NO330666B1 - Selektivt replikerende, rekombinant virusvektor, farmasoytisk formulering, fremgangsmate for dreping av en celle ex vivo med en reaksjonsveimangel, anvendelse av en selektivt replikerende viral vektor for fremstilling av et farmasoytisk preparat, samt fremgangsmate for fremstilling av en selektivt replikerende viral vektor. - Google Patents

Selektivt replikerende, rekombinant virusvektor, farmasoytisk formulering, fremgangsmate for dreping av en celle ex vivo med en reaksjonsveimangel, anvendelse av en selektivt replikerende viral vektor for fremstilling av et farmasoytisk preparat, samt fremgangsmate for fremstilling av en selektivt replikerende viral vektor. Download PDF

Info

Publication number
NO330666B1
NO330666B1 NO20011843A NO20011843A NO330666B1 NO 330666 B1 NO330666 B1 NO 330666B1 NO 20011843 A NO20011843 A NO 20011843A NO 20011843 A NO20011843 A NO 20011843A NO 330666 B1 NO330666 B1 NO 330666B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
promoter
pathway
vector
cell
cells
Prior art date
Application number
NO20011843A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20011843L (no
NO20011843D0 (no
Inventor
Muralidhara Ramachandra
Paul W Shabram
Original Assignee
Canji Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Canji Inc filed Critical Canji Inc
Publication of NO20011843D0 publication Critical patent/NO20011843D0/no
Publication of NO20011843L publication Critical patent/NO20011843L/no
Publication of NO330666B1 publication Critical patent/NO330666B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4736—Retinoblastoma protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter selektivt replikerende, rekombinant virusvektor, farmasøytisk formulering, fremgangsmåte for dreping av en celle ex vivo med en reaksjonsveimangel, anvendelse av en selektivt replikerende viral vektor for fremstilling av et farmasøytisk preparat, samt fremgangsmåte for fremstilling av en selektivt replikerende viral vektor.
Oppfinnelsens bakgrunn
Rekombinante adenovirus anvendes i dag for tilførsel av terapeutiske transgener i en rekke terapeutiske behandlingsformer. Imidlertid har det brede infektivitetsområde av dette vektorsystemet fremkalt bekymring for at ekspresjon av viruset i ikke-tumorceller kan forårsake samtidig skade på ikke-neoplastiske celler. Følgelig har et bredt utvalg av målstyringssystemer blitt utviklet for preferensiell ekspresjon av transgenet i en gitt celletype. Vevsspesifikke og tumorspesifikke promotere har blitt anvendt for preferensiell replikasjon av viruset i visse celletyper. For eksempel beskriver internasjonal patent-søknad nr. PCT/US96/10838, publisert 16. januar 1997 (internasjonal publikasjon nr. WO97/01358) anvendelse av vektorer som replikerer i en spesifikk vertscelle ved anvendelse av prostataspesifikke promoterelementer som styrer El, E2 eller E4 om ønskelig inneholdende en cytotoksisk transgenekspresjonskassett. Nærmere bestemt beskriver denne publikasjon en konstruksjon hvor en prostataspesifikk enhancer kontrollerer ekspresjonen av El og som har en ekspresjonskassett som omfatter CMV-promoteren som styrer ekspresjon av cytosindeaminasegenet, som er innsatt i E3-området. Disse vektorer er replikasjonskompetente og kan pakkes til intakte viruspartikler i en gitt celletype.
En alternativ tilnærming til anvendelse av tumorspesifikke promotere for styring av virusreplikasjonen er å anvende spesifikke delesjoner i den kodende sekvens for det adenovirale Elb 55K-protein. Rekombinante adenovirus som inneholder defekter i nukleotidsekvensen som koder for Elb 55K beskrives i U.S. patentskrift nr. 5 677 178 tildelt 14. oktober 1997. Det har imidlertid blitt observert at disse vevsspesifikke eller tumorspesifikke kontrollelementene er "lekke", det vil si at de tillater replikasjon i celletyper forskjellige fra de foretrukne målceller.
Et alternativ til denne type av selektivt replikerende vektor er anvendelse av en replikasjonsdefisient adenovirusvektor hvor omfattende deler av El-funksjonen er eliminert. Nærmere bestemt har vektorer hvor El, E2, E3 er eliminert og med partielle delesjoner i E4 blitt anvendt for tilførsel av eksogene transgener. Slike vektorer har blitt anvendt for tilførsel av p53-genet til målceller. Det har blitt vist at ekspresjon av et eksogent tilført villtype-p53 i en p53-defisient (p53-mutert eller p53-null) tumorcelle kan indusere p53-formidlet apoptose i tumorcellen. Slike virale vektorer for tilførsel av p53 er for tiden under utvikling av Schering Corporation og Introgen Corporation. Igjen har disse vektorer vist toksikologiske profiler og en terapeutisk effektivitet som er akseptabel for terapeutisk anvendelse i mennesker, og de befinner seg i fase II kliniske forsøk i mennesker for behandling av ondartede tilstander forbundet med p53.
Replikasjonsdefisiente og selektivt replikerende vektorer har, i det minste i teorien, mangler i utformingen som bekymrer klinikere. Siden replikasjonsdefisiente vektorer ikke vil oppformeres ukontrollert i pasienten har de teoretisk sett en mer tiltalende sikkerhetsprofil. Siden effektiv tumorfjerning krever infeksjon av et stort flertall av tumorcellene anvendes imidlertid et vesentlig molart overskudd av vektor for å sikre terapeutisk effektivitet. Selektivt replikerende vektorer anses som mer bekymrings-fulle fra et sikkerhetssynspunkt, grunnet deres evne til å replikere og, muligens mutere slik at det dannes fullt ut replikasjonskompetente vektorer i pasienten. Ved å opprettholde virusets naturlige evne til å oppformeres under gitte betingelser tillates det imidlertid at disse vektorer sprer seg til omliggende tumorceller. Siden vektorene selv kan replikeres kreves en lavere utgangsdose av slike vektorer. Dette er fordelaktig fra et immunologisk synspunkt, så vel som av økonomiske grunner ved fremstilling av slike midler. Det foreligger derfor et behov innen faget for en selektivt replikerende vektor som tar seg av de antatte sikkerhetsproblemer, samtidig som den forhøyede terapeutiske indeks oppnås.
Foreliggende oppfinnelse løser disse problemer ved tilveiebringelse av en selektivt replikerende adenovirus vektor som inneholder en reaksjons veirettet, reaksjonsveiresponderende promoter som styrer ekspresjonen av en repressor av virusreplikasjonen, slik at vektoren replikeres preferensielt i celler som mangler reaksjonsveien. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også farmasøytiske preparater som omfatter slike vektorer.
Det fremkommer i W. Zhang et al., Oncogene, vol. 9, nr. 9, 1994, s. 2513-2521, at p53-proteinet spesifikt binder DNA-sekvenser og aktiverer transkripsjon. WO 9839464 tilveiebringer adenovirusvektorspesifikke målceller omfattende et første adenoviralt gen under kontroll av et cellespesifikt, heterologt, transkripsjonelt regulatorisk element (TRE) og minst ett andre gen under kontroll av et annet heterologt TRE. WO 9821228 gjør kjent fusjonspeptider av en DNA-bindende transkripsjonsfaktor og et retinoblastoma (RB)-polypeptid som omfatter et vekstundertrykkende domene.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse omfatter selektivt replikerende, rekombinant virusvektor, kjennetegnet ved at den omfatter en reaksjonsveiresponderende promoter operativt koblet til en virusreplikasjonrepressor, hvori vektoren selektivt replikeres i neoplastiske celler som har en mangel i reaksjonsveien til hvilken promoteren er responderende.
Videre omfatter oppfinnelsen farmasøytisk formulering, kjennetegnet ved at den omfatter en selektivt replikerende rekombinant vektor som aktiv bestanddel, ifølge et hvert av kravene 1-14, forbundet med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere.
Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåte for dreping av en celle med en reaksjonsveimangel, kjennetegnet ved at cellen ex vivo bringes i kontakt med en selektivt replikerende rekombinant virus ifølge et hvert av kravene 1-14.
Også omfatter av oppfinnelsen er anvendelse av en selektivt replikerende viral vektor ifølge et hvert av kravene 1-14 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å drepe en celle med en reaksjonsveimangel.
Endelig omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av en selektivt replikerende viral vektor ifølge et hvert av kravene 1-14 hvori nevnte fremgangsmåte omfatter infisering av en populasjon av producerceller med en prøve av nevnte vektor, dyrkning av nevnte producercellelinje under betingelser som tillater replikering av nevnte vektor i nevnte producerceller og isolering av vektoren fra producercellene.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således rekombinante virus som replikerer virusgenomet selektivt som respons på de intracellulære forhold i målcellen, ved anvendelse av en reaksjonsveiresponderende promoter som styrer ekspresjonen av en inhibitor av virusreplikasjonen, som i det vesentlige inhiberer virusreplikasjonen i vertscellen basert på den infiserte celles fenotype eller genotype. I målcellen er promoterelementet i den reaksjonsveiresponderende promoter inaktivt, og viruset tillates således å replikeres. Dette fører til: (1) dreping av cellene ved hjelp av virusets naturlige, lytiske natur, og/eller (2) tilveiebringelse av en terapeutisk dose av et transgenprodukt (amplifisert sammenliknet med replikasjonsinkompetente vektorer) til målcellen, og (3) produksjon av en lokalisert konsentrasjon av viruset som letter infeksjon av omliggende målceller for det rekombinante virus. Det beskrives også terapeutiske og diagnostiske fremgangsmåter for anvendelse av vektorene, farmasøytiske preparater som omfatter vektorene, fremgangsmåter for fremstilling av vektorene og transformerte celler som omfatter vektorene.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1. Resultater av CPE-analyser for bestemmelse av den cytopatiske virkning av rekombinante andenovirusvektorer som inneholder kodende sekvens for en E2F-RB-fusjon under kontroll av enten en TGF-|3-reaksjonsveiresponderende promoter (PAI eller SRE) eller en p53-reaksjonsveiresponderende promoter (RGC eller p53CON). I tillegg ble genet som koder for grønt fluorescerende protein også innført i vektorene som et rapportørgen. Felt A representerer MRC-9-celler, felt B representerer Hep3B) og felt C representerer WIDR-celler. Spor 1: replikasjonsdefisient (El delert) rekombinant adenovirus som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP); spor 2: PAI-Ad; spor 3:
SRE-Ad; spor 4: RGC-Ad; spor 5 p53CON-Ad. Partikkelkonsentrasjonen er som angitt til høyre i figuren. Figur 2. Resultater fra fluorescensmikroskopi (de øvre felt) som viser GFP-ekspresjon med reaksjonsveistyrte vektorer. Felt A representerer GFCB-kontrollvektoren, felt B SRE-Ad-vektoren og felt C p53CON-Ad-vektoren. Infeksjonen ble utført med 5 x IO<5>partikler per milliliter. Figur 3. Resultater fra infeksjon fra normale bronkiale epitelceller (felt A) og C33A-celler (felt B) med de rekombinante virus U3EE (firkanter), TILT (sirkler) og L9IU (triangler). De vertikale akser representerer prosenten av ikke-infiserte kontroller og de horisontale akser virusdosen i partikler per milliliter. Eksperimentene ble utført ved å behandle en kultur av hver celletype med seks forskjellige viruskonsentrasjoner, fra IO<5>til IO9 viruspartikler per milliliter. Cellene ble behandlet med viruset over et tidsrom på en time, overskudd av virus vasket bort og prosent levende celler bestemt seks dager etter infeksjonen med MTS-analysen (Promega, Madison WI) i det vesentlige i samsvar med produsentens instruksjoner. Den horisontale linje representerer det nivå hvor 50 % av cellene fortsatt var levedyktige. Krysningspunktet mellom kurvene fremstilt fra resultatene og den horisontale prikkede linje er et mål for ED50for viruset.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et selektivt replikerende, rekombinant virus som omfatter en reaksjonsveiresponderende promoter operativt koblet til en repressor av virusreplikasjonen.
Begrepet "selektivt replikerende" viser til en vektor som kan replikeres preferensielt i en celle i en fenotypisk tilstand, sammenliknet med en annen fenotypisk tilstand. Eksempler på forskjellige fenotypiske tilstander kan omfatte en p53-rekasjons-veidefektcelle sammenliknet med en normal celle av en gitt celletype. Et virus som viser preferensiell replikasjon tilsier at viruset replikeres minst fem ganger mer effektiv i målcelletypen, sammenliknet med en normalcelle (kontrollcelle) av samme type i et gitt doseringsnivå. For å fastslå hvorvidt et virus virkelig er selektivt er det nødvendig å evaluere virusets evne til å replikeres i målceller sammenliknet med normale celler av samme celletype, idet det tas hensyn til en rekke faktorer.
Det foretrekkes at man sammenlikner en gitt vektor evne til å replikeres i en målcelle som omfatter tilstanden det skal målstyres til og en normal celle av samme type som ikke er i denne tilstand. For eksempel er det første trinn etter virusinfeksjonen å indusere cellen til å gå inn i cellesyklus, siden faktorer som er avgjørende for maksimal effektivitet av virusreplikasjonen kun foreligger i S-fase. Dersom man prøvde å evaluere selektiviteten av et virus for selektivitet i tumorceller vil evaluering av virusets evne til å replikeres i en tumorcelle, sammenliknet med en annen celle som allerede har gått inn i cellesyklus (for eksempel en immortalisert eller transformert cellelinje) og til en viss grad følge virusets selektivitet for tumorceller. I tillegg har det blitt observert at forskjellige celletyper besitter svært forskjellig infektivitet overfor et gitt virus. Selv om noen virus, for eksempel adenovirus, besitter bred vevstropisme er andre virus mer begrensede når det gjelder hvilke celletyper de infiserer. Dersom man prøver å evaluere ytelsen av en gitt vektor i celler med svært forskjellig infektivitet vil det være vanskelig å anslå hvorvidt en manglende virkning skyldes vektorens ytelse i cellen eller rett og slett skyldes virusets manglende evne til å infisere cellen. Ved å evaluere selektiviteten i målceller og normale celler av en gitt type minimaliseres denne infektivitetsvirkning.
Tidsaspektet ved virusets livssyklus må også tas i betraktning. For eksempel kan selv en villtypevektor tilsynelatende ha selektivitet for tumorceller fremfor normale celler tidlig etter infeksjonen, siden cellen allerede befinner seg i cellesyklus. Denne tilsynelatende selektivitet avtar imidlertid med tiden, når først viruset har stimulert celle-syklusen. Tidspunktet etter infeksjonen ved hvilket selektiviteten evalueres må følgelig være tilstrekkelig til at denne forsinkelse i utgangspunktet av replikasjonen i normale celler unngås. Selv om dette vil variere med virustypen som anvendes kan denne forsinkelse lett bestemmes av fagpersonen.
Dosevirkningen må også tas i betraktning ved bestemmelse av hvorvidt et gitt rekombinant adenovirus viser en selektiv virkning i målcelletypen. Dersom man for eksempel ønsker fjerning av tumorceller og måler virkningen av cytotoksisitet kan et virus tilsynelatende ha selektiv cytotoksisitet ved forskjellige doser. Det har blitt observert at ved en tilstrekkelig høy dose vil nær sakt ethvert virus være cytotoksisk, uavhengig av i hvilken grad dets genom har modifisert, ganske enkelt grunnet virkningene av nærvær av de virale proteiner (for eksempel nexon i tilfellet adenovirus) som vites å være cytotoksiske. Likeså, selv om den vitenskapelige litteratur kan vise til et virus som "replikasjonsdefekt" (noe som antyder at viruset er fullstendig ute av stand til å replikeres i fravær av en cellelinje som kan komplementere virusdefekten) kan slike virus mer nøyaktig beskrives som "replikasjonssvekkede". For eksempel vil adenovirus som inneholder en delesjon av hele El-området og som hyppig betegnes som "replikasjonsdefekte" eller "replikasjonsdefisiente" replikeres i en viss grad, spesielt i celler i cellesyklus eller celler som deler seg hyppig som Mulligan observerte (1990, Science 260:926-932): Although the expression of the El region has been shown to affect the expression of other viral gene products necessary for replication ( citing Horwitz, M. in Virology, B.N. Fields red. (Raven, New York, 1990) kapittel 60)), the required of El gene expression for viral replication does not appear to be absolute. The early characterization of El-deficient vimses demonstrate that at high multiplicities of infection, the El region was dispensable for replication (citing Jones and Shenk
(1979) PNAS(USA) 76(8):3665-3669).
Følgelig kan virkningen av virusdosen ikke ignoreres når det skal bestemmes hvorvidt et virus replikeres på en selektiv måte.
Et middel for å evaluere replikasjonsselektiviteten av et virus for målcellene er å evaluere virusets "selektivitetsindeks" som følger. Den vanlig anvendte parameter ED50(som defineres som den dose som er tilstrekkelig til å indusere celledød i 50 % av cellene) tilveiebringer et passende sammenlikningsgrunnlag. ED50for et virus kan lett bestemmes ved, typisk, eksperimenter med økende doser in vitro. For å sikre det mest konsistente sammenlikningsgrunnlag uttrykkes ED50mest hensiktsmessig relativt til en viruskontroll, for å minimalisere virkningene av infektivitetsvariasjoner mellom celletypene som sammenliknes og eventuelle variasjoner i analysen. Følgelig anvendes det enhetsløse forhold: ED5o(virus)/ED50(kontroll) å uttrykke den relative toksisitet av viruset i cellen, og dette vil vises til som den "relative toksisitetsindeks" eller "RU". "Selektivitetsindeksen" til et gitt virus uttrykkes ved forholdet: RTI(målceller)/RTI(normale celler). Selektivt replikerende vektorer vil besitte en selektivitetsindeks på minst 10, men fortrinnsvis 50, 100 eller høyere.
For eksempel er de selektivt replikerende adenovirusvektorene U3EE og TILT utformet for å oppnå selektiv replikasjon i og dreping av tumorceller med p53-reaksjonsveidefekter. U3EE er i det vesentlige fremstilt i samsvar med fremgangsmåtene i eksemplene heri. Kort beskrevet inneholder U3EE-viruset en første ekspresjonskassett som omfatter et p53-responselement (p53 CON) som styrer ekspresjonen av E2F-RB-fusjonsproteinet. E2F-RB-fusjonsproteinet er en kraftig inhibitor av den adenovirale E2-promoteraktivitet, dets nærvær i cellen vil effektivt undertrykke virusreplikasjonen. p53-responselementet er aktivt som respons på nærvær av en funksjonell p53-reaksjonsvei. I normale celler hvor p53-reaksjonsveien er intakt vil følgelig U3EE-viruset uttrykke E2F-RB-fusjonsproteinet, og viruset vil ikke replikeres. I celler med p53-reaksjonsveidefekter (de fleste tumorceller) er p53CON-responselementet ikke aktivt, og det foreligger således ingen represjon av virusreplikasjonen. U3EE-vektoren inneholder også en ekspresjonskassett som omfatter MLP-promoteren som styrer ekspresjonen av det proapoptotiske gen Ad5 E3-10.5K. Anvendelse av temporale promotere (for eksempel MLP-promoteren) foretrekkes ved anvendelse av proapoptotiske gener, siden man ønsker å lette replikasjon av virus-DNA i målcellen før aktivering av det proapoptotiske signal. MLP-promoteren aktiveres tilnærmet syv timer etter infeksjonen, etter at replikasjonen av U3EE-genomet har startet, slik at aktiviteten av E3-10,5 K-proteinet induseres. Adenovirusvektoren TILT er i det vesentlige lik U3EE-vektoren, bortsett fra at den inneholder ytterligere en delesjon i El a-området som fjerner aminosyrene 4-25 i de adenovirale Ela-proteinene 243R og 289R. Denne delesjon ødelegger p300-proteinets evne til å bindes til disse Ela-proteinene.
U3EE og TILT-virusene ble analysert for evne til å replikeres i og drepe normale humane bronkiale epitelceller (NHBE) og C33A (en epiteltumorcellelinje med defekt p53-reaksjonsvei), med L9IU-vektoren som kontroll. Resultatene for disse eksperimenter er gitt i figur 3 i de vedlagte figurer. Følgende tabell oppsummerer de gitte resultater:
Som det kan observeres fra de gitte resultater besitter virusene U3EE og TILT høy selektivitet for tumorceller. Som diskutert tidligere besitter L9IU-viruset en svak replikasjonsfordel i tumorceller, som befinner seg i cellesyklus, sammenliknet med hvilende normale celler. Ved å sammenlikne forholdene ED5o(virus)/ED5o(kontroll) i hver av celletypene før beregning av selektivitetsindeksen minimaliseres virkningene av slike variasjoner.
Begrepet "rekombinant" viser til et genom som har blitt modifisert ved hjelp av konvensj onelle rekombinant-DNA-teknikker.
Begrepet "virus" viser til enhver obligat intracellulær parasitt uten mekanismer for proteinsyntese og energidannelse. Virusgenomet kan være RNA eller DNA som befinner seg inne i en belagt proteinstruktur i en lipidmembran. Eksempler på virus som er anvendbare ved utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter baculoviridiae, parvo-viridae, picornoviridiae, herpesviridiae, poxviridiae, adenoviridiae og picotrnaviridiae. Begrepet rekombinant virus omfatter kimære (eller til og med multimere) virus, dvs. vektorer som er konstruert ved anvendelse av komplementære kodende sekvenser fra mer enn en virussubtype. Se for eksempel Feng, et al. Nature Biotechnology 15:866-870.
Begrepet "adenovirus" er synonymt med begrepet "adenoviral vektor" og viser til virus fra slekten adenoviridiae. Begrepet adenoviridiae viser kollektivt dyreadenovirus fra slekten mastadenovirus innbefattet, men ikke begrenset til adenovirus under slekter fra menneske, storfe, høns, hest, hund, svin, mus og ape. Nærmere bestemt omfatter humane adenovirus underslektene A-F så vel som de enkelte stereotypene i disse, innbefattet, men ikke begrenset til, humane adenovirus av typene 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Adl IA og Ad 11P), 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19,19a, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47,48, og 91. Begrepet adenovirus fra storfe omfatter, men er ikke begrenset til, bovine adenovirus av typene 1, 2, 3, 4, 7, og 10. Begrepet adenovirus fra hund omfatter, men er ikke begrenset til, hundevirustypene 1 (stammene CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) og 2. Begrepet hesteadenovirus omfatter, men er ikke begrenset til, hestevirustypene 1 og 2. Begrepet svineadenovirus omfatter, men er ikke begrenset til, svinevirustypene 3 og 4. I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen er adenoviruset avledet fra humant adenovirus av serotyper 2 eller 5.
Begrepet "reaksjonsveiresponderende promoter" viser til DNA-sekvenser som binder et gitt protein og som får nærliggende gener til å respondere transkripsjonsmessig på binding av proteinet i normale celler. Slike promotere kan dannes ved å innføre responselementer, som er sekvenser som transkripsjonsfaktorer bindes til. Slike responser er generelt induktive, selv om det finnes flere tilfeller hvor økende proteinnivå reduserer transkripsjonen. Reaksjonsveiresponderende promotere kan være naturlig forekommende eller syntetiske. Reaksjonsveiresponderende promotere konstrueres typisk at det tas hensyn til hvilken reaksjonsvei eller hvilket funksjonelt protein som er målet. For eksempel vil en naturlig forekommende p53-reaksjonsveiresponderende promoter omfatte transkripsjonskontrollelementer som aktiveres i nærvær av funksjonelt p53, for eksempel p21-eller bax-promoteren. Alternativt kan syntetiske promotere som inneholder p53-bindingsseter oppstrøms for en minimal promoter (for eksempel TATA boksområdet fra SV40) anvendes for dannelse av en syntetisk reaksjonsveiresponderende promoter. Syntetiske reaksjonsveiresponderende promotere konstrueres generelt fra én eller flere kopier av en sekvens som stemmer med et konsensus-bindingsmotiv. Slike bindende konsensus-DNA-motiver kan lett bestemmes. Slike konsensussekvenser arrangeres generelt som direkte repetisjoner eller hode-hale-repetisjoner, adskilt med noen få basepar. Elementer som omfatter hode-hode-repetisjoner (for eksempel AGGTCATGACCT), kalles palindromer eller inverterte repetisjoner, mens elementer med hale-hale repetisjoner kalles irriterte repetisjoner.
Eksempler på reaksjonsveiresponderende promotere som er anvendbare ved utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter syntetiske insulinreaksjonsvei-responderende promotere som inneholder den insulinbindende konsensussekvens (Jacob, et. al. (1995). J. Biol. Chem. 270:27773-27779) den cytokine reaksjonsveiresponderende promoter, den glukokortikoidreaksjonsveiresponderende promoter (Lange, et al. (1992) J Biol Chem 267:15673-80), ILI og IL6-reaksjonsveiresponderende promotere (Won K.-A og Baumann H. (1990) Mol. Cell.Biol. 10: 3965-3978), T3-reaksjonsveiresponderende promotere, tyroidhormon-reaksjonsveiresponderende promotere som inneholder konsensusmotivet: 5' AGGRCA 3' TPA-reaksjonsveiresponderende promotere (TRE), TGF-P-reaksjonsveiresponderende promotere (som beskrevet i Grotendorst, et al. (1996) Cell Growth and Differentiation 7: 469-480). Eksempler på andre reaksjonsveiresponderende promotere er velkjente innen faget og kan identifiseres i Database of Transcription Regulatory Regions on Eukaryotic Genomes, som er tilgjengelig via internett ved hppt://www.eimb.rssu.ru/TRRD.
I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen som eksemplifisert heri omfatter vektoren en syntetisk TGF-|3-reaksjonsveiresponderende promoter som er aktiv i nærvær av en funksjonell TGF-|3-reaksjonsvei, for eksempel promoteren som inneholder SRE og PAI-RE-responselementer. PAI-RE viser til et syntetisk TGF-(3-responselement som omfatter sekvenser som responderer på TGF-|3-signal, isolert fra plasminogenaktivator I-promoterområdet. Konstruksjonen av PAI-RE er beskrevet i eksempel 3 heri. Den PAI-RE-reaksjonsveiresponderende promoter kan isoleres som et fragment på 749 basepar, som kan isoleres fra plasmid p8001uc (som beskrevet i Zonneveld, et a/.(1988) PNAS 85:5525-5529 og tilgjengelig fra genbank under aksesjonsbetegnelsen J03836). SRE viser til et syntetisk TGF-|3-responselemenet som omfatter en repetisjon av 4 av de Smad-4-bindende DNA-sekvensene (GTCTAGAC som beskrevet i Zawel, et. al. (1988) Mol. Cell 1:611-617. Konstruksjonen av SRE er beskrevet i eksempel 3 heri. SRE-respons-elementet kan dannes ved hybridisering av komplementære oligonukleotider som omfatter Smad-4-bindende sekvenser og kloning i plasmid pGL3 - Promoter Luciferase Vektor (kommersielt tilgjengelig fra Promega).
På tilsvarende måte viser en "p53-reaksjonsveirseponderende promoter" til et transkripsjonskontrollelement som er aktivt i nærvær av en funksjonell p53-reaksjonsvei. Den p53-reaksjonsveiresponderende promoter kan være et naturlig forekommende transkripsjonskontrollområde som er aktivt i nærvær av en funksjonell p53-reaksjonsvei, for eksempel p21- eller en mdm2-promoteren. Alternativt kan den p53-reaksjonsveiresponderende promoter være et syntetisk transkripsjonskontrollområde som er aktivt i nærvær av en funksjonell p53-reaksjonsvei, for eksempel de SRE og PAI-RE-reaksjonsveiresponderende promotere. p53-CON beskriver en p53-reaksjonsveiresponderende promoter som inneholder et syntetisk p53-responselement, konstruert ved innsetting av to syntetiske p53-bindende konsensus-DNA-sekvenser (som er beskrevet i Funk, et al.
(1992) Mol. Cell Biol. 12:2866-2871) oppstrøms for TATA-boksen fra SV40. Konstruksjonen av den p53-CON reaksjonsveiresponderende promoter er beskrevet i eksempel 3 heri. RGC viser til en syntetisk p53-reaksjonsveiresponderende promoter som anvender et enkelt p53-bindende domene, påvist i den ribosomale genansamling. Kern, et al.
(1991)Science 252:1708-1711 og Park, et al (1996) Molecular Carcinogenesis 16:101-108. p53CON- og RGC-responselementer kan konstrueres ved hybridisering av komplimentære oligokleotider, og p53-responderende promotere kan konstrueres (som beskrevet i mer detalj i eksempel 3) ved kloning i plasmid pGL3-promoterluciferase-vektor (kommersielt tilgjengelig fra Promega). Begrepet "målcelle" viser til en celle med en gitt fenotypisk tilstand som det er ønskelig å behandle ved tilførsel av et terapeutisk transgen. Ved anvendelse av forskjellige reaksjonsveiresponderende promoterelementer kan man styre ekspresjonen av viruset til enhver gitt celle med intakt reaksjonsvei. For eksempel kan repressoren av virusreplikasjon uttrykkes i en neoplastisk målcelle ved anvendelse av TGF-(3- eller p53- reaksjonsveiresponderende promotere. På tilsvarende måte kan repressoren av virusreplikasjon uttrykkes i en artrittisk målcelle ved hjelp av en inflammasjonsresponderende promoter, hvori vektoren eventuelt også koder for IL-10. Begrepet "operativt sammenkoblet" viser til en sammenkobling av polynukleotidelementer i et funksjonelt forhold. En nukleinsyresekvens er "operativt tilkoblet" når den er plassert i et funksjonelt forhold til en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er en promoter eller enhancer operativt sammenkoblet med en kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjonen av den kodende sekvens. Operativt sammenkoblet betyr at nukleotidsekvensene som er koblet sammen typisk er kontinuerlige. Siden enhancere generelt virker når de ligger flere kilobaser fra promoteren og introniske sekvenser kan ha variabel lengde, kan imidlertid noen polynukleotidelementer være operativt sammenkoblet uten at de ligger like ved hverandre, og de kan til og med fungere i trans fra et forskjellig allel eller kromosom. Begrepet "repressor av virusreplikasjon" viser til et protein som ved ekspresjon i en gitt celle i det vesentlige undertrykker virusreplikasjonen. Som fagfolk vil forstå, vil repressoren av virusreplikasjonen avhenge av egenskapene til den adenovirusvektor som den rekombinante vektor ifølge foreliggende oppfinnelse er avledet fra. Når det gjelder adenovirus vektorer eller andre DNA-tumorvirus, kan for eksempel E2F-RB-fusjonsjons-konstruksjonen som beskrevet i europeisk patentsøknad nr 94108445.1, publisert 6. desember 1995 (publikasjonsnr. 0 685 493 Al) anvendes. E2F-RB-fusjonsproteinet består av det DNA-bindende domene og DPl-heterodimeriseringsdomenet fra det human E2F-transkripsjonsfaktorprotein (aminosyrene 95-286 fira villtype-E2F) fusjonert til Rb-vekstundertrykkelsesdomenet (aminosyrene 379-928 fra villtype Rb-protein). E2F-fusjonsproteinet er en kraftig repressor av E2F-avhengig transkripsjon og stopper cellene i Gl. DNA-bindingsdomenet er plassert mellom aminosyrene 128-193 og dimeriserings-domenet mellom aminosyrene 194-289. Sekvensen av det humane E2F-1-protein er tilgjengelig fra genbank under aksesjonsbetegnelsen M96577, deponert den 10. august 1992. E2F-sekvenser fra andre E2F-familiemedlemmer fra andre arter kan anvendes ved konstruksjon av en vektor for anvendelse i andre arter. I den situasjon hvor det rekombinante virus er basert på adenoassosiert virus (AAV), er rep-proteinet, og derivater av dette, effektive repressorer av virusreplikasjonen i fravær av adenovirusinfeksjon. I den situasjon hvor viruset er avledet fra herpes simplex virus, kan ICPO-NX, en delert form av det umiddelbart tidlige protein ICPO (Liun, et al. (1998) J. Virol. 72:7785-7795), anvendes som en effektiv repressor av virusreplikasjonen. På tilsvarende måte kan ethvert protein med dominant negativ aktivitet anvendes som en repressor av virusreplikasjonen. TGF-|3 og beslektede proteiner, innbefattet aktivin, inhibiner og BMP, er kraftige, naturlige, antiproliferative midler og antas å spille viktige roller ved undertrykkelse av tumorigenisitet. I sin bioaktive form er TGF-(3 en disulfidsammenkoblet homodimer på 25 kDa som uttrykkes i nær sagt alle humane vev. Det er av interesse at mange ondartede celletyper har bibeholdt ekspresjonsmønsteret som observeres i normale celler. TGF-|3 signaliserer via heteromere reseptorkomplekser av type I og type II serin/treonin kinase-reseptorer. Av de to reseptorkinasene besitter type II-reseptoren en iboende kinasekativitet, og ved binding av TGF-|3 ligand heteromeriseres type II-reseptoren med og transfosfory-lerer type I-reseptoren. Fosforylering av type I-reseptoren aktiverer dens kinasektivitet, noe som i sin tur fører til fosforylering av Smad, som er intracellulære effektorer. Den fosforylerte type I-reseptor overfører signaler til innsiden av cellen, noe som fører til en cellulær respons, for eksempel vekstinhibering. Det er kjent at når Smad-kompleksene først foreligger i kjernen, aktiverer de transkripsjon av målgener, enten i seg selv ved at de fungerer som transkripsjonsfaktorer eller ved at de regulerer aktiviteten av andre transkripsjonsfaktorer. Transkripsjonsfaktorer som antas å reguleres av TGF-|3-signalet, omfatter CTF/NF-1, FAST-1, Spl, jun, SRF/TRF, Oet og CREB. Nettoresultatet av disse interaksjoner fører til de forskjellige kjente pleiotrope virkninger av TGF-|3. Transformerende vekstfaktor |3 (TGF-|3) og beslektede proteiner er kraftige inhibitorer av mange celletypers proliferasjon. Den ondartede utvikling av forskjellige tumorer med opphav i epitel og hematopoiesen korrelerer med tap av den antiproliferative og antiinvasive virkning av TGF-|3. Manglende TGF-|3-signaler har blitt vist å omfatte mutasjoner eller delesjoner i eller manglende ekspresjon av reseptorene og/eller de intracellulære formidlere i signaloverføringsveien. Mange ondartede tumorer som er resistente overfor TGF-|3 har også flere defekter i andre tumorsuppressorgener, noe som begrenser nytten av tumorsuppressorgen-erstatning for effektiv behandling. TGF-P-reaksjonsveirespronderende promotere ble konstruert ved å innføre sekvenser fira plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-promoter) eller bindingsseter for Smad4/DPC4 (SRE-promoter) oppstrøms for TATA-boksen fra SV40. Aktiviteten av disse promotere ble evaluert i transiente transfeksjonsanalyser med luciferase som reportør. Resultatene er gitt i tabell 2 nedenfor. Disse resultater viser at disse to promotere kun er aktive i celler med funksjonell TGF-|3-signaloverføring. I en TGF-P-reaksjonsvei defekt cellelinje, for eksempel MDA-MB468 som har defekt TGF-P-signaloverføring grunnet en homozygot delesjon av Smad4/DPC4-førte transfeksjon av PAI-promoteren eller SRE-promoteren, operativt koblet til luciferase, og infeksjon med et rekombinant adenovirus som kodet for Smad4 til gjenvinning av aktiviteten av begge responselementene beskrevet ovenfor, noe som ytterligere bekrefter spesifisiteten av disse responselementholdige promotere for TGF-|3-reaksjonsveien, som vist ved resultatene gitt i tabell 3 nedenfor. Et plasmid som inneholdt en PAI-promoter operativt koblet til E2F-RB ble så konstruert og analysert for evne til selektiv represjon av E2-promoteren i celler med en intakt TGF-|3-reaksjonsvei. I transiente transfeksjonsanalyser viste ko-transfeksjon av E2-promoteren koblet til luciferase og PAI-promoteren operativt koblet til E2F-RB selektiv represjon av E2-promoteraktiviteten i 293.celler (med en normal TGF-|3-reaksjonsvei), og ikke i MDA-468-celler (med en defekt TGF-|3-reaksjonsvei) som vist i tabell4, grunnet selektiv ekspresjon av E2F-RB i 293-celler. Som forventet inhiberte ko-transfeksjon med CMV-E2F-RB, som uttrykker E2F-RB i begge disse cellelinjer, aktiviteten av E2-promoteren i begge cellelinjer.
p53-reaksjonsveiresponderende promotere ble konstruert ved å innføre kjente p53-bindingsseter, enten fra den ribosomale genansamling (RGC-promoter) eller p53-bindingsseter med høy affinitet (p53CON-promoter). Aktiviteten av disse promotere ble evaluert i transiente transfeksjonsanalyser med luciferase som rapportørgen. Resultatene av disse eksperimenter er gitt i tabell 5 nedenfor.
Resultatene viste at begge disse responselementer er aktive i celler med funksjonelt p53. For å bekrefte at den p53-responderende promoteraktivitet skyldes funksjonelt p53 ble to cellelinjer, WIDR og U87, ko-transfektert med en RGC-promoter som styrte ekspresjonen av luciferasegenet og enten en kontrolladenovirusvektor med tom kassett (ZZCB) eller et rekombinant adenovirus som konstitutivt produserer p53 under kontroll av CMV-promoteren (FTCB). Resultatene fra disse eksperimenter er gitt tabell 6.
Som det kan ses fra de gitte resultater øker aktiviteten av den p53-responderende promoter på en doseavhengig måte med økende p53-aktivitet.
Rekombinante adenovirusvektorer som inneholder kodende sekvens for E2F-RB-fusjonsprotein under kontroll av enten en TGF-|3-reaksjonsveiresponderende promoter (PAI eller SRE) eller en p53-reaksjonsveiresponderende promoter (RGC eller p53-CON) ble fremstilt. I tillegg ble genet som koder for grønt fluorescerende protein også innført i vektorene som et rapportørgen. De resulterende virus ble analysert for evne til selektiv replikasjon i og dreping av celler i enten TGF-|3 eller p53-reaksjonsveidefekter i analyser av cytopatisk virkning (CPE). Resultatene er vist i figur 1 i de vedlagte figurer. IMRC9 (p53-reaksjonsveipositiv og TGF-|3-reaksjonsveipositiv) var villtype-adenovirus i stand til og replikeres og indusere CPE selv ved lave konsentrasjoner (lx IO<6>partikler/ml), mens de TGF-P"eller p53-reaksjonsveirettede vektorer ikke induserte CPE ved denne konsentrasjon. Kun i den høyeste analyserte dose (lx IO<8>partikler/ml), viste reaksjonsveirettede vektorer noe CPE. I motsetning til dette var reaksjonsveirettede vektorer effektive i cellelinjer som WIDR (defekt både i p53- og TGF-(3-reaksjonsveien) og Hep3B (p53 null og TGF-(3-reaksjonsveidefekte i fravær av eksogen TGF-|3 for induksjon av CPE i samme grad som villtypevirus, selv i lave konsentrasjoner (lx IO<6>) partikler/ml). Fluorescensmikroskopi av Hep3B-celler infisert med reaksjonsveirettede vektorer (SRE-Ad og p3Con-Ad) viste ekspresjon i høyt nivå av transgenet og spredning av viruset i kulturen, selv ved infeksjon med en lav partikkelkonsentrasjon (lx IO<5>) partikler/ml behandlet i to timer). I motsetning til dette viste Hep3B-celler infisert med det replikasjonsdefekte (ElA-delerte) GFP-kodende adenovirus (GFCB) i samme konsentrasjon (lx IO<5>partikler/ml) ingen GFP-ekspresjon.
Som tidligere antydet er vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse i stand til selektiv replikasjon og lysis av målcellen under selektive betingelser. Dette er imidlertid ikke ment å bety at ytterligere lag av selektivitet og toksisitet ikke kan innføres i disse vektorer. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også rekombinante adenovirus som inneholder ytterligere modifikasjoner i virusgenomet, for eksempel målstyringsmodifika-sjoner, transgenekspesjonskassetter eller modifikasjoner av virusgenomet for å lette selektiv replikasjon i en gitt celletype eller fenotypisk tilstand.
Begrepet "målrettende modifikasjon" viser til modifikasjoner i virusgenomet som er utformet slik at de fører til preferensiell infektivitet av en gitt celletype. Celletypespesifisitet eller celletypemålretting kan også oppnås i vektorer avledet fra virus med typisk bred infektivitet, for eksempel adenovirus, ved modifikasjon av viruskappeproteinene. For eksempel har cellemålretting blitt oppnådd ved adenovirusvektorer ved selektiv modifikasjon av virusgenomsekvenser som koder for knob og fibere for å oppnå ekspresjon av modifiserte knob- og fiberdomener som interagerer spesifikt med unike celleoverflate-reseptorer. Eksempler på slike modifikasjoner er beskrevet i Wickham, et al. (1997) J. Virol 71(11):8221-8229 (innføring av RGD-peptider i adenovirale fiberproteiner), Arnberg, et al.
(1997) Virology 227:239-244 (modifisering av adenovirale fibergener for å oppnå tropisme for øye og kjønnsorganer), Harris og Lemoine (1996) TIG 12(10):400-405; Stevenson, et al.
(1997) J. Virol 71(6):4782-4790; Michael, et al. (1995) genterapi 2:660-668 (innføring av gastrinfrigivende peptidfragment i adenoviralt fiberprotein), og Ohno, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:763-767 (innføring av et Protein A-IgG-bindende domene i Sindbis-virus). Andre fremgangsmåter for cellespesifikk målstyring har blitt oppnådd ved konjugasjon av antistoffer eller antistoff-fragmenter til kappe-proteinene (se for eksempel Michael, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869, Watkins, et al. (1997) Gene Therapy 4:1004-1012; Douglas et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1574-1578. Alternativt kan visse grupper konjugeres til virusoverflaten for å oppnå målstyring (se for eksempel Nilson et al. (1996) Gene Therapy 3:280-286 (konjugering av EGF til retrovirale proteiner). Disse rekombinant modifiserte vektorene kan fremstilles ifølge utførelsen av foreliggende oppfinnelse.
Begrepet "transgenekspresjonskassett" viser til en promoter som er funksjonell i målcellen, operativt koblet til et terapeutisk transgen. Begrepet promoter viser til nukleotidsekvenser som påvirker transkripsjonen av en annen nukleotidsekvens. Eksempler på promotere omfatter svake konstitutive promotere, temporale viruspromotere og regulerbare promotere.
Begrepet "temporale promotere" viser til promotere som styrer transkripsjon av det terapeutiske transgen på et senere tidspunkt i virusets livssyklus enn promoteren som kontrollerer ekspresjonen av den reaksjonsveiresponderende promoter. Eksempler på slike temporalt regulerte promotere omfatter den sene hovedpromoter fra adenovirus (MLP), og andre promotere, for eksempel E3.1 den foretrukne utførelse av oppfinnelsen anvendes MPL-promoteren. For herpes simplex-virus kan de latent aktiverte promotere anvendes.
Begrepet "regulerbare promotere" viser til induserbare promotere, vevsspesifikke promotere og tumorspesifikke promotere. Begrepet "induserbar promoter" viser til promotere som preferensielt (eller kun) letter transkripsjonen av det terapeutiske transgen under visse betingelser og/eller som respons på ytre kjemiske stimuli eller andre slags stimuli. Eksempler på induserbare promotere er kjente i den vitenskapelige litteratur (se for eksempel Yoshida og Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; lida, et al,. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059, Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; og Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(46);29364-29371. Eksempler på strålingsinduserbare promotere beskrives i Manome, et al. (1998) Human Gene Therapy 9:1409-1417). Ytterligere et selektivitetsnivå kan innføres ved anvendelse av vevsspesifikke eller tumorspesifikke promotere. Vevsspesifikke og tumorspesifikke promotere er velkjente innen faget og omfatter promotere som fortrinnsvis er aktive i glatt muskel (a-actin-promoteren), bukspyttkjertelspesifikke promotere (Palmiter, et al. (1987) Cell 50:435), leverspesifikke promotere Rovet, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20765; Lemaigne, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:19896; Nitsch, et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:4494), magespesifikke promotere (Kovarik, et al. (1993) J. Biol. Chem.
268:9917, hypofysespesifikke promotere (Rhodes, et al. (1993) Genes Dev. 7:913, prostataspesifikke promotere osv.
Begrepet "terapeutisk transgen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon i målcellen gir en terapeutisk virkning. Begrepet "terapeutisk transgene" omfatter, men er ikke begrenset til, tumorsuppressorgener, antigene gener, cytotoksiske gener, cytostatiske gener, promedikamentaktiverende gener, apoptopiske gener, farmasøytiske gener og antiangiogene gener. Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for produksjon av ett eller flere terapeutiske transgener, enten i tandem ved anvendelse av IRES-elementer eller via promotere som reguleres uavhengig av hverandre.
Begrepet "tumorsuppressorgen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon i målcellen kan undertrykke den neoplastiske fenotype og/eller indusere apoptose. Eksempler på tumorsuppressorgener som er anvendbare ved utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter p53-genet, APC-genet, DPC-4/Smad4-genet, BRCA-l-genet, BRCA-2genet, WT-1-genet, retinoblastomgenet (Lee, et al. (1987) Nature 329:642), MMAC-l-genet, adenomatøs polypose coli-proteinet (Albertsen, et al., U.S. patentskrift nr 5 783 666, tildelt 21. juli 1998), delert i kolonkarsinom (DCC)-genet, MMSC-2-genet, NF-l-genet, nasofaryngealt karsinom-tumorsuppressorgen kartlagt til kromosom 3p21.3. (Cheng, et al. 1998. ProcNatl. Acad. Sei. 95:3042-3047), MTSl-genet, CDK4-genet, NF-l-genet, NF2-genet og VHL-genet.
Begrepet "antigene gener" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon i målcellene føre til produksjon av et antigent celleoverflateprotein som kan gjenkjennes av immunsystemet. Eksempler på antigene gener omfatter karsinoembryonalt antigen (CEA), p53 (som beskrevet i Levine, A. PCT internasjonalt patentskrift nr WO94/02167, publisert 3 februar 1994). For å lette immungjenkjenningen kan det antigene gen være fusjonert til MHC klasse I-antigenet.
Begrepet "cytotoksisk gen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon i en celle gir en toksisk virkning. Eksempler på slike cytotoksiske gener omfatter nukleotidsekvenser som koder for pseudomonas eksotoksin, ricintoksin, difteritoksin og lignende.
Begrepet "cytostatisk gen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon i en celle gir en stans i cellesyklus. Eksempler på slike cytostatiske gener omfatter p21, retinoblastomgenet, E2F-RB-fusjonsproteingenet, gener som koder for cyclinavhengige kinase-inhibitorer som P16, pl5, pl8 og pl9, vekststoppspesifikke homeoboks (GAX)-gen som beskrevet i Branellec, et al. (PCT-skrift W097/16459 publisert 9. mai 1997 og PCT-skrift WO96/30385, publisert 3. oktober 1996).
Begrepet "cytokingen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon i en celle produserer et cytokin. Eksempler på slike cytokiner omfatter GM-CSF, interleukinene, fortrinnsvis IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferoner av subtypene a, |3 og y, fortrinnsvis interferon a-2b og fusjoner som interferon a-2a-l.
Begrepet "kjemokingen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon i en celle produserer et cytokin. Begrepet "kjemokin" viser til en gruppe strukturelt beslektede, lav-molekylære cytokiner/vekstfaktorer som utskilles av celler og som har mitogen, kjemotaktisk eller inflammatorisk aktivitet. Disse er fortrinnsvis kationiske proteiner med fra 70 til 100 aminosyrerester og fire konserverte cysteinrester. Disse proteinene kan inndeles i to grupper, basert på avstanden mellom de to aminoterminale cysteiner. I den første gruppe er de to cysteinene adskilt av en enkelt aminosyrerest (C-x-C), mens de i den andre gruppe ligger i nabostilling (C-C). Eksempler på medlemmer av 'C-x-C-kjemokinene omfatter, men er ikke begrenset til, blodplatefaktor 4 (PF4), basisk blodplateprotein (PBP), interleukin-8 (IL-8), melanomvekststimulerende aktivitet-protein (MGSA), inflammatorisk makrofagprotein 2 (MIP-2), mus Mig (ml 19), kylling 9E3 (eller pCEF-4), alveolære makrofagkjemotaktiske faktorer I og II fira svin (AMCF-I og -II), pre-B-cellevekst-stimulerende faktor (PBSF), og IP10. Eksempler på medlemmer av 'C-C'-gruppen omfatter, men er ikke begrenset til, kjemotaktisk monocyttprotein l(MCP-l) kjemotaktisk monocyttprotein 2 (MCP-2), kjemotaktisk monocyttprotein 3 (MCP-3), kjemotaktisk monocyttprotein 4 (MCP-4), inflammatorisk makrofagprotein 1 a (MIP-1-a), inflammatorisk makrofagprotein 113 (MIP-1-|3), inflammatorisk makrofagprotein 1 y (MIP-1-y) inflammatorisk makrofagprotein 3-a (MIP-3-a), inflammatorisk makrofagprotein 3
(MIP-3-P), kjemokin (ELC), inflammatorisk makrofagprotein 4(MIP-4), inflammatorisk makrofagprotein 5 (MIP-5), LD78 |3, RANTES, SIS-epsilon (p500), bisselaktiverings-regulert kjemokin (TARC), eotaksin, 1-309, humant protein HCC-l/NCC-2, humant protein HCC-3, museprotein CIO.
Begrepet "farmasøytisk proteingen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon fører til dannelse av et protein med en farmasøytisk virkning i målcellen. Eksempler på slike farmasøytiske gener omfatter proinsulingenet og analoger av dette (som beskrevet i PCT internasjonal patentsøknad nr W098/31397, veksthormongenet, gener for dopamin, serotonin, epidermal vekstfaktor, GABA, ACTH, NGF, VEGF (for å øke blodgjennom-strømmingen i målvevet og indusere angiogenese, PCT-publikasjon W098/32859, publisert 30. juli 1998), trombospondin osv.
Begrepet "proapoptopisk gen" viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon fører til cellens programmerte celledød. Eksempler på proapoptopiske gener omfatter p53, adenovirus E3-11,6K (avledet fira Ad2) eller adenovirus-E3-10,5K (avledet fira Ad), E4orf4-genet fira adenovirus, p53-reaksjonsveigenet og gener som koder for kaspaser.
Begrepet "promedikamentaktiverende gener" viser til nukleotidsekvenser hvis ekspresjon fører til dannelse av protein som kan overføre en ikke-terapeutisk forbindelse til en terapeutisk forbindelse, som gjør cellen følsom for dreping ved ytre faktorer eller som forårsaker en toksisk tilstand i cellen. Et eksempel på et promedikamentaktiverende gen er cytoindeaminasegenet. Cytosindeaminase overfører 5-fluorcytosin (5-FC) til 5-fluoracil (5-FU), et kraftig antitumormiddel. Lysering av tumorcellen gir en lokal høy konsentrasjon av cytosindeaminase som kan overføre 5FC til 5FU på dette sted i tumoren, noe som fører til dreping av mange omliggende tumorceller. Dette fører til dreping av et stort antall tumorceller uten at det er nødvendig å infisere disse cellene med et adenovirus (den såkalte tilskuervirkning). I tillegg kan tymidinkinase (TK)-genet (se for eksempel Woo, et al., U.S. patentskrift nr 5 631 236, tildelt 20. mai 1997, og Freeman, et al, U.S. patentskrift nr 5 601 818, tildelt 11. februar 1997) hvor cellene som uttrykker TK-genproduktet er utsatt for selektiv dreping ved tilførsel av ganciclovir, anvendes.
Begrepet "antiangiogene" gener viser til en nukleotidsekvens hvis ekspresjon fører til ekstracellulær utskillelse av antiangiogene faktorer. Antiangiogenesefaktorer omfatter angiostatin, inhibitorer av vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) som Tie 2 (som beskrevet i PNAS (USA) (1998) 95:8795-8800) og endostatin.
Det vil være åpenbart for fagfolk at modifikasjoner og/eller delesjoner i de ovenfor beskrevne gener slik at de koder for funksjonelle subfragmenter av villtypeproteinet lett kan tilpasses for anvendelse ved utførelse av foreliggende oppfinnelse. For eksempel omfatter henvisningen til p53-genet ikke bare villtypeproteinet, men også modifiserte p53-proteiner. Eksempler på slike modifiserte p53-proteiner omfatter modifikasjoner i p53 som øker kjerneretensjonen, delesjoner for eksempel av aminosyrene 13-19 for å fjerne konsensus-kløyvingssetet for calpain, eller modifikasjoner i oligomeriseringsdomenene (som beskrevet i Bracco, et al. PCT-publisert patentsøknad WO97/0492 eller U.S. patentskrift nr 5 573 925.
Det vil være åpenbart for fagfolk at de ovenfor beskrevne terapeutiske gener kan utskilles i mediet eller lokaliseres til gitte intracellulære områder ved å la en målstyrende gruppe inngå, for eksempel et signalpeptid eller et kjernelokaliseringssignal (NLS). Også omfattet av definisjonen for terapeutisk transgen er fusjonsproteiner mellom det terapeutiske transgen og det strukturelle protein VP22 fra herpes simpleks-virus type 1 (HSV-1). Fusjonsproteiner som omfatter VP22-signalet vil ved syntese i en infisert celle eksporteres ut av cellen og effektivt gå inn i omliggende, ikke infiserte celler innen en diameter tilsvarende tilnærmet 16 celler. Dette system er spesielt anvendbart i forbindelse med transkripsjonelt aktive proteiner (for eksempel p53) siden fusjonsproteinene effektivt transporteres til kjernen i de omliggende celler. Se for eksempel Elliott, G. & 0'Hare, P. Cell. 88:233:1997; Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nature Biotechnology, 15:205:1997; 0'Hare, et al. PCT patentskrift nr WO97/05265 publisert 13. februar 1997. En lignende målstyrende gruppe avledet fra Tat-protein fra HIV er også beskrevet i Vives, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017.
Ytterligere modifikasjoner for å øke effektiviteten av vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, endringer innen El, innføring av mutasjoner i E4 for å øke cytotoksisiteten (Muller, et al (1992) J. Virol. 66:5867-5878), og opp-regulering av virale dødsproteiner som proteinene E4orf4 eller E3 11,6K.
I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen, som eksemplifisert heri, omfatter vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse et betingelsesavhengig replikerende adenovirus som omfatter en p53- eller TGF-|3-reaksjonsveiresponderende promoter som styrer ekspresjonen av E2F-RB-fusjonsproteinet, og som eventuelt i tillegg omfatter cytosin-diaminasegenet under kontroll av den temporale E3-promoter. I slike tilfelle produseres cytosindiaminase kun i tumorceller etter virusreplikasjonen. I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen er det promedikamentomdannende gen under kontroll av en relativt svak eller vevs- eller tumorspesifikk promoter.
I annen utførelse av oppfinnelsen omfatter vektoren et rekombinant adenovirus med en p53- eller TGF-|3-reaksjonsveiresponderende promoter som styrer ekspresjonen av E2F-RB-fusjonsproteinet og en transgenekspresjonskassett som uttrykker cytosindeaminase alene, eller i en bicistronisk ekspresjonskassett som omfatter cytosindeaminase, et IRES-element og MIP-3alfa-proteinet. Siden cytosindiaminase uttrykkes oppnås tumorcelle-dreping ved tilførsel av et promedikament, for eksempel 5-fluorcytosin. Ekspresjon i lavt nivå av MIP-3-a vil bidra til utvikling av antitumorimmunitet.
Flernivå, flerfunksjonen og flerreaksjonsveiresponderende kaskade anvendes om hverandre heri for å vise til konstruksjon av reaksjonsveiresponderende elementer, slik at det oppnås en terapeutisk virkning dersom mer enn én reaksjonsvei kan analyseres samtidig. Det vil være åpenbart for fagfolk at vektorkontrollelementene som er beskrevet ovenfor kan kombineres slik at det oppnås flere selektivitetslag i vekstorene ifølge foreliggende oppfinnelse. Som et eksempel på flernivåkontroll ville det være mulig å utforme et betingelsesavhengig replikerende adenovirus som kan replikeres i og drepe celler med defekter i enten Rb, TGF-|3- eller p53-reaksjonsveien. En slik vektor ville omfatte ekspresjon av en dominant negativ inhibitor av virusreplikasjonen, kontrollert av en p53-responderende promoter, som et primært kontrollnivå. Som en følge av dette vil den dominant negative inhibitor uttrykkes i enhver celle (for eksempel alle normale celler) med funksjonelt p53, slik at virusreplikasjonen blokkeres, men ikke i celler med inaktivt p53. Denne vektor kan imidlertid replikeres i tumorceller med funksjonelt p53, men med defekter i andre reaksjonsveier, for eksempel TGF-|3- og Rb-reaksjonsveien. Derfor kan ytterligere kontrollnivåer som i det vesentlige ville inaktivere funksjonelt p53 i tumorceller innsettes, noe som tillater virusreplikasjon dersom andre reaksjonsveier er defekte.
Som et andre kontrollnivå kunne den samme vektor også inneholde en ekspresjonskassett som inneholdt ElB-55K-protein fra adenovirus, som kan inaktivere funksjonen av p53, under kontroll av en promoter som kun er aktiv i TGF-|3-reaksjonsveidefekte celler. En promoter som kun er aktiv i TGF-|3-reaksjonsveidefekte celler kan konstrueres ved å inn-sette repressorbindingsseter i en promoter slik at ekspresjon av reseptoren ved anvendelse av en TGF-(3-responderende promoter et annet sted i vektoren vil føre til blokkering av promoteraktiviteten i celler med intakt TGF-|3-signalisering. I celler hvor TGF-|3-reaksj om-veien er defekt vil på den annen side repressorer ikke syntetiseres, og promoteren vil således være aktiv. Grunnet ekspresjon av E1B-55K fra promoteren som kun er aktiv i celler med defekt TGF-|3-reaksjonsvei inaktiveres endogent p53. Alternativt kan enhver naturlig promoter som nedreguleres som følge av TGF-|3-signalisering anvendes. Omfattelse av de to ekspresjonskassettene beskrevet ovenfor vil sikre at den dominant negative inhibitor kun uttrykkes når både p53 og TGF-|3-reaksjonsveien er normal (fører til blokkert replikasjon), men ikke dersom én eller begge reaksjonsveier er defekte (fører til virusreplikasjon).
Som et tredje kontrollnivå oppnås ekspresjon av et protein, for eksempel Smad7 eller enhver annen dominant negativ form av Smad, som kan inaktivere TGF-|3-reaksjonsveien (Nakao et al, Nature 9. oktober 1997; 389 (6651):631-635) kontrollert av en E2F-responderende promoter, i samme vektor. En E2F-responderende promoter (for eksempel E2-fremgangsmåte-promoteren, E2-promoteren eller en syntetisk promoter med flere E2F-bindingsseter oppstrøms for en minimal promoter, for eksempel TATA-boksen fra SV40) er aktiv dersom Rb-reaksjonsveien er defekt. Grunnet dette tredje kontrollnivå uttrykkes Smad7 i celler med defekt Rb-reaksjonsvei og vil i sin tur inaktivere Smad4 og blokkere TGF-P-signaloverføringen. Derfor produseres E1B-55K og p53 inaktiveres, noe som fører til manglende ekspresjon av den dominant negative inhibitor. Derfor kan virusreplikasjonen forløpe uhindret. Dersom på den annen side Rb-reaksjonsveien er normal, vil Smad7 ikke syntetiseres, slik at TGF-|3-signaloverføringen forløper normalt. Derfor lages ikke ElB-55k, noe som fører til et funksjonelt p53, og ekspresjon av den dominant negative inhibitor, slik at virusreplikasjonen blokkeres.
Med de ovenfor beskrevne tre kontrollnivåer vil en defekt i én, to eller alle disse tre reaksjonsveier (Rb, TGF-(3 og p53) til syvende og sist føre til virusreplikasjon og cellelysis. Bare dersom alle tre reaksjonsveier er funksjonelle, som i normale celler, vil virusreplikasjon ikke opptre.
Som fagfolk forstår, kan vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes i mange varianter for påvisning og behandling av et bredt utvalg av reaksjonsveidefekter ved anvendelse av en rekke reaksjonsveiresponderende promotere. I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen, som eksemplifisert heri, er imidlertid den rekombinante adenovirale vektor avledet fira slekten adenoviridiae. Spesielt foretrukne virus er avledet fra humant adenovirus type 2 eller type 5. Dersom en adenoviral vektor anvendes som utgangsvektor er den foretrukne inhibitor av virusreplikasjonen E2F-RB-fusjonsproteinet.
I den foretrukne utførelsen av oppfinnelsen ved anvendelse av vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse for behandling av sykdommer forbundet med ukontrollert celle-proliferasjon foretrekkes det at en adeno viral vektor som inneholder spesifikke delesjoner i Ela-området anvendes, slik at Ela-genproduktets evne til å bindes til p300-proteinet og Rb-proteinet fjernes samtidig som den transaktiverende aktivitet av CR3-domenet i Ela bibeholdes. Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter delesjoner i den Ela-kodende sekvens som fjerner pl05-Rb-bindingsseter i den 13S-kodende sekvens. I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen representeres p300 bindingsdelesjonene av delesjon av aminosyrene tilnærmet 4 til tilnærmet 25 eller tilnærmet 36 til tilnærmet 49.
Delesjonene i den kodende sekvens for Ela 289R som er nødvendige for å fjerne binding av p300 og pRb er fortrinnsvis så små som mulig, for å forhindre vesentlig forstyrrelse av Ela 289R-proteinet sekundærstruktur og tertiærstruktur. For å fjerne p300-bindingen foretrekkes det at en mutasjon innføres i DNA-sekvensen som koder for p300-bindingsdomenene i 289R. Delesjon av mindre enn tilnærmet 30 aminosyrer i det C-terminale område for å forhindre p300-binding foretrekkes, selv om mindre modifikasjoner foretrekkes ytterligere. For eksempel foretrekkes alternativt delesjon av aminosyrene 4 til 25 (dll 101), aminosyrene tilnærmet 30 til 49 (dll 103) og, mer foretrukket, 36 til 49 for eliminering av p300-binding. Punktmutasjoner som er tilstrekkelige til å forstyrre binding av p300 foretrekkes spesielt. For eksempel har en punktmutasjon av aminosyre 2 fra arginin til glysin (Arg2-»Gly2) i 289R-proteinet blitt vist å forstyrre p300-bindingen (Se for eksempel pm563, Whyte, et al (1989) Cell 56:67-75). Når det gjelder å forhindre pRbl05-binding foretrekkes på tilsvarende måte minimale modifikasjoner. Fjerning av selektive aminosyrer i pRbl05-bindingsdomenet, for eksempel aminosyrene 111-123 (dll 107) og aminosyrene 124-127 (dll 108) foretrekkes. Delesjon av alendronsyrene 111-123 (dll 107) foretrekkes spesielt, siden den pl07-bindende aktivitet av 289R-proteinet bibeholdes.
I tillegg kan fjerning av aminosyrene fra tilnærmet 219 til 289 i Ela 289R-proteinet og 173 til 243 i Ela 243R-proteinet innføres. Ved for eksempel å innføre en punktmutasjon i en posisjon som tilsvarer posisjon 1131 i det humane Ad5-genom (det vil si å endre cytosin<1131>til guanin) danner et stoppkodon. Denne mutasjon fører til fjerning av aminosyrene 219 til 289 i Ela 289R-proteinet og 173 til 243 i EIA 243R-proteinet. Denne mutasjon utføres eventuelt i tillegg til delesjonene i Rb-p300-bidingsdomenene beskrevet ovenfor. Ytterligere eksempler på slike utgangsvektorer er beskrevet i U.S. patentsøknader nr 60/104 317 og 08/09/172 684, innlevert 15. oktober 1998.
I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen som eksemplifisert heri er de foretrukne p53-reaksjonsveiresponderende promotere p53-CON og RGC. Foretrukne TGF-|3-reaksjonsveiresponderende promotere er utvalgt fira gruppen som består av PAI-RE og SRE.
I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen er det terapeutiske gen et promedikamentaktiverende gen, for eksempel cytosindeaminase. I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen for induksjon av anti-tumorimmunitet koder vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse for MIP-3-alfa.
Foretrukne promotere for ekspresjon av det terapeutiske gen er temporale promotere, for eksempel MPL og E3.
I adenovirale konstruksjoner er Ad E3-1 l,6K-proteinet fjernet eller har forsinket virkning, for å minimalisere cellelysis indusert av adenovirus inntil replikasjon er oppnådd. Nærmere bestemt vil eliminering av det native E3-1 l,6K/10,5K-gen foretrekkes. Dette vil minimalisere immunresponsen til etter at den første runde med lokalisert spredning har skjedd. På dette sene tidspunkt, når først apoptose av de opprinnelig infiserte celler er oppnådd, og lokalisert virusspredning er tillatt, vil immunresponsen være fordelaktig. 1 l,6K-proteinet (eller det tilsvarende E3-10,5K-protein i Ad5) er et proapoptopisk gen og kan anvendes for å oppnå celledreping av tumorceller. Siden man ønsker å forsinke den tidlige lysis av målcellen for å maksimalisere virusreplikasjonen foretrekkes det imidlertid at 1 l,6K/10,5K-genet plasseres under kontroll av en temporal promoter, for eksempel MLP-promoteren, for å forsinke induksjonen av denne apoptopiske virkning.
Farmasøytiske preparater
Det beskrives også et farmasøytisk aksepterbart preparat av de rekombinante virus i kombinasjon med et bærerstoff. Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan i praksis utformes for dosetilførsel i samsvar med konvensjonell farmasøytisk praksis, ved tilsetning av bærerstoffer og eksipienser. Dosepreparater kan omfatte intravenøs, intratumoral, intramuskulær, intraperitoneal og topisk tilførsel, matrikstilførsel eller aerosoltilførsel.
Begrepet "bærerstoff' viser til forbindelser som vanligvis anvendes for utforming av farmasøytiske preparater og som anvendes for å øke den terapeutiske forbindelses-stabilitet, sterilitet og tilførbarhet. Dersom viruset er utformet som en løsning eller suspensjon, er tilførselssystemet i et aksepterbart bærerstoff, fortrinnsvis et vandig bærerstoff. En vandige bærerstoffer kan anvendes, for eksempel vann, bufret vann, 0,8 % saltvann, 0,3 % glysin, hyaluronsyre og lignende. Disse preparater kan steriliseres ved konvensjonelle, velkjente steriliseringsteknikker, eller de kan sterilfiltreres. De resulterende vandige løsninger kan pakkes for anvendelse som de er eller frysetørkes, og det frysetørkede preparat vil sammenblandes med en steril løsning før tilførsel. Preparatene kan inneholde farmasøytisk aksepterbare tilleggsforbindelser etter behov for å gi et miljø som ligger nær det fysiologiske, for eksempel pH-justerende og bufrende midler, tonisitetsjusterende midler, fuktningsmidler og lignende, for eksempel natriumacetat, natriumlaktat, natrium-klorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, natriummonolaurat, trietanolaminoleat osv.
Det beskrives videre farmasøytiske preparater av virusene ifølge foreliggende oppfinnelse med et bærerstoff og ett eller flere tilførselsfremmende midler. Begrepene "tilførselsfremmere" eller "tilførselsfremmende midler" anvendes om hverandre heri og omfatter ett eller flere midler som letter opptak av viruset i målcellen. Eksempler på tilførselsfremmende midler er beskrevet i U.S. patentsøknad nr 09/112 074, innlevert 8. juli 1998 og 08/938 089 innlevert 26. september 1997. Eksempler på slike tilførselsfremmende midler omfatter detergenter, alkoholer, glykoler overflateaktive midler, gallesalter, heparinantagonister, syklooksygenaseinhibitorer, hypertone saltløsninger og acetater. Alkoholer omfatter for eksempel de alifatiske alkoholene som etanol, N-propanol, isopropanol, butylalkohol og acetylalkohol. Glykoler omfatter glyserin, propylenglykol, polyetylenglykol og andre glykoler med lav molekylvekt for eksempel glyserol og tioglyserol. Acetater som eddiksyre, glukonsyre og natriumacetat er andre eksempler på tilførselsfremmende midler. Hypertone saltløsninger som IM NaCl er også eksempler på tilførselsfremmende midler. Eksempler på overflateaktive midler er natriumdodesylsulfat (SDS) og lysolecitin, polysorbat 80, nonylfenoksypolyoksyetylen, lysofosfatidylkolin, polyetylenglykol 400, polysorbat 80, polyoksyetylenetere, polyglykoletere og DMSO. Gallesalter som taurokolat, natriumtaurodeoksykolat, deoksykolat, chenodeoksykolat, glykokolsyre, glykochene-deoksykolsyre og andre astringerende midler, for eksempel sølvnitrat kan anvendes. Heparinantagonister som kvaternære aminer, for eksempel protaminsulfat, kan også anvendes. Syklooksygenaseinhibitorer som natriumsalisylat, salisylsyre og ikke-steroide antiinflammatoriske medikamenter (NSAID) som indometacin, naproxen og diclofenac kan anvendes. Tilførselsfremmende midler omfatter forbindelser med formel I:
hvori XI og X2 er utvalgt fra gruppen som består av en kolsyregruppe, en deoksykolsyre-gruppe og en sakkaridgruppe, m er et heltall fra 2 til 8 og fortrinnsvis 2 eller 3, n er et heltall fra 2 til 8 og fortrinnsvis 2 eller 3, og R en kationisk gruppe, en sakkaridgruppe eller en struktur -CO-X3, hvori X3 er en sakkaridgruppe. Sakkaridgruppen kan være utvalgt fra gruppen som består av pentosemonosakkaridgrupper, heksosemono-sakkaridgrupper, pentose-pentosedisakkaridgrupper, heksose-heksosedisakkaridgrupper, pentose-heksose-disakkairdgrupper og heksose-pentosedisakkaridgrupper.
Begrepet "detergent" omfatter anioniske, kationiske, zwitterioniske og ikke-ioniske detergenter. Eksempler på detergenter omfatter, men er ikke begrenset til, taurokolat, deoksykolat, taurodeoksykolat, cetylpyridium, benalkoniumklorid, zwittergent 3-14-detergent, CHAPS (3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammoniol]-l-propansulfonathydrat), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, Triton-X-100-detergent, C12E8, Oktyl-B-D-glukopyranosid, PLURONIC-F68-detergent, TWEEN 20-detergent og TWEEN 80-detergent (CalBiochem Biochemicals).
Enhetsdoseutforminger som beskrives heri kan inngå i et sett av produkter som omfatter det rekombinante virus (vektor) ifølge krav 1 i frysetørket form og en løsning for rekonstitusjon av det frysetørkede produkt. Rekombinante virus ifølge foreliggende oppfinnelse kan frysetørkes ved konvensjonelle fremgangsmåter og rekonstitueres.
Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også tilføres i forbindelse calpaininhibitorer. Begrepet "calpaininhibitor" (forkortet "CI") viser til en forbindelse som inhiberer den proteolytiske virkning av calpain-I, for eksempel^i-calpainer. Begrepet calpaininhibitorer, som det anvendes heri, omfatter forbindelser med calpain I-inhiberende aktivitet i tillegg til, eller uavhengig av, deres andre biologiske aktiviteter. Et bredt utvalg av forbindelser har blitt vist å ha inhiberende aktivitet på den proteolytiske virkning av calpainer. Eksempler på calpaininhibitorer som er anvendbare ved utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter N-acetyl-leu-leu-norleucinal, også betegnet "calpaininhibitor 1". Calpaininhibitorer har blitt vist å øke infektiviteten av celler når det gjelder virusvektorer, å forhøye transkripsjonen fra promotere ved å øke nivået av transkripsjonsfaktorene NfkappaB og AP-1, og å redusere CTL-responsen på adenovirale vektorer. Følgelig kan preparatene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse eventuelt omfatte calpaininhibitorer. Calpaininhibitorer og anvendelse av disse er beskrevet i Atencio, et al. U.S. patentsøknader nr 60/104 321 og 09/073 076, innlevert 15. oktober 1998.
Fremgangsmåter for anvendelse
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for dreping av en celle med en defekt i en regulatorisk reaksjonsvei ved å sette målcellen ex vivo i forbindelse med en selektivt replikerende vektor ifølge foreliggende oppfinnelse. I en utførelse av oppfinnelsen, som eksemplifisert heri, er cellen som inneholder en defekt reaksjonsvei en neoplastisk celle. Begrepet "neoplastisk celle" betegner en celle som fremviser en avvikende vekstfenotype,karakterisert vedat den er uavhengig av normale, cellulær vekstkontroller. Siden neoplastiske celler ikke nødvendigvis replikeres på et gitt tidspunkt omfatter begrepet neoplastiske celler som kan være i aktiv replikasjon og celler som er i en tidsbegrenset, ikke replikerende hviletilstand (Gl eller G0). Lokaliserte populasjoner av neoplastiske celler betegnes neoplasier. Neoplasier kan være ondartede eller godartede. Ondartede neoplasier betegnes også cancere. Begrepet cancer anvendes heri ensbetydende med begrepet tumor. Neoplastisk transformasjon betegner omdannelsen av en normal celle til en neoplastisk celle, ofte en tumorcelle.
Det beskrives også en fremgangsmåte for ablasjon av neoplastiske celler i en pattedyrsorganisme in vivo ved tilførsel av et farmasøytisk aksepterbart preparat av det rekombinante adenovirus som beskrevet heri. Begrepet "ablasjon" betyr en vesentlig reduksjon av populasjonen av levedyktige neoplastiske celler slik at de fysiologiske forstyrrelser som skyldes nærvær av de neoplastiske celler lettes. Begrepet "vesentlig" betyr en reduksjon i populasjonen av levedyktige neoplastiske celler i pattedyrsorganismen med mer en tilnærmet 20 % av populasjonen før behandlingen. Begrepet "levedyktig" betegner en celle med en neoplastisk celles egenskaper når det gjelder ukontrollert vekst og cellesyklusregulering. Begrepet "levedyktig neoplastisk celle" anvendes heri for å skille mellom slike celler og neoplastiske celler som ikke lenger er i stand til å replikeres. For eksempel kan en tumormasse forbli etter behandlingen, populasjonen av celler som utgjør tumormassen kan imidlertid være død. Disse døde celler har blitt fjernet og mangler evnen til å replikeres, selv om noe tumormasse kan forbli.
Begrepet "pattedyrsorganisme" omfatter, men er ikke begrenset til, mennesker, svin, hester, storfe, hunder og katter. Man anvender fortrinnsvis en adenoviral vektor som er endogen for pattedyrstypen som behandles. Selv om det generelt foretrekkes å anvende et virus fra arten som behandles, kan det i noen tilfelle være fordelaktig å anvende vektorer avledet fra andre arter som besitter fordelaktige patogene egenskaper. Det er for eksempel rapportert (WO 97/06826 publisert 10. april 1997) at adenovirale vektorer fra fjærfe kan anvendes i human genterapi for å minimalisere immunresponsen som er typisk for humane, adenovirale vektorer. Ved å minimalisere immunresponsen unngås hurtig systemisk fjerning av vektoren, noe som fører til økt varighet av vektorens virkning.
Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendbare for behandling av tumorer forbundet med tap av TGF-|3-antiproliferativ virkning, innbefattet, men ikke begrenset til, brystkarsinomer, hepatomer, tumorer i mage, kolon og hud, samt B- og T-lymfomer (Markowitz og Roberts, 1996) Mutasjoner i type II TGF-|3-reseptoren har blitt påvist i skvamøse karsinomer i colon, mage, hode og hals. Mutasjoner eller delesjoner i type I-reseptorene har også blitt påvist i Kaposis sarkom, brysttumorer, ovarietumorer og kolorektale tumorer. Blant de intracellulære effektorer av TGF-|3-signalisering ble Smad-genene Smad4/DPC4 identifisert som mulige tumorsuppressorgener som var endret i nesten 50 % av cancere i bukspyttkjertelen. Endringer i DPC4-genet har også blitt påvist i tumorer i colon, bryst og ovarier, om enn med mye lavere hyppighet. Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendbare for behandling av TGF-|3-insensitive tumorer, for eksempel cancer i bukspyttkjertelen.
Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendbare for behandling av tumorceller med defekter i p53-reaksjonsveien. Disse omfatter turmorer med endringer i p53, mdm2 og pl4/pl9ARF(INK4a-genet). Vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse er også anvendbare for behandling av cancerceller med defekter i Rb-reaksjonsveien. Defekter i Rb-reaksjonsveien følger av endringer i genene for Rb, syklin D, syklinavhengig kinase (for eksempel CDK4) og pl6 (INK4a-genet).
Selv om det beskrives en fremgangsmåte for anvendelse av de rekombinante adenovirus alene, kan de rekombinante adenovirus som beskrevet heri, og preparater av disse anvendes i kombinasjon med konvensjonelle kjemoterapeutiske midler eller behandlingsformer. Eksempler på slike kjemoterapeutiske midler omfatter inhibitorer av purinsyntesen (for eksempel pentostatin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, metotreksat) eller pyrimidinsyntesen (for eksempel Pala, azarbin) overføring av ribonukleotider til deoksy-ribonukleotider (for eksempel hydroksyurea), inhibitorer av dTMP-syntesen (5-fluoruracil), DNA-skadende midler (for eksempel stråling, blemyciner, etopsid, teniposid, dactinomycin, daunorubicin, doksorubicin, mitoksantron, alkylerende midler, mitomycin, cisplatin, procarbazin), så vel som inhibitorer av microtubulusfunksjonen (for eksempel vinca-alkaloider og colchicin). Kjemoterapeutiske behandlingsformer viser primært til ikke-kjemiske fremgangsmåter utformet for å fjerne neoplastiske celler, for eksempel stråle-behandling. Eksempler på kombinasjonsbehandling hvor det terapeutiske gen er p53 er beskrevet i Nielsen, et al. WO/9835554A2, publisert 20. august 1998.
Den immunologiske respons er av betydning ved gjentatt in v/vø-tilførsel av virale vektorer. Følgelig kan vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse tilføres sammen med immunsuppirmerende midler. Eksempler på immunsupprimerende midler omfatter syklosporin, azatioprin, metotreksat, syklofosfamid, lymfosytt-immunglobulin antistoffer mot CD3-komplekset, adenokortikosteroider, sulfasalzain, FK-506, metoksalen og thalidomid.
Det beskrives også en fremgangsmåte for ablasjon av neoplastiske celler ex vivo i en populasjon av normale celler kontaminert med de neoplastiske celler, ved tilførsel av et rekombinant adenovirus ifølge foreliggende oppfinnelse til populasjonen. Et eksempel på anvendelse av en slik fremgangsmåte benyttes i dag i ex v/vo-anvendelser, for eksempel rensing av autologe stamcelleprodukter, vanligvis betegnet beinmargsrensing. Begrepet "stamcelleprodukt" viser til en populasjon av hematopoetiske celler, forløperceller og stamceller som kan rekonstituere langvarig hematopoetisk funksjon hos en pasient som har blitt gitt myoablasjonsbehandling. Stamcelleprodukter erholdes konvensjonelt ved aferese av mobilisert eller ikke mobilisert perifert blod. Aferese oppnås konvensjonelt ved kjente fremgangsmåter som anvender kommersielt tilgjengelige afereseapparater, for eksempel COBE Spectra Apheresis System, kommersielt tilgjengelig fra COBE International, 1185 Oak Street, Lakewood, CO. Det foretrekkes at behandlingsbetingelsene optimaliseres slik at det oppnås en "3-log rensing" (det vil si fjerning av tilnærmet 99,9 % av tumorcellene fra stamcelleproduktet) og mest foretrukket en "5-log rensing" (fjerning av tilnærmet 99,999 % av tumorcellene fra stamcelleproduktet). I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen vil et stamcelleprodukt med volum 100 ml behandles ved et forhold mellom viruspartikkeltall og celler med kjerne på tilnærmet 2 x 10<11>av vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse, over et tidsrom på tilnærmet 4 timer ved 37 °C.
Diagnostiske anvendelser
I tillegg til de terapeutiske anvendelser beskrevet ovenfor er vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse også anvendbare for diagnostiske formål. For eksempel kan vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde et rapportørgen som uttrykkes ved virusinfeksjon eller -replikasjon. Begrepet "rapportørgen" viser til et gen hvis produkt kan gi et påvisbart signal, alene eller i kombinasjon med ytterligere elementer. Eksempler på rapportørgener omfatter |3-galaktosidasegenet, luciferasegenet, genet for grønt fluorescerende protein, nukleinsekvenser som koder for proteiner som kan påvises ved billed-dannelsessystemer, for eksempel røntgenstråler eller magnetfeltbilleddannelsessystemer (MRI). Slike vektorer ville være anvendbare for å påvise nærvær av en funksjonell reaksjonsvei (for eksempel p53- eller TGF-beta-reaksjonsveien). Alternativt kan slike vektorer også anvendes for ekspresjon av et celleoverflateprotein som kan gjenkjennes av et bindende molekyl, for eksempel et fluorescensmerket antistoff. Dersom den reaksjonsveiresponderende promoter anvendes for å styre ekspresjonen av en repressor av virus replikasjonen (for eksempel E2F-RB) kunne alternativt sende virale promotere (for eksempel E2, som skrus av av E2F-RB, eller enhver annen promoter med repressorbindingsseter, for eksempel E2F-bindingsseter) anvendes for å styre ekspresjonen av rapportørgenet for diagnostiske anvendelser hvor den reaksjonsveiresponderende promoter er avskrudd. Disse diagnostiske konstruksjoner kan anvendes for diagnostiske formål in vivo eller in vitro. Eksempler på in v/vo-anvendelse omfatter anvendelser med billed-dannelse, for eksempel røntgenstråling, CT-scanning eller magnetisk resonansbilled-dannelse (MRI).
Fremgangsmåter for fremstilling av vektorene
Det beskrives videre en fremgangsmåte for fremstilling av de rekombinante virus beskrevet ovenfor som omfatter følgende trinn: a. infeksjon av en produsentcelle med et rekombinant virus b. dyrking av den infiserte produsentcelle under betingelser som tillater
replikasjon av virusgenomet i produsentcellen,
c. høsting av produsentcellene, og
d. rensing av det rekombinante virus.
Begrepet "infeksjon" betyr å sette det rekombinante virus i forbindelse med produsentcellen under betingelser som letter infeksjon av produsentcellen med det rekombinante adenovirus. I celler som har blitt infisert av flere kopier av et gitt virus er aktivitetene som er nødvendige for virusreplikasjon og pakking av viruspartikler kooperative. Det foretrekkes således at betingelsene justeres slik at det er en signifikant sannsynlighet for at produsentcellene infiseres av flere virus. Et eksempel på betingelser som fremmer produksjon av virus i produsentcellene er forhøyet viruskonsentrasjon i infeksjonsfasen. Det er imidlertid mulig at det totale antall virusinfeksjoner pr produsentcelle kan overdrives, noe som fører til toksiske virkninger på cellen. Følgelig bør man prøve å infisere med en viruskonsentrasjon i området fira lx IO<6>til lx IO<10>, fortrinnsvis tilnærmet lx IO<9>, viruspartikler pr ml. Kjemiske midler kan også anvendes for å øke infektiviteten av produsentcellelinjen. For eksempel tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å øke produsentcellelinjenes infektivitet for virusinfeksjon ved å innbefatte en calpaininhibitor. Eksempler på calpaininhibitorer som er anvendbare ved utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter calpaininhibitor 1 (også betegnet N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal, kommersielt tilgjengelig fra Boehinger Mannheim). Calpaininhibitor 1 har blitt observert å øke infektiviteten av produsentcellelinjer overfor rekombinant adenovirus.
Begrepet "produsentcelle" betyr en celle som kan fremme replikasjonen av virusgenomet til det rekombinante adenovirus som skal produseres. En rekke pattedyrscellelinjer er allment tilgjengelige for dyrking av rekombinante adenovirus. For eksempel har 293-cellelinjen (Graham og Smiley (1977) J. Gen. Virol. 36:59-72) blitt modifisert slik at den komplementerer manglene i El-funksjonen, og dette er en foretrukket cellelinje for fremstilling av de foreliggende vektorer. Eksempler på andre produsentceller omfatter HeLa-celler og PERC.-celler (som beskrevet i patentskrift WO/97/00326, søknadsnummer PCT/NL96/00244).
Begrepet "dyrking under betingelser som tillater replikasjon av virusgenomet" betyr å opprettholde betingelsene for den infiserte produsentcelle slik at viruset tillates å oppformeres i produsentcellen. Det er ønskelig å kontrollere betingelsene slik at antall viruspartikler produsert av hver celle maksimaliseres. Følgelig vil det vær nødvendig å følge og kontrollere reaksjonsbetingelser som temperatur, oppløst oksygen, pH og så videre. Kommersielt tilgjengelige bioreaktorer som CelliGen Plus Bioreactor (kommersielt tilgjengelig fra New Brunswick Scientific, Inc. 44 Talmadge Road Edison, NJ) er utstyrt slik at slike parametere kan følges og opprettholdes. Optimalisering av betingelsene for infeksjon og dyrking vil i en viss grad variere, imidlertid kan betingelser for effektiv replikasjon og produksjon av virus oppnås av fagfolk ved at de tar i betraktning produsent-cellelinjens kjente egenskapet, virusets egenskaper, hvilken bioreaktor som anvendes og så videre. Dersom 293-celler anvendes som produsentcellelinje opprettholdes fortrinnsvis oksygenkonsentrasjonen mellom fra tilnærmet 50 % til tilnærmet 120 % oppløst oksygen, fortrinnsvis 100 % oppløst oksygen. Når konsentrasjonen av viruspartikler (bestemt ved konvensjonelle fremgangsmåter, for eksempel HPLC ved anvendelse av en Rosource Q-kolonne) begynner å flate ut høstes reaktoren.
Begrepet "høste" betyr oppsamling av cellene som inneholder rekombinante adenovirus fra mediet. Dette kan oppnås ved konvensjonelle fremgangsmåter, for eksempel differensiell sentrifugering eller kromatografiske midler. På dette stadium kan de høstede celler lagres eller viderebehandles ved lysering og rensing for isolering av det rekombinante virus. For lagring bør de høstede celler bufres ved, eller tilnærmet ved, fysiologisk pH og nedfryses ved -70 °C.
Begrepet "lysering" viser til oppbrytning av produsentcellene. Lysering kan oppnås ved en rekke midler som er velkjente innen faget. Dersom det er ønskelig å isolere virus-partiklene fira produsentcellene, lyseres cellene ved anvendelse av en rekke midler som er velkjente innen faget. For eksempel kan pattedyrsceller lyseres under lavt trykk (ved en trykkforskjell på 690-1 380 kpa) eller ved konvensjonelle fryse - tine-firemgangsmåter. eksogent, fritt DNA-RNA fjernes ved degradering med DNAse/RNAse.
Begrepet "rensing" betyr isolering av en i det vesentlige ren populasjon av rekombinante viruspartikler fra de lyserte produsentceller. Konvensjonelle rensings-teknikker som kromatografiske fremgangsmåter eller differensiell tetthetsgradient-sentrifugering kan anvendes. I den foretrukne utførelse av oppfinnelsen renses viruset ved kolonnekromatografi, i det vesentlige i samsvar med fremgangsmåten til Huyghe et al.
(1995) Human Gene Therapy 6: 1403-1416 som beskrevet i den ennå ikke ferdigbehandlede U.S. patentsøknad nr 08/400 793 innlevert 7. mars 1995. Ytterligere fremgangsmåter og metoder for optimalisering av produksjonen av de rekombinante adenovirus ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives i den ennå ikke ferdigbehandlede U.S. patentsøknad nr 09/073 076, innlevert 4. mai 1998 med tittelen Viral Production Process.
Eksempler
De påfølgende eksempler gir metodologi og resultater fra eksperimenter som viser konstruksjon av bestemte rekombinante adenovirale vektorer og plasmidvektorer. I de påfølgende eksempler betyr "g" gram, "ml" milliliter, "°C" grader Celsius, "min" minutter, "FBS" fetalt bovint serum og "PN" viser til antall rekombinante viruspartikler.
Eksempel 1. Plasmidkonstruksioner
p8001uc, et plasmid som koder for luciferase under kontroll av en PAI-promoter på 800 bp ble erholdt fra Dr. David Luskutoff (Scripps Institute. LaJolla, California). Plasmid pCTMIE-E2F-RB, som inneholder en CMV-promoter fulgt av en tredelt ledersekvens fra adenovirus-5 og SV40-enhancer oppstrøms for den kodende sekvens for E2F-RB-fusjons-protein ble erholdt fra Doug Antelman (Canji).
Eksempel 2. Konstruksjon av luciferaseplasmidet med TGF-| 3- responderende promotere
A. PAI- luciferaseplasmid:
Sekvensene til alle fragmenter er vist i 5-3' retning. Et fragment på 749 bp med et Sacl-sete i 5' ende og et Xhol-sete i den 3' ende og en TATA-boks fra SV40 i stedet for den native TATA-boks i promoteren ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av p8001uc som templat og primerene AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA og GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (som inneholder TATA-boksen fra SV40). Det resulterende PCR-produkt ble kuttet med SacI og Xhol og ligert til et fragment erholdt ved å kutte PGL3-Basic en luciferasekonstruksjon uten promoter (Promega) for erholdelse av PAI-luciferase.
B. SRE- luciferaseplasmid:
Oligonukleotidene GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG
AGC TCG AGG ATC og GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC
TCA TAA ATA CC ble hybridisert sammen. Hybridiseringsproduktet ble kuttet med Xhol og ligert til PGL3-Basic kuttet med Mlul, gjort buttendet med Klenow og kuttet med Xhol for erholdelse av pSVT-luc (en luciferasekonstruksjon med TATA-boks fra SV40). De Smad4/DPC4-bindingssetholdige oligonukleotidene CGT CTA GAC GCT TAG ACG TCT
AGA CGT CTA GAC TGT AC og AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT
CTA GAC GGT AC ble hybridisert sammen og ligert til pSVT-luciferase kuttet med Kpnl for erholdelse av plasmid SRE-luciferase.
Eksempel 3. Konstruksjon av luciferaseplasmider med p53- responderende promotere
A. RGC- luciferaseplasmid:
To komplimentære, 5'-fosforylerte oligonukleotider som inneholdt p53-bindingsseter fra den ribosomale genansamling, AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA
GGC AAC TCG TGG TAC og CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG
CCT TTT CTG TAC, ble hybridisert sammen. Det dobbelttrådede fragment ble ligert til pSVT-lucifease kuttet med Kpnl for erholdelse av RGC-lucieraseplasmid.
B. p53CON- luciferaseplasmid:
To komplimentære, 5'-fosforylert oligonukleotider som inneholdt konsensusseter for p53-binding (p53CON), CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG
GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC og AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC
CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC, ble hybridisert sammen. Det dobbelttådede fragment ble ligert til pSVT-luciferase kuttet med Kpnl for erholdelse av p53CON-luciferaseplasmid.
C. PAI- E2F- RB- plasmid:
Sekvensen som inneholdt CMV-promoteren fulgt av den tredelte ledersekvens fra adenovirus 5 og en SV40-enhancer oppstrøms for den kodende sekvens for E2F-RB-fusjonsprotein i plasmid pCTMIE-E2F-RB ble utkuttet ved kutting med Bgll og Xbal, og det resulterende fragment ble ligert for erholdelse av det promoterløse E2F-RB-plasmid. Et fragment som inneholdt modifisert PAI-promoter ble utkuttet fra plasmid PAI-luciferase ved kutting med SacI og Xhol og ble gjort buttendet ved behandling med Klenow. Dette fragment ble ligert til det promoterløse E2F-RB-plasmid som var kuttet med EcoRI og behandlet med Klenow-fragmentet av DNA poymerase I for erholdelse av PAIE2F-RB-plasmid.
Eksempel 4. Dannelse av rekombinante adenovirus
Et overføringsplasmid som inneholdt Ad5-sekvens med en delesjon på 3 kb i E3-området, pNEBÆ3-ble konstruert ved å klone et SnaBI-fragment på 7,4 kb fra pBHGl 1 (26676 til 34140) til pNEB193 (plasmid a NEB) behandlet med BamHI, AccI og Klenow. Et flerkloningssete ble innført i plasmidet ovenfor ved å hybridisere de 5'-fosforylerte oligonukleotidene AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG
GAT CCT TAA T og TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT
ACG TAT TTA T og innføre det dobbelttrådete fragment i Pacl-kuttet pNEBAE3 ved legering for erholdelse av plasmid pNEBÆ3.
Overføringsplasmid for dannelse av et rekombinant adenovirus som kodet for E2F-RB under kontroll av PAI-promoteren og forbedret, grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av CMV-promoteren ble konstruert som følger. En midlertidig vektor, pABS.4-E2F-RB ble fremstilt ved å ligere et fragment som inneholdt PAI-promoteren og den kodende sekvens for E2F-RB, fremstilt ved å kutte PAI-E2F-RB med NacI og Xbal til et fragment fra pABS.4 (Microbix) fremstilt ved kutting med Kpnl, behandling med Klenow og kutting på ny med Xbal. Et fragment som inneholdt PAI-promoteren, den kodende sekvens for E2F-RB og Kanamycin-genet ble utkuttet fra plasmid PABS.4-E2F-RB ved kutting med PacI, behandlet med Klenow og ligert til plasmidfragmentet erholdt ved å kutte plasmid pNEBÆ3 med PacI og behandle med Klenow for erholdelse av plasmid pNEBÆ3-PAI-E2F-RB uten Pacl-setet. Kanamycingenet i dette plasmid ble erstattet med CMV-promoteren, operativt koblet til genet for grønt fluorescerende protein (GFP), ved å kutte pNEBÆ3-PAI-E2F-RB med Swal og ligere dette til et fragment isolert fira pEGFP-N (Clontech) ved kutting med Aflll og Sspl og behandling med Klenow for erholdelse av plasmid pAE3-PAI-E2F-RB-GFP.
Overføringsplasmider for dannelse av rekombinante adenovirus som koder for E2F-RB under kontroll av en TGF-(3-responderende promoter med SRE og forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av CMV-promoteren ble konstruert som følger. Kodende sekvens for E2F-RB ble innført i plasmid pNEBÆ3(MCS) for erholdelse av plasmid pNEBÆ3-E2F-RB ved å ligere et fragment isolert ved kutting av pNEBÆ3 (MCS) med Xbal og Nrul til et fragment dannet ved å kutte pCTMIE-E2F-RB med Xbal og Nae I. En TGF-(3-responderende promoter som inneholdt SRE ble innført i plasmidet ovenfor ved å amplifisere denne sekvens ved PCR ved anvendelse av SRE-luciferase som templat og de fosforylerte primerene GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT og GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CACT. Det resulterende PCR-produkt ble kuttet med Spel og ligert til SnaBI-og Xbal-kuttet pNEBÆ3-E2F-RB for erholdelse av pÆ3-DPC-E2F-RB.
Overføringsplasmider for dannelse av rekombinante adenovirus som koder for E2F-RB under kontroll av p53-responderende promotere og forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av CMV-promoteren ble konstruert som følger. En p53-responderende promoter som inneholdt p53-bindingsseter fra den ribosomale genansamling eller p53-konsensussetet (p53CON) ble innført i plasmid pNEBAE3-E2F-RB ved å amplifisere promotersekvensen ved PCR med RGC-luciferase eller p53CON-luciferase som templat og de fosforylerte primere GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C og GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CACT. De resulterende PCR-produkter ble kuttet med Xbal og ligert til SnaBI- og Xbal-kuttet pNEBÆ3-E2F-RB for erholdelse av pAE3-RGC-E2F-RB og pAE3-PCON-E2F-RB.
Eksempel 5. Homolog rekombinasion for dannelse av rekombinante adenovirus
De rekombinante adenovirus PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad og CON-Ad ble dannet ved å utføre homolog rekombinasjon i bakterier som beskrevet (Chartier et al (1996) J. Virol. 70:4805-4810). Overføringsplasmidene ble kuttet med Ascl for erholdelse av fragmentene som inneholdt E2F-RB under kontroll av en reaksjonsveiresponderende promoter og GFP under kontroll av CMV-promoteren, flankert av Ad5-sekvenser. Det resulterende fragment ble transformert inn i bakteriestamme BJ 5183 sammen med et fragment erholdt ved å kutte PTG4609 (tilgjengelig fra Transgene, Inc. og beskrevet i Chartier et al (1996) J. Virol. 70:4805-4810) med BstBi og Spel. De resulterende bakteriekolonier ble analysert for nærvær av de ønskede rekombinante, infektsiøse Ad5-plasmidene pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad og pCON-GFP-Ad. Disse infektiøse plasmider ble så linearisert ved kutting med PacI og renset ved fenol-kloroform-ekstraksjon og etanolutfelling, og anvendt for transfeksjon av 293-celler.
Transfeksjonen ble utført med Superfect (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. 2,5 ug lineariserte plasmider ble anvendt for transfeksjon av 250 000 celler dyrket i 6-brønners plater med 12 |xl Superfect/brønn. Etter 8 dager kunne cytopatiske virkninger grunnet virusproduksjon observeres. Cellene ble høstet sammen med dyrkningssupernatanten og behandlet med 3 runder fryse - tine-sykluser. Rekombinante virus i de resulterende lysater ble amplifisert ved reinfeksjon av 293-celler.
Eksempel 6. Cellelinjer
Alle cellelinjer som ble anvendt i denne undersøkelse ble erholdt fira ATCC (Rockville. MD) og dyrket som encellelagskulturer ved 37 °C i en C02-inkubator. 293, Hep3B, MRC9, A549, Panel, U87, Caco2, MCF-7 og WIDR ble dyrket Dulbeccos modifiserte Eagles medium tilsatt 10 % fetalt bovint serum. MDA-MB 468-cellene ble dyrket i Hams medium tilsatt 10 % fetalt bovint serum, mens MiaPaca-2-cellene ble dyrket i DMEM tilsatt 10 % fetalt bovint serum og 2.5 % hesteserum.
Eksempel 7. Transfeksjon
Cellene ble utsådd, enten i 6-brønners plater (250 000 celler/brønn) eller i 24-brønners plater (62 500 celler/brønn), og inkubert over natten for festing til underlaget. Transfeksjonene ble så utført ved anvendelse av kalsiumfosfat for 293-celler som beskrevet, og med Superfect (Quiagen) for andre celler ifølge produsentens instruksjoner.
Eksempel 8. Rapportør/ luciferaseanalyser
Cellene ble transfektert med 1,5 ug rapportørplasmid og 1,0 ug av inhibitorene. 48 timer etter transfeksjonen ble lysater fremstilt ved å tilsette IX rapportørlysisbuffer (Promega) og ved å inkubere i denne ved romtemperatur i 10 minutter. Luciferase-aktiviteten ble bestemt ved anvendelse av Top Count (Packard) og et analysesett fra Packard ifølge instruksjonene fra Packard.
Eksempel 9. Analyser for måling av virusformidlet cytopatisk virkning
Cellene ble infisert med de angitte rekombinante eller villtype adenovirus og farget med 0,5 % krystallfiolett løst i 20 % etanol 6 dager etter infeksjonen, i det vesentlige i samsvar med fremgangsmåten beskrevet i Bischoff, et al. (1996) Science 274:373-376.
Eksempel 10. Konstruksjon av virusene cU3EE og cTILT
MLP-promotersekvensen ble amplifisert ved PCR med primerene GAT CCG ATC
GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC og GAT CTT AAT TAA ATG GCA
GTG ACC CGG AAG og Ad5-DNA, for eksempel som det foreligger i plasmid pFG140 (Microbix), som templat. MLP-PCR- produktet ble så klonet i Pacl-setet i plasmid pAE3-PCON-E2F-RB for erholdelse av pAE3-PCON-E2F-RB-MLP. Kodende sekvens for adenovirus E3 10,5K-protein ble amplifisert ved PCR med primerene GCG ACC CAC CCT AAC AGA og GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A, og det resulterende PCR-produkt ble klonet i Xhol-setet i plasmid pCDNA3,l (Invitrogen) for erholdelse av plasmid pCDNA3-10,5. Kodende sekvens for E3 10,5K-protein fra adenovirus ble så utkuttet fra pCDNA3-10,5 ved kutting med Dralll Xbal, fulgt med Klenow, og ble ligert til PacI- og Klenow-behandlet pAE3-PCON-E2F-RB-MLP for erholdelse av plasmid pAE3-PCON-E2F-RB-MLP-10,5K.
De rekombinante adenovirus cU3EE og cTILT ble dannet ved å utføre homolog rekombinasjon i bakterier som beskrevet (Chartier et al, 1996, J. Virol, 70:4805-4810). Overføringsplasmidet ble kuttet med Ascl for erholdelse av fragmentene som inneholdet E2F-RB under kontroll av p53CON-sekvensen og E310,5K under kontroll av MLP-promoteren, flankert av Ad5-sekvenser. Det resulterende fragment ble transformert inn i bakteriestammen BJ 5283 sammen med et fragment erholdt ved å kutte PTG4609 (Transgene) med BstBI og Spl. De resulterende bakteriekolonier ble analysert for nærvær av det ønskede rekombinante, infektiøse Ad5-plasmid pCEMD. Det infektiøse Ad5-plasmid p01/CEMD ble erholdt ved å følge en lignende fremgangsmåte, men ved å anvende et derivat av PTG4609 (Transgene) i hvilket villtype-ElA-sekvensen var erstattet med en sekvens som inneholdt EIA med 01-mutasjon. Disse infektiøse plasmider ble så linearisert ved kutting med PacI, renset ved ekstraksjon med fenol-kloroform og etanolutfelling, og anvendt for transfeksjon av 293-celler.
Transfeksjon av plasmidene pCEMD og p01/CEMD ble utført for dannelse av de rekombinante virus cU3EE og cTILT ved anvendelse av Superfect (Quiagen) ifølge produsentens instruksjoner. 2,5 \ xg lieariserte plasmider ble anvendt for transfeksjon av 500 000 celler dyrket i 6-brønners plater med \ 2\ x\ Superfect/brønn. Etter 8 dager kunne cytopatiske virkninger grunnet virusproduksjon observeres. Cellene ble høstet sammen med dyrkningssupernatanten og behandlet med tre runder med fryse - tine sykluser. Rekombinante virus i de resulterende lysater ble amplifisert ved reinfeksjon av 293-celler.

Claims (19)

1. Selektivt replikerende, rekombinant virusvektor, karakterisert vedat den omfatter en reaksjonsveiresponderende promoter operativt koblet til en virusreplikasjonsrepressor, hvori vektoren selektivt replikeres i neoplastiske celler som har en mangel i reaksjonsveien til hvilken promoteren er responderende.
2. Vektor ifølge krav 1, karakterisert vedat de neoplastiske cellene er tumorceller.
3. Vektor ifølge krav 1 -2, karakterisert vedat den reaksjonsveiresponderende promoter er utvalgt fra gruppen som består av en p53-reaksjonsveiresponderende promoter, en Rb-reaksjonsveiresponderende promoter og en TGF-|3-reaksjonsveiresponderende promoter.
4. Vektor ifølge krav 3, karakterisert vedat viruset er avledet fra slekten adenoviridiae.
5. Vektor ifølge krav 4, karakterisert vedat virusreplikasjonsrepressoren er E2F-RB.
6. Vektor ifølge krav 1-2, karakterisert vedat den videre omfatter en transgenekspresjonskassett.
7. Vektor ifølge krav 6, karakterisert vedat transgenekspresjonskassetten omfatter et proapoptotisk gen operativt koblet til en promoter.
8. Vektor ifølge krav 7, karakterisert vedat det pro-apoptopiske gen er Ad5 E3-10.5K.
9. Vektor ifølge krav 8. karakterisert vedat den reaksjonsveiresponderende promoter er en p53-reaksjonsveiresponderende promoter.
10. Vektor ifølge krav 9, karakterisert vedat den p53-reaksjonsveiresponderende promoter er p53CON som har sekvensen CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC og AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC.
11. Vektor ifølge krav 10, karakterisert vedat promoterdelen av den transgene ekspresjonskassetten er en temporal promoter.
12. Vektor ifølge krav 11, karakterisert vedat den temporale promoter er sen hovedpromoter (MLP).
13. Vektor ifølge krav 12, karakterisert vedat den videre omfatter en delesjon i det adenovirale El a-kodende område slik at binding p300 elimineres.
14. Vektor ifølge krav 13, karakterisert vedat delesjonen i adenovirale Ela-kodende område omfatter en delesjon av aminosyrene 4-25 i Ela 289R-proteinet.
15. Farmasøytisk formulering, karakterisert vedat den omfatter en selektivt replikerende rekombinant vektor som aktiv bestanddel, ifølge et hvert av kravene 1-14, forbundet med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere.
16. Fremgangsmåte for dreping av en celle med en reaksjonsveimangel,karakterisert vedat cellen ex vivo bringes i kontakt med en selektivt replikerende rekombinant virus ifølge et hvert av kravene 1-14.
17. Anvendelse av en selektivt replikerende viral vektor ifølge et hvert av kravene 1-14, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å drepe en celle med en reaksjonsveimangel.
18. Anvendelse ifølge krav 17, hvori det farmasøytiske preparat anvendes for behandling av cancer.
19. Fremgangsmåte for fremstilling av en selektivt replikerende viral vektor ifølge et hvert av kravene 1-14, hvori nevnte fremgangsmåte omfatter infisering av en populasjon av produsentceller med en prøve av nevnte vektor, dyrkning av nevnte produsentcellelinje under betingelser som tillater replikering av nevnte vektor i nevnte produsentceller og isolering av vektoren fra produsentcellene.
NO20011843A 1998-10-15 2001-04-10 Selektivt replikerende, rekombinant virusvektor, farmasoytisk formulering, fremgangsmate for dreping av en celle ex vivo med en reaksjonsveimangel, anvendelse av en selektivt replikerende viral vektor for fremstilling av et farmasoytisk preparat, samt fremgangsmate for fremstilling av en selektivt replikerende viral vektor. NO330666B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17268698A 1998-10-15 1998-10-15
PCT/US1999/021452 WO2000022137A2 (en) 1998-10-15 1999-10-14 Selectively replicating viral vectors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20011843D0 NO20011843D0 (no) 2001-04-10
NO20011843L NO20011843L (no) 2001-06-14
NO330666B1 true NO330666B1 (no) 2011-06-06

Family

ID=22628758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20011843A NO330666B1 (no) 1998-10-15 2001-04-10 Selektivt replikerende, rekombinant virusvektor, farmasoytisk formulering, fremgangsmate for dreping av en celle ex vivo med en reaksjonsveimangel, anvendelse av en selektivt replikerende viral vektor for fremstilling av et farmasoytisk preparat, samt fremgangsmate for fremstilling av en selektivt replikerende viral vektor.

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP1121441B1 (no)
JP (2) JP4404490B2 (no)
KR (1) KR100841815B1 (no)
CN (2) CN1325647C (no)
AR (1) AR020897A1 (no)
AT (1) ATE348169T1 (no)
AU (1) AU758354B2 (no)
BR (1) BR9914527A (no)
CA (1) CA2345900A1 (no)
CZ (1) CZ301506B6 (no)
DE (1) DE69934421T2 (no)
ES (1) ES2279636T3 (no)
HK (1) HK1040529B (no)
HU (1) HU226602B1 (no)
IL (2) IL142337A0 (no)
NO (1) NO330666B1 (no)
NZ (2) NZ510805A (no)
PL (1) PL347898A1 (no)
SK (1) SK4412001A3 (no)
TW (1) TWI262948B (no)
WO (1) WO2000022137A2 (no)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ301506B6 (cs) * 1998-10-15 2010-03-31 Canji, Inc. Selektivne se replikující rekombinantní virový vektor a zpusob jeho prípravy, farmaceutická formulace, zpusob usmrcení bunky s defektní dráhou, transformovaná bunka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß
KR100492017B1 (ko) * 2002-06-24 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 인간 간엽줄기 세포를 이용한 항암치료방법
GB0416487D0 (en) 2004-07-23 2004-08-25 Isis Innovation Modified virus
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
CN107267554A (zh) * 2012-03-14 2017-10-20 萨克生物研究学院 腺病毒肿瘤诊断法
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
CA2908198A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2017035232A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
KR102471633B1 (ko) 2016-02-23 2022-11-25 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 바이러스 동역학에 미치는 영향 최소화를 위한 치료용 아데노바이러스의 외인성 유전자 발현
EP3390428B1 (en) 2016-02-23 2019-09-25 Salk Institute for Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
AU2017375633C1 (en) 2016-12-12 2023-04-27 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
CN110892064A (zh) * 2017-07-25 2020-03-17 牛津遗传学有限公司 腺病毒载体
EP3954766A1 (en) * 2017-10-10 2022-02-16 NantBio, Inc. Modified ec7 cells having low toxicity to viral production payloads

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69426841T2 (de) * 1993-02-16 2001-09-06 Onyx Pharma Inc Cytopatische Viren zur Therapie und Prophylaxe der Neoplasie
AU4592697A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Dana-Farber Cancer Institute Method of targeting malignant cells using an e2f responsive promoter
CA2271478C (en) * 1996-11-15 2003-02-04 Canji, Inc. Tissue specific expression of retinoblastoma protein
AU744725B2 (en) * 1997-03-03 2002-02-28 Cold Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing heterologous transcription regulatory elements and methods of using same
CZ301506B6 (cs) * 1998-10-15 2010-03-31 Canji, Inc. Selektivne se replikující rekombinantní virový vektor a zpusob jeho prípravy, farmaceutická formulace, zpusob usmrcení bunky s defektní dráhou, transformovaná bunka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß

Also Published As

Publication number Publication date
JP2002541761A (ja) 2002-12-10
HUP0104107A3 (en) 2003-09-29
IL142337A (en) 2009-05-04
DE69934421D1 (de) 2007-01-25
AU758354B2 (en) 2003-03-20
HK1040529A1 (en) 2002-06-14
CN101092636A (zh) 2007-12-26
HUP0104107A2 (hu) 2002-03-28
NO20011843L (no) 2001-06-14
KR100841815B1 (ko) 2008-06-26
CZ20011129A3 (cs) 2002-01-16
DE69934421T2 (de) 2007-10-11
HU226602B1 (en) 2009-04-28
BR9914527A (pt) 2001-06-26
HK1040529B (zh) 2007-02-09
IL142337A0 (en) 2002-03-10
WO2000022137A3 (en) 2000-08-03
SK4412001A3 (en) 2001-12-03
NZ528283A (en) 2005-05-27
WO2000022137A2 (en) 2000-04-20
ES2279636T3 (es) 2007-08-16
AR020897A1 (es) 2002-06-05
JP2009254385A (ja) 2009-11-05
CN1325647C (zh) 2007-07-11
PL347898A1 (en) 2002-04-22
ATE348169T1 (de) 2007-01-15
EP1121441B1 (en) 2006-12-13
CA2345900A1 (en) 2000-04-20
CN101092636B (zh) 2012-08-08
NO20011843D0 (no) 2001-04-10
JP4404490B2 (ja) 2010-01-27
KR20020013472A (ko) 2002-02-20
CZ301506B6 (cs) 2010-03-31
TWI262948B (en) 2006-10-01
EP1121441A2 (en) 2001-08-08
NZ510805A (en) 2003-12-19
CN1330715A (zh) 2002-01-09
AU6391599A (en) 2000-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8133481B2 (en) Selectively replicating viral vectors
JP4334174B2 (ja) 腫瘍崩壊性アデノウイルス
JP2009254385A (ja) 選択的に複製するウイルスベクター
US20040161848A1 (en) Adenoviral vector and related system and methods of making and use
KR20120139672A (ko) 원숭이 아데노바이러스 벡터의 증식 방법
JP4955397B2 (ja) 腫瘍崩壊性のアデノウイルス
CA2351587A1 (en) Viral vectors with late transgene expression
AU3656399A (en) Adenoviral vectors for treating disease
WO2001002540A9 (en) Adenoviral vectors for treating disease
JP2002527455A (ja) 組換え欠失アデノウイルスベクター
MXPA01003840A (en) Selectively replicating viral vectors
MXPA01004989A (en) Viral vectors with late transgene expression

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees