SK4412001A3 - Selectively replicating viral vectors - Google Patents

Selectively replicating viral vectors Download PDF

Info

Publication number
SK4412001A3
SK4412001A3 SK441-2001A SK4412001A SK4412001A3 SK 4412001 A3 SK4412001 A3 SK 4412001A3 SK 4412001 A SK4412001 A SK 4412001A SK 4412001 A3 SK4412001 A3 SK 4412001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
promoter
pathway
vector
cell
cells
Prior art date
Application number
SK441-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Muralidhara Ramachandra
Paul W Shabram
Original Assignee
Canji Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Canji Inc filed Critical Canji Inc
Publication of SK4412001A3 publication Critical patent/SK4412001A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4736—Retinoblastoma protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

·· ····
Oblasť techniky
Predmetný vynález poskytuje rekombinantné vírusy, ktoré replikujú vírusový genóm selektívne ako odozvu na intracelulárne podmienky cieľovej bunky a to prostredníctvom použitia promótora reagujúceho na určitú dráhu, ktorý riadi expresiu inhibítora replikácie vírusu.
Doterajší stav techniky
Rekombinantné adenovírusy sú dnes používané v rade terapeutických režimov ako sprostredkovatelia na dopravenie terapeutických transgénov. Rozsiahla nákazlivosť týchto vektorových systémov však spôsobila zväčšenie obáv, že by expresia vírusu v iných ako nádorových bunkách mohla spôsobovať súčasné zničenie iných buniek ako neoplastických. V dôsledku toho bolo vyvinuté široké spektrum systémov, ktorých cieľom je v danom type bunky prednostne exprimovať transgén. Na zaistenie prednostnej replikácie vektora v určitých typoch buniek boli použité tkaninovo špecifické a nádorovo špecifické promótory. Napríklad medzinárodná patentová prihláška č. PCT/US96/10838, publikovaná 16.1.1997 (medzinárodná publikácia č. WO97/01358) opisuje použitie vektorov, ktoré sa replikujú v špecifickej hostiteľskej bunke prostredníctvom použitia promótorových prvkov špecifických pre prostatu, ktoré riadia funkcie E1, E2 alebo E4 a ktoré príležitostne obsahujú cytotoxickú transgénnu expresnú kazetu. Táto publikácia konkrétne opisuje konštrukt, v ktorom zosilňovač špecifický pre prostatu kontroluje expresiu E1 a obsahuje expresnú kazetu, zahrňujúcu CMV-promótor, ktorý riadi expresiu génu na cytozíndeaminázu a ktorý je inzertovaný do oblasti E3. Tieto vektory sú replikačne kompetentné a v konkrétnom type bunky sú schopné sa zahaľovať do intaktných viriónov.
·· ···· ··
Alternatívnym prístupom použitia nádorovo špecifických promótorov na riadenie replikácie vírusu je použitie špecifických delécií v sekvencii kódujúcej adenovírusový proteín E1b 55K. Rekombinantné adenovírusy, ktoré obsahujú defekty v nukleotidovej sekvencii kódujúce E1b 55K, sú opísané vUS patente č. 5 677 178, vydanom 14.10.1997. V týchto tkanivovo špecifických alebo nádorovo špecifických kontrolných prvkoch však bolo pozorované, že sú „deravé“ tzn., že umožňujú replikáciu nielen v uprednostňovaných cieľových bunkách, ale tiež v ďalších typoch buniek.
Alternatívou k tomuto typu selektívne sa replikujúceho vektora je použitie replikačne deficitného adenovírusového vektora, ktorý obsahuje rozsiahlu elimináciu funkcie E1. Konkrétne na dopravenie exogénnych transferov boli použité vektory obsahujúce elimináciu delécií E1, E2, E3 a čiastočne E4. Tieto vektory boli použité na dopravenie génu p53 do cieľových buniek. Bolo dokázané, že expresia exogénne podaného divokého („wild type“) p53 v p53 deficitnej (s mutovaným p53 alebo bez p53) nádorovej bunke je schopná indukovať v nádorovej bunke apoptózu sprostredkovanú p53. Tieto vírusové vektory určené na dopravenie p53 sú v súčasnosti vo výskume v spoločnosti Schering Corporation a Introgen Corporation. Tieto vektory ďalej vykazovali prijateľné toxikologické profily a terapeutickú účinnosť na terapeutické aplikácie u ľudí. Teraz sú v druhej fáze klinických skúšok liečby zhubného bujnenia spojeného s p53 u mužov.
Porucha replikácie a selektívne sa replikujúce vektory majú, aspoň teoreticky, svoje tmavé stránky, ktoré sú predmetom záujmu lekárov. Pretože replikačne deficitné vektory sa u pacienta nebudú množiť nekontrolovane, majú teoreticky príťažlivejší bezpečnostný profil. Pretože účinná eliminácia vyžaduje, aby bola infikovaná podstatná časť nádorových buniek, je na zaistenie terapeutickej účinnosti bežne používaný molárny prebytok vektora. Selektívne sa replikujúce vírusy sú považované za vírusy, ktoré sú väčším problémom z pohľadu bezpečnosti a to vzhľadom k ich schopnosti repiikovať sa a mutovať za vzniku celkom replikačne kompetentných vektorov. Avšak tým, že je udržovaná prirodzená schopnosť vírusu množiť sa v konkrétnych podmienkach, je umožnené týmto vektorom rozšíriť sa na okolité nádorové bunky. Pretože vektory samy o sebe sú schopné sa repiikovať, je potrebná len nižšia začiatočná dávka týchto vektorov. Toto je dôležité z imunologického hľadiska, ale rovnako tiež z dôvodov ekonomických pri výrobe ·· ··· • ·
• ·· ·· • · · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · • ·· ·· · týchto činidiel. Selektívne sa replikujúce vírusy, ktoré sa zameriavajú na vnímané bezpečnostné problémy a ktoré súčasne poskytujú zvýšený terapeutický index, sú v danej oblasti techniky potrebné.
Predmetný vynález rieši tieto problémy tým, že poskytuje selektívne sa replikujúce adenovírusové vektory obsahujúce promótor reagujúci na určitú dráhu, ktorý riadi expresiu represora replikácie vírusu tak, že sa vektor replikuje prednostne v bunkách, ktoré sú z pohľadu sledovanej dráhy defektné. Predmetný vynález tiež poskytuje farmaceutické formulácie obsahujúce tieto vektory. Predmetný vynález tiež poskytuje spôsoby oddelenia buniek s defektnou dráhou od populácie normálnych buniek a to práve pomocou týchto vektorov.
Podstata vynálezu
Predmetný vynález poskytuje rekombinantné vírusy, ktoré replikujú vírusový génom selektívne ako odozvu na intracelulárne podmienky cieľovej bunky prostredníctvom použitia promótora reagujúceho na určitú dráhu, ktorý riadi expresiu inhibítora vírusu. Inhibítor podstatne inhibuje replikáciu vírusu v hostiteľskej bunke a to na báze fenotypu alebo genotypu infikovanej bunky. V cieľovej bunke je element promótora reagujúceho na určitú dráhu inaktívnv a vírus sa teda môže replikovať. Výsledkom je: (1) usmrtenie buniek prirodzenou lýziou vírusu a/alebo (2) poskytnutie terapeutickej dávky transgenného produktu (amplifikovaného v porovnaní s replikačne nekompetentnými vektormi) cieľovej bunky a (3) vznik miestnej koncentrácie vírusu uľahčujúcej infekciu okolitých cieľových buniek rekombinantným vírusom. Vynález ďalej poskytuje terapeutické a diagnostické spôsoby použitia vektorov, farmaceutické formulácie obsahujúce vektory, spôsoby prípravy vektorov a transformované bunky, ktoré obsahujú tieto vektory.
Predmetný vynález poskytuje selektívne sa replikujúci rekombinantný vírus obsahujúci promótor reagujúci na určitú dráhu, ktorý je operatívne pripojený na represor replikácie vírusu.
Termín „selektívne sa replikujúci“ sa vzťahuje k vektoru, ktorý je schopný sa prednostne replikovať v bunke v jednom fenotypovom stave v porovnaní s bunkou s iným fenotypovým stavom. Medzi príklady odlišných fenotypových stavov by mohli ·· ···· byť zahrnuté bunka s defektnou dráhou p53 verzus normálna bunka rovnakého bunkového typu. Vírus, ktorý vykazuje prednostnú replikáciu znamená, že sa pri určitej hladine replikuje v danom type cieľovej bunky v porovnaní s normálnou (kontrolnou) bunkou rovnakého typu aspoň s 5-násobnou účinnosťou. Aby bolo možné stanoviť, či je vírus skutočne selektívny, je vzhľadom k množstvu faktorov nevyhnutné určiť schopnosť vírusu replikovať sa v cieľových bunkách a porovnať ich s replikáciou v normálnych bunkách rovnakého typu.
Je výhodné porovnať schopnosť daného vektora replikovať sa v cieľovej bunke, ktorá disponuje určitou sledovanou podmienkou a v normálnej bunke rovnakého typu, ktorá danú podmienku nevykazuje. Napríklad prvým krokom, ktorý nasleduje po infekcii vírusu, je indukcia bunky tak, aby vstúpila do bunkového cyklu, pretože faktory, nevyhnutné na maximálnu účinnosť replikácie vírusu, sú prítomné len v S-fáze. Avšak pri pokuse o zhodnotenie selektivity vektora z pohľadu selektivity voči nádorovým bunkám, zhodnotenie schopnosti replikovať sa v nádorovej bunke a v inej bunke, ktorá už vstúpila do bunkového cyklu (ako je nesmrteľná bunka alebo transformovaná bunka), bude selektivita vírusu pre nádorové bunky do určitej miery nejasná, resp. skreslená. Ďalej bolo pozorované, že rôzne typy buniek vykazujú pre daný vírus veľmi odlišnú nákazlivosť. Aj keď niektoré vírusy, ako sú adenovírusy, vykazujú široký tropizmus tkanív, iné vírusy sú typom buniek, ktoré infikujú, obmedzené viac. Pri pokuse o určenie činnosti daného vektora v bunkách, ktoré sa veľmi líšia schopnosťou byť infikované, je ťažko odhadnúť, či je malý účinok dôsledkom pôsobenia vektora v bunke alebo len dôsledkom nedostatočnej infekcie bunky vírusom ako takým. Vplyv rôznej nákazy sa minimalizuje práve určením selektivity v cieľových aj normálnych bunkách rovnakého typu.
Tiež sa musí brať do úvahy dočasná povaha životného cyklu vírusu. Napríklad len pri wild-type vektora sa môže zdať, že v porovnaní s normálnymi bunkami vykazuje selektivitu v nádorových bunkách veľmi skoro po infekcii a to preto, že bunka práve cykluje. Avšak akonáhle má vírus stimulovaný bunkový cyklus, táto zdanlivá selektivita klesá. Preto teda musí byť čas, ktorý nasleduje po infekcii a v ktorom je selektivita určovaná, dostatočne dlhý na to, aby bola vylúčená táto počiatočná replikačná lag fáza v normálnych bunkách. Aj keď sa toto bude líšiť podľa typu použitého vírusu, môže odborník v danej oblasti techniky túto počiatočnú lag fázu ľahko určiť.
• · ·· ···*
·· ·· • · · · • · · · • · · ··· • · · ·· ·· • · · • · • · · • · ·· ·
Pri určovaní, či vykazuje daný rekombinantný adenovírus selektívny účinok v cieľových bunkách daného typu, je potrebné vziať do úvahy tiež vplyv dávkovania. Napríklad, ak je pozornosť zameraná na elimináciu nádorových buniek a meranie účinku prostredníctvom cytotoxicity, môže sa pri rôznom dávkovaní vírusu zdať, že vykazuje selektívnu cytotoxicitu. Toto je spôsobené tým, že dostatočne vysoká dávka takmer akéhokoľvek vírusu bez ohľadu na stupeň modifikácie genómu, bude cytotoxická a to jednoducho vzhľadom k vplyvu prítomnosti vírusových proteínov (ako je hexón v prípade adenovírusu), o ktorých je známe, že sú cytotoxické. Podobne sa vedecká literatúra dokonca môže odkazovať na vírus ako na „repiikačne defektné“ (za predpokladu, že vírus je úplne neschopný replikácie v neprítomnosti bunkovej línie, ktorá je schopná komplementovať defekt vírusu). Tieto vírusy sú presnejšie opísané ako „oslabené pre replikáciu“. Napríklad adenovírusy obsahujúce deléciu celej E1 oblasti, ktoré sú často označované ako „repiikačne deficitné“ alebo „repiikačne defektné“, sa budú do určitého stupňa replikovať a to konkrétne v cyklizujúcich sa alebo veľmi rýchlo sa deliacich bunkách. Toto pozoroval Mulligan (1990, Science 260:926 až 932).
Aj keď v prípade expresie E1 oblasti bolo ukázané, že ovplyvňuje expresiu iných produktov vírusových génov nevyhnutných pre replikáciu (Horwitz, M., Virology, B. N. Fields Ed. (Raven, New York, 1990, kapitola 60), nejaví sa požiadavka expresie génu E1 pre replikáciu vírusu ako absolútna. Skoršie charakteristiky E1 deficitných vírusov ukazujú, že pri vysokých multiplicitách infekcie bola E1 oblasť pre replikáciu nevyhnutná (Jones a Shenk (1979) PNAS (USA) 76(8): 3665 až 3669).
Z tohto dôvodu nemôže byť pri určovaní, či je alebo nie je vírus replikovaný selektívnym spôsobom, ignorovaný účinok dávky vírusu.
Jedným prostriedkom ako stanoviť replikačnú selektivitu vírusu na cieľové bunky, je určenie „indexu selektivity“ pre daný vírus. Bežne používaný parameter ED5o (ktorý je definovaný ako dávka dostatočná na indukovanie bunkovej smrti v 50 % buniek) poskytuje zodpovedajúci základ na porovnávanie. Hodnota ED50 vírusu môže byť ľahko stanovená pomocou typických in vitro experimentov pomocou stupňovania dávky. Aby sa zaistil pevný základ porovnania, je najvýhodnejšie vyjadrovať ED50 vo vzťahu ku kontrole. Cieľom tohto je minimalizovať vplyvy súvisiace s rôznou schopnosťou jednotlivých typov porovnávaných buniek byť ·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· · ·· ·· • · · · · · ·· • · · · · · · • · ··· · · · · • · · · · · ·· «· ·· ··· infikované a rovnako minimalizovať odchýlky merania. Preto je pomer ED5<> (vírus)/ED5o(kontrola) používaný na vyjadrenie relatívnej toxicity vírusu v bunke a bude označovaný ako „index relatívnej toxicity“ alebo „RTI“. „Index selektivity“ daného vírusu je vyjadrený pomerom RTI (cieľovej bunky)/RTI(normálnej bunky). Selektívne sa replikujúce vektory budú mať index selektivity aspoň 10, ale výhodnejšie 50, 100 alebo vyšší.
Napríklad selektívne sa replikujúce adenovírusové vektory U3EE a T1LT sú konštruované tak, aby bola dosiahnutá selektívna replikácia a usmrtenie nádorových buniek, ktoré majú defekty p53 dráhy. U3EE je pripravený v súlade s tu uvedenými príkladmi. Stručne, vírus U3EE obsahuje prvú expresnú kazetu zahrňujúcu responzívny prvok p53 (p53 CON), ktorý riadi expresiu fúzneho proteínu E2F-Rb. Fúzny protein E2F-Rb je veľmi účinným inhibítorom aktivity adenovírusového promótora E2 a jeho prítomnosť v bunke bude účinne potlačovať replikáciu vírusu. Responzívny prvok p53 je aktívny v závislosti od prítomnosti funkčnej dráhy p53.
Preto teda v normálnych bunkách, kde nie je p53 dráha porušená, bude vírus U3EE exprimovať fúzny protein E2F-Rb a vírus sa nebude replikovať. Avšak v bunkách, ktoré majú p53 dráhu defektnú (väčšina nádorových buniek), nie je prvok p53CON aktívny a teda tu nedochádza k potlačeniu replikácie vírusu. Vektor U3EE obsahuje tiež expresnú kazetu zahrňujúcu MLP promótor, ktorý riadi expresiu proapoptotického génu Ad5 E3-10.5K. Použitie časových promótorov (ako je MLP promótor) je výhodné v prípade proapoptotických génov, pretože sa predpokladá uľahčenie replikácie vírusovej DNA v cieľovej bunke skôr ako dôjde k aktivovaniu proapoptotického signálu. MLP promótor je aktivovaný približne sedem hodín po infekcii, teda ak replikácia genómu U3EE indukuje aktivitu proteínu E3-10.5 K. Adenovírusový vektor T1LT je nevyhnutný rovnako ako vektor U3EE až na to, že obsahuje ďalšiu deléciu v oblasti E1 a to takú, aby boli odstránené aminokyseliny 4 až 25 adenovírusových E1a proteínov 243R a 289R. Táto delécia porušuje schopnosť proteínu p300 viazať sa na tieto E1a proteíny.
U vírusov U3EE a T1LT bola stanovená ich schopnosť replikovať sa v normálnych ľudských bronchiálnych epiteliálnych bunkách (NHBE) a C33A (línia epiteliálnych nádorových buniek s defektnou p53 dráhou) a zabíjať ich. Ako kontrola bol použitý vektor L9IU. Výsledky týchto experimentov sú uvedené na obrázku č.3.
Nasledujúca tabuľka zhrňuje dáta:
·· ···· ·· ·· • « · · • · · · • · ··· • · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· ·
Tab. 1: Zhrnutie RTI a indexov selektivity vírusov
Vírus RTI (normálne bunky) RTI (nádorové bunky) index selektivity
L9IU 1,0 1,0 1,0
U3EE 12,5 0,0233 536
T1LT 10 0,066 152
Ako je možné vidieť z uvedených údajov, vykazujú vírusy U3EE a T1LT vysokú selektivitu na nádorové bunky. Ako už bolo rozoberané predtým, vírus L9IU vykazuje v prípade cyklizujúcich nádorových buniek mierne pozitívnu replikáciu oproti normálnym bunkám v pokojnom stave. Porovnaním pomerov ED5o(vírus)/ED50(kontrola) pre každý typ buniek predtým, ako je vypočítaný index selektivity, sú vplyvy týchto odchýlok minimalizované.
Termín „rekombinantný“ sa vzťahuje ku genómu, ktorý bol modifikovaný príslušnými rekombinantnými technikami.
Termín „vírus“ sa vzťahuje k akýmkoľvek intracelulárnym parazitom, ktoré nemajú mechanizmy na syntézu proteínov alebo na výrobu energie. Vírusový genóm môže byť tvorený RNA alebo DNA spojenou s obalovou proteínovou štruktúrou lipidovej membrány. Medzi príklady vírusov, ktoré sú prakticky užitočné v predmetnom vynáleze, patria rody baculoviridiae, parvoviridiae, picornaviridiae, herpesviridae, poxviridiae, adenoviridiae, picotrnaviridiae. Termín rekombinantný virus zahrňuje chimerické (alebo multimérne) vírusy, tzn. vektory konštruované pomocou komplementárnych kódujúcich sekvencií z viacej ako jedného subtypu vírusu. Toto je uvedené napr. v Feng a kol. Náture Biotechnology 15:866 až 870.
Termín „adenovírus“ je synonymom k termínu „adenovírusový vektor a vzťahuje sa k vírusom rodu adenoviridiae. Termín adenoviridiae sa vzťahuje celkovo k živočíšnym adenovírusom rodu mastadenovirus vrátane ľudskej, hovädzej, ovčej, konskej, psej, svinskej, myšej a opičej subgenerácie adenovírusov. Vyššie vymenované typy však nie sú v žiadnom smere limitujúce. Konkrétne ľudský adenovírus zahrňuje subgeneráciu A-F i jednotlivé sérotypy ich jednotlivých sérotypov a subgenerácie A-F vrátane typov ľudských adenovírusov 1, 2, 3, 4, 4a, 5,
·· • ···· • · ·· ·· ·· • · • ·
• • · ·
• • · • · • ··· ti t
• • · • • · • ·
·· • ·· ·· ·· ··
6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11A a Ad11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 a 91. Termín hovädzie adenovírusy zahrňuje, bez toho, aby tým bol nejako limitovaný, hovädzie adenovírusy typov 1, 2, 3, 4, 7 a 10. Termín psie adenovírusy zahrňuje, bez toho, aby tým bol nejako limitovaný, typy 1 (kmene CLL. Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) a 2. Termín konské adenovírusy zahrňuje, bez toho, aby tým bol nejako limitovaný, typy 1 a 2. Termín svinské adenovírusy zahrňuje, bez toho, aby tým bol nejako limitovaný, svinské typy 3 a 4. V uprednostňovanom uskutočnení vynálezu pochádza adenovírus z ľudského adenovírusu sérotypu 2 alebo 5.
Termín „promótor reagujúci na určitú dráhu“ sa vzťahuje k DNA sekvenciám, ktoré viažu určitý proteín a teda spôsobujú, aby v normálnej bunke gény v blízkosti tohto promótora na väzbu tohto proteínu reagovali na úrovni transkripcie. Tieto promótory môžu byť vytvorené začlenením responzívnych prvkov, čo sú sekvencie, na ktoré sa viažu transkripčné faktory. Tieto odozvy sú všeobecne induktívne a teda existuje niekoľko prípadov, kedy zvyšujúce sa hladiny proteínu znižujú transkripciu. Promótory reagujúce na určitú dráhu môžu byť prirodzene sa vyskytujúce alebo syntetické. Promótory reagujúce na určitú dráhu sú väčšinou konštruované s ohľadom na dráhu alebo funkčný proteín, ktorý je predmetom sledovania. Napríklad prirodzene sa vyskytujúci promótor reagujúci na p53 dráhu bude zahrňovať transkripčné kontrolné prvky aktivované prítomnosťou funkčného p53 ako je p21 alebo bax promótor.
Príležitostne môžu byť na vytvorenie syntetického promótora reagujúceho na určitú dráhu použité syntetické promótory obsahujúce väzbové miesta na p53 umiestnené po smere transkripcie (upstream) voči minimálnemu promótoru (napr. oblasť TATA box SV40). Syntetické promótory reagujúce na určitú dráhu sú všeobecne konštruované z jednej alebo viacerých kópií sekvencie, ktorá sa zhoduje v konvenčnom väzbovom motíve. Tieto konvenčné DNA väzbové motívy môžu byť ľahko určené. Tieto konvenčné sekvencie sú všeobecne usporiadané ako priame alebo repetície hlava-ku-koncu oddelené niekoľkými pármi báz. Prvky, ktoré zahrňujú repetície hlava-ku-hlave (napr. AGGTCATGACCT) sú nazývané palindrómy alebo obrátené repetície a tie s repetíciami koniec-ku-koncu sú nazývané repetície obrátené von.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· ·· · ···· ·· • · · · · · ··· · · · ··· ·· ··· ·· · ·· ·· ·· ·
Medzi príklady promótorov reagujúcich na určitú dráhu, ktoré sú užitočné v praxi predmetného vynálezu, patria syntetické promótory reagujúce na dráhu inzulínu, obsahujúceho konvenčnú väzbovú sekvenciu pre inzulín (Jacob a kol.
(1995) J. Biol. Chem. 270:27 773 až 27 779), promótor reagujúci na dráhu cytokínov, promótor reagujúci na dráhu glukokortikoidov (Lange a kol. (1992) J. Biol. Chem. 267:15 673 až 15 680), promótor reagujúci na dráhu IL1 a IL6 (Won K.A., Baumann H (1990) Mol. Celí. Biol. 10:3965 až 3978), promótor reagujúci na dráhu T3, promótor reagujúci na dráhu tyroidného hormónu, obsahujúci konvenčný motív: 5'AGGTCA 3', promótory reagujúce na dráhu TPA (TRE), promótory reagujúce na dráhu TGF-β (opísané v Grotendorst a kol. (1996) Celí Growth and Differentiation 7:469 až 480).
Ďalšie príklady promótorov reagujúcich na určitú dráhu sú v danej oblasti techniky dobre známe a je možné ich nájsť v databáze Database of Transkription Regulátory Regions on Eukaryotic Genomes, ktorá je prístupná na internetovej adrese http://www.eimb.rssi.ru/TRRD.
V uprednostňovanom uskutočnení vynálezu, ako je tu doložené príkladom, obsahuje vektor syntetický promótor reagujúci na dráhu TGF-β, ako napríklad promótor obsahujúci responzívne elementy SRE a PAI-RE, ktorý je aktívny v prítomnosti funkčnej dráhy TGF-β. PAI-RE sa vzťahuje k syntetickému responzívnemu elementu TGF-β, ktorý obsahuje sekvencie reagujúce na signál TGFβ, izolované z promótorovej oblasti aktivátora-l plazminogénu. Konštrukcia PAI-RE je opísaná nižšie v príklade 3. Promótor reagujúci na dráhu PAI-RE môže byť izolovaný ako fragment s veľkosťou 749 bp, ktorý je možné izolovať z plazmidu p800luc (ako je opísané vZonneveld a kol. (1998) PNAS 85:5525 až 5529 a je dostupný z GenBank pod prístupovým číslom J03836). SRE sa vzťahuje k syntetickému responzívnemu elementu TGF-β, ktorý obsahuje repetíciu 4 zoSmad-4 DNA väzbových sekvencii (GTCTAGAC, opísané vZawel a kol. (1998)
Mol. Celí 1:611 až 617). Konštrukcia SRE je opísaná nižšie v príklade 3. Responzívny element SRE môže byť vytvorený spojením komplementárnych oligonukleotidov kódujúcich Smad-4 väzbové sekvencie a klonovaním v plazmidovom vektore pGL#3-promótor luciferáza (komerčne dostupný od firmy ProMega).
Podobne „promótor reagujúci na p53 dráhu“ sa vzťahuje k transkripčnému kontrolnému elementu, ktorý je aktívny v prítomnosti funkčnej dráhy p53. Promótor ·· ···· • · · • · · • · · • · · • · · ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • ······ · • · · · · ·· ·· ·· · reagujúci na dráhu p53 môže byť prirodzene sa vyskytujúca transkripčná kontrolná oblasť v prítomnosti funkčnej dráhy p53, ako napr. promótory p21 alebo mdm2. Promótor reagujúci na dráhu p53 môže byť príležitostne tiež syntetická transkripčná oblasť aktívna v prítomnosti funkčnej dráhy p53, ako sú promótory reagujúce na dráhu SRE a ΡΑΙ-RE. p53-CON opisuje promótor reagujúci na dráhu p53, ktorý obsahuje syntetický responzívny element p53 konštruovaný prostredníctvom inzercie dvoch syntetických p53 konvenčných DNA väzbových sekvencií (ako opisuje Funk a kol. (1992) Mol. Celí Biol. 12:2866 až 2871) ktoré sú upstream k TATA boxu SV40. Konštrukcia promótora reagujúceho na dráhu p53-CON je opísaná nižšie v príklade
3. RGC sa vzťahuje k syntetickému promótoru reagujúcemu na dráhu p53 použitím jedinej väzbovej domény pre p53 identifikovanej v ribozomálnom génovom zväzku viď Kern a kol. (1991) Science 252:1708 až 1711 a Park a kol. (1996) Molecular Carcinogenesis 16:101 až 108. Responzívne elementy p53CON a RGC môžu byť konštruované spojením komplementárnych oligonukleotidov a p53 responzívne promótory môžu byť konštruované (ako je opísané v príklade 3) klonovaním vplazmidovom vektore pGL3-promótor luciferáza (komerčne dostupný od firmy ProMega).
Termín „cieľová bunka“ sa vzťahuje k bunke fenotypového stavu, v ktorom je nevyhnutné, aby bola ošetrená podávaním terapeutického transgénu. Použitím rôznych promótorových elementov reagujúcich na určitú dráhu je možné smerovať expresiu vírusu do akejkoľvek bunky s neporušenou danou dráhou. Napríklad represor replikácie vírusu môže byť exprimovaný v neoplastickej cieľovej bunke prostredníctvom použitia promótorov reagujúcich na dráhu TGF-β alebo p53. Represor replikácie vírusu môže byť exprimovaný tiež v artritickej cieľovej bunke prostredníctvom promótora reagujúceho na zápal, pričom vektor prípadne kóduje IL10.
Termín „operatívne pripojený“ sa vzťahuje ku spojeniu polynukleotidových prvkov vo funkčnom vzťahu. Sekvencia nukleovej kyseliny je „operatívne pripojená“ vtedy, ak je umiestnená do funkčného vzťahu s inou sekvenciou nukleovej kyseliny. Napríklad promótor alebo zosilňovač je operatívne pripojený ku kódujúcej sekvencií vtedy, ak ovplyvňuje transkripciu kódujúcej sekvencie. Operatívne pripojený znamená to, že sekvencie nukleotidov, ktoré sú spojované, sú väčšinou spojité. Avšak, pretože zosilňovače obyčajne plnia svoju funkciu vtedy, ak sú oddelené od ·· ···· ·· • · ···· ··· • · · ······ • · · · · · ··· · · · ··· ·· · · · ]| ·········· promótora niekoľkými kilobázami a sekvencie intrónov môžu byť rôzne dlhé, môžu byť určité polynukleotidy operatívne pripojené, ale nemusia priamo susediť a môžu ešte plniť funkciu podľa rôznych alel alebo chromozómov.
Termín „represor replikácie vírusu“ sa vzťahuje k proteínu, ktorý, ak je v danej bunke exprimovaný, podstatne potlačuje replikáciu vírusu. Represor replikácie vírusu je závislý od pôvodu rodičovského adenovírusového vektora, od ktorého je rekombinantný vektor podľa predmetného vynálezu odvodený, čo odborníci v danej oblasti techniky určite ocenia. Napríklad v prípade adenovírusových vektorov alebo iných DNA nádorových vírusov môže byť použitý fúzny konštrukt E2F-Rb, čo je opísané vEP prihláške č. 94 108 445, publikovanej 6.12.1995 (publikačné číslo 0 685 493 A1). Fúzny protein E2F-Rb sa skladá z DNA väzbovej domény a DP1 heterodimerizačnej domény ľudského proteínového transkripčného faktora E2F (aminokyseliny 95 až 286 z wild-type E2F) fúzovaného s doménou potlačujúcou rast Rb (aminokyseliny 379 až 928 wild-type Rb proteínu). E2F-Rb fúzny protein je účinným represorom E2F-dependentnej transkripcie a viaže bunky vG1. DNA väzbová doména je umiestnená v aminokyselinách 128 až 193 a dimerizačná doména sa nachádza v pozícii 194 až 289. Sekvencia ľudského proteínu E2F-1 je dostupná vGenBank pod prístupovým číslom M96577, uložené 10.8.1992. Ak je vektor konštruovaný pre použitie v iných druhoch, môžu byť použité E2F sekvencie od iných členov E2F rodiny z E2F iných druhov. V situácii, kedy je rekombinantný vírus založený na víruse, príbuznom s adenovírusom (AAV), sú rep protein a jeho deriváty účinnými represormi replikácie vírusu v neprítomnosti infekcie adenovírusom. V situácii, kedy je vírus odvodený od vírusu herpes simplex, môže byť ako účinný represor replikácie vírusu použitý protein ICPO-NX, čo je deletovaná forma ranného proteínu IPCO (Ltun a kol. (1998) J. Vtrol. 72:7785 až 7795). Podobne môže byť ako represor replikácie vírusu použitý akýkoľvek protein s dominantnou negatívnou aktivitou.
TGF-β a príbuzné proteíny vrátane aktivínu, inhibinsu a BMP sú účinnými prirodzenými antirozmnožovacími látkami a predpokladá sa, že hrajú dôležité úlohy v potlačení tumorogenicity. Vo svojej bioaktívnej forme je TGF-β homodimér s veľkosťou 25 kDa spojený disulfidovými väzbami, ktorý je exprimovaný prakticky vo všetkých ľudských tkanivách. Je zaujímavé, že veľa malígnych typov buniek si zachováva priebeh expresie, ktorý je pozorovaný v normálnych bunkách. TGF-β ·· ···· • · ·· ·· ··· ······ • · · · · · ··· · · · • · · · · ··· ·· · ·· ·· ·· · signalizuje prostredníctvom heteromérnych receptorových komplexov serín/treonínkinázovým receptorom typu I a II. Receptor typu II má vlastnú kinázovú aktivitu a po väzbe na TGF-β ligand heteromerizuje s receptorom typu I a transfosforyluje ho. Fosforylácia receptora typu I aktivuje jeho kinázovú aktivitu, ktorej výsledkom je fosforylácia Smäd, čo sú intraceluláme efektory. Fosforylovaný receptor typu I transportuje signály do bunky a výsledkom je odpoveď bunky vo forme napr. inhibície rastu. Je známe, že akonáhle sú Smäd komplexy vo vnútri jadra, aktivujú transkripciu cieľových génov buď tým, že samy pracujú ako transkripčné faktory alebo tým, že regulujú aktivitu iných transkripčných faktorov. O transkripčných faktoroch sa predpokladá, že sú regulované signálom TGF-β vrátane CTF/NF-1, FAST-1, Sp1, Jun, SRF/TRF, Oct a CREB. Výsledok týchto interakcií vedie k rôznym známym pleiotropným efektom TGF-β.
Transformačný rastový faktor-β (TGF-β) a jemu príbuzné proteíny sú účinnými inhibítormi množenia rôznych typov buniek. Malígny vývoj jednotlivých nádorov epiteliálneho a hematopoietického pôvodu zodpovedá strate antirozmnožovacieho a antiinvazívneho pôsobenia TGF-β. Bolo dokázané, že porucha signalizácie TGF-β zahrňuje mutácie alebo delécie alebo nedostatočnú expresiu receptorov a/alebo intracelulárnych efektorov dráhy prenosu signálu. Veľa malígnych nádorov, ktoré sú rezistentné voči TGF- β, sú tiež násobne defektné na iné gény potlačujúce nádor, čím je obmedzená možnosť využiť nahradenie génu potlačujúceho nádor v účinnej terapii.
Promotóry reagujúce na dráhu TGF-β boli konštruované pomocou začlenenia sekvencií z plazminogénového aktivátorového inhibítora-1 (PAl-promótor) alebo väzbových miest na Smad4/DPC4 (SRE-promótor) upstream k TATA boxu SV40.
Aktivity týchto promótorov boli zistené pomocou merania prechodnej transfekcie pomocou luciferázy ako značky. Výsledky sú uvedené v tab. 2.
Tabuľka č.2 ·· ···· • · · • · · • · e • · · ·· · ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • · ··· · · · • · · · · ·· ·· ·· ·
Relatívna aktivita luciferázy* (násobok)
Línia buniek TGF-β PAI promótor PAI promótor SRE promótor SRE
promótor dráha -TGF-β + TGF-β - TGF-β + TGF-β
Hep3b normálna 68,82 128,42 105,02 86,47
293 normálna 57,62 88,78 9,40 - 46,94
A549 normálna 33,26 56,76 2,87 ~ 17,93
Panel normálna 15,36 141,80 1,14 29,03
087 normálna 110,40 73,88 7,42 7,85
MCF-7 defektná 18,93 10,72 1,28 1,22
WIDR defektná 10,66 4,41 1,24 1,57
MDA-MB468 defektná 2,28 1,10 1,33 0,62
AsPC-1 defektná 6,56 1,24 1,79 0,76
Caco2 defektná 13,07 13,8 1,18 0,96
MicaPaca2 defektná 14,08 1,81 0,79 26,34
* aktivita luciferázy je vyjadrovaná vo vzťahu k aktivite získanej v prípade konštruktu bez promótora
Tieto výsledky ukazujú, že obidva promótory sú aktívne len v bunkách s funkčnou cestou prenosu signálu TGF-β. V bunkovej línii s defektnou TGF-β dráhou ako je MDA-MB468, ktorá je defektná na prenos signálu TGF-β z dôvodu homozygotnej delécie Smad4/DPC4, obnovuje transfekciu PAl-promótora alebo SRE-promótora operatívne pripopojených k luciferáze a infekciu rekombinantným adenovírusom kódujúcim Smad4 aktivitu obidvoch vyššie spomínaných responzívnych elementov a ďalej potvrdzuje špecifitu promótorov obsahujúcich responzívne prvky pre dráhu TGF-β, čo je ukázané pomocou dát v tab. 3.
·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· ·· · ···· ·· • · · · · » ··· · · · ··· ·· ···
Tabuľka č.3 Obnovenie aktivity promótora reagujúceho na TGF-β v bunkách MDA-
MB-468 po infekcii rekombinantným (relatívna aktivita luciferázy* (násobok)) adenovírusom kódujúcim Smad4/DPC4
Vírus Dávka PAI promótor -TGF-B PAI promótor + TGF-β SRE promótor - TGF-β SRE promótor + TGF-β
BGCA 1 x 108, 1,0 1,53 1,00 1,00
BGCA 1 x 109 0,86 1,06 0,33 0,77
DCCA 1 x 108 1,13 4,86 8,50 139,17
DCCA 1 x 109 1,93 31,60 22,00 370,84
*aktivita luciferázy je vyjadrovaná vo vzťahu k aktivite získanej v prípade konštruktu s BGCA bez prídavku TGF-β. BGCA je rekombinantný adenovirus exprímujúci gén pre β-gal DCCA je rekombinantný adenovirus kódujúci Smad4/DPC4
Potom bol skonštruovaný piazmid obsahujúci PAl-promótor operatívne pripojený k E2F-Rb a bola testovaná jeho schopnosť selektívne potlačovať E2 promótor v bunkách s neporušenou dráhou TGF-β. Pri meraní prechodnej transfekcie vykazovala transfekcia E2 promótora pripojeného k luciferáze s PAIpromótorom operatívne pripojeným k E2F-Rb selektívnu represiu aktivity E2 promótora v bunkách 293 (s normálnou TGF-β dráhou) a nikdy v bunkách MDAMB468 (s defektnou TGF-β dráhou), čo je ukázané v tab. č. 4. Dôvodom bola selektívna expresia E2F-Rb v bunkách 293. Podľa predpokladu transfekcie CMVE2F-Rb, ktorý exprimuje E2F-Rb v obidvoch týchto bunkových líniách, inhibovala aktivitu E2 promótora v obidvoch bunkových líniách.
Tabuľka č. 4 Selektívna represia aktivity E2 promótora PAI-E2F-Rb v bunkách 293 verzus bunky MDA-Mb-468 (relatívna aktivita luciferázy* (%)) ·· ·· 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9 999 9 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 • e ····
Represor
Žiadny
CMV-E2F-Rb
PAI-E2F-RĎ bunky MDA-Mb-468 100 9,38 124,02 bunky 293 100 10,53 17,38 “aktivita luciferázy je vyjadrená v percentách vo vzťahu k aktivite získanej v prípade konštruktu bez premótora
Promótory reagujúce na dráhu p53 boli konštruované včlenením známych väzbových miest pre p53 buď z ribozomálneho génového zväzku (RGC-promótor) alebo vysoko afinitných väzbových miest pre p53 (p53CON-promótor). Aktivity týchto promótorov boli stanovené prostredníctvom merania prechodnej transfekcie pomocou luciferázy ako značky. Výsledky týchto experimentov sú uvedené nižšie v tab. 5.
Tabuľka č.5 Aktivity promótorov reagujúce na p53 v rôznych líniách buniek (relatívna aktivita luciferázy*)
Línia buniek status p53 p53 CON promótor RGC-promótor
U87 wild-type 3921,12 112,33
A549 wild-type 647,30 16,36
MCF-7 wild-type 445,25 12,26
293 wild-type, inaktívny 13,03 0,62
Hep3b nulový 4,62 1,22
NCI-H358 nulový 0,35 0,56
Pane 1 mutantný 1,56 1,02
WIDR mutantný 16,17 1,07
MDA-Mb-468 mutantný 4,88 0,87
AsPC-1 mutantný 054 1,08
Caco-2 mutantný 14,9 1,13
MicaPaca2 neznámy 28,43 1,24
t * aktivita luciferázy je vyjadrovaná vo vzťahu k aktivite získanej v prípade konštruktu bez promótora ·· ···· ··· ···· ·· • · · · · · ··· · · · ··· · · ··· ·· · ·· ·· ·· ·
Výsledky naznačujú, že obidva tieto responzívne elementy sú aktívne v bunkách s funkčným p53. Aby bolo potvrdené, že aktivita promótora reagujúceho na p53 je závislá na funkčnosti p53, boli dve línie buniek WIDR a U87 transfekované RGC promótorom, ktorý riadi expresiu génu pre luciferázu a buď prázdnym kontrolným adenovírusovým vektorom (ZZCB) alebo rekombinantným adenovírusom konštitutívne produkujúcim p53 pod kontrolou CMV promótora (FTCB). Výsledky týchto experimentov sú uvedené v tab. č. 6.
Tabuľka č. 6 Obnovenie/zvýšenie aktivity promótora reagujúceho na p53 v bunkách WIDR a U87 po infekcii rekombinantným adenovírusom kódujúcim p53 (relatívna aktivita luciferázy*)
vírus dávka WIDR U87
ZZCB 1 x108 1,0 1,0
ZZCB 1 x109 1,25 0,67
FTCB 1 x 108 4,71 20,30
FTCB 1 x 109 29,00 109,95
* aktivita luciferázy je vyjadrovaná vo vzťahu k aktivite získanej v prípade infekcie ZZCB
Ako je zrejmé z uvedených údajov, aktivita promótora reagujúca na p53 sa zvyšuje v závislosti od dávky s rastúcou aktivitou p53.
Boli pripravené rekombinantné adenovírusové vektory, ktoré kódujú kódujúcu sekvenciu E2FRb pod kontrolou buď promótora reagujúceho na dráhu TGF-β (PAI alebo SRE) alebo promótora reagujúceho na dráhu p53 (RGC alebo p53CON). Do vektorov bol ako značka začlenený gén kódujúci zelený fluoreskujúci proteín. Vo vzniknutých vírusoch bola testovaná pomocou merania cytopatického efektu (CPE) ich schopnosť selektívne sa replikovať a zabíjať bunky s defektom dráby TGF-β alebo p.53. Výsledky sú ukázané na priloženom obr. 1. Pri MRC9 (s pozitívnou dráhou p53 aj TGF-β) bol wild-type adenovírus schopný replikovať sa a indukovať CPE už pri nízkych koncentráciách (1 x 106 častíc/ml), zatiaľ čo vektory zacielené na dráhy TGF-β alebo p53 neboli schopné pri týchto koncentráciách indukovať CPE. Len pri testovaní vyšších dávok (1x10® častíc/ml) vykazovali vektory zacielené na • · • · · · · · · • · · · · · • · · ··· · · · • · · · · ·· ·· ·· · ·· ···· ·· ·· • · · • · · • · · ·· * danú dráhu určitý CPE. Na druhej strane v líniách buniek ako sú WIDR (defekty v dráhach TGF-β a p53) a Hep3B (bez p53 a s defektnou dráhou TGF-β pri absencii exogénneho TGF-β) boli vektory zacielené na určitú dráhu účinnými induktormi CPE už pri nízkych koncentráciách (1 x 10® častíc/ml) podobne ako wild-type vírusy. Fluorescenčná mikroskopia buniek Hep3B infikovaných vektormi zacielenými na danú dráhu (SRE-Ad a p53CON-Ad) odhalila vysokú hladinu expresie transgénu a rozšírenie vírusu v kultúre, a to už vtedy, ak bola infikovaná nízkou koncentráciou vírusových častíc (1x10® častíc/ml, v čase 2 h). Naopak bunky Hep3B infikované replikačne defektným (ElA-deletovaným) GFP, ktorý kóduje adenovírus (GFCB), s rovnakou koncentráciou (1 x 105 častíc/ml), nevykazovali žiadnu expresiu GFP.
Ako už bolo predtým naznačené, sú vektory podľa predmetného vynálezu schopné sa za selektívnych podmienok selektívne replikovať a spôsobovať lýziu cieľovej bunky. To však neznamená, že by do týchto vektorov nemohli byť začlenení ďalší nositelia selektivity alebo toxicity. Predmetný vynález rovnako poskytuje rekombinantné adenovírusy obsahujúce ďalšie modifikácie vírusového genómu ako sú cielené modifikácie, transgénne expresné kazety alebo modifikáciu vírusového genómu s cieľom uľahčiť selektívnu replikáciu v danom type bunky alebo v bunke daného fenotypu.
Termín „cielená modifikácia sa vzťahuje k modifikáciám vírusového genómu, ktoré sú navrhnuté tak, aby výsledkom bola schopnosť prednostne infikovať konkrétny typ bunky. Špecifita k typu bunky alebo zacielenie bunkového typu môže byť dosiahnuté tiež u vektorov odvodených od vírusov, pre ktoré je charakteristická veľká nákazlivosť, ako napr. adenovírus, a to modifikáciou vírusových obalových proteínov. Zacielenie bunky môže byť vykonané napr. u adenovírusových vektorov selektívnou modifikáciou vírusových genómových nevláknitých oblastí (gombík) a sekvencií kódujúcich vláknité proteíny. Cieľom je dosiahnuť expresiu modifikovaných nevláknitých a vláknitých domén, ktoré vykazujú špecifickú interakciu so špecifickými bunkovými povrchovými receptormi. Príklady týchto modifikácií sú opísané napr. v publikáciách Wickham a kol. (1997) J. Virol 71 (11):8221 až 8229 (začlenenie RGD peptidov do adenovírusových vláknitých proteínov); Arnberg a kol. (1997) Virology 227:239 až 244 (modifikácia adenovírusových vláknitých génov s cieľom dosiahnuť tropizmus k oku a urogenitálnemu orgánu); Harris a Lemoine (1996) TIG 12(10):400 ·· ···· ·· ·· ·· • · · · • · · · • · · ··· • · · ·· ·· ·· až 405; Stevenson a kol. (1997) J. Virol. 71(6):4782 až 4790; Michael a kol. (1995) Gene Therapy 2:660 až 668 (začlenenie fragmentu peptidu uvoľňujúceho gastrín do adenovírusového vláknitého proteínu); Ohno a kol. (1997) Náture Biotechnology 15:763 až 767 (začlenenie väzbovej domény IgG pre Proteín A do vírusu Sindbis). Medzi iné spôsoby ako dosiahnuť špecifické zacielenie bunky je konjugácia protilátok alebo fragmentov protilátok s obalovými proteínmi (v/'ďnapr. Michael a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268:6866 až 6869; Watkins a kol. (1997) Gene Therapy 4:1004 až 1012; Douglas a kol. (1996) Náture Biotechnology 14:1574 až 1578. Príležitostne môžu byť na povrch vírusu konjugované konkrétne skupiny s cieľom dosiahnuť zacielenie (viď Nilson a kol. (1996) Gene Therapy 3:280 až 286 (konjugácia EGF k retrovírusovým proteinom). Tieto rekombinantne modifikované vektory môžu byť produkované v súlade s praxou predmetného vynálezu.
Termín „transgénna expresná kazeta sa vzťahuje k promótoru funkčnému v cieľovej bunke, ktorý je operatívne pripojený k terapeutickému transgénu. Termín promótor sa vzťahuje k nukleotidovým sekvenciám, ktoré ovplyvňujú transkripciu inej nukleotidovej sekvencie. Medzi príklady promótorov patria slabé konštitutívne promótory, časové vírusové promótory a regulovateľné promótory.
Termín „časové promótory” sa vzťahuje k promótorom, ktoré riadia transkripciu terapeutického transgénu v neskoršom štádiu cyklu vírusu v porovnaní s promótorom, ktorý kontroluje expresiu promótora reagujúceho na určitú dráhu. Medzi príklady týchto časovo regulovaných promótorov patrí adenovírusový hlavný neskorý promótor (MLP), ďalšie promótory ako je E3. V uprednostňovanom uskutočnení vynálezu je použitý MLP promótor. V prípade vírusov herpes simplex môže byť použitý promótor LAP (Latent Activated Promotor).
Termín „regulovateľné promótory sa vzťahuje k indukovateľným promótorom, tkanivovo špecifickým alebo nádorovo špecifickým promótorom. Termín „indukovateľný promótor sa vzťahuje k promótorom, ktoré uľahčujú transkripciu terapeutického transgénu výhodne (alebo len) za určitých podmienok a/alebo v závislosti od externého chemického alebo iného podnetu. Príklady indukovateľných promótorov sú vo vedeckej literatúre známe (viď napr. Yoshida a Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426 až 430; Lida a kol. (1996) J. Virol. 70(9):6054 až 6059; Hwang a kol. (1997) J. Virol 71 (9):7128 až 7131; Lee a kol. (1997) Mol. Celí. Biol. 17(9):5097 až 5105; Dreher a kol. (1997) J. Biol. Chem.
·· ·· t '1* • · • · • · • · ·· ··· · ·
272(46):29364 až 29371. Príklady radiačné indukovateľných promótorov sú opísané v Manome a kol. (1998) Human Gene Therapy 9:1409 až 1417). Iná úroveň selektivity môže byť získaná pri použití tkanivovo špecifických a nádorovo špecifických promótorov. Tkanivovo špecifické a nádorovo špecifické promótory sú v danej oblasti technicky veľmi dobre známe a zahrňujú promótory aktívne predovšetkým v hladkom svalstve (α-aktínový promótor), špecifické pre pankreas (Palmiter a kol. (1987) Celí 50:435), špecifické pre črevá (Rovet a kol. (1992) J. Biol. Chem. 267:20765; Lemaigne a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268:19896; Nitsch a kol. (1993) Mol. Celí. Biol. 13:4494), špecifické pre žalúdok (Kovarik a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268:9917; špecifické pre hypofýzu (Rhodes a kol. (1993) Genes Dev. 7:913; špecifické pre prostatu atď.
Termín ,,terapeutický transgén sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencii, ktorej expresiou v cieľovej bunke vzniká terapeutický účinok. Termín terapeutický transgén zahrňuje, bez toho aby tým však bol nejako limitovaný, gény potlačujúce nádor, antigénne gény, cytotoxické gény, cytostatické gény, gény aktivujúce pro-liek, apoptotické gény, farmaceutické gény alebo antiangiogénne gény. Vektory podľa predmetného vynálezu môžu byť použité na produkciu jedného alebo viacerých terapeutických transgénov, buď spoločne prostredníctvom použitia IRES elementov alebo prostredníctvom nezávisle regulovaných promótorov.
Termín „gén potlačujúci nádor sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencii, ktorej expresia v cieľovej bunke vedie ku schopnosti potlačiť neoplastický fenotyp a/alebo indukovať apoptózu. Medzi príklady génov potlačujúcich nádor, ktoré sú užitočné v uskutočneniach predmetného vynálezu, patrí gén p53, gén APC, gén DPC-4/Smad4, gén BRCA-1, gén BRCA-2, gén WT-1, retinoblastomový gén (Lee a kol. (1987) Náture 329:642), gén MMAC-1, gén pre proteín adenomatóznej kolipolypózy (Albertsen a kol., US patent 5 783 666, vydaný 21.7.1998), gén DCC, gén MMSC-2, gén NF-1, gén na potlačenie nasofaryngálneho karcinómu, ktorý je na chromozóme 3p21.3. (Cheng a kol. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95:3042 až 3047), gén MTS1, gén CDK4, gén NF-1, gén NF2 a gén VHL.
Termín „antigénne gény sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencii, ktorej expresia v cieľovej bunke vedie k produkcii bunkového povrchového antigénneho proteínu, ktorý môže byť rozpoznaný imunitným systémom. Medzi príklady ·· ···· ·· ·· • · ·· • · · • · · • · • · ··
··· ·· ·· · antigénnych génov patrí karcinoembryonický antigén (CEA), p53 (ako je opísaný v Levine, Medzinárodná patentová prihláška č. W094/02167, publikovaná 3.2.1994). Aby bolo uľahčené imunitné rozpoznanie, môže byť antigénny gén fúzovaný s antigénom I. triedy MHC.
Termín „cytotoxický gén sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencií, ktorej expresia v bunke vedie k toxickému účinku. Príklady týchto cytotoxických génov zahrňujú nukleotidové sekvencie kódujúce pseudomonádový exotoxín, ricínový toxín, toxín diptérie a pod.
Termín „cytostatický gén sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencií, ktorej expresia v bunke vedie k zastaveniu bunkového cyklu. Medzi príklady týchto cytostatických génov patrí p21, retinoblastómový gén, gén fúzneho proteínu E2F-Rb, gény kódujúce inhibítory cyklíndependentnej kinázy ako napr. P16, p15, p18 a p19, špecifický homeoboxný gén (GAX) zabraňujúci rastu (opísaný v Branellec a kol., W097/16459, publikované 9.5.1997 a W096/30385, publikované 3.10.1996).
Termín „cytokinový gén sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencií, ktorej expresia v bunke vedie k produkcii cytokínu. Príkladom týchto cytokínov sú GM-CSF, interleukíny, predovšetkým IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferóny podtypu α, β a γ predovšetkým interferón a-2b a fúzie ako sú interferón α-2α-1.
Termín „chemokínový gén sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencií, ktorej expresia v bunke vedie k produkcii cytokínu. Termín chemokín sa vzťahuje ku skupine štruktúrne príbuzných nízkomolekulárnych cytokínových faktorov, ktoré sú vylučované bunkami a ktoré sú štruktúrne príbuzné a majú mitogénne, chemotaktické alebo zápalové aktivity. Primárne to sú katiónové proteíny so 70 až 100 aminokyselinovými zvyškami, ktoré majú štyri konzervatívne cysteínové zvyšky. Tieto proteíny môžu byť rozdelené do dvoch skupín a to na základe medzier medzi dvoma N-koncovými cysteínmi. V prvej skupine sú dva cysteíny oddelené jediným zvyškom (C-x-C), zatiaľ čo v druhej skupine spolu bezprostredne susedí (C-C). Medzi „C-x-C chemokíny patrí napr. doštičkový faktor 4 (PF4), doštičkový základný proteín (PBP), interleukín 8 (IL-8), proteín stimulujúci aktivitu rastu melanómu (MGSA), makrofágový zápalový proteín 2 (MIP-2) myší Mig (m119), kurací 9E3 (alebo pCEF-4), prasacie alveolárne makrofágové chemotaktické faktory I a II (AMCF-I a II), faktor stimulujúci rast pre-B-buniek (PBSF) a IP10. Medzi členy „C-C ·· ···· skupiny patrí napr., bez toho aby tým však bol akokoľvek limitovaný, monocytový chemotaktický proteín 1 (MPC-1), monocytový chemotaktický proteín 2 (MCP-2), monocytový chemotaktický proteín 3 (MPC-3), monocytový chemotaktický proteín 4 (MCP-4), makrofágový zápalový proteín 1a (ΜΙΡ-1-α), makrofágový zápalový proteín 1β (ΜΙΡ-1-β), makrofágový zápalový proteín 1γ (ΜΙΡ-1-γ), makrofágový zápalový proteín 3-a (MIP3-a), makrofágový zápalový proteín 3 β (ΜΙΡ3-β), chemokín (ELC), makrofágový zápalový proteín 4 (MIP-4), makrofágový zápalový proteín 5 (MIP-5), LD78 β, RANTES, SIS-epsilon (p500), chemokín týmusu a chemokín regulovaný aktiváciou (TARC), eotaxín, I-309, ľudský proteín HCC-1/NCC-2, ľudský proteín HCC-3, myší proteín C10.
Termín „farmaceutický gén sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencii, ktorej expresia vedie k produkcii proteínu, ktorý v cieľovej bunke vykazuje farmaceutický účinok. Medzi príklady farmaceutických génov patrí proinzulínový gén a jeho analógy (ako je opísané v medzinárodnej patentovej prihláške č. W098/31397 gén na rastový hormón, dopamin, serotonín, epidermálny rastový faktor, GABA, ACTH, NGF, VEGF (na zvýšenie zásobovania cieľového tkaniva krvi, na indukciu angiogenézy, W098/32859, publikované 30.7.1998), trombospondín atď.
Termín „proapoptotický gén sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencii, ktorej expresia vedie k programovanej smrti bunky. Medzi príklady proapoptotických génov patrí p53, adenovírusový E3-11. 6K (pochádzajúci z Ad2) alebo adenovírusový E31O.5K (odvodený od Ad), adenovírusový gén E4orf4, gény p53 dráhy a gény kódujúce kaspasy.
Termín „gény aktivujúce pro-liek sa vzťahuje k nukleotidovým sekvenciám, ktorých expresia vedie k produkcii proteínu, ktorý je schopný premieňať terapeuticky neúčinnú zlúčeninu na terapeuticky účinnú, ktorá robí bunku náchylnú k smrti vplyvom vnútorných faktorov alebo ktorá spôsobuje toxické podmienky v bunke. Príkladom génu aktivujúceho pro-liek je gén pre cytozíndeaminázu. Cytozíndeamináza premieňa 5-fluórcytozín (5-FC) na 5-fluóruracil (5FU), čo je účinná protinádorové látka. Lýzia nádorových buniek poskytuje miestny zhluk cytozíndeaminázy, ktorá je schopná v danom mieste nádora premieňať 5FC na 5FU a výsledkom je usmrtenie mnohých okolitých nádorových buniek. Toto vedie k smrti veľkého počtu nádorových buniek a to bez nutnosti infikovať tieto bunky ·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· · ·· • · · • · · • ··· · • · •
• · • · · • · • · • · ·· · adenovírusom (tiež označované ako „efekt vedľa stojaceho”). Rovnako môže byť použitý gén tymidínkinázy (TK) (vid Woo a kol., US patent č. 5 631 236, vydaný 20.5.1997 a Freeman a kol., US patent č. 5 601 818, vydaný 11.2.1997), pričom bunky exprimujúce produkt génu TK sú náchylné k selektívnemu usmrteniu podávaním gancyklovírusu.
Termín „antiangiogénne gény sa vzťahuje k nukleotidovej sekvencií, ktorej expresia vedie k extracelulámej exkrécii antiangiogénnych faktorov. Antiangiogénne faktory zahrňujú angiostatín, inhibítory vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF) ako je Tie 2 (opísané v PNAS (USA) (1998) 95:8795 až 8800), endostatín.
Odborníkom v danej oblasti techniky bude iste zrejmé, že na použitie v príkladoch predmetného vynálezu môžu byť urobené modifikácie a/alebo delécie vyššie spomínaných génov, ktoré by kódovali funkčné subfragmenty wild-type proteínu. Napríklad odkaz na gén p53 nezahrňuje len wild-type proteín, ale tiež modifikované p53 proteíny. Medzi príklady týchto modifikovaných p53 proteínov patria tiež modifikácie p53, ktoré zvyšujú jadrovú retenciu, deléciu napr. aminokyselín Δ13-19, ich cieľom je eliminovať konvenčné miesto štiepenia pre kalpaín, modifikácie s cieľom oligomerizovať domény (ako je opísané v Bracco a kol., W097/0492 alebo v US patente č. 5 573 925).
Odborníkom v danej oblasti techniky bude zrejmé, že vyššie spomínané terapeutické gény môžu byť vylučované do média alebo môžu byť lokalizované do konkrétnych intracelulárnych miest a to prostredníctvom začlenenia smerujúcej skupiny ako je signálny peptid alebo signál pre jadrovú lokalizáciu (NLS). V definícii terapeutického transgénu sú rovnako zahrnuté fúzne proteíny terapeutického transgénu so štruktúrnym proteínom vírusu herpes simplex typu 1 (HSV-1) VP22. Fúzne proteíny obsahujíce VP22 signál sú v prípade, kedy sú syntetizované v infikovanej bunke, exportované von z infikovanej bunky a účinne prenikajú do okolitých neinfikovaných buniek a to do vzdialenosti približne 16 buniek. Tento systém je konkrétne užitočný v spojení s transkripčne aktívnymi proteínmi (napr. p53), pretože fúzne proteíny sú účinne transportované do jadra okolitých buniek. Toto je uvedené napr. v Elliott, G. & O'Hare, P. Celí. 88:223 až 233 (1997); Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Náture Biotechnology. 15:205 (1997); OHare a kol. W097/05265, publikované 13.2.1997. Podobné smerujúce skupiny ·· ·· » · ·
B · · ·» ···· • · · • · · 23 ·..· :
odvodené od HIV Tat proteínu sú opísané tiež vo Vives a kol. (1997) J. Biol. Chem. 272:1601 až 16017.
Medzi ďalšie modifikácie, ktoré vedú ku zvýšeniu účinnosti vektorov podľa predmetného vynálezu, patria bez toho, aby boli akokoľvek limitujúce, zmeny v rámci E1, začlenenie mutácií do E4 s cieľom zvýšiť cytotoxicitu (Muller a kol. (1992) J. Virol. 66:5867 až 5878), vyššia regulácia vírusových smrtiacich proteínov ako sú proteíny E4orf4 alebo E3 11.6K.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu a je to doložené príkladmi, obsahuje vektor predmetného vynálezu adenovírus replikujúci sa v závislosti od podmienok, ktorý obsahuje promótor reagujúci na dráhu p53 alebo TGF-β, ktorý riadi expresiu fúzneho proteínu E2F-Rb. Ďalej vektor obsahuje gén cytozíndeaminázy, ktorý je pod kontrolou časového E3 promótora. V týchto prípadoch je cytozíndeamináza produkovaná v nádorových bunkách len po replikácii vírusu. V uprednostňovanom uskutočnení predmetného vynálezu je gén na premenu pro-lieku pod kontrolou relatívne slabého alebo tkanivovo špecifického alebo nádorovo špecifického promótora.
V inom uskutočnení predmetného vynálezu vektor obsahuje rekombinantný adenovírus s promótorom reagujúcim na dráhu p53 alebo TGF-β, ktorý riadi expresiu fúzneho proteínu E2F-Rb a transgénnu expresnú kazetu exprimujúcu cytozíndeaminázu samotnú alebo v bi-cistronickej expresnej kazete obsahujúcej cytozíndeaminázu a prvok IRES a proteín ΜΙΡ-3-alfa. Pretože je cytozíndeamináza exprimovaná, je po podaní pro-lieku, ako je 5-fluórcytozín, dosiahnuté usmrtenie nádorovej bunky. Nízka hladina expresie ΜΙΡ-3-alfa bude pomáhať vo vývoji protinádorovej imunity.
V súvislosti s konštrukciou prvkov reagujúcich na určitú dráhu, ako je napr. produkcia terapeutického účinku, kedy môže byť súčasne sledovaná viac než jedna dráha, sú tu používané zameniteľné víacúrovňové, multifunkčné alebo násobné kaskády reagujúce na danú dráhu. Odborníkom v danej oblasti techniky bude zrejmé, že vektorové kontrolné prvky, ktoré sú opísané vyššie, môžu byť kombinované a to tak, aby poskytli násobnú úroveň selektivity vektorov podľa predmetného vynálezu. Ako príklad multiúrovňovej kontroly je možné uviesť adenovírus replikujúci sa v závislosti od podmienok, ktorý sa môže replikovať a ·· ···· zabíjať bunky, ktoré majú defekty buď v Rb, TGF-β alebo p53 dráhe. Tieto vektory budú zahrňovať expresiu dominantného negatívneho inhibítora replikácie vírusu kontrolované promótorom reagujúcim na dráhu p53 ako aj primárnu úroveň kontroly. Výsledkom v akejkoľvek bunke s funkčným p53 (ako sú všetky normálne bunky), ale nikdy v bunke s inaktívnym p53, bude expresia dominantného negatívneho inhibítora a replikácie vírusu blokovaná. Tento vektor sa však môže replikovať v nádorových bunkách s funkčným p53, ale s defektami v iných dráhach ako napr. TGF-β a Rb dráhe. Teda môžu byť inzertované ďalšie úrovne kontroly, ktoré budú podstatne inaktivovať funkčný p53 v nádorových bunkách, čím umožnia replikáciu vírusu, aj keď sú iné dráhy defektné.
Druhou úrovňou kontroly bude rovnaký vektor obsahovať expresnú kazetu obsahujúcu adenovirusový proteín E1B-55K, ktorý môže funkčne inaktivovať p53, pod kontrolou promótora, ktorý je aktívny len v bunkách s defektnou TGF-β dráhou. Promótor, ktorý je aktívny len v bunkách s defektnou TGF-β dráhou, môže byť konštruovaný inzertovaním väzbových miest pre represor do promótora a to tak, že expresia represora pomocou promótora reagujúceho na TGF-β niekde na vektore povedie k blokovaniu aktivity promótora v bunkách s neporušeným TGF-β signalizovaním. Na druhej strane v bunkách, ktoré majú TGF-β dráhu defektnú nebude represor syntetizovaný a teda bude promótor aktívny. Vzhľadom k expresii E1B-55K pomocou promótora, ktorý je aktívny len v bunkách s defektnou TGF-β dráhou, je inaktivovaný endogénny p53. Príležitostne môže byť použitý akýkoľvek prirodzený promótor, ktorého aktivita je z dôvodu TGF-β signalizovania znižovaná. Začlenenie dvoch vyššie spomínaných expresných kaziet zaistí, že dominantný negatívny inhibítor bude exprimovaný len vtedy, keď budú dráhy p53 a TGF-β normálne (vedie k blokovaniu replikácie), ale nikdy vtedy, keď bude jedna alebo obidve dráhy defektné (vedie k replikácii vírusu).
Ako tretia úroveň kontroly je v rovnakom vektore použitá expresia proteínu ako je Smadľ alebo akákoľvek iná dominantná negatívna forma Smäd, ktorá je schopná inaktivovať TGF-β dráhu (Nakao a kol. Náture 1997 389 (6651):631 až 635) a je kontrolována E2F responzívnym promótorom. E2F responzívny promótor (ako je E2F1 promótor, E2 promótor alebo syntetický promótor s viacväzbovými miestami pre E2F upstream k minimálnemu promotoru ako je SV40 TATA box) je aktívny ·· ···· • · ·· • · ·· · · · · · ··· ·· · · · · · ·· □ ς ······ ··· · · · *- ►’ ··· ····· ·· · ·· ·· ·· · vtedy, ak je Rb dráha defektná. Vzhľadom k tretej úrovni kontroly je v bunkách s defektnou Rb dráhou exprimovaný Smad7, ktorý naopak inaktivuje Smad4 a blokuje cestu prenosu signálu TGF-β. Teda je vytvorený E1B-55K a p53 je inaktivovaný, čo vedie k nedostatečnej expresii dominantného negatívneho inhĺbitora. V dôsledku toho môže replikácia vírusu prebiehať. Na druhej strane, ak je je Rb dráha normálna, potom Smad7 nie je syntetizovaný a cesta prenosu signálu TGF-β teda prebieha normálne. Preto vtedy nie je vytvorený E1B-55K a výsledkom je funkčný p53, ktorý je schopný exprimovať dominantný negatívny inhibítor a tým blokovať replikáciu vírusu.
Pri všetkých troch vyššie uvedených úrovniach kontroly môže viesť defekt jednej alebo dvoch alebo troch dráh (Rb, TGF-β a p53) k replikácii vírusu a bunkovej lýzii. Replikácia vírusu nebude prebiehať len vtedy, keď budú všetky tri dráhy funkčné ako je tomu v normálnych bunkách.
Ako iste ocenia odborníci v danej oblasti techniky, môžu byť vektory predmetného vynálezu použité vo veľa modifikáciách pri detekcii a liečbe širokého spektra defektov dráh a to pomocou rady promótorov reagujúcich na určitú dráhu. V uprednostňovanom uskutočnení vynálezu, a je to doložené príkladom, je však rekombinantný adenovírusový vektor odvodený od rodu Adenoviridiae. Konkrétne uprednostňované vírusy sú odvodené od ľudského adenovírusu typu 2 alebo 5. Ak je použitý adenovírusový vektor ako rodičovský vektor, potom je výhodným inhibítorom replikácie vírusu fúzny proteín E2F-RB.
Vo výhodnejšom uskutočnení predmetného vynálezu je v prípade, ak sú použité vektory predmetného vynálezu na liečbu ochorení spojených s nekontrolovaným bunkovým rozmnožovaním, uprednostňované použitie adenovírusového vektora obsahujúceho špecifické delécie v oblasti E1A a to také, aby došlo k eliminácii schopnosti produktu génu E1a viazať sa na p300 a Rb proteíny, zatiaľ čo transaktivačná funkcia domény E1a CR3 zostáva nezmenená. Vektory predmetného vynálezu obsahujú delécie v kódujúcej sekvencií E1a s cieľom eliminovať p300 a p105Rb väzbové miesta v 13S kódujúcej sekvencií. Vo výhodnejšom uskutočnení predmetného vynálezu sú p300 väzbové delécie reprezentované deléciami aminokyselín od asi 4 do asi 25 alebo od asi 36 do asi 49.
Delécie v sekvencií kódujúcej Ela 289R nevyhnutné na dosiahnutie eliminácie väzby p300 a pRb sú výhodnejšie čo najmenšie a to preto, aby sa zabránilo ·· ···· • ·
t • · · · • · · · · · · • · · ·· ·· • · • · ·· porušeniu sekundárnej a terciárnej štruktúry proteínu E1a289R. Aby bola vylúčená väzba p300, je výhodnejšie, aby bola v sekvencii DNA kódujúcej p300 väzbové domény 289R začlenená mutácia. Z pohľadu eliminácie p300 väzby sú výhodnejšie delécie menej ako asi 30 aminokyselín v C-koncovej oblasti, aj keď výhodné sú rovnako menšie modifikácie. Napríklad príležitostne sú výhodné delécie aminokyselín 4 až 25 (dl1101), od asi 30 do asi 49 (dl1103) a ešte konkrétnejšie 36 až 49, ktoré eliminujú väzbu p300. Konkrétne sú výhodné tiež bodové mutácie, aby boli dostatočné na porušenie väzby p300. Ako mutácie porušujúce väzbu p300 je uvádzaná napríklad bodová mutácia v proteíne 289R druhej aminokyseliny arginínu, ktorá je vymenená za glycín (Arg2-Gly2) (V/'ď napr. pm563, Whyte a kol., (1989) Celí 56:67 až 75). Podobne sú minimálne modifikácie výhodné z pohľadu eliminovania väzby pRb105. Výhodné sú eliminácie selektívnych aminokyselín vo väzbovej doméne pRb105 ako sú aminokyseliny 111 až 123 (dl1107) a aminokyselina 124 až 127 (dl1108). Delécia aminokyseliny 111 až 123 (dl1107) je výhodná konkrétne preto, že zachováva p107 väzbovú aktivitu proteínu 289R.
Ďalej môžu byť začlenené eliminácie aminokyselín od približne 219 do 289 v proteíne Ela 289R a 173 až 243 proteínu E1A 243R. Napríklad začlenením bodovej mutácie v pozícii zodpovedajúcej pozícii 1131 v genóme ľudského Ad5 (tzn. zámena cytozínu1131 za guanín) vytvára stop kodón. Táto mutácia vedie k eliminácii aminokyselín 219 až 289 proteínu Ela 289R a 173 až 243 proteínu E1 A 243R. Okrem delécií v Rb a p300 väzbe, ktoré sú opísané vyššie, je poprípade vykonávaná táto mutácia. Ďalšie príklady týchto rodičovských vektorov sú opísané v podaných US patentových prihláškach č. 60/104 317 a 08/09/172 684, podaných 15. 10.1998.
Vo výhodnejšom uskutočnení predmetného vynálezu, čo je tu tiež doložené príkladom, sú výhodnejšími promótormi reagujúcimi na p53 dráhu p53-CON a RGC. Výhodnejšie promótory reagujúce na dráhu TGF-β sú vybrané zo skupiny, ktorú tvoria PAI-RE a SRE.
Vo výhodnejšom uskutočnení predmetného vynálezu je terapeutickým génom gén, aktivujúci pro-liek napr. cytozíndeaminázový. Vo výhodnejšom uskutočnení vynálezu na indukciu protinádorovej imunity kóduje vektor podľa predmetného vynálezu ΜΙΡ-3-alfa.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· • · · · · · ··· · · · · ··· ·· ···· ·· · ·· ·· ·· ···
Výhodnejšími promótormi na expresiu terapeutického génu sú časové promótory ako je MLP a E3.
V adenovírusových konštruktoch je dosahovaná eliminácia alebo oneskorenie činnosti proteínu Ad E3-11.6 K, ktorých úlohou je minimalizovať bunkovú lýziu indukovanú adenovírusom predchádzajúcej replikácie. Konkrétne by mala byť výhodnejšia eliminácia natívneho génu E311.6K/10.5K. To by malo minimalizovať imunitnú odozvu do toho času, pokiaľ sa neuskutoční počiatočná fáza miestneho rozšírenia. V tomto neskoršom čase, akonáhle sa dosiahne apoptóza najskôr infikovaných buniek a je umožnené miestne rozšírenie vírusu, by mala byť imunitná odpoveď výhodná. Proteín 11.6K (alebo zodpovedajúci proteín E3-1O.5K v Ad5) je proapoptotický gén a môže byť použitý na dosiahnutie bunkovej smrti v nádorových bunkách. Pretože sa však predpokladá, že dôjde k zadržaniu počiatočnej lýzie cieľovej bunky, je z pohľadu maximalizácie replikácie vírusu výhodnejšie, aby bol gén 11.6K/10.5K umiestnený pod kontrolu časového promótora ako je MLP promótor a to preto, aby bol zadržaný nástup jeho apoptotického účinku.
Farmaceutické formulácie
Predmetný vynález ďalej poskytuje farmaceutický prijateľnú formuláciu rekombinantných vírusov v kombinácii s nosičom. Vektory predmetného vynálezu môžu byť v praxi formulované pre aplikáciu v dávkach a to v súlade s bežnými farmaceutickými prípravkami s prídavkom nosičov a pomocných látok. Dávkovacie formulácie môžu zahrnovať aplikáciu intravenóznu, intratumorálnu, intramuskulárnu, intraperitonálnu, topikálnu, ložiskovú alebo aplikáciu vo forme spreja.
Termín „nosič sa vzťahuje k zlúčeninám bežne používaným pri formulácii farmaceutických zlúčenín, ktoré sa používajú na zvýšenie stability, sterility a dopraviteľnosti terapeutickej zlúčeniny. Ak je je vírus formulovaný vo forme roztoku alebo suspenzie, je systémom na dopravenie prijateľným nosičom výhodnejšie vodný nosič. Môže byť použité množstvo vodných nosičov, napr. voda, pufrovaná voda, 0,8% fyziologický roztok, 0,3% glycín, hyalurónová kyselina a podobné. Tieto zlúčeniny môžu byť sterilizované príslušnými, v danej oblasti techniky dobre známymi, sterilizačnými spôsobmi alebo môžu byť sterilné prefiltrované. Výsledné vodné roztoky môžu byť priamo zabalené a určené na použitie, alebo môžu byť ·· ···· ·· ·· ·· ·· · · · · · ··· ··· · · · · · · * · é · · · ··· · · · ··· ·· ··· lyofilizované a potom je potrebné pred podávaním lyofilizovaný preparát zmiešať so sterilným roztokom. Prostriedky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné doplnkové látky, ktoré sú nutné na priblíženie fyziologických podmienok, ako je úprava pH a to sú napr. pufrujúce činidlá, činidlá upravujúce pružnosť, zmáčacie prostriedky a podobné napríklad acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, sorpčný monolaurát, trietanolaminoleát atď.
Predmetný vynález ďalej poskytuje farmaceutické formulácie vírusov podľa predmetného vynálezu s nosičom a činidlom(ami) uľahčujúcim dopravenie. Termíny „uľahčenie dopravenia alebo „činidlá uľahčujúce dopravenie sú tu používané zameniteľné a zahrňujú jedno alebo viac činidiel, ktoré uľahčujú zachytenie vírusu do cieľovej bunky. Príklady činidiel uľahčujúcich dopravenie sú opísané v podanej US patentovej prihláške č. 09/112 074, podanej 8.7.1998 a US 08/938 089, podanej 26.9.1997. Medzi príklady činidiel uľahčujúcich dopravenie patria detergenty, alkoholy, glykoly, povrchovo aktívne činidlá, soli kyseliny žlčovej, heparínové antagonisty, inhibítory cyklooxygenázy, hypertonické roztoky solí a acetáty. Alkoholy zahrňujú napríklad alifatické alkoholy ako je etanol, N-propanol, izopropanol, butylalkohol, acetylalkohol. Medzi glykoly patrí glycerín, propylénglykol, polyetylénglykol a ďalšie nízkomolekulárne glykoly ako je glycerol a tioglycerol. Acetáty, ako je kyselina octová, glukónová kyselina a acetát sodný, sú ďalšími príkladmi činidiel uľahčujúcich dopravenie. Hypertonické roztoky solí, ako je 1M NaCI sú tiež príkladmi činidiel uľahčujúcich dopravenie. Príkladom povrchovo aktívnych činidiel sú dodecylsulfát sodný (SDS) a lyzolecitín, polysorbát 80, nonylfenoxypolyoxyetylén, lyzofosfatidylcholín, polyetylénglykol 400, polyoxyetylénétery, povrchovo aktívne činidlá na báze polyglykoléteru a DMSO. Môžu byť použité soli kyseliny žlčovej ako je taurocholát, taurodeoxycholát sodný, deoxycholát, chenodezoxycholát, kyselina glykocholová, kyselina glykochenodeoxycholová a ďalšie astringentné látky ako je dusičnan strieborný. Rovnako môžu byť použité heparínové antagonisty ako kvartérne amíny, napr. protamínsulfát. Môžu byť použité cyklooxygenázové inhibítory ako je salicylát sodný, kyselina salicylová a nesteroidné protizápalové lieky (NSAIDS) ako je indometacin, naproxen, diclofenak. Činidlá uľahčujúce dopravenie zahrňujú zlúčeniny podľa všeobecného vzorca (I):
·· ···· ·· ·· ·· • e · · · · · · · · ·· · ···· · · • · · · · · ··· · · ft ··· ·· ··· ·· · ·· ·· ·· · kde X1 a X2 sú vybraté zo skupiny, ktorú tvorí skupina kyseliny cholovej, skupina kyseliny deoxycholovej a sacharidová skupina, m je celé číslo od 2 do 8 a výhodnejšie 2 alebo 3, n je celé číslo od 2 do 8 a výhodnejšie 2 alebo 3 a R je katiónové skupina, sacharidová skupina alebo štruktúra -CO-X3, kde X3 je sacharidová skupina. Sacharidová skupina môže byť vybraná zo skupiny, ktorú tvoria pentózové monosacharidové skupiny, hexózové monosacharidové skupiny, disacharidové skupiny pentóza-pentóza, disacharidové skupiny hexóza-hexóza, disacharidové skupiny pentóza-hexóza, disacharidové skupiny hexóza-pentóza.
Termín „detergent zahrňuje aniónové, katiónové, zwitterionové a neionogénne detergenty. Medzi exemplárne príklady detergentov patria, ale nie sú v žiadnom zmysle limitujúce, taurocholát, deoxycholát, taurodeoxycholát, cetylpyridínium, benzalkóniumchlorid, Zwittergent 3-14, CHAPS (3-[(3cholamidopropyl)dimetylamoniol]-1-propánsulfonátydrát), Big CHÁP, Deoxy Big CHÁP, Triton-X-100, C12E8, oktyl-p-D-glukopyranozid, PLURONIC-F68, Tween 20 a Tween 80 (CalBioechem Biochemicals).
Jednotka dávkovacej formulácie podľa predmetného vynálezu môže byť súčasťou súpravy obsahujúcej rekombinantný vírus podľa nároku 1 v lyofilizovanej forme a roztok na rozpustenie lyofilizovaného produktu. Rekombinantné vírusy predmetného vynálezu môžu byť lyofilizované bežnými spôsobmi a potom opäť rozpustené.
Vektory predmetného vynálezu môžu byť aplikované tiež v kombinácii s kalpaínovými inhibítormi. „Kalpaínový inhibítor (skrátene „Cl) sa vzťahuje k zlúčenine, ktorá inhibuje proteolytický účinok kalpaínu-l resp. μ-kalpaínov. Termín kalpaínové inhibitory, ktorý je tu používaný, zahrňuje také zlúčeniny, ktoré majú inhibičnú aktivitu voči kalpaínu-l ako dodatok ku svojím ďalším biologickým aktivitám alebo ju majú nezávisle od svojich biologických aktivít. Ako zlúčeniny, ktoré vykazujú ·· ·· ·· • · · · · ··· • · · · · · · • · · · ··· · · · • · · · · · • · • · • · • · ·· ·· ···· aktivitu v procese inhibovania proteolytickej činnosti kalpaínov, je uvádzané široké spektrum zlúčenín. Medzi príklady kalpaínových inhibítorov, ktoré sú užitočné vo vykonaní predmetného vynálezu, patrí N-acetyl-Leu-Leu-norleucinal rovnako známy ako „kalpaínový inhibítor 1. Kalpaínové inhibítory boli sledované z pohľadu zvýšenia možnosti infekcie buniek s ohľadom na vírusové vektory, zvýšenie transkripcie od promótorov prostredníctvom zvýšenia hladín transkripčných faktorov NF-kappaB a AP-1 a z dôvodu zníženia CTL odozvy na adenovírusové vektory. Z tohto dôvodu môžu formulácie a spôsoby podľa predmetného vynálezu príležitostne zahrňovať kalpaínové inhibítory. Kalpaínové inhibítory a ich aplikácie sú opísané v Atencio a kol., US patentová prihláška č. 60/104 321 a US 09/073 076, podané 15.10.1998.
Spôsoby použitia
Predmetný vynález poskytuje spôsoby usmrtenia bunky s určtiou defektnou regulačnou dráhou pomocou kontaktu cieľovej bunky so selektívne sa replikujúcim vektorom podľa predmetného vynálezu. V jednom uskutočnení vynálezu a je to tu doložené príkladom, je bunkou obsahujúcou defekt danej dráhy bunka neoplastická. Termín „neoplastická bunka je bunka vykazujúca odlišný rastový fenotyp, charakteristický svojou nezávislosťou od regulácie bunkového rastu, ktorá sa vyskytuje v normálnej bunke. Pretože neoplastické bunky sa nevyhnutne nemusia v ľubovoľnom časovom okamžiku replikovať, zahrňuje termín neoplastické bunky bunky, ktoré sa môžu účinne replikovať alebo sa môžu nachádzať v dočasnom kľudovom stave, kedy sa nereplikujú (G1 alebo GO). Miestne populácie neoplastických buniek sú označované ako novotvary. Novotvary môžu byť malígne alebo benígne. Malígne novotvary sú rovnako označované ako karcinómy. Termín karcinóm je tu používaný zameniteľné s pojmom nádor. Neoplastická transformácia sa vzťahuje k premene normálnej bunky na neoplastickú, často nádorovú bunku.
Predmetný vynález poskytuje spôsob ablácie neoplastických buniek v cicavčom organizme in vivo a to podávanín farmaceutický prijateľnej formulácie rekombinantného adenovírusu podľa predmetného vynálezu. Termín „ablácia znamená podstatné zníženie populácie životaschopných neoplastických buniek tak, aby došlo k zmierneniu zlých fyziologických prejavov spôsobených prítomnosťou neoplastických buniek. Termín „podstatne znamená vyššie ako približne 20 % ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· · · · ··· ······ • · · · · · ··· · · · ··· · · ··· ·· · ·· ·· ·· · zníženie populácie životaschopných neoplastických buniek v cicavčom organizme. Termín „životaschopné znamená vykazujúce nekontrolovaný rast a majúce regulačné charakteristiky bunkového cyklu neoplastickej bunky. Termín „životaschopná neoplastická bunka je tu používaný na rozlíšenie spomínaných buniek od neoplastických buniek, ktoré už nie sú schopné sa replikovať. Napríklad nádor môže zostať aj po ošetrení, avšak populácia buniek obsahujúcich nádorovú hmotu môže byť mŕtva. Tieto mŕtve bunky sú odstránené a chýba im schopnosť sa replikovať, aj keď určitá nádorová hmota zostala.
Termín „cicavčí organizmus zahrňuje, ale nie je tým nijako limitovaný, ľudský, prasačí, konský, kravský, psí a mačací organizmus. Výhodnejšie je použiť adenovírusový vektor endogénny voči typu cicavca, ktorý je liečený. Aj keď je všeobecne uprednostňované, aby bol použitý vírus z rovnakého druhu ako je druh, ktorý má byť liečený, v určitých prípadoch môže byť výhodné použiť vektory odvodené od odlišného druhu, ktorý disponuje výhodnými patogénnymi znakmi. Napríklad bolo uvedené (WO 97/06826, publikované 10.4.1997), že ovčie adenovírusové vektory môžu byť použité v génovej terapii ľudí na minimalizáciu charakteristík imunitnej odozvy ľudských adenovírusových vektorov. Minimalizovaním imunitnej odozvy je zabránené rýchlej systemickej samolikvidácii (clearance) vektoru, čo vedie k dlhšiemu trvaniu účinku vektora.
Vektory podľa predmetného vynálezu je možné konkrétne aplikovať v liečbe nádorov spojených s nedostatočnou antirozmnožovacou činnosťou TGF-β vrátane karcinómov pŕs, hrubého čreva a karcinómov kože, rovnako tak ako v súvislosti s B a T lymfómami (Markowitz & Roberts, 1996). Mutácie TGF-β receptora typu II boli identifikované v karcinómoch hrubého čreva, tráviaceho traktu, hlavy a šupinatých buniek krku. Mutácie alebo delécie receptorov typu I boli nájdené tiež v Kaposovom sarkóme, nádoroch pŕs, vaječníka a kolorekta. Medzi intracelulárnymi efektormi signalizovania TGF-β, boli ako možné supresorové gény, potlačujúce nádor, identifikované Smäd a Smad4/DPC4, ktoré boli zmenené približne v 50 % nádoroch pankreasu. Zmena génu DPC4 bola zistená tiež v nádorov hrubého čreva, pŕs a vaječníkov, aj keď s oveľa menšou frekvenciou výskytu. Vektory podľa predmetného vynálezu je možné aplikovať konkrétne na liečbu nádorov necitlivých na TGF-β ako je napr. karcinóm pankreasu.
·· ··
·« ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · · ··· · · · • · · · · ·· ·· ··
Vektory podľa predmetného vynálezu je možné aplikovať tiež na liečbu nádorových buniek, obsahujúcich defekty dráhy p53. Medzi tieto nádory patria také, ktoré vykazujú zmeny v p53, mdm2 a p14/p19ARF(INK4a gén). Vektory podľa predmetného vynálezu sú tiež užitočné v ošetrení karcinómových buniek s defektami Rb dráhy. Defekty Rb dráhy sú výsledkom zmien v Rb, cyklíne D, cyklíndependentnej kináze (ako je CDK4) a p16 (INK4a gén).
Aj keď predmetný vynález poskytuje spôsob použitia samotných rekombinantných adenovírusov, rekombinantné adenovírusy podľa predmetného vynálezu a ich formulácie môžu byť použité v kombinácii so zodpovedajúcimi chemoterapeutickými činidlami alebo liečebnými režimami. Ako príklady týchto chemoterapeutických činidiel je možné uviesť inhibítory syntézy purínov (napr. pentostatín, 6-merkaptopurín, 6-tioguanín, metotrexát) alebo syntézy pyrimidínov (napr. Pala, azarbín), premeny ribonukleotidov na deoxyribonukleotidy (napr. hydroxymoôovina), inhibítory syntézy dTMP (5-fluóruracil), činidlá poškodzujúce DNA (napr. žiarenie, bleomycíny, etopozidy, tenipozidy, dactinomycín, daunorubicín, doxorubicín, mitoxantron, alkylačné činidlá, mitomycín, cisplatin, prokarbazín), ale tiež inhibítory funkcie mikrotubulov (napr. vinea alkaloidy a kolchicin). Chemoterapeutické liečebné režimy sa týkajú predovšetkým nechemických procesov navrhnutých na odstránenie neoplastických buniek ako je napr. ožarovanie. Príklady kombinovanej terapie pre prípad, že terapeutickým génom je p53, sú opísané v Nielsen a kol., WO/9 835 5 54A2, publikované 20.8.1998.
Imunologická odpoveď je významná pre opakované in vivo podávanie vírusových vektorov. Vektory podľa predmetného vynálezu môžu byť podávané v kombinácii s imunosupresívnymi činidlami. Medzi príklady imunosupresívnych činidiel patria cyklosporín, azatioprin, metotrexát, cyklofosfamid, lymfocytový imunoglobulín, protilátky proti CD3 komplexu, adrenokortikosteroidy, sulfasalzaín, FK-506, metoxsalén a talidomid.
Predmetný vynález rovnako poskytuje spôsob odstránenia neoplastických buniek v populácii normálnych buniek kontaminovaných spomínanými neoplastickými bunkami ex vivo a to prostredníctvom podávania rekombinantných adenovírusov podľa predmetného vynálezu spomínanej populácii. Príkladom aplikácie tohto postupu je postup, ktorý je bežne používaný pri ex vivo aplikáciách, a to očistenie od ·· ···· • · autológnych produktov kmeňovej bunky, čo je všeobecne známe pod názvom očistenie kostnej drene. Termín „produkt kmeňovej bunky sa vzťahuje k populácii hematopoietických, progenitorových a kmeňových buniek, ktoré sú schopné obnoviť dlhodobú hematopoietickú funkciu pacienta, ktorý podstúpil myoablatívnu terapiu. Produkty kmeňovej bunky sú všeobecne získané odobratím (aferéziou) zmobilizovanej alebo nezmobilizovanej periférnej krvi. Aferézia je bežne vykonávaná známymi postupmi pomocou komerčne dostupných prístrojov na aferéziu, ako je COBE Spectra Apheresis Systém, komerčne dostupný od COBE International, Oak Street 1185, Lakewood, CO, USA. Na optimalizáciu liečebných stavov je výhodnejšie previesť „3-log očistenie (tzn. odstránenie približne 99,9 % nádorových buniek z produktu kmeňovej bunky) a najvýhodnejšie je „5-log očistenie (odstránenie 99,999 nádorových buniek z produktu kmeňovej bunky). Vo výhodnom vykonaní predmetného vynálezu by mal byť ošetrený produkt kmeňovej bunky s objemom 100 ml pri pomere počtu častíc k bunkám približne 2 x 1011 vektorov podľa predmetného vynálezu, v čase približne 4 h a pri teplote 37 °C.
Diagnostické aplikácie
Okrem terapeutických aplikácií, ktoré sú opísané vyššie, sú vektory podľa predmetného vynálezu užitočné tiež na diagnostické účely. Vektory podľa predmetného vynálezu môžu byť napríklad začlenené do oznamovacieho génu, ktorý je exprimovaný po infekcii vírusu alebo po jeho replikácii. Termín „oznamovací gén sa vzťahuje ku génu, ktorého produkt je schopný produkovať detekovateľný signál či už sám o sebe alebo v kombinácii s ďalšími prvkami. K príkladom oznamovacích génov patrí gén β-galaktozidázy, gén pre luciferázu, gén pre zelený fluorescenčný protein, nukleotidové sekvencie kódujúce proteíny, ktoré je možné detekovať rôznymi systémami ako je rôntgenové žiarenie alebo systémy využívajúce magnetické pole (MRI). Tieto vektory by mohli byť užitočné na detekciu prítomnosti funkčnej dráhy (napr. p53 alebo TGF-β dráhy). Tieto vektory môžu byť tiež príležitostne použité na expresiu bunkových povrchových proteínov schopných rozpoznávať prostredníctvom väzby molekuly ako je fluorescenčné označená protilátka. V prípade, kedy je promótor reagujúci na určitú dráhu použitý na riadenie represora replikácie vírusu (napr. E2F-Rb), môžu byť na riadenie oznamovacieho génu na diagnostické ·· ····
·· ·· • · · · • · · · • · · ··· · • · · ·· ·· aplikácie, kedy je promótor reagujúci na určitú dráhu zablokovaný, použité neskoré promótory vírusu (napr. E2, ktorý je vypnutý prostredníctvom E2F-Rb alebo akýkoľvek iný promótor s väzbovými miestami pre represor, napr. väzbovými miestami pre E2F). Tieto diagnostické konštrukty môžu byť použité na diagnostické účely in vivo alebo in vitro. Príklady in vivo aplikácií zahrňujú róntgenové žiarenie, CT snímania alebo magnetickú rezonanciu (MRI).
Spôsoby prípravy vektorov
Predmetný vynález ďalej poskytuje spôsob prípravy rekombinantných vírusov opísaných vyššie. Spomínaný spôsob sa skladá z nasledujúcich krokov:
a. infekcia produkčnej bunky rekombinantným vírusom
b. kultivácia spomínanej infikovanej produkčnej bunky za takých podmienok, kedy je umožnená replikácia vírusového genómu v produkčnej bunke
c. zber produkčných buniek a
d. prečistenie rekombinantného vírusu
Termín „infikovanie znamená vystavenie rekombinantného vírusu produkujúcej bunke pri takých podmienkach, ktoré uľahčujú infekciu produkujúcej bunky rekombinantným adenovírusom. V bunkách, ktoré boli infikované niekoľkými kópiami daného vírusu, sú aktivity nevyhnutné na replikáciu vírusu a zbalenie viriónu kooperativne. Preto je teda výhodnejšie, aby boli podmienky upravené tak, aby existovala významná pravdepodobnosť, že produkčné bunky budú násobne infikované vírusom. Príkladom podmienky, ktorá zvyšuje produkciu virusu v produkčnej bunke je zvýšená koncentrácia vírusu vo fáze infekcie. Je však možné, že celkové číslo infekcie vírusom pripadajúcim na jednú produkčnú bunku môže byť prekročené a potom dôjde k toxickým účinkom na bunku. Preto by mala byť infekcia vykonávaná pri koncentráciách vírusu v rozmezí 1 x 10® až 1 x 101°, výhodnejšie 1 x 109 viriónov pripadajúcich na 1 ml. Na zvýšenie infekcie línie produkčných buniek môžu byť použité chemické činidlá. Predmetný vynález napríklad poskytuje spôsob ako zvýšiť infekciu línií produkčných buniek vírusom a to prostredníctvom začlenenia ·· ···· inhibítora kalpaínu. Medzi príklady kalpaínových inhibítorov, ktoré sú užitočné vo vykonaní predmetného vynálezu, patrí kalpaínový inhibítor 1 (rovnako známy ako Nacetyl-leucyl-leucyl-norleucinal, komerčne dostupný od Boehringer Mannheim). V kalpainovom inhibítori 1 bolo zistené, že zvyšuje možnosť infekcie línií produkčných buniek rekombinantným adenovírusom.
Termín „produkčná bunka” znamená bunku, ktorá je schopná umožniť replikáciu vírusového genómu rekombinantného adenovirusu, aby bol predukovaný. Pre kultúru rekombinantných adenovírusov je verejne dostupné množstvo cicavčích bunkových línií. Napríklad na doplnenie nedostatkov v E1 funkcii bola pripravená línia buniek 293 (Graham a Smiley (1977) J. Gen. Virol. 36:59 až 72), ktorá je výhodnou bunkovou líniou na produkciu obvyklých vektorov. Medzi príklady ďalších produkčných buniek patria bunky HeLa, PERC.6 (ako sú opísané v publikácii WO/97/00326, prihláška č. PCT/NL96/00244).
Termín „kultivácia pri podmienkach, ktoré umožňujú replikáciu vírusového genómu” znamená udržovanie takých podmienok na infikovanej produkčnej bunke, aby mohlo dôjsť ku zmnoženiu vírusu v bunke producenta. Je žiadúce, aby boli podmienky regulované tak, aby sa dosiahol maximálny počet vírusových častíc produkovaných každou bunkou. Preto je tiež nevyhnutné monitorovať a regulovať reakčné podmienky ako je teplota, rozpustený kyslík, pH atď. Komerčne dostupné bioreaktory ako je CelliGen Plus Bioreactor (komerčne dostupný od firmy New Brunswick Scientifíc, Inc., Talmadge Road 44, Edison, NJ, USA) sú zariadením na monitorovanie a udržovanie týchto parametrov vybavené. Optimalizácia infekcie a podmienky kultivácie sa budú vždy trochu líšiť, avšak podmienky, vhodné na účinnú replikáciu a produkciu vírusu, môžu odborníci v danej oblasti dosiahnuť tým, že budú brať do úvahy známe vlastnosti produkčnej bunky, vlastnosti vírusu, typ bioreaktora atď. Ak sú používané ako línie produkčných buniek bunky 293, je koncentrácia kyslíka výhodne udržovaná v rozmedzí približne 50 % až 120 % rozpusteného kyslíka, výhodnejšie 100 % rozpusteného kyslíka. V prípade, že koncentrácia častíc vírusu (čo je stanovované príslušnými postupmi ako je HPLC s použitím kolóny Resource Q) zostáva ďalej stabilná, potom je kultivácia v reaktore ukončená a bunky sú odstránené.
Termín „zber znamená zhromaždenie buniek, obsahujúcich rekombinantný adenovírus, z média. Toto môže byť vykonané bežnými spôsobmi, ako je • · ·· ··· odstredenie alebo použitie chromatografických techník. V tejto fáze môžu byť zberané bunky skladované alebo môžu byť ďalej podrobené lýzii a prečistené, ktorých cieľom je izolovať rekombinantný vírus. Pri skladovaní by mali byť zberané bunky skladované v pufri s približne fyziologickým pH a zmrazené na teplotu -70 °C.
Termín „lýzia sa vzťahuje k porušeniu produkčných buniek. Lýzia môže byť vykonaná množstvom rôznych spôsobov, ktoré sú v danej oblasti techniky dobre známe. V prípade, že je treba vírusové častice izolovať od produkčných buniek, sú bunky lyzované a to postupmi, ktoré sú v danej oblasti techniky veľmi dobre známe. Napríklad cicavčie bunky môžu byť lyzované pri nízkom tlaku (odlišný tlak o 100 až 200 psi) alebo postupom opakovaného zmrazovania a rozmrazovania. Exogénne voľná DNA/RNA je odstránená degradáciou DNAázou/RNAázou.
Termín „prečistenie znamená izoláciu podstatne čistej populácie častíc rekombinantného vírusu z lyzovaných produkčných buniek. Na tento cieľ môžu byť použité príslušné techniky prečistenia ako sú chromatografické alebo gradientové centrifugačné. Vo výhodnom vykonaní predmetného vynálezu je vírus prečistený chromatografiou v kolónovom usporiadaní a to postupom, ktorý je v súlade s publikáciou Huyghe a kol. (1995) Human Gene Therapy 6:1403 až 1416, čo je opísané v US patentovej prihláške č. 08/400 793, podanej 7 3.1995.
Ďalšie spôsoby a postupy používané nae optimalizáciu produkcie rekombinantných adenovírusov podľa predmetného vynálezu sú opísané v US patentovej prihláške č. 09/073 076, podanej 4.5.1998 a nazvanej Viral Production Process.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1. Výsledky CPE stanovenia na určenie cytopatického účinku rekombinantných adenovírusových vektorov kódujúcich sekvenciu kódujúcu fúzny E2F-Rb pod kontrolou buď promótora reagujúceho na TGF-β dráhu (PAI alebo SRE) alebo promótora reagujúceho na p53 dráhu (RGC alebo p53CON). Ďalej bol do vektorov ako oznamovateľ začlenený gén kódujúci zelený fluorescenčný proteín. Panel A predstavuje bunky MRC-9, panel B predstavuje bunky Hep3B a panel C ·· ····
·· • · · • · · • ··· • · ·· predstavuje bunky WIDR. Dráha 1: replikačne deficitentný (deletovaná E1) rekombinantný adenovírus exprimujúci zelený fluorescenčný proteín (GFP); dráha 2: PAI-Ad; dráha 3: SRE-Ad; dráha 4: RGC-Ad; drába 5: p53CON-Ad. Koncentrácie vírusových častíc sú naznačené na obrázku vpravo.
Obr. 2. Výsledky fluorescenčnej mikroskopie (horný panel) zobrazujúci expresiu GFP vo vektoroch zacielených na určitú dráhu. Panel A predstavuje kontrolný vektor GFCB, panel B vektor SRE-Ad a panel C vektor p53CON-Ad. Infekcia bola 5x10® častíc na milimeter.
Obr. 3. Výsledky infekcie normálnych bronchiálnych epiteliálnych buniek (panel A) a buniek C33A (panel B) rekombinantnými vírusmi U3EE (štvorčeky), T1LT (kolieska) a L9IU (trojuholníky). Vertikálne osi predstavujú percento neinfikovaných kontrol a horizontálne osi predstavujú dávku vírusu v časticiach na ml. Pokusy boli vykonané tak, že kultúra buniek bola vystavená šiestim rôznym koncentráciám vírusu, ktoré sa pohybovali v rozmedzí 10® až 109 častíc vírusu na 1 ml. Bunky boli vystavené pôsobeniu vírusu v čase 1 hodiny, prebytočný vírus bol odstránený premytím a pomocou MTS stanovenia (Promega, Madison Wl), ktoré bolo vykonávané v súlade s priloženým firemným návodom, bolo stanovené percento životaschopných buniek šiesty deň po infekcii. Horizontálna čiara predstavuje hladinu, pri ktorej zostalo životaschopných 50 % buniek. Priesečník kriviek získaných z dát a horizontálne čiarkované čiary predstavujú hodnotu ED50 pre daný vírus.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady poskytujú metódy a výsledky experimentov, ktoré ukazujú konštrukciu konkrétnych rekombinantných adenovírusových a plazmidových vektorov. Odborníkom v danej oblasti techniky, ktorým je predmetný vynález určený bude itste zrejmé, že predmetný vynález môže byť vykonaný tiež v iných formách ako tie, ktoré sú odhalené v uvedených príkladoch, bez toho, aby došlo k odchýleniu sa od zmyslu alebo základných charakteristík vynálezu. Konkrétne uskutočnenia vynálezu, ktoré sú opísané nižšie, je treba teda považovať za ilustratívne a nie reštriktívne. V nasledujúcich príkladoch „g znamená gramy, „ml znamená mililitre, ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ·· ·· ·· e „moľ znamená móly, „°C znamená stupne Celzia, „min. znamená minúty, „FBS znamená zárodkové hovädzie sérum a „PN znamená počet častíc rekombinantného vírusu.
Príklad 1 Konštrukcie plazmidov p800luc, plazmid kódujúci luciferázu pod kontrolou PAI promótora s veľkosťou 800 bp bol získaný od Dr. Davida Luskutoffa (Scripps Inštitúte, LaJolla, Kalifornia). Plazmid pCTMIE-E2FRb, ktorý obsahuje CMV promótor, po ktorom nasleduje trojzložková vedúca sekvencia adenovírusu 5 a SV40 zosilovač upstream k sekvencii kódujúcej fúzny proteín E2F-RB, poskytol Doug Antelman (Canji).
Príklad 2 Konštrukcie luciferázových plazmidov s promótormi reagujúcimi na TGF-β
A. Plazmid PAl-luciferáza
Sekvencie všetkých fragmentov sú uvádzané v 5'- 3' smere. Fragment s veľkosťou 749 bp s Sací a Xhol miestami na 5' resp- 3' konci a s SV40 TATA boxom namiesto natívneho TATA boxu v promótori, bol amplifikovaný pomocou PCR s použitím p800luc ako templátu a s primérmi
AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA a GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (obsahujúce SV40 TATA box). Výsledný produkt PCR bol naštiepený reštrikčnými enzýmami Sací a Xhot a bol ligovaný do fragmentu, ktorý sa získal po štiepení PGL3-základného, čo je luciferázový konštrukt bez promótora (Promega). Ako výsledok sa získala PAl-luciferáza.
B. Plazmid SRE-luciferáza
Boli spojené nasledujúce oligonukleotidy: GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG ACG ATC a GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC. Výsledný produkt bol naštiepený Xhol a ligovaný do PGL3-základného, ktorý bol naštiepený Mlul, konce boli otupené ·· ···· ·· • · · • · · • · · • · · ·· · ·· · • · · · • · · · • · · ··· • · · ·· ·· pomocou Klenowovho enzýmu a bolo vykonané ešte štiepenie Xhol. Výsledkom bol pSVt-luc (luciferázový konštrukt s SV40 TATA boxom). Oiigonukleotidy, obsahujúce Smad4/DPC4 väzbové miesta, CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC a AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC boli spojené a ligované do konštruktu pSVT-luciferáza naštiepeného KpnI. Cieľom bolo získať plazmid SRE-luciferáza.
Príklad 3 Konštrukcie luciferázových plazmidov s promótormi reagujúcimi na p53
A. Plazmid RGC-luciferáza
Boli spojené dva komplementárne 5*-fosforylované oiigonukleotidy obsahujúce väzbové miesta na p53 z ribozomálneho génového zväzku, AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC a CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC. Spojený fragment bol ligovaný do konštruktu pSVT-luciferáza naštiepeného KpnI. Cieľom bolo získať plazmid RGCluciferáza.
B. Plazmid p53CON-luciferáza
Boli spojené dva komplementárne 5'-fosforylované oiigonukleotidy obsahujúce konvenčné väzbové miesta na p53 (p53CON), CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC a AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC. Spojený fragment bol ligovaný do konštruktu pSVt-luciferáza, naštiepeného KpnI. Cieľom bolo získať plazmid p53NOC-luciferáza.
C. Plazmid PAI-E2F-Rb
Sekvencie obsahujúce CMV promótor, po ktorom nasleduje trojzložková vedúca sekvencia adenovírusu-5 a SV40 zosilovač upstream k sekvencii kódujúcej fúzny proteín E2F-Rb v plazmide pCTMIE-E2F-Rb, bola vystrihnutá prostredníctvom štiepenia Bg11 a Xbal. Výsledný fragment bol ligovaný s cieľom získať plazmid bez ·· ····
• · ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · • · ··· · · · • · · · · ·· ·· ·· · promótora E2F-Rb. Fragment obsahujúci modifikovaný PAI promótor bol vystrihnutý z plazmidu PAl-luciferáza prostredníctvom štiepenia Sací a Xhol a konce boli otupené pomocou Klenowovho enzýmu. Tento tragment bol ligovaný do plazmidu bez promótora E2F-Rb, ktorý bol naštiepený EcoRI a ošetrený Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I. Cieľom bolo získať plazmid PAI-E2F-Rb.
Príklad 4 Príprava rekombinantných adenovírusov
Prenosový plazmid obsahujúci sekvenciu Ad5 s deléciou s veľkosťou 3 kb v E3 oblasti, ρΝΕΒΔΕ3, bol konštruovaný klonovaním fragmentu s veľkosťou 7,4 kb získaného štiepením SnaBI z pBHG11 (26 676 až 34 140) do pNEB193 (plazmid z NEB) ošetreného BamHI, Accl a Klenowovým enzýmom. Násobné klonovacie miesto bolo začlenené do vyššie spomínaného plazmidu spojením 5-fosforylovaných oligonukleotidov AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T a TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T a začlenením tohto fragmentu zaligovaním do ρΝΕΒΔΕ3 naštiepeného PAcl. Cieľom bolo získať plazmid pNEBAE3(MCS).
Prenosový plazmid na vytvorenie rekombinantného adenovírusu kódujúceho E2F-Rb pod kontrolou PAI promótora a zosilnený zelený fluorescenčný proteín (GFP) pod kontrolou CMV promótora bol konštruovaný nasledovne. Prechodný vektor pABS 4-E2F-Rb bol pripravený legovaním fragmentu obsahujúceho PAI promótor a sekvenciu kódujúcu E2F-Rb, ktorá bola pripravená naštiepením PAI-E2FRb enzýmami NacI a Xbal a zaligovaním fragmentu do plazmidu pABS.4 (Microbix), ktorý bol pripravený pomocou KpnI, ošetrením Klenowovým enzýmom a ďalším štiepením Xbal. Fragment obsahujúci PAI promótor, E2F-Rb kódujúci sekvenciu a kanamycínový gén bol potom z plazmidu PABS.4-E2F-Rb vystrihnutý pomocou enzýmu PacI, bol ošetrený Klenowovým enzýmom a legovaný s fragmentom plazmidu získaným štiepením plazmidu ρΝΕΒΔΕ3 enzýmami PacI a ošetrením Klenowovým enzýmom. Cieľom bolo získať plazmid pNEBAE3-PAI-E2F-Rb bez miesta reštrikčného miesta PacI. Kanamycínový gén v tomto plazmide bol nahradený CMV promótorom operatívne pripojeným ku génu pre zelený fluorescenčný proteín (GFP). Toto bolo vykonané štiepením pNEBAE3-PAI-E2F-Rb enzýmom Swal a zaligovaním fragmentu izolovaného z pEGFP-N (Clonetech) a to pomocou štiepenia ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· • · · ···· ·· ······ ··· · · · 1 · · · *···· ·· · ·· ·· ·· · enzýmov Aflll a Sspl a ošetrením Klenowovým enzýmom. Cieľom bolo získať plazmid pAE3-PAI-E2F-Rb-GFP.
Prenosové plazmidy na prípravu rekombinantných adenovírusov kódujúcich E2F-Rb pod kontrolou promótora reagujúceho na TGF-β s SRE a zosilnený zelený fluorescenčný proteín (GFP) pod kontrolou CMV promótora boli konštruované nasledovne. Aby sa získal plazmid ρΝΕΒΔΕ3 -E2F-Rb, bola do plazmidu pNEBAE3(MCS) začlenená E2F-Rb kódujúca sekvencia a to prostredníctvom legovania fragmentu, izolovaného štiepením pNEBAE3(MCS) enzýmami Xbal a Nrul a fragmentu vytvoreného štiepením pCTMIE-E2F-Rb enzýmami Xbal a Nael. Promótor reagujúci na TGF-β obsahujúci SRE bol začlenený do vyššie spomínaného plazmidu prostredníctvom amplifikácie tejto sekvencie PCR s použitím SREluciferázy ako templátu a fosforylovaných primérov GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C a GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T. Výsledný produkt PCR bol naštiepený Spel a legovaný do plazmidu pNEBAE3-E2FRb naštiepeného SnaBI a Xbal za vzniku pAE3-DPC-E2F-Rb.
Prenosové plazmidy na prípravu rekombinantných adenovírusov kódujúcich E2F-Rb pod kontrolou promótorov reagujúcich na p53 a zosilnený zelený fluorescenčný proteín (GFP) pod kontrolou CMV promótora boli pripravené nasledujúcim spôsobom. Promótor reagujúci na p53 obsahujúci väzbové miesta na p53 z ribozomálneho génového zväzku alebo konvenčné miesto p53 (p53CON) bol začlenený do plazmidu pNEBAE3-E2F-Rb pomocou amplifikácie promótorovej sekvencie PCR s použitím RGC-luciferázy alebo p53CON-luciferázy ako templátu a fosforylovaných primérov GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C a GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T. Výsledné produkty PCR boli naštiepené enzýmom Xbal a boli ligované do plazmidu pNEBAE3-E2F-Rb naštiepeného SnaBI a Xbal. Cieľom bolo získať pAE3RGC-E2F-Rb a pdelataE3-PCON-E2F-Rb.
Príklad 5 Homológne rekombinácie na prípravu rekombinantných adenovírusov
Rekombinantné adenovírusy PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad a CON-Ad boli pripravené homológnou rekombináciou v baktérii, čo je napr. opísané v Chartier a kol. (1996) J.Virol. 70:4805 až 4810. Aby boli získané fragmenty obsahujúce E2F-Rb ·· ···· pod kontrolou promótora reagujúceho na určitú dráhu a GFP pod kontrolou CMV promótora na koncoch sAd5 sekvenciami, boli prenosové plazmidy naštiepené enzýmom Ascl. Výsledný fragment bol transformovaný do bakteriálneho kmeňa BJ 5183 spolu s fragmentom získaným štiepením PTG4609 (dostupný od Transgene, Inc. a opísaný v Chartier a kol. (1996) J. Virol. 70:4805 až 4810) enzýmami BstBI a Spel. Vo výsledných bakteriálnych kolóniách bola testovaná prítomnosť žiadaných rekombinantných Ad5 infekčných plazmidov pPAl-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGCGFP-Ad a pCON-GFP-Ad. Tieto infekčné plazmidy boli linearizované prostredníctvom štiepenia PacI a prečistené extrakciou v systéme fenol-chloroform a etanolovým zrážaním. Potom boli použité na transfekciu buniek 293.
Transfekcia bola vykonaná pomocou Superfect (Qiagen) podľa priloženého návodu. Na transfekciu 250 000 buniek rastúcich v doštičkách so 6 jamkami s 12 μΙ Superfect/jamku bolo použitých 2,5 pg linearizovaných plazmidov. Po 8 dňoch bol vzhľadom k produkcii vírusu pozorovaný cytopatický účinok. Bunky boli zberané spolu so supernatantmi a boli 3 x podrobené cyklu zmrazenia - rozmrazenia. Rekombinantné vírusy v vzniknutých lyzátoch boli amplifikované opakovanou infekciou buniek 293.
Príklad 6 Línia buniek
Všetky línie buniek, ktoré sú použité v tejto štúdii, boli získané od ATCC (Rockville, MD, USA) a boli kultivované ako jednovrstvové kultúry udržované pri teplote 37 °C vCO2 inkubátore. Bunky 293, Hep3B, MRC9, A549, Panel, U87, Caco2, MCF-7 a WIDR boli uchovávané v modifikovanom Eagle médiu Dulbecco, ktoré bolo obohatené 10% zárodkovým hovädzím sérom. Bunky MDA-MB 468 boli kultivované v médiu Ham obohatenom 10% zárodkovým hovädzím sérom, zatiaľ čo bunky MiaPaca-2 boli kultivované v DMEM obohatenom 10% zárodkovým hovädzím sérom a 2,5% konským sérom.
Príklad 7 Transfekcie
Bunky boli umiestnené buď do doštičiek so 6 jamkami (250 000 buniek/jamka) alebo do doštičiek s 24 jamkami (62 500 buniek/jamka) a boli ponechané cez noc.
·· ···· • · ·· • · · • · · t ··· • · • ·
Transfekcie boli potom uskutočnené pomocou fosforečnanu vápenatého v prípade buniek 293, čo je tu opísané a s použitím Superfect (Qiagen) v prípade iných buniek, kedy bolo sa postupovalo podľa návodov od výrobcu.
Príklad 8 Meranie oznamovateľ/luciferáza
Bunky boli transfekované 1,5 pg oznamovacieho plazmidu a 1,0 pg inhibitorov. Prídavkom 1X pufra na lýziu oznamovateľa (Promega) a následnú inkubáciu pri laboratórnej teplote v čase 10 min. boli pripravené posttransfekčné lyzáty (po 48 h). Aktivita luciferázy bola stanovená pomocou zariadenia Top Count (Packard) a súpravy na stanovenie od rovnakej firmy a použitím inštrukcií od danej firmy.
Príklad 9 Meranie cytopatického účinku spôsobeného vírusom
Bunky boli infikované spomínaným rekombinantným alebo wild-type adenovírusom a boli ponechané v čase 6 dní po infekcii v prítomnosti 0,5 % roztoku kryštálovej violete, ktorý bol pripravený v 20 % metanole. Všetko prebiehalo podľa postupu, ktorý opísal Bioschoff a kol. (1996) Science 274:373 až 376.
Príklad 10 Konštrukcie vírusov cU3EE a cT1 LT
Sekvencia MLP promótora bola amplifikovaná pomocou PCR použitím primérov GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC a GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG, ďalej bola použitá Ad5 DNA ako v plazmide pFG140 (Microbix) ako templát. Produkt po PCR bol potom klonovaný do PACT miesta plazmidu pdelataE3-PCON-E2P-Rb. Cieľom bolo získať pdelataE3PCON-E2F-Rb-MLP. Adenovirusová sekvencia kódujúca proteín E3 10.5K bola amplifikovaná PCR s použitím primérov GCG ACC CAC CCT AAC AGA a GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A. Výsledný produkt PCR bol klonovaný do Xhol miesta plazmidu pCDNA3.1 (Invitrogén) s cieľom získať plazmid pCDNA3-10.5. Adenovirusová sekvencia kódujúca proteín E3 10.5K bola potom z pCDNA3-10.5 vystrihnutá pomocou štiepenia enzýmami Dralll a Xbal, nasledovalo použitie • · ·· ···· • · e • · · • · · • · · ·· · ·· • · · · • · · · • · · ··· • · · ·· ·· ··
Klenowovho enzýmu a potom bola ligovaná do PacI miesta a Klenowovým enzýmom ošetreného pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP. Cieľom bolo získať plazmid pdelataE3PCON-E2F-Rb-MLP-I0.5K.
Rekombinantné adenovirusy cU3EE a cT1LT boli pripravené homológnou rekombináciou v baktérii, čo už bolo opísané (Chartier a kol. (1996) J.Virol. 70:4805 až 4810). Aby sa získali fragmenty obsahujúce E2F-Rb pod kontrolou sekvencie p53CON a E310.SK pod kontrolou MLP promótor na koncoch sAd5 sekvenciami, bol prenosový plazmid naštiepený enzýmom Ascl. Výsledný fragment bol transformovaný do bakteriálneho kmeňa BJ 5283 spolu s fragmentom získaným štiepením PTG4609 (Transgene) enzýmami BstBI a Spel. Vo výsledných bakteriálnych kolóniách bola testovaná prítomnosť žiadaného rekombinantného Ad5 infekčného plazmidu pCEMD. Ad5 infekčný plazmid p01/CEMD bol získaný použitím podobného protokolu, ale použitím derivátu PTG4609 (Transgene), v ktorom bola wiid-type sekvencia E1 A nahradená sekvenciou obsahujúcou E1A s mutáciou 01. Tieto infekčné plazmidy boli linearizované prostredníctvom štiepenia PacI, ďalej boli prečistené extrakciou v systéme fenol-chloroform a etanolovým zrážaním. Potom boli použité na transfekciu buniek 293.
Transfekcia plazmidov pCEMD a p01/CEMD bola vykonaná pomocou Superfect (Qiagen) podľa návodu preto, aby boli vytvorené rekombinantné vírusy cU3EE a cT1LT. Na transfekciu 500 000 buniek rastúcich v doštičkách so 6 jamkami a 12 μΙ Superfect/jamku bolo použitých 2,5 μg linearizovaných plazmidov. Po 8 dňoch bol vzhľadom k produkcii vírusu pozorovaný cytopatický účinok. Bunky boli zberané spolu so supernatantmi a boli 3 x podrobené cyklu zmrazenia - rozmrazenia. Rekombinantné vírusy vo vzniknutých lyzátoch boli amplifikované opätovnou infekciou buniek 293.

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY ·· ·· » · · · • · · • ··· ·· ··
    1. Selektívne sa replikujúci rekombinantný vírusový vektor, ktorý obsahuje promótor reagujúci na určitú dráhu operatívne pripojený na represor replikácie vírusu.
  2. 2. Vektor podľa nároku 1, v ktorom je promótor reagujúci na určitú dráhu vybraný zo skupiny, ktorú tvorí promótor reagujúci na dráhu p53, promótor reagujúci na dráhu Rb a promótor reagujúci na dráhu TGF-β.
  3. 3. Vektor podľa nároku 2, pričom vírus je odvodený od rodu adenoviridiae.
  4. 4. Vektor podľa nároku 3, pričom represor replikácie vírusu je E2F-RB.
  5. 5. Vektor podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje transgénnu expresnú kazetu.
  6. 6. Vektor podľa nároku 5, pričom transgénna expresná kazeta obsahuje proapoptický gén operatívne pripojený na promótor.
  7. 7. Vektor podľa nároku 6, pričom génom aktivujúcim pro-liek je Ad5 E3-10.5K.
  8. 8. Vektor podľa nároku 7, pričom promótorom reagujúcim na určitú dráhu je promótor reagujúci na dráhu p53.
  9. 9. Vektor podľa nároku 8, pričom promótorom reagujúcim na dráhu p53 je p53CON.
  10. 10. Vektor podľa nároku 9, pričom promótorovou zložkou transgénnej expresnej kazety je časový promótor.
  11. 11. Vektor podľa nároku 10, pričom časovým promótorom je MLP.
  12. 12. Vektor podľa nároku 11, ktorý ďalej obsahuje v adenovírusovej E1a kódujúcej oblasti deléciu, ktorá eliminuje väzbu p300.
  13. 13. Vektor podľa nároku 12, pričom delécia v adenovírusovej E1 a kódujúcej oblasti zahrňuje deléciu aminokyselín 4 až 25 z E1 a 289R a 243R proteínov.
  14. 14. Farmaceutická formulácia, vyznačujúca sa tým, že ako účinnú prísadu obsahuje selektívne sa replikujúci rekombinantný vektor nárokovaný v ·· ···· ·· • · · • · · • · ·· • · · • · · • · e • · · · · ·· ··· ·· ·· • · · • e • · • · ktoromkoľvek z nárokov 1 až 13 spojený s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi.
  15. 15. Spôsob usmrtenia bunky s defektnou dráhou, vyznačujúci sa tým, že bunka je vystavená kontaktu so selektívne sa replikujúcim rekombinantným vírusom nárokovaným v ktoromkoľvek z nárokov 1 až 13.
  16. 16. Selektíne sa replikujúci vírusový vektor podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 13, alebo jeho farmaceutický prijateľná formulácia, vyznačujúci sa tým, že sú použité pri liečbe karcinómu.
  17. 17. Bunka transformovaná selektívne sa replikujúcim rekorobinantným vírusom, ktorá obsahuje promótor reagujúci na určitú dráhu operatívne pripojený na represor replikácie vírusu.
  18. 18. Promótor reagujúci na dráhu p53, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí p53CON a RGC.
  19. 19. Promótor reagujúci na dráhu TGF-β, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí PAI a SRE.
  20. 20. Spôsob produkcie selektívne sa replikujúceho vírusového vektoru podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje infekciu populácie produkčných buniek vzorkom spomínaného vektora, kultiváciu línie produkčných buniek za takých podmienok, ktoré umožňují replikáciu vektora v produkčných bunkách a izoláciu vektora z produkčných buniek.
    ····
SK441-2001A 1998-10-15 1999-10-14 Selectively replicating viral vectors SK4412001A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17268698A 1998-10-15 1998-10-15
PCT/US1999/021452 WO2000022137A2 (en) 1998-10-15 1999-10-14 Selectively replicating viral vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK4412001A3 true SK4412001A3 (en) 2001-12-03

Family

ID=22628758

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK441-2001A SK4412001A3 (en) 1998-10-15 1999-10-14 Selectively replicating viral vectors

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP1121441B1 (sk)
JP (2) JP4404490B2 (sk)
KR (1) KR100841815B1 (sk)
CN (2) CN1325647C (sk)
AR (1) AR020897A1 (sk)
AT (1) ATE348169T1 (sk)
AU (1) AU758354B2 (sk)
BR (1) BR9914527A (sk)
CA (1) CA2345900A1 (sk)
CZ (1) CZ301506B6 (sk)
DE (1) DE69934421T2 (sk)
ES (1) ES2279636T3 (sk)
HK (1) HK1040529B (sk)
HU (1) HU226602B1 (sk)
IL (2) IL142337A0 (sk)
NO (1) NO330666B1 (sk)
NZ (2) NZ528283A (sk)
PL (1) PL347898A1 (sk)
SK (1) SK4412001A3 (sk)
TW (1) TWI262948B (sk)
WO (1) WO2000022137A2 (sk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100841815B1 (ko) * 1998-10-15 2008-06-26 캔지, 인크. 선택적으로 복제하는 바이러스 벡터
KR100492017B1 (ko) * 2002-06-24 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 인간 간엽줄기 세포를 이용한 항암치료방법
GB0416487D0 (en) 2004-07-23 2004-08-25 Isis Innovation Modified virus
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
JP6329936B2 (ja) 2012-03-14 2018-05-23 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルス腫瘍診断
JP6576326B2 (ja) 2013-03-14 2019-09-18 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 腫瘍溶解性アデノウイルス組成物
CN106913865A (zh) 2013-04-18 2017-07-04 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
WO2017035232A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
AU2017223589B2 (en) 2016-02-23 2023-08-03 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
WO2019020992A1 (en) * 2017-07-25 2019-01-31 Oxford Genetics Limited ADENOVIRAL VECTOR
WO2019074907A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-18 Nantbio, Inc. MODIFIED EC7 CELLS WITH LOW TOXICITY FOR VIRAL PRODUCTION LOADS

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0931830T3 (da) * 1993-02-16 2001-06-11 Onyx Pharma Inc Cytopatiske vira til terapi og profylakse af neoplasi
WO1998013508A1 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Dana-Farber Cancer Institute Method of targeting malignant cells using an e2f responsive promoter
KR100336551B1 (ko) * 1996-11-15 2002-05-11 이. 엘. 나가부샨, 리차드 비. 머피 망막아종 단백질의 조직 특이적 발현
AU744725B2 (en) * 1997-03-03 2002-02-28 Cold Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing heterologous transcription regulatory elements and methods of using same
KR100841815B1 (ko) * 1998-10-15 2008-06-26 캔지, 인크. 선택적으로 복제하는 바이러스 벡터

Also Published As

Publication number Publication date
IL142337A (en) 2009-05-04
CN1325647C (zh) 2007-07-11
AU6391599A (en) 2000-05-01
EP1121441B1 (en) 2006-12-13
JP4404490B2 (ja) 2010-01-27
JP2009254385A (ja) 2009-11-05
KR100841815B1 (ko) 2008-06-26
BR9914527A (pt) 2001-06-26
CZ20011129A3 (cs) 2002-01-16
PL347898A1 (en) 2002-04-22
WO2000022137A3 (en) 2000-08-03
NO20011843D0 (no) 2001-04-10
DE69934421D1 (de) 2007-01-25
HUP0104107A2 (hu) 2002-03-28
JP2002541761A (ja) 2002-12-10
NZ528283A (en) 2005-05-27
EP1121441A2 (en) 2001-08-08
HUP0104107A3 (en) 2003-09-29
CN101092636B (zh) 2012-08-08
NZ510805A (en) 2003-12-19
AU758354B2 (en) 2003-03-20
HU226602B1 (en) 2009-04-28
ATE348169T1 (de) 2007-01-15
CN101092636A (zh) 2007-12-26
CZ301506B6 (cs) 2010-03-31
WO2000022137A2 (en) 2000-04-20
AR020897A1 (es) 2002-06-05
CA2345900A1 (en) 2000-04-20
CN1330715A (zh) 2002-01-09
NO20011843L (no) 2001-06-14
KR20020013472A (ko) 2002-02-20
DE69934421T2 (de) 2007-10-11
NO330666B1 (no) 2011-06-06
ES2279636T3 (es) 2007-08-16
TWI262948B (en) 2006-10-01
HK1040529B (zh) 2007-02-09
IL142337A0 (en) 2002-03-10
HK1040529A1 (en) 2002-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8133481B2 (en) Selectively replicating viral vectors
JP2009254385A (ja) 選択的に複製するウイルスベクター
JP2005503797A (ja) アデノウイルスベクター及び関連する系、並びに製造及び使用の方法
EP1196616B1 (en) Replication-competent anti-cancer vectors
US20060257370A1 (en) Adenoviral vectors for treating diseases
JP2002530085A (ja) 後期導入遺伝子の発現を有するウイルスベクター
US20020019051A1 (en) Chimeric adenoviral vectors
JP2002527455A (ja) 組換え欠失アデノウイルスベクター
WO2000029573A2 (en) Adenoviral vectors
CN113774031B (zh) 一种复制型人腺病毒及其应用
MXPA01003840A (en) Selectively replicating viral vectors
MXPA01004989A (en) Viral vectors with late transgene expression

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Suspended procedure due to non-payment of fee