JP4404490B2 - 選択的に複製するウイルスベクター - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
組換えアデノウイルスは、種々の治療レジメンにおいて治療トランスジーンの送達のために近年用いられている。しかし、これらのベクター系の広範な範囲の感染性は、非腫瘍細胞におけるこのウイルスの発現が、非腫瘍細胞に対して付帯的な損傷を引き起こし得るという懸念を生じている。その結果、広範な範囲の標的化系が、所定の細胞型においてトランスジーンを優先的に発現するために開発されている。組織特異的プロモーターおよび腫瘍特異的プロモーターは、特定の細胞型においてベクターを優先的に複製するために用いられている。例えば、１９９７年１月１６日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０８３８号（国際公開第ＷＯ９７／０１３５８号）は、必要に応じて細胞傷害性トランスジーン発現カセットを含む、Ｅ１、Ｅ２またはＥ４の機能を駆動する前立腺特異的プロモーターエレメントの使用による、特定の宿主細胞において複製するベクターの使用を記載する。詳細には、この公報は、前立腺特異的エンハンサーが、Ｅ１の発現を制御し、そしてＥ３領域に挿入されたシトシンデアミナーゼ遺伝子の発現を駆動するＣＭＶプロモーターを含む発現カセットを有する、構築物を記載する。これらのベクターは、複製能力があり、そして特定の細胞型においてインタクトなビリオンへとパッケージングされ得る。
【０００２】
ウイルス複製を駆動するための腫瘍特異的プロモーターの使用に対する代替的なアプローチは、アデノウイルスＥ１ｂ ５５Ｋタンパク質コード配列における特定の欠失を用いることである。Ｅ１ｂ ５５Ｋをコードするヌクレオチド配列に欠損を含む組換えアデノウイルスは、１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７８号に記載される。しかし、これらの組織特異的または腫瘍特異的な制御エレメントは、「漏れる」、すなわち、好ましい標的細胞以外の細胞型における複製を可能にすることが観察されている。
【０００３】
選択的に複製するこの型のベクターの代替法は、Ｅ１機能の甚だしい除去を含む、複製欠損アデノウイルスベクターの使用である。詳細には、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３の除去および部分的Ｅ４欠失を含むベクターが、外因性トランスジーンを送達するために用いられている。このようなベクターは、ｐ５３遺伝子を標的細胞に送達するために用いられている。ｐ５３欠損（ｐ５３変異またはｐ５３ヌル）腫瘍細胞における外因性に投与された野生型ｐ５３の発現は、その腫瘍細胞におけるｐ５３媒介アポトーシスを誘導し得ることが実証されている。ｐ５３の送達のためのこのようなウイルスベクターは、目下、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＩｎｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで開発中である。また、これらのベクターは、ヒトでの治療適用に関して受容可能な毒物学プロフィールおよび治療効力が実証された。そしてこれらのベクターは、ｐ５３関連悪性疾患の処置に関してヒトにおいて第ＩＩ相臨床試験中である。
【０００４】
複製欠損ベクターおよび選択的に複製するベクターは、少なくとも理論的には、臨床医に懸念される設計的欠点を有する。複製欠損ベクターは、患者において制御できずに増殖することがないので、これらは理論的に、より魅力的な安全プロフィールを有する。しかし、有効な腫瘍除去は、かなり大多数の腫瘍細胞が感染されることを必要とするので、治療有効性を確実にするために、実質的なモル過剰のベクターが通常用いられる。選択的に複製するベクターは、患者において複製し、そして潜在的に変異して十分に複製能力のあるベクターを形成する能力によって、安全性の観点からより問題であると考えられる。しかし、このウイルスが特定の条件下で増殖する天然の能力を維持することにより、これらのベクターが周囲の腫瘍細胞に伝播することが可能になる。ベクター自体が複製し得るので、より低い初回用量のこのようなベクターが必要とされる。これは、免疫学的観点ならびにこのような薬剤の製造における経済的理由から好ましい。それゆえ、当該分野には、認識された安全性問題と取り組みつつ、一方では増加した治療指数を提供する、選択的に複製するベクターについての必要性がある。
【０００５】
本発明は、ベクターが、経路が欠損した細胞において優先的に複製するように、ウイルス複製のリプレッサーの発現を駆動する経路標的化経路応答性プロモーターを含む、選択的に複製するアデノウイルスベクターを提供することにより、これらの問題を解決する。本発明はまた、このようなベクターを含む薬学的処方物を提供する。本発明はまた、このようなベクターを用いることにより、経路欠損細胞を正常細胞の集団から除去する方法を提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、感染細胞の表現型または遺伝子型に基づいて宿主細胞におけるウイルス複製を実質的に阻害する、ウイルス複製のインヒビターの発現を駆動する、経路応答性プロモーターの使用を介して、標的細胞の細胞内条件に応答してウイルスゲノムを選択的に複製する、組換えウイルスを提供する。標的細胞では、この経路応答性プロモーターのプロモーターエレメントは不活性であり、従って、このウイルスは複製が可能である。この結果、（１）このウイルスの天然の溶菌性により細胞が殺傷される、および／または（２）治療用量のトランスジーン産物（複製不能ベクターと比較して増幅される）を標的細胞に提供する、および（３）組換えウイルスによる周囲の標的細胞の感染を容易にする、局所的ウイルス濃縮を生じる。本発明はさらに、このベクターの使用による治療方法および診断方法、このベクターを含む薬学的処方物、このベクターの作製方法およびこのベクターを含む形質転換細胞を提供する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ウイルス複製のリプレッサーに作動可能に連結された経路応答性プロモーターを含む、選択的に複製する組換えウイルスを提供する。
【０００８】
用語「選択的に複製する」とは、１つの表現型状態において別の表現型状態に対して優先的に細胞において複製し得るベクターをいう。異なる表現型状態の例としては、所定の細胞型の正常な細胞に対するｐ５３経路欠損細胞が挙げられる。優先的な複製を示すウイルスは、このウイルスが、所定の投薬レベルにて、標的細胞型において同じ型の正常な（コントロールの）細胞型に対して少なくとも５倍効率的に複製することを示す。ウイルスが本当に選択的であるか否かを決定するために、多数の因子に関して、同じ細胞型の正常細胞と比較した、このウイルスが標的細胞において複製する能力を評価することが必要である。
【０００９】
所定のベクターが、標的化されるべき条件を含む標的細胞において複製する能力を、この条件を保有しない同じ型の正常細胞において複製する能力と比較することが好ましい。例えば、ウイルスの感染後の第１工程は、細胞を細胞周期に入るように誘導することである。なぜなら、最大ウイルス複製効率について必須の因子はＳ期にのみ存在するからである。しかし、腫瘍細胞における選択性に関してベクターの選択的を評価しようとする場合、既に細胞周期に入っている別の細胞（例えば、不死化細胞株または形質転換細胞株）と比較した、腫瘍細胞において複製する能力、腫瘍細胞についてのウイルスの選択性の評価は、ある程度まで、不明瞭である。さらに、異なる細胞型は、所定のウイルスに対して広範に異なる感染性を保有することが観察された。アデノウイルスのようないくつかのウイルスは広範な組織向性を保有するとはいえ、他のウイルスは、感染する細胞の型がより制限される。広範に異なる感染性の細胞における所定のベクターの性能を評価することを試みることによっては、効果がないことが、細胞内でのベクターの性能に起因するのか、または単にウイルスが細胞に全く感染できないことに起因するのかを評価することは困難である。所定の型の標的細胞および正常細胞において選択性を評価することにより、この感染性効果を最小にする。
【００１０】
ウイルスの生活環の時間的性質もまた考慮されなければならない。例えば、野生型ベクターでさえ、感染のすぐ後に、正常細胞と比較して腫瘍細胞に選択性を保有するようであり得る。なぜなら、この細胞は既に細胞周期に入っているからである。しかし、この見かけの選択性は、一旦ウイルスが細胞周期を刺激すると、時間の経過とともに減少する。その結果、感染後に選択性が評価される時間は、正常細胞におけるこの初期の複製遅延を回避するに十分でなければならない。ここの時間は用いられるウイルスの型によって変動するが、この初期の遅延は、当業者によって容易に決定され得る。
【００１１】
投薬量の効果もまた、所定の組換えアデノウイルスが標的細胞型において選択的効果を実証しているか否かを決定する際に考慮されなければならない。例えば、腫瘍細胞の除去を標的化し、そして細胞傷害性による効果を測定している場合、ウイルスは、投薬量を変更することにより、選択的細胞傷害性を有するようにされ得る。そのゲノムが改変された程度にかかわらず、十分に高い用量のほぼ任意のウイルスが、細胞傷害性であることが公知であるウイルスタンパク質（例えば、アデノウイルスの場合、ヘキソン）の存在の効果に単に起因して細胞傷害性であることが観察されている。同様に、たとえ科学文献がウイルスを「複製欠損」（このウイルスが、ウイルス欠損を補完し得る細胞株の非存在下では絶対的に複製できないことを示唆する）として述べられ得るとしても、このようなウイルスは、より正確には、「複製が弱められている」と記載される。例えば、「複製欠損」または「複製欠損性」と頻繁にいわれる、Ｅ１領域全体の欠失を含むアデノウイルスは、ある程度、特に細胞周期に入った（ｃｙｃｌｉｎｇ）細胞または迅速に分裂している細胞において複製する。Ｍｕｌｌｉｇａｎの観察によると以下の通りである（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２）：
Ｅ１領域の発現が、複製に必要な他のウイルス遺伝子産物の発現に影響を与えることが示されている（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ編（Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０）第６０章を引用）とはいえ、Ｅ１遺伝子の発現がウイルス複製に必要とされるのは絶対的ではないようである。Ｅ１欠損ウイルスの初期の特徴付けは、高い感染多重度では、Ｅ１領域が複製に関して重要でなかったことを実証する（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ（１９７９）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７６（８）：３６６５−３６６９を引用）。
その結果、ウイルス用量の効果は、ウイルスが選択的様式で複製しているか否かを決定する際には無視できない。
【００１２】
標的細胞に関してウイルスの複製選択性を評価する１つの手段は、ウイルスの「選択性指数」を以下の通りに評価して使用することである。通常用いられるパラメーターであるＥＤ₅₀（これは、５０％の細胞の細胞死を誘導するために十分な用量として規定される）は、比較の適切な基礎を提供する。ウイルスのＥＤ₅₀は、代表的なインビトロ用量漸増実験によって容易に決定され得る。比較の最も一貫した基礎を確実にするために、ＥＤ₅₀は、比較される細胞型の間の感染性のバリエーションおよび任意のアッセイバリエーションの効果を最小にするために、ウイルスコントロールに対して最も適切に表される。その結果、単位のない比ＥＤ₅₀（ウイルス）／ＥＤ₅₀（コントロール）を用いて、細胞におけるウイルスの相対毒性が表され、そして「相対毒性指数」または「ＲＴＩ」と呼ばれる。所定のウイルスの「選択性指数」は、比ＲＴＩ（標的細胞）／ＲＴＩ（正常細胞）によって表される。選択的に複製するベクターは、少なくとも１０、しかし好ましくは５０、１００以上の選択性指数を保有する。
【００１３】
例えば、選択的に複製するアデノウイルスベクターＵ３ＥＥおよびＴ１ＬＴは、ｐ５３経路の欠損を有する腫瘍細胞の選択的複製および殺傷を達成するように設計される。Ｕ３ＥＥは、本明細書中の実施例 の教示に実質的に従って調製される。手短には、Ｕ３ＥＥウイルスは、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質の発現を駆動するｐ５３応答エレメント（ｐ５３ ＣＯＮ）を含む第１の発現カセットを含む。Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質は、アデノウイルスＥ２プロモーター活性の強力なインヒビターであり、細胞内におけるその存在は、ウイルス複製を効果的に抑制する。ｐ５３応答エレメントは、機能的ｐ５３経路の存在に応答して活性である。その結果、ｐ５３経路がインタクトである正常細胞では、Ｕ３ＥＥウイルスがＥ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質を発現し、そしてこのウイルスは複製しない。しかし、ｐ５３経路欠損を有する細胞（大部分の腫瘍細胞）では、ｐ５３ＣＯＮ応答エレメントは活性ではなく、従って、ウイルス複製の抑制は存在しない。Ｕ３ＥＥベクターはまた、Ａｄ５ Ｅ３−１０．５Ｋアポトーシス促進（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）遺伝子の発現を駆動するＭＬＰプロモーターを含む発現カセットを含む。アポトーシス促進遺伝子を用いる場合、時間的プロモーター（例えば、ＭＬＰプロモーター）の使用が好ましい。なぜなら、アポトーシス促進シグナルを活性化する前に標的細胞内のウイルスＤＮＡの複製を促進することを望むからである。ＭＬＰプロモーターは、Ｕ３ＥＥゲノムの複製がＥ３−１０．５Ｋタンパク質の活性をこのように誘導する場合、開始に引き続き感染のほぼ７時間後に活性化される。Ｔ１ＬＴアデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ領域に２４３Ｒおよび２８９ＲというアデノウイルスＥ１ａタンパク質のアミノ酸４〜２５を除去するさらなる欠失を含む以外はＵ３ＥＥベクターと本質的に同じである。この欠失は、ｐ３００タンパク質がこれらのＥ１ａタンパク質に結合する能力を破壊する。
【００１４】
Ｕ３ＥＥウイルスおよびＴ１ＬＴウイルスを、正常なヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）およびＣ３３Ａ（ｐ５３欠損経路を有する上皮腫瘍細胞株）において複製し、そしてこれらを殺傷するそれらの能力について、Ｌ９ＩＵベクターをコントロールとして用いて評価した。これらの実験の結果を、添付の図面の図３において表す。以下の表は提示されたデータをまとめる：
【００１５】
【表１】

表されるデータからわかり得るように、Ｕ３ＥＥウイルスおよびＴ１ＬＴウイルスは、腫瘍細胞に関して高い選択性を保有する。以前に考察したように、Ｌ９ＩＵウイルスは、静止期の正常細胞と比較して、細胞周期に入った腫瘍細胞においてわずかな複製利点を保有する。選択性指数を算出する前に細胞型の各々におけるＥＤ₅₀（ウイルス）／ＥＤ₅₀（コントロール）の比を比較することにより、このようなバリエーションの効果を最小にする。
【００１６】
用語「組換え」とは、従来の組換えＤＮＡ技術によって改変されたゲノムをいう。
【００１７】
用語「ウイルス」とは、タンパク質合成機構もエネルギー生成機構も有さない任意の絶対的な細胞内寄生物をいう。ウイルスゲノムは、脂質膜でタンパク質がコーティングされた構造を有する、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。本発明の実施において有用なウイルスの例としては、ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄｉａｅ、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄｉａｅ、ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ、ｈｅｒｅｐｅｓｖｉｒｉｄｉａｅ、ｐｏｘｖｉｒｉｄｉａｅ、ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ、ｐｉｃｏｔｒｎａｖｉｒｉｄｉａｅが挙げられる。用語組換えウイルスとしては、キメラ（またはさらにマルチマー）ウイルス、すなわち、１より多くのウイルス亜型由来の相補的コード配列を用いて構築されたベクターが挙げられる。例えば、Ｆｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８６６−８７０を参照のこと。
【００１８】
用語「アデノウイルス」は、用語「アデノウイルスベクター」と同義語（ｓｙｎｏｎｏｍｏｕｓ）であり、ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ属のウイルスをいう。用語ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄｉａｅは、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルのアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されない、マストアデノウイルス属の動物のアデノウイルスを集合的にいう。詳細には、ヒトアデノウイルスとしては、Ａ−Ｆ亜属（ｓｕｇｅｎｅｒａ）ならびにその個々の血清型が挙げられ、個々の血清型およびＡ−Ｆ亜属は、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、８型、９型、１０型、１１型（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、１９ａ型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型および９１型を含むがこれらに限定されない。用語ウシアデノウイルスは、ウシアデノウイルス１型、２型、３型、４型、７型および１０型を包含するがこれらに限定されない。用語イヌアデノウイルスは、イヌ１型（ＣＬＬ株、Ｇｌａｘｏ株、ＲＩ２６１株、Ｕｔｒｅｃｔ株、Ｔｏｒｏｎｔｏ ２６−６１株）および２型を包含するがこれらに限定されない。用語ウマアデノウイルスは、ウマ１型および２型を包含するがこれらに限定されない。用語ブタアデノウイルスは、ブタ３型および４型を包含するがこれらに限定されない。本発明の好ましい実施では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２および血清型５に由来する。
【００１９】
用語「経路応答性プロモーター」は、特定のタンパク質に結合し、そして近くの遺伝子が正常細胞におけるこのタンパク質の結合に転写的に応答することを引き起こす、ＤＮＡ配列をいう。このようなプロモーターは、転写因子が結合する配列である応答エレメントを取り込むことにより生成され得る。漸増するタンパク質レベルが転写を減少させる場合がいくつか存在するとはいえ、このような応答は一般に誘導性である。経路応答性プロモーターは、天然に存在し得るかまたは合成であり得る。経路応答性プロモーターは代表的には、この経路または標的化される機能的タンパク質に関して構築される。例えば、天然に存在するｐ５３経路応答性プロモーターは、ｐ２１プロモーターまたはｂａｘプロモーターのような、機能的ｐ５３の存在により活性化される転写制御エレメントを含む。あるいは、最小プロモーター（例えば、ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックス領域）の上流にｐ５３結合部位を含む合成プロモーターは、合成経路応答性プロモーターを作製するために用いられ得る。合成経路応答性プロモーターは一般に、コンセンサス結合モチーフに適合する配列の１以上のコピーから構築される。このようなコンセンサスＤＮＡ結合モチーフは、容易に決定され得る。このようなコンセンサス配列は一般に、いくつかの塩基対によって隔てられる直接反復物または頭−尾反復物として配置される。頭−頭反復物を含むエレメント（例えば、ＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴ（配列番号２１））はパリンドロームまたは逆方向反復と呼ばれ、尾−尾反復物を有するエレメントは外反転（ｅｖｅｒｔｅｄ）反復と呼ばれる。
【００２０】
本発明の実施において有用な経路応答性プロモーターの例としては、コンセンサスインスリン結合配列を含む合成インスリン経路応答性プロモーター（Ｊａｃｏｂら，（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７７７３−２７７７９）、サイトカイン経路応答性プロモーター、グルココルチコイド経路応答性プロモーター（Ｌａｎｇｅら，（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１５６７３−８０）、ＩＬ１およびＩＬ６経路応答性プロモーター（Ｗｏｎ Ｋ．−ＡおよびＢａｕｍａｎｎ Ｈ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３９６５−３９７８）、Ｔ３経路応答性プロモーター、コンセンサスモチーフ５’ＡＧＧＴＣＡ３’を含む甲状腺ホルモン経路応答性プロモーター、ＴＰＡ経路応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＴＧＦ−β経路応答性プロモーター（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔら（１９９６）Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７：４６９−４８０に記載される通り）が挙げられる。他の経路応答性プロモーターの例は当該分野で周知であり、そしてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｍｂ．ｒｓｓｉ．ｒｕ／ＴＲＲＤにてインターネットを通してアクセス可能なＤａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅｓにおいて同定され得る。
【００２１】
本明細書中に例示されるように本発明の好ましい実施では、ベクターは、ＳＲＥおよびＰＡＩ−ＲＥ応答エレメントを含むプロモーターのような、機能的ＴＧＦ−β経路の存在下で活性な合成ＴＧＦ−β経路応答性プロモーターを含む。ＰＡＩ−ＲＥは、プラスミノーゲンアクチベーター−Ｉプロモーター領域から単離されたＴＧＦ−βシグナルに応答性の配列を含む合成ＴＧＦ−β応答エレメントをいう。ＰＡＩ−ＲＥの構築は、本明細書中の実施例３に記載される。ＰＡＩ−ＲＥ経路応答性プロモーターは、プラスミドｐ８００ｌｕｃ（Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄら，（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５５２５−５５２９に記載され、そして登録番号Ｊ０３８３６の下でＧｅｎＢａｎｋから入手可能）から単離され得る７４９塩基対のフラグメントとして単離され得る。ＳＲＥは、Ｓｍａｄ−４ ＤＮＡ結合配列（Ｚａｗｅｌら，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １：６１１−６１７に記載される通りのＧＴＣＴＡＧＡＣ）の４つの反復を含む合成ＴＧＦ−β応答エレメントをいう。ＳＲＥの構築は、本明細書中の実施例３に記載される。ＳＲＥ応答エレメントは、Ｓｍａｄ−４結合配列をコードする相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、そしてプラスミドｐＧＬ＃３−プロモータールシフェラーゼベクター（ＰｒｏＭｅｇａから市販される）にクローニングすることにより作製され得る。
【００２２】
同様に、「ｐ５３経路応答性プロモーター」は、機能的ｐ５３経路の存在下で活性な転写制御エレメントをいう。ｐ５３経路応答性プロモーターは、ｐ２１プロモーターまたはｍｄｍ２プロモーターのような、機能的ｐ５３経路の存在下で活性な天然に存在する転写制御領域であり得る。あるいは、ｐ５３経路応答性プロモーターは、ＳＲＥ経路応答性プロモーターおよびＰＡＩ−ＲＥ経路応答性プロモーターのような、機能的ｐ５３経路の存在下で活性な合成転写制御領域であり得る。ｐ５３−ＣＯＮは、ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックスの上流の２つの合成ｐ５３コンセンサスＤＮＡ結合配列（Ｆｕｎｋら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：２８６６−２８７１に記載される通り）の挿入によって構築される合成ｐ５３応答エレメントを含むｐ５３経路応答性プロモーターを記載する。ｐ５３−ＣＯＮ経路応答性プロモーターの構築は、本明細書中の実施例３に記載される。ＲＧＣは、リボゾーム遺伝子クラスターにおいて同定された単一のｐ５３結合ドメインを用いた合成ｐ５３経路応答性プロモーターをいう。Ｋｅｒｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１７０８−１７１１およびＰａｒｋら（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １６：１０１−１０８。ｐ５３ＣＯＮ応答性エレメントおよびＲＧＣ応答性エレメントは、相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより構築され得、そしてｐ５３応答性プロモーターは、プラスミドｐＧＬ３−プロモータールシフェラーゼベクター（ＰｒｏＭｅｇａから市販される）にクローニングすることにより（実施例３により十分に記載されるように）構築され得る。
【００２３】
用語「標的細胞」は、治療トランスジーンの投与によって処置されることが所望される所定の表現型状態の細胞をいう。種々の経路応答性プロモーターエレメントの使用により、ウイルスの発現を、インタクトな経路を有する任意の所定の細胞に対して標的化し得る。例えば、ウイルス複製のリプレッサーは、ＴＧＦ−β経路応答性プロモーターまたはｐ５３経路応答性プロモーターの使用により腫瘍性標的細胞において発現され得る。同様に、ウイルス複製のリプレッサーは、炎症応答性プロモーターを通した関節炎標的細胞において発現され得、ここでこのベクターは必要に応じてＩＬ−１０をコードする。
【００２４】
用語「作動可能に連結される」は、機能的な関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。核酸配列が別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、その核酸配列は、「作動可能に連結され」ている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を与える場合、そのプロモーターまたはエンハンサーはそのコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるは、連結されたヌクレオチド配列が代表的には連続していることを意味する。しかし、エンハンサーは、プロモーターから数キロ塩基離れた場合に一般に機能し、そして介在配列は種々の長さであり得るので、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結され得るが直接は隣接していないかもしれず、そしてさらに異なる対立遺伝子または染色体からトランスで作用し得る。
【００２５】
用語「ウイルス複製のリプレッサー」は、所定の細胞において発現される場合、ウイルス複製を実質的に抑制するタンパク質をいう。当業者によって認識されるように、ウイルス複製のリプレッサーは、本発明の組換えベクターを誘導する親のアデノウイルスベクターの性質に依存する。例えば、アデノウイルスベクターまたは他のＤＮＡ腫瘍ウイルスの場合、１９９５年１２月６日に公開された欧州特許出願第９４１０８４４５．１号（公開第０ ６８５ ４９３ Ａ１号）に記載されるようなＥ２Ｆ−Ｒｂ融合構築物が用いられ得る。Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質は、Ｒｂ増殖抑制ドメイン（野生型Ｒｂタンパク質のアミノ酸３７９−９２８）に融合された、ヒトＥ２Ｆ転写因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよびＤＰ１ヘテロダイマー化ドメイン（野生型Ｅ２Ｆのアミノ酸９５〜２８６）からなる。Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質は、Ｅ２Ｆ依存性転写の強力なリプレッサーであり、そしてＧ１において細胞を停止させる。ＤＮＡ結合ドメインはアミノ酸１２８〜１９３に存在し、そしてダイマー化ドメインは１９４〜２８９に存在する。ヒトＥ２Ｆ−１タンパク質の配列は、１９９２年８月１０日に寄託された登録番号Ｍ９６５７７の下でＧｅｎＢａｎｋから利用可能である。他の種由来の他のＥ２ＦファミリーのメンバーのＥ２ＦからのＥ２Ｆの配列を、他の種において用いるためのベクターを構築する場合に用い得る。組換えウイルスがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく状況では、ｒｅｐタンパク質およびその誘導体は、アデノウイルス感染の非存在下では、ウイルス複製の有効なリプレッサーである。このウイルスが単純疱疹ウイルスに由来する状況では、前初期タンパク質ＩＣＰＯ（Ｌｉｕｎら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７７８５−７７９５）の欠失形態であるＩＣＰＯ−ＮＸタンパク質は、ウイルス複製の有効なリプレッサーとして用いられ得る。同様に、ドミナントネガティブ活性を有する任意のタンパク質は、ウイルス複製のリプレッサーとして用いられ得る。
【００２６】
ＴＧＦ−βおよび関連タンパク質（アクチビン、インヒビンおよびＢＭＰを含む）は、強力な天然の抗増殖因子であり、そして腫瘍形成性の抑制において重要な役割を果たすと考えられる。その生物活性形態では、ＴＧＦ−βは、２５−ｋＤａのジスルフィド結合されたホモダイマーであり、そして実質的に全てのヒト組織において発現される。興味深いことには、多くの悪性細胞型は、正常細胞において見られる発現パターンを保持した。ＴＧＦ−βは、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／トレオニンキナーゼレセプターのヘテロマーレセプター複合体を介してシグナルを発する。２つのレセプターキナーゼのうち、ＩＩ型リプレッサーは、固有のキナーゼ活性を保有し、そしてＴＧＦ−βリガンドへの結合の際には、ＩＩ型レセプターはＩ型レセプターとヘテロマーを形成し、そしてＩ型レセプターをトランスリン酸化する。Ｉ型レセプターのリン酸化は、そのキナーゼ活性を活性化し、これは次に、細胞内エフェクターであるＳｍａｄのリン酸化をもたらす。リン酸化されたＩ型レセプターは、細胞の内側にシグナルを伝え、増殖阻害のような細胞応答をもたらす。一旦核の内側に入ると、Ｓｍａｄ複合体は、この複合体自体が転写因子として作用することにより、または他の転写因子の活性を調節することにより、標的遺伝子の転写を活性化することが公知である。ＴＧＦ−βのシグナルによって調節されると考えられる転写因子としては、ＣＴＦ／ＮＦ−１、ＦＡＳＴ−１、Ｓｐ１、Ｊｕｎ、ＳＲＦ／ＴＲＦ、ＯｃｔおよびＣＲＥＢが挙げられる。これらの相互作用の正味の結果は、ＴＧＦ−βの種々の公知の多面発現性効果を導く。
【００２７】
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）および関連タンパク質は、多くの細胞型の増殖の強力なインヒビターである。上皮起源および造血起源のいくつかの腫瘍の悪性進行は、ＴＧＦ−βの抗増殖作用および抗侵襲作用の喪失と相関する。ＴＧＦ−βシグナル伝達の欠乏は、レセプターおよび／またはシグナル伝達経路の細胞内エフェクターの発現の変異または欠失または欠損を含むことが示されている。ＴＧＦ−βに対して抵抗性である多くの悪性腫瘍はまた、他の腫瘍抑制遺伝子について複数欠損しており、従って、効率的な治療について腫瘍抑制遺伝子の置換の実用性を制限している。
【００２８】
ＴＧＦ−β経路応答性プロモーターを、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１由来の配列（ＰＡＩ−プロモーター）またはＳＶ４０ ＴＡＴＡボックスの上流のＳｍａｄ４／ＤＰＣ４についての結合部位（ＳＲＥ−プロモーター）を取り込むことにより構築した。これらのプロモーターの活性を、一過性トランスフェクションアッセイにおいて、リポーターとしてルシフェラーゼを用いて評価した。これらの結果を以下の表２に提示する：
【００２９】
【表２】

これらの結果は、これらの両方のプロモーターが、機能的ＴＧＦ−βシグナル伝達を有する細胞においてのみ活性であることを実証する。ＴＧＦ−β経路欠損細胞株（例えば、Ｓｍａｄ４／ＤＰＣ４のホモ接合性欠失に起因してＴＧＦ−βシグナル伝達が欠損している、ＭＤＡ−ＭＢ４６８）では、ルシフェラーゼに作動可能に連結されたＰＡＩ−プロモーターまたはＳＲＥ−プロモーターのトランスフェクション、およびＳｍａｄ４をコードする組換えアデノウイルスでの感染が、上記の両方の応答エレメントの活性を回復させた。このことはさらに、以下の表３に提示されるデータにより実証されるように、ＴＧＦ−β経路についてのこれらの応答エレメント含有プロモーターの特異性を確認する。
【００３０】
【表３】

次いで、Ｅ２Ｆ−Ｒｂに作動可能に連結されたＰＡＩ−プロモーターを含むプラスミドを構築し、そしてインタクトなＴＧＦ−β経路を有する細胞においてＥ２プロモーターを選択的に抑制する能力について試験した。一過性のトランスフェクションアッセイでは、Ｅ２Ｆ−Ｒｂに作動可能に連結されたＰＡＩ−プロモーターを有するルシフェラーゼに連結されたＥ２プロモーターの同時トランスフェクションは、表４に示されるように、２９３細胞におけるＥ２Ｆ−Ｒｂの選択的発現によって、２９３細胞（正常なＴＧＦ−β経路を有する）においてＥ２プロモーター活性の選択的抑制を示し、そしてＭＤＡ−ＭＢ ４６８細胞（欠損したＴＧＦ−β経路を有する）においては抑制を示さなかった。予想されるように、これらの両方の細胞株における、Ｅ２Ｆ−Ｒｂを発現するＣＭＶ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂでの同時トランスフェクションは、両方の細胞株においてＥ２プロモーターの活性を阻害した。
【００３１】
【表４】

ｐ５３経路応答性プロモーターを、リボソーム遺伝子クラスター（ＲＧＣプロモーター）または高親和性ｐ５３結合部位（ｐ５３ＣＯＮプロモーター）のいずれか由来の公知のｐ５３結合部位を取り込むことにより構築した。これらのプロモーターの活性を、一過性トランスフェクションアッセイにおいて、ルシフェラーゼをレポーターとして用いて評価した。これらの実験の結果を以下の表５に表す。
【００３２】
【表５】

結果は、これらの両方の応答性エレメントが、機能的ｐ５３を有する細胞において活性であることを示した。ｐ５３応答性プロモーターの活性が機能的ｐ５３に起因することを確認するために、２つの細胞株ＷＩＤＲおよびＵ８７を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するＲＧＣプロモーターと、空のカセットのコントロールアデノウイルスベクター（ＺＺＣＢ）またはＣＭＶプロモーターの制御下でｐ５３を構成的に生成する組換えアデノウイルス（ＦＴＣＢ）のいずれかとで同時トランスフェクトした。これらの実験の結果を表６に表す。
【００３３】
【表６】

提示したデータからわかり得るように、ｐ５３応答性プロモーターの活性は、ｐ５３活性が増加するにつれて用量依存性様式で増加する。
【００３４】
ＴＧＦ−β経路応答性プロモーター（ＰＡＩもしくはＳＲＥ）またはｐ５３経路応答性プロモーター（ＲＧＣもしくはｐ５３ＣＯＮ）のいずれかの制御下でＥ２Ｆ−Ｒｂ融合コード配列をコードする組換えアデノウイルスベクターを作製した。さらに、グリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝子もまた、これらのベクターにレポーターとして取り込んだ。得られたウイルスを、ＴＧＦ−β経路またはｐ５３経路のいずれかの欠損を有する細胞を選択的に複製し、そして殺傷する能力について細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイにおいて試験した。結果を、添付の図面の図１に示す。ＭＲＣ９（ｐ５３経路陽性およびＴＧＦ−β経路陽性）では、野生型アデノウイルスは、低い濃度（１×１０⁶粒子／ｍｌ）でさえも複製し得、そしてＣＰＥを誘導し得たが、一方、ＴＧＦ−β経路またはｐ５３経路を標的化するベクターは、その濃度でＣＰＥを誘導しなかった。試験した最大の用量（１×１０⁸粒子／ｍｌ）でのみ、経路を標的化したベクターは、いくらかのＣＰＥを示した。ＷＩＤＲ（ｐ５３経路およびＴＧＦ−β経路の両方が欠損している）およびＨｅｐ３Ｂ（ｐ５３ヌルおよび外因性ＴＧＦ−βの非存在下ではＴＧＦ−β経路が欠損している）のような細胞株においては対照的に、経路を標的化したベクターは、低い濃度（１×１０⁶粒子／ｍｌ）でさえも、野生型ウイルスと同様にＣＰＥを誘導する際に有効であった。経路を標的化したベクター（ＳＲＥ−Ａｄおよびｐ５３Ｃｏｎ−Ａｄ）で感染させたＨｅｐ３Ｂ細胞の蛍光顕微鏡法は、低い粒子濃度（１×１０⁵粒子／ｍｌに２時間暴露した）で感染させた場合でさえ、トランスジーンの高レベルの発現および培養物内でのウイルスの伝播を示した。対照的に、同じ濃度（１×１０⁵粒子／ｍｌ）で複製欠損（Ｅ１Ａが欠失している）ＧＦＰコードアデノウイルス（ＧＦＣＢ）に感染させたＨｅｐ３Ｂ細胞は、ＧＦＰ発現を示さなかった。
【００３５】
以前に示したように、本発明のベクターは、選択的に複製し得、そして選択的条件下で標的細胞を溶解し得る。しかし、これは、さらなる層の選択性または毒性がこれらのベクターに操作され得ないことを暗示することを意味しない。本発明はまた、ウイルスゲノムに対してさらなる改変（例えば、標的化する改変）、トランスジーン発現カセットまたは所定の細胞型もしくは表現型状態における選択的複製を容易にするウイルスゲノムへの改変を含む組換えアデノウイルスを提供する。
【００３６】
用語「標的化する改変」は、特定の細胞型の優先的感染性をもたらすように設計された、ウイルスゲノムに対する改変をいう。細胞型特異性または細胞型標的化はまた、特徴的に広範な感染性を有するウイルス（例えば、アデノウイルス）に由来するベクターにおいて、ウイルスエンベロープタンパク質の改変によって達成され得る。例えば、細胞標的化は、固有の細胞表面レセプターとの特異的相互作用を有する改変されたこぶドメインおよび線維ドメインの発現を達成するための、ウイルスゲノムのこぶおよび線維をコードする配列の選択的改変によってアデノウイルスベクターを用いて達成された。このような改変の例は、Ｗｉｃｋｈａｍら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１（１１）：８２２１−８２２９（アデノウイルス線維タンパク質へのＲＧＤペプチドの取り込み）；Ａｒｎｂｅｒｇら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２７：２３９−２４４（眼および生殖管への向性を達成するためのアデノウイルス線維遺伝子の改変）；ＨａｒｒｉｓおよびＬｅｍｏｉｎｅ（１９９６）ＴＩＧ １２（１０）：４００−４０５；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（６）：４７８２−４７９０；Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９５）ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２：６６０−６６８（アデノウイルス線維タンパク質へのガストリン放出ペプチドフラグメントの取り込み）；ならびにＯｈｎｏら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：７６３−７６７（シンドビスウイルスへのプロテインＡ−ＩｇＧ結合ドメインの取り込み）に記載される。細胞特異的標的化の他の方法は、エンベロープタンパク質への抗体または抗体フラグメントの結合体化によって達成されている（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６８６６−６８６９、Ｗａｔｋｉｎｓら（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１００４−１０１２；Ｄｏｕｇｌａｓら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１５７４−１５７８を参照のこと）。あるいは、特定の部分をウイルス表面に結合体化して、標的化を達成し得る（例えば、Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：２８０−２８６（レトロウイルスタンパク質へのＥＧＦの結合体化）を参照のこと）。組換えによって改変されたこれらのベクターは、本発明の実施に従って生成され得る。
【００３７】
用語「トランスジーン発現カセット」は、治療トランスジーンに作動可能に連結された、標的細胞において機能的なプロモーターをいう。用語プロモーターは、別のヌクレオチド配列の転写に影響を与えるヌクレオチド配列をいう。プロモーターの例としては、弱い構成性プロモーター、時間的ウイルスプロモーターまたは調節性プロモーターが挙げられる。
【００３８】
用語「時間的プロモーター」は、経路応答性プロモーターの発現を制御するプロモーターに対して、ウイルスのサイクルの後期にある時点で転写または治療トランスジーンを駆動するプロモーターをいう。このような時間的に調節されるプロモーターの例としては、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、Ｅ３のような他のプロモーターが挙げられる。本発明の好ましい実施では、ＭＬＰプロモーターが用いられる。単純疱疹ウイルスについては、後期活性化プロモーターが用いられ得る。
【００３９】
用語「調節性プロモーター」は、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターをいう。用語「誘導性プロモーター」は、好ましい（または専ら）特定の条件下で、および／または外部の化学的刺激もしくは他の刺激に応答して、治療トランスジーンの転写を促進するプロモーターをいう。誘導性プロモーターの例は、科学文献において公知である（例えば、ＹｏｓｈｉｄａおよびＨａｍａｄａ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３０：４２６−４３０；Ｉｉｄａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（９）：６０５４−６０５９；Ｈｗａｎｇら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７１（９）：７１２８−７１３１；Ｌｅｅら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７（９）：５０９７−５１０５；ならびにＤｒｅｈｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４６）；２９３６４−２９３７１を参照のこと）。照射（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）誘導性プロモーターの例は、Ｍａｎｏｍｅら（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１４０９−１４１７に記載される。さらなるレベルの選択性が、組織特異的プロモーターまたは腫瘍特異的プロモーターの使用によって付与され得る。組織特異的プロモーターおよび腫瘍特異的プロモーターは当該分野で周知であり、そして以下を含む：平滑筋において優先的に活性なプロモーター（α−アクチンプロモーター）、膵臓特異的（Ｐａｌｍｉｔｅｒら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５０：４３５）、肝臓特異的（Ｒｏｖｅｔら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７６５；Ｌｅｍａｉｇｎｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９８９６；Ｎｉｔｓｃｈら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４４９４）、胃特異的（Ｋｏｖａｒｉｋら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９９１７）、下垂体特異的（Ｒｈｏｄｅｓら（１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：９１３）、前立腺特異的など。
【００４０】
用語「治療用トランスジーン」とは、標的細胞におけるその発現が治療効果を生ずるヌクレオチド配列をいう。用語治療用トランスジーンは、腫瘍抑制遺伝子、抗原性遺伝子、細胞傷害性遺伝子、細胞分裂抑制遺伝子、プロドラッグ活性化遺伝子、アポトーシス遺伝子、薬学的遺伝子、または抗脈管形成遺伝子を含むがこれらに限定されない。本発明のべクターは、ＩＲＥＳエレメントの使用を通してタンデムでか、または独立して調節されるプロモーターを通してかのいずれかで１つ以上の治療用トランスジーンを産生するために使用され得る。
【００４１】
用語「腫瘍抑制遺伝子」とは、標的細胞中でのその発現が、新生物表現型の抑制および／またはアポトーシスの誘導をし得るヌクレオチド配列をいう。本発明の実施において有用な腫瘍抑制遺伝子の例には、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌｅｅら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：６４２）、ＭＭＡＣ−１遺伝子、腺腫様ポリープ症ｃｏｌｉタンパク質（１９９８年７月２１日に発行された、Ａｌｂｅｒｔｓｅｎら、米国特許第５，７８３，６６６号）、結腸癌における欠損（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１．３にマッピングされる鼻咽頭癌腫瘍抑制遺伝子（Ｃｈｅｎｇら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：３０４２−３０４７）、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ２遺伝子、およびＶＨＬ遺伝子が挙げられる。
【００４２】
用語「抗原性遺伝子」とは、標的細胞におけるその発現が、免疫系により認識され得る細胞表面抗原性タンパク質の産生を生じるヌクレオチド配列をいう。抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３（１９９４年２月３日に公開された、Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／０２１６７によって記載される通り）が含まれる。免疫認識を容易にするために、抗原性遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ抗原に融合され得る。
【００４３】
用語「細胞傷害性遺伝子」とは、細胞におけるその発現が、毒性の効果を生ずるヌクレオチド配列をいう。このような細胞傷害性遺伝子の例には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、リシン毒素、ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００４４】
用語「細胞分裂抑制遺伝子」とは、細胞におけるその発現が、細胞周期の停止を生じるヌクレオチド配列をいう。このような細胞分裂抑制遺伝子の例には、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（例えば、Ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８、およびｐ１９）をコードする遺伝子、Ｂｒａｎｅｌｌｅｃら（１９９７年５月９日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９７／１６４５９および１９９６年１０月３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９６／３０３８５）によって記載されたような、増殖停止特異的ホメオボックス（ＧＡＸ）遺伝子が含まれる。
【００４５】
用語「サイトカイン遺伝子」とは、細胞におけるその発現がサイトカインを産生するヌクレオチド配列をいう。このようなサイトカインの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（特に、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、α、β、およびγのサブタイプのインターフェロン（特に、インターフェロンα−２ｂおよび融合物（例えば、インターフェロンα−２α−１））が含まれる。
【００４６】
用語「ケモカイン遺伝子」とは、細胞におけるその発現がサイトカインを産生するヌクレオチド配列をいう。用語ケモカインとは、分裂促進活性、走化性活性、または炎症性活性を有する、構造的に関連している、細胞によって分泌される構造的に関連する低分子量のサイトカイン因子のグループをいう。これらは、主に、７０〜１００アミノ酸残基のカチオン性タンパク質であり、４つの保存性システイン残基を共有する。これらのタンパク質は、２つのアミノ末端システインの間隔に基づいて、２つのグループに分類され得る。第１のグループにおいて、２つのシステインは１残基隔てられており（Ｃ−ｘ−Ｃ）、一方第２のグループにおいては、これらは隣接している（Ｃ−Ｃ）。「Ｃ−ｘ−Ｃ」ケモカインのメンバーの例には、血小板因子４（ＰＦ４）、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、メラノーマ増殖刺激活性タンパク質（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症タンパク質２（ＭＩＰ−２）、マウスＭｉｇ（ｍ１１９）、ニワトリ９Ｅ３（またはｐＣＥＦ−４）、ブタ肺胞マクロファージ走化性因子ＩおよびＩＩ（ＡＭＣＦ−ＩおよびＡＭＣＦ−ＩＩ）、前Ｂ細胞増殖刺激因子（ＰＢＳＦ）、およびＩＰ１０が含まれるがこれらに限定されない。「Ｃ−Ｃ」グループのメンバーの例には、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質２（ＭＣＰ−２）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、単球走化性タンパク質４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症タンパク質１α（ＭＩＰ−１−α）、マクロファージ炎症タンパク質１β（ＭＩＰ−１−β）、マクロファージ炎症タンパク質１γ（ＭＩＰ−１−γ）、マクロファージ炎症タンパク質３−α（ＭＩＰ−３−α）、マクロファージ炎症タンパク質３β（ＭＩＰ−３−β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、マクロファージ炎症タンパク質４（ＭＩＰ−４）、マクロファージ炎症タンパク質５（ＭＩＰ−５）、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−ε（ｐ５００）、胸腺活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、Ｉ−３０９、ヒトタンパク質ＨＣＣ−１／ＮＣＣ−２、ヒトタンパク質ＨＣＣ−３、マウスタンパク質Ｃ１０が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
用語「薬学的なタンパク質遺伝子」とは、そのタンパク質の産生を生じる発現が、標的細胞において薬学的な効果を有するヌクレオチド配列をいう。このような薬学的遺伝子の例には、プロインスリン遺伝子およびアナログ（ＰＣＴ国際特許出願番号ＷＯ９８／３１３９７に記載される通り）、成長ホルモン遺伝子、ドパミン、セロトニン、上皮増殖因子、ＧＡＢＡ、ＡＣＴＨ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ（標的組織への血液灌流を増大させるため、新脈管形成を誘導するため、１９９８年７月３０日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９８／３２８５９）、トロンボスポンジンなどが含まれる。
【００４８】
用語「アポトーシス促進（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）遺伝子」とは、その発現が、細胞のプログラムされた細胞死を生じるヌクレオチド配列をいう。アポトーシス促進遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２由来）またはアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ（Ａｄ由来）、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、およびカスパーゼをコードする遺伝子を含む。
【００４９】
用語「プロドラッグ活性化遺伝子」とは、その発現が、非治療用化合物を治療用化合物に転換し得るタンパク質の産生を生じるヌクレオチド配列をいい、それは、外部の因子によって細胞を殺傷されやすくするか、または細胞内に毒性条件を引き起こす。プロドラッグ活性化遺伝子の例は、シトシンデアミナーゼ遺伝子である。シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を、強力な抗腫瘍剤である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に転換する。腫瘍細胞の溶解は、腫瘍の局在化された点において５ＦＣを５ＦＵに転換し得るシトシンデアミナーゼの局所的なバーストを提供し、腫瘍細胞を取り囲む多くの細胞の殺傷を生じる。このことは、アデノウイルスでこれらの細胞を感染させる必要性なしで、多数の腫瘍細胞の殺傷を生じる（いわゆる、「傍観者効果」）。さらに、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（例えば、Ｗｏｏら、１９９７年５月２０日に発行された米国特許第５，６３１，２３６号および１９９７年２月１１日に発行されたＦｒｅｅｍａｎら、米国特許第５，６０１，８１８号を参照のこと）（ここで、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビルの投与による選択的な殺傷に感受性である）が用いられ得る。
【００５０】
用語「抗脈管形成」遺伝子とは、その発現が抗脈管形成因子の細胞外分泌を生じるヌクレオチド配列をいう。抗脈管形成因子には、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビター（例えば、Ｔｉｅ２）（ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）（１９９８）９５：８７９５−８８００において記載される通り）、エンドスタチンが含まれる。
【００５１】
野生型タンパク質の機能的なサブフラグメントをコードするための上記に言及された遺伝子に対する改変およびまたは欠失が、本発明の実施における使用のために容易に適合され得ることは、当業者には容易に明らかである。例えば、ｐ５３遺伝子に対する言及は、野生型タンパク質を含むだけでなく、改変されたｐ５３タンパク質をも含む。このような改変されたｐ５３タンパク質の例には、核残留を増大させるためのｐ５３に対する改変、カルパインコンセンサス切断部位を除去するためのΔ１３−１９アミノ酸のような欠失、オリゴマー化ドメインに対する改変（Ｂｒａｃｃｏら、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９７／０４９２または米国特許第５，５７３，９２５号において記載される通り）が含まれる。
【００５２】
標的化部分（例えば、シグナルペプチドまたは核局在化シグナル（ＮＬＳ））の含有によって、上記の治療用遺伝子が培地中に分泌され得るか、または特定の細胞内位置に局在し得るかは、当業者には容易に明らかである。１型単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）の構造タンパク質ＶＰ２２を有する治療用トランスジーンの融合タンパク質もまた、治療用トランスジーンの定義の中に含まれる。ＶＰ２２シグナルを含む融合タンパク質は、感染した細胞において合成される場合、感染した細胞の外部に搬出され、そして約１６細胞の幅の直径まで、周囲の非感染細胞に効率的に侵入する。この系は、融合タンパク質が、周囲の細胞の核に効率よく輸送されるので、転写活性タンパク質（例えば、ｐ５３）と組み合わせて特に有用である。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｇ．およびＯ’Ｈａｒｅ，Ｐ．Ｃｅｌｌ ８８：２２３−２３３：１９９７；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．およびＣａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ａ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｗｓ Ｂｒｉｅｆｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５：２０５：１９９７；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９９７年２月１３日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９７／０５２６５を参照のこと。ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来する同様の標的化部分はまた、Ｖｉｖｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６０１７に記載される。
【００５３】
さらに、本発明のベクターの効力を増大させるための改変には、Ｅ１中の変化、細胞傷害性を増加させるためのＥ４における変異の導入（Ｍｕｌｌｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５８６７−５８７８）、ウイルス死（ｄｅａｔｈ）タンパク質（例えば、Ｅ４ｏｒｆ４タンパク質またはＥ３ １１．６Ｋタンパク質）の上方制御が含まれるがこれらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で例示されるような本発明の好ましい実施において、本発明のベクターは、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質の発現を駆動するｐ５３経路応答性プロモーターまたはＴＧＦ−β経路応答性プロモーターを含む、条件付きで複製するアデノウイルスを含み、さらに、一過性のＥ３プロモーターの制御下にあるシトシンデアミナーゼ遺伝子を含む。このような例において、シトシンデアミナーゼは、ウイルス複製後に腫瘍細胞においてのみ産生される。本発明の好ましい実施において、プロドラッグ変換遺伝子は、比較的弱いプロモーター、または組織特異的プロモーター、または腫瘍特異的なプロモーターの制御下にある。
【００５５】
本発明の別の実施形態において、ベクターは、シトシンデアミナーゼを単独で発現するトランスジーン発現カセット中の、またはシトシンデアミナーゼを含む二シストロン性発現カセット中の、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質の発現を駆動するｐ５３経路応答性プロモーターまたはＴＧＦ−β経路応答性プロモーターを有する組換えアデノウイルス、ならびにＩＲＥＳエレメントおよびＭＩＰ−３−αタンパク質を含む。シトシンデアミナーゼが発現されるので、腫瘍細胞殺傷は、５−フルオロシトシンのようなプロドラッグの投与に際して達成される。ＭＩＰ−３αの低レベル発現は、抗腫瘍免疫の発生を補助する。
【００５６】
複数レベルの、多機能の、または複数の経路応答性カスケードは、本明細書中で交換可能に使用されて、１より多くの経路が同時に探査され得る治療的効果を生じるための経路応答性エレメントの構造をいう。上記のようなベクターコントロールエレメントが、本発明のベクターに対して複数の層の選択性を提供するために組み合わされ得ることは当業者に明白である。複数レベルのコントロールの例として、Ｒｂ経路、ＴＧＦ−β経路、またはｐ５３経路のいずれかにおいて欠損を有する細胞を複製および殺傷し得る、条件付きで複製するアデノウイルスを設計することが可能である。このようなベクターは、一次レベルのコントロールとしてｐ５３応答性プロモーターによって制御されるウイルス複製のドミナントネガティブインヒビターの発現を含む。結果として、機能的ｐ５３を有する任意の細胞（例えば、すべての正常な細胞）において、ドミナントネガティブインヒビターが発現され、そしてウイルス複製はブロックされるが、しかし不活性ｐ５３を有する細胞ではそうではない。しかし、このベクターは、機能的ｐ５３を有するが、他の経路（例えば、ＴＧＦ−β経路およびＲｂ経路）において欠損を有する腫瘍細胞においては複製し得る。従って、腫瘍細胞において機能的ｐ５３を本質的に不活化し、従って、他の経路に欠損がある場合にウイルス複製を可能にする、さらなるコントロールのレベルが挿入され得る。
【００５７】
制御の第２のレベルとして、同じベクターはまた、ＴＧＦ−β経路欠損細胞においてのみ活性であるプロモーターの制御下で、機能的に不活性なｐ５３であり得るアデノウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋタンパク質、を含む発現カセットを構成する。ＴＧＦ−β経路欠損細胞においてのみ活性であるプロモーターは、プロモーター内にリプレッサー結合部位を挿入することにより構築され得、これにより、ベクター上のどこかにある、ＴＧＦ−β応答性プロモーターを用いるリプレッサーの発現は、インタクトなＴＧＦ−βシグナル伝達による細胞中のこのプロモーター活性の妨害を導く。一方で、ＴＧＦ−β経路が欠損している細胞においては、リプレッサーは合成されず、従って、プロモーターは活性である。ＴＧＦ−β経路が欠損している細胞のみにおいて活性であるプロモーターからのＥ１Ｂ−５５Ｋの発現により、内因性ｐ５３は不活化される。あるいは、ＴＧＦ−βシグナル伝達のために下方制御される任意の天然のプロモーターが用いられ得る。上記の２つの発現カセットを含むことは、ドミナントネガティブなインヒビターが、ｐ５３およびＴＧＦ−β経路の両方が正常である（複製の阻害を導く）ときだけは発現されるが、それらの一方または両方が欠損している（ウイルス複製を導く）ときには発現されないということを、確実にする。
【００５８】
制御の第３のレベルとして、Ｅ２Ｆ−応答性プロモーターにより制御されるＴＧＦ−β経路を不活性化し得る（Ｎａｋａｏら、Ｎａｔｕｒｅ １９９７ Ｏｃｔ ９；３８９（６６５１）：６３１〜６３５）Ｓｍａｄ７またはＳｍａｄの任意の他のドミナントネガティブ形態のようなタンパク質の発現は、同じベクターにおいて達成される。Ｅ２Ｆ−応答性プロモーター（例えば、ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックスのような最小プロモーターの上流に複数のＥ２Ｆ結合部位を有する、Ｅ２Ｆ１プロモーター、Ｅ２プロモーターまたは合成プロモーター）は、Ｒｂ経路が欠損している場合に活性である。この第３のレベルの制御により、Ｒｂ経路を欠損している細胞において、Ｓｍａｄ７が発現され、次にこのＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ４を不活性化し、そしてＴＧＦ−βシグナル伝達をブロックする。従って、Ｅ１Ｂ−５５Ｋが作製され、そしてｐ５３は不活性化され、このことはドミナントネガティブなインヒビターの発現の欠如を導く。従って、ウイルス複製は、妨害されずに進行し得る。一方で、Ｒｂ経路が正常であれば、Ｓｍａｄ７は合成されず、従ってＴＧＦ−βシグナル伝達が正常に進行する。従って、Ｅ１Ｂ−５５Ｋは生成されず、結果として、ドミナントネガティブなインヒビターを発現し、ウイルス複製をブロックし得る、機能的ｐ５３を生じる。
【００５９】
上記の３つのレベルの制御において、３つの経路（Ｒｂ、ＴＧＦ−βおよびｐ５３）の任意の１つまたは２つまたは全ての欠損は、最終的にウイルス複製および細胞溶解を導く。ウイルス複製は、３つ全ての経路が正常細胞中と同様に機能的である場合にのみ生じない。
【００６０】
当業者により理解され得るように、本発明のベクターは、種々の経路応答性プロモーターを用いる広範な種々の経路欠損の検出および処置のために、多くのバリエーションに用いられ得る。しかし、本明細書において例示される本発明の好ましい実施において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス属から誘導される。特に好ましいウイルスは、２型または５型のヒトアデノウイルスから誘導される。アデノウイルスベクターが親ベクターとして用いられる場合、ウイルス複製の好ましいインヒビターはＥ２Ｆ−ＲＢ融合タンパク質である。
【００６１】
本発明の好ましい実施において、制御されていない細胞増殖に関連する疾患を処置するために本発明のベクターを用いる場合、Ｅ１ａ ＣＲ３ドメインのトランス活性化機能を保持しながら、Ｅ１ａ遺伝子産物がｐ３００タンパク質およびＲｂタンパク質に結合する能力を除去するために、Ｅ１Ａ領域において特定の欠失を含むアデノウイルスベクターを用いることが好ましい。本発明のベクターは、Ｅ１ａコード配列に欠失を有し、１３Ｓコード配列においてｐ３００結合部位およびｐ１０５−Ｒｂ結合部位が除去される。本発明の好ましい実施において、ｐ３００結合の欠失は、アミノ酸ほぼ４〜ほぼ２５、またはアミノ酸ほぼ３６〜ほぼ４９の欠失により示される。
【００６２】
ｐ３００結合およびｐＲｂ結合の除去を達成するために必要なＥ１ａ ２８９Ｒコード配列における欠失は、Ｅ１ａ ２８９Ｒタンパク質の二次構造および三次構造の重大な破壊を防ぐために、好ましくは、可能な限り最小である。ｐ３００結合を除去するためには、２８９Ｒのｐ３００結合ドメインをコードするＤＮＡ配列に変異が導入されることが好ましい。ｐ３００結合を除去するためには、Ｃ末端領域における約３０アミノ酸未満の欠失が好ましいが、より少ない改変が好ましい。例えば、アミノ酸４〜２５（ｄｌ１１０１）、約アミノ酸３０〜約アミノ酸４９（ｄｌ１１０３）、そしてより好ましくはアミノ酸３６〜４９の欠失が、ｐ３００結合を除去するために、代替的に好ましい。結合するｐ３００を破壊するために十分な点変異が特に好ましい。例えば、２８９Ｒタンパク質における、アルギニンからグリシンへの（Ａｒｇ２→Ｇｌｙ２）第２のアミノ酸の点変異は、ｐ３００結合を破壊することが実証されている（例えば、ｐｍ５６３、Ｗｈｙｔｅら（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：６７〜７５を参照のこと）。同様に、ｐＲｂ１０５結合の除去については、最小限の改変が好ましい。アミノ酸１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）およびアミノ酸１２４〜１２７（ｄｌ１１０８）のようなｐＲｂ１０５結合ドメインにおける選択的アミノ酸の除去が好ましい。アミノ酸１１１〜１２３（ｄｌ１１０７）の欠失は、それが２８９Ｒタンパク質のｐ１０７結合活性を保持しているという点で、特に好ましい。
【００６３】
さらに、Ｅ１ａ ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸のほぼ２１９〜２８９およびＥ１Ａ ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸の約１７３〜２４３の除去が導入され得る。例えば、ヒトＡｄ５ゲノムの１１３１位に対応する位置での点変異の導入（すなわち、シトシン¹¹³¹をグアニンに変化すること）により、終止コドンを作製する。この変異は、Ｅ１ａ ２８９Ｒタンパク質のアミノ酸２１９〜２８９およびＥ１Ａ ２４３Ｒタンパク質のアミノ酸１７３〜２４３の除去を生じる。この変異は、上記のＲｂ結合およびｐ３００結合における欠失に加えて、必要に応じて作製される。このような親ベクターのさらなる例は、同時係属中の米国特許出願番号６０／１０４，３１７および同第０８／０９／１７２，６８４（１９９８年１０月１５日出願）に記載されている。
【００６４】
本明細書において例示されるように、本発明の好ましい実施において、好ましいｐ５３経路応答性プロモーターは、ｐ５３−ＣＯＮおよびＲＧＣである。好ましいＴＧＦ−β経路応答性プロモーターは、ＰＡＩ−ＲＥおよびＳＲＥからなる群より選択される。
【００６５】
本発明の好ましい実施において、治療用遺伝子は、プロドラッグ活性化遺伝子（例えば、シトシンデアミナーゼ）である。抗腫瘍免疫を誘導するための本発明の好ましい実施において、本発明のベクターは、ＭＩＰ−３−αをコードする。
【００６６】
治療用遺伝子の発現のために好ましいプロモーターは、ＭＬＰおよびＥ３のような時間的プロモーターである。
【００６７】
アデノウイルス構築物において、複製までアデノウイルスにより誘導される細胞溶解を最小限にするために、ＡｄＥ３−１１．６Ｋタンパク質の作用の排除または遅延が達成される。特に、ネイティブなＥ３−１１．６Ｋ／１０．５遺伝子の排除が、好ましい。これは、初回の局所的伝播が生じる後まで免疫応答を最小限にする。この後者の時点で、一旦、最初に感染した細胞のアポトーシスが達成され、そして局所的ウイルス伝播が可能になると、この免疫応答は有利である。１１．６Ｋタンパク質（すなわち、Ａｄ５の対応するＥ３−１０．５Ｋタンパク質）は、アポトーシス促進性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）遺伝子であり、そして腫瘍細胞において細胞殺傷を達成するために用いられ得る。しかし、ウイルス複製を最大化する標的細胞の早発性溶解を遅延することが望ましいので、１１．６Ｋ／１０．５Ｋ遺伝子は、そのアポトーシス性効果の発現を遅延するため、時間的プロモーター（例えば、ＭＬＰプロモーター）の制御下に配置されることが好ましい。
【００６８】
（薬学的処方物）
本発明はさらに、キャリアと組み合わせた組換えウイルスの薬学的に受容可能な処方物を提供する。本発明のベクターは、キャリアおよび賦形剤の添加を伴う従来の薬学に従って、用量投与のために処方され得る。投薬処方物は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、局所、基質またはエアロゾルでの送達を含み得る。
【００６９】
用語「キャリア」は、治療用化合物の安定性、無菌性および送達可能性を増大させｓるために用いられる薬学的化合物の処方に対して通常、用いられる化合物をいう。ウイルスが溶液または懸濁液として処方される場合、送達系は、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア中である。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が用いられ得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水性溶液は、そのままでの使用のためにパッケージングされ得るか、または凍結乾燥され得、この凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わせられる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる場合、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、吸着（ｓｏｒｐｔｉｏｎ）モノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなど））を含み得る。
【００７０】
本発明はさらに、キャリアおよび送達増強剤を含む本発明のウイルスの薬学的処方物を提供する。用語「送達エンハンサー」または「送達増強剤」は、本明細書中で互換可能に用いられ、そして標的細胞へのウイルスの取り込みを促進する１つ以上の薬剤を含む。送達エンハンサーの例は、１９９８年７月８日提出の同時係属中の米国特許出願番号０９／１１２，０７４号および１９９７年９月２６日提出、０８／９３８，０８９号に記載される。このような送達増強剤の例としては、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、アルコール、グリコール、界面活性物質（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、胆汁酸塩、ヘパリンアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高張性塩溶液およびアセテートが挙げられる。アルコールとしては例えば、エタノール、Ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブチルアルコール、アセチルアルコールのような脂肪族アルコールが挙げられる。グリコールとしては、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の低分子量グリコール（例えば、グリセロールおよびチオグリセロール）が挙げられる。酢酸、グルコン酸、および酢酸ナトリウムのようなアセテートは、送達増強剤のさらなる例である。１Ｍ ＮａＣｌのような高張性塩溶液もまた、送達増強剤の例である。界面活性物質の例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびリゾレシチン、ポリソルベート８０、ノニルフェノキシポリオキシエチレン、リゾホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール４００、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレンエーテル、ポリグリコールエーテル界面活性物質、ならびにＤＭＳＯである。タウロコレート、タウロ−デオキシコール酸ナトリウム、デオキシコレート、ケノデオキシコレート（ｃｈｅｎｏｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸および他の収斂薬（例えば、硝酸銀）のような胆汁酸塩が用いられ得る。第４級アミン（例えば、硫酸プロタミン）のようなヘパリン−アンタゴニストもまた用いられ得る。シクロオキシゲナーゼインヒビター（例えば、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸、および非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＡＳＩＤＳ）（インドメタシン、ナプロキセン、ジクロフェナクのような）が用いられ得る。送達増強剤としては、式Ｉの化合物が挙げられる。
【００７１】
ここで、Ｘ１およびＸ２は、コール酸基、デオキシコール酸基および糖基からなる群より選択され、ｍは２〜８の整数であり、そして好ましくは２または３であり、ｎは、２〜８の整数であり、そして好ましくは２または３であり、そしてＲは、カチオン性基、糖基または−ＣＯ−Ｘ３構造（ここでＸ３は、糖基である）である。この糖基は五炭糖単糖基、六炭糖単糖基、五炭糖−五炭糖二糖基、六炭糖−六炭糖二糖基、五炭糖−六炭糖二糖基、および六炭糖−五炭糖二糖基からなる群より選択され得る。
【００７２】
用語「界面活性剤」としては、アニオン性、カチオン性、両性イオン性および非イオン性の界面活性剤が挙げられる。例示的な界面活性剤としては、タウロコレート、デオキシコレート、タウロデオキシコレート、セチルピリジウム、ベナルコニウムクロリド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１４界面活性剤、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオル］−１−プロパンスルホン酸水和物）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００界面活性剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ−Ｆ６８界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ ２０界面活性剤およびＴＷＥＥＮ ８０界面活性剤（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
本発明の単位投薬処方物は、凍結乾燥形態の請求項１の組換えウイルス、およびその凍結乾燥製品の再構成のための溶液を含む製品のキットに含まれ得る。本発明の組換えウイルスは、従来の手順により凍結乾燥され、そして再構成され得る。
【００７４】
本発明のベクターは、カルパインインヒビターと組み合わせて投与され得る。「カルパインインヒビター」（略して「ＣＩ」）は、カルパイン−Ｉ（例えば、μ−カルパイン）のタンパク質分解性作用を阻害する化合物をいう。本明細書において用いる場合、用語カルパインインヒビターは、それらの他の生物学的活性に加えて、またはその活性と独立して、カルパインＩ阻害性活性を有するそれらの化合物を含む。広範な種々の化合物がカルパインのタンパク質分解性作用の阻害の活性を有することが実証されている。本発明の実施において有用であるカルパインインヒビターの例としては、「カルパイン インヒビター１」としても公知である、Ｎ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ノルロイシナル（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎａｌ）が挙げられる。カルパインインヒビターは、ウイルスベクターに関して細胞の感染性を増大すること、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１転写因子のレベルを増大することによりプロモーターからの転写を増強すること、ならびにアデノウイルスベクターに対するＣＴＬ応答を減弱することが観察されている。結果的に、本発明の処方物および方法は、必要に応じてカルパインインヒビターを含み得る。カルパインインヒビターおよびそれらの適用は、Ａｔｅｎｃｉｏら、同時係属の米国特許出願第６０／１０４，３２１号および同第０９／０７３，０７６号（１９９８年１０月１５日出願）に記載されている。
【００７５】
（使用方法）
本発明は、標的細胞と本発明の選択的複製ベクターとの接触による調節経路欠損で、細胞を殺傷する方法を提供する。本明細書において例示するように、本発明の１つの実施形態において、経路欠損を有する細胞は、新生物細胞である。用語「新生物細胞」は、独立した正常細胞増殖制御により特徴付けられる異常な増殖表現型を示す細胞である。新生物細胞は、任意の所定の時点で必ずしも複製さないので、用語、新生物細胞は、活性に複製されているかまたは一時的な非複製休止状態（Ｇ１またはＧ０）にあり得る細胞を含む。新生物細胞の局所的集団は新生物と呼ばれる。新生物は、悪性または良性であり得る。悪性新生物はまた、ガンとも呼ばれる。用語、ガンは、本明細書において用語、腫瘍と互換可能に用いられる。新生物形質転換とは、新生物細胞、しばしば腫瘍細胞への正常細胞の転換をいう。
【００７６】
本発明は、本発明の組換えアデノウイルスの薬学的に受容可能な処方物の投与による、インビボでの哺乳動物生物体における新生物細胞の除去方法を提供する。用語「除去（ａｂｌａｔｉｎｇ）」は、新生物細胞の存在の生理学的疾病状態（ｍａｌａｄｉｃｔｉｏｎ）を軽減するような、生存可能な新生物細胞の集団の実質的な減少を意味する。用語「実質的な」は、哺乳動物生物体中の生存可能な新生物細胞の集団の、前処置集団の約２０％より大きい減少を意味する。用語「生存可能な」は、新生物細胞の制御されていない増殖特徴および細胞周期調節特徴を有することを意味する。用語「生存可能な新生物細胞」は、もはや複製し得ない新生物細胞とこの細胞を区別するために本明細書において使用される。例えば、腫瘍塊は、処置後も残存し得るが、腫瘍塊を含む細胞集団は死に得る。ある程度の腫瘍塊が残存し得るとしても、これらの死んだ細胞は、除去され、そして複製する能力が欠失している。
【００７７】
用語「哺乳動物生物体」は、ヒト、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコを含むがこれらに限定されない。好ましくは、処置される哺乳動物の型に内在性のアデノウイルスベクターを用いる。処置されるべき種由来のウイルスを使用することが一般に好ましいが、ある場合には、有利な病原性特性を有する異なる種から誘導されたベクターを用いることが有利であり得る。例えば、ヒトアデノウイルスベクターの免疫応答特性を最小限にするために、ヒツジのアデノウイルスベクターが、ヒト遺伝子治療において用いられ得ることが報告されている（１９９７年４月１０日公開、ＷＯ ９７／０６８２６）。免疫応答を最小限にすることにより、ベクターの迅速な全身的クリアランスが回避され、このベクターのより長い作用持続時間を生じる。
【００７８】
本発明のベクターは、乳房癌腫、肝細胞腫、胃の腫瘍、結腸腫瘍および皮膚の腫瘍、ならびにＢリンパ腫およびＴリンパ腫（ＭａｒｋｏｗｉｔｚおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９６）を含むがこれらに限定されないＴＧＦ−β抗増殖作用の欠失と関連する腫瘍の処置に、特に適応し得る。ＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターの変異は、結腸、胃、頭部および頸の扁平上皮癌腫において同定されている。Ｉ型レセプターの変異または欠失もまた、カポジ肉腫、乳房腫瘍、卵巣腫瘍および結腸直腸腫瘍において見出されている。ＴＧＦ−βシグナル伝達の細胞間エフェクターの中でも、Ｓｍａｄ、Ｓｍａｄ４／ＤＰＣ４が、膵臓ガンのほぼ５０％において変化した、腫瘍サプレッサー遺伝子の候補として同定された。ＤＰＣ４遺伝子の変化はまた、結腸腫瘍、乳房腫瘍および卵巣腫瘍において見出されているが、より低い頻度である。本発明のベクターは、膵臓ガンのようなＴＧＦ−β非感受性腫瘍の処置に特に適用可能である。
【００７９】
本発明のベクターはまた、ｐ５３経路欠損を含む腫瘍細胞の処置に適用可能である。これらの腫瘍は、ｐ５３、ｍｄｍ２およびｐ１４／ｐ１９ＡＲＦ（ＩＮＫ４ａ遺伝子）における変化を保有する腫瘍を含む。本発明のベクターはまた、Ｒｂ経路欠損を有するガン細胞の処置において有用である。Ｒｂ、サイクリンＤ、サイクリン依存性キナーゼ（例えば、ＣＤＫ４）およびｐ１６（ＩＮＫ４ａ遺伝子）における変化からＲｂ経路欠損が生じる。
【００８０】
本発明は、組換えアデノウイルス単独の使用の方法を提供するが、本発明の組換えアデノウイルスおよびそれらの処方物は、従来の化学療法剤または処置レジメンと組み合わせて使用され得る。このような化学療法剤の例としては、プリン合成のインヒビター（例えば、ペントスタチン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、メトトレキサート）またはピリミジン合成のインヒビター（例えば、Ｐａｌａ、アザリビン（ａｚａｒｂｉｎｅ））、リボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドへの変換のインヒビター（例えば、ヒドロキシウレア）、ｄＴＭＰ合成のインヒビター（５−フルオロウラシル）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、照射、ブレオマイシン、エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトザントロン、アルキル化剤、マイトマイシン、シスプラチン、プロカルバジン）、ならびに微小管機能のインヒビター（例えば、ビンカアルカロイドおよびコルヒチン）が挙げられる。化学療法処置レジメンとは、放射線療法のような新生物細胞を除去するために設計された非化学的な手順を主にいう。治療用遺伝子がｐ５３である場合の併用療法の例は、Ｎｉｅｌｓｅｎら ＷＯ／９８３５５５４Ａ２（１９９８年８月２０日公開）に記載されている。
【００８１】
免疫学的応答は、ウイルスベクターのインビボでの反復投与に対して重要である。従って、本発明のベクターは、免疫抑制剤と組み合わせて投与され得る。免疫抑制剤の例としては、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、リンパ球免疫グロブリン、ＣＤ３複合体に対する抗体、副腎皮質ステロイド、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌｚａｉｎｅ）、ＦＫ−５０６、メトキサレンおよびサリドマイドが挙げられる。
【００８２】
本発明はまた、エクスビボにおいて、新生物細胞により汚染された正常細胞の集団への、本発明の組換えアデノウイルスの投与により、この集団における新生物細胞を除去する方法を提供する。このような方法の適用の１例は、骨髄浄化（ｐｕｒｇｉｎｇ）として通常知られた自己の幹細胞産物の浄化のようなエクスビボの適用において、現在使用されている。用語「幹細胞産物」とは、筋切除（ｍｙｏａｂｌａｔｉｖｅ）治療を受けた患者の長期の造血機能を再構成し得る造血細胞、前駆細胞および幹細胞の集団をいう。幹細胞産物は、動員された末梢血または非動員末梢血のアフェレーシスにより従来得られる。アフェレーシスは、市販のアフェレーシス装置（例えば、ＣＯＢＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１１８５ Ｏａｋ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＣＯから市販される、ＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、公知の手順の使用を通じて従来達成される。処置条件は、「３対数の浄化（３−ｌｏｇ ｐｕｒｇｅ）」（すなわち、幹細胞産物からの腫瘍細胞の約９９．９％の除去）を達成するように最適化されることが好ましく、そして「５対数浄化」（幹細胞産物からの腫瘍細胞の約９９．９９９％の除去）を達成するように最適化されることが最も好ましい。本発明の好ましい実施において、１００ｍｌ容積の幹細胞産物は、本発明のベクターの約２×１０¹¹の粒子数対有核細胞の比で、３７Ｃで約４時間、処置される。
【００８３】
（診断的な適用）
上記の治療的な適用に加えて、本発明のベクターはまた診断目的にも有用である。例えば、本発明のベクターは、ウイルス感染または複製の際に発現されるレポーター遺伝子を組み込み得る。用語「レポーター遺伝子」は、その産物が、単独でまたはさらなるエレメントと組み合わせて、検出可能なシグナルを生成し得る遺伝子をいう。レポーター遺伝子の例としては、βガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光タンパク質遺伝子、Ｘ線または磁場画像化システム（ＭＲＩ）のような画像化システムにより検出可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。このようなベクターは、機能的経路（例えば、ｐ５３またはＴＧＦ−β経路）の存在を検出するために有用である。あるいは、このようなベクターはまた、蛍光標識された抗体のような結合分子により認識され得る細胞表面タンパク質を発現するために使用され得る。あるいは、経路応答性プロモーターが、ウイルス複製のリプレッサー（例えば、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ）を駆動するために用いられる場合、後期ウイルスプロモーター（例えば、Ｅ２Ｆ−Ｒｂにより停止されるＥ２、またはリプレッサー結合部位（例えばＥ２Ｆ結合部位）を有する任意の他のプロモーター）が、経路応答性プロモーターがオフである診断的な適用のためのレポーター遺伝子を駆動するために用いられ得る。これらの診断構築物は、インビボまたはインビトロにおいて診断目的のために用いられ得る。インビボ適用の例としては、Ｘ線、ＣＴスキャン、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの画像化適用が挙げられる。
【００８４】
（ベクターの調製方法）
本発明はさらに、上記の組換えウイルスを生成する方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：
ａ．組換えウイルスを用いてプロデューサー細胞を感染する工程、
ｂ．この感染したプロデューサー細胞中でウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で、このプロデューサー細胞を培養する工程、
ｃ．このプロデューサー細胞を収集する工程、および
ｄ．この組換えウイルスを精製する工程。
【００８５】
用語「感染させる」とは、プロデューサー細胞の組換えアデノウイルスでの感染を容易にする条件下で、組換えウイルスをプロデューサー細胞に曝露させることを意味する。所定のウイルスの複数のコピーによって感染された細胞において、ウイルス複製およびビリオンパッケージングに必要な活性は、協同的である。従って、プロデューサー細胞がウイルスに多重感染する有意な可能性が存在するように、条件を調整することが好ましい。プロデューサー細胞におけるウイルスの産生を増強する条件の例は、感染期におけるウイルス濃度の増加である。しかし、プロデューサー細胞あたりのウイルス感染の総数が過度であり、この細胞に対して毒性効果を生じ得る可能性がある。従って、１ｍｌあたり１×１０⁶〜１×１０¹⁰ビリオンの範囲、好ましくは、１ｍｌあたり１×１０⁹ビリオンのウイルス濃度での感染を維持するように努めるべきである。化学薬剤もまた、プロデューサー細胞株の感染性を増加させるために使用され得る。例えば、本発明は、カルパインインヒビターを含めることによって、ウイルス感染性についてプロデューサー細胞株の感染性を増加させるための方法を提供する。本発明の実施において有用なカルパインインヒビターの例としては、カルパインインヒビター１（Ｎ−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシナル（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎａｌ）としてまた公知である（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより市販される））が挙げられる。カルパインインヒビター１は、プロデューサー細胞の組換えアデノウイルスに対する感染性を増加させることが観察されている。
【００８６】
用語「プロデューサー細胞」とは、産生されるべき組換えアデノウイルスのウイルスゲノムの複製を容易にし得る細胞を意味する。種々の哺乳動物細胞株が、組換えアデノウイルスの培養のために公に利用可能である。例えば、２９３細胞株（ＧｒａｈａｍおよびＳｍｉｌｅｙ（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）は、Ｅ１機能における欠損を補完するように操作されており、そしてこの現在のベクターの産生のために好ましい細胞株である。他のプロデューサー細胞の例としては、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（公報ＷＯ／９７／００３２６、出願番号ＰＣＴ／ＮＬ９６／００２４４において記載される通り）が挙げられる。
【００８７】
用語「ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する」とは、ウイルスがプロデューサー細胞において増殖することを可能にするように、感染されたプロデューサー細胞についての条件を維持することを意味する。各細胞によって産生されるウイルス粒子の数を最大化するように、条件を制御することが望ましい。従って、温度、溶存酸素、ｐＨなどのような反応条件をモニターおよび制御することが必要である。ＣｅｌｌｉＧｅｎ Ｐｌｕｓ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．４４ Ｔａｌｍａｄｇｅ Ｒｏａｄ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪから市販される）のような市販のバイオリアクターは、このようなパラメーターをモニターおよび維持するための設備を得有する。感染条件および培養条件の最適化は幾分変化するが、しかし、ウイルスの効率的な複製および産生のための条件は、プロデューサー細胞株の公知の特性、ウイルスの特性、バイオリアクターの型などを考慮して当業者によって達成され得る。２９３細胞をプロデューサー細胞株として使用する場合、酸素濃度は、約５０％〜約１２０％の溶存酸素、好ましくは１００％の溶存酸素で、好ましくは維持される。ウイルス粒子の濃度（例えば、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムを使用してＨＰＬＣのような従来の方法によって決定される）が、プラトーに達し始めた時に、このリアクターを収集する。
【００８８】
用語「収集する」とは、培地からの組換えアデノウイルスを含む細胞の採集を意味する。これは、差示的遠心分離またはクロマトグラフィー手段のような従来の方法によって達成され得る。この段階で、この収集された細胞を保存し得るか、または溶解および精製によってさらに処理して、組換えウイルスを単離し得る。保存のために、この収集された細胞は、生理学的ｐＨで、またはその付近で緩衝化させて、そして−７０Ｃで凍結させるべきである。
【００８９】
用語「溶解」とは、プロデューサー細胞の破壊をいう。溶解は、当該分野で周知の種々の手段によって達成され得る。プロデューサー細胞からウイルス粒子を単離することが所望される場合、この細胞を、当該分野で周知の種々の手段を使用して溶解させる。例えば、哺乳動物細胞を、低圧（１００〜２００ｐｓｉの圧力差）条件下で溶解させ得るか、または従来の凍結融解法で溶解させ得る。外因性の遊離ＤＮＡ／ＲＮＡは、ＤＮＡｓｅ／ＲＮＡｓｅでの分解によって除去される。
【００９０】
用語「精製する」とは、組換えウイルス粒子の実質的に純粋な集団の、この溶解させたプロデューサー細胞からの単離を意味する。クロマトグラフィー方法または差示的密度勾配遠心分離方法のような従来の精製技術を使用し得る。本発明の好ましい実施において、ウイルスは、同時係属中の米国特許出願番号０８／４００，７９３（１９９５年３月７日出願）に記載のように、Ｈｕｙｇｈｅら（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４０３−１４１６のプロセスに実質的に従って、カラムクロマトグラフィーによって精製される。
【００９１】
本発明の組換えアデノウイルスの産生を最適化するためのさらなる方法および手順は、Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓという表題の同時係属中の米国特許出願番号０９／０７３，０７６（１９９８年５月４日出願）において記載される。
【００９２】
（実施例）
以下の実施例は、特定の組換えアデノウイルスベクターおよびプラスミドベクターの構築を実証する実験の、方法および結果を提供する。本発明が、本発明の精神または本質的特徴から逸脱することなく、これらの実施例に具体的に開示される形態以外の形態で具体化され得ることは、本発明が属する当業者に明らかである。本発明の特定の実施形態が以下に記載されるため、限定ではなく例示としてみなされるべきである。以下の実施例において、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ＦＢＳ」は、ウシ胎仔血清を意味し、そして「ＰＮ」は、組換えウイルスの粒子数をいう。
【００９３】
（実施例１．プラスミド構築）
ｐ８００ｌｕｃ（８００ｂｐのＰＡＩプロモーターの制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミド）を、Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ Ｌｕｓｋｕｔｏｆｆ（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｆｏｒｎｉａ）から得た。Ｅ２Ｆ−ＲＢ融合タンパク質のコード配列の上流に、ＣＭＶプロモーター、それに続くアデノウイルス−５の３部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列、ならびにＳＶ４０エンハンサーを含む、プラスミドｐＣＴＭＩＥ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを、Ｄｏｕｇ Ａｎｔｅｌｍａｎ（Ｃａｎｊｉ）によって提供された。
【００９４】
（実施例２．ＴＧＦ−β応答性プロモーターを有するルシフェラーゼプラスミドの構築）
（Ａ．ＰＡＩ−ルシフェラーゼプラスミド：）
全てのフラグメントの配列は、５’−３’方向に示す。５’末端および３’末端で、それぞれＳａｃＩ部位およびＸｈｏＩ部位、そしてそのプロモーター内のネイティブＴＡＴＡボックスに代わるＳＶ４０ ＴＡＴＡボックスで隣接される、７４９ｂｐフラグメントを、テンプレートとしてｐ８００ｌｕｃ、およびプライマーＡＧＴ ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＣＣ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＧＡ（配列番号１）およびＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＧＧ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＣＣ（配列番号２）（ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックスを含む）を使用するＰＣＲによって増幅した。この得られたＰＣＲ産物を、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＰＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロモーターを含まないルシフェラーゼ構築物（Ｐｒｏｍｅｇａ）の消化後に得られたフラグメントに連結させて、ＰＡＩ−ルシフェラーゼを得た。
【００９５】
（Ｂ．ＳＲＥ−ルシフェラーゼプラスミド：）
以下のオリゴヌクレオチド、ＧＧ ＴＡＴ ＴＴＡ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＡＴＣ（配列番号３）およびＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ＴＧＧ ＧＣＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＣＣ（配列番号４）をアニールさせた。このアニールさせた産物を、ＸｈｏＩで消化し、そしてＭｌｕＩで消化したＰＧＬ３−ｂａｓｉｃに連結し、Ｋｌｅｎｏｗで平滑末端化し、そしてＸｈｏＩで消化して、ｐＳＶＴ−ｌｕｃ（ＳＶ４０ ＴＡＴＡボックスを有するルシフェラーゼ構築物）を得た。Ｓｍａｄ４／ＤＰＣ４結合部位を含むオリゴヌクレオチド、ＣＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＴＧＴ ＡＣ（配列番号５）およびＡＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＧＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＡＣ（配列番号６）をアニールさせて、そしてＫｐｎＩで消化したｐＳＶＴ−ルシフェラーゼに連結して、ＳＲＥ−ルシフェラーゼプラスミドを得た。
【００９６】
（実施例３ ｐ５３応答性プロモーターを有するルシフェラーゼプラスミドの構築）
（Ａ．ＲＧＣ−ルシフェラーゼプラスミド：）
リボソーム遺伝子クラスター由来のｐ５３結合部位を含む、２つの相補的５’−リン酸化オリゴヌクレオチド、ＡＧ ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＡＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＧＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＴＡＣ（配列番号７）およびＣＡ ＣＧＡ ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＣＴ ＴＧＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＣＣＴ ＴＴＴ ＣＴＧ ＴＡＣ（配列番号８）をアニールさせた。このアニールさせたフラグメントを、ＫｐｎＩで消化したｐＳＶＴ−ルシフェラーゼに連結して、ＲＧＣ−ルシフェラーゼプラスミドを得た。
【００９７】
（Ｂ．ｐ５３ＣＯＮ−ルシフェラーゼプラスミド：）
コンセンサスｐ５３結合部位（ｐ５３ＣＯＮ）を含む、２つの相補的５’−リン酸化オリゴヌクレオチド、ＣＴ ＣＧＡ ＣＧＧ ＡＣＡ ＴＧＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＣＧ ＡＣＧ ＧＡＣ ＡＴＧＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＡＣ（配列番号９）およびＡＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＧＧ ＧＣＡＴＧＴ ＣＣＧ ＴＣＧ ＡＧＧ ＴＡＣ（配列番号１０）をアニールさせた。このアニールさせたフラグメントを、ＫｐｎＩで消化したｐＳＶＴ−ルシフェラーゼに連結して、ｐ５３ＣＯＮ−ルシフェラーゼプラスミドを得た。
【００９８】
（Ｃ．ＰＡＩ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂプラスミド：）
プラスミドｐＣＴＭＩＥ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂにおける、Ｅ２Ｆ−ＲＢ融合タンパク質のコード配列の上流の、ＣＭＶプロモーター、それに続くアデノウイルス−５の３部分（Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列、ならびにＳＶ４０エンハンサーを含む配列を、ＢｇｌＩおよびＸｂａＩで消化することによって切り出し、そしてこの生じたフラグメントを連結して、プロモーターを含まないＥ２Ｆ−ＲＢプラスミドを得た。改変型ＰＡＩプロモーターを含むフラグメントを、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化することによって、プラスミドＰＡＩ−ルシフェラーゼから切り出し、そしてＫｌｅｎｏｗでの処理によって平滑末端化した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化した、プロモーターを含まないＥ２Ｆ−ＲＢプラスミドに連結し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して、ＰＡＩ−Ｅ２Ｆ−ＲＢプラスミドを得た。
【００９９】
（実施例４：組換えアデノウイルスの生成）
ＢａｍＨＩ、ＡｃｃＩおよびクレノウで処理したｐＮＥＢ１９３（ＮＥＢ由来のプラスミド）にｐＢＨＧ１１由来の７．４ｋｂ ＳｎａＢＩフラグメント（２６６７６〜３４１４０）をクローニングすることにより、Ｅ３領域に３ｋｂの欠失を有するＡｄ５配列を含む移入プラスミド（ｐＮＥＢΔＥ３）を、構築した。、マルチクローニング部位を、５−リン酸化オリゴヌクレオチド：
【０１００】
【化１】

をアニーリングし、そしてこのアニールしたフラグメントをＰａｃＩ消化したｐＮＥＢΔＥ３に連結して導入することにより上記のプラスミドに導入して、ｐＮＥＢΔＥ３（ＭＣＳ）プラスミドを得た。
【０１０１】
ＰＡＩプロモーターの制御下のＥ２Ｆ−ＲｂおよびＣＭＶプロモーターの制御下の増強グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする組換えアデノウイルスを生成するための移入プラスミドを、以下のとおりに作製した。ＮａｃＩおよびＸｂａＩでＰＡＩ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを消化することにより調製した、ＰＡＩプロモーターおよびＥ２Ｆ−Ｒｂコード配列を含むフラグメントを、ＫｐｎＩで消化し、クレノウで処理し、そしてＸｂａＩで再消化することにより調製したｐＡＢＳ．４プラスミド（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）フラグメントに連結することにより、中間ベクターｐＡＢＳ．４−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを調製した。次いで、ＰＡＩプロモーター、Ｅ２Ｆ−Ｒｂコード配列およびカナマイシン遺伝子を含むフラグメントを、ＰａｃＩで消化することによりプラスミドＡＢＳ．４−Ｅ２Ｆ−Ｒｂから切り出し、クレノウで処理し、そしてｐＮＥＢΔＥ３プラスミドをＰａｃＩで消化し、クレノウで処理することにより得たこのプラスミドフラグメントに連結して、ＰａｃＩ部位を含んでいないプラスミドＮＥＢΔＥ３−ＰＡＩ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを得た。ｐＮＥＢΔＥ３−ＰＡＩ−Ｅ２Ｆ−ＲｂをＳｗａＩで消化し、そしてこれをＡｆＩＩＩおよびＳｓｐＩで消化してクレノウで処理することによりｐＥＧＦＰ−Ｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離したフラグメントに連結することにより、このプラスミドにおけるカナマイシン遺伝子を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターと置換して、ｐΔＥ３−ＰＡＩ−Ｒｂ−ＧＦＰプラスミドを得た。
【０１０２】
ＳＲＥとともにＴＧＦ−β応答性プロモーターの制御下のＥ２Ｆ−ＲｂおよびＣＭＶプロモーターの制御下の増強グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする組換えアデノウイルスを生成するための移入プラスミドを以下のとおりに構築した。Ｅ２Ｆ−Ｒｂコード配列を、ＸｂａＩおよびＮｒｕＩでｐＮＥＢΔＥ３（ＭＣＳ）を消化することにより単離されたフラグメントと、ＸｂａＩおよびＮａｅＩでｐＣＴＭＩＥ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを消化することにより生成されたフラグメントとを連結することによって、プラスミドｐＮＥＢΔＥ３（ＭＣＳ）に導入して、プラスミドｐＮＥＢΔＥ３−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを得た。ＳＲＥを含むＴＧＦβ応答性プロモーターを、テンプレートとしてＳＲＥ−ルシフェラーゼ、およびリン酸化プライマー：
【０１０３】
【化２】

を用いるＰＣＲによりこの配列を増幅することで上記のプラスミドに導入した。得られたＰＣＲ産物をＳｐｅＩで消化し、そしてＳｎａＩおよびＸｂａＩ消化したｐＮＥＢΔＥ３−Ｅ２Ｆ−Ｒｂに連結して、ｐΔＥ３−ＤＰＣ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを得た。
【０１０４】
ｐ５３応答性プロモーターの制御下のＥ２Ｆ−ＲｂおよびＣＭＶプロモーター制御下の増強グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする組換えアデノウイルスを生成するための移入プラスミドを以下のとおりに構築した。リボソーム遺伝子クラスターまたはｐ５３コンセンサス部位（ｐ５３ＯＣＮ）に由来するｐ−５３結合部位を含有する、ｐ５３応答性プロモーターを、テンプレートとしてＲＧＣ−ルシフェラーゼまたはｐ５３−ＯＣＮ−ルシフェラーゼをおよびリン酸化プライマー：
【０１０５】
【化３】

を使用するＰＣＲによりこのプロモーター配列を増幅することによって、プラスミドｐＮＥＢΔＥ３−Ｅ２Ｆ−Ｒｂに導入した。得られたＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化し、そしてＳｎａＩおよびＸｂａＩ消化したｐＮＥＢΔＥ３−Ｅ２Ｆ−Ｒｂに連結して、ｐΔＥ３−ＲＧＣ−Ｅ２Ｆ−ＲｂおよびｐΔＥ３−ＰＣＯＮ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂを得た。
【０１０６】
（実施例５：組換えアデノウイルスを生成するための相同組換え）
組換えアデノウイルス（ＰＡＩ−Ａｄ、ＳＲＥ−Ａｄ、ＲＧＣ−ＡｄおよびＣＯＮ−Ａｄ）を、記載のように細菌にて相同組換えを行うことにより生成した（Ｃｈａｒｔｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５−４８１０）。移入プラスミドをＡｓｃＩで消化して、経路応答性プロモーターの制御下のＥ２Ｆ−ＲｂおよびＡｄ５配列に隣接したＣＭＶプロモーターの制御下のＧＦＰを含むフラグメントを得た。得られたフラグメントを、ＰＴＧ４６０９（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から市販され、そしてＣｈａｒｔｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５−４８１０に記載される）をＢｓｔＢＩおよびＳｐｅＩで消化することにより得られたフラグメントとともに、ＢＪ５１８３細菌株へ同時形質転換した。得られた細菌コロニーを所望の組換えＡｄ感染性プラスミド（ｐＰＡＩ−ＧＦＰ−Ａｄ、ｐＳＲＥ−ＧＦＰ−Ａｄ、ｐＲＧＣ−ＧＦＰ−Ａｄ、およびｐＣＯＮ−ＧＦＰ−Ａｄ）の存在についてスクリーニングした。次いで、これらの感染性プラスミドをＰａｃＩで消化することにより線状化し、そしてフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製し、そして２９３細胞のトランスフェクションのために使用した。
【０１０７】
トランスフェクションを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従って行った。２．５μｇの線状化プラスミドを、１２μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ／ウェルを有する６ウェルプレート中で増殖させた２５０，０００細胞のトランスフェクションのために使用した。８日後に、ウイルス生成に起因する細胞変性効果を観察した。細胞を培養上清とともに採取し、そして３回の凍結融解サイクルに供した。得られた溶解物中の組換えウイルスを、２９３細胞に再感染させることにより増幅した。
【０１０８】
（実施例６：細胞株）
この研究で使用した全ての細胞株をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得、そしてＣＯ₂インキュベーター中で３７℃に維持して単層培養物として増殖させた。２９３、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＲＣ９、Ａ５４９、Ｐａｎｃ１、Ｕ８７、Ｃａｃｏ２、ＭＣＦ−７およびＷＩＤＲを、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＨａｍ’ｓで培養したが、それに対して、ＭｉａＰａｃａ−２細胞を、１０％ウシ胎仔血清および２．５％ ウマ血清を補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。
【０１０９】
（実施例７：トランスフェクション）
細胞を、６ウェルプレート（２５０，０００細胞／ウェル）または２４ウェルプレート（６２，５００細胞／ウェル）のいずれかにプレートし、そして一晩接着させた。次いで、２９３細胞については、記載のようにリン酸カルシウム沈澱を用いて、および他の細胞についてはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従ってトランスフェクションを行った。
【０１１０】
（実施例８：レポーター／ルシフェラーゼアッセイ）
細胞を、１．５μｇのレポータープラスミドおよび１．０μｇのインヒビターでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、１×レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加して室温で１０分間インキュベートすることにより溶解物を調製した。ルシフェラーゼ活性を、Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）およびＰａｃｋａｒｄから市販されるアッセイキットを用いて、Ｐａｃｋａｒｄの指示に従って決定した。
【０１１１】
（実施例９：ウイルス媒介性細胞変性効果を測定するためのアッセイ）
細胞を、Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：３７３−３７６に記載の手順に実質的に従って、示した組み換えアデノウイルスまたは野生型アデノウイルスに感染させ、そして感染の６日後に、２０％エタノール中に調製した０．５％クリスタルバイオレットで染色した。
【０１１２】
（実施例１０：ｃＵ３ＥＥおよびｃＴ１ＬＴウイルスの構築）
ＭＬＰプロモーター配列を、テンプレートとしてプラスミドｐＦＧ１４０（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）中に存在するようなＡｄ５ ＤＮＡを用いて、プライマー：
【０１１３】
【化４】

を用いるＰＣＲにより増幅した。次いで、ＭＬＰ ＰＣＲ産物を、プラスミドｐΔＥ３−ＰＣＯＮ−Ｅ２Ｆ−ＲｂにおけるＰａｃＩ部位にクローニングして、ｐΔＥ３−ＰＣＯＮ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ−ＭＬＰを得た。アデノウイルスＥ３ １０．５Ｋタンパク質コード配列を、プライマー：
【０１１４】
【化５】

を用いるＰＣＲにより増幅し、そして得られたＰＣＲ産物を、プラスミドｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＸｈｏＩ部位にクローニングして、ｐＣＤＮＡ３−１０．５プラスミドを得た。次いで、アデノウイルスＥ３ １０．５Ｋタンパク質コード配列を、ＤｒａＩＩＩおよびＸｂａＩでの消化によりｐＣＤＮＡ３−１０．５から切り出し、次いで、クレノウ処理し、そしてＰａｃＩおよびクレノウ処理したｐΔＥ３−ＰＣＯＮ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ−ＭＬＰに連結して、ｐΔＥ３−ＰＣＯＮ−Ｅ２Ｆ−Ｒｂ−ＭＬＰ−１０．５Ｋプラスミドを得た。
【０１１５】
組換えアデノウイルスｃＵ３ＥＥおよびｃＴ１ＬＴを、記載のように（Ｃｈａｒｔｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５−４８１０）細菌において相同組換えを行うことにより生成した。移入プラスミドをＡｓｃＩで消化して、ｐ５３ＣＯＮ配列の制御下のＥ２Ｆ−ＲｂおよびＡｄ５配列に隣接したＭＬＰプロモーターの制御下のＥ３１０．５Ｋを含む配列を得た。得られたフラグメントを、ＢｓｔＩおよびＳｐｅＩｄでＰＴＧ４６０９（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を消化することによって得たフラグメントとともに、ＢＪ５２８３細菌株に同時形質転換した。得られた細菌コロニーを所望の組換えＡｄ５感染性プラスミドｐＣＥＭＤの存在についてスクリーニングした。Ａｄ５感染性プラスミドｐ０１／ＣＥＭＤを以下の類似のプロトコル（ＰＴＧ４６０９（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の誘導体を使用することを除く）により得た。ここで、野生型Ｅ１Ａ配列を、０１変異を有するＥ１Ａを含む配列と置換した。次いで、これらの感染性プラスミドを、ＰａｃＩで消化することにより線状化し、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱により精製し、そして２９３細胞のトランスフェクションのために使用した。
【０１１６】
プラスミドｐＣＥＭＤおよびｐ０１／ＣＥＭＤのトランスフェクションを、それぞれ、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って行い、組換えウイルスｃＵ３ＥＥおよびｃＴ１ＬＴを生成した。２．５μｇの線状化プラスミドを、１２μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ／ウェルを有する６ウェルプレート中で増殖させた５００，０００細胞のトランスフェクションのために用いた。８日後、ウイルス生成に起因する細胞変性効果を観察した。細胞を培養上清とともに採取し、そして３回の凍結融解サイクルに供した。得られた溶解物中の組換えウイルスを２９３細胞に再感染させることにより増殖させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＴＧＦ−β経路応答性プロモーター（ＰＡＩまたはＳＲＥ）またはｐ５３経路応答性プロモーター（ＲＧＣまたはｐ５３ＣＯＮ）のいずれかの制御下にＥ２Ｆ−Ｒｂ融合コード配列をコードする、組換えアデノウイルスベクターの細胞変性効果を決定するためのＣＰＥアッセイの結果を得た。さらに、グリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝子また、レポーターとしてこのベクターに取り込まれた。パネルＡはＭＲＣ−９細胞を表し、パネルＢはＨｅｐ３Ｂ細胞を表し、そしてパネルＣはＷＩＤＲ細胞を表す。レーン１：グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する複製欠損（Ｅ１欠失）組換えアデノウイルス；レーン２：ＰＡＩ−Ａｄ；レーン３：ＳＲＥ−Ａｄ；レーン４：ＲＧＣ−Ａｄ；レーン５：ｐ５３ＣＯＮ−Ａｄ。粒子濃度は、図の右に示す通りである。
【図２】 経路標的化ベクターを用いたＧＦＰ発現を示す、蛍光顕微鏡の結果（上のパネル）。パネルＡはＧＦＣＢコントロールベクターを表し、パネルＢはＳＲＥ−Ａｄベクターを表し、そしてパネルＣはｐ５３ＣＯＮ−Ａｄベクターを表す。感染は１ミリリットルあたり５×１０⁵粒子であった。
【図３】 組換えウイルスＵ３ＥＥ（四角）、Ｔ１ＬＴ（丸）およびＬ９ＩＵ（三角）による、正常な気管支上皮細胞（パネルＡ）およびＣ３３Ａ細胞（パネルＢ）の感染結果。垂直軸は非感染コントロールのパーセントを表し、そして水平軸は１ミリリットルあたりの粒子数でのウイルス用量を表す。この実験を、各細胞の培養物を、１ミリリットルあたりの１０⁵〜１０⁹個のウイルス粒子という６つの異なる濃度のウイルスに対して暴露することにより行った。この細胞を、１時間にわたってウイルスに暴露し、過剰なウイルスを洗浄し、そして感染後６日目の生存細胞のパーセントをＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）において製造業者の指示に実質的に従って決定した。水平線は、５０％の細胞が生存したままであるレベルを表す。このデータにより作成された曲線と水平な点線との交点は、ウイルスのＥＤ₅₀の尺度である。

Claims (11)

1. 選択的に複製する組換えアデノウイルスベクターであって、アデノウイルス複製のリプレッサーに作動可能に連結された経路応答性プロモーターを含み、ここで該経路応答性プロモーターが、ｐ５３経路応答性プロモーター、Ｒｂ経路応答性プロモーターおよびＴＧＦ−β経路応答性プロモーターからなる群より選択され、該アデノウイルス複製のリプレッサーが、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質であり、そして該ベクターは、該プロモーターが応答する経路の欠損を有する新生物細胞において選択的に複製する、ベクター。
2. トランスジーン発現カセットをさらに含む、請求項１に記載のベクター。
3. 前記トランスジーン発現カセットが、プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含む、請求項２に記載のベクター。
4. 前記プロモーターがＭＬＰである、請求項３に記載のベクター。
5. ｐ３００結合を除去するようにアデノウイルスＥ１ａコード領域において欠失をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
6. 前記アデノウイルスＥ１ａコード領域における欠失が、Ｅ１ａの２８９Ｒタンパク質および２４３Ｒタンパク質のアミノ酸４〜２５の欠失を含む、請求項５に記載のベクター。
7. 活性成分のための１以上の薬学的に受容可能なキャリアとともに、請求項１〜６のいずれか１項に記載の選択的に複製する組換えベクターを活性成分として含む薬学的処方物。
8. 経路の欠損を有する細胞を殺傷するエクスビボの方法であって、該細胞を、請求項１〜６のいずれか１項に記載の選択的に複製する組換えアデノウイルスに接触させることによる、方法。
9. アデノウイルス複製のリプレッサーに作動可能に連結された経路応答性プロモーターを含む選択的に複製する組換えアデノウイルスで形質転換された細胞であって、ここで該経路応答性プロモーターが、ｐ５３経路応答性プロモーター、Ｒｂ経路応答性プロモーターおよびＴＧＦ−β経路応答性プロモーターからなる群より選択され、該アデノウイルス複製のリプレッサーが、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質であり、そして該アデノウイルスは、該プロモーターが応答する経路の欠損を有する新生物細胞において選択的に複製する、細胞。
10. 請求項１に記載の選択的に複製するアデノウイルスベクターであって、ここで前記ｐ５３経路応答性プロモーターが、ｐ５３ＣＯＮおよびＲＧＣからなる群より選択される、アデノウイルスベクター。
11. 請求項１に記載の選択的に複製するアデノウイルスベクターであって、ここで前記ＴＧＦ−β経路応答性プロモーターが、ＰＡＩおよびＳＲＥからなる群より選択される、アデノウイルスベクター。

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