA-S ' (SEQ ID
NO: 12),
utilizando como molde el plásmido pTA-attB (Groth, et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sd.
USA, 97: 5995-6000). El fragmento amplificado se subclonó en el vector específico para productos de PCR pGemT-Easy (Promega), siguiendo las recomendaciones del fabricante. El cebador attB-P2 incluye un Linker con la secuencia de reconocimiento para el enzima de restricción I-Scel de Saccharomyces cerevisiae.
El fragmento αtóMScel (316 pb) se liberó del vector pGemT-Easy mediante digestión con los enzimas de restricción Ncol y Pací y se subclonó en el plásmido pGemT/A6, digerido previamente con estos mismos enzimas. pGemT/A6 deriva de la amplificación por PCR de la región del genoma del adenovirus serotipo 5 comprendida entre las posiciones 1 y 190, con los cebadores:
ad63: 5 '-AGATCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-S ', (SEQ ID NO:13) y ad64: 5 -AGATCTCGGCGCACACCAAAAACGTC-3 ' (SEQ ID NO: 14),
y su clonaje en el vector pGemT-Easy. En la construcción resultante, pGemT/attB-A6, la diana de restricción para I-Scel queda insertada entre la región attB y la posición 1 del genoma del adenovirus.
2) Clonación de la región Ad(3528-4459) El inserto αtó?-ISceI-Ad(l-190), de 512 pb, se escindió mediante digestión con BgHl y se subclonó en el vector pRC/A4-A5. Este vector es producto de la amplificación de la secuencia del adenovirus comprendida entre las posiciones 3528 y 4459 con los cebadores: ad57 5 -AGATCTCGTGGCTTAAGGGTGGGAAA-3 ' (SEQ ID NO: 15), y ad58: 5 -TCTAGATTATATGGCTGGGAACATAGCC-3 ' (SEQ ID NO: 16). y su clonaje en el vector de expresión eucariota pRC/RSV (Invitrogen), el cual incluye, además del gen de resistencia a ampicilina, el gen de resistencia a neomicina para su selección en células de mamífero. Para la inserción de la secuencia Ad(3528-4459) en pRC/RSV, se incluyeron secuencias diana para BgHl y Xbal el extremo 5 ' de los cebadores ad57 y ad58, respectivamente. El inserto queda integrado entre las posiciones 13 y 701 del vector.
La construcción resultante de la ligación del fragmento αtó?-iSceI-Ad(l-190) al vector pRC/A4-A5 se denominó pRC/A6-A5. De este modo queda delecionada la región El del adenovirus y que se localizaría entre las posiciones 190 y 3528.
3) Clonación de la región Ad(34901-35938)
El extremo 3' del genoma adenoviral (posiciones 34901-35938) se amplificó con los cebadores:
ad59: 5 '-TCTAGATTAGCTATGCTAACCAGCGTAG-3 '(SEQ ID NO: 17), y ad65 : 5 '-GGTACCTAGGGATAACAGGGTAATCATCATCAATAATATACCTT-S '(SEQ
ID NO: 18).
En el extremo 5 ' del cebador ad65 se incluyó la secuencia diana para el enzima de restricción I-Scel (subrayado). Ambos cebadores incluyen en su extremo 5' las dianas de restricción para Xbal (ad59) y Kpnl (ad65). El fragmento de 1060 pb, producto de esta amplificación, se cortó con estos enzimas para facilitar su subclonaje "corriente abajo" de la región Ad(3528-4459) insertada en el vector pRC/A6-A5. La construcción resultante se denominó pRC/A6-A7.
4) Obtención del plásmido pRcAd2
El plásmido pRC/A6-A7 fue linealizado con Xbal y desfosforilado con Fosfatasa Alcalina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Alkaline Phosphatase, CaIf Intestinal (CIP); New England Biolabs).
Simultáneamente, la digestión del plásmido pTG3602 (Chartier, et al, 1996, J. Virol, 70: 4805-4810) con Pací liberó una copia completa del genoma del adenovirus serotipo 5. Su recircularización se evitó mediante la desfosforilación de sus extremos con fosfatasa alcalina.
Tanto el vector linealizado pRC/A6-A7 como el inserto liberado del plásmido pTG3602 se utilizaron simultáneamente para transformar la cepa bacteriana electrocompetente de E. coli BJ5183 (BJ5I83 Electroporation competent cells; Stratagene). Estas células están diseñadas especialmente para promover procesos de recombinación entre secuencias homologas de un vector transferente, que contiene el gen de interés, y un vector que incluya el genoma adenoviral. En este caso las regiones homologas incluidas en ambos fragmentos de ADN (regiones Ad(3528-4459) y Ad(34901-35938)) favorece dicho proceso de recombinación cuya resolución conlleva la inserción del genoma adenoviral dentro del vector pRC/A6-A7 y a partir de la posición 4459 del virus (Fig. 5).
El proceso de electroporación se llevó a cabo, siguiendo las recomendaciones del fabricante, en un electroporador Gene Pulser (Biorad) y estableciendo los siguientes parámetros: voltaje: 2.5 kV; resistencia: 200 Ω; capacitancia: 25 μF; duración del pulso: 5 ms. Por último se añadió 1 mi de medio LB y la suspensión se incubó en agitación durante 1 hora a 37 0C. Seguidamente se prepararon diluciones seriadas de las células transformadas. Éstas se sembraron en placas de medio de cultivo suplementado con ampicilina (100 μg/ml) como antibiótico de selección para el plásmido pRC/A6-A7. La incubación se continuó a 37 0C hasta la aparición de clones resistentes.
El análisis de restricción con Hindlll confirmó la correcta inserción del genoma adeno viral en sólo uno de los clones obtenidos y que se denominó pRcAd2.
El plásmido pRcAd2 incluye el genoma completo del adenovirus, a excepción de la región localizada entre las posiciones 190 y 3528 y que corresponde a la región El. La secuencia se encuentra delimitada por dianas de restricción para I-Scel, y posee una secuencia attB en su extremo 5' (Fig. 5).
Ejemplo 3: Construcción y caracterización de líneas celulares estables para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad
En la presente invención se ha propuesto la obtención de líneas celulares estables diseñadas para la producción y empaquetamiento de vectores adenovirales de alta capacidad. Estas células serán capaces de producir todos los componentes necesarios para la replicación, ensamblaje y funcionamiento del virus.
Debido a la citotoxicidad de niveles elevados de proteínas virales, un sistema de regulación transcripcional inducible por mifepristona controla la expresión de los genes EIa y EIb, los cuales a su vez dirigen la expresión y replicación del resto del genoma adenoviral. Este mismo sistema controla, a su vez, la producción de la endonucleasa de restricción I-Scel necesaria para la liberación del genoma adenoviral integrado en el genoma de la célula eucariota, lo que proporciona un segundo nivel de control de la transcripción. La inducción (y por tanto la producción de partículas virales) se inicia en el momento de la adición al medio de cultivo de mifepristona o su análogo RU486.
Al no ser necesaria la utilización de un virus helper durante el proceso de producción, el sistema desarrollado por los inventores permite la obtención de extractos virales sin la contaminación residual indeseable de partículas virales que contienen copias genómicas de dichos virus helper. En la presente realización se ha utilizado la línea celular humana de carcinoma de pulmón A549 para el diseño de un sistema de producción de vectores de alta capacidad independiente de helper. Esta línea celular iniciada por Giard et al. (1973, J. Nati. Cáncer Inst. , 51 : 1417-1423) y posteriormente caracterizada en profundidad por Lieber et al. (1976, Int. J. Cáncer., 17: 62-70), presenta una gran sensibilidad a la infección por adenovirus lo que le confiere un elevado potencial como línea de producción de virus
(Smith et al, 1986, J. Clin. Microbiol, 24: 265-268). Las células son fácilmente cultivables sin variaciones en su morfología y se mantienen viables entre 10 y 14 días sin mostrar señales importantes de degeneración.
Ejemplo 3.1 : Generación de líneas celulares mediante transfección del plásmido pRcAd2 para la integración estable del genoma adeno viral (polinucleótido B).
Para la obtención de una línea celular de empaquetamiento capaz de complementar la síntesis de proteínas virales implicadas en la replicación, formación de la cápside y empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad, las células A549 se incubaron en placa de 10 cm2 a 37 0C, 5% CO2, hasta alcanzar una confluencia del 80%. Las células fueron co-transfectadas mediante lipofectamina con 3 μg de la construcción pRcAd2 (confiere resistencia a la Neomicina (neo1)) y 1 μg del plásmido pCMV-Int (Groth et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sd. USA, 97: 5995-6000), que codifica la integrasa del fago PhiC31 de Streptomyces y que promueve la integración estable del plásmido en el genoma de la célula (Fig. 6A).
El ADN de ambos plásmidos se diluyó previamente en 500 μl de medio sin suero OPTI- MEM (Gibco®: Invitrogen, Carlsbad CA92008, USA). Para favorecer la formación de los complejos entre el ADN y lípidos catiónicos se añadió el reactivo Plus Reagent (Invitrogen) en una relación 1 :0.75 (DNA: Plus Reagent). Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se añadieron 6 μl de Lipofectamina LTX (Invitrogen) y la mezcla se incubó de nuevo a temperatura ambiente durante 25 minutos. Seguidamente la dilución se añadió gota a gota sobre el medio de cultivo de las células: DMEM suplementado con suero fetal bovino 10% (Gibco®); L-Glutamina 1% (200 mM en NaCl 0.85%; Lonza Ibérica, 08006 Barcelona, España); y Penicilina/Estreptomicina 1% (10 mg/ml en NaCl 0.85%; Gibco®). Tras 4 horas de incubación a 37 0C, 5% CO2, el medio se sustituyó por medio DMEM fresco y se continuó la incubación otras 24 horas. Finalmente se retiró el medio y, tras un lavado con tampón fosfato salino IX (PBS) (Gibco®), las células transfectadas se levantaron con tripsina (Trypsin-EDTA; Gibco®) y se centrifugaron a 1250 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El precipitado de células se resuspendió en 6 mi de medio de cultivo y se repartió en tres placas de 60 cm2. Se añadió medio nuevo, en este caso suplementado con el antibiótico de selección G418, análogo de la Neomicina, a una concentración de 600 μg/ml. Cada dos días se procedió al cambio del medio de cultivo hasta la aparición de clones aislados resistentes al antibiótico (2-3 semanas). Los clones se levantaron con tripsina y se transfirieron a pocilios de 0.3 cm2 con medio de selección. La incubación se continuó hasta alcanzar el 80% de confluencia y seguidamente se transfirieron a pocilios de mayor superficie. Tras sucesivos pases se aisló un clon resistente a G418 que recibió el nombre de pRc-1. Para probar la estabilidad del clon las células se mantuvieron 4 meses en cultivo sin que se observaran cambios en su morfología o viabilidad.
Para confirmar la integración del plásmido pRcAd2 en el clon aislado, se extrajo el ADN genómico del clon pRc-1 con el sistema QIAmp DNA minikit (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este ADN se utilizó en ensayos de Nested-PCR para detectar la presencia de los genes adenovirales Illa, IV, el gen codificante de la proteasa y el gen que codifica la polimerasa viral. Los cebadores utilizados en esta detección fueron:
Gen Cebador Tm PCR SEQ ID NO:
Illa IHaI 5 -AGAGCCAGCCGTCCGGCCTTA-3 55 0C 19
IIIa2 5 -CGCGGTCGCCTGTGGGAGCCC-3 20
IIIa3 5 -GGTTGC ACT AAACGCCTTCC-3 ' 54 0C 21
IIIa4 5 -AGCCCCTGCAAGTTTTTGAA-3 ' 22
IV IVl 5 -CCTCT AGTT ACCTCCAATGGC-3 ' 45 0C 23
IV2 5 -AGT AACTTT AGTTTGCAAGGA-3 ' 24
IV3 5 -GGGCAACACACTCACCATGC-3 ' 55 0C 25
IV4 5 -ACATGCAAAGGAGCCCCGTA-3 ' 26 Proteasa PrI 5 -ACAGCTGCCGCCATGGGCTCC-3 ' 55 0C 27
Pr2 5 -GGGCGAGTGGCGCTCCAGGAA-3 ' 28
Pr3 5 -GCTTTTCTGACCAGCGACT-3 ' 51 0C 29
Pr4 5 -CACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3 ' 30
Polimerasa POLI 5 -CTGGCCTGGACGCGAGCCTTT-3' 55 0C 31
POL2 5 -CAGGGTCCTCGTCAGCGTAGT-3 ' 32
POL3 5 -T ACGGGGAC ACGGAC AGCCTT-3 ' 60 0C 33
POL4 5 -CTTGGCGCGCAGCTTGCCCTT-3 ' 34
Las reacciones de PCR con los cebadores externos de Nested-PCR (cebadores 1 y 2) se llevaron a cabo en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa (BioTaq, Bioline), tampón de PCR (Bioline), MgCl2 1.5 mM, 0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta un volumen final de 50 μl. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de 2 minutos a 94 0C, 50 segundos a 94 0C de desnaturalización, 50 segundos de hibridación con el cebador (Tm según el gen a amplificar, ver tabla) y 50 segundos a 72 0C de elongación; 35 ciclos de 50 segundos a 94 0C de desnaturalización, 50 segundos de hibridación con el cebador (Tm según el gen a amplificar, ver tabla) y 50 segundos a 72 0C de elongación; 1 ciclo de 7 minutos a 72 0C de elongación final. Las reacciones de amplificación con los cebadores internos de Nested-PCR (cebadores 3 y 4) se llevaron a cabo a partir de 2 μl de las reacciones de PCR anteriores y en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa (BioTaq, Bioline), tampón de PCR (Bioline), MgCl2 2.5 mM, 0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta un volumen final de 50 μl. En este caso las condiciones de amplificación fueron: 35 ciclos de 50 segundos a 94 0C de desnaturalización, 50 segundos de hibridación con el cebador (Tm según el gen a amplificar, ver tabla) y 50 segundos a 72 0C de elongación; 1 ciclo de 7 minutos a 72 0C de elongación final.
La pérdida de la región attB también se comprobó mediante reacción de PCR utilizando los cebadores attB-Pl; attB-P2 (Ejemplo 2). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa (BioTaq, Bioline), tampón de PCR (Bioline), MgCl2 4 mM, 0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta un volumen final de 50 μl. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de desnaturalización de 4 minutos a 95 0C; 29 ciclos de 50 segundos a 94 0C de desnaturalización, 40 segundos a 50 0C de hibridación con el cebador y 40 segundos a 72 0C de elongación; 1 ciclo de 5 minutos a 72 0C de elongación final.
Para el análisis de los productos de amplificación las muestras se mezclaron con 1 ,5 μl de la solución de carga (azul de bromofenol 0.25% en agua destilada; Glicerol 40%; EDTA 100 mM) y se analizaron por electroforesis en geles de agarosa (1%) con tampón TAE IX (Tris Base 40 mM; ácido acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizando el ADN mediante tinción con bromuro de etidio (0.5 μg/ml).
Los resultados obtenidos (Fig. 6B) confirman la correcta integración del polinucleótido B en el genoma de la célula eucariota A549. La pérdida de la región attB confirma, además, que dicha integración ha sido mediada específica y unidireccionalmente por la integrasa PhiC31.
A continuación, y para determinar la expresión de los genes del adenovirus, el clon pRc-1 se incubó en placa de 20 cm2 a 37 0C, 5% CO2, hasta alcanzar una confluencia del 80%. En este momento las células fueron transfectadas con una dilución de 5 μg de la construcción pGal4-2RU-SceI-El, Plus Reagent (1 :0.75) y 12 μl Lipofectamina LTX, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Las transfecciones se llevaron a cabo por duplicado incubando una de las placas en presencia del inductor RU486 a una concentración de 10"8M. Tras 48 horas de incubación las células se usaron con 1 mi de TRIZOL (Invitrogen) para proceder a la extracción del RNA total siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este RNA fue utilizado para ensayos de retrotranscripción (RT)-PCR con cebadores específicos para los genes adenovirales
Gen Cebador Secuencia SEQ ID NO:
IVa2 PRCl 5 -TGATCCAGTCGTAGCAGGAG-3 ' 35
PRC4 5 -ACGATCTCATCCTGGAACAC-3 ' 36
III III 1 5 -GCCAGTGGCGGCGGCGCTGGG-3 ' 37
III2 5 -CCGATGTCGCTTTCCAGAACC-3 ' 38 E4 E4-1 5 -CGTGCGAGGTCTTCCCTGCAG-3 ' 39
E4-2 5 -CT AC ATGGGGGT AGAGTCAT A-3 ' 40
Para estos ensayos previamente se trató 1 μg de RNA con 1 unidad de DNasa (DNasal amplification grade; Invitrogen) en tampón de reacción (Tris-HCl 20 mM, pH 8.4; MgCl2 2 mM; KCl 50 mM) y a un volumen final de 10 μl. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos y la DNasa se inactivo añadiendo 1 μl de solución EDTA 25 mM, e incubando a 65 0C durante 10 min. En la reacción de síntesis del cDNA se emplearon 625 ng de este RNA libre de ADN. La reacción de reverso- transcripción se inició mezclando la muestra con 10 pmol del cebador específico, 1 μl de dNTPs (10 mM) y agua hasta un volumen final de 13 μl. Tras incubar a 65 0C durante 5 minutos, la mezcla se enfrió en hielo y se añadieron 2 μl de DTT 0.1 M y 4 μl de tampón de reacción (Tris-HCl 250 mM, pH 8.3; KCl 375 mM; MgCl2 15 mM). Finalmente tras una nueva incubación a 37 0C durante 2 minutos se añadieron 200 U de M-MLV Reverse-Transcriptase (Invitrogen) y se continuó la incubación a 37 0C durante 50 min. Seguidamente el cDNA resultante se utilizó como molde en reacciones de PCR con objeto de amplificar el producto de la transcripción de los genes bajo estudio. Como control negativo y para comprobar la ausencia de contaminación por ADN genómico, en todos los casos, se incluyó una reacción de amplificación utilizando como molde el RNA tratado con la DNasa. Las condiciones de amplificación utilizadas para las reacciones de PCR con el ADNc obtenido de la reacción de reverso-transcripción fueron las mismas que las empleadas en las reacciones de amplificación del ADN genómico.
Los resultados de estos ensayos, mostrados en la Figura 7, confirman la capacidad de transcripción de los genes adenovirales integrados de manera estable en el cromosoma de la célula eucariota.
Finalmente, para confirmar la capacidad de las células de producir proteínas virales a partir del mRNA viral, se ensayó la detección de proteínas de la cápside viral mediante ensayos de inmunocitoquímica. Para inducir la síntesis de proteínas, el clon pRc-1 se transfectó previamente con la construcción pGal4-2RU-SceI-El. Las transfecciones se hicieron por duplicado para obtener células transfectadas e incubadas en presencia y ausencia del inductor RU486. Tras 24 horas de incubación, las células se levantaron con tripsina y 8x104 células se transfirieron a un portaobjeto de cultivo de cuatro celdas (BD Falcon Cultureslide; BD Biosciences, Erembodegem 9320, Bélgica), añadiendo nuevo medio de cultivo con y sin inductor RU486. Al día siguiente se retiró el medio y las células se lavaron con PBS. Seguidamente se procedió a su fijación con una solución Acetona:Metanol (1 :1) previamente enfriada a -20 0C. La solución de fijado se dejó evaporar a temperatura ambiente (30 minutos) y los portaobjetos se sumergieron en PBS IX. Tras 3 lavados de 3 minutos en PBS se procedió a la hibridación con el anticuerpo primario (Mouse anti-adenovirus monoclonal antibody blend; Millipore Ibérica, 28050 Madrid, España) diluido previamente en PBS (1 :75). Dicha hibridación se llevó a cabo durante toda la noche a 4 0C, en oscuridad y cámara húmeda. Al día siguiente el exceso de anticuerpo se lavó en PBS (3 lavados de 3 minutos) y se procedió a la hibridación con el anticuerpo secundario (Immunopure goat anti-mouse IgG- Peroxidase; Pierce Biotechnology, Rockford IL61105, USA) diluido también en PBS (1 :400). La hibridación se incubó 45 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. De nuevo, las muestras se lavaron 3 veces en PBS IX y se procedió al revelado con el cromógeno DAB (DakoCytomation Liquid DAB Substrate Chromogen System; Dako Diagnósticos, Sant Just Desvern E-08960, Barcelona, España) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las muestras se contratiñeron con Hematoxilina de Mayer (5 segundos) para la tinción específica de núcleos y, tras un lavado de 15 minutos en agua, las muestras se deshidrataron sumergiéndolas 1 minuto en alcohol al 70%, 96% y 100%, y 10 minutos en Xileno.
La coloración marrón detectada en las muestra confirma la síntesis de proteínas de la cápside viral. Aunque se detecta una ligera producción basal de estas proteínas en la muestra sin inductor, los resultados de la inmunocitoquímica revelan una clara diferencia con respecto a los niveles de expresión de las proteínas virales en presencia del inductor RU486, confirmando que el sistema de regulación por mifepristona funciona en el control de la expresión de los genes virales integrados en el genoma del clon pRc-1. Ejemplo 3.2: Transfección de células A549 con el plásmido pGa!4-2RUSceI-El (polinucleótido A) para la generación de líneas celulares estables que integran la región El y el gen I-SceL ambos bajo control del sistema de regulación transcripcional inducible por mifepristona.
En una segunda realización, se diseñó una línea celular estable en la que se ha integrado el polinucleótido A2, según se define en la invención (Fig. IA). Así, la línea celular originada cuenta con los genes necesarios para el inicio y control de la expresión de los genes adenovirales incluidos en el polinucleótido B. A su vez, estos genes, como son el gen que codifica la endonucleasa de restricción I-Scel y la región adeno viral El que codifica, a su vez, las proteínas ElA y ElB, se encuentran bajo el control de promotores regulados por mifepristona. El propio factor de regulación GAL4-hPR-p65 está incluido en el polinucleótido A2 y, por tanto, se integrará de manera simultánea en el genoma celular. Dicho trans activador será expresado de manera constitutiva por las células modificadas.
Para la obtención de esta línea celular se incubaron células A549 en placa de 10 cm2 a 37 0C, 5% CO2, hasta alcanzar una confluencia del 80%. Las células se transfectaron por el método de la lipofectamina con la construcción pGal4-2RUSceI-El (gen de resistencia a la Zeomicina (zeo1)) y siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.1 para la obtención del clon pRc-1. Las células se incubaron en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino 10%, L-GIu 1 % y P/S 1 % y el antibiótico Zeomicina a una concentración de 400 μg/ml. Tras sucesivos pases de amplificación se aisló un clon resistente al antibiótico que recibió el nombre de Gal-13. Del mismo modo que para el clon pRc-1, la estabilidad del clon Gal-13 se testó mediante su mantenimiento en cultivo durante un período superior a los 4 meses y más de 35 pases sucesivos.
Ensayos de PCR a partir del ADN genómico de la célula confirmaron la presencia de los genes adenovirales EIa y EIb, del gen codificante de la endonucleasa I-Scel y del gen que codifica la proteína de fusión GAL4- hPR-p65 reguladora de la transcripción e inducible por mifepristona. Los cebadores utilizados fueron: Gen Cebador Secuencia SEQ ID NO:
EIa RT-EAl 5 -T ATCTGCC ACGGAGGTGTTAT-3 ' 41
RT-EA2 5 -TAGACAAACATGCCACAGGTC-3 ' 42
EIb RT-EB3 5 -GCTTGGGAGTGTTTGGAAGAT-3 ' 43
RT-EB4 5 '-CTGCTCCTCCGTCGGT ATT AT-3 ' 44
Scel SceI-3 5 -CCATACGATGTTCCTGACTA-3 ' 45
SceI-4 5 -CCCTT AACCAGGT ATTCT ACT-3' 46
GAL4- hPR-p65 GaI-I 5 -CTGACTAGGGC AC ATCTGAC A-3 ' 47
Gal-2 5 -TTGATGAGCTCTCTAATGTAG-3 ' 48
El ADN genómico de las células se extrajo con el sistema QIAmp DNA minikit (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante y las reacciones de PCR se llevaron a cabo en presencia de 1 U del enzima Taq polimerasa (BioTaq, Bioline), tampón de PCR (Bioline), MgCl2 4 mM, 0.4 mM de cada dNTP, 10 pmol de cada cebador, ADN y agua desionizada estéril hasta un volumen final de 50 μl. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 1 ciclo de desnaturalización de 4 minutos a 95 0C; 29 ciclos de 50 segundos a 94 0C de desnaturalización, 40 segundos a 50 0C de hibridación con el cebador y 40 segundos a 72 0C de elongación; 1 ciclo de 5 minutos a 72 0C de elongación final. Para el análisis de los productos de amplificación las muestras se mezclaron con 1.5 μl de la solución de carga (azul de bromofenol 0.25% en agua destilada; Glicerol 40%; EDTA 100 mM) y se analizaron por electro foresis en geles de agarosa (1%) con tampón TAE IX (Tris Base 40 mM; ácido acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) visualizando el ADN mediante tinción con bromuro de etidio (0.5 μg/ml). Los resultados de amplificación confirmaron la correcta integración de los genes incluidos en el polinucleótido A2 dentro del genoma de la línea A549 (Fig. 8).
Seguidamente, para comprobar la capacidad de regulación de la expresión génica del sistema inducible por mifepristona se analizó, por Western blot, la síntesis de las proteínas E lA y I-Scel partiendo de muestras de proteínas obtenidas de cultivos incubados en presencia y ausencia del inductor RU486 a una concentración de 10"8M. Los extractos proteicos se purificaron en 500 μl de Passive Ly sis Buffer IX (Promega) y los niveles de proteína total fueron determinados usando la técnica de Bradford para cuantificación de proteínas (Bradford, 1976, Anal. Biochem., 72 : 248-254). Las muestras se analizaron por electro foresis en gel discontinuo de poliacrilamida-SDS y tampón de electroforesis Laemli (Tris-HCl 25 mM; Glicina 192 mM; SDS 0.1% p/v). El gel separador estaba compuesto por poliacrilamida al 12% en tampón Tris-HCl 0.39 M (pH 8.8) con SDS al 0.1%. Como catalizadores se utilizaron PSA al 0.1% y TEMED al 0.04%. Por su parte el gel de concentración estaba compuesto por poliacrilamida al 5% en Tris-HCl 0.125 M (pH6.8) con SDS al 0.1%, PSA 0.1% y TEMED al 0.01%. Las muestras se transfirieron a membrana Hybond-P (GE Healthcare Europe) en tampón de transferencia (Tris-Base 0.3%; Glicina 186 mM; Metanol 20%) durante 2 horas a 4 0C. Seguidamente se procedió al bloqueo de la membrana en solución de leche 5% en PBS+Tween (0.05%) a 4 0C durante toda la noche. La hibridación con el anticuerpo primario se llevó a cabo en solución de leche 1% + PBS-T ween durante 1.5 horas a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpo se eliminó con 3 lavados de 10 minutos en PBS-Tween. La hibridación con el anticuerpo secundario se realizó en leche 1% + PBS-Tween durante 30 minutos a temperatura ambiente. En la detección de la proteína ElA se empleó el anticuerpo Anti-adenovirus2 ElA (Mouse) (1 :500) (Calbiochem®: EMD, La Jolla CA92039-2087, USA) y como anticuerpo secundario el Immunopure goat anti-mouse IgG-Peroxidase (1 :5000) (Pierce Biotechnology). En el caso de la proteína I-Scel se empleó como único anticuerpo el Anti-H A-Per oxidase High affinity (1 :500) (Roche Diagnostics, 08174 Barcelona, España). Tras 3 lavados de la membrana en PBS-Tween durante 10 minutos, se procedió al revelado. Para ello se empleó el sistema Western lightning chemiluminescence reagent (Perkin-Elmer, 28760 Madrid, España) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 9 y demuestran la correcta producción de las proteínas analizadas, así como un incremento en los niveles de expresión de estas proteínas en presencia del inductor. Sin embargo hay que tener en cuenta que, en ausencia de inductor, existe una expresión basal de las proteínas sometidas a regulación. Ejemplo 3.3: Generación de líneas celulares estables mediante doble transfección de células A549 con los plásmidos pGa!4-2RUSceI-El (polinucleótido A) y pRcAd2 (polinucleótido B).
Para obtener una única línea celular con todos los genes necesarios en la producción de partículas virales, el clon resistente a Zeomicina Gal- 13 (ejemplo 3.2) se co-transfectó con la construcción pRcAd2 (neo1), que incluye el resto de genes del adenovirus, y el plásmido pCMV-Int que codifica la integrasa PhiC31. Las condiciones de transfección fueron las mismas que las empleadas en la obtención del clon Gal- 13 y la selección se hizo en presencia de los antibióticos G418 (600 μg/ml) y Zeomicina (400 μg/ml). De esta selección resultó el aislamiento de dos clones doblemente resistentes (zeor+neor) y que se denominaron GAd-I y GAd-6 respectivamente. Las características morfológicas de ambos clones difieren enormemente de la línea parental A549 y su derivado Gal-13. Los nuevos clones transfectantes tienden a una forma esférica y son de menor tamaño. Este cambio morfológico posiblemente sea debido a la transcripción basal de los genes El detectada anteriormente en el clon Gal-13, lo que conlleva la transcripción del resto de genes adenovirales clonados en el plásmido pRcAd2 e insertados en el genoma de la célula. Sin embargo los niveles de proteínas virales no afectan de manera significativa a la estabilidad y viabilidad de las células, tal y como se ha comprobado tras su mantenimiento en cultivo durante un periodo superior a los 4 meses.
Para confirmar la integración del plásmido pRcAd2 en los clones GAd-I y GAd-6, se extrajo el ADN genómico con el sistema QIAmp DNA minikit (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este ADN se utilizó en ensayos de Nested-PCR para detectar la presencia de los genes adenovirales Illa, IV, el gen codificante de la proteasa y el gen que codifica la polimerasa viral. Los cebadores utilizados en esta detección fueron los mismos que los empleados en el apartado 3.1. Del mismo modo, las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en las mismas condiciones que las descritas en el apartado 3.1.
Los productos de amplificación se analizaron por electro foresis en geles de agarosa (1%) con tampón TAE IX (Tris Base 40 mM; ácido acético glacial 20 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) y visualizando el ADN mediante tinción con bromuro de etidio (0.5 μg/ml) (Fig. 10).
Para confirmar la síntesis de proteínas virales se diseñaron ensayos de inmunocitoquímica contra proteínas de la cápside viral. En este caso los clones GAdI y
GAd6 se incubaron durante 48 horas tanto en presencia como en ausencia del inductor
RU486 a una concentración 10"8M. Seguidamente se transfirieron 6x104 células a un portaobjeto de cultivo de cuatro celdas (BD Falcon Cultureslide; BD) y se procedió de igual modo que en el caso del clon pRc-1 (ejemplo 3.1). Como anticuerpo primario se utilizó el anticuerpo Mouse anti-adenovirus monoclonal antibody blend (Millipore) diluido en PBS (1 :75) y como anticuerpo secundario el anticuerpo Immunopure goat anti-mouse IgG-P er oxidase (Pierce Biotechnology) también diluido en PBS (1 :400).
La detección de coloración marrón en las células confirma la síntesis de proteínas de la cápside viral. Sin embargo, no se detectan diferencias claras entre las muestras incubadas en presencia del inductor RU486 y en ausencia del mismo. Por tanto, la expresión basal de las proteínas E l , la cual escapa al control del regulador transcripcional GAL4-hPR-p65, es suficiente para iniciar la expresión del resto de genes adenovirales integrados en el genoma de la célula.
Ejemplo 4: Producción y empaquetamiento de partículas infectivas del virus gutless KCZ.
Ejemplo 4.1 : Producción y empaquetamiento del virus KCZ en la línea empaquetadora pRc-1 mediante sistema de co-transfección con dos plásmidos. En el presente ejemplo, el clon seleccionado de la línea celular generada en el ejemplo 3.1 se utilizó para la producción y empaquetamiento de adeno virus de alta capacidad o adenovirus gutless. Este sistema de producción permite la obtención de extractos virales de adenovirus de alta capacidad sin necesidad de la utilización de un virus helper como complemento de los genes delecionados en el plásmido pRcAd2 e integrado de manera estable en el cromosoma de la célula eucariota. Para compensar la deficiencia de la región El, el sistema requiere la transfección de la línea celular, en cada uno de los pasos de producción, con el plásmido pGal4-2RU-SceI- El . Este plásmido de complementación expresa los genes EIa y EIb a partir del promotor inducible regulado por mifepristona (Fig. IA), lo que iniciará la expresión del resto de los genes adenovirales. Además, la replicación del genoma viral integrado sólo será posible en el momento de la expresión de la endonucleasa de restricción I-Scel, incluida en el plásmido p Gal4-2RU-SceI-El y también controlada a nivel transcripcional por el regulador GAL4-hPR-p65. La liberación del genoma viral y el inicio de su replicación permitirán la obtención de múltiples copias del mismo y, por tanto, suficientes niveles de proteínas virales para la encapsidación del adeno virus de alta capacidad y su purificación en un alto título.
Para determinar la capacidad del sistema de producir partículas infectivas, se incubaron 8xlO5 células del clon pRc-1, en placa de 20 cm2 a 37 0C, 5% CO2, hasta alcanzar una confluencia del 80%. Seguidamente las células se co-transfectaron con 5 μg del plásmido pGal4-2RU-SceI-El y 12 μg del vector gutless KCZ, digerido con el enzima de restricción Pmel para eliminar el origen de replicación, el gen de resistencia a la ampicilina y dejar los extremos ITR del vector libres. Como gen reportero, el vector KCZ lleva el gen de la β-galactosidasa bacteriana (lacZ).
En la co-transfección se empleó la lipofectamina como sistema de internalización del ADN en la célula eucariota. Así, el ADN de ambos plásmidos se diluyó previamente en 1 mi de medio sin suero OPTI-MEM (Gibco®). Para favorecer la formación de los complejos entre el ADN y lípidos catiónicos se añadió el reactivo Plus Reagent (Invitrogen) en una relación 1 :0.75. Tras 5 minutos de incubación a temperatura ambiente se añadieron 12 μl de Lipofectamina LTX (Invitrogen) y la mezcla se incubó de nuevo a temperatura ambiente durante 25 minutos. Seguidamente la dilución se añadió gota a gota sobre el medio de cultivo de las células (DMEM suplementado con suero fetal bovino 10%). Tras 4 horas de incubación a 37 0C, 5% CO2, el medio se sustituyó por medio DMEM fresco suplementado con suero fetal bovino 2% e inductor RU486 a una concentración 10"8M. Al no tener un efecto citopático claro, las células se incubaron entre 48 y 120 horas y, posteriormente, se recogieron a distintos tiempos en su propio medio. Tras una centrifugación a 1250 rpm durante 5 minutos, el precipitado se resuspendió en 200 μl de Tris-HCl 0.1M (pH 8.0) y las células fueron Usadas mediante tres ciclos de congelación/descongelación. Los restos celulares se centrifugaron y el título del sobrenadante se determinó por tinción X-gal de células 293 S infectadas con las preparaciones del vector KCZ. Para ello, las células 293S se crecieron en pocilios de 2 cm2 hasta alcanzar una confluencia del 80% en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino 2% y Na-Piruvato 1%. Seguidamente, el medio de cultivo se retiró y las células se infectaron con diluciones seriadas del extracto viral en DMEM + FBS 2% + Na-Piruvato 1%. Tras una incubación de 4 horas a 37 0C, 5% CO2, se añadió medio fresco y se continuó la incubación otras 48 horas. Finalmente las células se fijaron con una solución de glutaraldehido 0.5% en PBS durante 10 minutos y a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces en PBS y se tiñeron 4 horas a 37 0C con 1 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactopiranósido) en PBS suplementado con MgCl2 2OmM, K3Fe(CN6) 5mM y K4Fe(CN6) 5mM.
Según los resultados obtenidos, utilizando como línea de producción y empaquetamiento el clon pRc-1, la producción a Pase 0 alcanza sus niveles máximos a las 48-72 horas y están en torno a 7x105 unidades infectivas (ui)/ml (Fig. 11). En los sucesivos pases de amplificación, estos extractos se utilizarán para la infección de nuevas células pRc-1, previamente transfectadas con el plásmido pGal4-2RU-SceI-El. El sistema descrito permite, por tanto, la recuperación de extractos de adenovirus de alta capacidad libres de partículas infectivas derivadas de un virus helper, así como su obtención a altos niveles de producción.
Ejemplo 4.2: Producción y empaquetamiento del virus KCZ en células de los clones GAd-I y GAd-6. Sistema de transfección única con el vector de alta capacidad. El sistema de producción descrito a continuación utiliza como célula empaquetadora una línea modificada en la que se ha integrado de manera estable los polinucleótidos A2 y B, descritos en la invención (Fig. IA, IB). Salvo el polinucleótido correspondiente al vector adenoviral de alta capacidad, esta línea celular no requiere ningún elemento adicional (plásmido o virus helper) para la producción de partículas virales con capacidad infectiva.
El sistema integra los genes adenovirales necesarios para la encapsidación y replicación del adenovirus de alta capacidad (polinucleótido B), así como los genes de la región El y la endonucleasa de restricción I-Scel (polinucleótido A2), necesarios para la expresión controlada y a altos niveles de las proteínas virales anteriores, en una única célula.
Finalmente, el inicio del proceso de producción está regulado mediante la expresión de los genes de la región E l y la endonucleasa de restricción a partir de sus correspondientes promotores inducibles y el activador transcripcional GAL4-hPR-p65.
En el presente ej emplo de producción de partículas infectivas, las líneas empaquetadoras GAd-6 y GAd-I se transfectaron con 12 μg del vector gutless KCZ que codifica el gen reportero de la β-galactosidasa y que se ha linearizado previamente con el enzima de restricción Pmel, tal y como se indica en el ejemplo 4.1. La transfección con el vector de alta capacidad se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el sistema de producción con la línea empaquetadora pRc-1 (ejemplo 4.1).
Las células se incubaron entre 48 y 120 horas en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino 2% y en presencia del inductor RU486 a una concentración 10"8M.
Las células se recogieron a distintos tiempos, se centrifugaron a 1250 rpm durante 5 minutos y, finalmente, se resuspendieron en 200 μl de Tris-HCl 0.1M. Tras su lisis con tres ciclos de congelación/descongelación, los restos celulares se centrifugaron y el sobrenadante se tituló en la línea celular 293 S siguiendo el protocolo descrito en el ejemplo anterior.
Utilizando como línea de producción y empaquetamiento el clon GAd-I, los niveles de producción a Pase 0 fueron de hasta 1,7x106 unidades infectivas (ui/ml), mientras que para el clon GAd-6 se obtuvo una titulación de 3xlO6 ui/ml (Fig. 12).
Igual que en el ejemplo anterior, estos extractos se utilizarán para la infección de nuevas células empaquetadoras durante los sucesivos pases de amplificación. El sistema descrito en la presente realización se diferencia del sistema anterior de co-transfección con dos plásmidos (ejemplo 4.1) u otros sistemas de producción dependientes de helper, en la eliminación del proceso de transfección/infección de las células empaquetadoras en cada uno de los pasos de amplificación del virus. Esta característica reduce significativamente el tiempo de producción e incrementa el rendimiento de la misma. La otra gran ventaja es la ausencia de contaminaciones con virus helper, lo que simplifica el proceso de purificación del virus y permite la obtención de cantidades suficientes para su utilización en procedimientos de terapia génica en humanos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido o un vector de expresión que comprende:
(a) un primer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
(b) un segundo cásete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional codificado por el polinucleótido definido en (a).
2. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicación 1 donde el regulador transcripcional codificado por el cásete (a) es un regulador transcripcional activable.
3. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 2 donde el regulador transcripcional activable (a) está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio de unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el dominio de activación de NF-kappaB p65.
4. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la endonucleasa de restricción codificada por el cásete (b) es I-Scel.
5. Un polinucleótido o vector de expresión que comprende: (a) un primer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un regulador transcripcional;
(b) un segundo cásete de expresión que comprende a secuencia nucleotídica que codifica una endonucleasa de restricción, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) y
(c) un tercer cásete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína adenoviral seleccionada ElA o las proteínas adenovirales ElA y ElB, y que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a).
6. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 5 dónde el segundo y tercer cásete se transcriben en sentido contrario.
7. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 6 dónde la secuencia reguladora de la transcripción que controla el segundo y tercer cásete comparten el mismo sitio de unión para el regulador transcripcional (a).
8. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 donde el regulador transcripcional codificado por el cásete (a) es un regulador transcripcional activable.
9. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 8 donde el regulador transcripcional activable (a) está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio de unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el dominio de activación de NF-kappaB p65.
10. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 donde la endonucleasa de restricción codificada por el segundo cásete (b) es I- Scel.
11. Un polinucleótido o vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que comprende el genoma de un adenovirus recombinante que carece de, al menos, la secuencia ψ de empaquetamiento y la secuencia que codifica la proteína ElA o E1A/E1B, en donde dicha secuencia que comprende el genoma de un adenovirus recombinante se encuentra flanqueada por secuencias de reconocimiento específico para una endonucleasa de restricción.
12. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicación 11 que comprende además una secuencia nucleotídica de reconocimiento específico para una integrasa, donde la secuencia de reconocimiento para la integrasa se encuentra en posición 5 ' respecto de la primera secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción.
13. Polinucleótido o vector de expresión según la reivindicaciones 12 en donde la secuencia nucleotídica de reconocimiento para la integrasa es attB, específica para la integrasa PhiC31.
14. Polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones l i a 13 en donde las secuencias nucleotídicas de reconocimiento para la endonucleasa son específicas para la endonucleasa I-Scel.
15. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
16. Una célula hospedadora según la reivindicación 15 que comprende, adicionalmente, una secuencia que codifica la proteína adeno viral ElA y, opcionalmente, una secuencia que codifica la proteína adeno viral ElB.
17. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
18. Una célula hospedadora según la reivindicación 15 a 17 que comprende, adicionalmente, un polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 o que es obtenible mediante integración en una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, de un polinucleótido según la reivindicaciones 11 a 14.
19. Una célula según la reivindicación 18 en donde las dianas de restricción que flanquean el genoma viral derivadas del polinucleótido o vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 son reconocidas de forma específica por la endonucleasa de restricción que se encuentra bajo control operativo de una secuencia reguladora de la transcripción activable por el regulador transcripcional (a) derivado del polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
20. Un método para la producción de células adecuadas para la producción y empaquetamiento de partículas infectivas de un adenovirus de alta capacidad que comprende (i) transfectar una célula con un primer polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o con un vector que comprende dicho polinucleótido, o con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 o con un vector que comprende dicho polinucleótido y (ii) transfectar dicha célula con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14 o con un vector que comprende dicho polinucleótido en donde las etapas (i) y (ii) pueden llevarse a cabo en cualquier orden o de forma simultánea y en donde si las células se transfectan en la etapa (i) con un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, entonces se utilizan células que comprenden la secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB.
21. Método según la reivindicación 20 en donde las etapas (i) y/o (ii) incluyen una etapa adicional de selección en la que se seleccionan células que han integrado de forma estable el primer y/o el segundo polinucleótido en base a marcadores de selección presentes en los polinucleótidos utilizados en las etapas (i) y (ii).
22. Método según la reivindicación 20 ó 21 en donde el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 comprende adicionalmente una secuencia nucleotídica de reconocimiento específico para una integrasa y en donde la transfección realizada en la etapa (ii) incluye, adicionalmente, un polinucleótido que codifica una integrasa específica para dichas secuencias de reconocimiento.
23. Método según la reivindicación 22 en donde la integrasa específica es la integrasa del fago PhiC31 de Streptomyces y en donde el sitio de reconocimiento específico es un sitio attB.
24. Célula obtenible mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
25. Un sistema para la producción de adenovirus de alta capacidad que comprende
(a) una célula según cualquiera de las reivindicaciones 15 a l9 y 24 y
(b) un adenovirus de alta capacidad.
26. Método para la producción de vectores adenovirales de alta capacidad, que comprende las etapas de:
(a) transfectar o infectar una célula hospedadora con un polinucleótido que comprende el genoma del adenovirus de alta capacidad que se desea producir o con un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(b) cultivar las células transfectadas/infectadas en condiciones que permitan la replicación y empaquetamiento del adenovirus de alta capacidad,
(c) recuperar las partículas virales del adenovirus de alta capacidad y, opcionalmente, (d) repetir las etapas (a) a (c) en donde las partículas virales de alta capacidad obtenidas en la etapa (c) se utilizan para infección en la etapa (a) del siguiente ciclo, en donde la célula hospedadora usada en la etapa (a) se selecciona del grupo de
(i) una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y la secuencia que codifica la proteína adenoviral
ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB, en cuyo caso la etapa
(a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 11 a 14 y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido, (ii) una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 11 a 14 y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido, (iii) una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 4 y en donde la célula comprende una secuencia que codifica la proteína adeno viral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB,
(iv) una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en cuyo caso la etapa (a) va precedida de o se lleva a cabo simultáneamente con una etapa de transfección con un polinucleótido según las reivindicaciones 5 a 10 y/o un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido,
(v) una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un polinucleótido según las reivindicaciones l i a
14 y una secuencia que codifica la proteína adenoviral ElA y, opcionalmente, la proteína adenoviral ElB, y (vi) una célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 y un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.
27. Método según la reivindicación 26, donde el cultivo de la etapa (b) se realiza en presencia de un agente inductor específico del regulador transcripcional codificado por la secuencia nucleotídica comprendida en el polinucleótido según las reivindicaciones I a 4 y 5 a lθ.
28. Método según las reivindicación 27 en donde el regulador transcripcional está formado por el dominio de unión a ADN de GAL4, el dominio de unión a ligando del receptor humano de progesterona y por el dominio de activación de NF- kappaB p65 y donde el agente inductor es una antiprogestina sintética, preferiblemente mifepristona.
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