CN1330715A - 选择性复制的病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供重组病毒,所述重组病毒通过利用途径效应启动子,随着靶细胞的细胞内环境选择性地复制所述病毒的基因组,所述途径效应启动子基于被感染细胞的表型或基因型在宿主细胞中显著抑制病毒复制。在所述靶细胞中,所述途径效应启动子的启动子元件是失活的,因此允许所述病毒复制。这导致:(1)通过所述病毒的自身裂解特性杀伤所述细胞,和/或(2)提供针对所述靶细胞的治疗剂量(相对于不能复制的载体增加)的转基因产物,以及(3)产生局限性浓度的所述病毒,促进周围的细胞感染所述重组病毒。本发明还提供使用所述载体的治疗和诊断方法、含所述载体的药用制剂、制备所述载体及含所述载体的转化细胞的方法。

Description

选择性复制的病毒载体
                     发明背景
重组腺病毒目前在各种治疗方案中用于传送治疗性转基因。然而，这类载体系统的广泛感染性已经引起对所述病毒在非肿瘤细胞中的表达可能引起对非赘生性细胞的伴随损伤的担心。因此，已经开发了各种导向系统，以在特定的细胞类型中优先表达所述转基因。组织特异性启动子和肿瘤特异性启动子已经用于在某些细胞类型中优先复制所述载体。例如，1997年1月16日公开的国际专利申请号PCT/US96/10838(国际公开号WO97/01358)描述了载体的应用，所述载体利用驱动E1、E2或E4功能的前列腺特异性启动子元件在特定的宿主细胞中复制，所述启动子元件任选地可含有细胞毒性转基因表达盒。具体而言，该说明书描述一种构建物，其中前列腺特异性增强子控制E1的表达，并具有一个含CMV启动子的表达盒，所述CMV启动子驱动插入到E3区中的胞嘧啶脱氨酶基因的表达。这些载体为可复制载体，并能够在特定细胞类型中包装入完整病毒体中。
使用肿瘤特异性启动子驱动病毒复制的一个可替代途径是使用特异性缺失的腺病毒E1b 55K蛋白编码序列。在1997年10月14日颁发的美国专利第5,677,178号中描述了在编码E1b 55K的核苷酸序列中含有缺损的重组腺病毒。然而，已经观察到这些组织或肿瘤特异性控制元件是“渗漏的”，即允许在非优选靶细胞的细胞类型中复制。
使用彻底消除E1功能的复制缺陷型腺病毒载体可替代所述类型的选择性复制载体。具体而言，已经使用消除E1、E2、E3并含有部分F4缺失的载体输送外源性转基因。已经使用这类载体向靶细胞输送p53基因。已经证明，外源性给予的野生型p53在p53缺失型(p53突变或p53无效)肿瘤细胞中的表达能够在该肿瘤细胞中诱导p53介导的凋亡。目前Schering Corporation和Introgen Corporation正在研制这类用于输送p53的病毒载体。此外，这些载体已经表现出可接受的毒理学特征和用于人类治疗用途的治疗效力，并在成年男子中进行治疗p53相关恶性肿瘤的II期临床试验。
复制缺陷型载体和选择性复制载体至少在理论上具有临床医生担心的设计缺点。因为复制缺陷型载体将不会在患者体内不受控地增殖，所以理论上它们具有更吸引人的安全性。但是，因为有效消除肿瘤需要感染相当大部分的待感染肿瘤细胞，所以通常使用摩尔数显著过量的载体，以确保治疗的有效性。因为选择性复制载体能够在患者体内复制并潜在性地突变成为可充分复制的载体，所以人们更多的是从前瞻性安全角度看待选择性复制载体问题。然而，通过保持所述病毒在特定条件下繁殖的本能，能够使这些载体扩散至肿瘤细胞周围。因为所述载体本身能够复制，所以要求这类载体的初始剂量较低。这从免疫学角度以及生产这类药物的经济理由来讲是有利的。因此，本领域中需要选择性复制载体，该载体解决了认识到的安全性问题，同时提高了治疗指数。
本发明通过提供含途径靶向性途径效应启动子的选择性复制腺病毒载体解决了这些问题，所述途径效应启动子驱动病毒复制阻遏物的表达，使得所述载体优先在所述途径缺陷的细胞中复制。本发明还提供包含此类载体的药用制剂。本发明还提供使用这类载体从正常细胞群中消除途径缺陷细胞的方法。
                       发明概述
本发明提供重组病毒，该重组病毒通过使用驱动病毒复制抑制物表达的途径效应启动子，随着靶细胞的细胞内环境选择性地复制所述病毒基因组，所述病毒复制抑制物基于被感染细胞的表型或基因型在所述宿主细胞中显著抑制病毒复制。在所述靶细胞中，所述途径效应启动子的启动子元件是失活的，因此允许所述病毒复制。这导致：(1)通过所述病毒的自然裂解特性杀伤所述细胞，和/或(2)提供针对所述靶细胞的治疗剂量(相对于不能复制的载体增加)的转基因产物，和(3)引起所述病毒在局部浓集，促进周围的靶细胞感染所述重组病毒。本发明还提供利用所述载体的治疗和诊断方法、包含所述载体的药用制剂、制备所述载体和含所述载体的转化细胞的方法。
                       附图简述
图1：检测编码E2F-Rb融合编码序列的重组腺病毒载体的细胞致病作用的CPE测定结果，所述编码序列处于或者TGF-β途径效应启动子(PAI或SRE)或者p53途径效应启动子(RGC或p53CON)控制之下。另外，还在所述载体中加入了编码绿色荧光蛋白的基因作为报道基因。A组代表MRC-9细胞，B组代表Hep3B细胞，C组代表WIDR细胞。泳道1：表达绿色荧光蛋白(GFP)的复制缺陷型(E1缺失)重组腺病毒；泳道2：PAI-Ad；泳道3：SRE-Ad；泳道4：RGC-Ad；泳道5：p53CON-Ad。在该图右侧标明了颗粒浓度。
图2：图示与途径导向性载体一起表达的GFP的荧光显微镜检查(上面各组)结果。A组代表GFCB对照载体，B组代表SRE-Ad载体，C组代表p53CON-Ad载体。以5×105颗粒/ml进行感染。
图3：用重组病毒U3EE(正方形)、T1LT(圆形)以及L9IU(三角形)感染正常支气管上皮细胞(A图)和C33A细胞(B图)的结果。纵轴表示未感染对照的百分率，横轴以颗粒/ml表示病毒剂量。通过将每种细胞的培养物暴露于六种不同浓度(105-109病毒颗粒/ml)的病毒，进行所述试验。将所述细胞暴露于所述病毒1小时，洗去过量的病毒，基本上按照生产商(Promega，Madison WI)的说明，用MTS分析检测在感染后的6天中活细胞的百分数。水平线代表50％的所述细胞保持存活状态的水平。由所述数据生成的曲线与水平点线的交叉点为所述病毒的ED50检测值。
                      发明详述
本发明提供含途径效应启动子的选择性复制重组病毒，所述途径效应启动子有效连接至一种病毒复制阻遏物。
术语“选择性复制”是指相对于另一种表型状态的细胞，能够在一种表型状态的细胞中优先复制的载体。不同表型状态的实例应当包括给定细胞类型的p53途径缺陷型细胞与正常细胞。优先复制的病毒显示，在给定的剂量水平，相对于在相同类型的正常(对照)细胞中的复制，所述病毒在靶细胞类型中的复制效率增加至少为5倍。为了测定病毒是否确实具有选择性，必须在考虑许多因素的情况下，相对于相同细胞类型的正常细胞，评价所述病毒在靶细胞中的复制能力。
最好是比较给定载体在具有被靶向条件的靶细胞中复制的能力与在不具有这种条件的相同类型正常细胞中复制的能力。例如，在病毒感染后的第一步是诱导所述细胞进入细胞周期，因为最高病毒复制效力所必需的因素仅存在于S期。然而，如果人们试图根据载体在肿瘤细胞中的选择性来评价载体的选择性，即相对于已经进入细胞周期的另一种细胞(例如无限增殖化细胞系或转化细胞系)评价载体在肿瘤细胞中的复制能力，则在某种程度上模糊了所述病毒对肿瘤细胞的选择性。另外，已经观察到不同细胞类型对给定病毒的感染性差别较大。尽管某些病毒例如腺病毒具有广泛的组织嗜性，但其它病毒更受限于它们感染的细胞类型。通过尝试评价给定病毒在感染性差别较大的细胞中的性能，难以确定缺乏效力是缘于所述载体在所述细胞中的性能，还是仅仅由于所述病毒根本不能感染所述细胞。通过评价在给定类型的靶细胞和正常细胞中的选择性，使得这种感染性作用最小。
还必须考虑所述病毒生命周期的时序性。例如，相对于感染后不久的正常细胞，即使是野生型载体似乎在肿瘤细胞中也具有选择性，因为所述细胞已进入细胞周期。但是，一旦所述病毒已经刺激所述细胞周期，则这种表观选择性随时间减弱。因此，在感染后评价选择性的时间必须足以避免正常细胞中的这种起始复制延迟。尽管所述起始延迟将随所使用的病毒类型改变，但本领域技术人员可以轻易测定这种起始延迟。
在确定给定的重组腺病毒是否在靶细胞类型中呈现选择性作用时，还必须考虑剂量的作用。例如，如果人们目标在于消除肿瘤细胞并通过细胞毒性检测该作用，则可以制备似乎按剂量的不同具有选择性细胞毒性的病毒。已经观察到足够高剂量的几乎任何病毒，不管其基因组被修饰的程度如何，仅由于存在已知的具有细胞毒性的病毒蛋白(例如在腺病毒，为六邻体)的作用而具有细胞毒性。同样地，即使科技文献可以将病毒称为“复制缺陷型”(提示所述病毒在缺乏能够互补该病毒缺陷的细胞系的情况下完全不能复制)，这样的病毒更精确地描述为“复制衰减型”。例如，通常称为“复制缺损型”或“复制缺陷型”的整个E1区缺失的腺病毒将在某种程度上复制，尤其是处于细胞周期中的细胞或快速分裂的细胞。正如Mulligan(1990，Science 260：926-932)观察到的：
尽管E1区的表达已经显示影响复制所必需的其它病毒基因产物
的表达(援引Horwitz，M.，载于Virology，B.N.Fields编辑(Raven，
New York，1990，第60章))，但是病毒复制似乎并不绝对需要E1
基因表达。E1缺损型病毒的早期特征证实，在高感染复数时，
所述E1区不是复制所必需的(援引Jones和Shenk(1979)PNAS
(USA)76(8)：3665-3669)。因此，在确定病毒是否以选择性方式复制时，病毒剂量的作用不能被忽视。
评价病毒对靶细胞的复制选择性的一个方法是使用如下的评价病毒的“选择性指数”。通常使用的参数ED50(定义为足以诱导50％的所述细胞死亡的剂量)提供了合适的比较基础。通过典型的体外剂量扩大试验可以轻易测定病毒的ED50。为了确保比较基础最大程度地一致，相对于病毒对照表示ED50是最合适的，以使待比较的细胞类型之间的感染性变化和任何测定变异的作用最小。因此，无单位比率：ED50(病毒)/ED50(对照)用于表示所述病毒在所述细胞中的相对毒性，并将其称为“相对毒性指数”或“RTI”。给定病毒的“选择性指数”表示为：RTI(靶细胞)/RTI(正常细胞)比。选择性复制载体将具有至少为10的选择性指数，但优选为50、100或更高。
例如，设计选择性复制的腺病毒载体U3EE和T1LT以实现选择性复制和杀伤具有p53途径缺陷的肿瘤细胞。基本上按照本文实施例的讲述制备U3EE。简而言之，所述U3EE病毒包含一个含有驱动E2F-Rb融合蛋白表达的p53效应元件(p53 CON)的第一表达盒。E2F-Rb融合蛋白是腺病毒E2启动子活性的有效抑制物，其在所述细胞中的存在将有效抑制病毒复制。所述p53效应元件在功能性p53途径存在下是有活性的。因此，在p53途径完整的正常细胞中，所述U3EE病毒将表达E2F-Rb融合蛋白，并且该病毒将不复制。然而，在p53途径缺损的细胞(大多数肿瘤细胞)中，所述p53CON效应元件是无活性的，因此不存在对病毒复制的抑制。所述U3EE载体还包含一个含有驱动Ad5 E3-10.5K原凋亡(pro-apoptotic)基因表达的MLP启动子的表达盒。在使用原凋亡基因时最好使用所述时序启动子(例如MLP启动子)，因为人们希望在激活原凋亡信号之前促进病毒DNA在所述靶细胞中的复制。MLP启动子大约在感染后7小时被激活，在激活以后如果U3EE基因组复制，则诱导E3-10.5K蛋白的活性。所述T1LT腺病毒载体与所述U3EE载体基本相同，只是T1LT腺病毒载体在E1a区中含有其它的缺失以去除243R和289R腺病毒E1a蛋白的氨基酸4-25。此缺失破坏了p300蛋白结合这些E1a蛋白的能力。
使用L9IU载体作为对照，评价U3EE和T1LT病毒在正常人支气管上皮细胞(NHBE)和C33A(具有p53缺陷途径的上皮肿瘤细胞系)中复制的能力以及杀伤该细胞的能力。这些试验的结果示于附图的图3。下表概述了所获得的数据：
              表1.病毒RTI和选择性指数的总结
    病毒 RTI(正常细胞) RTI(肿瘤细胞) 选择性指数
    L9IU      1.0      1.0     1.0
    U3EE     12.5    0.0233     536
    T1LT      10    0.066     152
由所示数据可见，U3EE和T1LT病毒对肿瘤细胞具有高选择性。如前所论述，相对于休眠的正常细胞，L9IU病毒在处于周期中的肿瘤细胞中具有轻微的复制优势。通过在计算选择性指数之前比较每种细胞类型的ED50(病毒)/ED50(对照)比率，可使这种变化的作用最小化。
术语“重组”是指已经通过常规的重组DNA技术进行修饰的基因组。
术语“病毒”是指任何不具有蛋白合成机制或能量产生机制的专性细胞内寄生物。所述病毒基因组可以是包含在脂质膜蛋白的包膜结构中的RNA或DNA。用于实施本发明的病毒的实例包括杆状病毒科、细小病毒科、小RNA病毒科(picornoviridiae)、疱疹病毒科(herepesviridiae)、痘病毒科、腺病毒科、小转移RNA病毒科(picotrnaviridiae)。术语重组病毒包括嵌合(乃至多嵌合)病毒，即采用互补编码序列由一个以上的病毒亚型构建的载体。参见例如Feng等，Nature Biotechnology 15：866-870。
术语“腺病毒”与术语“腺病毒载体”同义，是指腺病毒科的病毒属。术语腺病毒科总起来说是指乳腺病毒属的动物腺病毒，包括但不限于人、牛、绵羊、马、犬、猪、鼠和猿腺病毒亚属。具体而言，人腺病毒包括a-F亚属以及它们各自的血清型，各自的血清型和A-F亚属包括但不限于人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11A和Ad11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型。术语牛腺病毒包括但不限于牛腺病毒1、2、3、4、7和10型。术语犬腺病毒包括但不限于犬腺病毒1型(CLL、Glaxo、RI261、Utrect、Toronto26-61病毒株)和2型。术语马腺病毒包括但不限于马腺病毒1型和2型。术语猪腺病毒包括但不限于猪腺病毒3和4型。在本发明的优选实践中，所述腺病毒得自人腺病毒血清型2或5。
术语“途径效应启动子”是指DNA序列，该序列结合某种蛋白并引起邻近基因对正常细胞的该蛋白结合作转录性应答。可以通过加入效应元件制备这类启动子，所述效应元件为与转录因子结合的序列。这种效应通常是诱导性的，但是存在蛋白水平的增加降低转录的一些情况。途径效应启动子可以是天然产生或者合成获得。途径效应启动子通常根据途径或被靶向的功能性蛋白构建。例如，天然产生的p53途径效应启动子包括由于存在功能性p53(如p21或bax启动子)而被激活的转录控制元件。或者，可以使用含最小启动子(例如SV40TATA盒区)上游p53结合位点的合成启动子产生合成途径效应启动子。合成途径效应启动子通常由一个或多个拷贝的匹配共有结合基元的序列构建。这种共有DNA结合基元易于测定。这种共有序列通常以直线或以被几个碱基对分隔的头-尾重复序列排列。含头-头重复序列(例如AGGTCATGACCT)的元件称为回文序列或反向重复序列，而那些含尾-尾重复序列的元件称为反卷重复序列。
用于实施本发明的途径效应启动子的实例包括含共有胰岛素结合序列的合成性胰岛素途径效应启动子(Jacob等，(1995).J.Biol.Chem.270：27773-27779)、细胞因子途径效应启动子、糖皮质激素途径效应启动子(Lange等(1992)J Biol Chem 267：15673-80)、IL1和IL6途径效应启动子(Won K.-A和Baumann H.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3965-3978)、T3途径效应启动子、含共有基元5′AGGTCA 3′的甲状腺激素途径效应启动子、TPA途径效应启动子(TRE)、TGF-β途径效应启动子(如在Grotendorst等，(1996)Cell Growth and Differentiation 7：469-480中所述)。其它途径效应启动子的实例是本领域众所周知的，并可以在通过国际互联网http：//www.eimb.rssi.ru/TRRD获得的真核生物基因组转录调节区数据库中对其进行鉴定。
本文列举的本发明的优选实践中，所述载体包含在功能性TGF-β途径存在下有活性的合成性TGF-β途径效应启动子，诸如含SRE和PAI-RE效应元件的启动子。PAI-RE是指包含TGF-β信号、分离自纤溶酶原激活物-I启动子区的效应序列的合成TGF-β效应元件。PAI-RE的构建描述于本文的实施例3。所述PAI-RE途径效应启动子可以作为分离自质粒p800luc的一个749个碱基对片段分离(如在Zonneveld等，(1988)PNAS 85：5525-5529中所述并可以登录号J03836由GenBank获得)。SRE是指包含重复的4个Smad-4 DNA结合序列(GTCTAGAC，如在Zawel等，(1988)Mol.Cell1：611-617中所述)的合成TGF-β效应元件。SRE的构建描述于本文的实施例3。所述SRE效应元件可以通过退火编码Smad-4结合序列的互补寡核苷酸并在质粒pGL#3-启动子荧光素酶载体(购自ProMega)中克隆而产生。
同样地，“p53途径效应启动子”是指在功能性p53途径存在下有活性的转录控制元件。所述p53途径效应启动子可以是在功能性p53途径存在下有活性的天然产生的转录控制区，例如p21或mdm2启动子。或者，所述p53途径效应启动子可以是在功能性p53途径存在下有活性的合成性转录控制区，例如SRE和PAI-RE途径效应启动子。p53-CON代表一个含合成p53效应元件的p53途径效应启动子，它通过在SV40 TATA盒的上游插入两个合成p53共有DNA结合序列(如在Funk等，(1992)Mol.Cell Biol.12：2866-2871中所述)而构建。p53-CON途径效应启动子的构建描述于本文的实施例3。RGC是指使用单一p53结合域的、在核糖体基因簇中鉴定的合成p53途径效应启动子。Kern等(1991)Science 252：1708-1711和Park等(1996)MolecularCarcinogenesis 16：101-108。p53CON和RGC效应元件可以通过退火互补寡核苷酸构建，而p53效应启动子可以通过在质粒pGL3-启动子荧光素酶载体(可购自ProMega)中克隆构建(在实施例3中更充分地描述)。
术语“靶细胞”是指希望通过给予治疗性转基因处理的特定表型状态的细胞。通过使用各种途径效应启动子元件，人们可以将所述病毒的表达导向具有完整途径的任何特定细胞。例如可以在赘生性靶细胞中，通过使用TGF-β或p53途径效应启动子表达病毒复制阻遏物。同样地，可以在关节炎靶细胞中，通过炎症效应启动子表达病毒复制阻遏物，其中所述载体可选地编码IL-10。
术语“有效连接的”是指多核苷酸元件以功能性关系连接。当一个核酸序列与另一个核酸序列处于功能性关系时，该核酸序列是“有效连接的”。例如，启动子或增强子如果影响编码序列的转录，则该启动子或增强子与所述编码序列有效连接。有效连接意指所连接的核苷酸序列通常是连续的。然而，因为增强子通常在与所述启动子相隔几千个碱基时起作用，并且内含子序列的长度可以变化，所以某些多核苷酸元件可以有效连接但不直接位于侧翼，甚至可以在不同等位基因或染色体的易位中起作用。
术语“病毒复制阻遏物”是指如果在给定细胞中表达，显著阻遏病毒复制的蛋白。正如本领域的技术人员将预见到的，所述病毒复制阻遏物将取决于衍生本发明重组载体的亲代腺病毒载体的性质。例如，当为腺病毒载体或其它DNA肿瘤病毒时，可以使用E2F-Rb融合构建物，该构建物描述于1995年12月6日公开的欧洲专利申请第94108445.1号(公开号0685493A1)。E2F-Rb融合蛋白由融合Rb生长抑制域(野生型Rb蛋白的氨基酸379-928)的人E2F转录因子蛋白(野生型E2F的氨基酸95-286)的DNA结合域和DP1杂二聚化域组成。E2F-Rb融合蛋白是E2F依赖性转录的有效阻遏物，并使细胞停滞在G1期。所述DNA结合域位于氨基酸128-193，而所述二聚化域位于氨基酸194-289。人E2F-1蛋白的序列根据登录号M96577由GenBank(1992年8月10日收录)获得。当构建用于其它物种的载体时，可以使用来自其它物种的其它E2F家族成员的E2F序列。在所述重组病毒是基于腺伴随病毒(AAV)的情况下，不存在腺病毒感染时，rep蛋白及其衍生物是病毒复制的有效阻遏物。在所述病毒是衍生自单纯疱疹病毒的情况下，ICPO-NX蛋白(立即早期蛋白ICPO的缺失形式(Liun等，(1998)J.Virol.72：7785-7795))可以用作病毒复制的有效阻遏物。同样地，任何显性失活活性的蛋白都可以用作病毒复制的阻遏物。
TGF-β和相关蛋白(包括活化素、抑制素以及BMP)是有效的天然抗增殖剂，据信它们在抑制肿瘤发生中起重要作用。生物活性形式的TGF-β是一个25 kDa的二硫键连接的同型二聚体，并真正在所有人类组织中表达。有趣的是，许多恶性细胞类型保有见于正常细胞的表达模式。TGF-β通过I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的杂二聚化受体复合物发送信号。在这两种受体激酶中，II型受体具有内在的激酶活性，并在结合TGF-β配体时，II型受体与I型受体杂二聚化并对I型受体转磷酸。I型受体的磷酸化激活其激酶活性，这又导致细胞内效应子Smad的磷酸化。磷酸化的I型受体将信号传送到细胞内，导致如生长抑制的细胞反应。一旦在细胞核内，则已知Smad复合物或者通过它们自身作为转录因子起作用，或者通过调节其它转录因子的活性，激活靶基因的转录。据信由TGF-β信号调节的转录因子包括CTF/NF1、FAST-1、Spl、Jun、SRF/TRF、Oct和CREB。这些相互作用的最终结果导致各种已知的TGF-β的基因多效作用。
转化生长因子-β(TGF-β)和相关蛋白是许多细胞类型增殖的有效抑制物。几种上皮肿瘤和造血源性肿瘤的恶性发展与TGF-β的抗增殖和抗侵染作用的丧失有关。已经表明，TGF-β不能发送信号与所述受体和/或信号转导途径的细胞内效应子表达的突变或缺失或缺乏有关。许多抗TGF-β的恶性肿瘤的其它肿瘤抑制基因也多重缺损，因此限制了用于有效治疗的肿瘤抑制基因替换的实用性。
通过加入纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-启动子)的序列或SV40TATA盒上游的Smad4/DPC4(SRE-启动子)结合位点，构建TGF-β途径效应启动子。在瞬时转染测定中，使用荧光素酶作为报道基因，评价这些启动子的活性。结果示于下表2：
                表2.相对荧光素酶活性*(倍数)
  细胞系 TGF-β途径 PAI-启动子-TGF-β   PAI-启动子＋TGF-β   SRE启动子-TGF-β   SRE启动子＋TGF-β
Hep3B  正常   68.82   128.42   105.02    86.47
293  正常   51.62   88.78    9.40    46.94
A549  正常   33.26   56.76    2.87    17.93
Pancl  正常   15.36  141.80    1.14    29.03
U87  正常  110.40   73.88    7.42    7.85
MCF-7  缺损   18.93   10.72    1.28    1.22
Widr  缺损   10.66   4.41    1.24    1.57
MDA-MB468  缺损   2.28   1.10    1.33    0.62
AsPC-1  缺损    6.56   1.24    1.79    0.76
Caco2  缺损   13.01   13.8    1.18    0.96
MicaPaca2  缺损   14.08   1.81    0.79   26.34
*相对于用没有启动子的构建物获得的活性表达的荧光素酶活性。
这些结果证实，这两种启动子仅在具有功能性TGF-β信号转导的细胞中有活性。在TGF-β途径缺陷细胞系如MDA-MB468(它由于纯合缺失Smad4/DPC4而造成TGF-β信号转导缺陷)中，转染有效连接荧光素酶的PAI启动子或SRE启动子并用编码Smad4的重组腺病毒感染，恢复了以上两种效应元件的活性，这进一步证实这些含效应元件的启动子对TGF-β途径的特异性，正如下表3所示数据所证实的一样。
表3.用编码Smad4/DPC4的重组腺病毒感染时MDA-MB-468细胞TGF-β效应启动子活性的恢复(相对荧光素酶活性*(倍数))
   病毒     剂量  PAI-启动子-TGF-β   PAI-启动子＋TGF-β    SRE启动子-TGF-β   SRE启动子＋TGF-β
   BGCA    1×108     1.0     1.53     1.00     1.00
   BGCA    1×109    0.86     1.06     0.33     0.77
   DCCA    1×108    1.13     4.86     8.50    139.17
   DCCA    1×109    1.93    31.60    22.00    370.84
*相对于用未加入TGF-β的BGCA的构建物获得的活性表达的荧光素酶活性。BGCA是表达β-gal基因的重组腺病毒。DCCA是编码Smad4/DPC4的重组腺病毒。
然后构建含有效连接至E2F-Rb的PAI启动子的质粒，并测试其在具有完整TGF-β途径的细胞中选择性抑制E2启动子的能力。在瞬时转染测定中，连接荧光素酶的E2启动子与有效连接E2F-Rb的PAI启动子的共转染显示在293细胞(具有正常的TGF-β途径)中选择性抑制E2启动子活性，而不能在MDA-MB 468细胞(具有缺损的TGF-β途径)中选择性抑制E2启动子活性，如表4所示，这是因为E2F-Rb在293细胞中选择性表达。正如所预料的，与在这两种细胞系中都表达E2F-Rb的CMV-E2F-Rb的共转染在这两种细胞系中都抑制E2启动子的活性。
表4.在293细胞和MDA-MB-468细胞中PAI-E2F-Rb选择性抑制E2启动子活性(相对荧光素酶活性*(％))
      阻遏物 MDA-MB-468细胞          293细胞
        无       100            100
    CMV-E2F-Rb      9.38           10.53
    PAI-E2F-Rb     124.02           17.38
*以相对于用无启动子的构建物获得的活性的百分率表示荧光素酶活性。
通过加入已知的源自核糖体基因簇(RGC启动子)或者高亲和力p53结合位点(p53CON启动子)的p53结合位点，构建p53途径效应启动子。在瞬时转染测定中，使用荧光素酶作为报道基因，评价这些启动子的活性。这些试验的结果示于下表5。
表5.在各种细胞系中p53效应启动子的活性(相对荧光素酶活性*)
   细胞系     p53状态   p53 CON启动子   RGC启动子
U87     野生型     3,921.12    112.33
A549     野生型      647.30    16.36
MCF-7     野生型      445.25    12.26
293  野生型；失活      13.03    0.62
Hep3B      无效      4.62    1.22
NCI-H358      无效      0.35    0.56
Pancl     突变体      1.56    1.02
WIDR     突变体     16.17    1.07
MDA-Mb-468     突变体     4.88    0.87
AsPC-1     突变体     0.54    1.08
Caco-2     突变体    14.59    1.13
MicaPaca2      未知    28.43    1.24
*以相对于用没有启动子的构建物获得的活性表示荧光素酶活性。
结果表明，这两种效应元件在具有功能性p53的细胞中有活性。为了证实所述p53效应启动子活性是缘于功能性p53，用驱动荧光素酶基因表达的RGC启动子和或者空表达盒对照腺病毒载体(ZZCB)或者在CMV启动子控制下组成产生p53的重组腺病毒(FTCB)，共转染WIDR和U87两种细胞系。这些试验的结果示于表6。
表6.用编码p53的重组腺病毒感染时WIDR和U87细胞中恢复/增强的p53效应启动子活性(相对荧光素酶活性*)
   病毒     剂量     WIDR     U87
   ZCCB    1×108     1.0     1.0
   ZCCB    1×109     1.25     0.67
   FTCB    1×108     4.71    20.30
   FTCB    1×109    29.00   109.95
*相对于用ZZCB感染获得的活性表达的荧光素酶活性。
由所示数据可以看出，p53效应启动子活性以剂量依赖方式随p53活性的增加而增加。
产生处于或TGF-β途径效应启动子(PAI或SRE)或p53途径效应启动子(RGC或p53CON)控制下的编码E2F-Rb融合编码序列的重组腺病毒。另外，还在所述载体中加入编码绿色荧光蛋白的基因作为报道基因。测试产生的病毒的选择性复制能力和在细胞致病作用(CPE)测定中杀伤TGF-β途径缺陷或p53途径缺陷细胞的能力。结果示于附图中的图1。在MRC9(p53途径阳性和TGF-β途径阳性)中，野生型腺病毒甚至能以低浓度(1×106颗粒/ml)复制并诱导CPE，而TGF-β或p53途径导向载体在该浓度不能诱导CPE。途径导向载体仅在最高测试剂量(1×108颗粒/ml)显示一定的CPE。相反，在诸如WIDR(p53和TGF-β途径均缺损)和Hep3B(p53无效以及在没有外源性TGF-β的情况下TGF-β途径缺损)细胞系中，途径导向载体甚至在低浓度(1×106颗粒/ml)都和野生型病毒一样有效诱导CPE。荧光显微检测用途径导向载体(SRE-Ad和p53CON-Ad)感染的Hep3B细胞，结果显示甚至在低颗粒浓度(1×105颗粒/ml，暴露2小时)感染时，所述细胞都高水平表达所述转基因，并在培养物中扩散所述病毒。相反，用复制缺陷(E1A缺失)的编码GFP的腺病毒(GFCB)，以相同浓度(1×105颗粒/ml)感染Hep3B细胞，显示没有GFP表达。
如先前所指出的，本发明的载体能够选择性复制并能在选择条件下裂解靶细胞。然而，这并不意味着暗示不能将其它层面的选择性或毒性工程入这些载体。本发明还提供含病毒基因组其他修饰的重组腺病毒，如导向修饰、转基因表达盒或促进在特定细胞类型选择性复制或表型状态的病毒基因组修饰。
术语“导向修饰”是指为优先感染特定细胞类型而设计的病毒基因组修饰。在衍生自特征为广泛感染性的病毒(诸如腺病毒)的载体中，通过修饰病毒包膜蛋白，也可以实现细胞类型特异性或细胞类型导向性。例如，用腺病毒载体，通过选择性修饰病毒基因组染色纽和尾丝编码序列，实现与独特细胞表面受体特异性相互作用的修饰的染色纽和尾丝结构域的表达，已经实现了细胞导向。这种修饰的实例描述于Wickham等，(1997)J.Virol71(11)：8221-8229(在腺病毒尾丝蛋白中加入RGD肽)；Arnberg等，(1997)Virology 227：239-244(修饰腺病毒尾丝基因以获得对眼和生殖道的向性)；Harris和Lemoine(1996)TIG12(10)：400-405；Stevenson等，(1997)J.Virol.71(6)：4782-4790；Michael等，(1995)Gene Therapy 2：660-668(在腺病毒尾丝蛋白中加入胃泌素释放肽片段)；以及Ohno等，(1997)Nature Biotechnology 15：763-767(在Sindbis病毒中加入A蛋白-IgG结合域)。已经通过将抗体或抗体片段与包膜蛋白结合，获得细胞特异性导向的其它方法(参见例如Michael等，(1993)J.Biol.Chem.268：6866-6869，Watkins等，(1997)GeneTherapy 4：1004-1012；Douglas等，(1996)Nature Biotechnology 14：1574-1578)。另一方面，特定部分可以与病毒表面结合以实现细胞特异性导向(参见例如Nilson等，(1996)Gene Therapy 3：280-286(将EGF与逆转录病毒蛋白接合))。可以按照本发明的实践生产这些重组修饰的载体。
术语“转基因表达盒”是指在有效连接治疗性转基因的靶细胞中起作用的启动子。术语启动子是指影响另一个核苷酸序列转录的核苷酸序列。启动子的实例包括弱组成型启动子、时序病毒启动子或可调节启动子。
术语“时序启动子”是指相对于控制途径效应启动子表达的启动子，在病毒周期晚期的一个时间点驱动治疗性转基因转录的启动子。这种时序调节启动子的实例包括腺病毒主要晚期启动子(MLP)、其它启动子如E3。在本发明的优选实践中，使用MLP启动子。对于单纯疱疹病毒而言，可以使用潜伏激活启动子。
术语“可调节启动子”是指诱导型启动子、组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子。术语“诱导型启动子”是指优选(或仅)在某些条件下和/或应答外界化学物质或其它刺激物，促进所述治疗性转基因转录的启动子。诱导型启动子的实例在科学文献中是已知的(参见例如Yoshida和Hamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230：426-430；Iida等，(1996)J.Virol.70(9)：6054-6059；Hwang等，(1997)J.Virol71(9)：7128-7131；Lee等，(1997)Mol.Cell.Biol.17(9)：5097-5105；以及Dreher等，(1997)J.Biol.Chem.272(46)；29364-29371。辐射诱导启动子的实例描述于Manome等，(1998)Human Gene Therapy 9：1409-1417)。可以通过使用组织特异性或肿瘤特异性启动子赋予其它水平的选择性。组织特异性启动子和肿瘤特异性启动子是本领域众所周知的，包括优选在平滑肌中有活性的启动子(α-肌动蛋白启动子)、胰腺特异性启动子(Palmiter等，(1987)Cell 50：435)、肝特异性启动子(Rover等，(1992)J.Biol.Chem.267：20765；Lemaihne等，(1993)J.Biol.Chem.268：19896；Nitsch等，(1993)Mol.Cell.Biol.13：4494)、胃特异性启动子(Kovarik等(1993)J.Biol.Chem.268：9917)、垂体特异性启动子(Rhodes等，(1993)Genes Dev.7：913)、前列腺特异性启动子等。
术语“治疗性转基因”是指其在靶细胞中的表达产生治疗作用的核苷酸序列。术语治疗性转基因包括但不限于肿瘤抑制基因、抗原基因、细胞毒性基因、细胞静止基因、前体药物激活基因、凋亡基因、药用基因或抗血管生成基因。本发明的载体可以或者通过串联使用IRES元件，或者通过独立调节的启动子，用于生产一个或多个治疗性转基因。
术语“肿瘤抑制基因”是指其在靶细胞中的表达能够抑制赘生性表型和/或诱导凋亡的核苷酸序列。用于实施本发明的肿瘤抑制基因的实例包括p53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、成视网膜细胞瘤基因(Lee等，(1987)Nature329：642)、MMAC-1基因、腺瘤息肉大肠杆茵蛋白(Albertsen等，美国专利5,783,666号，1998年7月21日授予)、缺失的结肠癌(DCC)基因、MMSC-2基因、NF-1基因、位于染色体3p21.3.的鼻咽癌肿瘤抑制基因(Cheng等，1998.Proc.Nat.Acad.Sci.95：3042-3047)、MTS1基因、CDK4基因、NF-1基因、NF-2基因以及VHL基因。
术语“抗原基因”是指其在靶细胞中的表达导致产生能够被免疫系统识别的细胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。抗原基因的实例包括癌胚抗原(CEA)、p53(如在1994年2月3日公开的Levine，A的PCT国际公开号WO94/02167中的描述)。为了易于免疫识别，抗原基因可以和MHCI类抗原融合。
术语“细胞毒性基因”是指其在细胞中的表达产生毒性作用的核苷酸序列。此类细胞毒性基因的实例包括编码假单胞杆茵外毒素、蓖麻毒蛋白毒素、白喉(diptheroa)毒素等的核苷酸序列。
术语“细胞静止基因”是指其在细胞中的表达引起细胞周期停滞的核苷酸序列。此类细胞静止基因的实例包括p21、成视网膜细胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的基因如P16、p15、p18以及p19、Branellec等所述的生长抑制特异性同源框(GAX)基因(1997年5月9日公开的PCT公开号WO97/16459和1996年10月3日公开的PCT公开号WO96/30385)。
术语“细胞因子基因”是指其在细胞中的表达产生细胞因子的核苷酸序列。此类细胞因子的实例包括GM-CSF；白介素，尤其是IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-10、IL-19、IL-20；α、β和γ亚型干扰素，尤其是α-2b干扰素；以及诸如干扰素α-2α-1的融合体。
术语“趋化因子基因”是指其在细胞中的表达产生细胞因子的核苷酸序列。术语趋化因子是指一组结构上相关的低分子量细胞因子，所述细胞因子由结构上相关的并具有促有丝分裂活性、趋化活性或炎性活性的细胞分泌。它们主要为共享4个半胱氨酸残基的70-100个氨基酸残基的阳离子蛋白。这些蛋白可以根据两个N端半胱氨酸的间隔分为两组。在第一组中，所述两个半胱氨酸被单个残基分隔(C-x-C)，而在第二组中，它们是相邻的(C-C)。‘C-x-C’趋化因子成员的实例包括但不限于血小板因子4(PF4)、血小板碱性蛋白(PBP)、白介素-8(IL-8)、黑素瘤生长刺激活性蛋白(MGSA)、巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)、小鼠Mig(m119)、小鸡9E3(或pCEF-4)、猪尘细胞趋化因子I型和II型(AMCF-I和-II)、前B细胞生长刺激因子(PBSF)以及IL10。‘C-C’组成员的实例包括但不限于单细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单细胞趋化蛋白2(MCP-2)、单细胞趋化蛋白3(MCP-3)、单细胞趋化蛋白4(MCP-4)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1-α)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1-β)、巨噬细胞炎性蛋白1γ(MIP-1-γ)、巨噬细胞炎性蛋白3-α(MIP-3-α)、巨噬细胞炎性蛋白3β(MIP-3-β)、趋化因子(ELC)、巨噬细胞炎性蛋白4(MIP-4)、巨噬细胞炎性蛋白5(MIP-5)、LD78β、RANTES、SIS-ε(p500)、胸腺和活化调节趋化因子(TARC)、eotaxin、I-309、人蛋白HCC-1/NCC-2、人蛋白HCC-3、小鼠蛋白C10。
术语“药物蛋白基因”是指其表达导致产生的蛋白在靶细胞中具有药理作用的核苷酸序列。此类药物基因的实例包括胰岛素原基因和类似物(如PCT国际专利申请号WO98/31397中所述)、生长激素基因、多巴胺、血清素、表皮生长因子、GABA、ACTH、NGF、VEGF(增加对靶组织的血液灌流、诱导血管生成，1998年7月30日公开的PCT公开号WO98/32859)、血小板反应蛋白等。
术语“原凋亡基因”是指其表达导致所述细胞程序性细胞死亡的核苷酸序列。原凋亡基因的实例包括p53、腺病毒E3-11.6K(衍生自Ad2)或腺病毒E3-10.5K(衍生自Ad)、腺病毒E4orf4基因、p53途径基因以及编码caspases的基因。
术语“前体药物激活基因”是指核苷酸序列，该序列的表达产生能够将非治疗性化合物转变为治疗性化合物的蛋白，从而使得所述细胞对外界因子的杀伤敏感或引起所述细胞毒性状态。前体药物激活基因的实例是胞嘧啶脱氨酶基因。胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶(5-FC)转变为5-氟尿嘧啶(5-FU)，它是一种有效的抗肿瘤药物。肿瘤细胞的裂解在所述肿瘤的局部位置产生局部大量的能够将5FC转变为5FU的胞嘧啶脱氨酶，从而杀死许多周围肿瘤细胞。这导致杀死大量的肿瘤细胞，而不必用腺病毒感染这些细胞(所谓的“旁观者效应”)。另外，可以使用胸苷激酶(TK)基因(参见例如Woo等，1997年5月20日颁发的Freeman等的美国专利第5,631,236号，以及1997年2月11日颁发的美国专利第5,601,818号)，其中表达所述TK基因产物的细胞对给予9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(gancycloir)的选择性杀伤易感。
术语“抗血管生成”基因是指其表达导致细胞外分泌抗血管生成因子的核苷酸序列。抗血管生成因子包括制管张素、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂如Tie2(如在PNAS(USA)(1998)95：8795-8800中的描述)、内抑制素(endostatin)。
对本领域技术人员显而易见的是，修饰和或缺失以上提及的基因，以便编码所述野生型蛋白的功能性亚片段，可能易于实施本发明。例如，提及的p53基因不仅包括野生型蛋白，而且包括修饰的p53蛋白。这类修饰的p53蛋白的实例包括修饰p53以增加核保留、缺失诸如Δ13-19氨基酸以消除钙蛋白酶共有切割位点、对寡聚化结构域的修饰(如Bracco等在PCT公开申请号WO97/0492或美国专利第5,573,925号中所述)。
将对本领域技术人员显而易见的是，上述治疗基因可以分泌到培养基中，或由导向部分(诸如信号肽或核定位信号(NLS))的内涵体定位于细胞内特定的位置。在治疗性转基因的定义中还包括治疗性转基因和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)结构蛋白VP22的融合蛋白。含有所述VP22信号的融合蛋白当在感染细胞中合成时，输出到所述感染细胞之外，并有效进入周围直径约为16个细胞宽范围内的非感染细胞。此系统特别用于和转录活性蛋白(例如p53)结合，因而融合蛋白能够有效转运到周围细胞的细胞核中。参见例如Elliott，G.&O′Hare，P.Cell.88：223-233：1997；Marshall，A.&Castellino，A.Research News Briefs.NatureBiotechnology.15：205：1997，O′Hare等，1997年2月13日公开的PCT申请号WO97/05265。Vives等在(1997)J.Biol.Chem.272：16010-16017中还描述了一种衍生自HIV Tat蛋白的相似导向部分。
增加本发明载体效力的其它修饰包括但不限于E1内部改变、在E4中导入突变以增加细胞毒性(Muller等(1992)J.Virol.66：5867-5878)、上调病毒死亡蛋白如E4orf4或E3 11.6K蛋白。
在本文例举的本发明优选实践中，本发明的载体包含条件性复制的腺病毒，它含有驱动E2F-Rb融合蛋白表达的p53或TGF-β途径效应启动子，还含有处于时序性E3启动子控制下的胞嘧啶脱氨酶基因。在此情况下，胞嘧啶脱氨酶只在病毒复制之后的肿瘤细胞中产生。在本发明的优选实践中，所述前体药物转化基因处于相对弱的组织特异性启动子或肿瘤特异性启动子控制之下。
在本发明的另一实施方案中，所述载体包含具有驱动E2F-Rb融合蛋白表达的p53或TGF-β途径效应启动子的重组腺病毒和单独表达胞嘧啶脱氨酶或以含胞嘧啶脱氨酶的双顺反子表达盒的转基因表达盒，以及IRES元件和MIP-3-α蛋白。因为表达胞嘧啶脱氨酶，所以在给予如5-氟胞嘧啶的前体药物时实现了对肿瘤细胞的杀伤。低水平表达MIP-3-α将有助于形成抗肿瘤免疫。
在本文中可交替使用的多水平、多功能或多途径效应级联是指构建途径效应元件，以便产生治疗作用，在该治疗作用中可以同时探测到一个以上的途径。对本领域技术人员显而易见的是，可以组合如上所述的载体控制元件，以提供对本发明载体的多层选择性。作为多水平控制的实例，应该能够设计一种可复制并杀死Rb、TGF-β或p53途径缺陷细胞的条件复制腺病毒。这种载体将包括表达由p53效应启动子作为第一控制水平控制的病毒复制的显性失活抑制剂。结果，在任何具有功能性p53的细胞(例如所有的正常细胞)中，但不是在p53失活的细胞中，表达所述显性失活抑制剂并阻断所述病毒复制。然而，该载体可以在具有功能性p53但其它途径(如TGF-β和Rb途径)缺陷的肿瘤细胞中复制。因此，可以插入使功能性p53在肿瘤细胞中基本失活的其它水平的控制，由此当其他途径缺陷时允许病毒复制。
作为第二水平的控制，所述载体还应包括含腺病毒E1B-51K蛋白的表达盒，它可以在仅在TGF-β途径缺陷细胞中有活性的启动子控制下使p53功能失活。可以通过将阻遏物结合位点插入启动子中，使得使用TGF-β效应启动子在所述载体的其它位置表达所述阻遏物将导致在具有完整TGF-β信号转导的细胞中阻断所述启动子活性，从而构建仅在TGF-β途径缺陷细胞中有活性的启动子。在另一方面，在TGF-β途径缺陷的细胞中不合成所述阻遏物，所述启动子将因此有活性。因为E1B-55K由仅在TGF-β途径缺陷细胞中有活性的启动子表达，所以内源性p53失活。或者，可以使用任何由于TGF-β信号发送而下调的天然启动子。上述两种表达盒的内含物将确保仅在p53和TGF-β途径都正常时(导致复制阻断)表达显性失活抑制物，但在它们中的一个缺陷或两个都缺陷时(导致病毒复制)不表达。
作为第三水平的控制，在相同载体中实现了蛋白的表达，所述蛋白例如Smad7或任何其它显性失活形式的Smad，它能够使E2F效应启动子控制的TGF-β途径失活(Nakao等，Nature1997年10月9日；389(6651)：631-635)的。当Rb途径缺陷时，E2F效应启动子(诸如E2F1启动子、E2启动子或在最小启动子如SV40 TATA盒上游具有多个E2F结合位点的合成启动子)有活性。因为此第三水平的控制，在Rb途径缺陷细胞中，Smad7的表达又使Smad4失活，并阻断TGF-β信号转导。因此，制备E1B-55K和p53失活导致所述显性失活抑制物不能表达。因此，病毒复制可以不受妨碍地进行。另一方面，如果Rb途径正常，则Smad7不能合成，因此TGF-β信号转导正常进行。因此，不制备E1B-55K，导致功能性p53能够表达显性失活抑制物以阻断病毒复制。
在上述三种控制水平的情况下，所述三种途径(Rb、TGF-β以及p53)中的任何一种或两种或全部缺陷将最终导致病毒复制和细胞裂解。只有所有三种途径都和在正常细胞中一样起作用时，才不会发生病毒复制。
正如本领域的技术人员能够意识到的，本发明的载体可以采用各种不同的途径效应启动子，以许多变化用于检测和治疗多种多样的途径缺陷。然而，在本文例举的本发明优选实践中，重组腺病毒载体得自腺病毒科病毒属。特别优选的病毒得自人腺病毒2型或5型。当腺病毒载体用做亲代载体时，优选的病毒复制抑制物是E2F-RB融合蛋白。
在本发明的优选实践中，当使用本发明载体治疗与不受控的细胞增殖相关的疾病时，最好是要使用的腺病毒载体在E1A区含有特异性缺失，以便消除E1a基因产物结合p300和Rb蛋白的能力，同时保留E1a CR3结构域的反式激活功能。本发明载体在E1a编码序列中包含缺失，以消除在13S编码序列中的p300和p105-Rb结合位点。在本发明的优选实践中，p300结合缺失表现为缺失约4至约25的氨基酸或约36至约49的氨基酸。
对于实现消除p300和pRb结合所必需的E1a289R编码序列中的缺失最好是最低限度的，以尽可能防止对E1a289R蛋白的二级和三级结构的大的破坏。为了消除p300结合，最好是在289R的p300结合域DNA编码序列中导入突变。尽管优选较小的修饰，但最好是在C末端区缺失低于约30个氨基酸，以消除p300结合。例如，可优先选择缺失氨基酸4至25(dl1101)、缺失约氨基酸30至氨基酸49(dl1103)以及更具体的缺失氨基酸36至49，以消除p300结合。特别优选足以破坏p300结合的点突变。例如，已经证实，在289R蛋白中的第二个氨基酸由精氨酸变为甘氨酸(Arg2→Gly2)的点突变破坏p300结合(参见例如pm563，Whyte等，(1989)Cell56：67-75)。同样地，关于消除pRb105结合，优选最小修饰。最好是在pRb105结合域中消除选择的氨基酸，例如氨基酸111-123(dl1107)和氨基酸124-127(dl1108)。特别优选消除氨基酸111-123(dl1107)，因为它保留289R蛋白的p107结合活性。
另外，可以导入对Ela 289R蛋白由约219至289氨基酸的消除，以及对ElA 243R蛋白的由173至243氨基酸的消除。例如，通过在相当于人Ad5基因组的位置1131的位置引入点突变(即将胞嘧啶1131变为鸟嘌呤)，产生一个终止密码子。该突变消除Ela 289R蛋白的氨基酸219至289和E1A 243R蛋白的氨基酸173至243。除了上述的Rb和p300结合缺失以外，可任选地产生该突变。这类亲代载体的其它实例描述于共同未决的美国专利申请序号60/104,317和1998年10月15日提交的美国专利申请序号08/09/172，684。
在本文例举的本发明优选实践中，优选的p53途径效应启动子是p53-CON和RGC。优选的TGF-β途径效应启动子选自PAI-RE和SRE。
在本发明优选实践中，治疗性基因是前体药物激活基因，例如胞嘧啶脱氨酶。在诱导抗肿瘤免疫的本发明优选实践中，本发明的载体编码MIP-3-α。
用于表达所述治疗性基因的优选启动子是诸如MLP和E3的时序启动子。
在腺病毒构建物中，实现了消除或延迟Ad E3-11.6K蛋白的作用，以使腺病毒诱导的细胞裂解最小化，直至复制。特别优选消除天然E3-11.6K/10.5K基因。这将使免疫应答最小化，直至首轮局部扩散发生之后。在所述后一时刻，一旦最初感染的细胞出现凋亡并允许局部病毒扩散，那么所述免疫应答将是有利的。所述11.6K蛋白(或对应的Ad5的E3-10.5K蛋白)是原凋亡基因，并可以用于杀伤肿瘤细胞。然而，因为人们希望延迟靶细胞的早期裂解以使病毒复制最大化，所以最好是将所述11.6K/10.5K基因置于时序启动子如MLP启动子控制之下，以延迟其凋亡作用的发生。
                    药用制剂
本发明还提供药学上可接受的所述重组病毒与载体组合的制剂。本发明的载体可以实际配制为按照外加载体和赋形剂的常规药物便于按剂量给予的制剂。给药方式可以包括静脉内、肿瘤内(intratumoral)、肌内、腹膜内、局部、基质或气溶胶传递。
术语“载体”是指通常用于药用化合物制剂的化合物，用来增强所述治疗性化合物的稳定性、无茵性和传递能力。当所述病毒配制为溶液或悬浮液时，传递系统采用可接受的载体，最好是水性载体。可以使用各种各样的水性载体，例如水、缓冲液、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可以通过常规的、众所周知的除茵技术除菌，或者可以无茵过滤除茵。获得的水溶液可以封装原样使用或冻干，冻干制剂在给予前和无菌溶液混合。所述组合物根据需要可以包含药学上可接受的辅助性物质以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇(sorption)一月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本发明还提供本发明的病毒和载体以及一种(或多种)输送增强剂的药用制剂。术语“输送增强物”或“输送增强剂”在本文中交替使用，包括一种或多种促进所述病毒进入靶细胞的物质。输送增强物的实例描述于共同未决美国专利申请序列号第09/112,074号(1998年7月8日提交)和第08/938,089号(1997年9月26日提交)。这种输送增强剂的实例包括洗涤剂、醇类、二元醇、表面活性剂、胆汁盐、肝素拮抗剂、环加氧酶抑制剂、高渗盐溶液和乙酸盐。醇类包括例如脂肪族醇，诸如乙醇、正丙醇、异丙醇、丁基乙醇、乙酰基乙醇。二元醇包括丙三醇、丙二醇、聚乙二醇和其它低分子量二元醇如甘油和硫代甘油。输送增强剂的其它实例是乙酸盐，例如乙酸、葡糖酸和乙酸钠。高渗盐溶液如1M NaCl也是输送增强剂的实例。表面活性剂的实例是十二烷基硫酸钠(SDS)和溶血卵磷脂、多乙氧基醚、壬基苯氧基聚氧乙烯、溶血磷脂酰胆碱、聚乙二醇400、多乙氧基醚、聚氧乙烯醚、聚乙二醇醚表面活性剂和DMSO。可以使用的胆汁盐例如为牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸钠、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸盐、甘氨胆酸、鹅脱氧甘胆酸和其它收敛剂，例如硝酸银。还可以使用象季铵一样的肝素拮抗剂，例如硫酸鱼精蛋白。可以使用的环加氧酶抑制剂例如为水杨酸钠、水杨酸和非甾族类抗炎药(NSAIDS)，例如吲哚美辛、萘普生、双氯酚酸钠。输送增强剂包括式I的化合物：
                                                 I其中X1和X2选自胆酸基、脱氧胆酸基和糖基，m为2-8的整数，优选为2或3，n为2-8的整数，优选为2或3，而R是阳离子基团、糖基或-CO-X3结构，其中X3为糖基。所述糖基可选自戊糖单糖基、己糖单糖基、戊糖-戊糖二糖基、已糖-己糖二糖基、戊糖-已糖二糖基和己糖-戊糖二糖基。
术语“洗涤剂”包括阴离子、阳离子、两性离子和非离子洗涤剂。洗涤剂的实例包括但不限于牛磺胆酸、脱氧胆酸、脱氧牛磺胆酸、十六烷基苯基偶氮二氨基吡啶、氯化苯甲烃铵(benalkonium chloride)、Zwittergent 3-14洗涤剂、CHAPS(3-[(3-胆酰氨丙基)二甲铵]-1-丙磺酸酯水合物)、Big CHAP、脱氧Big CHAP、Triton-X-100洗涤剂、C12E8、辛基-B-D-吡喃葡糖苷、PLURONIC-F68洗涤剂、吐温20洗涤剂和吐温80洗涤剂(CalBiochem Biochemicals)。
本发明的单位剂型可以包含在一个产物试剂盒中，该试剂盒含有冻干形式的权利要求1的重组病毒和重构所述冻干产物的溶液。本发明的重组病毒可以通过常规方法冻干并重构。
本发明的载体也可以和钙蛋白酶抑制剂一起给予。所述“钙蛋白酶抑制剂”(简写为“CI”)是指抑制钙蛋白酶I例如μ-钙蛋白酶蛋白水解作用的化合物。本文所用的术语钙蛋白酶抑制剂包括除了其它生物活性以外还具有钙蛋白酶I抑制活性的那些化合物，或者独立于其它生物活性而具有钙蛋白酶I抑制活性的那些化合物。已经证实，各种各样的化合物都具有抑制钙蛋白酶蛋白水解作用的活性。用于实施本发明的钙蛋白酶抑制剂的实例包括也称为“钙蛋白酶抑制剂1”的N-乙酰基-leu-leu-正亮氨酸(norleucinal)。已经观察到钙蛋白酶抑制剂增加细胞对病毒载体的感染性，利用增加水平的NF-κB和AP-1转录因子增强启动子的转录，以及减少对腺病毒载体的CTL应答。因此，本发明的制剂和方法可任选地包括钙蛋白酶抑制剂。钙蛋白酶抑制剂及其应用描述于1998年10月15日提交的Atencio等的共同未决美国专利申请序号第60/104,321和09/073,076号。
                      使用方法
本发明提供一种方法，该方法通过使靶细胞与本发明的选择性复制载体接触，杀伤调节途径缺陷的细胞。在本文例举的本发明的一个实施方案中，包含途径缺陷的所述细胞是赘生性细胞。术语“赘生性细胞”是表现出与正常细胞生长控制无关为特征的异常生长表型的细胞。因为赘生性细胞不一定在任何特定时间点复制，所以术语赘生性细胞包含可活跃复制的细胞或处于暂时非复制性静止状态(G1或G0)的细胞。赘生性细胞的局部群体称为瘤。瘤可以为恶性或良性。恶性瘤也称为癌症。术语癌症和术语肿瘤在本文中交替使用。瘤性转化是指正常细胞转变为赘生性细胞，通常为肿瘤细胞。
本发明提供一种方法，该方法通过给予药学上可接受的本发明的重组腺病毒制剂，在哺乳动物体内消除赘生性细胞。术语“消除”是指活的赘生性细胞群明显减少，以便减轻存在所述赘生性细胞引起的生理失调。术语“明显”是指在哺乳动物机体中活的赘生性细胞群的减少为处理前群的约20％以上。术语“活的”是指具有赘生性细胞不受控制的生长和细胞周期调节特征。术语“活的赘生性细胞”在本文中用于区分所述细胞和不能再复制的赘生性细胞。例如，肿瘤块可以在治疗后继续存在，但组成所述肿瘤块的细胞群可能是死的。即使某些肿瘤块还可能保留，但这些死亡的细胞已经被切除或失去复制能力。
术语“哺乳动物”包括但不限于人、猪、马、牛、犬、猫。最好是使用对治疗的哺乳动物类型为内源性的腺病毒载体。尽管使用来自待治疗物种的病毒通常是有利的，但在某些情况下，可优选使用具有有利的病原特征的得自不同物种的载体。例如，有报道(1997年4月10日公开的WO97/06826)指出可在人类基因治疗中使用绵羊腺病毒载体，以使人腺病毒载体的免疫应答特征最小化。通过使免疫应答最小化，避免了所述载体的快速系统性清除，导致所述载体作用时间更长。
本发明的载体特别适用于治疗与缺乏TGF-β抗增殖作用有关的肿瘤，包括但不限于乳癌、肝癌、胃癌、结肠癌和皮肤癌，以及B淋巴瘤和T淋巴瘤(Markowitz和Roberts，1996)。已经在结肠癌、胃癌、头颈鳞状细胞癌中鉴定出II型TGF-β受体的突变。也已经在Kaposi肉瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤和结肠直肠肿瘤中发现了I型TGF-β受体缺失的突变。在TGF-β信号转导的细胞内效应子Smad中，Smad4/DPC4被鉴定为侯选肿瘤抑制基因，它在接近50％的胰腺癌中发生改变。在结肠癌、乳癌和卵巢癌中也发现了改变的DPC4基因，尽管机率低得多。本发明的载体特别用于治疗TGF-β不敏感的肿瘤，例如胰腺癌。
本发明的载体还适用于治疗含p53途径缺陷的肿瘤细胞。这些肿瘤包括具有p53、mdm2和p14/p19ARF(INK4a基因)改变的肿瘤。本发明的载体还可用于治疗Rb途径缺陷的癌细胞。Rb途径缺陷起因于Rb、细胞周期蛋白D、依赖细胞周期蛋白的激酶(例如CDK4)和p16(INK4a基因)的改变。
尽管本发明提供了单独使用所述重组腺病毒的方法，但本发明的重组腺病毒及其制剂还可以同常规化疗药物或治疗方案联合使用。这种化疗药物的实例包括嘌呤合成抑制剂(例如戊制茵素、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、氨甲蝶呤)或嘧啶合成抑制剂(例如Pala、azarbine)、核糖核苷酸转变为脱氧核糖核苷酸(例如羟脲)、dTMP合成抑制剂(5-氟尿嘧啶)、DNA损伤剂(例如放射、博来霉素、鬼臼亚乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、放线菌素、道诺红霉素、阿霉素、二羟基蒽酮、烷化剂、丝裂霉素、顺氯氨铂、普鲁苄肼)以及微管功能抑制剂(例如长春花生物碱和秋水仙素)。化疗治疗方案主要是指用来切除赘生性细胞的非化学方法，例如放射性治疗。当所述治疗性基因为p53时，联合治疗的实例描述于1998年8月20日公开的Nielsen等的WO/9835554A2。
免疫应答对体内重复给予病毒载体是重要的。因此，本发明的载体可以和免疫抑制剂联合给予。免疫抑制剂的实例包括环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、环磷酰胺、淋巴细胞免疫球蛋白、抗CD3复合物的抗体、肾上腺皮质类固醇、水杨酸偶氮磺胺吡啶、FK-506、敏白灵和酞胺哌啶酮。
本发明还提供一种方法，该方法通过向赘生性细胞污染的正常细胞群给予本发明的重组腺病毒，体外切除所述细胞群中的赘生性细胞。目前该方法的一个应用实例是用于体外用途，例如通常称为骨髓清洗的自身干细胞制品清洗。术语“干细胞制品”是指能够再建接受myoablative therpay患者的长期造血功能的造血细胞群、祖细胞群和干细胞群。干细胞制品通常由取出(apheresis)或流动或非流动的外周血获得。通常使用已知方法，采用市售的取出装置，例如COBEIntemational，Oak街1185号，Lakewood，CO出售的COBE光谱取出系统，实现取出。最好是优化治疗条件以达到“3个对数的清洗”(即从干细胞制品中去除约99.9％的肿瘤细胞)，最优选是达到“5个对数的清洗”(即去除干细胞制品中约99.999％的肿瘤细胞)。在本发明的优选实践中，100ml体积的干细胞制品应以约2×1011本发明载体的颗粒数/有核细胞比率于37℃处理约4小时。
                      诊断用途
除了上述治疗用途以外，本发明的载体还用于诊断目的。例如，本发明的载体可加入在病毒感染和复制时表达的报道基因。术语“报道基因”是指其产物能够单独或与其它元件组合产生可检测信号的基因。报道基因的实例包括β-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、编码可通过如X射线的成象系统或磁场成象系统(MRI)检测的蛋白的核苷酸序列。这样的载体将用于检测功能性途径(例如p53途径或TGF-β途径)的存在。或者，这类载体也可以用于表达能够被例如荧光标记抗体的结合分子识别的细胞表面蛋白。或者，其中使用途径效应启动子驱动病毒复制阻遏物(例如E2F-Rb)的晚期病毒启动子(例如由E2F-Rb产生的E2或任何具有例如E2F结合位点的阻遏物结合位点的其它启动子)，可用于控制用于诊断用途的、其中没有途径效应启动子的报道基因。这些诊断构建物可用于体内或体外诊断目的。体内的应用实例包括成象用途，例如X射线、CT扫描或磁共振成象(MRI)。
                   载体的制备方法
本发明还提供一种产生如上所述的重组病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
a.用重组病毒感染生产细胞，
b.在多种条件下培养所述感染的生产细胞，以允许所述病毒基因组在所述生产细胞中复制，
c.收获所述生产细胞，和
d.纯化所述重组病毒。
术语“感染”是指在多种条件下将所述重组病毒暴露于所述生产细胞，以促进重组腺病毒感染生产细胞。在已经被多拷贝的特定病毒感染的细胞中，病毒复制和病毒体包装所需的活性是协同的。因此，最好是调整这些条件，使得存在明显的所述病毒多次感染所述生产细胞的可能性。增强病毒在所述生产细胞中产生的一个条件实例是增加感染阶段的病毒浓度。然而，每个生产细胞的病毒感染总数有可能过多，导致对所述细胞的毒性作用。因此，人们应当努力将病毒感染浓度保持在1×106至1×1010病毒体/ml的范围内，最好是约1×109病毒体ml。也可以使用化学试剂增加生产细胞系的感染性。例如，本发明提供一种利用钙蛋白酶抑制剂的内含物增加生产细胞系对病毒感染的感染性的方法。用于实施本发明的钙蛋白酶抑制剂的实例包括钙蛋白酶抑制剂1(也称为N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸，可由Boehringer Mannheim购买)。已经发现钙蛋白酶抑制剂1增加生产细胞系对重组腺病毒的感染性。
术语“生产细胞”是指能够促进所产生的重组腺病毒的病毒基因组复制的细胞。可公开获得各种哺乳动物细胞系用于培养重组腺病毒。例如，已对293细胞系(Graham和Smiley(1977)J.Gen.Virol.36：59-72)进行工程改造，以补充E1功能的缺陷，该细胞系是用于生产所述载体的优选细胞系。其它生产细胞的实例包括Hela细胞、PERC.6细胞(如公开号WO/97/00326，申请序列号为PCT/NL96/00244中所述)。
术语“在多种条件下培养，以允许所述病毒基因组复制”是指保持感染生产细胞的条件，以便允许所述病毒在所述生产细胞中繁殖。理想的是控制条件，使得每个细胞生产的病毒颗粒的数量最大。因此，监测和控制反应条件，例如温度、溶解氧、pH等，将是必需的。市售的生物反应器例如CelliGen Plus生物反应器(购自New BrunswickScientific，Inc.44 Talmadge Road，Edison，NJ)具有监测和保持这类参数的装置。然而，最佳的感染和培养条件将多少有所变化，本领域的技术人员考虑了所述生产细胞系的已知特性、所述病毒的特性、生物反应器类型等后，可以获得病毒有效复制和生产的条件。当使用293细胞作为生产细胞系时，氧浓度最好保持在约50％-约120％溶解氧，优选100％溶解氧。当病毒颗粒的浓度(通过常规方法例如使用Resource Q柱的HPLC进行测定)开始达到稳定水平时，对反应器进行收获。
术语“收获”是指由培养基中收集含所述重组腺病毒的细胞。这可以通过常规方法实现，例如差速离心法或层析法。在此阶段，可储存的收获的细胞，或者可通过裂解和纯化进一步加工收获的细胞，以分离所述重组病毒。对于储存而言，所收获的细胞应以生理pH或在生理pH左右缓冲，并冷冻于-70℃。
术语“裂解”是指破裂所述生产细胞。通过各种本领域已熟知方法可以实现裂解。当需要由所述生产细胞分离病毒颗粒时，使用各种本领域已知方法裂解细胞。例如，可在低压(100-200psi分压)条件下或用常规冻融法裂解哺乳动物细胞。通过用DNA酶/RNA酶降解除去外源性游离的DNA/RNA。
术语“纯化”是指由裂解的生产细胞中分离大致纯的重组病毒颗粒群。可以使用常规的纯化技术，例如层析法或密度差异梯度离心法。在本发明的优选实践中，基本按照如在1995年3月7日提交的共同未决美国专利申请序列号第08/400,793号中所述的Huyghe等(1995)Human Gene Therapy 6：1403-1416的方法，通过柱层析纯化所述病毒。
其它的优化本发明的重组腺病毒生产的方法和步骤描述于1998年5月4日提交的共同未决美国专利申请序列号第09/073,076号，题目：病毒生产方法。
                       实施例
以下的实施例提供了试验的方法和结果，证实具体重组腺病毒和质粒载体的构建。对本发明所属领域的技术人员而言显而易见的是，本发明可以有别于这些实施例中具体公开的形式实施，而不背离本发明的宗旨或基本特征。因此，以下描述的本发明的具体实施方案被认为是说明性的和非限制性的。在以下的实施例中，“g”代表克，“ml”代表毫升，“mol”代表摩尔，“℃”代表摄氏度，“min”代表分钟，“FBS”代表胎牛血清，而“PN”是指重组病毒的颗粒数。
                实施例1.质粒构建
在800bp的PAI启动子控制下编码荧光素酶的质粒p800luc得自David Luskutoff博士(Scripps Institute，LaJolla，California)。在腺病毒-5三联前导序列后含一个CMV启动子和在E2F-RB融合蛋白编码序列上游含一个SV40增强子的质粒pCTMIE-E2F-Rb由Doug Antelman(Canji)提供。
实施例2.构建具有TGF-β效应启动子的荧光素酶质粒A.PAI-荧光素酶质粒：
以5′-3′方向显示所有片段的序列。一个749bp的片段两侧于5′和3′末端分别具有SacI位点和XhoI位点，并且由SV40 TATA盒代替所述启动子中的天然TATA盒，使用模板p800luc和引物AGT CGAGCT CCA ACC TCA GCC AGA和GAT CCT CGA GCT CCT CTGTGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC(含SV 40 TATA盒)，通过PCR扩增该片段。获得的PCR产物用SacI和XhoI消化，并连接至在消化一种不含启动子的荧光素酶构建物PGL3-基(basic))(Promega)之后获得的片段，以获得PAI-荧光素酶。B.SRE-荧光素酶质粒：
退火以下的寡核苷酸：GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGCCCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC和GAT CCT CGA GCT CCTCTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC。用XhoI消化退火产物，并连接至用MluI消化的PGL3-基，用Klenow平端化，并用XhoI消化以获得pSVT-luc(一种具有SV40 TATA盒的荧光素酶构建物)。退火含Smad4/DPC4结合位点的寡核苷酸：CGT CTA GAC GTC TAGACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC和AGT CTA GAC GTC TAGACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC，并连接至用KpnI消化的pSVT-荧光素酶，获得SRE-荧光素酶质粒。
实施例3.构建具有p53效应启动子的荧光素酶质粒A.RGC-荧光素酶质粒：
退火两个含核糖体基因簇的p53结合位点的互补性5′-磷酸化寡核苷酸：AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AACTCG TGG TAC和CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTGCCT TTT CTG TAC。将退火的片段连接至用KpnI消化的pSVT-荧光素酶，获得RGC-荧光素酶质粒。B.p53CON-荧光素酶质粒：
退火两个含共有p53结合位点(p53CON)的互补性5′-磷酸化寡核苷酸：CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GACATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC和AG GAC ATG CCC GGG CATGTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGGTAC。将退火的片段连接至周KpnI消化的pSVT-荧光素酶，获得p53CON-荧光素酶质粒。C.PAI-E2F-Rb质粒：
通过用BglI和XbaI消化，切除质粒pCTMIE-E2F-Rb中的序列，该序列在腺病毒-5三联前导序列后含有CMV启动子，并在E2F-RB融合蛋白的编码序列上游含有一个SV40增强子，连接所获得的片段，获得启动子减少的E2F-RB质粒。通过用SacI和XhoI消化，由质粒PAI-荧光素酶切除含修饰的PAI启动子的片段，并用Klenow处理进行平端化。将该片段连接至用EeoR消化并用DNA聚合酶I的Klenow片段处理的启动子减少的E2F-RB质粒，获得PAI-E2F-RB质粒。
         实施例4.重组腺病毒的制备
用BamHI、AccI和Klenow处理由pBHG11(26676至34140)至pNEB193(来自NEB的质粒)的7.4kb的SnaBI片段，通过克隆该片段构建含E3区缺失3-kb的Ad5序列的转移质粒pNEBΔE3。通过退火5-磷酸化寡核苷酸：AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCCGCT CGC GAG GAT CCT TAA T和TAA GGA TCC TCG CGA GCGGCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T，并通过连接至用PacI消化的pNEBΔE3引入退火的片段，将多个克隆位点引入上述质粒中，获得pNEBΔE3(MCS)质粒。
如下构建产生重组腺病毒的转移质粒，该质粒编码处于PΔI-启动子控制下的E2F-Rb和处于CMV启动子控制下的增强的绿色荧光蛋白(GFP)。通过连接含PAI启动子的片段和用NacI和XbaI消化PAI-E2F-Rb制备的E2F-Rb编码序列，并连接至用KpnI消化制备的pABS.4质粒(Microbix)片段，用Klenow处理，并用XbaI再消化，制备中间态载体pABS.4-E2F-Rb。然后用PacI消化，用Klenow处理，由质粒pABS.4-E2F-Rb切除含PAI启动子、E2F-Rb编码序列和卡那霉素基因的片段，并连接至用PacI消化pNEBΔE3质粒并用Klenow处理获得的质粒片段，获得不含PacI位点的质粒pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb。通过用SwaI消化pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb，并将其连接至用AflII和SspI消化并用Klenow处理由pEGFP-N(Clontech)分离的片段，用有效连接至绿色荧光蛋白(GFP)基因的CMV启动子替换该质粒中的卡那霉素基因，获得pΔE3-PAI-E2F-Rb-GFP质粒。
如下构建产生重组腺病毒的转移质粒，该质粒编码处于含SRE的TGF-β效应启动子控制下的E2F-Rb和处于CMV启动子控制下的增强的绿色荧光蛋白(GFP)。通过连接用XbaI和NruI消化pNEBΔE3(MCS)而分离的片段和用XbaI和Nae I消化pCTMIE-E2F-Rb产生的片段，将E2F-Rb编码序列引入质粒pNEBΔE3(MCS)中，获得质粒pNEBΔE3-E2F-Rb。使用SRE荧光素酶模板和磷酸化引物GTA AGGTGC CAG AAC ATT TCT C和GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTGGGC CAC T，通过PCR扩增含SRE的TGF-β效应启动子，将该序列引入上述质粒中。用SpeI消化所获得的PCR产物，并连接至用SnaBI和XbaI消化的pNEBΔE3-E2F-Rb，获得pΔE3-DPC-E2F-Rb。
如下构建产生重组腺病毒的转移质粒，该质粒编码处于p53效应启动子控制下的E2F-Rb和处于CMV启动子控制下的增强的绿色荧光蛋白(GFP)。使用RGC-荧光素酶模板或p53CON荧光素酶模板和磷酸化引物：GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C和GAT ATC TAGACG TCC TCT GTG GGC CAC T，通过PCR扩增含来自核糖体基因簇的p53结合位点或p53共有位点(p53CON)的p53效应启动子序列，将该p53效应启动子引入质粒pNEBΔE3-E2F-Rb中。获得的PCR产物用XbaI消化，并连接至SnaBI和XbaI消化的pNEBΔE3-E2F-Rb，获得pΔE3-RGC-E2F-Rb和pdelataE3-PCON-E2F-Rb。
          实施例5.产生重组腺病毒的同源重组
如Chartier等，(1996)J.Virol.70：4805-4810所述，通过在细茵中进行同源重组，产生重组腺病毒PAI-Ad、SRE-Ad、RGC-Ad和CON-Ad。用AscI消化所述转移质粒，获得含有处于途径效应启动子控制下的E2F-Rb和处于位于Ad5序列侧翼的CMV启动子控制下的GFP的片段。将所获得的片段与用BstBI和SpeI消化PTG4609(得自Transgene，Inc.并描述于Chartier等，(1996)J.Virol.70：4805-4810)获得的片段共转化到BJ5183细菌菌株中。在所获得的细菌菌落中筛选存在所需的重组Ad5感染性质粒pPAI-GFP-Ad、pSRE-GFP-Ad、pRGC-GFP-Ad和pCON-GFP-Ad的茵落。然后用PacI消化这些感染性质粒，使之线性化，并通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀纯化，用于转染293细胞。
使用Superfect(Qiagen)，按照生产商的说明进行转染。使用2.5μg的线性化质粒转染在每孔含12μl Superfect的6孔培养板上培养的250,000个细胞。8天后，观察到起因于病毒的产生的细胞致病作用。收获细胞和培养物上清液，并进行3轮冻融循环。通过再感染293细胞扩增所产生的裂解液中的重组病毒。
               实施例6.细胞系
在本研究中使用的所有细胞系都得自ATCC(Rockville，MD)，并于CO2培养箱中保持37℃，培养成为单层培养物。293、Hep3B、MRC9、A549、PancI、U87、Caco2、MCF-7和WIDR保持在补加10％胎牛血清的Dulbecco改良型Eagle培养基中。MDA-MB468细胞在补加10％胎牛血清的Ham培养基中培养，而MiaPaca-2细胞在补加10％胎牛血清和2.5％马血清的DMEM培养基中培养。
              实施例7.转染
将细胞平板接种或者在6孔培养板(250,000细胞/孔)或者在24孔培养板(62,500细胞/孔)中，并使细胞过夜附着。然后如所述对293细胞使用磷酸钙进行转染，对其它细胞使用Superfect(Qiagen)按照生产商的说明进行转染。
       实施例8.报道基因/荧光素酶测定
用1.5μg报道基因质粒和1.0μg所述抑制剂转染细胞。转染后48小时，通过将细胞加入1X报道基因裂解缓冲液(Promega)中并于室温温育10分钟，制备裂解物。使用Top Count(Packard)和Packard的检测试剂盒，按照Packard的说明书测定荧光素酶活性。
     实施例9.检测病毒介导的细胞致病作用的分析
用标明的重组或野生型腺病毒感染细胞，并在感染后的6天中，基本上按照Bischoff等，(1996)Science 274：373-376描述的方法，用在20％乙醇中制备的0.5％结晶紫染色。
        实施例10.构建cU3EE和cT1LT病毒
使用引物GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCTAGG GC和GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG，使用诸如质粒pFG140(Microbix)中的Ad5 DNA作为模板，通过PCR扩增MLP启动子序列。然后在质粒pdelataE3-PCON-E2F-Rb中的PacI位点克隆MLP PCR产物，获得pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP。使用引物GCG ACC CAC CCT AAC AGA和GAT CGG ATC CAA AGCGCA ACA AGG GTC A，通过PCR扩增腺病毒E3 10.5K蛋白编码序列，获得的PCR产物克隆在质粒pCDNA3.1(Invitrogen)中的Xho I位点，获得pCDNA3-10.5质粒。然后用DraIII和XbaI消化继之以Klenow处理，由pCDNA3-10.5中切除腺病毒E3 10.5K蛋白编码序列，并将其连接至PacI和Klenow处理的pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP，获得pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K质粒。
如Chartier等，(1996)J.Virol.70：4805-4810所述，通过在细菌中进行同源重组，产生重组腺病毒cU3EE和cT1LT。用AscI消化所述转移质粒，获得包含处于p53CON序列控制下的E2F-Rb和处于位于Ad5序列侧翼的MLP启动子控制下的E310.5K的片段。将所获得的片段和通过用BstBI和SpeI消化PTG4609(Transgene)获得的片段共转化到BJ 5283细菌菌株中。在所获得的细菌菌落中筛选存在所需的重组Ad5感染性质粒pCEMD的菌落。按照相似的方法，但是使用PTG4609衍生物(Transgene)获得Ad5感染性质粒p01/CEMD，在所述PTG4609衍生物中，用含具有01突变的E1A的序列代替野生型E1A序列。然后通过用PacI消化，使这些感染性质粒线性化，并通过苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀纯化，用于转染293细胞。
使用Superfect(Qiagen)，按照生产商的说明对质粒pCEMD和p01/CEMD进行转染，分别产生重组病毒cU3EE和cT1LT。使用2.5μg的线性化质粒转染在每孔含12μl Superfect的6孔培养板上培养的500,000个细胞。8天后，观察到起因于病毒产生的细胞致病作用。收获细胞和培养物上清液，并进行3轮冻融循环。通过再感染293细胞扩增所产生的裂解液中的重组病毒。

Claims (27)

1.一种选择性复制的重组病毒，它包含有效连接至病毒复制阻遏物的途径效应启动子。
2.权利要求1的载体，其中所述途径效应启动子选自p53途径效应启动子、Rb途径效应启动子和TGF-β途径效应启动子。
3.权利要求2的载体，其中所述病毒得自腺病毒科病毒属(genus adenoviridiae)。
4.权利要求3的载体，其中所述病毒复制阻遏物为E2F-RB。
5.权利要求4的载体，它还包含一个转基因表达盒。
6.权利要求5的载体，其中所述治疗性转基因为原凋亡(pro-apoptotic)基因。
7.权利要求6的载体，其中所述前体药物激活基因为Ad5E3-10.5K。
8.权利要求4的载体，它还包含E1功能的缺失，以便消除p300结合。
9.包含一种选择性复制的重组病毒和一种药学上可接受的载体的药用制剂，所述重组病毒含有一个有效连接至病毒复制阻遏物的途径效应启动子。
10.权利要求9的制剂，其中所述病毒得自腺病毒科病毒属。
11.权利要求10的载体，其中所述病毒复制阻遏物为E2F-RB。
12.权利要求11的载体，它还包含一个转基因表达盒。
13.权利要求12的载体，其中所述治疗性转基因为原凋亡基因。
14.权利要求13的载体，其中所述前体药物激活基因为Ad5E3-10.5K。
15.权利要求14的载体，它还包含E1功能的缺失，以便消除p300结合。
16.权利要求14的制剂，它还含有一种输送增强剂。
17.一种方法，通过使途径缺陷细胞接触包含有效连接至病毒复制阻遏物的途径效应启动子的选择性复制重组病毒，杀伤所述靶细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述方法在体内实施。
19.权利要求18的方法，其中所述载体通过腹膜内、静脉内或肿瘤内(intratumoral)注射给予。
20.权利要求17的方法，其中所述方法在体外实施。
21.权利要求14的方法，其中所述方法在体外实施，以消除干细胞制品中的肿瘤细胞。
22.用选择性复制重组病毒转化的细胞，所述重组病毒含有有效连接至病毒复制阻遏物的途径效应启动子。
23.基本选自p53CON和RGC的p53途径效应启动子。
24.选自PAI和SRE的TGF-β途径效应启动子。
25.一种重组腺病毒载体，它包含多个途径效应启动子，使得所述病毒能够选择性地在具有多个途径缺陷的细胞中复制。
26.组件包含权利要求1的选择性复制病毒的诊断试剂盒，它还含有一个含报道基因的转基因表达盒和正确使用的说明书。
27.制备权利要求1的选择性复制载体的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)用重组病毒感染生产细胞，
(b)在多种条件下培养所述感染的生产细胞，以便允许所述病毒(c)基因组在所述生产细胞中复制，
(d)收获所述生产细胞，和
(e)纯化所述重组病毒。
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