JP2004517610A - 自己再編成性ｄｎａベクター - Google Patents

Abstract

部位特異的ＤＮＡ改質酵素及び該酵素によって認識されるＤＮＡ標的をコードする複製可能ウイルスＤＮＡベクターについて開示する。該酵素は、該酵素を発現している細胞において、該ＤＮＡベクターを再編成型へと選択的に変換する。本発明は、さらに、組換えアデノウイルスＤＮＡを組み立てるための方法に関する。これらの方法は、制限部位とｃｏｓ部位とを含む第一の直鎖状化されたＤＮＡベクター、及び該制限部位とアデノウイルス核酸分子とｃｏｓ部位とを含む第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターを提供する段階；並びに組換えアデノウイルスＤＮＡが組み立てられるよう、該第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターと第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターとをライゲートさせる段階を含む。

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、ＤＮＡベクターに関する。
【０００２】
ＤＮＡウイルスに基づく哺乳動物細胞発現ベクターは、遺伝子治療用の遺伝子送達媒体として広く検討されている。この目的のために提唱された種々のＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルス、バキュロウイルス、エプスタインバーウイルス、及びヘルペス単純ウイルスがある。さらに、レトロウイルス及びパルボウイルスのような、ウイルスゲノムが二本鎖ＤＮＡとして存在する核内期を有するその他の比較的小型のウイルスが、遺伝子送達媒体として提唱されている。
【０００３】
例えば、アデノウイルス・ベクター（ＡｄＶ）は、広範な宿主域、培養中の活発な増殖、及び有糸分裂休止期の細胞への感染能に基づき、遺伝子送達の潜在能力を有することが認められている（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、アデノウイルスベクターの操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ）， １０９−１２８頁， Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第７巻，Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９９１；ＴｒａｐｎｅｌｌおよびＧｏｒｚｉｇｌｉａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：６１７−６２５，１９９４）。ＡｄＶは、ヘルパー細胞系である、アデノウイルス５型により形質転換された２９３ヒト胎児腎細胞系において繁殖しうる（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９９４）。２９３細胞は、後のウイルス遺伝子発現の主要な制御タンパク質であるウイルスＥ１遺伝子産物（Ｅ１ａ及びＥ１ｂ）を発現している。Ｅ１欠失ウイルスは、２９３細胞においては繁殖することができるが、他の細胞においては繁殖することができない。Ｅ１欠失ウイルスはウイルス遺伝子を発現させるための機構を欠いていると予想されるが、いくつかの研究は、細胞性Ｅ１様成分がウイルス遺伝子発現を刺激しうることを証明している（Ｉｍｐｅｒｉａｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：８６７−７４，１９８４；Ｏｎｃｌｅｒｃｑら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４５３３−７，１９８８；Ｓｐｅｒｇｅｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１０２１−３０，１９９２）。これらのウイルス遺伝子発現によって、形質導入された細胞は、細胞障害性Ｔ細胞応答の結果として比較的迅速に排除される（Ｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４３３−４２，１９９４；．Ｙａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１３７−４４，１９９６；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４−１５，１９９５）。
【０００４】
従って、ウイルス発現の痕跡の排除は、大きく注目されている。この目的のため欠失させられたウイルス遺伝子には、Ｅ４タンパク質（Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１３４３−５３，１９９５；Ｋｏｃｈａｎｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５７３１−６，１９９６；及びＹｅｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５５９−５６５，１９９６）、ＤＮＡ結合タンパク質（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２１：６１９６−６２００，１９９４；及びＧｏｒｚｉｇｌｉａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４１７３−８，１９９６）、ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９２６−３３，１９９８）、及びプレターミナル・プロテイン（ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｓｃｈａａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６８６−９１，１９９６）の遺伝子が含まれる。最も強引な手法は、全てのウイルス遺伝子を欠失させたヘルパーウイルス依存性ベクターの作出である（Ｈａｒｄｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１８４２−９，１９９７；Ｋｏｃｈａｎｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５７３１−６，１９９６；Ｌｉｅｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８９４４−６０，１９９６；Ｍｉｔａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３８５４−８，１９９５；及びＰａｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３５６５−１３５７０，１９９６）。これらのベクターは、高い収容力を有し、低い細胞性免疫応答を惹起し、インビボでの長期発現を示す（Ｍｏｒｓｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：７８６６−７１，１９９８）。しかしながら、ヘルパーウイルスを除去するためには塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配が必要であるため、ヒト臨床適用に必要な規模でこれらのウイルスを調達することは、極めて困難である。
【０００５】
発明の概要
一つの局面において、本発明は、部位特異的ＤＮＡ改質酵素と、該酵素によって認識されるＤＮＡ標的とをコードする複製可能ウイルスＤＮＡベクター（ここで、該酵素は、該酵素を発現している細胞において、該ＤＮＡベクターを再編成型へと選択的に変換するものである）を特徴とする。
【０００６】
好ましい態様において、再編成型は、自律複製性エピソームと直鎖状ＤＮＡ産物とを含む。他の好ましい態様において、ベクターはアデノウイルスＤＮＡを含む。
【０００７】
さらに他の好ましい態様において、ベクターは、（Ｃｒｅ又はＦＬＰの標的のような）遺伝学的に改変された組換え部位を含む。好ましくは、そのような組換え部位は、部位特異的ＤＮＡ改質酵素の認識配列を含む。
【０００８】
もう一つの好ましい態様において、部位特異的ＤＮＡ改質酵素は、（ＣｒｅもしくはＦＬＰのような）リコンビナーゼ又はインテグラーゼである。好ましくは、そのような酵素は、哺乳動物細胞において機能性である。ベクターの好ましい態様はまた、（エプスタインバーウイルス・レプリコンのような）哺乳動物細胞において機能する複製開始点も含む。さらに、ベクターは、典型的には、（タンパク質もしくはポリペプチド又はＲＮＡ産物をコードする治療用遺伝子のような）目的の遺伝子を含む。
【０００９】
もう一つの局面において、本発明は、組換えアデノウイルスＤＮＡを組み立てるための方法を特徴とする。その方法は一般的に以下の段階を含む：（ａ）制限部位とｃｏｓ部位とを含む第一の直鎖状化されたＤＮＡベクター、及び該制限部位とアデノウイルス核酸分子とｃｏｓ部位とを含む第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターを提供する段階；並びに（ｂ）組換えアデノウイルスＤＮＡが組み立てられるよう、第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターと第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターとをライゲートさせる段階。
【００１０】
好ましい態様において、第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターは、（そのようなポリペプチドを発現する宿主細胞に、抗生物質に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子のような）選択可能マーカーを含む。他の好ましい態様において、第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターは、アデノウイルス左末端逆方向末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）；目的の遺伝子；又はそれら両方を含む。さらに他の好ましい態様において、第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターは、選択可能マーカーを含む。好ましくは、第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターは、アデノウイルス右末端逆方向末端反復配列を含む。
【００１１】
本方法はさらに、組み立てられたアデノウイルスＤＮＡをファージへとパッケージングする段階、及び宿主細胞に感染させる段階をさらに含む。典型的には、第一及び第二の直鎖状化されたＤＮＡは、コスミド・ベクターＤＮＡを含む。さらに、そのようなアデノウイルスＤＮＡには、典型的には、（イントロン・エンドヌクレアーゼ（ｉｎｔｒｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）開裂部位のような）開裂部位が隣接している。
【００１２】
もう一つの局面において、本発明は、ドミナント・ネガティブ部位特異的ＤＮＡ改質酵素を発現する核酸分子を有するアデノウイルス産生細胞を特徴とする。好ましい態様において、部位特異的ＤＮＡ改質酵素は、ドミナント・ネガティブ・リコンビナーゼ（例えばＣｒｅＹ３２４ＣのようなＣｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼ）である。例示的なアデノウイルス産生細胞には、これらに限定はされないが、２９３ヒト胎児腎細胞、ｐｅｒ．Ｃ６細胞、及びＮ５２細胞が含まれる。
【００１３】
さらにもう一つの局面において、本発明は、部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第一の遺伝学的に改変されたシス作用性標的と；目的の遺伝子と；系列特異的遺伝子プロモーターと；部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第二の遺伝学的に改変されたシス作用性標的と；部位特異的ＤＮＡ改質酵素をコードする核酸分子とを、５’から３’の方向に含むベクターを特徴とする。
【００１４】
さらにもう一つの局面において、本発明は、部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第一の遺伝学的に改変されたシス作用性標的と；目的の遺伝子と；部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第二の遺伝学的に改変されたシス作用性標的を含む双方向性プロモーターと；部位特異的ＤＮＡ改質酵素をコードする核酸分子とを、５’から３’の方向に含むベクターを特徴とする。
【００１５】
関連する局面において、本発明は、患者において発現される本発明のベクターを、治療に有効な量、遺伝子治療を必要とする患者へ投与することを含む、遺伝子治療の方法を特徴とする。本発明は、さらに、本発明のベクターでトランスフェクトされた細胞集団に関する。
【００１６】
従って、本発明は、さらに、遺伝子治療のための、組換えウイルス・ベクターの使用又は組換えウイルス粒子の使用に関する。そのようなベクター及びウイルス粒子は、当技術分野において既知の標準的な方法に従い、患者から摘出された宿主細胞へとインビトロで導入されてもよいし、又は治療すべき体内へ直接的にインビボ導入されてもよい。
【００１７】
本発明は、薬学的見地から許容される媒体と組み合わされた、本発明に開示された方法に従い調製された組換えウイルス・ベクター又はウイルス粒子を治療に有効な量で含む薬学的組成物にも関する。そのような薬学的組成物は、一般的に利用されている技術に従い調製され、任意の既知の投与経路で、例えば全身的に（特に、静脈内、気管内、腹腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内、もしくは頭蓋内の経路で）、又はエアロゾルもしくは肺内投与によって投与されうる。
【００１８】
当業者であれば、遺伝子治療、化学療法、及び予防接種の目的のため本発明のベクター（特に、アデノウイルス・ベクター）を動物へと投与するための適当な方法を認識していると思われる。投与には複数の経路を使用してもよいが、一つの特定の経路は、他のものより迅速かつ効率的な反応を与えるかもしれない。薬学的に許容される賦形剤も、当業者に周知であり、容易に入手可能である。賦形剤の選択は、組換えベクター又は粒子を投与するために使用される特定の方法により、部分的には決定される。従って、本発明における使用に適した極めて多様な製剤が存在する。
【００１９】
「組換えＤＮＡベクター」とは、（目的の遺伝子のような）所望の配列と、（哺乳動物のような）特定の宿主生物における機能的に連結された配列の発現に必要な適切な（１個以上の）制御因子とを含有しているＤＮＡ配列を意味する。
【００２０】
「機能的に連結された」とは、遺伝子と（１個以上の）制御因子とが、適切な分子（例えば転写活性化タンパク質）が（１個以上の）制御配列と結合した場合に、遺伝子発現を可能にするよう接続されていることを意味する。
【００２１】
「制御因子」とは、核酸配列の発現のいくつかの局面を調節する遺伝因子を意味する。例えば、プロモーターは、機能的に連結されたコード領域の転写の開始を促進する制御因子である。他の遺伝制御因子には、これらに限定はされないが、スプライシング・シグナル、ポリアデニル化シグナル、及び終結シグナルが含まれる。例えば、真核生物の転写制御因子には、プロモーター因子及びエンハンサー因子が含まれる。プロモーター及びエンハンサーには、転写に関与する細胞タンパク質と直接的又は間接的に相互作用するＤＮＡ配列アレイが含まれる。プロモーター因子及びエンハンサー因子は、哺乳動物細胞の遺伝子を含む多様な真核生物起源、及びウイルスより単離されている。
【００２２】
「トランスフェクション」とは、真核細胞への外来ＤＮＡの導入を意味する。トランスフェクションは、典型的には、これらに限定はされないが、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、電気穿孔、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、及び微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、当技術分野において既知の多様な手段によって達成される。
【００２３】
「安定的にトランスフェクトされた」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入を意味する。一般に、哺乳動物細胞への導入遺伝子の移入及び発現は、現在では、当業者にとってルーチンの実務であり、遺伝子発現研究を実施するため、及び遺伝子治療において有用なベクターを作製するための主要なツールとなっている。
【００２４】
「目的の遺伝子」とは、宿主細胞における発現が望まれる、ベクターに挿入される遺伝子を意味する。目的の遺伝子には、これらに限定はされないが、治療的価値を有する遺伝子、及びレポーター遺伝子が含まれる。治療的機能を提供するタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む、多様なそのような遺伝子が、本発明において有用である。さらに、目的の遺伝子は、治療用遺伝子である場合、例えばアンチセンス・メッセージ又はリボザイム、スプライシングもしくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を与えるタンパク質をコードすることにより、ＲＮＡのレベルでその効果を付与することができる。又は、それは、例えば、ｍＲＮＡ蓄積速度の改変、ｍＲＮＡ輸送の改変、及び／又は転写後制御の変化を媒介することにより、細胞内の別の遺伝子の発現レベルに影響を与えることにより作用するタンパク質をコードすることができる（即ち、遺伝子発現が、転写の開始からプロセシングされたタンパク質の産生までの全ての段階を含むよう広義に考えられる場合）。
【００２５】
「レポーター遺伝子」とは、レポーター分子（酵素を含む）をコードする遺伝子配列を意味する。「レポーター分子」とは、任意の検出システムにおいて検出可能なものであり、これらに限定はされないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び酵素に基づく組織化学的アッセイ法）、蛍光系、放射性系、及び発光系を含む。例示的なレポーター遺伝子系には、大腸菌のベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子又はグルクロニダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が含まれ；当技術分野において既知であり、所望により利用されうるレポーター遺伝子は、その他にも存在する。
【００２６】
「導入遺伝子」とは、人為的に細胞に挿入され、その細胞から発生する生物のゲノムの一部となる任意のＤＮＡ片を意味する。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物にとって部分的又は完全に異種（即ち、外来性）である遺伝子を含んでいてもよく、又は生物の内因性遺伝子と同種の遺伝子であってもよい。
【００２７】
「トランスジェニック」とは、人為的に細胞に挿入され、その細胞から発生する生物のゲノムの一部となるＤＮＡ配列を含む任意の細胞を意味する。
【００２８】
「ポリペプチド」とは、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）に関わらず、任意のアミノ酸の鎖を意味する。
【００２９】
「に由来する」とは、天然に存在する配列から単離されたこと、又はその配列を有することを意味する（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成、又はそれらの組み合わせ）。
【００３０】
「核酸」とは、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を意味する。
【００３１】
「遺伝子」とは、タンパク質又はＲＮＡ分子をコードする任意の核酸配列を意味する。
【００３２】
「遺伝子産物」とは、（ｍＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡのような）ある遺伝子もしくはコード配列から転写された非翻訳ＲＮＡ分子、又はある遺伝子もしくはコード配列から転写されたｍＲＮＡ分子から翻訳されたポリペプチド鎖のいずれかを意味する。本発明に係る核酸は、完全又は部分的に合成により作成されてもよく、ゲノムＤＮＡもしくは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列を含んでいてもよく、又はＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの形態で提供されうる。
【００３３】
特許請求の範囲に記載された本発明は、多数の利点を示す。例えば、本出願人らの遺伝子治療媒体、特に組換えアデノウイルスに基づくものは、ベクターが宿主の免疫監視を活性化する傾向を最小限に抑え、それにより形質導入されたＤＮＡの残留性を最大にする。従って、本発明は、唯一のアデノウイルス・エンハンサーと潜在的に抗原性のウイルス・タンパク質をコードする配列との接続を断絶することにより、ウイルスによって送達された遺伝子の残留性を増強し、細胞性免疫応答を回避するよう設計された遺伝子送達ベクターの開発を容易にする。
【００３４】
以下により詳細に説明されるように、これが達成されるメカニズムは、他のいずれの従来の手法とも有意に異なっている。例えば、ベクターの免疫原性を減少させるためには、鍵となる遺伝子の除去、又は治療標的細胞における発現の防止のような何らかの介入が重要であることが広く認識されているが、多くの関連手法が、宿主指向的であり、一般的には、アデノウイルス抗原に対する寛容の選択的導入、又は時間的に制限された、もしくは抗原特異的な免疫系の失活（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）の誘導を目的とした類似のストラテジーに焦点をあてている。
【００３５】
さらに、形質導入されたＤＮＡの不十分な残留性は、一部には、形質導入された細胞の免疫学的拒絶、及びウイルスＤＮＡの複製能の欠如によると考えられる。この特質は、アデノウイルス・ベクターの設計に一般的に内在しているが、本出願人らの特許請求の範囲に記載された遺伝子治療媒体とは関連していない。
【００３６】
さらに、いくつかの現代のアデノウイルス・ベクターは、必須の複製因子をトランスで提供する特定の宿主細胞において繁殖するよう設計されている。これらのベクターは、典型的には、アデノウイルスＤＮＡ複製の誘導に必要とされるＥ１複合体の主要な制御タンパク質を発現する細胞系に基づく。Ｅ１遺伝子を発現している細胞（そのうち、最もよく研究されているのは、ヒト・アデノウイルス５型由来のＤＮＡにより形質転換されたヒト胎児腎細胞系（ＨＥＫ２９３、又は単に２９３と呼ばれる）である）においては、Ｅ１遺伝子が欠失しているウイルスがよく繁殖する。そのようなウイルスは、Ｅ１を発現していない細胞系においては繁殖せず、治療用遺伝子を送達すべき標的細胞において一般的にはよく繁殖しない。Ｅ１欠失アデノウイルス・ベクターで形質導入された細胞は、Ｅ１の非存在下ではウイルス遺伝子も高レベルに発現しない。しかしながら、そのようなベクターに保持されている弱い残存発現は、形質導入された細胞の破壊に寄与する細胞性免疫応答を誘導するのに十分であると考えられる。
【００３７】
さらに、特許請求の範囲に記載された遺伝子治療ベクターは、環状及び直鎖状のＤＮＡ産物が形成されるよう自己再編成することができるハイブリッド・ベクターである。直鎖状ＤＮＡは、アデノウイルス遺伝子を発現する能力を失っており、従って比較的低い免疫学的プロファイルを有する。そして、環状ＤＮＡは、哺乳動物プラスミドと同様の挙動を示し、目的の遺伝子をコードし、核内で自律複製によって残留する。
【００３８】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用を介したアデノウイルス・ベクターの環状化により、有益に、自己複製エピソーム上に目的の遺伝子（例えば、治療用遺伝子）が配置される。ベクターの環状化は、組織指向的に、例えば、リコンビナーゼＣｒｅの上流の合成肝特異的プロモーターの活性化の結果として起こる。環状化後、エピソーム内のＥＢＶレプリコンは、レポーター遺伝子発現、及びベクターＤＮＡ配列の存在の直接的なアッセイ法により検出されるような、改良された残留性を治療用遺伝子に付与する。
【００３９】
さらに、本発明は、ヘルパー・ウイルスの必要性を排除し、従ってその系の二つの潜在的な限界を回避する。第一に、Ｃｒｅリコンビナーゼの継続的な発現は、タンパク質の活性の直接的な結果として、又はその免疫原性を介して、宿主細胞に毒性をもたらす可能性がある。第二に、Ｃｒｅヘルパー・ウイルスは、それ自体が、感染宿主細胞の免疫学的排除に寄与する抗原性ウイルス・タンパク質を産生する可能性がある。対照的に、本明細書に開示された自己分解アデノウイルス／ＥＢＶベクター系は、有利なことに、ウイルス・タンパク質の代替起源を提供せず、Ｃｒｅ発現は再編成時に終結する。
【００４０】
さらに、本明細書に記載された発明は、ウイルス遺伝子制御及びウイルス増殖におけるエンハンサーの役割を分析するためのツールを提供する。
【００４１】
本発明は、基礎研究のための遺伝子形質導入ツールとしての魅力を増加させる、組換えアデノウイルスを作出するための便利な一般的な系も提供する。その系は、例えば、２個の従来のプラスミド・ベクター、及びλファージ・パッケージング段階を用いる。完全な組換えＡｄＶゲノムが、大腸菌において容易に増幅される単一のコスミドへと組み立てられる。ＩＴＲに隣接しているイントロン・エンドヌクレアーゼ認識配列の使用は、ウイルス産生を増強し、治療用遺伝子配列のｐＬＥＰシャトル・プラスミドへの挿入を単純化する。このベクター系の便利さによって、現在までに、２００個超の組換えウイルスの構築が促進された。
【００４２】
本発明の他の態様及び利点は、本発明の詳細な説明、及び特許請求の範囲より明らかとなると思われる。
【００４３】
詳細な説明
ＤＮＡベクター、例えば遺伝子治療ベクターの制御された自己再編成のための系が、本明細書に記載される。そのような制御された自己再編成は、治療効果に必要でないベクター遺伝子の不要な発現を防止し、かつ治療用遺伝子の標的細胞との安定的な会合を可能にする可能性を有している。
【００４４】
制御されたＤＮＡ再編成系の必須因子は、ＤＮＡ再編成を誘導する１個以上のタンパク質をコードする遺伝子、それらのタンパク質の活性又は量を制御する方法、及びそれらのタンパク質が作用する標的ＤＮＡ配列である。特に望ましいのは、ＤＮＡ再編成を引き起こすタンパク質の活性又は量を誘導する、薬物、ホルモン、又は熱もしくは放射線のような環境刺激の投与又は撤去のような、完全な生物に対して容易に実施されうる、タンパク質の活性又は量を制御する方法である。
【００４５】
特に望ましいのは、全ての成分が単一ベクターで送達されうる制御されたＤＮＡ再編成系である。これの例は、ＤＮＡ再編成のためのシス作用性配列、及びそれらの配列に作用する１個以上のタンパク質の両方を保持するウイルス、並びにそれらのタンパク質の活性又は量を調節する制御装置である。しかしながら、必ずしも、異なる要素が単一の核酸にコードされる必要はない。
【００４６】
このストラテジーの重要な因子は、ＤＮＡトポロジーの制御された再編成によるベクター遺伝子機能の妨害、制御された様式でのベクターＤＮＡからのプラスミド環の生成、及び制御された切り出しによるベクターＤＮＡからのエンハンサー因子又はプロモーター因子の除去である。部位特異的組換えによって生成した環状ＤＮＡが、何らかの形態での宿主ゲノムとの安定的な会合のためのメカニズム（本明細書においてはＥＢＶレプリコンによって付与される）を保有していることも重要である。他の態様において、環状ＤＮＡは、部位特異的組み込みによる宿主染色体への組み込みを指図する能力を保有していてもよい。宿主染色体への部位特異的組み込みは、環状中間体を経ることなく、直鎖状テンプレートに対する制御された部位特異的リコンビナーゼの作用によって生成してもよい。
【００４７】
２個の連結されていない分子、環状ＤＮＡ及び直鎖状ＤＮＡへと自己変換しうる、ハイブリッド・アデノウイルス・ベクターとして開始する、ある特定の自己再編成ベクターも、本明細書に記載される。この事象の後、直鎖状ＤＮＡ産物からは、２個の重要なシス作用性配列、即ちウイルスＤＮＡのウイルス・カプシドへの挿入に必要なパッケージング・シグナル、及びウイルスＤＮＡ中にコードされた他のプロモーターの発現を増加させるエンハンサーが欠失する。それにより、残りの直鎖状ＤＮＡは、アデノウイルス遺伝子を発現する能力を失い、より低い免疫学的プロフィールをベクターに賦与する。切り出し事象によって生成した環状ＤＮＡは、核内での自律複製によって残留する能力を有している哺乳動物細胞プラスミドである。この能力は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に由来する遺伝因子にコードされる。そのようなベクターの概略図は、図５に例示されている。
【００４８】
エプスタインバーウイルスは、伝染性単核球症の病原体であり、バーキット・リンパ腫、Ｂ細胞新生物の発生に関与していることが示されているヒト・ヘルペスウイルスであり、いくつかの型の鼻咽頭癌の素因であると考えられている。成人西洋集団のおよそ８５％が、ウイルス潜伏期複製開始点ＯｒｉＰに対して作用するＤＮＡ複製タンパク質であるエプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）の作用によって細胞内に維持される環状の潜伏型のウイルス・ゲノムを含有している残留性のＢ細胞集団を有している。ＥＢＮＡ１自体は、新生物を促進しないと考えられており；現在、ＥＢＶ関連新生物の発症に関しては、ＥＢＮＡ２タンパク質及びＬＭＰ（潜伏期膜タンパク質（ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ））の作用の方が重要視されている。
【００４９】
ＥＢＮＡ１遺伝子及びＯｒｉＰを保持する哺乳動物細胞プラスミドが作出された。非齧歯動物細胞において、これらのプラスミドは、細胞周期の推移による複製によって残留する。複数の転写単位が、これらのプラスミドから産出され、多様な遺伝子産物の制御された発現を可能にしうる。
【００５０】
図１Ａ及び１Ｂに示されている好ましいアデノウイルス・ベクターは、バクテリオファージＰ１ ｃｒｅタンパク質によって指図される部位特異的組換えに必要なシス作用性配列であるｌｏｘＰ部位が隣接している直鎖型ＥＢＶプラスミドである。ｃｒｅタンパク質及びｌｏｘＰ部位の両方を保持しているアデノウイルスを調製するためには、ベクターが２９３細胞において繁殖している間は、ｃｒｅタンパク質が発現されないことを保証することが必要である。ベクターの免疫学的プロフィールを低下させるため、ベクターがそのペイロードを標的細胞に送達し、ｃｒｅタンパク質がその機能を実行した後も、ｃｒｅタンパク質が発現されないことが望ましい。
【００５１】
これらの目的を達成するため、部位特異的リコンビナーゼの制御された発現の後、環状化するアデノウイルス染色体の作製のための、二つの一般的な手法が開発された。いずれの場合にも、ベクターは、２９３細胞におけるウイルスの産生を可能にし、かつ標的組織における再編成を誘導するリコンビナーゼの一過性発現を提供するよう改変されている。二つのストラテジーの主な違いは、リコンビナーゼの脱誘導（ｄｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）が達成される手段にある。
【００５２】
第一の手法では、アデノウイルス・ベクターは、転写活性化因子が染色体再編成後にリプレッサーに転換されるよう操作される。この手法を利用するベクターは、本明細書においてＡ型ベクター（図１Ａ）と呼ばれる。第二の手法においては、リコンビナーゼ・プロモーターが、染色体再編成後に再指向化される。第二の手法を利用するベクターは、Ｂ型ベクター（図１Ｂ）と呼ばれる。いずれの場合にも、直鎖状染色体が、環状エピソーム型、及び結果として生じる欠失直鎖型へと変換される。環状ＤＮＡは、エピソームの宿主有糸分裂との同調複製を可能にするエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）レプリコンを含有している（Ｒｅｉｓｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：１８２２−３２，１９８５；Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２−１５，１９８５）。直鎖状ＤＮＡからは、エンハンサー及びＥ１遺伝子が欠失している。
【００５３】
Ａ型ベクターストラテジーを利用した一つの自己制御遺伝子スイッチは、細菌トランスポゾンＴｎ１Ｏテトラサイクリン・リプレッサー（ｔｅｔＲ）遺伝子に基づき設計された。その天然の環境において、テトラサイクリンが存在しない場合には、ｔｅｔＲタンパク質が、テトラサイクリン耐性遺伝子の上流の特異的配列（ｔｅｔオペレーター配列）と結合し、遺伝子の転写を防止している。真核生物遺伝子制御にこのタンパク質を適応させるために、ｔｅｔＲと、強力な真核生物転写アクチベーター、ヘルペス単純ウイルスＶＰ１６タンパク質の活性部分との間で遺伝子融合が作出される。融合タンパク質は、基本プロモーター因子の上流の複数のｔｅｔオペレーター配列の挿入によって作出された合成プロモーターに対してその作用を及ぼす。ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質がその同族オペレーター配列と結合する場合には常に、この配置は、高レベルの遺伝子発現を可能にする。ｔｅｔＲタンパク質は、通常、テトラサイクリンの存在下ではオペレーターと結合しないため、この合成プロモーターの活性はテトラサイクリンの非存在下で高く、存在下では低い。
【００５４】
Ａ型ベクターの一例が、図１Ａに示されている。ハイブリッド・アデノウイルス中に存在するこの自己制御遺伝子発現カセットは、中央のｔｅｔＲ結合部位に、逆方向に方向付けられた基本プロモーター因子と隣接している、双方向性プロモーター因子からなる。一方の方向へは、プロモーターは、ｃｒｅタンパク質をコードする転写物の形成を指図し；もう一方の方向へは、プロモーターは、ｔｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質の形成を指図する。後者は、ｔｅｔＲ成分とＶＰ１６成分との間にｌｏｘＰ部位を保持している点で、従来の様式とは異なっている。テトラサイクリンが存在する場合、この遺伝子スイッチはサイレントである。図１Ａに示されるように、テトラサイクリンの非存在下で標的細胞へと導入された場合には、ｔｅｔＲ−ｌｏｘＰ−ＶＰ１６融合タンパク質が産生され、それが融合タンパク質及びｃｒｅタンパク質のさらなる産生を刺激する。次いで、ｃｒｅタンパク質が、ｔｅｔＲ−ｌｏｘＰ−ＶＰ１６コード配列内のｌｏｘＰ部位と、遠位ｌｏｘＰ部位との間の部位特異的組換えを促進するよう作用する。この組換えの結果として、融合タンパク質コード配列は崩壊し、プロモーターは、もはや、ｔｅｔＲ−ｌｏｘＰ−ＶＰ１６融合タンパク質の形成を指図せず、プロモーター上流因子との結合に関して不活性なｔｅｔＲ−ｌｏｘＰ−ＶＰ１６融合タンパク質を生成させ、それによりプロモーター活性を消滅させる。
【００５５】
図１Ａに示されるように、切り出された環状ＤＮＡ因子は、少なくとも２個の転写単位を含有している。さらに、他の転写単位又は内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）因子が、送達されたＤＮＡの残留性を拡大するか、目的の遺伝子の発現を制御するか、又は存在がもはや望ましくなくなった後の、形質導入された細胞の排斥を提供するのに有用な遺伝子産物の共発現を可能にするために使用されてもよい。さらに、環状遺伝子発現プラスミドの切り出しの後に残る直鎖状ＤＮＡは、ウイルス・パッケージング配列及びシス作用性エンハンサーの両方を欠いている。この直鎖状ＤＮＡ内には、遺伝子の正常なトポロジーを崩壊させ、発現をさらに妨害する、標的細胞内の残存ベクターＤＮＡの再編成を提供するために、付加的なｌｏｘＰ部位が置かれてもよい。
【００５６】
以下により詳細に記載されるＢ型ベクター設計ストラテジーを使用し、増殖期依存性の部位特異的組換えを行うことができる組換えアデノウイルス遺伝子送達系も構築された。
【００５７】
以下の実施例は、本発明を例示する目的で提示されるものであり、本発明を制限するものではない。
【００５８】
Ｂ 型ベクター−実験結果
Ｂ型ベクターを構築し、本発明の一般的な手法を実施するためのいくつかの実験例を、以下に記載する。
【００５９】
組換え ＡｄＶ の効率的な構築のためのツーコスミド系
組換えＡｄＶの生成を単純化し促進するため、ライゲーションによって単一プラスミド中に所望のＡｄＶゲノムを組み立てるための系を確立した（図２Ａ、２Ｂに示される）。その系は、２個の成分ベクター、左末端プラスミドｐＬＥＰ及び右末端プラスミドｐＲＥＰからなる。ｐＬＥＰ中の左末端Ａｄ配列（ｎｔ１〜３７６）は、ウイルス逆方向末端反復配列、シス作用性パッケージング配列、及びウイルス・エンハンサーを含む。本明細書に記載されるヌクレオチド（ｎｔ）位は、ＧｅｎＢａｎｋの野生型Ａｄ２配列（Ｊ０１９０１７）に対応する。Ａｄ２配列の後ろには、送達のための遺伝子発現単位、及びイントロン・エンドヌクレアーゼ（ＰＩ−ＰｓｐＩ）分解部位が続いている。右末端プラスミドは、Ｅ１遺伝子座の末端より右側のＡｄ２ゲノム（ｎｔ３５２７〜３５９３７）が後ろに続くＰＩ−ＰｓｐＩ部位を含有している。
【００６０】
ｐＬＥＰは、クローニングのための小さい扱いやすいベクターであるが、ｐＲＥＰははるかに大きく、操作された遺伝子を含有することは少ない。ｐＬＥＰ及びｐＲＥＰはいずれも、ＰＩ−ＰｓｐＩ分解部位での２個のプラスミドのライゲーションの後、インビトロ・パッケージングのための適切な長さの単一コスミドが生成するよう方向付けられたバクテリオファージλｃｏｓ部位を含有している。ｐＬＥＰは、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^ｒ）であり、ｐＲＥＰはアンピシリン耐性（Ａｍｐ^ｒ）であるため、両方のマーカーについての共選択により、組換え体を選択的に単離することが可能である。得られた組み立てられたコスミドにおいて、アデノウイルス配列には、イントロン・エンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩの分解部位が隣接している。Ｉ−ＣｅｕＩによる消化は、親コスミドから組換えＡｄＶゲノム全体を遊離させる（図２Ｂ参照）。
【００６１】
Ｅ１欠失を保持するＡｄＶ（ｐＲＥＰ７；配列番号：２）、Ｅ１及びＥ３の欠失を保持するＡｄＶ（ｐＲＥＰ８；配列番号：３）、又はＥ１、Ｅ３、及びＥ４の欠失を保持するＡｄＶ（ＰＲＥＰ１２；配列番号：４）の調製を可能にする、３つのクラスのｐＲＥＰを構築した。ｐＲＥＰ７（配列番号：２）は、Ａｄ２ゲノムのｎｔ３５２７〜３５９３７を含有しており、ｐＲＥＰ８（配列番号：３）はさらにＥ３領域の欠失を保持している（Δｎｔ２７９０１〜３０８４１）。ｐＲＥＰ１２（配列番号：４）からは、Ｅ４領域のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）１〜４（Δｎｔ３４１２１〜３５４６９、１３４８ｂｐ）が欠失している。これらのコスミドから生成したＡｄＶは、それぞれ５ｋｂ、８ｋｂ、及び１０ｋｂの挿入配列を受容可能なはずである。
【００６２】
これらの上記のベクターは、以下のように構築した。ｐＢＲ３２２内のアンピシリン耐性遺伝子に相当するＥｃｏＲＩ−ＢｓａＩ断片を欠失させ、合成アダプターに交換し、バクテリオファージλｃｏｓ部位を、唯一のＳｔｙＩ部位とＢｓｍＩ部位との間に挿入した。左末端ＩＴＲ（Ｌ．ＩＴＲ）、エンハンサー因子、及びカプシド形成シグナルを含有しているＡｄ２断片（ｎｔ１〜３７６）をＰＣＲ増幅したものを作出し、テトラサイクリン耐性左末端プラスミドｐＬＥＰを得るためにアダプターへと挿入した（図２Ａ、２Ｂ）。ＡｆｌＩＩ部位から右末端までのＡｄ２の右末端（ｎｔ３５２７〜３５９３７）を、ＰＣＲ増幅及び断片交換の複数の段階により、アンピシリン耐性コスミド・ベクターｐＡＣＫｒｒ３（配列番号：１）へと組み立てた。得られたコスミドを、ｐＲＥＰ７（配列番号：２）と名付けた。ベクターの収容力を拡大するために、ｐＲＥＰ７（配列番号：２）コスミドに、２つの欠失を組み込んだ。即ち、コスミドｐＲＥＰ８（配列番号：３）へはＥ３遺伝子欠失（ｎｔ２７９０１〜３０８４１、２８４０ｂｐ）を組み込み、ｐＲＥＰ１２（配列番号：４）へのＡｄ２領域のＥ４領域の１．３ｋｂの欠失（ｎｔ３４１２１〜３５４６９）を組み込んだ。
【００６３】
ＣＭＶ−ＧＦＰ発現単位を保持しているＡｄＶの構築の例は、図２に概説されている。ｐＬＥＰＣＭＶＧＦＰ（Ｔｅｔ^ｒ）をＰＩ−ＰｓｐＩで消化し、同酵素で消化されたｐＲＥＰ７（配列番号：２；ΔＥ１、Ａｍｐ^ｒ）とライゲートさせた。ライゲーション混合物を、λファージ抽出物（ＭａｘＰｌａｘラムダ・パッケージング抽出物、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてパッケージングし、パッケージングされたファージの一部を、組換え能欠損大腸菌宿主に感染させるために使用し、組み立てられたプラスミドをＡｍｐ／Ｔｅｔプレート上で選択した。ｐＲＥＰと融合したｐＬＥＰを含有している形質導入体を、２５μｇ／ｍｌアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ａｍｐ／Ｔｅｔ）を含んでいる寒天上で選択した。コロニーを選択し、ＤＮＡを単離した（Ｑｉａｇｅｎ）。ＤＮＡを、本明細書に記載されたようにして、制限分析、又は２９３細胞のトランスフェクションのいずれかに使用した。
【００６４】
図３Ａは、ｐＬＥＰ３ＣＭＶＧＦＰ／ｐＲＥＰ７ハイブリッド・コスミド、ｐＡｄ２−７ＣＭＶＧＦＰ ＤＮＡのＢｇｌＩＩ消化パターンの典型的な結果を示している。λファージ・インビトロ・パッケージングのための最小のサイズ（およそ４０ｋｂｐ）及び二重抗生物質選択のため、Ａｍｐ／Ｔｅｔプレート上で増殖するコロニーの大部分が、所望のハイブリッド・コスミドであり、所望でない再編成はほとんど見られなかった。本実施例においては、４個のｐＡｄ２−７ＣＭＶＧＦＰクローン全てが、推定配列から予測された消化パターンを示した。次いで、組換えＡｄＶゲノム全体を、Ｉ−ＣｅｕＩ消化によってコスミドから放出させた（図３Ｂ）。Ｉ−ＣｅｕＩ消化は、左ＩＴＲの左側に１０ヌクレオチド、右ＩＴＲの右側に８ヌクレオチドを残す。短い隣接配列は、２９３（ヒト胎児腎）細胞へＤＮＡをトランスフェクトした後、組換えウイルスの複製中に排除されることが報告されている（Ｈａｎａｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：３０２−３０９，１９８４）。
【００６５】
消化反応物は、以下のように、精製することなく、２９３細胞へとトランスフェクトさせられうる。Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｓｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）より得られた２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）が補足された完全ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１０ｃｍディッシュで培養し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気のインキュベーターで維持した。トランスフェクションの日に、細胞をおよそ５０％コンフルエンスにまで増殖させた。１０μｇのコスミドＤＮＡを、５０μｌの容量でＩ−ＣｅｕＩで消化した。反応混合物を、精製することなく、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，１０９−１２８頁，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（編），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第７巻，Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，１９９１）によって２９３細胞へとトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現に関して毎日検査した。ウイルスの繁殖、精製、プラーク・アッセイ法、及びウイルスＤＮＡ単離は、確立されたプロトコル（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ（前記））を使用して実施した。トランスフェクション後６日目に、通常、５〜３０ウイルス・プラーク／１０ｃｍディッシュ／１０μｇ ＤＮＡが認められ、それは、精製された野生型Ａｄ２ ＤＮＡでトランスフェクトされた２９３細胞について見出された３０〜５０プラーク／１０ｃｍディッシュ／１０μｇ ＤＮＡに匹敵していた。
【００６６】
組換えウイルス産生の効率を比較するため、相同性組換えによって類似のウイルスも生成させた。ｐＲＥＰ７（配列番号：２）２０μｇを、アデノウイルス・ゲノムの左末端及び緑色蛍光レポーター遺伝子をコードするプラスミド（ｐＬＩＴＲＥＦ１αＧＦＰ）と共に、２９３細胞へ共トランスフェクトした。ｐＬＩＴＲＥＦ１αＧＦＰは、Ａｄ２左末端ｎｔ１〜３７６、ＥＦ１αプロモーター／ＧＦＰ発現単位、及びｐＲＥＰ７（配列番号：２）内の同じ配列と重複するＡｄ２配列（３５２５〜８１２０）を含有していた。この重複断片は、相同性組換えのための領域として機能した。各共トランスフェクションを、デュプリケートで実施した。初期プラークは、出現までに比較的長い時間を要し（トランスフェクション後１４日目）、比較的少量であった（プレート１枚当たり０〜３個のプラーク）。
【００６７】
文献中のデータは、露出したＩＴＲ末端が効率的なウイルス産生にとって好都合であることを示唆している（Ｈａｎａｈａｎら（前記））。この効果の重要性を評価するために、ＡｄＶ ＩＴＲの両端に異なる制限部位が隣接しているＡｄＶコスミド、ｐＩＡｄＥＦ１αＧＦＰＢを構築した。ｐＩＡｄＥＦ１αＧＦＰＢ ＤＮＡを、右ＩＴＲを露出させるためＢｓａＢＩで消化するか、左ＩＴＲを露出させるためＩ−ＣｅｕＩで消化するか、又は両端を露出させるため２個の酵素を共に使用した。消化されたコスミドＤＮＡ試料を、２９３細胞へとトランスフェクトし、プラークを発生させた。ウイルスの繁殖、精製、プラーク・アッセイ法、及びウイルスＤＮＡ単離は、ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ．（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ（編），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第７巻．Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ．，１０９−１２８頁，１９９１）に記載されている確立されたプロトコルを使用して実施した。
【００６８】
トランスフェクション後１０日目に、ウイルスを採集し、ウイルス力価を決定した。ウイルス・ストックの平均力価（図４Ａ、４Ｂ）は、未消化ＤＮＡによるトランスフェクションでは１．３×１０^４ｐｆｕ／ｍｌ；ＢｓａＢＩ直鎖状化ＤＮＡ（右ＩＴＲ遊離型）では２．４×１０^５ｐｆｕ／ｍｌ；Ｉ−ＣｅｕＩ直鎖状化ＤＮＡ（左ＩＴＲ遊離型）では１．１×１０^５ｐｆｕ／ｍｌ；そしてＢｓａＢＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ二重消化ＤＮＡ（両ＩＴＲ遊離型）では２．７×１０^６ｐｆｕ／ｍｌであった。従って、各末端の遊離は、およそ１０倍、ウイルス生成効率を増加させた（図４Ａ、４Ｂ）。
【００６９】
自己再編成能を有する ＡｄＶ の構築
アデノウイルス遺伝子発現を減弱させ、導入遺伝子の残留性を改善するための一つの手法は、標的組織への送達時に、内部自発的再編成を行うことができるウイルスの作出である。この目的は、原則として、リコンビナーゼ作用のシス作用性標的を含有しているベクターにおける、部位特異的リコンビナーゼの制御された発現によって達成されうる。そのようなベクターの作出を可能にするためには、パッケージング細胞系における繁殖中は、リコンビナーゼ活性を抑制しなければならない。以下により詳細に記載されるように、リコンビナーゼ発現を調節するための系列特異的プロモーターの使用は、この目標を達成するために良好に使用された。
【００７０】
これの一例は、図５に示される。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現は、以下のように構築された肝特異的プロモーターによって調節された。ＡｐｏＥ／Ｃ遺伝子座のヒト肝調節領域（ｈｅｐａｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ）１及び２（ＨＣＲ１及び２）（Ａｌｌａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２６２７８−８１，１９９５；及びＤａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２５７７−８５，１９９５）を、２９３細胞ゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲによって増幅した。ＨＣＲ１断片及びＨＣＲ２断片の両方を増幅するために、以下のプライマーを使用した：ＨＣＲｔｏｐ−５’ｇｃｇｇａａｔｔｃｇｇｃｔｔｇｇｔｇａｃｔｔａｇａｇａａｃａｇａｇ ３’（配列番号：５）；ＨＣＲｂｏｔ−５’ｇｃｇｇｇａｔｃｃｔｔｇａａｃｃｃｇｇａｃｃｃｔｃｔｃａｃａｃｔａ ３’（配列番号：６）。増幅されたＰＣＲ断片（およそ０．３９ｋｂ）を、ｐＵＣ１９へとクローニングした。ＨＣＲ１及びＨＣＲ２の配列を、ジデオキシＤＮＡ配列決定によって確認した。２個の断片を、頭部−尾部方向で組み立て、合成基本ＴＡＴＡ因子と融合させ、ＧＦＰレポーター遺伝子を含有している親ｐＬＥＰベクターへとクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＬＥＰＨＣＲ１２ＧＦＰと命名した。合成肝特異的は、以下に証明されるように、２９３細胞におけるベクターの繁殖中のＣｒｅリコンビナーゼ発現を調節する手段を提供し、ＤＮＡの標的細胞への送達時の、直鎖状ベクターＤＮＡからのエンハンサーの削除の結果を試験することを可能にした。
【００７１】
２９３細胞においては、このプロモーターはサイレントであり、再編成を最小限に抑えウイルス染色体が繁殖することを可能にする。形成される再編成型ウイルスは、全て、パッケージング・シグナルを欠いており、従って、繁殖ベクターのプールから消失する。肝細胞においては、組織特異的プロモーターの作用によって、Ｃｒｅリコンビナーゼが誘導される。その結果起こるＣｒｅにより誘導される組換えが、環状エピソームを切り出し、目的の導入遺伝子の合成を指図するよう、肝特異的プロモーターの転写出力を再指向化する。残りの直鎖状断片は、エンハンサー及びパッケージング・シグナルを欠いたアデノウイルス・ゲノム、並びにプロモーター配列を欠いたＣｒｅ発現単位からなる。
【００７２】
ここで論じられた型においては、１個のｌｏｘＰ部位が、左ＩＴＲとエンハンサー／パッケージング配列との間の、Ａｄ２ゲノムのヌクレオチド１４７に位置しており、そして第二のｌｏｘＰが、スプライス・アクセプター配列の数塩基上流のイントロン内に置かれている。従って、ｌｏｘＰ部位は、得られる成熟転写物中には出現しない。再編成後に右末端直鎖状断片上に残るＣｒｅコード配列は、スプライス・ドナー又は上流プロモーター配列を欠くスプライス・アクセプターの下流に存在する。このことにより、切り出し後、Ｃｒｅの発現は効率的に終結する。
【００７３】
組換え前、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、ヒトＥＦ１α遺伝子の第一イントロンと融合したヒトＡｐｏＥ／Ｃ遺伝子座由来の肝遺伝子座調節因子（ｈｅｐａｔｉｃ ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）からなる合成プロモーター（ＨＣＲ１２と呼ばれる）の調節下にある。環状化後は、ＨＣＲ１２プロモーターが、導入遺伝子（この場合ＧＦＰ）の上流に存在し、イントロンの遠位セグメント（ｌｏｘＰ部位より先）が、アデノウイルス・エンハンサーを含有している。大腸菌におけるプラスミドの操作を促進するため、ヒトＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２イントロン（１１８ｂｐ）を、Ｃｒｅコード配列のヌクレオチド２３７に挿入し、細菌におけるＣｒｅ発現を抑制した。環状化したエピソームは、エプスタインバーウイルスの潜伏期複製開始点（ＯｒｉＰ）及びトランス作用性ＤＮＡ複製タンパク質（ＥＢＮＡ−１）を含有しており、従って、宿主有糸分裂周期と同調して自律複製することができる（Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２−８１５，１９８５）。
【００７４】
前記のツーコスミド系を使用して、自己分解成分を含有しているｐＬＥＰプラスミド、ｐＬＥＰ１ＢＨＣＲ１２を、ｐＲＥＰ８（配列番号：３；ΔＥ１ΔＥ３）とライゲートさせ、ｐＡｄＶＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶを作出した。後者をＩ−ＣｅｕＩで消化し、２９３細胞へとトランスフェクトした。ｐＡｄＶＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶからのプラークの出現は、おそらくは、２９３細胞における肝特異的プロモーターの基底発現の結果として、非再編成性ウイルスと比較して、遅かった（８日）。しかしながら、１０^１２名目（ｎｏｍｉｎａｌ）（吸光度測定）粒子／ｍｌというの高力価のウイルス・ストックが得られた。
【００７５】
標的細胞及び非標的細胞における再編成
切り出し効率を試験するため、ＡＴＣＣから得られたＨｅｐＧ２（肝細胞癌）細胞及びＨｅｌａ（子宮頚癌）細胞に、１，０００名目粒子／細胞という感染多重度（ｍｏｉ）でウイルスを感染させた。この力価は、細胞１個当たりおよそ１０プラーク形成単位に相当する。これらの実験のため、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅｌａ細胞を３５ｍｍディッシュに播き、本明細書に記載されたようなＤＭＥＭ／ＦＢＳ中でおよそ８０％コンフルエンスにまで培養した。細胞に、２時間、３７℃で、１ｍｌの容量で所望の多重度のウイルスを感染させた。インキュベーションの終了後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２ｍｌの培地中で培養した。低分子量のＤＮＡ及びＲＮＡの抽出のため、所望の時点で、平行して細胞を収集した。蛍光顕微鏡検（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＩＸ７０）又はマイクロタイター・プレート・リーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ ＩＩ）によってＧＦＰ発現について細胞を検査した後、染色体再編成の分析のためＤＮＡを抽出した。
【００７６】
染色体再編成のＤＮＡ分析は、以下のようにして実施した。Ｈｉｒｔ ＤＮＡ ５μｇを、ＢｇｌＩＩで消化し、プローブとして標識ＥＢＮＡ−１遺伝子断片を使用したＤＮＡブロット技術によって分析した（図６）。ＡｄＶの５’末端からＡｄＶ中の第一ＢｇｌＩＩ部位までより生成した非環状化ＡｄＶに由来するＢｇｌＩＩ断片は３１６２ｂｐである。２個のｌｏｘＰ部位から作出された環状化断片は、４９１５ｂｐというサイズを有している（図６Ａ）。濃度測定によって、感染後７２時間目、入力ゲノムの９５％以上が、ＨｅｐＧ２細胞において環状化されたことが明らかとなった。対照的に、低いが検出可能なレベルの環状化断片が、ＨｅｐＧ２細胞と同時に、ＨｅｐＧ２細胞に使用されたのと同じ感染多重度で感染させたＨｅｌａ細胞において可視化された（図６Ｂ）。
【００７７】
感染時（ｔ＝０、図６Ｂ）、ＤＮＡブロットによって検出された入力ウイルスＤＮＡの量は、同様のウイルス多重度（ｍｏｉ １，０００）が適用された場合、Ｈｅｌａ細胞よりもＨｅｐＧ２細胞の方が高かった。これは、おそらくはＨｅｌａ細胞表面上のコクサッキーウイルス−アデノウイルス受容体の比較的低いレベルの結果としての、２個の細胞型間のＡｄＶの吸着又は感染の効率の差を反映していると考えられる。ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅｌａ細胞への類似のウイルス・ゲノム入力を達成するため、Ｈｅｌａ細胞に、ＨｅｐＧ２細胞（ｍｏｉ １，０００）より１０倍多いウイルス（ｍｏｉおよそ１０，０００）を感染させた。エピソームＤＮＡ試料を抽出し、ブロッティングにより分析した。結果（図６Ｃ）は、比較可能な量のウイルス・ゲノムが核内に存在する場合には、両細胞型における環状化率が類似していることを示した。その後のＧＦＰ発現のレベルは、ＨｅＬａ細胞よりＨｅｐＧ２細胞の方がはるかに高いため（図７Ａ）、再編成を促進するためには極めて少量のＣｒｅリコンビナーゼで十分であり、リコンビナーゼ発現はＨｅｐＧ２細胞又はＨｅＬａ細胞のいずれかにおける再編成にとって律速性でない可能性が高い。
【００７８】
再編成が起こるまで、ＧＦＰ発現は検出され得ないため、ＧＦＰ陽性細胞の割合の測定は、生産的再編成の程度を評価するための単純な代替法を提供した。図７Ａは、形質導入されたＨｅｐＧ２細胞においては迅速にＧＦＰ発現が発生するが、ＨｅｐＧ２細胞で見られたものと比較可能な程度の環状化を可能にする条件（図６Ｃ）である１０倍高いｍｏｉで感染させたＨｅｌａ細胞においては、極少数のＧＦＰ陽性細胞しか検出され得ないことを示している。
【００７９】
２個の付加的な非肝細胞系、Ａ４３１（ヒト類表皮癌）及びＨＴ２９（ヒト大腸腺癌）に、Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶベクターを感染させることによっても、ＨＣＲ１２プロモーターの特異性を試験した。両細胞系は、ＡＴＣＣから得られ、本明細書に記載されたようなＤＭＥＭ／ＦＢＳを使用して培養された。これらの細胞においては、感染後７２時間目に、弱いＧＦＰシグナルを有する少数の細胞が検出された（図７Ｂ）。対照的に、第一世代ＡｄＶ、Ａｄ２ＣＭＶＧＦＰウイルスは、これらの非肝細胞に効率的に感染することができ（データは示していない）、このことから、低いＧＦＰシグナルが、これらの細胞へのＡｄＶの低い感染性によるのではないことが示された。
【００８０】
ＡｄＶゲノム再編成の有益性をさらに評価するため、初代ヒト肝細胞に、Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶベクターを感染させた。これらの実験のために、Ｄｒ．Ａｌｂｅｒｔ Ｅｄｇｅ（Ｄｉａｃｒｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｗｎ，ＭＡ）より譲り受けた初代ヒト肝細胞を、Ｇｕｎｓａｌｕｓら（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４８−５３，１９９７）により記載されたようにして単離し、培養し、アデノウイルスを感染させ、ＧＦＰ発現を分析した。図７Ｃに示されるように、ＧＦＰ発現は感染後７２時間目に容易に検出された。
【００８１】
再編成型 ＡｄＶ における減少したウイルス遺伝子発現
切り出し後、アデノウイルス主要エンハンサー／パッケージング・シグナルは、エピソームＤＮＡと隔離され、この重要なシス因子を含まないＡｄＶゲノムの残部を含有している直鎖状断片が生じる（図５）。エンハンサー欠失の影響を評価するため、ＰＣＲ増幅及び後期ウイルス遺伝子発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定を、以下のように実施した。
【００８２】
全ＲＮＡ ４μｇを、標準的なプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＭ−ＭＬＶ ＲＴを使用してｃＤＮＡへと逆転写した。各試料に由来するｃＤＮＡ １μｌを、その後のＰＣＲ反応において使用した。ＰＣＲプライマーは、アデノウイルス後期遺伝子の三成分リーダー配列を増幅するため設計された：ＴＰＬ１−５’ａｃｔ ｃｔｃ ｔｔｃ ｃｇｃ ａｔｃ ｇｃｔ ｇｔ ３’（配列番号：７）及びＴＰＬ２−５’ｃｔｔ ｇｃｇ ａｃｔ ｇｔｇ ａｃｔ ｇｇｔ ｔａｇ ３’（配列番号：８）。Ｈｉｒｔ ＤＮＡ試料中のＡｄＶゲノムの検出のため、ＤＮＡ １μｇを、ファイバー遺伝子中のアデノウイルスＤＮＡに特異的な以下のプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅において使用した：Ｆｉｂｅｒ１−５’ｃｃｇ ｃａｃ ｃｃａ ｃｔａ ｔｃｔ ｔｃａ ｔａ ３’（配列番号：９）及びＦｉｂｅｒ２−５’ｇｇｔ ｇｔｃ ｃａａ ａｇｇ ｔｔｃ ｇｇａ ｇａ ３’（配列番号：１０）。ＰＣＲ反応は、９５℃３０秒；５４℃３０秒；７２℃３０秒を３０サイクル実施した。増幅産物は、全て、２％アガロース・ゲル上で解析した。
【００８３】
定量的ＰＣＲについては、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）に基づく普遍的増幅及び検出の系を使用した（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）。共通リーディング配列（Ｚ配列、５’ａｃｔ ｇａａ ｃｃｔ ｇａｃ ｃｇｔ ａｃａ ３’）を、ＴＰＬ１プライマー及びＦｉｂｅｒ１プライマーに追加した。上記のＴＰＬ２プライマー及びＦｉｂｅｒ２プライマーを、定量的ＰＣＲ反応において使用した。各試料に由来するｃＤＮＡ １μｌ及びＨｉｒｔ ＤＮＡ １μｇを、アッセイにおいて使用した。ＰＣＲを、９６穴分光蛍光測定サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００）において実施した。ＰＣＲ反応中の鋳型分子の数は、直鎖状化されたプラスミドを鋳型として使用した標準曲線から計算された。
【００８４】
最後期アデノウイルス遺伝子転写物は、共通のおよそ２００ｂｐの三成分リーダー配列（ＴＰＬ）を共有しているため（ＡｋｕｓｊａｒｖｉおよびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：４２０−６，１９８１）、ＴＰＬ配列をウイルス遺伝子発現のマーカーとして選択した。ＨｅｐＧ２細胞に、段階的な感染多重度を使用して、第一世代ベクターＡｄ２ＣＭＶＧＦＰ及びＡｄ２ＨＣＲＧＦＰ、又は自己分解性ベクターＡｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶを感染させた。全細胞ＲＮＡ及び低分子量ＤＮＡを、Ｈｉｒｔ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５−９，１９６７）によって記載されたようにして平行して単離し、全ＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ溶液（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ．Ｉｎｃ）を使用して調製した。ＲＴ−ＰＣＲを、ｃＤＮＡ試料中のＴＰＬをコードするＲＮＡの量を定量するために実施した。ＡｄＶゲノムからの２０１ｂｐファイバー遺伝子断片のＰＣＲ増幅を、ＤＮＡ試料中のウイルス・ゲノムの量を検出するために使用した。３つの実験の代表的な結果を、図８Ａに示す。両方の第一世代アデノウイルスを使用して、細胞１個当たり１００個又は１０００個のウイルスを感染させた場合に、感染後７２時間目に、ＴＰＬ配列が検出された（上パネル）。
【００８５】
対照的に、自己分解性Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶ感染細胞においては、１００，０００／細胞というｍｏｉですら、ＴＰＬシグナルが検出されなかった。ＡｄＶファイバー遺伝子のＰＣＲ増幅によって、比較可能なｍｏｉで感染させた細胞におけるＡｄＶゲノムＤＮＡのレベルは比較可能であることが明らかとなった（図８Ａ、下パネル）。ＴＰＬシグナルが検出されたｃＤＮＡ試料を、リアルタイム蛍光ＰＣＲによってさらに解析した。対応するゲノムＤＮＡ試料も、各試料中に存在するＡｄＶゲノムの数を決定するため解析した。結果は、図８Ｂに要約されている。Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ感染細胞においてはＡｄＶゲノム１×１０^６個当たりおよそ１×１０^４個のＴＰＬが検出されたが、自己分解性Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶ感染細胞においてはＴＰＬが検出不可であった。これらの結果は、自己分解性ベクターの再編成によって誘発されたウイルス・エンハンサー配列の分離によって、アデノウイルス遺伝子発現が劇的に減少したことを示している。
【００８６】
Ａ 型及び Ｂ 型のベクター−実験結果
Ａ型及びＢ型のベクターの使用及び構築に関する本発明の一般的な手法をさらに例示する、さらなる実験例を、以下に示す。そのようなアデノウイルス・ベクターを生成させるため、標的組織における遺伝子発現にとって重要なＤＮＡ配列を、２個のｌｏｘＰ部位の間に置いた。第一のｌｏｘＰ部位は、Ａｄ２のＢｓｐＬＵ１１Ｉ−ＢｓｔＺ１７断片と交換して、Ａｄ２左末端逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）とエンハンサー配列との間に挿入した。プロモーター、目的の遺伝子、ポリアデニル化シグナル、ＥＢＶレプリコン、及び部位特異的リコンビナーゼ発現単位を含む標的遺伝子発現カセットを、Ｅ１遺伝子座の代わりに挿入した。
【００８７】
Ａ型アデノウイルス・ベクターにおいては、第二のｌｏｘＰ部位が、両方のコーディング・フレームを保存しつつ、ＴｅｔＲとＶＰ１６との間に置かれている（図１Ａ）。中央のテトラサイクリン・オペレーター部位（ＴｅｔＯ）の七量体（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１，１９９２）に２個の逆方向に方向付けられた基本因子が隣接している双方向性プロモーターは、合成ＴＡＴＡ因子からのＴｅｔＲ ｌｏｘＰ ＶＰ１６の発現を指図し、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＨＩＶ ＬＴＲ基本因子の上流の同じオペレーターの七量体によって調節される。
【００８８】
Ｂ型ウイルス（図１Ｂ）の場合には、第二のｌｏｘＰ部位を、本明細書に記載された転写刺激配列を含有しているＥｆ１α遺伝子の第一イントロンに挿入した。さらに、スプライス・アクセプター配列を、目的の遺伝子のコード配列の５’末端に付加した。細菌におけるプラスミド構築中の再編成を回避するため、本明細書に記載されるようなヒトＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２イントロンの付加（アミノ酸Ｑ７８とＡ７９との間）によって、Ｃｒｅリコンビナーゼ・コード配列を中断した。
【００８９】
コンパクトな ＥＢＶ レプリコンの設計
ＥＢＶ潜伏期複製開始点を利用するほとんどのプラスミドが、１０ｋｂ長を超えている。治療用遺伝子を受容するための組換えアデノウイルスＡ型又はＢ型ベクターの収容力を増加させるための手段を提供するため、エピソーム安定性を有するコンパクトなＥＢＶレプリコンを設計した。この目標のため、シス作用性複製開始点ＯｒｉＰ、及びトランス作用性複製タンパク質、エプスタインバーウイルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードする配列の両方に、欠失を生じさせた（図９Ａ）。エピソーム残留性は、隔離の失敗の結果としてエピソームを受け取らなかった娘細胞におけるＧＦＰの半減期が、およそ１．４日であると仮定して（Ｆｕｋｕｍｕｒａら、Ｃｅｌｌ ９４：７１５−７２５，１９９８）、時間の関数として緑色蛍光を保持している細胞の割合を決定することにより、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）保持被検プラスミドを用いて評価した。
【００９０】
ＥＢＮＡ−１は、ＧＡ反復配列と呼ばれるＧｌｙ残基及びＡｌａ残基から完全になる中央反復構造を含有している（図９Ａ）。この構造の欠失はほとんど影響を及ぼさないことが報告されているが、短いＯｒｉＰ及び短いＥＢＮＡ−１の両方（ＳｏｒｉＰ＋ＳＥＢＮＡ１）からなる欠失変異体を生成させたところ、それはプラスミド維持を効率的に支持しないことが見出された（細胞分裂１回当たりおよそ４０％の欠損）。短いＯｒｉＰが短いＥＢＮＡ−１と組み合わされたこの変異体を、４０ＧＡ反復配列を用いて再構築したものは、有意に高いプラスミド安定性を提供した（野生型の細胞分裂１回当たり１０％に対し、細胞分裂１回当たり２０％の欠損）（図９Ｂ）。ほとんどの標的組織が、比較的、有糸分裂休止状態であるため、このレベルの隔離の忠実度は、コンパクトなレプリコンに合理的な安定性を提供する。
【００９１】
Ｃｒｅ ドミナント・ネガティブ変異体及び ＦＬＰ ドミナント・ネガティブ変異体を発現する細胞系の作製
本明細書で論じられるように、リコンビナーゼ及び標的部位の両方を保持するアデノウイルスの作出に対する一つの障害は、ウイルス繁殖中のリコンビナーゼ活性の調節の困難さであった。効率的なリコンビナーゼ活性が標的細胞においては必要であるため、リコンビナーゼ活性は産生細胞系において最も良好に調律される。
【００９２】
ベクター設計の目的をより少ない制約で追求することが可能となるため、産生期にリコンビナーゼ活性を抑制するための非ベクター依存性の方法は魅力的である。原則として、ドミナント・ネガティブ・リコンビナーゼ変異体は、リコンビナーゼ活性の所望の拮抗を提供する。そのようなリコンビナーゼ・ドミナント・ネガティブ変異体を発現している細胞系を、以下のようにして作製した。
【００９３】
組換え機能が欠損しているが、二量体化機能は保持している可能性が高いドミナント・ネガティブＣｒｅ変異体を、既知の点変異体（Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：７８５−７９４，１９８７）より選択した（図１０Ａ〜Ｅ）。いくつかの変異体を、一過性共トランスフェクション・アッセイ法においてＢ型ベクター構築物（図１０Ｂのａｄ２２３９）のＣｒｅ活性を阻害する能力に関してスクリーニングした。これらの条件の下で、Ｃｒｅ活性は、再編成によって起こるＧＦＰの発現によって検出される。図１０Ｄ及び１０Ｅは、評価された点変異体、及び一過性共トランスフェクション・アッセイ法におけるそれらの相対活性を示している。増加する量の基質／Ｃｒｅプラスミドを、変異型と共に共トランスフェクトする希釈研究を実施し、その好都合なプロフィールに基づき、ＣｒｅＹ３２４Ｃと名付けられた１個の変異型リコンビナーゼを、さらなる開発のために選択した（図１０Ｄ）。
【００９４】
ＣｒｅＹ３２４Ｃの強い構成性発現は、Ｅｆ１αプロモーターの調節下では、安定的な細胞系を与えることができなかった。Ｅｆ１αプロモーターをテトラサイクリン制御プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９，１９９５）と交換すると、安定的なクローンが得られた。次いで、クローンを、Ｃｒｅ酵素活性の阻害能に関して試験し、細胞系＃１７と名付けられた１個のクローンを、さらなる実験のため選択した。Ｃｒｅを保持しており、Ｃｒｅにより指図される再編成を行い、ＧＦＰ転写単位（ａｄ２２３９）を作出することができるプラスミドを、＃１７細胞又は親２９３０Ｎ細胞へとトランスフェクトしたところ、２μＭドキシサイクリンの存在下での＃１７細胞におけるＧＦＰ発現は、対照のものより有意に低く（図１１）、Ｃｒｅ酵素活性が＃１７細胞において阻害されうることが示された。
【００９５】
ドミナント・ネガティブＣｒｅ変異体に加えて、ドミナント・ネガティブＦＬＰ変異体も、同定されうる。ＦＬＰは、Ｃｒｅリコンビナーゼと同じ部位特異的リコンビナーゼのファミリーに属している。ＦＲＴ部位の分解又はライゲーションのいずれかの欠陥を示す多数のＦＬＰ変異体が同定されている。ＦＲＴ部位（例えばＨ３０９Ｌ、Ｌ３１５Ｐ、Ｇ３２８Ｒ、Ｇ２８Ｅ、Ｎ３２９Ｄ、Ｓ３３６Ｙ、Ｓ３３６Ｆ、Ａ３３９Ｄ、Ｙ３４３Ｆ、及びＨ３４５Ｌ）の分解能が欠損している変異型ＦＬＰを、標準的な方法を使用して生成させる。次いで、野生型酵素を阻害する変異体を、上記の方法に従い、安定的な細胞系を生成させるために同定する。次いで、これら及びその他の細胞系（本明細書に記載される）を、ＦＲＴ／ＦＬＰ含有ウイルスの作製のために使用する。
【００９６】
前述のように、Ｃｒｅドミナント・ネガティブ変異体を発現している安定的な細胞系を作出することは、時として困難である。この困難さは、Ｃｒｅ変異体に限定されず、野生型のＣｒｅ酵素にも当てはまる。対照的に、ＦＬＰｅ（Ｂｕｃｋｈｏｌｚら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６５７−６６２，１９９８）と呼ばれる熱安定性ＦＬＰを安定的に発現している２９３細胞系は作出されており、このことから、ＦＬＰｅはＣｒｅタンパク質ほど細胞分裂抑制性でないことが示唆される。これを証明するため、２９３細胞に、Ｃｒｅ又はＦＬＰｅのいずれかを発現するプラスミドをトランスフェクトし、ピューロマイシン耐性コロニーを選択した。Ｃｒｅ又はＦＬＰの変異体を発現している安定的な細胞系を生成させるため、Ｃｒｅ又はＦＬＰの変異体及びピューロマイシン・アセチルトランスフェラーゼを発現する直鎖状化されたプラスミドを２９３ＴｅｔＯＮ細胞にトランスフェクトし、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。ピューロマイシン耐性コロニーを、ｃｒｅ基質プラスミド（ａｄ２２３９）又はｆｌｐ基質プラスミド（ａｄ２８７９）を使用してＣｒｅリコンビナーゼを阻害する能力に関して、さらに特徴決定した。表１は、ＦＬＰｅトランスフェクト細胞から選択されるピューロマイシン耐性コロニーの方が、Ｃｒｅトランスフェクト細胞から選択されるものよりも多いことを示している。この結果から、合理的に高いレベルのドミナント・ネガティブＦＬＰを発現している安定的な細胞系は、容易に作出されうると予想される。
【００９７】
【表１】２９３ 細胞をトランスフェクトするために Ｃｒｅ 発現プラスミド又は ＦＬＰｅ 発現プラスミドを使用した場合に形成されたピューロマイシン耐性コロニー

【００９８】
Ｃｒｅ又はＣｒｅドミナント・ネガティブ変異体も、ＦＬＰ活性を阻害することが見出された（表２）。従って、Ｃｒｅドミナント・ネガティブ変異体（例えば、ＣｒｅＹ３２４Ｃ）を安定的に発現している細胞系＃１７のような細胞系は、ＦＬＰ／ＦＲＴ保持アデノウイルスを作製するのに有用である。
【００９９】
【表２】Ｃｒｅ による ＦＬＰ 活性のトランス阻害

ＦＬＰ酵素活性は、ＦＬＰ基質プラスミドａｄ２８７９（図１９Ａ）を共トランスフェクトすることにより、ＧＦＰ強度によって測定した。ＧＦＰ強度は、ＩＰ ｌａｂソフトウェアを使用して定量した。
【０１００】
Ｃｒｅ リコンビナーゼ又は ＦＬＰ リコンビナーゼの転写制御
複製中のアデノウイルスにおける高レベルのプロモーター誘導可能性を達成することは、比較的困難であった。それは、一過性発現の場合に転写の正確な調節を達成することの困難さと類似している。一過性の場合の誘導比を増加させるための一つの手法は、自己制御性（フィード・フォワード）回路の使用である。テトラサイクリン依存性活性化に基づくそのような一つの系が、図１２に示されている。中央のテトラサイクリン・プロモーター・オペレーター部位（ＴｅｔＯ部位）の七量体を、２個の逆方向に方向付けられた基本ＴＡＴＡ因子の間に置いた。左側のＴＡＴＡは、ＴｅｔＲ ＤＮＡ結合ドメインとＶＰ１６転写アクチベーターとの間にｌｏｘＰ（又はＦＲＴ）部位が置かれているＴｅｔＲ−ＶＰ１６融合タンパク質の発現を調節する。右側のＴＡＴＡボックスは、リコンビナーゼ、Ｃｒｅ又は酵母ＦＬＰ酵素のいずれかの合成を指図する。テトラサイクリンの存在下では、プロモーターはいずれの方向にも減少した活性を有する。テトラサイクリンの除去により、ＴｅｔＲ−ＶＰ１６及びリコンビナーゼ両方の合成が誘導される（図１Ａ）。次いで、誘導されたリコンビナーゼは、ＶＰ１６が寄与する転写活性化からＴｅｔＲ ＤＮＡ結合因子を断絶させる。その後、存在するＴｅｔＲ−ＶＰ１６融合体が、ＴｅｔＲの転写を促進し、ＴｅｔＲが、ＴｅｔＯに関してＴｅｔＲ−ＶＰ１６と競合し、リコンビナーゼ転写の脱誘導をもたらす。
【０１０１】
モデル標的細胞系ＨｅｐＧ２を、この型のアデノウイルスを用いて試験した場合、環状化の効率は、２９３細胞で見られたものと比して低く（データは示していない）、そのことから、双方向性ＴｅｔＯプロモーターの細胞依存性が示された。これを修正するため、（ＣＭＶ早初期プロモーターに由来する）ＴｅｔＯ合成プロモーターのＴＡＴＡ因子を、ＨＩＶ ＬＴＲのものと交換した。ＨＩＶ基本プロモーターの異なる成分を保有する構築物を、２９３細胞及びＨｅｐＧ２細胞における強度及び制御に関して分析した（図１３Ａ）。試験された構築物のうち、ＨＩＶ ＬＴＲ ＴＡＴＡ因子及びＳｐｌ因子を保持している型（図１３ＡのＤ）が、２９３細胞における最小の基底発現（データは示していない）及びＨｅｐＧ２細胞における最大の誘導（図１３Ｂ）を示した。
【０１０２】
このプロモーターを使用して、図１３Ａに示されるような自己制御性構造Ｄを含有している構築物（ａｄ３４００）を設計し、テトラサイクリンの存在下及び非存在下でのＣｒｅ活性をアッセイした。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）発現単位が、２個のｌｏｘＰ部位及び転写終結配列により中断されているプラスミドａｄ２２６５（図１４）を、Ｃｒｅの基質として使用した。Ｃｒｅにより媒介される組換えは、ＢＦＰをプロモーターへと接合し、ＢＦＰ発現をもたらす。表３に示されるように、テトラサイクリンの存在下又は非存在下でＢＦＰ発現の強度には差が見い出されなかった。これの可能性のある一つの説明は、活性にとって必要なＣｒｅタンパク質は極めて少ないということである。この考えと一致して、標準的な免疫組織化学的技術は、完全に誘導された細胞におけるＣｒｅ酵素の存在を明らかにし得なかった（データは示していない）。
【０１０３】
【表３】Ａ 型構築物における Ｃｒｅ リコンビナーゼ活性の制御

Ｃｒｅ酵素活性は、基質プラスミド（ａｄ２２６５）を共トランスフェクトすることにより、リガンドであるタモキシフェンの存在下又は非存在下で測定した。ＢＦＰ強度（平均強度／視野）は、ＩＰ ｌａｂソフトウェアを使用して、デジタル・カメラによって捕捉された蛍光画像を解析することにより定量した。ＮＤとは、弱すぎたため、測定不能であった蛍光強度を指す。ｔｅｔ、テトラサイクリン；ｔａｍ、タモキシフェン。
【０１０４】
Ｃｒｅ 転写単位又は ＦＬＰ 転写単位からのポリ Ａ コンセンサス配列の欠失
ＦＬＰリコンビナーゼ又はＣｒｅリコンビナーゼの発現をさらに減少させるため、Ｃｒｅ転写単位又はＦＬＰ転写単位に由来するコンセンサス・ポリＡ付加シグナルを、ベクター構築物から欠失させ、遠位下流配列に依存するポリアデニル化を、例えば遺伝子ＩＸに残した。ポリＡシグナルを含む、又は含まないＢ型プロウイルス構築物を使用して、Ｃｒｅの活性を測定した。表４に示されるように、ポリＡシグナルを含まない構築物（ＡＤ２２９．３）は、ポリＡシグナルを保持している構築物（ＡＤ２３０．５）と比較して、有意なＧＦＰ強度の減少を示した。類似の構造のＦＬＰｅ構築物を評価した場合、類似の結果が見い出された（データは示していない）。これらのデータは、ポリアデニル化を減弱させることにより、Ｃｒｅ及びＦＬＰｅの酵素活性レベルが調整されうることを示している。
【０１０５】
【表４】Ｃｒｅ 発現単位からのポリ Ａ 付加シグナルの欠失の、 Ｃｒｅ 酵素活性レベルに対する効果

【０１０６】
Ｃｒｅ リコンビナーゼ活性の転写後制御
Ｃｒｅリコンビナーゼ活性の転写後調節メカニズムも評価した。Ｃｒｅと、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）との間の翻訳融合は、エストロゲンによって（Ｆｅｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ ９３：１０８８７−１０８９０，１９９６；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１，１９９４）、又は変異型エストロゲン受容体の場合には（Ｍｅｔｚｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：６９９１−６９９５，１９９５）、部分的アンタゴニストであるタモキシフェンによって制御されることが報告されている。
【０１０７】
ＨＩＶ ＬＴＲに基づく自己制御Ｔｅｔ系と組み合わされたリガンド依存性リコンビナーゼ（表３のａｄ４３９４）の使用は、ａｄ２２６５再編成アッセイ法を使用してアッセイされるように、テトラサイクリンによる小さな程度の制御は可能にしたが、リガンドによる制御は可能にしなかった（表３）。この所見の一つの解釈は、エストロゲン受容体ＬＢＤのＣｒｅとの融合は、リコンビナーゼ活性の中程度の調節しか提供しないが、転写制御が測定されうるようなレベルにまで酵素の効力を減弱させるというものである。
【０１０８】
リコンビナーゼ活性の調節を増加させるため、ＬＢＤをＣｒｅのＮ末端及びＣ末端の両方に融合させ（ＬＢＤ−Ｃｒｅ−ＬＢＤ）、Ａ型ベクター及びＢ型ベクター両方のコード配列へと挿入した。Ａ型のＬＢＤ−Ｃｒｅ−ＬＢＤ構築物を２９３細胞へトランスフェクトした場合、それはリガンドの存在下ですら有意なＣｒｅ酵素活性を示さなかった（表３）。この結果より、Ｎ末端又は末端の伸長によってＣｒｅリコンビナーゼ活性が減弱することが確認された。
【０１０９】
ＬＢＤ融合Ｃｒｅ酵素をＢ型ベクター環境においてアッセイした場合には、ＬＢＤ−Ｃｒｅ−ＬＢＤ融合体（ｐｋ８−ａｄ４６２６）のみが、Ｃｒｅ酵素活性のリガンド依存性制御を示した（表５）。リガンドの非存在下でのＬＢＤ−Ｃｒｅ−ＬＢＤにおける減弱したＣｒｅ活性は、Ｃｒｅアッセイ法の上限未満にまで低下するのに十分なほど低い。
【０１１０】
【表５】Ｂ 型プロウイルスの Ｃｒｅ 酵素活性

Ｃｒｅ酵素活性は、リガンドであるタモキシフェンの存在下又は非存在下で測定した。ＧＦＰ強度は、ＩＰ ｌａｂソフトウェアを使用して定量した。ｔａｍ、タモキシフェン。
【０１１１】
この概念と一致して、２個のＬＢＤを保持している構築物ｐｋ８−ａｄ４６２６のみが、トランスフェクションによってウイルス（ＡＤ１２１．５）を産生し、２９３細胞において繁殖することができた。１個のＬＢＤを保持しているｐｋ８−ａｄ４３３２は、（同族ＤＮＡのトランスフェクションの後）初期にはウイルス（ＡＤ１００．９）を産生したが、２９３細胞において繁殖することはできなかった（表６）。野生型Ｃｒｅの場合には、トランスフェクションによって２９３細胞においてウイルスは産生されなかった。
【０１１２】
【表６】Ｂ 型アデノウイルスの産生及び繁殖

【０１１３】
ＡＤ１００．９ウイルスは、ドミナント・ネガティブＣｒｅ Ｙ３２４Ｃを発現している＃１７細胞において繁殖することができ、そのことから、Ｃｒｅ活性の調整が、ウイルスの産生にとって重要であることが証明された。従って、２つの異なる配置で、２個のｌｏｘＰ部位及びＣｒｅの両方を保持しているアデノウイルスを、Ｃｒｅ活性を調節することにより作製した。
【０１１４】
培養中のウイルス再編成
組織培養細胞におけるＣｒｅ／ｌｏｘＰにより媒介されるアデノウイルスの再編成も解析した。図１５Ａに示されるように、ＡＤ１２１．５ウイルスは、リガンドであるエストロゲンの存在下でＧＦＰ発現の有意な増加を示し、そのことから、Ｃｒｅリコンビナーゼによるウイルスの再編成の成功が示唆された。非染色体ＤＮＡ（Ｈｉｒｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：１４１−１４４，１９６９）を、細胞から作成し、ＤＮＡブロット分析によって分析したところ、エストロゲン処理細胞に由来するウイルスＤＮＡは、主として環状の形態（図１５ＢのＣ）で同定され、エストロゲンで処理されていない細胞に由来するＤＮＡは、主として直鎖状の形態（図１５ＢのＬ）で見い出された。
【０１１５】
自己再編成性ウイルスの効率をインビボで評価するため、＃１７細胞におけるＡＤ１０２．７（ＬＢＤ−Ｃｒｅを保持するＡ型ウイルス、ｐｋ８−ａｄ４３９４）の高力価ストックを、調製し、ＣｓＣｌ勾配超遠心分離によって精製した。ＡＤ１０２．７の力価（ＯＤにより４〜６×１０^１２／ｍｌ）は、ＣｒｅもｌｏｘＰ部位も保持していない対照ウイルスのもの（ＯＤにより２〜４×１０^１２／ｍｌ）と匹敵するか、又はそれをわずかに超えていた。インビボのウイルス再編成の効率、及びそのような再編成がリガンドの存在に依存するか否かを決定するため、ＡＤ１０２．７ウイルス（光学密度によって決定されるような４×１０^１１ｐｆｕ／マウス）を、以下のようにして、７日間、媒体単独又は１１０μｇ／日のタモキシフェンで前処理されたＲａｇ−２マウスへ、尾静脈から注射した。
【０１１６】
Ｒａｇ−２マウスに、ＰＢＳ（モック）、又は４×１０^１１アデノウイルス粒子（ＯＤ_２６０により決定）のＡ型ウイルス、ＡＤ１０２．７のいずれかを、尾静脈から注射した。注射後の様々な時点で、動物を屠殺し、肝組織を摘出し、ドライアイス上で急速凍結させた。動物組織におけるＧＦＰ発現を可視化するため、マウスを安楽死させ、０．２％グルタルアルデヒドを含有している４％パラホルムアルデヒドで心臓内を灌流し（Ｋａｆｒｉら、Ｎａｔｌ．Ｇｅｎｅｔ．１７：３１４−３１７，１９９７）、肝組織を摘出し、３０％ショ糖を含有している灌流緩衝液で室温で一夜固定した。固定された組織を、連続的に切開し、共焦点走査型レーザー顕微鏡下で観察した。リガンドにより制御されたリコンビナーゼの応答を評価する実験では、アデノウイルス注入前に７日間、媒体（植物油）単独、又は１１０μｇ／日のタモキシフェンをマウスに注射した。
【０１１７】
これらの動物に由来する肝組織を、注射後２．５時間目（注入後にとられた最も早い時点）に採集し、およそ２５０ｍｇの凍結肝組織からＨｉｒｔ ＤＮＡを調製し、ブロット分析によって分析した。図１６に示されるように、アデノウイルスＤＮＡの大半は、未処理マウスの組織においても、タモキシフェン処理マウスの組織においても環状の形態で見い出された。これらのデータより、組織中に存在するＣｒｅ酵素活性は、リガンドの非存在下ですら、ウイルスの効率的な自己再編成にとって十分であったと結論付けることができる。予想通り、ＡＤ１０２．７を注射されたＲａｇ２マウスに由来する肝組織は、ＧＦＰの強い発現を示した（図１７）。
【０１１８】
従来の手段によって高力価で２９３細胞において効率的に産生されたＡＤ１０２．７ウイルスが、インビボで効率的に自己再編成しうることの証明は、潜在的により安全なアデノウイルス遺伝子治療ベクターが作製されうるという概念の立証を提供する。
【０１１９】
ＦＲＴ 及び ＦＬＰ リコンビナーゼの両方を保持しているアデノウイルス
ＦＲＴ（ＦＬＰリコンビナーゼ認識部位）及びＦＬＰリコンビナーゼの両方を保持しているＡ型及びＢ型のプロウイルス構築物も、作製した。これらのウイルスの構造は、ｌｏｘＰ部位がＦＲＴ部位に交換されており、Ｃｒｅコード配列が、ＦＬＰコード配列に交換されていることを除き、ｌｏｘＰ／Ｃｒｅ保持ウイルスのものと類似している（図１８Ａ、１８Ｂ）。
【０１２０】
低温におけるウイルス産生
マーカーとしてＧＦＰ発現を使用して、Ｅｆ１αプロモーターの温度依存性も調査した。表７に示されるように、ＥＦ１αプロモーター活性は、３７℃又は３９℃と比較して３２℃においては強く減少する。Ｅｆ１αプロモーターの温度感受性を、まず３７℃でＤＮＡトランスフェクション（ｐｋ８−ａｄ３３０２）によりウイルスを産生させた後、３２℃でＦＬＰを保持しているＢ型アデノウイルスを繁殖させるために使用した。これらのウイルス（ＡＤ４１．４）を感染させたＨｅｐＧ２細胞は、強いＧＦＰ発現を示したが、ＧＦＰ発現ウイルスと比較するとおよそ１２ｈｒ遅れており、そのことから、ＦＬＰリコンビナーゼ活性が、３７℃では損なわれることが示唆された。ＦＬＰリコンビナーゼの活性を改善するため、Ｂｕｃｈｈｏｌｚら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６５７−６６２，１９９８）によって記載された熱安定性ＦＬＰ（「ＦＬＰｅ」と呼ばれる）を使用して、ウイルス構築物を作出した。
【０１２１】
【表７】ＧＦＰ 強度により示されるような ＥＦ１ αプロモーター強度に対する温度の効果

ＧＦＰ強度は、蛍光リーダーを使用して測定した。
【０１２２】
ＦＬＰ基質プラスミド（ａｄ２８７９、図１９Ａ）を使用した２９３細胞におけるＦＬＰ及びＦＬＰｅの活性を比較した。表８に示されるように、これらの条件の下で、ＦＬＰｅはＦＬＰより有意に活性が高い。
【０１２３】
【表８】ＦＬＰｅ は ＦＬＰ リコンビナーゼより有意に活性が高い

ＦＬＰｅ又はＦＬＰのいずれかをコードするプラスミドを、ＦＬＰ基質プラスミド（図１９Ａ）と共に２９３細胞へ共トランスフェクトした。各トランスフェクションのＧＦＰ強度を、ＩＰ ｌａｂプログラムを使用して測定した。
【０１２４】
さらに、エストロゲン受容体の変異型に由来するリガンド結合ドメインを、ＦＬＰｅコード配列のＣ末端と融合させることにより、タモキシフェンにより制御されるＦＬＰｅを作出した（ＦＬＰｅ−ＬＢＤ）。ＦＬＰｅ−ＬＢＤは、リガンドであるタモキシフェンによって制御されることが見出された（表９）。ＦＬＰ活性は、Ｃ末端融合によって保持されたが（ＦＬＰ−ＬＢＤ）、ＦＬＰのＮ末端への短いオリゴペプチド・タグの付加は、その活性を消滅させた（データは示していない）。
【０１２５】
【表９】ＧＦＰ 強度によって決定されるようなタモキシフェンによる ＦＬＰｅ の制御

ＦＬＰｅにより媒介された組換えに起因するＧＦＰ強度を、蛍光顕微鏡を使用して測定した。ｔａｍ、２μｇ／ｍｌタモキシフェン。
【０１２６】
アンチセンス ＦＬＰｅ による ＦＬＰｅ 活性の阻害
ＦＬＰ酵素活性を阻害するため、アンチセンス手法も利用した。この手法により、アンチセンス転写物へのオープン・リーディング・フレームの組み込みが、転写物を安定化し、アンチセンス活性を強化するであろうという概念を検証した。二つの手法を利用した。一つの手法では、ＢＦＰコード配列を、アンチＦＬＰｅの上流に置いた。第二の手法では、アンチＦＬＰｅを、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）及びＢＦＰコード配列の上流に置いた（図２０）。これらの構築物のＦＬＰｅ阻害能を、ＦＬＰ基質プラスミドａｄ２８７９（図１９Ａ）を使用してアッセイした。その結果を図２１に示す。これらのデータは、アンチセンスＦＬＰｅが、ＢＦＰと融合した場合、ＦＬＰｅ機能を阻害する効果がより高くなることを示している。なお、ＢＦＰは、他の任意の安定的なタンパク質と交換されうると推測される。
【０１２７】
その他の自己再編成性アデノウイルス
ｌｏｘＰ／ＦＬＰ 及び ＦＲＴ／Ｃｒｅ を保持しているアデノウイルスによる混合感染
産生細胞においては再編成され得ず、標的細胞において再編成されうるアデノウイルスを作製する手段の一つは、各々が１個のリコンビナーゼと、他方のリコンビナーゼの標的配列とを保持する、２個の別個のウイルスを工作することである。この系を試験するため、ＣｒｅリコンビナーゼとＦＲＴ部位とを保持しているＢ型アデノウイルス構築物、及びＦＬＰｅリコンビナーゼとｌｏｘＰ部位とを保持しているＢ型アデノウイルス構築物を作出した（図２２）。両ウイルスを感染させた標的細胞においては、Ｃｒｅが、ＦＬＰウイルス内の２個のｌｏｘＰ部位間の組換えを触媒し、ＦＬＰが、Ｃｒｅウイルス内のＦＲＴにより媒介される組換えを実施し、２個の環状プラスミドが生じる。ｌｏｘＰウイルスはＢＦＰを含有しており、ＦＲＴウイルスはＧＦＰを含有していた。２個の構築物を共トランスフェクトした後、ＧＦＰ及びＢＦＰの蛍光強度を測定したところ、（Ｃｒｅ酵素によって媒介される）ＢＦＰ発現が、（ＦＬＰ酵素によって媒介される）ＧＦＰ発現より大きいことが明らかとなり、Ｃｒｅ酵素がＦＬＰより効率的に機能することが示唆された。
【０１２８】
従って、両方のウイルス・ベクターを完全に環状化させるためには、標的細胞におけるこれらの２個のリコンビナーゼ活性のバランスを保つ必要がある。Ｃｒｅ／ＦＬＰ活性を調整するための例示的な方法には、（プロモーター強度の変動、及び／又はポリＡ付加シグナル配列の有無のような）転写制御、及び（ＦＬＰのＦＬＰｅへの変化、及びＬＢＤ融合タンパク質の作成のような）翻訳及び／又は翻訳後制御、並びに（２個のウイルスの比率の変化のような）ウイルス産生後調節の使用が含まれる。
【０１２９】
一つの手法において、ＣｒｅをＣｒｅ−ＬＢＤに交換し、ＦＬＰをＦＬＰｅに交換した。再編成産物の同定を改善するため、Ｃｒｅ組換えのマーカーとしてのＢＦＰをＲＦＰに交換した。表１０に示されるように、エストロゲンの存在下で、ＧＦＰ（ＦＬＰｅ媒介）及びＲＦＰ（Ｃｒｅ媒介）の発現は類似していた。
【０１３０】
【表１０】Ｃｒｅ−ＬＢＤ／ＦＲＴ （ ＧＦＰ ）又は ＦＬＰｅ／ｌｏｘＰ （ ＲＦＰ ）を保持している Ｂ 型プロウイルス構築物で共トランスフェクトされた細胞の ＲＦＰ 及び ＧＦＰ の発現

【０１３１】
最適な比率でＣｒｅ保持ウイルス及びＦＬＰ保持ウイルスの両方が各標的細胞に感染することを保証するため、これらのウイルスを感染前にクロスリンクさせることができる。例えば、Ｃｒｅ保持ウイルスをビオチンで標識し、ＦＬＰ保持ウイルスをアビジンで標識する。二種類の修飾型ウイルスを混合することにより、所望の割合のウイルス複合体が生成する。ビオチン化又はアビジン化は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＴＦＰ−ＰＥＯビオチン（Ｐｅａｒｃｅ）、及びＥＺ−Ｌｉｎｋマレイミド活性化ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｅａｒｃｅ）のような市販されている試薬を使用して実施されうる。ビオチン／ウイルス及びアビジン／ウイルスの程度は、ウイルスの生存可能性が保証され、かつ混合物中の２個のウイルスの最適な比率が得られるよう、経験的に決定されると思われる。最適な比率は、標的細胞におけるＣｒｅリコンビナーゼ活性とＦＬＰリコンビナーゼ活性が１：１となるようなものであると考えられる。修飾は、製造業者の指示に従い実施されうる。
【０１３２】
この手法は、アデノウイルス・ベクターの有効収容力を増加させるのみならず、複数のタンパク質（組み合わせ毒性の結果として、産生細胞系において共発現され得ないものも含む）を含む適用の新たな道を開く。
【０１３３】
本明細書において言及された参考文献は、全て、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
その他の態様も、特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】アデノウイルスＡ型ベクターの構造、及び標的細胞におけるその運命の概略図である。ｅｎｈはＡｄ２エンハンサーを指し；ＧＦＰはマーカー遺伝子緑色蛍光タンパク質を指し；ＥＢＶはエプスタインバーウイルス・レプリコンを指し；ＴｅｔＯ_７は、Ｔｅｔオペレーターの七量体を指し；ＴｅｔＲはＴｅｔリプレッサーを指し；ＶＰ１６はヘルペス単純ウイルスのウイルス・タンパク質１６を指し、ＳＤはスプライス・ドナー部位を指し；そしてＳＡはスプライス・アクセプター部位を指す。
【図１Ｂ】アデノウイルスＢ型ベクターの構造、及び標的細胞におけるその運命の概略図である。ｅｎｈはＡｄ２エンハンサーを指し；ＧＦＰはマーカー遺伝子緑色蛍光タンパク質を指し；ＥＢＶはエプスタインバーウイルス・レプリコンを指し；ＳＤはスプライス・ドナー部位を指し；そしてＳＡはスプライス・アクセプター部位を指す。
【図２Ａ】ｐＬＥＰコスミド・ポリリンカー領域の概略図、及びアデノウイルス左ＩＴＲに対する相対位置を示す。アデノウイルス・エンハンサー／パッケージング配列（Ψ）は四角で囲まれている。
【図２Ｂ】２個の比較的小さいプラスミドの直接ライゲーションによる、ＡｄＶゲノムをコードする単一コスミドの作成を示す概略図である。遺伝子発現単位ＣＭＶＧＦＰは、ｐＬＥＰコスミドのポリリンカー領域に挿入された。ｐＬＥＰコスミド及びｐＲＥＰコスミドを、イントロン・エンドヌクレアーゼ（ＰＩ−ＰｓｐＩ）で消化し、ライゲートさせ、ｐＡｄ２ＣＭＶＧＦＰが生成するようインビトロでパッケージングした。次いで、このＤＮＡを、もう一つのイントロン・エンドヌクレアーゼ（Ｉ−ＣｅｕＩ）で消化し、ウイルスのゲノムの両端にＩＴＲを露出させた。最後に、コスミド消化混合物を２９３細胞へとトランスフェクトした。組換えウイルスより生成したプラークは、７〜１０日以内に検出される。
【図３Ａ】所望のベクターＤＮＡの均一な生成を示す全長ＡｄＶ ＤＮＡを保持しているコスミドの制限解析を示す。４つのｐＡｄ２−７ＣＭＶＧＦＰコロニーに由来するＤＮＡ試料２μｇを、ＢｇｌＩＩで消化し、１％アガロース・ゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。ＤＮＡ断片の推定サイズは、１３２６１、７６８４、５２２８、５０８８、２２８４、１７５７、１５４９、１２７０、３５１、及び２７５塩基対（ｂｐ）である。５２２８断片及び５０８８断片は、二重線として出現し、３５１ｂｐ断片及び２７５ｂｐ断片は、小さいためゲル上には見られない。
【図３Ｂ】Ｉ−ＣｅｕＩ消化によるコスミドからの組換えＡｄ ＤＮＡの放出を示す。２個のクローンに由来するｐＡｄ２−７ＣＭＶ ＤＮＡ ２μｇをＩ−ＣｅｕＩで消化した。矢印は、放出された組換えＡｄＶ ＤＮＡ、並びにそれぞれおよそ３５ｋｂ及び５ｋｂのベクター断片の位置を示した。
【図４Ａ】ＩＴＲが露出していないｐＩＡｄＧＦＰＢ（未消化）、一方のＩＴＲが露出しているｐＩＡｄＧＦＰＢ（ＢｓａＢＩ又はＩ−ＣｅｕＩ）、又は両方のＩＴＲが露出しているｐＩＡｄＧＦＰＢ（ＢｓａＢＩ＋Ｉ−ＣｅｕＩ）１０μｇでトランスフェクトされた２９３細胞におけるプラークの出現を示す。値は、３回の別個の実験からの、ディッシュ１枚当たりの平均プラーク数、及び２９３細胞におけるプラーク発生に必要な時間を表す。「Ｉ」はＩ−ＣｅｕＩを意味し；「Ｂ」はＢｓａＢＩを意味する。
【図４Ｂ】トランスフェクション後１０日を超えて増殖させたプラークから得られたウイルス力価を示す。ウイルスを採集し、各ウイルス・ストックの力価を、本明細書に記載されたＧＦＰに基づく半定量的力価測定法によって決定した。値は、３回の独立した決定の平均±ＳＥを表す。
【図５】環状エピソームへと分解する直鎖状ＡｄＶを示す概略図である。ベクターの自発的再編成に関与している因子が、ｐＬＥＰ１ＢＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶ、及び対応するＡｄＶに概略的に示されている。左ＩＴＲからスタートして、因子は、以下のような順序で示されている：左ＩＴＲ（１４７ ｂｐ）；第一の３４ｂｐのｌｏｘＰ部位；１８５ｂｐのエンハンサー／パッケージング・シグナル；ＥＦ１α遺伝子第一イントロン由来の６４ｂｐのスプライシング・アクセプター（ＳＡ）；７２０ｂｐ ＧＦＰ ｃＤＮＡ；２３０ｂｐ ＳＶ４０ポリ（Ａ）；１．７ｋｂのＴＫ−ＥＢＮＡ−１／ＯｒｉＰ；９７０ｂｐのＨＣＲ１２プロモーター；３’末端の６４ｂｐ上流に第二のｌｏｘＰ部位が挿入されている、スプライシング・ドナー部位（ＳＤ）及びスプライシング・アクセプター部位（ＳＡ）を含有している１ｋｂのＥＦ１α遺伝子第一イントロン；ＡＵ１及び核移行シグナルをタグ化された１．２ｋｂのＣｒｅ遺伝子；およそ１２０ｂｐのポリ（Ａ）シグナル及びＰＩ−ＰｓｐＩ部位。肝細胞の感染後、ＨＣＲ１２プロモーターは、２個のｌｏｘＰ部位の開裂をもたらすＣｒｅの発現を駆動する。これは、ＥＢＶレプリコンを含有している断片の環状化をもたらす。切り出しは、エンハンサー／パッケージング・シグナルとＡｄＶゲノムの残部との結合を切断する。Ｃｒｅ遺伝子は無プロモーターとなり、ＡｄＶゲノム断片上に残される。切り出し後、ＨＣＲ１２プロモーターは、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現を駆動する。ＥＢＶレプリコンは、宿主細胞において、切り出された環をエピソームとして維持する。
【図６Ａ】ＡｄＶゲノム内のｌｏｘＰ部位及びＥＢＮＡ−１の位置の概略図である。関連するＢｇｌＩＩ部位も示されている。
【図６Ｂ】細胞１個当たり１，０００粒子という等しい感染多重度（ｍｏｉ）でのＨｅｐＧ２細胞及びＨｅｌａ細胞における再編成の時間経緯を示す。細胞に、３７℃で２時間、Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶウイルスを感染させた。Ｈｉｒｔ ＤＮＡ試料を細胞から抽出した。およそ５μｇのＨｉｒｔ ＤＮＡ試料をＢｇｌＩＩで消化し、１％アガロース・ゲル上で分画し、^３２Ｐ−標識ＥＢＮＡ−１断片をハイブリダイゼーション・プローブとして使用したサザンブロット技術によって解析した。
【図６Ｃ】ｍｏｉ １０，０００で感染させたＨｅｌａ細胞；及びｍｏｉ １，０００で感染させたＨｅｐＧ２より得られたＤＮＡブロットの結果を示す。上方のバンド（４９１５ ｂｐ）は環状化ＤＮＡ断片を表し、下方のバンド（３１６２ ｂｐ）は非環状化ＡｄＶを表す。
【図７Ａ】Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶウイルスを感染させた肝細胞及び非肝細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を示す。細胞を３５ｍｍディッシュで培養し、所望のｍｏｉでＡｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶウイルスを感染させた。ＨｅｐＧ２細胞には細胞１個当たり１，０００粒子、Ｈｅｌａ細胞にはｍｏｉ １０，０００で感染させた。感染後の示された時点で、ＧＦＰ発現を調査した。それぞれ４５０ｎｍ及び５１０ｎｍのピーク励起波長及び放射波長を有するフィルターを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０蛍光顕微鏡に取り付けられたＯｌｙｍｐｕｓ ＳＣ ３５ｍｍカメラを使用して、２００倍で、蛍光性細胞を写真撮影した。
【図７Ｂ】ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ４３１細胞、及びＨＴ２９細胞におけるＧＦＰの発現を示す。３５ｍｍディッシュに細胞を播き、細胞１個当たり１０，０００粒子というｍｏｉでＡｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶウイルスを感染させた。ＧＦＰ発現を、感染後７２時間目に調査した。
【図７Ｃ】ヒト初代肝細胞におけるＧＦＰの発現を示す。これらの細胞は、明視野条件下（左）及び蛍光条件下（右）で撮影された。
【図８Ａ】ウイルス後期遺伝子発現のための三成分リーダー配列を検出するために実施されたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（上部のパネル）。ＡｄＶゲノムの検出のためのＰＣＲを、ＤＮＡ試料において実施した。特異的標的配列は、下記において詳述される。第一世代ＡｄＶ又は自己分解性Ａｄ２ＨＣＲＧＦＰ／ＥＢＶを感染させた細胞におけるアデノウイルス後期遺伝子発現のＰＣＲ解析を行った。ＨｅｐＧ２細胞を、３５ｍｍディッシュで培養し、増加するｍｏｉ（０、１０、１００、１０００、１０，０００、及び１００，０００）のアデノウイルス・ベクターを感染させた。ＲＮＡ及びＤＮＡは、感染後７２時間目に平行して細胞から単離された。
【図８Ｂ】定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲの結果の概要を示す。各測定値は、３回の実験の平均であった。
【図９Ａ】ＥＢＶレプリコンのＯｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１領域の欠失解析を示す概略図である。ＥＢＮＡ−１及びＯｒｉＰの中の欠失の構造が、概略的に表わされている。エピソームの維持にとって重要であると考えられた因子が示されている。ＦＲは反復配列のファミリーを指し；ＤＳはダイアド・シンメトリー（ｄｙａｄ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）の領域を指し；ＬＲ１はいわゆるリンカー領域１を指し；ＧＡはｇｌｙ−ａｌａ反復配列を指し；ＬＲ２はリンカー領域２を指し；そして二量体化は二量体化ドメインを意味する。
【図９Ｂ】図９Ａに表わされたＥＢＶレプリコンを保持しているＧＦＰ陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図１０Ａ】ドミナント・ネガティブＣｒｅ活性に関して試験されたＣｒｅ変異体の位置及び同一性を示す。
【図１０Ｂ】Ｃｒｅ変異体のドミナント・ネガティブ機能を試験するために使用された基質Ｃｒｅプラスミド（ａｄ２２３９）の概略図である。
【図１０Ｃ】基質Ｃｒｅプラスミド（ａｄ２２３９）と示されたＣｒｅ変異体とで共トランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現を示す。
【図１０Ｄ及び１０Ｅ】再編成を阻害する能力に関して試験されたＣｒｅ変異体を示す。最も強い阻害活性を示すもののみを、図１０Ｅにおいて再試験した。ＧＦＰ強度は、阻害の非存在下での細胞の強度に対し正規化された。
【図１１】ａｄ２２３９でトランスフェクトされた２９３ＴｅｔＯＮ細胞及び＃１７細胞におけるＧＦＰ発現を示す。＃１７細胞のＣｒｅ活性阻害能は、２μＭドキシサイクリンで処理された細胞における弱いＧＦＰシグナルによって証明される。
【図１２】テトラサイクリンにより媒介される自己制御回路を示す概略図である。
【図１３Ａ及び１３Ｂ】合成ＴｅｔＯプロモーター活性に対する異なる基本因子の効果を示す。図１３Ａは、様々な自己制御性合成ＴｅｔＯプロモーターの成分の概略図を示す。図１３Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞における、マーカーとしてＧＦＰを使用した、テトラサイクリンの存在下及び非存在下での、異なる基本因子を保有している自己制御性合成ＴｅｔＯプロモーターの強度の比較を示す。
【図１４】Ｃｒｅ基質プラスミド（ａｄ２２６５）の構造を示す。プロモーターＥＦ１α及び遺伝子ＢＦＰは、Ｃｒｅにより媒介される組換えによって接合されうる２個のｌｏｘＰ部位によって中断されている。ＰＡはポリＡを表し；ＢＦＰは青色蛍光タンパク質を表す。
【図１５Ａ及び１５Ｂ】Ｃｒｅリコンビナーゼ活性のエストロゲンによる制御を示す。Ｃｒｅ酵素のＮ末端及びＣ末端の両方にエストロゲン・リガンド結合ドメインが融合しているＢ型ウイルスＡＤ １２１．５を感染させた２９３細胞を、１μＭエストロゲンの存在下又は非存在下で培養した。エストロゲンの存在下でのＣｒｅにより媒介される再編成が、図１５Ａに示されており、同細胞に由来する染色体外ＤＮＡのブロット解析が、図１５Ｂに示されている。Ｌは非再編成アデノウイルスＤＮＡに対応する位置を表し；Ｃは環状型ＤＮＡに対応する位置を表す。
【図１６】インビボでのアデノウイルス配列の再編成を示す。Ａ型アデノウイルスＡＤ１０２．７の注入後２．５時間目に屠殺されたＲａｇ−２マウスの肝臓に由来する染色体外ＤＮＡを、ＤＮＡブロットによって解析した。Ｌは直鎖状アデノウイルスＤＮＡに対応するサイズを表し；Ｃは再編成された環状ＤＮＡに対応するサイズを表す。
【図１７】Ａ型アデノウイルス（ＡＤ１０２．７）注入後４８時間目のＲａｇ２マウス肝組織における高レベルのＧＦＰ発現を示す顕微鏡写真である。
【図１８Ａ及び１８Ｂ】アデノウイルス・ベクターの構造、及び標的細胞におけるそれらの運命の概略図を示す。ｅｎｈはＡｄ２エンハンサーを指し；ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質を指し；ＥＢＶはエプスタインバーウイルス・レプリコンを指し；Ｔｅｔ０_７はＴｅｔオペレーターの七量体を指し；ＴｅｔＲはＴｅｔリプレッサーを指し；ＶＰ１６はＨＳＶタンパク質１６由来の転写アクチベーター・ドメインを指し；ＳＤはスプライス・ドナー部位を指し；そしてＳＡはスプライス・アクセプターを指す。
【図１９Ａ】ＦＬＰ基質プラスミドａｄ２８７９の構造を示す。プロモーターＥＦ１α、及び遺伝子ＧＦＰは、ＦＬＰにより媒介される組換えによって接合されうる２個のＦＲＴ部位によって中断されている。ＰＡはポリＡを表し；ＢＦＰは青色蛍光タンパク質を表す。
【図１９Ｂ】ｃｒｅ基質プラスミドａｄ２２０４の構造を示す。
【図２０】いくつかのＦＬＰｅアンチセンス・プラスミドの構造を示す。
【図２１】アンチセンスＦＬＰによるＦＬＰ酵素活性の阻害を示す顕微鏡写真のパネルである。２９３細胞に、ＦＬＰ基質（図１２）及び各写真に示されたプラスミドをトランスフェクトした。高いＧＦＰ強度は、比較的高いＦＬＰの発現、及び発現したアンチセンスによる比較的少ない阻害を示す。
【図２２】ＦＲＴ／Ｃｒｅアデノウイルス及びｌｏｘＰ／ＦＬＰアデノウイルスの概略図を示す。

Claims (34)

1. 部位特異的ＤＮＡ改質酵素と該酵素によって認識されるＤＮＡ標的とをコードする複製可能ウイルスＤＮＡベクターであって、該酵素が、該酵素を発現している細胞において、該ＤＮＡベクターを再編成型へと選択的に変換するものである、ベクター。
2. 再編成型が自律複製性エピソームを含む、請求項１記載のベクター。
3. 再編成型が直鎖状ＤＮＡと環状ＤＮＡとを含む、請求項１記載のベクター。
4. アデノウイルスＤＮＡを含む、請求項１記載のベクター。
5. 遺伝学的に改変された組換え部位を含む、請求項１記載のベクター。
6. 組換え部位が、Ｃｒｅ又はＦＬＰの標的を含む、請求項５記載のベクター。
7. 酵素がリコンビナーゼ又はインテグラーゼを含む、請求項１記載のベクター。
8. リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦＬＰリコンビナーゼである、請求項７記載のベクター。
9. 酵素が、哺乳動物細胞において機能性である、請求項１記載のベクター。
10. 組換え部位が、部位特異的ＤＮＡ改質酵素の認識配列を含む、請求項５記載のベクター。
11. 哺乳動物細胞において機能する複製開始点を含む、請求項１記載のベクター。
12. 複製開始点がエプスタインバーウイルス・レプリコンである、請求項１１記載のベクター。
13. 目的の遺伝子を含む、請求項１記載のベクター。
14. 組換えアデノウイルスＤＮＡを組み立てるための方法であって、（ａ）制限部位とｃｏｓ部位とを含む第一の直鎖状化されたＤＮＡベクター、及び該制限部位とアデノウイルス核酸分子とｃｏｓ部位とを含む第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターを提供する段階；並びに（ｂ）組換えアデノウイルスＤＮＡが組み立てられるよう、該第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターと第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターとをライゲートさせる段階を含む方法。
15. 第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターが選択可能マーカーを含む、請求項１４記載の方法。
16. 第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターがアデノウイルス左末端逆方向末端反復配列を含む、請求項１４記載の方法。
17. 第一の直鎖状化されたＤＮＡベクターが目的の遺伝子を含む、請求項１４記載の方法。
18. 第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターが選択可能マーカーを含む、請求項１４記載の方法。
19. 第二の直鎖状化されたＤＮＡベクターがアデノウイルス右末端逆方向末端反復配列を含む、請求項１４記載の方法。
20. 組み立てられたアデノウイルスＤＮＡをファージへとパッケージングする段階、及び宿主細胞に感染させる段階をさらに含む、請求項１４記載の方法。
21. 第一及び第二の直鎖状化されたＤＮＡがコスミド・ベクターを含む、請求項１４記載の方法。
22. アデノウイルスＤＮＡに開裂部位が隣接している、請求項１４記載の方法。
23. 開裂部位がイントロン・エンドヌクレアーゼ開裂部位を含む、請求項２２記載の方法。
24. ドミナント・ネガティブ部位特異的ＤＮＡ改質酵素を発現する核酸分子を含むアデノウイルス産生細胞。
25. 部位特異的ＤＮＡ改質酵素がドミナント・ネガティブ・リコンビナーゼである、請求項２４記載の産生細胞。
26. リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼである、請求項２５記載の産生細胞。
27. ドミナント・ネガティブ・リコンビナーゼがＣｒｅＹ３２４Ｃである、請求項２６記載の産生細胞。
28. ＦｌｐリコンビナーゼがＦｌｐｅである、請求項２６記載の産生細胞。
29. ２９３ヒト胎児腎細胞である、請求項２４記載の産生細胞。
30. 部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第一の遺伝学的に改変されたシス作用性標的と；
    目的の遺伝子と；
    系列特異的遺伝子プロモーターと；
    部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第二の遺伝学的に改変されたシス作用性標的と；
    部位特異的ＤＮＡ改質酵素をコードする核酸分子とを、５’から３’の方向に含むベクター。
31. 部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第一の遺伝学的に改変されたシス作用性標的と；
    目的の遺伝子と；
    部位特異的ＤＮＡ改質酵素によって認識される第二の遺伝学的に改変されたシス作用性標的を含む双方向性プロモーターと；
    部位特異的ＤＮＡ改質酵素をコードする核酸分子とを、５’から３’の方向に含むベクター。
32. 患者において発現される請求項１、３０、又は３１のいずれか一項記載のベクターを治療に有効な量で、遺伝子治療を必要とする患者へ投与することを含む、遺伝子治療の方法。
33. 請求項１、３０、又は３１のいずれか一項記載のベクターでトランスフェクトされた細胞集団。
34. 請求項３３記載の細胞集団を治療に有効な量で、遺伝子治療を必要とする患者へ投与することを含む、遺伝子治療の方法。

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