CZ20011129A3 - Selektivně se replikující rekombinantní virový vektor a způsob jeho přípravy, farmaceutická formulace, způsob usmrcení buňky s defektní dráhou, transformovaná buňka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß - Google Patents

Selektivně se replikující rekombinantní virový vektor a způsob jeho přípravy, farmaceutická formulace, způsob usmrcení buňky s defektní dráhou, transformovaná buňka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß Download PDF

Info

Publication number
CZ20011129A3
CZ20011129A3 CZ20011129A CZ20011129A CZ20011129A3 CZ 20011129 A3 CZ20011129 A3 CZ 20011129A3 CZ 20011129 A CZ20011129 A CZ 20011129A CZ 20011129 A CZ20011129 A CZ 20011129A CZ 20011129 A3 CZ20011129 A3 CZ 20011129A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
promoter
pathway
vector
cell
virus
Prior art date
Application number
CZ20011129A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301506B6 (cs
Inventor
Muralidhara Ramachandra
Paul W. Shabram
Original Assignee
Canji, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Canji, Inc. filed Critical Canji, Inc.
Publication of CZ20011129A3 publication Critical patent/CZ20011129A3/cs
Publication of CZ301506B6 publication Critical patent/CZ301506B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4736—Retinoblastoma protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oblast techniky
Předmětný vynález poskytuje rekombinantní viry, které replikují virový genom selektivně jako odezvu na intracelulární podmínky cílové buňky a to prostřednictvím použití promotoru reagujícího na určitou dráhu, který řídí expresi inhibitoru replikace viru.
Dosavadní stav techniky
Rekombinantní adenoviry jsou dnes používány v řadě terapeutických režimů jako prostředníci pro dopravení terapeutických transgenů. Rozsáhlá nakažlivost těchto vektorových systémů však způsobila zvýšení obav z toho, že by exprese viru v jiných než nádorových buňkách mohla způsobovat současné zničení jiných buněk než neoplastických. V důsledku toho bylo vyvinuto široké spektrum systémů, jejichž úkolem je v daném typu buňky přednostně exprimovat transgen. Pro zajištění přednostní replikace vektoru v určitých typech buněk byly použity tkáňově specifické a nádorově specifické promotory. Například mezinárodní patentová přihláška č. PCT/US96/10838, publikovaná 16.1.1997 (mezinárodní publikace č. WO97/01358) popisuje použití vektorů, které se replikují ve specifické hostitelské buňce prostřednictvím použití promotorových prvků specifických pro prostatu, které řídí funkce El, E2 nebo E4 a které příležitostně obsahují cytotoxickou transgenní expresní kazetu. Tato publikace konkrétně popisuje konstrukt, ve kterém kontroluje zesilovač specifický pro prostatu expresi El a obsahuje expresní kazetu, zahrnující CMV-promotor, který řídí expresi genu pro cytosindeaminasu a který je inzertován do oblasti E3. Tyto vektory jsou replikačně kompetentní a v konkrétním typu buňky jsou schopny se sbalovat do intaktních virionů.
Alternativním přístupem k použití nádorově specifických promotorů pro řízení replikace viru je použití specifických delecí v sekvenci kódující adenovirový protein Elb 55K.
Rekombinantní adenoviry, které obsahují defekty v nukleotídové sekvenci kódující Elb 55K, jsou popsány v US patentu č. 5 677 178, vydaném 14.10.1997. U těchto tkáňově specifických nebo nádorově specifických kontrolních prvků však bylo pozorováno, že jsou „děravé“ tzn., že • · · · · · · • · 9 · · · 9 · · · · 9 9 9
9 9 9999 ·
9 9 9 9 9
999 99 999 umožňují replikaci nejen v upřednostňovaných cílových buňkách, ale také v dalších typech buněk.
Alternativou k tomuto typu selektivně se replikujícího vektoru je použití replikačně deficitního adenovirového vektoru, který obsahuje rozsáhlou eliminaci funkce El. Konkrétně byly pro dopravení exogenních transgenů použity vektory obsahující eliminaci delecí El, E2 E3 a částečně E4. Tyto vektory byly použity pro dopravení genu p53 do cílových buněk. Bylo dokázáno, že exprese exogenně podaného divokého („wild type“) p53 vp53 deficitní (s mutovaným p53 nebo bez p53) nádorové buňce je schopna indukovat v nádorové buňce apoptózu zprostředkovanou p53. Tyto virové vektory určené pro dopravení p53 jsou v současné době ve výzkumu ve společnostech Schering Corporation a Introgen Corporation. Tyto vektory dále vykazovaly přijatelné toxikologické profily a terapeutickou účinnost pro terapeutické aplikace u lidí. Nyní jsou ve druhé fázi klinických zkoušek léčby zhoubného bujení spojeného s p53 u mužů.
Porucha replikace a selektivně se replikující vektory mají, alespoň teoreticky, své stinné stránky, které jsou předmětem zájmu kliniků. Protože replikačně deficitní vektory se u pacienta nebudou množit nekontrolované, mají teoreticky přitažlivější bezpečnostní profil. Protože účinná eliminace nádoru vyžaduje, aby byla infikována podstatná část nádorových buněk, je pro zajištění terapeutické účinnosti běžně používán molární přebytek vektoru. Selektivně se replikující viry jsou považovány za viry, které jsou větším problémem z pohledu bezpečnosti a to vzhledem k jejich schopnosti replikovat se a mutovat za vzniku zcela replikačně kompetentních vektorů. Avšak tím, že je udržována přirozená schopnost viru množit se za konkrétních podmínek, je umožněno těmto vektorům rozšířit se na okolní nádorové buňky. Protože vektory sami o sobě jsou schopny se replikovat, je potřeba pouze nižší počáteční dávka těchto vektorů. Toto je důležité z imunologického hlediska, ale rovněž také z důvodů ekonomických při výrobě těchto činidel. Selektivně se replikující viry, které se zaměřují na vnímané bezpečnostní problémy a které současně poskytují zvýšený terapeutický index, jsou v dané oblasti techniky potřebné.
Předmětný vynález řeší tyto problémy tím, že poskytuje selektivně se replikující adenovirové vektory obsahující promotor reagující na určitou dráhu, který řídí expresi represoru replikace viru tak, že se vektor replikuje přednostně v buňkách, které jsou z pohledu sledované dráhy defektní. Předmětný vynález také poskytuje farmaceutické formulace obsahující tyto vektory. Předmětný vynález také poskytuje způsoby oddělení buněk s defektní dráhou od populace normálních buněk a to právě s pomocí těchto vektorů.
·· ·· ·· · · · · · · • · · · ··· · · · ·· · ····· ·· ·· ···· · · · ·
Podstata vynálezu
Předmětný vynález poskytuje rekombinantní viry, které replikují virový genom selektivně jako odezvu na intracelulární podmínky cílové buňky prostřednictvím použití promotoru reagujícího na určitou dráhu, který řídí expresi inhibitoru replikace viru. Inhibitor podstatně inhibuje replikaci viru v hostitelské buňce a to na bázi fenotypu nebo genotypu infikované buňky. V cílové buňce je element promotoru reagujícího na určitou dráhu inaktívní a virus se tudíž může replikovat. Výsledkem je: (1) usmrcení buněk přirozenou lýzí viru a/nebo (2) poskytnutí terapeutické dávky transgenního produktu (amplifikovaného ve srovnání s replikačně nekompetentními vektory) cílové buňce a (3) vznik místní koncentrace viru usnadňující infekci okolních cílových buněk rekombinantním virem. Vynález dále poskytuje terapeutické a diagnostické způsoby použití vektorů, farmaceutické formulace obsahující vektory, způsoby přípravy vektorů a transformované buňky, které obsahují tyto vektory.
Předmětný vynález poskytuje selektivně se replikující rekombinantní virus obsahující promotor reagující na určitou dráhu, kteiý je operativně připojen na represor replikace viru.
Termín „selektivně se replikující“ se vztahuje k vektoru, který je schopen se přednostně replikovat v buňce v jednom fenotypovém stavu ve srovnání s buňkou s jiným fenotypovým stavem. Mezi příklady odlišných fenotypových stavů by mohly být zahrnuty buňka s defektní dráhou p53 versus normální buňka stejného buněčného typu. Virus, který vykazuje přednostní replikaci, znamená, že se při určité hladině dávky replikuje vdaném typu cílové buňky ve srovnání s normální (kontrolní) buňkou stejného typu alespoň s 5 násobnou účinností. Aby bylo možno stanovit, je-li virus skutečně selektivní, je vzhledem křadě faktorů nezbytné určit schopnost viru replikovat se v cílových buňkách a porovnat ji s replikací v normálních buňkách stejného typu.
Je výhodné srovnat schopnost daného vektoru replikovat se v cílové buňce, která disponuje určitou sledovanou podmínkou a v normální buňce stejného typu, která danou podmínku nevykazuje. Například prvním krokem, který následuje po infekci viru, je indukce buňky tak, aby vstoupila do buněčného cyklu, protože faktory, nezbytné pro maximální účinnost replikace viru, jsou přítomny pouze v S-fázi. Avšak při pokusu o zhodnocení selektivity vektoru z pohledu selektivity vůči nádorovým buňkám, zhodnocení schopnosti replikovat se v nádorové buňce a v jiné buňce, která již vstoupila do buněčného cyklu (jako je nesmrtelná buňka nebo transformovaná buňka), bude selektivita viru pro nádorové buňky do určité míry nejasná resp. zkreslená. Dále bylo pozorováno, že různé typy buněk vykazují pro daný virus velmi odlišnou • · · · • ·
nakažlivost. Ačkoliv některé viry jako jsou adenoviry vykazují široký tropismus tkání, jiné viry jsou typem buněk, které infikují, omezeny více. Při pokusu o určení činnosti daného vektoru v buňkách, které se velmi liší schopností být infikovány, je obtížné odhadnout, zdali je malý účinek důsledkem působení vektoru v buňce nebo pouze důsledkem nedostatečné infekce buňky virem jako takové. Vliv různé nakažlivosti se minimalizuje právě určením selektivity v cílových i normálních buňkách stejného typu.
Rovněž musí být brána v úvahu dočasná povaha životního cyklu viru. Například pouze u wild-type vektoru se může zdát, že ve srovnání s normálními buňkami vykazuje selektivitu v nádorových buňkách velmi brzo po infekci a to proto, že buňka je právě v cyklování. Avšak jakmile má virus stimulovaný buněčný cyklus, tato zdánlivá selektivita klesá. Proto tedy musí být doba, která následuje po infekci a ve které je selektivita určována, dostatečně dlouhá pro to, aby byla vyloučena tato počáteční replikační lag fáze v normálních buňkách. Ačkoliv se toto bude lišit podle typu použitého viru, může odborník v dané oblasti techniky tuto počáteční lag fázi snadno určit.
Při určování, vykazuj e-li daný rekombinantní adenovirus selektivní účinek v cílových buňkách daného typu, je třeba brát v úvahu také vliv dávkování. Například, jestliže je pozornost zaměřena na eliminaci nádorových buněk a měření účinku prostřednictvím cytotoxicity, může se při různém dávkováním viru zdát, že vykazuje selektivní cytotoxicitu. Toto je způsobeno tím, že dostatečně vysoká dávka téměř jakéhokoliv viru bez ohledu na stupeň modifikace genomu, bude cytotoxická a to jednoduše vzhledem k vlivu přítomnosti virových proteinů (jako je hexon v případě adenoviru), o nichž je známo, že jsou cytotoxické. Podobně se vědecká literatura dokonce může odkazovat na virus jako na „replikačně defektní“ (za předpokladu, že virus je zcela neschopný replikace v nepřítomnosti buněčné linie, která je schopna komplementovat defekt viru). Tyto viry jsou přesněji popsány jakožto „oslabené pro replikaci“. Například adenoviry obsahující deleci celé El oblasti, které jsou často označovány jako „replikačně deficitní“ nebo „replikačně defektní“, se budou do určitého stupně replikovat a to konkrétně v cyklizujících se nebo velmi rychle se dělících buňkách. Toto pozoroval Mulligan (1990, Science 260:926 až 932):
Ačkoliv v případě exprese El oblasti bylo ukázáno, že ovlivňuje expresi jiných produktů virových genů nezbytných pro replikaci (Horwitz, M., Virology, B. N. Fields Ed. (Raven, New
York, 1990), kapitola 60), nejeví se požadavek exprese genu El pro replikaci viru jako absolutní.
Dřívější charakterizace El deficitních virů ukazují, že při vysokých multiplicitách infekce byla
El oblast pro replikaci postradatelná (Jones a Shenk (1979) PNAS (USA) 76(8): 3665 až 3669).
·· ·· ·· ♦ · · · ·· • φφφ φφφ φφφ φφ · φφφφφ · · «ΦΦ «« ·φ·« φφ φφφφ ·· φ·φ ·· φφφ
Z tohoto důvodu nemůže být při určování, zdali je nebo není virus replikován selektivním způsobem, ignorován účinek dávky viru.
Jedním prostředkem jak stanovit replikační selektivitu viru pro cílové buňky, je určení „indexu selektivity“ pro daný virus. Běžně používaný parametr ED50 (který je definován jako dávka dostatečná pro indukování buněčné smrti u 50 % buněk) poskytuje odpovídající základ pro porovnání. Hodnota ED50 viru může být snadno stanovena pomocí typických in vitro experimentů pomocí stupňování dávky. Aby byl zajištěn pevný základ porovnání, je nej vhodnější vyjadřovat ED50 ve vztahu ke kontrole. Cílem tohoto je minimalizovat vlivy související s různou schopností jednotlivých typů srovnávaných buněk být infikována a rovněž minimalizovat odchylky měření. Proto je poměr ED5o(virus)/EDjo(kontrola) používán pro vyjádření relativní toxicity viru v buňce a bude označován jako „index relativní toxicity“ nebo „RTI“. „Index selektivity“ daného viru je vyjádřen poměrem RTI(cílové buňky)/RTI(normální buňky). Selektivně se replikující vektory budou mít index selektivity alespoň 10, ale výhodněji 50, 100 nebo vyšší.
Například selektivně se replikující adenovirové vektory U3EE a T1LT jsou konstruovány tak, aby bylo dosaženo selektivní replikace a usmrcení nádorových buněk, které mají defekty p53 dráhy. U3EE je připraven v souladu se zde uvedenými příklady. Stručně, virus U3EE obsahuje první expresní kazetu zahrnující responzivní prvek p53 (p53 CON), který řídí expresi fúzního proteinu E2F-Rb. Fúzní protein E2F-Rb je velmi účinným inhibitorem aktivity adenovirového promotoru E2 a jeho přítomnost v buňce bude účinně potlačovat replikaci viru. Responzivní prvek p53 je aktivní v závislosti na přítomnosti funkční dráhy p53.
Proto tedy v normálních buňkách, kde není p53 dráha porušena, bude virus U3EE exprimovat fúzní protein E2F-Rb a virus se nebude replikovat. Avšak v buňkách, které mají p53 dráhu defektní (většina nádorových buněk), není prvek p53CON aktivní a tudíž zde nedochází k potlačení replikace viru. Vektor U3EE obsahuje také expresní kazetu zahrnující MLP promotor, který řídí expresi proapoptotického genu Ad5 E3-10.5K. Použití časových promotorů (jako je MLP promotor) je výhodné v případě proapoptotických genů, protože se předpokládá usnadnění replikace virové DNA v cílové buňce dříve než dojde k aktivování proapoptotického signálu. MLP promotor je aktivován přibližně sedm hodin po infekci, tedy jestliže replikace genomu U3EE indukuje aktivitu proteinu E3-10.5 K. Adenovirový vektor T1LT je nezbytný stejně jako vektor U3EE až na to, že obsahuje další deleci v oblasti Ela a to takovou, aby byly odstraněny aminokyseliny 4 až 25 adenovirových Ela proteinů 243R a 289R. Tato delece porušuje schopnost proteinu p300 vázat se na tyto Ela proteiny.
U virů U3EE a T1LT byla stanovena jejich schopnost replikovat se v normálních lidských bronchiálních epiteliálních buňkách (NHBE) a C33A (linie epiteliálních nádorových buněk s defektní p53 dráhou) a zabíjet je. Jako kontrola byl použit vektor L9IU. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na přiloženém obr. 3. Následující tabulka shrnuje data:
Tab. 1: Shrnutí RTI a indexů selektivity virů
Virus RTI (normální buňky) RTI (nádorové buňky) index selektivity
L9IU 1,0 1,0 1,0
U3EE 12,5 0,0233 536
T1LT 10 0,066 152
Jak je patrné z uvedených údajů, vykazují viry U3EE a T1LT vysokou selektivitu pro nádorové buňky. Jak již bylo diskutováno dříve, virus L9IU vykazuje v případě cyklizujících nádorových buněk mírně pozitivní replikaci oproti normálním buňkám v klidovém stavu. Srovnáním poměrů ED5o(virus)/ED5o(kontrola) pro každý typ buněk před tím, než je vypočítán index selektivity, jsou vlivy těchto odchylek minimalizovány.
Termín „rekombinantní“ se vztahuje ke genomu, který byl modifikován příslušnými rekombinantními technikami.
Termín „virus“ se vztahuje k jakýmkoliv intracelulárním parazitům, které nemají mechanismy pro syntézu proteinů nebo pro výrobu energie. Virový genom může být tvořen RNA nebo DNA spojenou s obalovou proteinovou strukturou lipidové membrány. Mezi příklady virů, které jsou prakticky užitečné v předmětném vynálezu, patří rody baculoviridiae, parvoviridiae, picornaviridiae, herpesviridiae, poxviridiae, adenoviridiae, picotrnaviridiae. Termín rekombinantní virus zahrnuje chimérické (nebo multimerní) viry, tzn. vektory konstruované pomocí komplementárních kódujících sekvencí z více než jednoho subtypu viru. Toto je uvedeno např. v Feng a kol. Nátuře Biotechnology 15:866 až 870.
Termín „adenovirus“ je synonymem k termínu „adenovirový vektor“ a vztahuje se k virům rodu adenoviridiae. Termín adenoviridiae se vztahuje celkově k živočišným adenovirům rodu mastadenovirus včetně lidské, hovězí, ovčí, koňské, psí, prasečí, myší a opičí subgenerace adenovirů. Výše vyjmenované typy však nejsou v žádném směru limitující. Konkrétně lidský adenovirus zahrnuje subgeneraci A-F i jednotlivé sérotypy jejich jednotlivých sérotypů a subgenerace A-F včetně typů lidských adenovirů 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Adl 1A a Ad 1 IP), 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ♦ ·♦ ···· • ♦ • ·♦· ··
4 ♦ 4 · ·· • · · ·· • 4 ··· ♦<·
34a, 35, 35ρ, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 a 91. Termín hovězí adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, hovězí adenoviry typů 1, 2, 3, 4, 7 a 10. Termín psí adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, typy 1 (kmeny CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) a 2. Termín koňské adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, typy 1 a 2. Termín prasečí adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, prasečí typy 3 a 4. V upřednostňovaném provedení vynálezu pochází adenovirus z lidského adenoviru sérotypu 2 nebo 5.
Termín „promotor reagující na určitou dráhu“ se vztahuje k DNA sekvencím, které vážou určitý protein a tudíž způsobují, aby v normální buňce geny v blízkosti tohoto promotoru na vazbu tohoto proteinu reagovaly na úrovni transkripce. Tyto promotory mohou být vytvořeny začleněním responzivních prvků, což jsou sekvence, na které se vážou transkripční faktory. Tyto odezvy jsou obecně induktivní a tudíž existuje několik případů, kdy zvyšující se hladiny proteinu snižují transkripci. Promotory reagující na určitou dráhu mohou být přirozeně se vyskytující nebo syntetické. Promotory reagující na určitou dráhu jsou většinou konstruovány s ohledem na dráhu nebo funkční protein, který je předmětem sledování. Například přirozeně se vyskytující promotor reagující na p53 dráhu bude zahrnovat transkripční kontrolní prvky aktivované přítomností funkčního p53 jako je p21 nebo bax promotor.
Příležitostně mohou být pro vytvoření syntetického promotoru reagujícího na určitou dráhu použity syntetické promotory obsahující vazebná místa pro p53 umístěná po směru transkripce (upstream) vůči minimálnímu promotoru (např. oblast TATA box SV40). Syntetické promotory reagující na určitou dráhu jsou obecně konstruovány z jedné nebo více kopií sekvence, která se shoduje v konvenčním vazebném motivu. Tyto konvenční DNA vazebné motivy mohou být snadno určeny. Tyto konvenční sekvence jsou obecně uspořádány jako přímé nebo repetice hlava-ku-konci oddělené několika páry baží. Prvky, které zahrnují repetice hlavaku-hlavě (např. AGGTCATGACCT) jsou nazývány palindromy nebo obrácené repetice a ty s repeticemi konec-ku-konci jsou nazývány repetice obrácené ven.
Mezi příklady promotorů reagujících na určitou dráhu, které jsou užitečné v praxi předmětného vynálezu, patří syntetické promotory reagující na dráhu insulinu, obsahující konvenční vazebnou sekvenci pro insulin (Jacob a kol. (1995) J. Biol. Chem. 270:27 773 až 27 779), promotor reagující na dráhu cytokinů, promotor reagující na dráhu glukokortikoidů (Lange a kol. (1992) J. Biol. Chem 267:15 673 až 15 680), promotory reagující na dráhu IL1 a IL6 (Won K.A., Baumann H (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3965 až 3978), promotory reagující na dráhu T3, promotory reagující na dráhu thyroidního hormonu, obsahující konvenční motiv: 5' AGGTCA 3', promotory reagující na dráhu TPA (TRE), promotory reagující na dráhu TGF-β • · · · · · · ··· • · · ····· ·· (popsáno v Grotendorst a kol. (1996) Cell Growth and Differentiation 7:469 až 480). Další příklady promotorů reagujících na určitou dráhu jsou v dané oblasti techniky dobře známé a je možno je nalézt v databázi Database of Transkription Regulátory Regions on Eukaryotic
Genomes, která je přístupná na internetové adrese http://vww.eimb.rssi.nl/rRRD.
V upřednostňovaném provedení vynálezu, jak je zde doloženo příkladem, obsahuje vektor syntetický promotor reagující na dráhu TGF-β, jako například promotor obsahující responzivni elementy SRE a PAI-RE, který je aktivní v přítomnosti funkční dráhy TGF-β. PAIRE se vztahuje k syntetickému responzivnímu elementu TGF-β, který obsahuje sekvence reagující na signál TGF-β, izolované z promotorové oblasti aktivátoru-I plasminogenu. Konstrukce PAI-RE je popsána níže v příkladu 3. Promotor reagující na dráhu PAI-RE může být izolován jako fragment o velikosti 749 bp, který lze izolovat z plasmidu p8001uc (jako je popsáno vZonneveld a kol. (1988) PNAS 85:5525 až 5529 a je dostupný zGenBank pod přístupovým číslem J03836). SRE se vztahuje k syntetickému responzivnímu elementu TGF-β, který obsahuje repetici 4 z Smad-4 DNA vazebných sekvencí (GTCTAGAC, popsáno v Zawel a kol. (1988) Mol. Cell 1:611 až 617). Konstrukce SRE je popsána níže v příkladu 3. Responzivni element SRE může být vytvořen spojením komplementárních oligonukleotidů kódujících Smad4 vazebné sekvence a klonováním v plasmidovém vektoru pGL#3-promotor luciferasa (komerčně dostupný od firmy ProMega).
Podobně „promotor reagující na p53 dráhu“ se vztahuje k transkripčnímu kontrolnímu elementu, který je aktivní v přítomnosti funkční dráhy p53. Promotor reagující na dráhu p53 může být přirozeně se vyskytující transkripční kontrolní oblast aktivní v přítomnosti funkční dráhy p53, jako např. promotory p21 nebo mdm2. Promotor reagující na dráhu p53 může být příležitostně také syntetická transkripční kontrolní oblast aktivní v přítomnosti funkční dráhy p53, jako jsou promotory reagující na dráhu SRE a PAI-RE. p53-CON popisuje promotor reagující na dráhu p53, který obsahuje syntetický responzivni element p53 konstruovaný prostřednictvím inzerce dvou syntetických p53 konvenčních DNA vazebných sekvencí (jako popisuje Funk a kol. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2866 až 2871) které jsou upstream k TATA boxu SV40. Konstrukce promotoru reagujícího na dráhu p53-CON je popsána níže v příkladu 3. RGC se vztahuje k syntetickému promotoru reagujícímu na dráhu p53 použitím jediné vazebné domény pro p53 identifikované v ribozomálním genovém svazku viz Kem a kol. (1991) Science 252:1708 až 1711 a Park a kol. (1996) Molecular Carcinogenesis 16:101 až 108. Responzivni elementy p53CON a RGC mohou být konstruovány spojením komplementárních oligonukleotidů a p53 responzivni promotory mohou být konstruovány (jako je popsáno • · ·· · · ···· ·· · • · · · ··· · · · · • · · ····· ·· · • · ···· · · · · · ··· · · · · · · ·· ···· ·· ··· ·· ··· v příkladu 3) klonováním v plasmidovém vektoru pGL3-promotor luciferasa (komerčně dostupný od firmy ProMega).
Termín „cílová buňka“ se vztahuje k buňce daného fenotypového stavu, u které je žádoucí, aby byla ošetřena podáváním terapeutického transgenu. Použitím různých promotorových elementů reagujících na určitou dráhu je možno směřovat expresi viru do jakékoliv dané buňky s neporušenou danou dráhou. Například represor replikace viru může být exprimován v neoplastické cílové buňce prostřednictvím použití promotorů reagujících na dráhu TGF-β nebo p53. Represor replikace viru může být exprimován také v artritické cílové buňce prostřednictvím promotoru reagujícího na zánět, přičemž vektor případně kóduje IL-10.
Termín „operativně připojen“ se vztahuje ke spojení polynukleotidových prvků ve funkční vztah. Sekvence nukleové kyseliny je „operativně připojena“ tehdy, je-li umístěna do funkčního vztahu s jinou sekvencí nukleové kyseliny. Například promotor nebo zesilovač je operativně připojen ke kódující sekvenci tehdy, když ovlivňuje transkripci kódující sekvence. Operativně připojený znamená to, že sekvence nukleotidů, které jsou spojovány, jsou většinou spojité. Avšak, protože zesilovače obvykle plní svou funkci tehdy, jsou-li odděleny od promotoru několika kilobazemi a sekvence intronů mohou být různě dlouhé, mohou být určité polynukleotidy operativně připojeny, ale nemusí přímo sousedit a mohou ještě plnit funkci dle různých alel nebo chromozomu.
Termín „represor replikace viru“ se vztahuje kproteinu, který, je-li vdané buňce exprimován, podstatně potlačuje replikaci viru. Represor replikace viru je závislý na původu rodičovského adenovirového vektoru, od něhož je rekombinantní vektor podle předmětného vynálezu odvozen, což odborníci v dané oblasti techniky jistě ocení. Například v případě adenovirových vektorů nebo jiných DNA nádorových virů může být použit fuzní konstrukt E2FRb, což je popsáno v EP přihlášce č. 94 108 445, publikované 6.12.1995 (publikační číslo 0 685 493 Al). Fúzní protein E2F-Rb se skládá z DNA vazebné domény a DPI heterodimerizační domény lidského proteinového transkripčního faktoru E2F (aminokyseliny 95 až 286 z wild-type E2F) fúzovaného s doménou potlačující růst Rb (aminokyseliny 379 až 928 wild-type Rb proteinu). E2F-Rb fuzní protein je účinným represorem E2F-dependentní transkripce a váže buňky vGl. DNA vazebná doména je umístěna v aminokyselinách 128 až 193 a dimerizační doména se nachází v pozici 194 až 289. Sekvence lidského proteinu E2F-1 je dostupná v GenBank pod přístupovým číslem M96577, uložené 10.8.1992. Je-li konstruován vektor pro použití v jiných druzích, mohou být použity E2F sekvence od jiných členů E2F rodiny z E2F jiných druhů. V situaci, kdy je rekombinantní virus založen na viru, příbuzném s adenovirem (AAV), jsou řep protein a jeho deriváty účinnými represory replikace viru v nepřítomnosti ·· ·· ·· ···· ·· • ΦΦΦ φ · · ΦΦΦ • Φ φ φ φ φ φ φ φφ infekce adenovirem. V situaci, kdy je virus odvozen od viru herpes simplex, může být jako účinný represor replikace viru použit protein ICPO-NX, což je deletovaná forma ranného proteinu IPCO (Liun a kol. (1998) J. Virol. 72:7785 až 7795). Podobně může být jako represor replikace viru použit jakýkoliv protein s dominantní negativní aktivitou.
TGF-β a příbuzné proteiny včetně aktivinu, inhibinsu a BMP jsou účinnými přirozenými antirozmnožovacími látkami a předpokládá se, že hrají důležité role v potlačení tumorogenicity. Ve své bioaktivní formě je TGF-β homodimer o velikosti 25 kDa spojený disulfidovými vazbami, který je exprimován prakticky ve všech lidských tkáních. Je zajímavé, že mnoho maligních typů buněk si zachovává průběh exprese, který je pozorován u normálních buněk. TGF-β signalizuje prostřednictvím heteromerních receptorových komplexů serin/threoninkinasovým receptorům typu I a H. Receptor typu II má vlastní kinasovou aktivitu a po vazbě na TGF-β ligand heteromerizuje s receptorem typu I a transfosforyluje ho. Fosforylace receptoru typu I aktivuje jeho kinasovou aktivitu, jejíž výsledkem je fosforylace Smad, což jsou intracelulární efektory. Fosforylovaný receptor typu I transportuje signály do buňky a výsledkem je odezva buňky ve formě např. inhibice růstu. Je známo, že jakmile jsou Smad komplexy uvnitř jádra, aktivují transkripci cílových genů buď tím, že sami pracují jako transkripční faktory nebo tím, že regulují aktivitu jiných transkripčních faktorů. U transkripčních faktorů se předpokládá, že jsou regulovány signálem TGF-β včetně CTF/NF-1, FAST-1, Spi, Jun, SRF/TRF, Oct a CREB. Výsledek těchto interakcí vede k různým známým pleiotropním efektům TGF-β.
Transformační růstový faktor-β (TGF-β) a jemu příbuzné proteiny jsou účinnými inhibitory množení mnoha typů buněk. Maligní vývoj jednotlivých nádorů epiteliálního a hematopoietického původu odpovídá ztrátě antirozmnožovacího a antiinvasivního působení TGF-β. Bylo dokázáno, že porucha signalizace TGF-β zahrnuje mutace nebo delece nebo nedostatečnou expresi receptorů a/nebo intracelulárních efektorů dráhy přenosu signálu. Mnoho maligních nádorů, které jsou rezistentní vůči TGF-β, jsou také násobně defektní pro jiné geny potlačující nádor, čímž je omezena možnost využít náhrazení genu potlačujícího nádor v účinné terapii.
Promotory reagující na dráhu TGF-β byly konstruovány pomocí začlenění sekvencí z plasminogenového aktivátorového inhibitoru-1 (PAI-promotor) nebo vazebných míst pro
Smad4/DPC4 (SRE-promotor) upstream k TATA boxu SV40. Aktivity těchto promotorů byly zjištěny pomocí měření přechodné transfekce pomocí luciferasy jakožto značky. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2.
Tabulka 2 Relativní aktivita luciferasy* (násobek)
Linie buněk TGF-β dráha PAI promotor -TGF-β PAI promotor + TGF-β SRE promotor - TGF-β SRE promotor + TGF-β
Hep3B normální 68,82 128,42 105,02 86,47
293 normální 51,62 88,78 9,40 46,94
A549 normální 33,26 56,76 2,87 17,93
Panel normální 15,36 141,80 1,14 29,03
U87 normální 110,40 73,88 7,42 7,85
MCF-7 defektní 18,93 10,72 1,28 1,22
WIDR defektní 10,66 4,41 1,24 1,57
MDA-MB468 defektní 2,28 1,10 1,33 0,62
AsPC-1 defektní 6,56 1,24 1,79 0,76
Caco2 defektní 13,01 13,8 1,18 0,96
MicaPaca2 defektní 14,08 1,81 0,79 26,34
* aktivita luciferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu bez promotora
Tyto výsledky ukazují, že oba promotory jsou aktivní pouze v buňkách s funkční cestou přenosu signálu TGF-β. V buněčné linii s defektní TGF-β dráhou jako je MDA-MB468, která je defektní pro přenos signálu TGF-β z důvodu homozygotní delece Smad4/DPC4, obnovuje transfekce PAI-promotoru nebo SRE-promotoru operativně připojených k luciferase a infekce rekombinantním adenovirem kódujícím Smad4 aktivitu obou výše zmíněných responzivních elementů a dále potvrzuje specifitu promotorů obsahujících responzivní prvky pro dráhu TGF-β, což je ukázáno pomocí dat v tab. 3.
Tabulka 3 Obnovení aktivity promotoru reagujícího na TGF-β v buňkách MDA-MB-468 po infekci rekombinantním adenovirem kódujícím Smad4/DPC4 (relativní aktivita luciferasy* (násobek))
Virus Dávka PAI promotor - TGF-β PAI promotor + TGF-β SRE promotor - TGF-β SRE promotor + TGF-β
BGCA 1 x 10* 1,0 1,53 1,00 1,00
BGCA 1 x 109 0,86 1,06 0,33 0,77
• · · · · · · · · · ·· · · ♦ ··· 9 · · ·· · ····· · · ··· ·· 9 9 9 9
9999 99 999 99 999
DCCA 1 x 10* 1,13 4,86 8,50 139,17
DCCA 1 x 109 1,93 31,60 22,00 370,84
* aktivita luciferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu s BGCA bez přídavku TGF-β. BGCA je rekombinantní adenovirus exprimující gen pro β-gal. DCCA je rekombinantní adenovirus kódující Smad4/DPC4
Poté byl zkonstruován plasmid obsahující PAI-promotor operativně připojený k E2F-Rb a byla u něj testována schopnost selektivně potlačovat E2 promotor v buňkách s neporušenou dráhou TGF-β. Při měření přechodné transfekce vykazovala transfekce E2 promotoru připojeného k luciferase s PAI-promotorem operativně připojeným k E2F-Rb selektivní represi aktivity E2 promotoru u buněk 293 (s normální TGF-β dráhou) a nikoliv u buněk MDA-MB468 (s defektní TGF-β dráhou), což je ukázáno vtab. 4. Důvodem byla selektivní exprese E2F-Rb v buňkách 293. Podle předpokladu transfekce CMV-E2F-Rb, který exprimuje E2F-Rb v obou těchto buněčných liniích, inhibovala aktivitu E2 promotoru v obou buněčných liniích.
Tabulka 4 Selektivní represe aktivity E2 promotoru pomocí PAI-E2F-Rb u buněk 293 versus buňky MDA-MB-468 (relativní aktivita luciferasy* (%))
Represor buňky MDA-MB-468 buňky 293
žádný 100 100
CMV-E2F-Rb 9,38 10,53
PAI-E2F-Rb 124,02 17,38
aktivita luciferasy je vyjadřována v procentech ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu bez promotoru
Promotory reagující na dráhu p53 byly konstruovány včleněním známých vazebných míst pro p53 buď z ribozomálního genového svazku (RGC-promotor) nebo vysoce afinitních vazebných míst pro p53 (p53CON-promotor). Aktivity těchto promotorů byly stanoveny prostřednictvím měření přechodné transfekce pomocí luciferasy jakožto značky. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny níže v tab. 5.
Tabulka 5 Aktivity promotorů reagující na p53 v různých liniích buněk (relativní aktivita luciferasy*)
Linie buněk status p53 p53 CON promotor RGC-promotor
U87 wild-type 3 921,12 112,33
A549 wild-type 647,30 16,36
MCF-7 wild-type 445,25 12,26
293 wild-type, inaktivní 13,03 0,62
Hep3B nulový 4,62 1,22
NCI-H358 nulový 0,35 0,56
Panel mutantní 1,56 1,02
WIDR mutantní 16,17 1,07
MDA-Mb-468 mutantní 4,88 0,87
AsPC-1 mutantní 0,54 1,08
Caco-2 mutantní 14,59 1,13
MicaPaca2 neznámý 28,43 1,24
* aktivita luciferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu bez promotoru
Výsledky naznačují, že oba tyto responzivní elementy jsou aktivní v buňkách s funkčním p53. Aby bylo potvrzeno, že aktivita promotoru reagujícího na p53 je závislá na funkčnosti p53, byly dvě linie buněk WIDR a U87 transfekovány RGC promotorem, který řídí expresi genu pro luciferasu a buď prázdným kontrolním adenovirovým vektorem (ZZCB) nebo rekombinantním adenovirem konstitutivně produkujícím p53 pod kontrolou CMV promotoru (FTCB). Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v tab. 6.
Tabulka 6 Obnovení/zvýšení aktivity promotoru reagujícího na p53 v buňkách WIDR a U87 po infekci rekombinantním adenovirem kódujícím p53 (relativní aktivita luciferasy*)
virus dávka WIDR U87
ZZCB 1 x 108 1,0 1,0
ZZCB 1 x 109 1,25 0,67
FTCB 1 x 108 4,71 20,30
FTCB 1 x 109 29,00 109,95
‘ aktivita luciferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě infekce ZZCB φφφφ ··· φφφ φ φ · · φ φ φ φ φφ φφφ ·· φφφφ φφ φφφφ φφ φφφ φφ ΦΦ·
Jak je patrné z uvedených údajů, aktivita promotoru reagující na p53 se zvyšuje v závislosti na dávce s rostoucí aktivitou p53.
Byly připraveny rekombinantní adenovirové vektory, které kódují kódující sekvenci E2FRb pod kontrolou buď promotoru reagujícího na dráhu TGF-β (PAI nebo SRE) nebo promotoru reagujícího na dráhu p53 (RGC nebo p53CON). Do vektorů byl jako značka začleněn gen kódující zelený fluoreskující protein. U vzniklých virů byla testována pomocí měření cytopatického efektu (CPE) jejich schopnost selektivně se replikovat a zabíjet buňky s defektem dráhy TGF-β nebo p53. Výsledky jsou ukázány na přiloženém obr. 1. U MRC9 (s pozitivní dráhou p53 i TGF-β) byl wild-type adenovirus schopný replikovat se a indukovat CPE již při nízkých koncentracích (1 x 106 částic/ml), zatímco vektory zacílené na dráhy TGF-β nebo p53 nebyly schopny při těchto koncentracích indukovat CPE. Pouze při testování vyšších dávek (1 x 108 částic/ml) vykazovaly vektory zacílené na danou dráhu určitý CPE. Na druhé straně u linie buněk jako jsou WIDR (defekty v drahách TGF-β i p53) a Hep3B (bez p53 a s defektní dráhou TGF-β při absenci exogenního TGF-β) byly vektory zacílené na určitou dráhu účinnými induktory CPE již při nízkých koncentracích (1 x 106 částic/ml) podobně jako wild-type viry. Fluorescenční mikroskopie buněk Hep3B infikovaných vektory zacílenými na danou dráhu (SRE-Ad a p53CON-Ad) odhalila vysokou hladinu exprese transgenu a rozšíření viru v kultuře, a to již tehdy, byla-lí infikována nízkou koncentrací virových částic (1 x 103 částic/ml, po dobu 2
h). Naopak buňky Hep3B infikované replikačně defektní m (ElA-deletovaným) GFP, který kóduje adenovirus (GFCB), o stejné koncentraci (1 x 105 částic/ml), nevykazovaly žádnou expresi GFP.
Jak již bylo dříve naznačeno, jsou vektory podle předmětného vynálezu schopny se za selektivních podmínek selektivně replikovat a způsobovat lýzi cílové buňky. To však neznamená, že by do těchto vektorů nemohli být začleněni další nositelé selektivity nebo toxicity. Předmětný vynález rovněž poskytuje rekombinantní adenoviry obsahující další modifikace virového genomu jako jsou cílené modifikace, transgenní expresní kazety nebo modifikace virového genomu s cílem usnadnit selektivní replikaci v daném typu buňky nebo v buňce daného fenotypu.
Termín „cílená modifikace“ se vztahuje k modifikacím virového genomu, které jsou navrženy tak, aby výsledkem byla schopnost přednostně infikovat konkrétní typ buňky. Specifita k typu buňky nebo zacílení buněčného typu může být dosaženo také u vektorů odvozených od virů, pro které je charakteristická velká nakažlivost jako např. adenovirus a to modifikací virových obalových proteinů. Zacílení buňky může být provedeno např. u adenovirových vektorů selektivní modifikací virových genomových nevláknitých oblastí (knoflík) a sekvencí • · ·· · · ···· · · * • · · · · · · ···· • · « ····· ·· · ··· ·· ···· ·· ···· ·· ··· ·· ··· kódujících vláknité proteiny. Cílem je dosáhnout exprese modifikovaných nevláknitých a vláknitých domén, které vykazují specifickou interakci se specifickými buněčnými povrchovými receptory. Příklady těchto modifikací jsou popsány např. v publikacích Wickham a kol. (1997) J. Virol 71(11):8221 až 8229 (začlenění RGD peptidu do adenovirových vláknitých proteinů); Arnberg a kol. (1997) Virology 227:239 až 244 (modifikace adenovirových vláknitých genů s cílem dosáhnout tropismu koku a urogenitálnímu ústrojí); Harris a Lemoine (1996) TIG 12(10):400 až 405; Stevenson a kol. (1997) J. Virol. 71(6):4782 až 4790; Michael a kol. (1995) Gene Therapy 2:660 až 668 (začlenění fragmentu peptidu uvolňujícího gastrin do adenovirového vláknitého proteinu); Ohno a kol. (1997) Nátuře Biotechnology 15:763 až 767 (začlenění vazebné domény IgG pro Protein A do viru Sindbis). Mezi jiné způsoby jak dosáhnout specifického zacílení buňky je konjugace protilátek nebo fragmentů protilátek s obalovými proteiny (viz např. Michael a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268:6866 až 6869; Watkins a kol. (1997) Gene Therapy 4:1004 až 1012; Douglas a kol. (1996) Nátuře Biotechnology 14:1574 až 1578. Příležitostně mohou být na povrch viru konjugovány konkrétní skupiny s cílem dosáhnout zacílení (viz Nilson a kol. (1996) Gene Therapy 3:280 až 286 (konjugace EGF k retrovirovým proteinům). Tyto rekombinantně modifikované vektory mohou být produkovány v souladu s praxí předmětného vynálezu.
Termín „transgenní expresní kazeta“ se vztahuje k promotoru funkčnímu v cílové buňce, který je operativně připojen k terapeutickému transgenu. Termín promotor se vztahuje k nukleotidovým sekvencím, které ovlivňují transkripci jiné nukleotidové sekvence. Mezi příklady promotorů patří slabé konstitutivní promotory, časové virové promotory a regulovatelné promotory.
Termín „časové promotory“ se vztahuje k promotorům, které řídí transkripci terapeutického transgenu v pozdějším stadiu cyklu viru ve srovnání s promotorem, který kontroluje expresi promotoru reagujícího na určitou dráhu. Mezi příklady těchto časově regulovaných promotorů patří adenovirový hlavní pozdní promotor (MLP), další promotory jako je E3. V upřednostňovaném provedení vynálezu je použit MLP promotor. V případě virů herpes simplex může být použit promotor LAP (Latent Activated Promotor).
Termín „regulovatelné promotory“ se vztahuje k indukovatelným promotorům, tkáňově specifickým nebo nádorově specifickým promotorům. Termín „indukovatelný promotor“ se vztahuje k promotorům, které usnadňují transkripci terapeutického transgenu výhodně (nebo pouze) za určitých podmínek a/nebo v závislosti na externím chemickém nebo jiném podnětu.
Příklady indukovatelných promotorů jsou ve vědecké literatuře známé (viz např. Yoshida a
Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426 až 430; lida a kol. (1996) J. Virol.
φ· ·· ·· ···· ·· · • · · · ··· * · · · • · · ·♦··· ·· · • · · · · · · · · · · • · · ·· · · · · ·· ·<·· ·· ··· ·· ···
70(9):6054 až 6059; Hwang a kol. (1997) J. Virol 71 (9):7128 až 7131; Lee a kol. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097 až 5105; Dreher a kol. (1997) J. Biol. Chem. 272(46):29364 až 29371. Příklady radiačně indukovatelných promotorů jsou popsány vManome a kol. (1998) Human Gene Therapy 9:1409 ažl417). Jiná úroveň selektivity může být získána při použití tkáňově specifických a nádorově specifických promotorů. Tkáňově specifické a nádorově specifické promotory jsou v dané oblasti techniky velmi dobře známé a zahrnují promotory aktivní zejména v hladkém svalstvu (α-aktinový promotor), specifické pro pankreas (Palmiter a kol. (1987) Cell 50:435), specifické pro játra (Rovet a kol. (1992) J. Biol. Chem. 267:20765; Lemaigne a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268:19896; Nitschr/A-o/. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:4494), specifické pro žaludek (Kovarik a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268:9917; specifické pro hypofýzu (Rhodes a kol. (1993) Genes Dev. 7:913; specifické pro prostatu atd.
Termín „terapeutický transgen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž expresí v cílové buňce vzniká terapeutický účinek. Termín terapeutický transgen zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, geny potlačující nádor, antigenní geny, cytotoxické geny, cytostatické geny, geny aktivující prolék, apoptotické geny, farmaceutické geny nebo antiangiogenní geny. Vektory podle předmětného vynálezu mohou být použity pro produkci jednoho nebo více terapeutických transgenů, buď společně prostřednictvím použití IRES elementů nebo prostřednictvím nezávisle regulovaných promotorů.
Termín „gen potlačující nádor“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v cílové buňce vede ke schopnosti potlačit neoplastický fenotyp a/nebo indukovat apoptózu. Mezi příklady genů potlačujících nádor, které jsou užitečné v provedení předmětného vynálezu, patří gen p53, gen APC, gen DPC-4/Smad4, gen BRCA-1, gen BRCA-2, gen WT-1, retinoblastomový gen (Lee a kol. (1987) Nátuře 329:642), gen MMAC-1, gen pro protein adenomatózní kolipolyposy (Albertsen a kol. US patent 5 783 666, vydaný 21.7.1998), gen DCC, gen MMSC-2, gen NF-1, gen pro potlačení nasofaryngálního karcinomu, který je na chromozómu 3p21.3. (Cheng a kol. (1998) Proč. Nati. Acad. Sci. 95:3042 až 3047), gen MTS1, gen CDK4, gen NF-1, gen NF2 a gen VHL.
Termín „antigenní geny“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v cílové buňce vede k produkci buněčného povrchového antigenního proteinu, který může být rozpoznán imunitním systémem. Mezi příklady antigenních genů patří karcinoembryonický antigen (CEA), p53 (jako je popsán vLevine, Mezinárodní patentová přihláška č. WO94/02167, publikovaná 3.2.1994). Aby bylo usnadněno imunitní rozpoznání, může být antigenní gen fúzován s antigenem I. třídy MHC.
ΦΦ φφ φφ φφφφ φφ φφφφ Φφφ φφ φφ φ φφφφφ φφ
Termín „cytotoxický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k toxickému účinku. Příklady těchto cytotoxických genů zahrnují nukleotidové sekvence kódující pseudomonadový exotoxin, ricinový toxin, toxin diptherie apod.
Termín „cytostatický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k zastavení buněčného cyklu. Mezi příklady těchto cytostatických genů patří p21, retinoblastomový gen, gen fuzního proteinu E2F-Rb, geny kódující inhibitory cyklindependentní kinasy jako např. P16, pl5, p!8 a pl9, specifický homeoboxní gen (GAX) zabraňující růstu (popsán v Branellec a kol., WO97/16459, publikované 9.5.1997 a WO96/30385, publikované 3.10.1996).
Termín „cytokinový gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k produkci cytokinů. Příkladem těchto cytokinů jsou GM-CSF, interleukiny zejména IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferony podtypu a, β a γ zejména interferon a-2b a fuze jako jsou interferon α-2α-1.
Termín „chemokinový gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k produkci cytokinů. Termín chemokin se vztahuje ke skupině strukturně příbuzných nízkomolekulárních cytokinových faktorů, které jsou vylučovány buňkami a které jsou strukturně příbuzné a mají mitogenní, chemotaktické nebo zánětlivé aktivity. Primárně to jsou kationtové proteiny o 70 až 100 aminokyselinových zbytcích, které mají čtyři konzervativní cysteinové zbytky. Tyto proteiny mohou být rozděleny do dvou skupin a to na základě mezer mezi dvěmi N-koncovými cysteiny. V první skupině jsou dva cysteiny oddděleny jediným zbytkem (C-x-C), zatímco ve druhé skupině spolu bezprostředně sousedí (C-C). Mezi „C-x-C“ chemokiny patří např. destičkový faktor 4 (PF4), destičkový základní protein (PBP), interleukin8 (IL-8), protein stimulující aktivitu růstu melanomu (MGSA), makrofágový zánětlivý protein 2 (MIP-2) myší Mig (ml 19), kuřecí 9E3 (nebo pCEF-4), prasečí alveolární makrofágové chemotaktické faktory I a II (AMCF-I a II), faktor stimulující růst pre-B buněk (PBSF) a IP 10. Mezi členy „C-C“ skupiny patří např., aniž by tím však byl jakkoliv limitován, monocytový chemotaktický protein 1 (MPC-1), monocytový chemotaktický protein 2 (MCP-2), monocytový chemotaktický protein 3 (MPC-3), monocytový chemotaktický protein 4 (MCP-4), makrofágový zánětlivý protein 1 a (MIP-1-a), makrofágový zánětlivý protein 1 β (MIP-1-β), makrofágový zánětlivý protein 1 γ (ΜΠΜ-γ), makrofágový zánětlivý protein 3-a (MIP-3-a), makrofágový zánětlivý protein 3 β (MIP-3-β), chemokin (ELC), makrofágový zánětlivý protein 4 (MIP-4), makrofágový zánětlivý protein 5 (MIP-5), LD78 β, RANTES, SIS-epsilon (p500), chemokin thymu a chemokin regulovaný aktivací (TARC), eotaxin, 1-309, lidský protein HCC-l/NCC-2, lidský protein HCC-3, myší protein C10.
• 4 94 · 9 9999 99 • •99 ··· · 9 ·
9 99099 09
Termín „farmaceutický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese vede k produkci proteinu, který v cílové buňce vykazuje farmaceutický účinek. Mezi příklady farmaceutických genů patří proinsulinový gen a jeho analogy (jako je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce č. WO98/31397 gen pro růstový hormon, dopamin, serotonin, epidermální růstový faktor, GABA, ACTH, NGF, VEGF (pro zvýšení zásobování cílové tkáně krví, pro indukci angiogeneze, WO98/32859, publikované 30.7.1998), thrombospondin atd.
Termín „proapoptotický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese vede k programované smrti buňky. Mezi příklady proapototických genů patří p53, adenovirový E311.6K (pocházející zAd2) nebo adenovirový E3-1O.5K (odvozený od Ad), adenovirový gen E4orf4, geny p53 dráhy a geny kódující kaspasy.
Termín „geny aktivující prolék“ se vztahuje k nukleotidovým sekvencím, jejíchž exprese vede k produkci proteinu, který je schopen převádět terapeuticky neúčinnou sloučeninu na terapeuticky účinnou, která činí buňku náchylnou ke smrti vlivem vnějších faktorů nebo která způsobuje toxické podmínky v buňce. Příkladem genu aktivujícího prolék je gen pro cytosindeaminasu. Cytosindeaminasa přeměňuje 5-fluorocytosin (5-FC) na 5-fluorouracil (5FU), což je účinná protinádorová látka. Lýze nádorových buněk poskytuje místní shluk cytosindeaminasy, která je schopna v daném místě nádoru přeměňovat 5FC na 5FU a výsledkem je usmrcení mnoha okolních nádorových buněk. Toto vede ke smrti velkého počtu nádorových buněk a to bez nutnosti infikovat tyto buňky adenovirem (také označováno jako „efekt vedlestojícího“). Rovněž může být použit gen thymidinkinasy (TK) (viz Woo a kol., US patent č. 5 631 236, vydaný 20.5.1997 a Freeman a kol. US patent č. 5 601 818, vydaný 11.2.1997), přičemž buňky exprimující produkt genu TK jsou náchylné k selektivnímu usmrcení podáváním gancykloviru.
Termín „antiangiogenní“ geny se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese vede k extracelulární exkreci antiangiogenních faktorů. Antiangiogenní faktory zahrnují angiostatin, inhibitory vaskulárního endotelového růstového faktoru (VEGF) jako je Tie 2 (popsáno v PNAS(USA) (1998) 95:8795 až 8800), endostatin.
Odborníkům vdané oblasti techniky bude jistě zřejmé, že pro použití v provedení předmětného vynálezu mohou být učiněny modifikace a/nebo delece výše zmíněných genů, které by kódovaly funkční subfragmenty wild-type proteinu. Například odkaz na gen p53 nezahrnuje pouze wild-type protein, ale také modifikované p53 proteiny. Mezi příklady těchto modifikovaných p53 proteinů patří takové modifikace p53, které zvyšují jadernou retenci, delece např. aminokyselin Δ13-19, jejíž cílem je eliminovat konvenční místo štěpení pro kalpain.
·· *«· ·♦♦·♦· ·· · • · · · ··· ···· • · · · · 999 9 9 9 • · · · · · ···· · ··· · · ···· ·· ♦ ··· ·· ··· ·· ··· modifikace s cílem oligomerizovat domény (jako je popsáno v Bracco a kol., WO97/0492 nebo v US patentu č. 5 573 925).
Odborníkům v dané oblasti techniky bude zřejmé, že výše zmíněné terapeutické geny mohou být vylučovány do média nebo mohou být lokalizovány do konkrétních intracelulárních míst a to prostřednictvím začlenění směřující skupiny jako je signální peptid nebo signál pro jadernou lokalizaci (NLS). V definici terapeutického transgenu jsou rovněž zahrnuty fúzní proteiny terapeutického transgenu se strukturním proteinem viru herpes simplex typu 1 (HSV-1) VP22. Fúzní proteiny obsahující VP22 signál, jsou v případě, kdy jsou syntetizovány v infikované buňce, exportovány ven z infikované buňky a účinně pronikají do okolních neinfikovaných buněk a to do vzdálenosti přibližně 16 buněk. Tento systém je konkrétně užitečný ve spojení s transkripčně aktivními proteiny (např. p53), protože fúzní proteiny jsou účinně transportovány do jádra okolních buněk. Toto je uvedeno např. v Elliott, G. & O'Hare, P. Cell. 88:223 až 233 (1997); Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nátuře Biotechnology. 15:205 (1997); O Hare a kol. WO97/05265, publikované 13.2.1997. Podobné směřující skupiny odvozené od HIV Tat proteinu jsou popsány také v Vives a kol. (1997) J. Biol. Chem. 272:1601 až 16017.
Mezi další modifikace, které vedou ke zvýšení účinnosti vektorů podle předmětného vynálezu, patří, aniž by však byly jakkoliv limitující, změny v rámci El, začlenění mutací do E4 s cílem zvýšit cytotoxicitu (Muller a kol. (1992) J. Virol. 66:5867 až 5878), vyšší regulace virových smrtících proteinů jako jsou proteiny E4orf4 nebo E3 11,6K.
V upřednostňovaném provedení vynálezu a je to doloženo příklady, obsahuje vektor předmětného vynálezu adenovirus replikující se v závislosti na podmínkách, který obsahuje promotor reagující na dráhu p53 nebo TGF-β, kteiý řídí expresi fuzního proteinu E2F-Rb. Dále vektor obsahuje gen cytosindeaminasy, který je pod kontrolou časového E3 promotoru. V těchto případech je cytosindeaminasa produkována v nádorových buňkách pouze po replikaci viru. V upřednostňovaném provedení předmětného vynálezu je gen pro přeměnu proléku pod kontrolou relativně slabého nebo tkáňově specifického nebo nádorově specifického promotoru.
V jiném provedení předmětného vynálezu vektor obsahuje rekombinantní adenovirus s promotorem reagujícím na dráhu p53 nebo TGF-β, který řídí expresi fuzního proteinu E2F-Rb a transgenní expresní kazetu exprimující cytosindeaminasu samotnou nebo v bi-cistronické expresní kazetě obsahující cytosindeaminasu a prvek IRES a protein MEP-3-alpha. Protože je cytosindeaminasa exprimována, je po podání proléku jako je 5-fluorocytosin dosaženo usmrcení nádorové buňky. Nízká hladina exprese MEP-3-alpha bude pomáhat ve vývoji protinádorové imunity.
• · ·♦ · · · · · · ·· • · · · φφφ · · · • · φ ΦΦΦΦ· φφ
V souvislosti s konstrukcí prvků reagujících na určitou dráhu, jako je např. produkce terapeutického účinku, kdy může být současně sledována více než jedna dráha, jsou zde používány zaměnitelně víceúrovňové, multifunkční nebo násobné kaskády reagující na danou dráhu. Odborníkům v dané oblasti techniky bude zřejmé, že vektorové kontrolní prvky, které jsou popsány výše, mohou být kombinovány a to tak, aby poskytly násobnou úroveň selektivity vektorů podle předmětného vynálezu. Jako příklad multiúrovňové kontroly je možno uvést adenovirus replikující se v závislosti na podmínkách, který se může replikovat a zabíjet buňky, které mají defekty bud’ vRb, TGF-β nebo p53 dráze. Tyto vektory budou zahrnovat expresi dominantního negativního inhibitoru replikace viru kontrolované promotorem reagujícím na dráhu p53 jakožto primární úroveň kontroly. Výsledkem v jakékoliv buňce s funkčním p53 (jako jsou všechny normální buňky), ale nikoliv v buňce s inaktivním p53, bude exprese dominantního negativního inhibitoru a replikace viru bude blokována. Tento vektor se však může replikovat v nádorových buňkách s funkčním p53, ale s defekty v jiných drahách jako např. TGF-β a Rb dráze. Tudíž mohou být inzertovány další úrovně kontroly, které budou podstatně inaktivovat funkční p53 v nádorových buňkách, čímž umožní replikaci viru i když jsou jiné dráhy defektní.
Jako druhou úroveň kontroly bude stejný vektor obsahovat expresní kazetu obsahující adenovirový protein E1B-55K, který může funkčně inaktivovat p53, pod kontrolou promotoru, který je aktivní pouze v buňkách s defektní TGF-β dráhou. Promotor, který je aktivní pouze v buňkách s defektní TGF-β dráhou, může být konstruován inzertováním vazebných míst pro represor do promotoru a to tak, že exprese represoru pomocí promotoru reagujícího na TGF-β někde na vektoru povede k blokování aktivity promotoru v buňkách s neporušeným TGF-β signalizováním. Na druhé straně v buňkách, které mají TGF-β dráhu defektní nebude represor syntetizován a tudíž bude promotor aktivní. Vzhledem k expresi E1B-55K pomocí promotoru, který je aktivní pouze v buňkách s defektní TGF-β dráhou, je inaktivován endogenní p53. Příležitostně může být použit jakýkoliv přirozený promotor, jehož aktivita je z důvodu TGF-β signalizování snižována. Začlenění dvou výše zmíněných expresních kazet zajistí, že dominantní negativní inhibitor bude exprimován pouze tehdy, když budou dráhy p53 i TGF-β normální (vede k blokování replikace), ale nikoliv tehdy, když bude jedna nebo obě dráhy defektní (vede k replikaci viru).
Jako třetí úroveň kontroly je ve stejném vektoru použita exprese proteinu jako je Smad7 nebo jakákoliv jiná dominantní negativní forma Smad, která je schopna inaktivovat TGF-β dráhu (Nakao a kol. Nátuře 1997 389 (6651):631 až 635) a je kontrolována E2F responzivním promotorem. E2F responzivní promotor (jako je E2F1 promotor, E2 promotor nebo syntetický promotor s více vazebnými místy pro E2F upstream k minimálnímu promotoru jako je SV40 ·· 44 ♦ ♦ ··· 4 44 • 4 4 ♦ · · 4 · ·4 • 4 4 · 4 · 4 4 ··
4 4 ·· 4 44 • 4 4444 44 ·444* 4
ΤΑΤΑ box) je aktivní tehdy, je-li Rb dráha defektní. Vzhledem ke třetí úrovni kontroly je v buňkách s defektní Rb dráhou exprimován Smad7, který naopak inaktivuje Smad4 a blokuje cestu přenosu signálu TGF-β. Tudíž je vytvořen E1B-55K a p53 je inaktivován, což vede k nedostatečné expresi dominantního negativního inhibitoru. V důsledku toho může replikace viru probíhat. Na druhé straně, jestliže je Rb dráha normální, pak Smad7 není syntetizován a cesta přenosu signálu TGF-β tedy probíhá normálně. Proto tedy není vytvořen E1B-55K a výsledkem je funkční p53, který je schopen exprimovat dominantní negativní inhibitor a tím blokovat replikaci viru.
U všech tří výše uvedených úrovní kontroly může vést defekt jedné nebo dvou nebo tří drah (Rb, TGF-β a p53) k replikaci viru a buněčné lýzi. Replikace viru nebude probíhat pouze tehdy, když budou všechny tři dráhy funkční jako tomu je v normálních buňkách.
Jak jistě ocení odborníci v dané oblasti techniky, mohou být vektory předmětného vynálezu použity v mnoha modifikacích při detekci a léčbě širokého spektra defektů drah a to pomocí řady promotorů reagujících na určitou dráhu. V upřednostňovaném provedení vynálezu a je to doloženo příkladem, je však rekombinantni adenovirový vektor odvozen od rodu Adenoviridiae. Konkrétně upřednostňované viry jsou odvozeny od lidského adenoviru typu 2 nebo 5. Jestliže je použit adenovirový vektor jakožto rodičovský vektor, pak je výhodným inhibitorem replikace viru fuzní protein E2F-RB.
Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu je v případě, jsou-li použity vektory předmětného vynálezu k léčbě onemocnění spojených s nekontrolovaným buněčným rozmnožováním, upřednostňováno použití adenovirového vektoru obsahujícího specifické delece v oblasti El A a to takové, aby došlo k eliminaci schopnosti produktu genu Ela vázat se na p300 a Rb proteiny, zatímco transaktivační funkce domény Ela CR3 zůstává nezměněna. Vektory předmětného vynálezu obsahují delece v kódující sekvenci Ela s cílem eliminovat p300 a pl05Rb vazebná místa v 13S kódující sekvenci. Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu jsou p300 vazebné delece reprezentovány delecemi aminokyselin od asi 4 do asi 25 nebo od asi 36 do asi 49.
Delece v sekvenci kódující Ela 289R nezbytné pro dosažení eliminace vazby p300 a pRb jsou výhodněji co nej menší a to proto, aby bylo zabráněno porušeni sekundární a terciární struktury proteinu Ela289R. Aby byla vyloučena vazba p300, je výhodnější, aby byla v sekvenci DNA kódující p300 vazebné domény 289R začleněna mutace. Z pohledu eliminace p300 vazby jsou výhodnější delece méně než asi 30 aminokyselin v C-koncové oblasti, ačkoliv výhodné jsou rovněž menší modifikace. Například příležitostně jsou výhodné delece aminokyselin 4 až 25 (dli 101), od aminokyseliny asi 30 do aminokyseliny asi 49 (dli 103) a ještě
99 999999 ·· • 9 « · · 9 9 99
9 99999 99 konkrétněji 36 až 49, které eliminují vazbu p300. Konkrétně jsou výhodné takové bodové mutace, aby byly dostatečné pro porušení vazby p300. Jako mutace porušující vazbu p300 je uváděna například bodová mutace v proteinu 289R druhé aminokyseliny argininu, která je vyměněna za glycin (Arg2-Gly2) (viz např. pm563, Whyte a kol., (1989) Cell 56:67 až 75). Podobně jsou minimální modifikace výhodné z pohledu eliminování vazby pRblO5. Výhodné jsou eliminace selektivních aminokyselin ve vazebné doméně pRblO5 jako jsou aminokyseliny 111 až 123 (dli 107) a aminokyselin 124 až 127 (dli 108). Delece aminokyselin 111 až 123 (dli 107) je výhodná konkrétně proto, že zachovává pl07 vazebnou aktivitu proteinu 289R.
Dále mohou být začleněny eliminace aminokyselin od přibližně 219 do 289 v proteinu Ela 289R a 173 až 243 proteinu El A 243R. Například začleněním bodové mutace v pozici odpovídající pozici 1131 vgenomu lidského Ad5 (tzn. záměna cytosinu1131 za guanin) vytváří stop kodón. Tato mutace vede k eliminaci aminokyselin 219 až 289 proteinu Ela 289R a 173 až 243 proteinu El A 243R. Kromě delecí v Rb a p300 vazbě, které jsou popsány výše, je případně prováděna tato mutace. Další příklady těchto rodičovských vektorů jsou popsány v podaných US patentových přihláškách č. 60/104 317 a 08/09/172 684, podaných 15.10.1998.
Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu, což je zde také doloženo příkladem, jsou výhodnějšími promotory reagujícími na p53 dráhu p53-CON a RGC. Výhodnější promotory reagující na dráhu TGF-β jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří PAI-RE a SRE.
Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu je terapeutickým genem gen, aktivující prolék např. cytosindeaminasový. Ve výhodnějším provedení vynálezu pro indukci protinádorové imunity kóduje vektor podle předmětného vynálezu MIP-3-alpha.
Výhodnějšími promotory pro expresi terapeutického genu jsou časové promotory jako je MLP aE3.
V adenovirových konstruktech je dosahováno eliminace nebo zpoždění činnosti proteinu Ad E3-11.6 K jejichž úkolem je minimalizovat buněčnou lýzi indukovanou adenovirem předcházející replikaci. Konkrétně by měla být výhodnější eliminace nativního genu E311.6K/10.5K. To by mělo minimalizovat imunitní odezvu do té doby, dokud se neuskuteční počáteční fáze místního rozšíření. V této pozdější době, jakmile je dosaženo apoptózy nejdříve infikovaných buněk a je umožněno místní rozšíření viru, by měla být imunitní odpověď výhodná. Protein 11.6K (nebo odpovídající protein E3-1O.5K v Ad5) je proapoptotický gen a může být použit pro dosažení buněčné smrti v nádorových buňkách. Protože se však předpokládá, že dojde k pozdržení počáteční lýze cílové buňky, je z pohledu maximalizace replikace viru výhodnější, aby byl gen 11.6K/10.5K umístěn pod kontrolu časového promotoru jako je MLP promotor a to proto, aby byl pozdržen nástup jeho apoptotického účinku.
• 4 44 44 444 t 44 *·*· · 4 4 ·*· • 4 4 4 * 4 · 4 4 4 «4 4444 4444
44» 4 4 444
4444 44 «44 44 4
Farmaceutické formulace
Předmětný vynález dále poskytuje farmaceuticky přijatelnou formulaci rekombinantních virů v kombinaci s nosičem. Vektory předmětného vynálezu mohou být v praxi formulovány pro aplikaci v dávkách a to v souladu s běžnými farmaceutickými přípravky s přídavkem nosičů a pomocných látek. Dávkovači formulace mohou zahrnovat aplikaci intravenózní, intratumorální, intramuskulární, intraperitonální, topikální, ložiskovou nebo aplikaci ve formě spreje.
Termín „nosič“ se vztahuje ke sloučeninám běžně používaným při formulaci farmaceutických sloučenin, které se používají pro zvýšení stability, sterility a dopravitelnosti terapeutické sloučeniny. Jestliže je virus formulován ve formě roztoku nebo suspenze, je systémem pro dopravení přijatelný nosič výhodněji vodný nosič. Může být použita řada vodných nosičů např. voda, pufrovaná voda, 0,8% fyziologický roztok, 0,3% glycin, hyaluronová kyselina a podobné. Tyto sloučeniny mohou být sterilizovány příslušnými, v dané oblasti techniky dobře známými, sterilizačními způsoby nebo mohou být sterilně přefiltrovány. Výsledné vodné roztoky mohou být přímo zabaleny a určeny pro použití nebo mohou být lyofilizovány a pak je třeba před podáváním lyofilizovaný preparát smíchat se sterilním roztokem. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné doplňkové látky, které jsou nutné pro přiblížení fyziologických podmínek jako je úprava pH a to jsou např. pufrující činidla, činidla upravující pružnost, smáčecí prostředky a podobné například acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, sorpční monolaurát, triethanolaminoleát atd.
Předmětný vynález dále poskytuje farmaceutické formulace virů podle předmětného vynálezu s nosičem a činidlem(y) usnadňujícím dopravení. Termíny „usnadnění dopravení“ nebo „činidla usnadňující dopravení“ jsou zde používány zaměnitelně a zahrnují jedno nebo více činidel, které usnadňují zachycení viru do cílové buňky. Příklady činidel usnadňujících dopravení jsou popsány v podaných US patentových přihláškách č. 09/112 074, podané 8.7.1998 a 08/938 089, podané 26.9.1997. Mezi příklady činidel usnadňujících dopravení patří detergenty, alkoholy, glykoly, povrchově aktivní činidla, soli kyseliny žlučové, heparinové antagonisty, inhibitory cyklooxygenasy, hypertonické roztoky solí a acetáty. Alkoholy zahrnují například alifatické alkoholy jako je ethanol, N-propanol, isopropanol, butylakohol, acetylalkohol. Mezi glykoly patří glycerin, propylenglykol, polyethylenglykol a další nízkomolekulámí glykoly jako je glycerol a thioglycerol. Acetáty jako je kyselina octová, glukonová kyselina a acetát sodný jsou dalšími příklady činidel usnadňujících dopravení. Hypertonické roztoky solí jako je 1M NaCl jsou také příklady činidel usnadňujících dopravení. Příkladem povrchově aktivních činidel jsou dodecylsulfát sodný (SDS) a lysolecithin, polysorbát 80, nonylfenoxypolyoxyethylen, ·· ···»
«<
• · · *
«4 ·♦·· lysofosfatídylcholin, polyethylenglykol 400, polyoxyethylenéthery, povrchově aktivní činidla na bázi polyglykolétheru a DMSO. Mohou být použity soli kyseliny žlučové jako je taurocholát, taurodeoxycholát sodný, deoxycholát, chenodesoxycholát, kyselina glykocholová, kyselina glykochenodeoxycholová a další astringentní látky jako je dusičnan stříbrný. Rovněž mohou být použity heparinové antagonisty jako kvarterní aminy např. protaminsulfát. Mohou být použity cyklooxygenasové inhibitory jako je salicylát sodný, kyselina salicylová a nesteroidní protizánětlivé léky (NSAIDS) jako je indomethacin, naproxen, diclofenak. Činidla usnadňující dopravení zahrnují sloučeniny podle obecného vzorce (I):
(I) kde XI a X2 jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří skupina kyseliny cholové, skupina kyseliny deoxycholové a sacharidová skupina, m je celé číslo od 2 do 8 a výhodněji 2 nebo 3, n je celé číslo od 2 do 8 a výhodněji 2 nebo 3 a R je kationtová skupina, sacharidová skupina nebo struktura -CO-X3, kde X3 je sacharidová skupina. Sacharidová skupina může být vybrána ze skupiny, kterou tvoří pentózové monosacharidové skupiny, hexosové monosacharidové skupiny, disacharidové skupiny pentóza-pentóza, disacharidové skupiny hexóza-hexóza, disacharidové skupiny pentóza-hexóza, disacharidové skupiny hexóza-pentóza.
Termín „detergent“ zahrnuje aniontové, kationtové, zwitterionové a neionogenní detergenty. Mezi exemplární příklady detergentů patří, ale nejsou v žádném smyslu limitující, taurocholát, deoxycholát, taurodeoxycholát, cetylpyridinium, benalkoniumchlorid, Zwittergent 3-14, CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamoniol]-l-propansulfonáthydrát), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, Triton-X-100, C12E8, oktyl-P-D-glukopyranosid, PLURONIC-F68, Tween 20 a Tween 80 (CalBiochem Biochemicals).
Jednotka dávkovači formulace podle předmětného vynálezu může být součástí soupravy obsahující rekombinantni virus podle nároku 1 v lyofílizované formě a roztok pro rozpuštění lyofilizovaného produktu. Rekombinantni viry předmětného vynálezu mohou být lyofilizovány běžnými způsoby a poté opět rozpuštěny.
Vektory předmětného vynálezu mohou být aplikovány také v kombinaci s kalpainovými inhibitory. „Kalpainový inhibitor“ (zkráceně „Cl“) se vztahuje ke sloučenině, která inhibuje proteolytický účinek kalpainu-I resp. μ-kalpainů. Termín kalpainové inhibitory, který je zde • Φ φφ ·· ΦΦ·Φ ·· · φ · φ φ · * φ · · φφ • φ φ φ · φφ » ··· φφ φ · φ · φφφ· · φφφ φφ φφφφ • Φ ···· φφ φφφ ·· ·» používán, zahrnuje takové sloučeniny, které mají inhibiční aktivitu vůči kalpainu-I jako dodatek ke svým dalším biologickým aktivitám nebo ji mají nezávisle na svých biologických aktivitách. Jako sloučeniny, které vykazují aktivitu v procesu inhibování proteolytické činnosti kalpainů, je uváděno široké spektrum sloučenin. Mezi příklady kalpainových inhibitorů, které jsou užitečné v provedení předmětného vynálezu, patří N-acetyl-Leu-Leu-norleucinal rovněž známý jako „kalpainový inhibitor 1“. Kalpainové inhibitory byly sledovány z pohledu zvýšení možnosti infekce buněk s ohledem na virové vektory, zvýšení transkripce od promotorů prostřednictvím zvýšení hladin transkripčních faktorů NF-kappaB a AP-1 a z důvodu snížení CTL odezvy na adenovirové vektory. Z tohoto důvodu mohou formulace a způsoby podle předmětného vynálezu příležitostně zahrnovat kalpainové inhibitory. Kalpainové inhibitory a jejich aplikace jsou popsány vAtencio a kol. US patentová přihláška č. 60/104 321 a 09/073 076, podané 15.10.1998.
Způsoby použití
Předmětný vynález poskytuje způsoby usmrcení buňky s určitou defektní regulační dráhou pomocí kontaktu cílové buňky se selektivně se replikujícím vektorem podle předmětného vynálezu. V jednom provedení vynálezu a je to zde doloženo příkladem, je buňkou obsahující defekt dané dráhy buňka neoplastická. Termín „neoplastická buňka“ je buňka vykazující odlišný růstový fenotyp, charakteristický svou nezávislostí na regulaci buněčného růstu, která se vyskytuje u normální buňky. Protože neoplastické buňky se nezbytně nemusí v libovolném časovém okamžiku replikovat, zahrnuje termín neoplastické buňky buňky, které se mohou účinně replikovat nebo se mohou nacházet v dočasném klidovém stavu, kdy se nereplikují (G1 nebo G0). Místní populace neoplastických buněk jsou označovány jako novotvary. Novotvary mohou být maligní nebo benigní. Maligní novotvary jsou rovněž označovány jako karcinomy. Termín karcinom je zde používán zaměnitelně s pojmem nádor. Neoplastická transformace se vztahuje k přeměně normální buňky na neoplastickou často nádorovou buňku.
Předmětný vynález poskytuje způsob ablace neoplastických buněk v savčím organismu in vivo a to podáváním farmaceuticky přijatelné formulace rekombinantního adenoviru podle předmětného vynálezu. Termín „ablace“ znamená podstatné snížení populace životaschopných neoplastických buněk tak, aby došlo ke zmírnění špatných fyziologických projevů způsobených přítomností neoplastických buněk. Termín „podstatně“ znamená vyšší než přibližně 20 % snížení populace životaschopných neoplastických buněk v savčím organismu. Termín „životaschopné“ znamená vykazující nekontrolovaný růst a mající regulační charakteristiky buněčného cyklu • · ·· · · · · · · · ·· • · · · ··· ·«·· • · · · · ··· · ·· • · ···· ·····
Λ z- ··· ·· · · ·· z ο ·· ···· ·· ··· ····· neoplastické buňky. Termín „životaschopná neoplastická buňka“ je zde používán pro rozlišení zmíněných buněk od neoplastických buněk, které již nejsou schopny se replikovat. Například nádor může zůstat i po ošetřeni, avšak populace buněk obsahujících nádorovou masu může být mrtvá. Tyto mrtvé buňky jsou odstraněny a postrádají schopnost se replikovat i když určitá nádorová masa zůstala.
Termín „savčí organismus“ zahrnuje, ale není tím nijak limitován, lidský, prasečí, koňský, kravský, psí a kočičí organismus. Výhodnější je použít adenovirový vektor endogenní vůči typu savce, který je léčen. Ačkoliv je obecně upřednostňováno, aby byl použit virus ze stejného druhu jako je druh, který má být léčen, v určitých případech může být výhodné použít vektory odvozené od odlišného druhu, který disponuje výhodnými patogenními znaky. Například bylo uvedeno (WO 97/06826, publikováno 10.4.1997), že ovčí adenovirové vektory mohou být použity v genové terapii u lidí pro minimalizaci charakteristik imunitní odezvy lidských adenovirových vektorů. Minimalizováním imunitní odezvy je zabráněno rychlé systemické samolikvidaci (clearance) vektoru, což vede k delšímu trvání účinku vektoru.
Vektory podle předmětného vynálezu je možno konkrétně aplikovat v léčbě nádorů spojených s nedostatečnou antirozmnožovací činností TGF-β včetně karcinomů prsu, tlustého střeva a karcinomů kůže, stejně tak jako v souvislosti s B a T lymfomy (Markowitz & Roberts, 1996). Mutace TGF-β receptoru typu II byly identifikovány v karcinomech tlustého střeva, trávicího traktu, hlavy a šupinatých buněk krku. Mutace nebo delece receptorů typu I byly nalezeny také v Kaposově sarkomu, nádorech prsu, vaječníku a kolorekta. Mezi intracelulárními efektory signalizování TGF-β, byly jako možné supresorové geny, potlačující nádor, identifikovány Smad a Smad4/DPC4, které byly změněny přibližně v 50 % nádorů pankreasu. Změna genu DPC4 byla zjištěna také u nádorů tlustého střeva, prsu a vaječníku, ačkoliv s mnohem menší frekvencí výskytu. Vektory podle předmětného vynálezu je možno aplikovat konkrétně pro léčbu nádorů necitlivých na TGF-β jako je např. karcinom pankreasu.
Vektory podle předmětného vynálezu je možno aplikovat také na léčbu nádorových buněk, obsahujících defekty dráhy p53. Mezi tyto nádory patří takové, které vykazují změny vp53, mdm2 a pl4/pl9ARF(INK4a gen). Vektory podle předmětného vynálezu jsou také užitečné v ošetření karcinomových buněk s defekty Rb dráhy. Defekty Rb dráhy jsou výsledkem změn v Rb, cyklinu D, cyklin-dependentní kinase (jako je CDK4) a pl6 (INK4a gen).
Ačkoliv předmětný vynález poskytuje způsob použití samotných rekombinantních adenovirů, rekombinantní adenoviry podle předmětného vynálezu a jejich formulace mohou být použity v kombinaci s odpovídajícími chemoterapeutickými činidly nebo léčebnými režimy.
Jako příklady těchto chemoterapeutických činidel je možno uvést inhibitory syntézy purinů • · ·· · · · · · · ·· · ···· · · · · · · · ·· · ····· ·· · ··· ·· · · · · ·· ···· ·· ··· ·· ··· (např. pentostatin, 6-merkaptopurin, 6-thioguanin, methotrexát) nebo syntézy pyrimidinů (např. Pala, azarbin), přeměny ribonukleotidů na deoxyribonukleotidy (např. hydroxymočovina), inhibitory syntézy dTMP (5-fluorouracil), činidla poškozující DNA (např. záření, bleomyciny, etoposidy, teniposidy, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitoxantron, alkylační činidla, mitomycin, cisplatin, prokarbazin), ale také inhibitory funkce mikrotubulů (např. vinca alkaloidy a colchicin). Chemoterapeutické léčebné režimy se týkají zejména nechemických procesů navržených pro odstranění neoplastických buněk jako je např. ozařování. Příklady kombinované terapie pro případ, že terapeutickým genem je p53, jsou popsány v Nielsen a kol. WO/9 835 5 54A2, publikované 20.8.1998.
Imunologická odezva je významná pro opakované in vivo podávání virových vektorů. Vektory podle předmětného vynálezu mohou být podávány v kombinaci s imunosupresivními činidly. Mezi příklady imunosupresivních činidel patří cyklosporin, azathioprin, methotrexát, cyklofosfamid, lymfocytový imunoglobulin, protilátky proti CD3 komplexu, adrenokortikosteroidy, sulfasalzain, FK-506, methoxsalen a thalidomid.
Předmětný vynález rovněž poskytuje způsob odstranění neoplastických buněk v populaci normálních buněk kontaminovaných zmíněnými neoplastickými buňkami ex vivo a to prostřednictvím podávání rekombinantních adenovirů podle předmětného vynálezu zmíněné populaci. Příkladem aplikace tohoto postupu je postup, který je běžně používán při ex vivo aplikacích a to očištění od autologních produktů kmenové buňky, což je obecně známo pod názvem očištění kostní dřeně. Termín „produkt kmenové buňky“ se vztahuje k populaci hematopoietických, progenitorových a kmenových buněk, které jsou schopny obnovit dlouhodobou hematopietickou funkci pacienta, který podstoupil myoablativní terapii. Produkty kmenové buňky jsou obecně získány odejmutím (aferezí) zmobilizované nebo nezmobilizované periferní krve. Aferéze je běžně prováděna známými postupy pomocí komerčně dostupných přístrojů pro aferézi jako je COBE Spectra Apheresis Systém, komerčně dostupný od COBE Intemational, Oak Street 1185, Lakewood, CO, USA. Pro optimalizaci léčebných stavů je výhodnější provést „3-log očištění (tzn. odstranění přibližně 99,9 % nádorových buněk z produktu kmenové buňky) a nejvýhodnější je „5-log očištění“ (odstranění 99,999 % nádorových buněk z produktu kmenové buňky). Ve výhodném provedení předmětného vynálezu by měl být ošetřen produkt kmenové buňky o objemu 100 ml při poměru počtu částic ku buňkám přibližně 2 x 1011 vektorů podle předmětného vynálezu, době přibližně 4 h a při teplotě 37 °C.
9 9· · · · ···· ··· · · · · • · · ····· · · · • · · · · · · · · ♦ · 7R ··· ······
Z, O II ···· ·· < · · · · ···
Diagnostické aplikace
Kromě terapeutických aplikací, které jsou popsány výše, jsou vektory podle předmětného vynálezu užitečné také pro diagnostické účely. Vektory podle předmětného vynálezu mohou být například začleněny do oznamovacího genu, který je exprimován po infekci viru nebo po jeho replikaci. Termín „oznamovací gen“ se vztahuje ke genu, jehož produkt je schopný produkovat detekovatelný signál ať již sám o sobě nebo v kombinaci s dalšími prvky. K příkladům oznamovacích genů patří gen β-galaktosidasy, gen pro luciferasu, gen pro zelený fluorescenční protein, nukleotidové sekvence kódující proteiny, které lze detekovat různými systémy jako je rentgenové záření nebo systémy využívající magnetické pole (MRI). Tyto vektory by mohly být užitečné pro detekci přítomnosti funkční dráhy (např.p53 nebo TGF-β dráhy). Tyto vektory mohou být také příležitostně použity pro expresi buněčných povrchových proteinů schopných rozpoznávat prostřednictvím vazby molekuly jako je fluorescenčně označená protilátka. V případě, kdy je promotor reagující na určitou dráhu použit pro řízení represoru replikace viru (např. E2F-Rb), mohou být pro řízení oznamovacího genu pro diagnostické aplikace, kdy je promotor reagující na určitou dráhu zablokován, použity pozdní promotory viru (např. E2, který je vypnut prostřednictvím E2F-Rb nebo jakýkoliv jiný promotor s vazebnými místy pro represor např. vazebnými místy pro E2F). Tyto diagnostické konstrukty mohou být použity pro diagnostické účely in vivo nebo in vitro. Příklady in vivo aplikací zahrnují rentgenové záření, CT snímání nebo magnetickou rezonanci (MRI).
Způsoby přípravy vektorů
Předmětný vynález dále poskytuje způsob přípravy rekombinantních virů popsaných výše. Zmíněný způsob se skládá z následujících kroků:
a. infekce produkční buňky rekombinantním virem
b. kultivace zmíněné infikované produkční buňky za takových podmínek, kdy je umožněna replikace virového genomu v produkční buňce
c. sklizení produkčních buněk a
d. přečištění rekombinantního viru
Termín „infikování“ znamená vystavení rekombinantního viru produkující buňce za takových podmínek, které usnadňují infekci produkující buňky rekombinantním adeno virem. V buňkách, které byly infikovány několika kopiemi daného viru, jsou aktivity nezbytné pro • · · · ·· · · · · · · ···· · · · ·· • · · ·«··· · · replikaci viru a sbalení virionu kooperativní. Proto je tedy výhodnější, aby byly podmínky upraveny tak, aby existovala významná pravděpodobnost, že produkční buňky budou násobně infikovány virem. Příkladem podmínky, která zvyšuje produkci viru v produkční buňce je zvýšená koncentrace viru ve fázi infekce. Je však možné, že celkové číslo infekce virem připadající na jednu produkční buňku může být překročeno a pak dojde k toxickým účinkům na buňku. Proto by měla být infekce prováděna při koncentracích viru v rozmezí 1 x 106 až 1 x 1O10, výhodněji 1 x 109 virionů připadajících na 1 ml. Pro zvýšení infekce linie produkčních buněk mohou být použita chemická činidla. Předmětný vynález například poskytuje způsob jak zvýšit infekci linií produkčních buněk virem a to prostřednictvím začlenění inhibitoru kalpainu. Mezi příklady kalpainových inhibitorů, které jsou užitečné v provedení předmětného vynálezu, patří kalpainový inhibitor 1 (rovněž známý jako N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal, komerčně dostupný od Boehringer Mannheim). U kalpainového inhibitoru 1 bylo zjištěno, že zvyšuje možnost infekce linií produkčních buněk rekombinantním adenovirem.
Termín „produkční buňka“ znamená buňku, která je schopna umožnit replikaci virového genomu rekombinantního adenoviru, aby byl produkován. Pro kulturu rekombinantních adenovirů je veřejně dostupná řada savčích buněčných linií. Například pro doplnění nedostatků v El funkci byla připravena linie buněk 293 (Graham a Smiley (1977) J. Gen. Virol. 36:59 až 72), která je výhodnou buněčnou linií pro produkci obvyklých vektorů. Mezi příklady dalších produkčních buněk patří buňky HeLa, PERC.6 (jako jsou popsány v publikaci WO/97/00326, aplikační č. PCT/NL96/00244).
Termín „kultivace za podmínek, které umožňují replikaci virového genomu“ znamená udržování takových podmínek pro infikovanou produkční buňku, aby mohlo dojít ke zmnožení viru v buňce producenta. Je žádoucí, aby byly podmínky regulovány tak, aby bylo dosaženo maximálního počtu virových částic produkovaných každou buňkou. Proto také je nezbytné monitorovat a regulovat reakční podmínky jako je teplota, rozpuštěný kyslík, pH atd. Komerčně dostupné bioreaktory jako je CelliGen Plus Bioreactor (komerčně dostupný od firmy New Brunswick Scientific, lne., Talmadge Road 44, Edison, NJ, USA) jsou zařízením pro monitorování a udržování těchto parametrů vybaveny. Optimalizace infekce a podmínky kultivace se budou vždy trochu lišit, avšak podmínky, vhodné pro účinnou replikaci a produkci viru, mohou odborníci v dané oblasti dosáhnout tím, že budou brát v úvahu známé vlastnosti produkční buňky, vlastnosti viru, typ bioreaktoru atd. Jestliže jsou používány jako linie produkčních buněk buňky 293, je koncentrace kyslíku výhodně udržována v rozmezí přibližně 50 % až 120 % rozpuštěného kyslíku, výhodněji 100 % rozpuštěného kyslíku. V případě, že koncentrace částic viru (což je stanovováno příslušnými postupy jako je HPLC s použitím • 9 9· 9 · · · · · ·· ···· 999 9 · · kolony Resource Q) zůstává dále stabilní, pak je kultivace v reaktoru ukončena a buňky jsou sklizeny.
Termín „sklizení“ znamená shromáždění buněk, obsahujících rekombinantní adenovirus, z média. Toto může být provedeno běžnými způsoby jako je odstředění nebo použití chromatografických technik. V této fázi mohou být sklizené buňky skladovány nebo mohou být dále podrobeny lýzi a přečištění, jehož cílem je izolovat rekombinantní virus. Při skladování by měly být sklizené buňky skladovány v pufru s přibližně fyziologickým pH a zmrazený na teplotu -70 °C.
Termín „lýze“ se vztahuje k porušení produkčních buněk. Lýze může být provedena řadou různých způsobů, které jsou v dané oblasti techniky dobře známé. V případě, že je třeba virové částice izolovat od produkčních buněk, jsou buňky lyžovány a to postupy, které jsou v dané oblasti techniky velmi dobře známé. Například savčí buňky mohou být lyžovány za nízkého tlaku (odlišný tlak o 100 až 200 psi) nebo postupem opakovaného zmrazování a rozmrazování. Exogenní volná DNA/RNA je odstraněna degradací DNAasou/RNAasou.
Termín „přečištění“ znamená izolaci podstatně čisté populace částic rekombinantního viru z lyžovaných produkčních buněk. K tomuto účelu mohou být použity příslušné techniky přečištění jako jsou chromatografické nebo gradientově centrifugační. Ve výhodném provedení předmětného vynálezu je virus přečištěn chromatografií v kolonovém uspořádání a to postupem, který je v souladu s publikací Huyghe a kol. (1995) Human Gene Therapy 6:1403 až 1416, což je popsáno v US patentové přihlášce Č. 08/400 793, podané 7.3.1995.
Další způsoby a postupy používané pro optimalizaci produkce rekombinantnich adenovirů podle předmětného vynálezu jsou popsány v US patentové přihlášce č. 09/073 076, podané 4.5.1998 a nazvané Viral Production Process.
Přehled obrázků ve výkresech
Obrázek 1. Výsledky CPE stanovení pro určení cytopatického účinku rekombinantnich adenovirových vektorů kódujících sekvenci kódující fúzni E2F-Rb pod kontrolou buď promotoru reagujícího na TGF-β dráhu (PAI nebo SRE) nebo promotoru reagujícího na p53 dráhu (RGC nebo p53CON. Dále byl do vektorů jako oznamovatel začleněn gen kódující zelený fluorescenční protein. Panel A představuje buňky MRC-9, panel B představuje buňky Hep3B a panel C představuje buňky WEDR. Dráha 1: replikačně deficientní (deletovaná El) rekombinantní adenovirus exprimující zelený fluorescenční protein (GFP); dráha 2: PAI-Ad;
• · ·♦ ·· · · · · · · · ···· · · · · · · · • · · · · · · · · · · • Φ ···· · · · · · ··· ·· · · · ·
J X ······ ····· · · · · · dráha 3: SRE-Ad; dráha 4: RGC-Ad; dráha 5: p53CON-Ad. Koncentrace virových částic jsou naznačeny na obrázku vpravo.
Obrázek 2. Výsledky fluorescenční mikroskopie (horní panel) zobrazující expresi GFP u vektorů zacílených na určitou dráhu. Panel A představuje kontrolní vektor GFCB, panel B vektor SRE-Ad a panel C vektor p53CON-Ad. Infekce byla 5 x 105 částic na mililitr.
Obrázek 3. Výsledky infekce normálních bronchiálních epiteliálních buněk (panel A) a buněk C33A (panel B) rekombinantními viry U3EE (čtverečky), T1LT (kolečka) a L9IU (trojúhelníky). Vertikální osy představují procento neinfíkovaných kontrol a horizontální osy představují dávku viru v částicích na ml. Pokusy byly provedeny tak, že kultura buněk byla vystavena šesti různým koncentracím viru, které se pohybovaly v rozmezí 105 až 109 částic viru na 1 ml. Buňky byly vystaveny působení viru po dobu 1 h, přebytečný virus byl odstraněn promytím a pomocí MTS stanovení (Promega, Madison WI), které bylo prováděno v souladu s přiloženým firemním návodem, bylo stanoveno procento životaschopných buněk šestý den po infekci. Horizontální čára představuje hladinu, při které zůstalo životaschopných 50 % buněk. Průsečík křivek získaných z dat a horizontální čárkované čáry představuje hodnotu ED50 pro daný virus.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady poskytují metody a výsledky experimentů, které ukazují konstrukci konkrétních rekombinantních adenovirových a plasmidových vektorů. Odborníkům vdané oblasti techniky, kterým je předmětný vynález určen, bude jistě zřejmé, že předmětný vynález může být proveden také v jiných formách než, které jsou odhaleny v uvedených příkladech, aniž by došlo k odchýlení se od smyslu nebo základních charakteristik vynálezu. Konkrétní provedení vynálezu, která jsou popsána níže, je třeba tudíž považovat za ilustrativní a nikoliv restriktivní. V následujících příkladech „g“ znamená gramy, „ml“ znamená mililitry, „mol“ znamená moly, „°C“ znamená stupně Celsia, „min.“ znamená minuty, „FBS“ znamená zárodečné hovězí sérum a „PN“ znamená počet částic rekombinantního viru.
Příklad 1 Konstrukce plasmidů pSOOluc, plasmid kódující luciferasu pod kontrolou PAI promotoru o velikosti 800 bp byl získán od Dr. Davida Luskutoffa (Scripps Institute, LaJolla, Kalifornie). Plasmid pCTMIE-E2FRb, který obsahuje CMV promotor, po němž následuje třísložková vedoucí sekvence adenoviru··«· ♦ · · ··· • 0 · ····· · · a SV40 zesilovač upstream k sekvenci kódující fúzní protein E2F-RB, poskytl Doug Antelman (Canji).
Příklad 2 Konstrukce luciferasových plasmidů s promotory reagujícími na TGF-β
A. Plasmid PAI-luciferasa
Sekvence všech fragmentů jsou uváděny v 5'- 3' směru. Fragment o velikosti 749 bp s Sací a Xhol místy na 5' resp. 3' konci a s SV40 TATA boxem namísto nativního TATA boxu v promotoru, byl amplifikován pomocí PCR s použitím p8001uc jakožto templátu a s primery AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA a GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (obsahující SV40 TATA box). Výsledný produkt PCR byl naštěpen restrikčními enzymy Sací a Xhol a byl ligován do fragmentu, který byl získán po štěpení PGL3-základního, což je luciferasový konstrukt bez promotoru (Promega). Jako výsledek byl získán PAI-luciferasa.
B. Plasmid SRE-luciferasa
Byly spojeny následující oligonukleotidy: GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC a GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC. Výsledný produkt byl naštěpen Xhol a ligován do PGL3základního, který byl naštěpen Mlul, konce byly ztupeny pomocí Klenowova enzymu a bylo provedeno ještě štěpení Xhol. Výsledkem byl pSVT-luc (luciferasový konstrukt s SV40 TATA boxem). Oligonukleotidy, obsahující Smad4/DPC4 vazebná místa, CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC a AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC byly spojeny a ligovány do konstruktu pSVT-luciferasa naštěpeného KpnI. Cílem bylo získat plasmid SRE-luciferasa.
Příklad 3 Konstrukce luciferasových plasmidů s promotory reagujícími na p53
A. Plasmid RGC-luciferasa
Byly spojeny dva komplementární 5'-fosforylované oligonukleotidy obsahující vazebná místa pro p53 z ribozomálního genového svazku, AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT
CCA GGC AAC TCG TGG TAC a CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT
TTT CTG TAC. Spojený fragment byl ligován do konstruktu pSVT-luciferasa naštěpeného
KpnI. Cílem bylo získat plasmid RGC-luciferasa.
B. Plasmid p53CON-luciferasa
Byly spojeny dva komplementární 5 '-fosforylované oligonukleotidy obsahující konvenční vazebná místa pro p53 (p53CON), CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC a AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC. Spojený fragment byl ligován do konstruktu pSVT-luciferasa, naštěpeného KpnI. Cílem bylo získat plasmid p53CONluciferasa.
C. Plasmid PAI-E2F-Rb
Sekvence obsahující CMV promotor, po kterém následuje třísložková vedoucí sekvence adenoviru-5 a SV40 zesilovač upstream k sekvenci kódující fuzní protein E2F-RB v plasmidu pCTMIE-E2F-Rb, byla vystřižena prostřednictvím štěpení BglI a Xbal. Výsledný fragment byl ligován s cílem získat plasmid bez promotoru E2F-RB. Fragment obsahující modifikovaný PA1 promotor byl vystřižen z plasmidu PAI-luciferasa prostřednictvím štěpení Sací a Xhol a konce byly ztupeny pomocí Klenowova enzymu. Tento fragment byl ligován do plasmidu bez promotoru E2F-RB, který byl naštěpen EcoRI a ošetřen Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I. Cílem bylo získat plasmid PAI-E2F-RB.
Příklad 4 Příprava rekombinantních adenovirů
Přenosový plasmid obsahující sekvenci Ad5 s delecí o velikosti 3 kb v E3 oblasti, pNEBAE3, byl konstruován klonováním fragmentu o velikosti 7,4 kb získaného štěpením SnaBI zpBHGll (26 676 až 34 140) do pNEB193 (plasmid z NEB) ošetřeného BamHI, AccI a Klenowovým enzymem. Násobné klonovací místo bylo začleněno do výše zmíněného plasmidu spojením 5-fosforylovaných oligonukleotidů AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T a TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T a začleněním tohoto fragmentu zaligováním do pNEBAE3 naštěpeného Pacl. Cílem bylo získat plasmid pNEBAE3(MCS).
• · ····· · · · • ♦ · · ♦ 9 9 9» · ·· · · · · · · ·· ···· ·· ··· ·* ···
Přenosový plasmid pro vytvoření rekombinantního adenovirů kódujícího E2F-Rb pod kontrolou PAI promotoru a zesílený zelený fluorescenční protein (GFP) pod kontrolou CMV promotoru byl konstruován následovně. Přechodný vektor pABS.4-E2F-Rb byl připraven ligováním fragmentu obsahujícího PAI promotor a sekvence kódující E2F-Rb, která byla připravena naštěpením PAI-E2F-Rb enzymy Naci a Xbal a zaligováním fragmentu do plasmidu pABS.4 (Microbix), který byl připraven pomocí KpnI, ošetřením Klenowovým enzymem a dalším štěpením Xbal. Fragment obsahující PAI promotor, E2F-Rb kódující sekvenci a kanamycinový gen byl poté z plasmidu PABS.4-E2F-Rb vystřižen pomocí enzymu PacI, byl ošetřen Klenowovým enzymem a ligován s fragmentem plasmidu získaným štěpením plasmidu pNEBAE3 enzymy PacI a ošetřením Klenowovým enzymem. Cílem bylo získat plasmid pNEBAE3-PAI-E2F-Rb bez místa restrikčního místa PacI. Kanamycinový gen v tomto plasmidu byl nahrazen CMV promotorem operativně připojeným ke genu pro zelený fluorescenční protein (GFP). Toto bylo provedeno štěpením pNEBAE3-PAI-E2F-Rb enzymem Swal a zaligováním fragmentu izolovaného z pEGFP-N (Clonetech) a to pomocí štěpení enzymy Aflll a SspI a ošetřením Klenowovým enzymem. Cílem bylo získat plasmid pAE3-PAI-E2F-Rb-GFP.
Přenosové plasmidy pro přípravu rekombinantních adenovirů kódujících E2F-Rb pod kontrolou promotoru reagujícího na TGF-β s SRE a zesílený zelený fluorescenční protein (GFP) pod kontrolou CMV promotoru byly konstruovány následovně. Aby byl získán plasmid pNEBAE3 -E2F-Rb, byla do plasmidu pNEBAE3(MCS) začleněna E2F-Rb kódující sekvence a to prostřednictvím ligování fragmentu, izolovaného štěpením pNEBAE3(MCS) enzymy Xbal a Nrul a fragmentu vytvořeného štěpením pCTMIE-E2F-Rb enzymy Xbal a Nael. Promotor reagující na TGF-β obsahující SRE byl začleněn do výše zmíněného plasmidu prostřednictvím amplifikace této sekvence PCR s použitím SRE-luciferasy jakožto templátu a fosforylovaných primerů GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C a GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T. Výsledný produkt PCR byl naštěpen Spěl a ligován do plasmidu pNEBAE3-E2FRb naštěpeného SnaBI a Xbal za vzniku pAE3-DPC-E2F-Rb.
Přenosové plasmidy pro přípravu rekombinantních adenovirů kódujících E2F-Rb pod kontrolou promotorů reagujících na p53 a zesílený zelený fluorescenční protein (GFP) pod kontrolou CMV promotoru byly připraveny následujícím způsobem. Promotor reagující na p53 obsahující vazebná místa pro p53 z ribozomálního genového svazku nebo konvenční místo p53 (p53CON) byl začleněn do plasmidu pNEBAE3-E2F-Rb pomocí amplifikace promotorové sekvence PCR s použitím RGC-luciferasy nebo p53CON-luciferasy jakožto templátu a fosforylovaných primerů GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C a GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T. Výsledné produkty PCR byly naštěpeny enzymem Xbal a byly • · ligovány do plasmidu pNEBAE3-E2F-Rb naštěpeného SnaBI a Xbal. Cílem bylo získat ρΔΕ3RGC-E2F-Rb a pdelataE3-PCON-E2F-Rb.
Příklad 5 Homologní rekombinace pro přípravu rekombinantních adenovirů
Rekombinantni adenoviry PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad a CON-Ad byly připraveny homologní rekombinací v bakterii, což je např. popsáno v Chartier a kol. (1996) J. Virol. 70:4805 až 4810. Aby byly získány fragmenty obsahující E2F-Rb pod kontrolou promotoru reagujícího na určitou dráhu a GFP pod kontrolou CMV promotoru na koncích s Ad5 sekvencemi, byly přenosové plasmidy naštěpeny enzymem AscI. Výsledný fragment byl transformován do bakteriálního kmene BJ 5183 spolu s fragmentem získaným štěpením PTG4609 (dostupný od Transgene, lne. a popsaný v Chartier a kol. (1996) J. Virol. 70:4805 až 4810) enzymy BstBI a Spěl. U výsledných bakteriálních kolonií byla testována přítomnost žádoucích rekombinantních Ad5 infekčních plasmidů pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad a pCON-GFP-Ad. Tyto infekční plasmidy byly linearizovány prostřednictvím štěpení PacI a přečištěny extrakcí v systému fenol-chloroform a ethanolovým srážením. Poté byly použity pro transfekci buněk 293.
Transfekce byla provedena pomocí Superfect (Qiagen) podle přiloženého návodu. Pro transfekci 250 000 buněk rostoucích v destičkách o 6 jamkách s 12 μΐ Superfect/jamku bylo použito 2,5 pg linearizovaných plasmidů. Po 8 dnech byl vzhledem k produkci viru pozorován cytopatický účinek. Buňky byly sklizeny spolu se supematanty a byly 3 x podrobeny cyklu zmrazení - rozmražení. Rekombinantni viry ve vzniklých lyzátech byly amplifikovány opakovanou infekcí buněk 293.
Příklad 6 Linie buněk
Všechny linie buněk, které jsou použity v této studii, byly získány od ATCC (Rockville, MD, USA) a byly kultivovány jako jednovrstvé kultury udržované při teplotě 37 °C v CO2 inkubátoru. Buňky 293, Hep3B, MRC9, A549, Panel, U87, Caco2, MCF-7 a WIDR byly uchovávány v modifikovaném Eagle médiu Dulbecco, které bylo obohaceno 10% zárodečným hovězím sérem. Buňky MDA-MB 468 byly kultivovány v médiu Ham obohaceném 10% zárodečným hovězím sérem, zatímco buňky MiaPaca-2 byly kultivovány v DMEM obohaceném 10% zárodečným hovězím sérem a 2,5% koňským sérem.
• φ ·· φφ ··«· Φ· · ···· ··· · · · · ·· φ · · · · · · · · • · ···· · · · · · • · · · ♦ · · · φ φφ ΦΦΦΦ ·· ··· φφ ···
Příklad 7 Transfekce
Buňky byly umístěny buď do destiček se 6 jamkami (250 000 buněk/jamku) nebo do destiček s 24 jamkami (62 500 buněk/jamku) a byly ponechány přes noc. Transfekce byly poté uskutečněny s pomocí fosforečnanu vápenatého v případě buněk 293, což je zde popsáno a s použitím Superfect (Qiagen) v případě jiných buněk, kdy bylo postupováno podle návodů od výrobce.
Příklad 8 Měření oznamovatel/luciferasa
Buňky byly transfekovány 1,5 pg oznamovacího plasmidu a 1,0 pg inhibitorů. Přídavkem IX pufřu pro lýzi oznamovatele (Promega) a následnou inkubací při laboratorní teplotě po dobu 10 min. byly připraveny posttransfekční lyzáty (po 48 h). Aktivita luciferasy byla stanovena pomocí zařízení Top Count (Packard) a soupravy pro stanovení od stejné firmy a s použitím instrukcí od dané firmy.
Příklad 9 Měření cytopatického účinku způsobeného virem
Buňky byly infikovány zmíněným rekombinantním nebo wild-type adenovirem a byly ponechány po dobu 6 dní po infekci v přítomnosti 0,5% roztoku krystalové violeti, který byl připraven ve 20% methanolu. Vše probíhalo podle postupu, který popsal Bischoff a kol. (1996) Science 274:373 až 376.
Příklad 10 Konstrukce virů cU3EE a cTILT
Sekvence MLP promotoru byla amplifikována pomocí PCR za použití primerů GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC a GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG , dále byla použita Ad5 DNA jako v plasmidu pFG140 (Microbix) jako templát. Produkt po PCR byl poté klonován do PacI místa plasmidu pdelataE3-PCON-E2F-Rb. Cílem bylo získat pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP. Adenovirová sekvence kódující protein E3 10.5K byla amplifikována PCR s použitím primerů GCG ACC CAC CCT AAC AGA a GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A. Výsledný produkt PCR byl klonován do Xhol místa plasmidu pCDNA3.1 (Invitrogen) s cílem získat plasmid pCDNA3-10.5. Adenovirová sekvence kódující protein E3 10.5K byla poté z pCDNA3-10.5 vystřižena pomocí štěpení •4 ··♦·
4 4*44 »444
-7 ' ·· 4444 44 444 44 44« enzymy Drali! a Xbal, následovalo použití Klenowova enzymu a poté byla ligována do PacI místa a Klenowovým enzymem ošetřeného pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP. Cílem bylo získat plasmid pdelataE3 -PC0N-E2F-Rb-MLP-10.5K.
Rekombinantní adenoviry cU3EE a cTILT byly připraveny homologní rekombinací v bakterii, což již bylo popsáno (Chartier a kol. (1996) J.Virol. 70:4805 až 4810). Aby byly získány fragmenty obsahující E2F-Rb pod kontrolou sekvence p53CON a E310.5K pod kontrolou MLP promotoru na koncích s Ad5 sekvencemi, byl přenosový plasmid naštěpen enzymem AscI. Výsledný fragment byl transformován do bakteriálního kmene BJ 5283 spolu s fragmentem získaným štěpením PTG4609 (Transgene) enzymy BstBI a Spěl. U výsledných bakteriálních kolonií byla testována přítomnost žádoucího rekombinantního Ad5 infekčního plasmidu pCEMD. Ad5 infekční plasmid pOl/CEMD byl získán použitím podobného protokolu, ale s použitím derivátu PTG4609 (Transgene), v němž byla wild-type sekvence El A nahrazena sekvencí obsahující El A s mutací 01. Tyto infekční plasmidy byly linearizovány prostřednictvím štěpení PacI, dále byly přečištěny extrakcí v systému fenol-chloroform a ethanolovým srážením. Poté byly použity pro transfekci buněk 293.
Transfekce plasmidů pCEMD a pOl/CEMD byla provedena pomocí Superfect (Qiagen) podle návodu proto, aby byly vytvořeny rekombinantní viry cU3EE a cTILT. Pro transfekci 500 000 buněk rostoucích v destičkách o 6 jamkách a 12 μΐ Superfect/jamku bylo použito 2,5 pg linearizovaných plasmidů. Po 8 dnech byl vzhledem k produkci viru pozorován cytopatický účinek. Buňky byly sklizeny spolu se supernatanty a byly 3 x podrobeny cyklu zmrazení rozmražení. Rekombinantní viry ve vzniklých lyzátech byly amplifíkovány opětovnou infekcí buněk 293.

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Selektivně se replikující rekombinantní virový vektor, který obsahuje promotor reagující na určitou dráhu operativně připojený na represor replikace viru.
  2. 2. Vektor podle nároku 1, u něhož je promotor reagující na určitou dráhu vybrán ze skupiny, kterou tvoří promotor reagující na dráhu p53, promotor reagující na dráhu Rb a promotor reagující na dráhu TGF-β.
  3. 3. Vektor podle nároku 2, přičemž virus je odvozen od rodu adenoviridiae.
  4. 4. Vektor podle nároku 3, přičemž represor replikace viru j e E2F-RB.
  5. 5. Vektor podle nároku 1, který dále obsahuje transgenní expresní kazetu.
  6. 6. Vektor podle nároku 5, přičemž transgenní expresní kazeta obsahuje proapoptotický gen operativně připojený na promotor.
  7. 7. Vektor podle nároku 6, přičemž genem aktivujícím prolék je Ad5 E3-10.5K.
  8. 8. Vektor podle nároku 7, přičemž promotorem reagujícím na určitou dráhu je promotor reagující na dráhu p53.
  9. 9. Vektor podle nároku 8, přičemž promotorem reagujícím na dráhu p53 je p53CON.
  10. 10. Vektor podle nároku 9, přičemž promotorovou složkou transgenní expresní kazety je časový promotor.
  11. 11. Vektor podle nároku 10, přičemž časovým promotorem je MLP.
  12. 12. Vektor podle nároku 11, který dále obsahuje vadenovirové Ela kódující oblasti deleci, která eliminuje vazbu p300.
  13. 13. Vektor podle nároku 12, přičemž delece vadenovirové Ela kódující oblasti zahrnuje deleci aminokyselin 4 až 25 z Ela 289R a 243R proteinů.
  14. 14. Farmaceutická formulace, vyznačující se tím, že jako účinnou přísadu obsahuje selektivně se replikující rekombinantní vektor nárokovaný v jakémkoliv z nároků 1 až 13 spojený s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči.
  15. 15. Způsob usmrcení buňky s defektní dráhou, vyznačující se tím, že zmíněná buňka je vystavena kontaktu se selektivně se replikujícím rekombinantním virem nárokovaným v jakémkoliv z nároků 1 až 13.
  16. 16. Selektivně se replikující virový vektor nárokovaný vjakémkoliv z nároků 1 až 13 nebo jeho farmaceuticky přijatelná formulace, vyznačující se tím, že jsou použity při léčbě karcinomu.
  17. 17. Buňka transformovaná selektivně se replikujícím rekombinantním virem, která obsahuje promotor reagující na určitou dráhu operativně připojený na represor replikace viru.
    ·· ·· ·· ··♦· ·· · ···· · · · * · 4 · ·· · · 4 · 4 4 · 4 4 • · ···· · · · · ·
    4 4 4 · 4 · 4 4 4
    J 9 444444 4 4 4 4 4 ·♦ ···
  18. 18. Promotor reagující na dráhu p53, který je vybrán ze skupiny, kterou tvoří p53CON a
    RGC.
  19. 19. Promotor reagující na dráhu TGF-β, který je vybrán ze skupiny, kterou tvoří PAI a SRE.
  20. 20. Způsob produkce selektivně se replikujícího virového vektoru nárokovaného v jakémkoliv nároku 1 až 13, v y z n a č u j í c í se tím, že zahrnuje infekci populace produkčních buněk vzorkem zmíněného vektoru, kultivaci zmíněné linie produkčních buněk za takových podmínek, které umožňují replikaci zmíněného vektoru ve zmíněných produkčních buňkách a izolaci vektoru z produkčních buněk.
CZ20011129A 1998-10-15 1999-10-14 Selektivne se replikující rekombinantní virový vektor a zpusob jeho prípravy, farmaceutická formulace, zpusob usmrcení bunky s defektní dráhou, transformovaná bunka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß CZ301506B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17268698A 1998-10-15 1998-10-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20011129A3 true CZ20011129A3 (cs) 2002-01-16
CZ301506B6 CZ301506B6 (cs) 2010-03-31

Family

ID=22628758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011129A CZ301506B6 (cs) 1998-10-15 1999-10-14 Selektivne se replikující rekombinantní virový vektor a zpusob jeho prípravy, farmaceutická formulace, zpusob usmrcení bunky s defektní dráhou, transformovaná bunka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP1121441B1 (cs)
JP (2) JP4404490B2 (cs)
KR (1) KR100841815B1 (cs)
CN (2) CN1325647C (cs)
AR (1) AR020897A1 (cs)
AT (1) ATE348169T1 (cs)
AU (1) AU758354B2 (cs)
BR (1) BR9914527A (cs)
CA (1) CA2345900A1 (cs)
CZ (1) CZ301506B6 (cs)
DE (1) DE69934421T2 (cs)
ES (1) ES2279636T3 (cs)
HK (1) HK1040529B (cs)
HU (1) HU226602B1 (cs)
IL (2) IL142337A0 (cs)
NO (1) NO330666B1 (cs)
NZ (2) NZ528283A (cs)
PL (1) PL347898A1 (cs)
SK (1) SK4412001A3 (cs)
TW (1) TWI262948B (cs)
WO (1) WO2000022137A2 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100841815B1 (ko) * 1998-10-15 2008-06-26 캔지, 인크. 선택적으로 복제하는 바이러스 벡터
KR100492017B1 (ko) * 2002-06-24 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 인간 간엽줄기 세포를 이용한 항암치료방법
GB0416487D0 (en) 2004-07-23 2004-08-25 Isis Innovation Modified virus
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
JP6329936B2 (ja) 2012-03-14 2018-05-23 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルス腫瘍診断
JP6576326B2 (ja) 2013-03-14 2019-09-18 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 腫瘍溶解性アデノウイルス組成物
CN106913865A (zh) 2013-04-18 2017-07-04 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
WO2017035232A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
AU2017223589B2 (en) 2016-02-23 2023-08-03 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
WO2019020992A1 (en) * 2017-07-25 2019-01-31 Oxford Genetics Limited ADENOVIRAL VECTOR
WO2019074907A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-18 Nantbio, Inc. MODIFIED EC7 CELLS WITH LOW TOXICITY FOR VIRAL PRODUCTION LOADS

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0931830T3 (da) * 1993-02-16 2001-06-11 Onyx Pharma Inc Cytopatiske vira til terapi og profylakse af neoplasi
WO1998013508A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Dana-Farber Cancer Institute Method of targeting malignant cells using an e2f responsive promoter
KR100336551B1 (ko) * 1996-11-15 2002-05-11 이. 엘. 나가부샨, 리차드 비. 머피 망막아종 단백질의 조직 특이적 발현
AU744725B2 (en) * 1997-03-03 2002-02-28 Cold Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing heterologous transcription regulatory elements and methods of using same
KR100841815B1 (ko) * 1998-10-15 2008-06-26 캔지, 인크. 선택적으로 복제하는 바이러스 벡터

Also Published As

Publication number Publication date
IL142337A (en) 2009-05-04
CN1325647C (zh) 2007-07-11
AU6391599A (en) 2000-05-01
EP1121441B1 (en) 2006-12-13
JP4404490B2 (ja) 2010-01-27
JP2009254385A (ja) 2009-11-05
KR100841815B1 (ko) 2008-06-26
BR9914527A (pt) 2001-06-26
PL347898A1 (en) 2002-04-22
SK4412001A3 (en) 2001-12-03
WO2000022137A3 (en) 2000-08-03
NO20011843D0 (no) 2001-04-10
DE69934421D1 (de) 2007-01-25
HUP0104107A2 (hu) 2002-03-28
JP2002541761A (ja) 2002-12-10
NZ528283A (en) 2005-05-27
EP1121441A2 (en) 2001-08-08
HUP0104107A3 (en) 2003-09-29
CN101092636B (zh) 2012-08-08
NZ510805A (en) 2003-12-19
AU758354B2 (en) 2003-03-20
HU226602B1 (en) 2009-04-28
ATE348169T1 (de) 2007-01-15
CN101092636A (zh) 2007-12-26
CZ301506B6 (cs) 2010-03-31
WO2000022137A2 (en) 2000-04-20
AR020897A1 (es) 2002-06-05
CA2345900A1 (en) 2000-04-20
CN1330715A (zh) 2002-01-09
NO20011843L (no) 2001-06-14
KR20020013472A (ko) 2002-02-20
DE69934421T2 (de) 2007-10-11
NO330666B1 (no) 2011-06-06
ES2279636T3 (es) 2007-08-16
TWI262948B (en) 2006-10-01
HK1040529B (zh) 2007-02-09
IL142337A0 (en) 2002-03-10
HK1040529A1 (en) 2002-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8133481B2 (en) Selectively replicating viral vectors
JP4334174B2 (ja) 腫瘍崩壊性アデノウイルス
JP2009254385A (ja) 選択的に複製するウイルスベクター
JP2005503797A (ja) アデノウイルスベクター及び関連する系、並びに製造及び使用の方法
US20060257370A1 (en) Adenoviral vectors for treating diseases
US20040241142A1 (en) Oncolytic adenovirus
JP2002530085A (ja) 後期導入遺伝子の発現を有するウイルスベクター
US7396679B2 (en) Oncolytic adenovirus
JP2002527455A (ja) 組換え欠失アデノウイルスベクター
MXPA01003840A (en) Selectively replicating viral vectors
MXPA01004989A (en) Viral vectors with late transgene expression

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20141014