KR20120139672A - 원숭이 아데노바이러스 벡터의 증식 방법 - Google Patents

원숭이 아데노바이러스 벡터의 증식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 아데노바이러스로부터 분리된 하나 이상의 유전자 생성물을 포함하는, 인간 세포를 포함하는 세포에서의 원숭이 아데노바이러스의 증식 방법을 제공하며, 또한 원숭이 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 증식 방법을 제공하고, 또한 본 발명은 이러한 증식 방법에 의해서 수득되는, 복제-결핍 원숭이 아데노바이러스를 포함하는 원숭이 아데노바이러스를 제공한다.

Description

원숭이 아데노바이러스 벡터의 증식 방법{METHODS OF PROPAGATING MONKEY ADENOVIRAL VECTORS}
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은 미국 특허 가출원 제61/259,343호(출원일: 2009년 11월 9일)의 우선권을 주장하며, 이 기초 출원은 참고로서 이의 전문이 본 명세서에 포함된다.
전자적으로 제출된 자료의 인용에 의한 기재
본 명세서에 이의 전문이 인용으로 기재된 것은 이와 동시에 제출되며, 하기와 같이 확인되는 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드 서열 목록이다: 2010년 11월 8일 작성된 파일명이 "SEQ_Listing.TXT"인 One 38,463 Byte ASCII (Text) 파일.
발명의 기술분야
본 발명은 원숭이 아데노바이러스, 및 이러한 원숭이 아데노바이러스를 성장시키는 방법에 관한 것이며, 상기 원숭이 아데노바이러스는 인간 질병의 치료 및 예방을 포함하는 다양한 적용에 이용할 수 있다.
재조합 진핵 세포 바이러스 벡터는 많은 연구자 및 임상의를 위한 유전자 전달의 바람직한 수단이 되었다. 생체내 유전자 전달은 핵산, 일반적으로는 DNA 형태의 핵산을 투여하여 수용자에게 유리한 위치에 전달된 유전자의 단백질 생성물을 발현시킨다. 이점은 유전자 생성물에 대한 면역 반응의 유도, 즉 백신 접종, 또는 치료 목적을 위한 목표 세포의 유전자 레퍼토리의 변형일 수 있다. 상기는 소위 "이식 유전자(transgene)"를 암호화하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용해서 효과적으로 성취할 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 유전자 전달에 일반적으로 적용되는 다른 벡터(예를 들면, 레트로바이러스 벡터)에 비해 이점이 있으며, 이는 아데노바이러스가 (i) 높은 역가로 생성될 수 있으며(즉, 1013 바이러스 입자/㎖까지); (ii) 이들은 비복제 뿐만 아니라 복제 세포에 유전자를 효과적으로 전달하고; (iii) 재조합이 드물며; (iv) 아데노바이러스에 의한 일반적인 인간 감염에도 불구하고 아데노바이러스 감염과 인간 악성 종양의 공지된 관련성이 없고; (v) 아데노바이러스 게놈을 조작하여 크기가 다양한 외래 유전자를 수용할 수 있도록 하며; (vi) 아데노바이러스 벡터가 이의 DNA를 세포의 염색체에 삽입시키지 않아 이의 효과가 비영구적이며, 세포의 정상 기능을 간섭할 것 같지 않고; 및 (vii) 필수적인 특성으로서 복제 능력을 갖는 살아있는 아데노바이러스는 인간 백신으로서 안전하게 사용되기 때문이다[Straus, In Adenoviruses, Pienan Press, New York, N.Y., 451-496(1984); Horwitz et al ., In Virology, 2nd Ed., Fields et al ., eds., Raven Press, New York, N.Y., 1679-1721 (1990); Berkner, BioTechniques, 6: 616 (1988); Chanock et al ., IAMA, 195: 151 (1966); HajAhmad et al ., J. Virol ., 57: 267 (1986); 및 Ballay et al ., EMBO J, 4:3861 (1985)]. 인간 아데노바이러스는 현재 바이러스 백터 백신 및 유전자 치료 과정에서 가장 광범위하게 사용되는 재조합 바이러스 벡터 중의 하나이다.
일반적인 구조에 관해서, 지금까지 시험된 모든 아데노바이러스는 직경이 약 65 내지 80 나노미터인 외막이 없는 정이십면체이다. 아데노바이러스는 코어 단백질과 복합체를 형성하고, 아데노바이러스 캡시드로 둘러싸인 직쇄형 이중-가닥 DNA로 구성된다. 캡시드 단백질은 중화 항체의 표적이며, 여러 항원형은 바이러스 입자의 외부 상에 있는 캡시드 단백질의 뚜렷한 아미노산 서열을 갖는다.
아데노바이러스는 다섯 개의 속, 즉 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus), 앳아데노바이러스(Atadenovirus), 시아데노바이러스(Siadenovirus), 아비아데노바이러스(Aviadenovirus) 및 이타아데노바이러스(Ichtadenovirus)로 나뉘는 아데노바이러스 과에 속한다. 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 속의 아데노바이러스는 단지 포유류만 감염시키며, 인간, 침팬지 및 원숭이 아데노바이러스를 포함한다.
아데노바이러스는 이식 유전자를 세포에 전달하는 훌륭하고 효과적인 수단을 제공한다. 그러나, 생체내 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용으로 부딪히는 하나의 문제점은 아데노바이러스로의 자연적인 노출을 통해 수용자에 의해 획득되는 아데노바이러스에 대한 이미 존재하는 면역성의 존재이다. 주로, 일생에 걸친 아데노바이러스에 의한 감염으로 아데노바이러스 캡시드 단백질 상의 항원성 에피톱에 대한 항체의 발생을 유도한다. 역가가 충분하다면 항체는 아데노바이러스 유전자 전달 벡터의 효능을 제한할 수 있다. 또한, 아데노바이러스 벡터의 투여로 면역성을 유도할 수 있으며; 이에 따라 아데노바이러스는 효과적인 유전자 전달 비히클로서 한 번 이상은 사용할 수 없을 것이다. 예를 들면, 동물 연구로 아데노바이러스 타입 2 또는 5 유전자 전달 벡터의 정맥내 또는 국소 투여(예를 들면, 폐, 심장 또는 복막으로의)로 동일한 항원형 벡터 투여 1 내지 2 주 후로부터 발현을 방지하는 벡터에 대항하도록 지시된 항체가 생성될 수 있다는 것을 알 수 있다[예를 들면, Yei et al ., Gene Therapy , 1: 192-200 (1994); Zabner et al ., Nat . Gen ., 6: 75-83 (1994); Setoguchi et al ., Am . J. Respir . Cell . Mol . Biol., 10: 369-377 (1994); Kass-Eisler et al ., Gene Therapy , 1: 395-402 (1994); Kass-Eisler et al ., Gene Therapy , 3: 154-162 (1996) 참조]. 상기는 아데노바이러스-중재 유전자 전달에서의 단점이며, (예를 들면, 병원체에 대한 면역 반응을 유도 또는 부스팅(boosting)시키거나 또는 치료상의 이차 투여를 제공하기 위한) 아데노바이러스 벡터의 많은 용도는 반복 투여가 요구되기 때문이다. 아데노바이러스에 대항하도록 지시된 항체가 아데노바이러스-암호화 유전자의 발현을 막거나 또는 줄일 수 있는 메커니즘은 불명확하다. 그러나, 이러한 현상은 막연히 "중화 반응(neutralization)"이라고 하며, 원인이 되는 항체를 "중화 항체(neutralizing antibodies)"라고 한다. 따라서, 생체내 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 완전한 이점을 취하기 위해서는 (1) 다른 타입을 향하는 항체가 중화 반응에 민감하지 않으며, (2) 인간 집단에서 일반적으로 확인되는 항체가 중화 반응에 민감하지 않은 신규 타입의 아데노바이러스가 필요하다.
광범위한 범위의 동물 숙주로부터 분리된 매우 다양한 아데노바이러스가 있으며, 아데노바이러스는 우선 분리되는 숙주에 의해 명명된다. 아데노바이러스가 분리되는 숙주 동물에는 포유류, 새, 뱀, 개구리 및 어류를 포함한다. 포유류 숙주에는 특히 영장류, 예컨대 원숭이, 인간 및 침팬지가 포함된다.
인간 및 침팬지는 매우 밀접하게 관련이 있으며, 인류의 조상으로서 함께 같은 무리이다. 대조적으로, 원숭이는 인간 및 침팬지와는 같은 무리가 아니며, 이들 사이에는 매우 큰 진화적 거리감이 존재하기 때문이다. 원숭이는 25 내지 35 백만년 전에 인류의 조상으로부터 분리되었지만 인간 및 침팬지는 단지 약 7 백만년 전에 분리되었다[Samonte and Eichler, Nature Reviews Genetics , 3: 65-72 (2002)]. 인간, 침팬지 및 원숭이 사이의 이러한 유사성 및 차이점은 아데노바이러스의 입증된 숙주 범위 제한과 일치한다.
숙주 범위 제한에 대한 여러 상이한 방법이 존재한다. 예를 들면, 야생형 인간 아데노바이러스는 원숭이 세포 상에서는 생산적으로 성장하지 않는다. 야생형 인간 아데노바이러스로 감염된 원숭이 세포에서, 바이러스 초기 유전자는 적절하게 발현되며[Feldman et al ., J Bacteriol ., 91:813-8(1966); Van der Vliet and Levine, Nature, 246:170-4(1973)], 바이러스 DNA 복제는 정상적으로 일어난다[Rapp et al ., J. Bacteriol ., 92: 931-6 (1966); Reich et al ., PNAS, 55: 336-41(1966); Friedman et al ., J. Virol., 5: 586-97(1970)]. 그러나, 몇몇 후기 바이러스 단백질의 발현이 감소한다. 후기 유전자 발현에 대한 차단은 바이러스의 후기 mRNAs의 비정상 생성에 기인하는 것으로 나타나며[Klessig and Anderson, J. Virol., 16: 1650-68(1975)], 이러한 차단은 아데노바이러스 DNA 결합 단백질(DBP)의 단일 돌연변이에 의해 극복될 수 있다[Klessig and Grodzicker, Cell , 17: 957-66 (1979)]. DBP 중 단일 돌연변이를 함유하는 인간 아데노바이러스는 원숭이 세포 상에서 생산적으로 성장하며, 이는 원숭이/인간 차단에 대한 요체가 아데노바이러스의 생활 주기 중 DBP의 역할에 중심을 둔다는 것을 제안한다.
원숭이/인간 차단과 대조적으로 침팬지로부터 분리된 아데노바이러스는 인간 세포에서 제한을 가지지 않으며, 효과적으로 증식될 수 있다는 것이 확인되었다[W. P. Rowe et al ., Proc . Soc . Exp . Biol . Med ., 97(2): 465-470(1958); W. D. Hillis et al ., American Journal of Epidemiology , 90(4): 344-353(1969); N, Rogers et al ., Nature , 216: 446-449(1967)]. 특히, 몇몇 침팬지 아데노바이러스 분리물의 복제가 원숭이 세포에서보다 인간에서보다 효과적이라는 것이 확인되었다[M. Basnight et al ., American Journal of Epidemiology , 94(2): 166-171(1971)]. 다른 고등 유인원 종들, 예컨대 고릴라 및 보노보로부터 분리된 아데노바이러스는 또한 인간 세포 중에서 성장한다는 것이 최근에 확인되었다[S. Roy et al ., PLoS Pathogens , 5(7): e1000503(2009)]. 인간 세포에서 야생형 침팬지 아데노바이러스 복제는 인간 아데노바이러스 상보성 인자의 발현을 필요로 하지 않는데, 이는 E1-발현 세포 주(예를 들면, 인간 배아 신장 293 세포, 인간 망막 PER.C6 세포) 및 비-발현 세포 주(A549 인간 폐 상피 암 세포)가 이들의 증식을 위해 사용되기 때문이다[미국 특허 제6,083,716호; S. F. Farina et al ., Journal of Virology, 74(23):11603-11613(2001); S. Roy et al ., Virology , 324: 361-372(2004); S. Roy et al ., Human Gene Therapy , 15: 519-530(2004); E. Fattori et al ., Gene Therapy , 13(14): 1088-1096(2006); J. Skog et al ., Molecular Therapy, 15(12): 2140-2145(2007); D. Peruzzi et al ., Vaccine , 27(9): 1293-1300(2009)]. 복제 차단의 부재는 약 7 백만년 전에만 분리된 인간 및 침팬지 계통 사이의 밀접한 진화적 거리와 일치한다[Samonte & Eichler, Nature Reviews Genetics, 3: 65-72(2002)].
숙주의 더 큰 분기와 일치하는 인간 세포 상의 성장을 위한 원숭이 아데노바이러스의 숙주 범위 제한이 기재되어 있으며[Am . J. Hyg ., 68: 31(1958); Virology, 35: 248(1968); Savitskaya et al ., Doklady Biochemistry , 375: 242(2000); Alstein et al ., JVi , 2: 488(1968); Genetika , 39(6): 725-31(June 2003)], 결정 요인은 일부는 E4이고, E2도 가능하다는 가설이 제기되었다. Savitskaya 등은 supra에서 인간 배아 신장(HEK) 세포 주 293 상에서 원숭이 아데노바이러스 SV7(C8)[현재 SV16(ICTV 8th Report, p. 220)으로 공지되어 있음]은 성장하지 않는 것으로 보고하였다. 따라서 인간 아데노바이러스로부터의 E1 부위는 복제에 대한 차단을 경감시키는 것에는 충분하지 않다. 이러한 바이러스는 삽입된 Ad5 E4 부위(VK-10-9 세포)가 있는 HEK-293 세포 상에서 성장할 수 있다. 그러나, VK-10-9 세포는 단지 복제 차단을 부분적으로만 경감시키며, 이는 복제가 CV1 세포(녹색 원숭이 신장의 연속 주)보다 40 배 낮기 때문이다. 상기로 VK-10-9 세포에서의 원숭이 바이러스 복제를 여전히 차단한다는 것을 알 수 있다. 본 발명자는 E4 발현이 E4 ORF3 단백질 수준을 기준으로 너무 낮고[Krougliak and Graham, Hum . Gene Ther ., 6: 1575(1995)], 바이러스 특이적인 생성물이 아마도 필요할 것이라는 결론에 도달했다(Savitskaya et al ., supra). 다음에 본 발명자는 추가적인 연구가 문제를 명확하게 하기 위해서 필요할 수 있지만 생성물이 E2A 유전자에 의해 암호화될 수 있다는 것을 제안하였다. Savitskaya 등은 supra에서 또한 낮은 E4 발현이 원인이 될 수 있거나, E2A로부터의 추가적인 인자가 복제 차단의 완벽한 방출을 위해 필요할 수 있으며, 추가적인 연구가 상기 원인을 확인하기 위해 필요하다는 것을 언급하였다. 흥미롭게도, VK-10-9 세포에서의 E4 발현의 수준이 야생형 Ad5 복제 중에서보다 현저하게 낮다고 보고되었는데도 불구하고, HEK-293 세포에서의 야생형 인간 Ad5와 동일한 수준으로 E4-결실 인간 아데노바이러스 타입 5 바이러스의 복제에 충분히 높으며(Krougliak and Graham 1955), 이는 추가로 E4 발현 수준이 종-특이적 차단에 대해 완벽하게 설명하지 못한다는 것을 제시한다. 따라서, 더 많은 E4 발현 및/또는 E2A 생성물이 필요하다고 믿어지기는 하지만 필요한 것은 아니다. 또한, 바이러스 성장에 요구되는 Ad5 E4 기능이 인간 세포 상에서 원숭이 아데노바이러스의 숙주 범위 제한을 극복하기 위해 필요한 것으로부터 분리되며, 이는 성장을 위한 E4 요구 사항이 숙주 범위 결정 인자에서와 동일하지 않기 때문이라는 것이 명백하다. 따라서, Savitskaya 등의 supra에서는 아데노바이러스 E1 및 E4 부위가 종의 차단을 경감시키기 위해서 충분하지 않으며, 다른 부위, 특히 DBP(E2A)를 암호화하는 다른 부위가 중요하다는 것을 설명한다.
또한, 또 다른 연구에서, 인간 Ad2 및 SA7(C8)의 아데노바이러스-아데노바이러스 하이브리드는 복제에 결함이 있다는 것을 나타내었고, 이는 인간 E1 및 원숭이 E4가 양립될 수 없으며, 인간 아데노바이러스 E1이 세포로부터 발현된 인간 E1이 숙주 범위를 변경시키지 않는 상기에서 기재한 결과와 일치하는 숙주 범위 제한을 극복하는데 충분하지 않다는 것을 제안하였다[Alstein et al ., JVi , 2: 488(1968); Savitskaya et al., supra]. Ad2 및 SA7(C8) 사이의 여러 아데노바이러스-아데노바이러스 하이브리드는 Ad2 증식을 방지하기 위해서 선택적 조건 하에서 두 개의 바이러스의 성장에 의해 발생되었다[Grinenko et al ., Molecular Genetics , Microbiology and Virology , 5:25(2004)]. 인간 세포(HEK-293) 상의 혼성 바이러스의 성장 및 선별로 단지 SA7(C8)의 L3 부위 만이 포함된 결함이 있는 바이러스가 수득되었다. 본 발명자는 Ad2 E2 및 E2A(DNA 결합 단백질을 암호화함) 둘 다가 결함이 있는 하이브리드에 존재하며, 온전하다는 것을 주목하고, 유전자 E4 및 가능한 E2A가 E4 이상이 숙주 범위 제한을 경감시키기 위해 필요하다는 초기 결론과 일치하는, 종-특이적 숙주 범위의 결정과 관련이 있다는 것을 설명하였다. 이 결과들은 Ad2 게놈 중 단지 10%만이 인간 세포 상에서 성장하기 위한 원숭이-인간 아데노바이러스 하이브리드를 위해 제거될 수 있으며, Ad2 게놈 중 90%가 숙주 범위 결정 인자를 함유하기 위해 남는다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 하이브리드는 인간 세포 상에서 원숭이 아데노바이러스의 성장을 위해 필요한 인간 아데노바이러스 생성물의 설명을 추가로 제공하지 않는다. 종합하면, 이러한 보고들로 E4가 숙주 범위 결정 인자로서 역할을 하지만, 다른 아데노바이러스 유전자 또한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 E4 부위는 적어도 다섯 개의 공지된 단백질 생성물로 구성되며, 이러한 연구에도 불구하고, 숙주 범위 차단의 부분적인 경감에 필요할 수 있는 E4 성분 또는 성분들은 확인되지 않았다.
따라서, 인간 세포 상에서 효과적으로 증식 또는 복제되는 것으로부터 원숭이 아데노바이러스를 예방하는 숙주 범위 제한 또는 종-특이적 차단, 이의 경감 및 심지어는 제거할 수 있는 방법의 필요성이 남아있다. 또한, 인간의 아데노바이러스에 대한 이미 존재하는 면역성을 피할 수 있는 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터에 대한 필요성도 있다. 본 발명은 이러한 방법, 아데노바이러스 및 벡터, 및 이를 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 원숭이 아데노바이러스를 제공한다. 상기 원숭이 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스의 하나 이상의 유전자 생성물을 포함하는 세포에서 증식할 수 있다.
본 발명은 또한 세포에서 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는 방법을 제공하며, 상기 세포는 인간 아데노바이러스의 유전자 생성물(및/또는 암호화 핵산 서열)을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 (a) 인간 아데노바이러스의 E1 부위의 적어도 하나의 핵산 서열 및 (b) 인간 아데노바이러스의 E4 부위의 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 원숭이 아데노바이러스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 세포는 인간 아데노바이러스의 E1B 부위 및 E1A 부위 중 하나 또는 둘 다에 의해 암호화되는 유전자 생성물, 및 인간 아데노바이러스의 E4 ORF6으로 필수 구성되는 E4 부위의 일부분에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 발현하며, 이에 의해 원숭이 아데노바이러스가 세포에서 증식한다.
본 발명은 또한 세포에서 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는 방법을 제공하며, 상기 원숭이 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스의 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스는 (a) 인간 아데노바이러스의 E1 부위의 적어도 하나의 핵산 서열 및 (b) 인간 아데노바이러스의 E4 부위의 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 원숭이 아데노바이러스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스의 하나 이상의 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 유전자 생성물은 인간 세포에서 숙주 복제 차단을 경감시키거나 또는 극복하는데 책임이 있는 E4 부위의 일부분에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 포함하고, 이러한 일부는 E4 ORF6으로 필수 구성되며, 이로 인해서 원숭이 아데노바이러스는 세포에서 증식한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 유전자 생성물은 또한 인간 아데노바이러스의 E1B 부위 및 E1A 부위 중 하나 또는 둘 다에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 기재하는 증식 방법에 의해 수득되는 원숭이 아데노바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 원숭이 아데노바이러스가 증식하는 세포는 바람직하게 인간 세포이며, 특정 실시형태에서 원숭이 아데노바이러스는 복제-결핍이다. 인간 아데노바이러스는 종 C 인간 아데노바이러스가 바람직하다.
본 발명은 인간 아데노바이러스에 대한 인간과 관련이 있는 이미 존재하는 면역성을 해결하는 수단을 포함하여 본 기술에 걸쳐 다수의 이점이 있다. 본 발명은 또한 인간 세포에서 원숭이 아데노바이러스의 증식 또는 복제에 대항하는 숙주 범위 제한 또는 차단을 경감 또는 극복하는 크게 개선된 방법을 제공한다. 따라서 본 발명은 특히 인간에서 질병을 치료 및 예방하는 것을 포함하여 폭 넓은 목적을 위한 원숭이 아데노바이러스의 실질적인 성장 및 용도를 가능하게 한다.
도 1은 영장류 목의 분류를 설명하는 그래프;
도 2a 및 도 2b는 단일 방출량(single burst) 조건 하에서 원숭이 아데노바이러스 자손의 생성을 설명하는 그래프, 도 2a는 발현 Ad5 인자의 상이한 인간 세포 주에서의 생성을 묘사한다(A549=Ad5 인자가 없음, A549+Ad5 E4ORF6=Ad5 E4ORF6 인자, 293-ORF6=Ad5 E1 및 E4ORF6 인자). 도 2b는 Ad5 E1(293 세포), Ad5 E1+Ad5 E4ORF6이 있는 인간 세포 주에서의 생성, 또는 원숭이 세포 주(BSC-1)에서의 생성을 묘사한다. 결과는 평균 +/- 표준 편차이다;
도 3은 E1을 대체하는 발현 카세트가 있는 원숭이 아데노바이러스를 구성하는 방법을 설명하는 도식; 주요 부위를 갖는 원숭이 아데노바이러스 게놈(SV)이 확인됨(크지 않음): 반점 상자=ITR, Ψ=패키징 신호, TATA=E1a 프로모터의 TATAA 박스, 및 E1a, E1b, pIX, E3 및 E4를 위한 코딩 부위. B는 CMV 프로모터(화살표), 열린 해독 틀(orf) 및 pIX 코딩 서열 및 ITR 사이의 선형화된 SV40 폴리아데닐화 신호(SV)로 구성된 발현 카세트, 박테리아 복제 원점(Ori) 및 카나마이신(Kan) 약물 저항성을 암호화하는 유전자를 포함하는 수용자 플라즈미드이다. SV 게놈 및 플라즈미드 B 사이의 상동 재조합으로 E1 프로모터 및 E1A 및 E1B 코딩 서열이 CMV-orf 발현 카세트로 대체된다. 상동 재조합은 플라즈미드 C에서 수득된 두 개의 DNA로 재조합 컴피턴트 박테리아 BJ5183을 형질 전환시켜 발생된다. Kan 저항력이 있는 박테리아를 선별하고, 플라즈미드 C를 제한 분해 및 시퀀싱으로 확인한다. 바이러스 입자를 발생시키기 위해서 바이러스 게놈을 293-ORF6 세포로 감염시키기 이전에 플라즈미드 C를 바이러스 게놈 외부의 부위(R)를 인식하는 엔도뉴클레아제로 제한한다.
본 발명은 일반적으로 인간 세포에서 원숭이 아데노바이러스의 효과적인 증식 또는 복제를 방지하는 숙주 범위 제한 또는 종-특이적 차단을 경감 또는 극복하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 일반적으로 원숭이 아데노바이러스에 대한 인간 군에서 이미 존재하는 면역성 부재의 이점을 수반하는 원숭이 아데노바이러스 및 이의 용도를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 세포에서 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는 방법을 제공하며, 상기 세포는 인간 아데노바이러스의 하나 이상의 유전자 생성물을 발현시키거나/발현시키고 상기 원숭이 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 이러한 증식 방법에 의해 획득되는 원숭이 아데노바이러스를 제공한다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 벡터로서의 원숭이 아데노바이러스에 대한 용도를 제공한다.
본 발명은 세포를 아데노바이러스와 접촉시키는 단계(예를 들면, 세포의 형질 전환 단계)를 포함하는 원숭이 아데노바이러스의 증식 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 세포는 인간 아데노바이러스의 E1A, E1B 및 E4 부위 중 하나 이상에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 인간 세포에서 원숭이 아데노바이러스의 숙주 복제 차단을 경감 또는 극복하는 것을 초래하는 유전자 생성물(및/또는 이의 암호화 핵산 서열)을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 원숭이 아데노바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 세포는 인간 아데노바이러스의 E1A 부위 및 E1B 부위 중 하나 또는 둘 다에 의해 암호화되는 유전자 생성물 및 인간 세포에서 숙주 복제 차단을 경감 또는 극복하는 것을 초래하는 E4 부위 중 일부분에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 발현시키며, 상기 일부는 E4 ORF6으로 필수 구성되며, 이로 인해서 원숭이 아데노바이러스가 세포에서 증식한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 원숭이 아데노바이러스와 접촉 단계를 포함하며, 상기 원숭이 아데노바이러스는 인간 세포에서 숙주 복제 차단을 경감 또는 극복하는 것을 초래하는 E4 부위 중 일부분에 의해서 암호화되는 유전자 생성물을 포함하며, 인간 아데노바이러스의 E1A, E1B 및 E4 부위 중 하나 이상에 의해서 암호화되는 유전자 생성물을 포함할 수 있는 인간 아데노바이러스 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포를 원숭이 아데노바이러스와 접촉시키는 단계를 포함한다. 원숭이 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스의 하나 이상의 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 유전자 생성물은 인간 세포에서 숙주 복제 차단을 경감 또는 극복하는 것을 초래하는 E4 부위 중 일부분에 의해서 암호화되는 유전자 생성물을 포함하고, 상기 일부는 E4 ORF6으로 필수 구성되며, 이로 인해서 원숭이 아데노바이러스가 세포에서 증식한다.
몇몇 실시형태에서, 세포는 종-특이적 차단을 경감 또는 극복하는 것을 초래하는 E4 부위를 발현시킨다. 몇몇 실시형태에서, 상기 발현된 E4 부위는 ORF6을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 발현된 E4 부위는 필수적으로 ORF6으로 구성된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 발현된 E4 부위는 ORF6으로 구성되며, E4 부위의 다른 ORF는 아니다.
하나의 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스와 접촉하는 세포는 종 C 인간 아데노바이러스의 하나 이상의 유전자 생성물을 발현시키는 것이 바람직한데, 이것은 바람직한 인간 항원형 5 아데노바이러스를 포함하는 다수의 인간 아데노바이러스를 포함한다.
인간 세포는 원숭이 아데노바이러스를 증식시키기 위해 바람직하며, 바람직한 인간 세포는 HEK-293 세포 또는 PerC.6 세포를 포함한다.
원숭이 아데노바이러스는 또한 복제-결핍일 수 있다. 복제-결핍인 경우 아데노바이러스는 증식을 위한 아데노바이러스의 E1A 부위, E1B 부위 및 E4 부위 중 하나 이상의 상보성을 필요로 한다. 하나의 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 E4 부위 중 적어도 일부분에서의 결핍 및 E1 부위에서의 결핍을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 아데노바이러스는 또한 아데노바이러스 게놈의 E3 부위 중의 결핍을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 원숭이 아데노바이러스는 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다. 원숭이 아데노바이러스는 E1 부위의 결실을 포함하는 것이 바람직하며, 아데노바이러스의 E4 부위 중 적어도 일부분의 결실을 포함하는 것이 가장 바람직하고, 상기 이종 핵산 서열은 아데노바이러스의 결실된 E4 부위 또는 결실된 E1 부위로 삽입된다.
원숭이 아데노바이러스는 하기에 공지된 항원형 1, 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 39 또는 이의 결합물을 포함하는, 공지되었거나 또는 미래에 발견되는 다양한 항원형일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 "원숭이(monkey)"라는 용어는 신세계 및 구세계 원숭이 둘 다를 나타내며, 사람과(Hominidae)[예를 들면, "고등 유인원(great apes)"이라고도 하는 인간, 침팬지, 고릴라 및 오랑우탄] 중 임의의 구성원을 포함하지 않는다. 신세계 원숭이는 비단원숭이과(Callitrichidae) 과(예를 들면, 마모셋 및 타마린), 꼬리감는원숭이과(Cebidae ) 과(예를 들면, 흰목꼬리감기원숭이 및 다람쥐원숭이), Aotidae 과[예를 들면, 올빼미원숭이(douroucoulis)], 사키원숭이과(Pitheciidae) 과(예를 들면, 티티원숭이, 굵은꼬리원숭이 및 우아카리) 및 거미원숭이과(Atelidae) 과(예를 들면, 하울러, 스파이더 및 양털원숭이)를 포함한다[예를 들면, Hershkovitz (ed.), Living New World Monkeys ( Platyrrhini), Volume 1, University of Chicago Press (1977) 참조]. 구세계 원숭이는 긴꼬리원숭이아과(Cercopithecinae) 과, 예컨대 예를 들면, 마카크, 개코원숭이 및 망가베이 동물을 포함한다[예를 들면, Whitehead, ed., Old World Monkeys, Cambridge University Press (2002) 참조]. "원숭이(monkey)"라는 용어는 본 명세서에서 "시미안(simian)"이라는 용어와 동의어로 사용된다. 영장류 순서의 분류 체계는 도 1에 나타낸다.
아데노바이러스 항원형은 중화 반응 분석을 기초로 구분된다. 항원형은 다른 타입과의 교차 반응이 없거나 또는 제한된 것으로서 규정한다[fauquet et al ., (eds.), Virus Taxonomy : The Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Academic Press, p. 216 (2005) 참조]. 혈청학적으로 구분가능한 항원형(또한 아데노바이러스 "타입"이라고도 함)을 종으로 배열한다. 고전적으로, 종 명칭은 첫 번째 기재된 숙주를 반영한다. 10% 이상의 계산된 계통 발생 거리와 결합된 교차 중화 반응의 부족으로 두 개의 항원형이 별개의 종으로 분리된다. 또한 종의 지정은 숙주 범위, DNA 이종 교배, RFLP 분석, 게놈 내 GC의 백분율, 설치류에서의 종양 형성력, 성장 특성, 재조합 가능성, VA RNA 유전자의 수, 혈구응집반응, E3 부위의 유전적 구성 및 숙주 범위를 포함하는 아데노바이러스의 항원형 사이가 다른 기타 특성에 따라 달라진다. 원숭이로부터 분리된 시미안 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 및 침팬지 아데노바이러스 둘 다로부터 매우 멀다. 침팬지 아데노바이러스는 종 B 및 E의 통상적 인간 아데노바이러스와 밀접하게 관련이 있어 너무 유사해서 침팬지 아데노바이러스가 인간 종 B 및 E 내로 배열된다. 시미안 아데노바이러스에 대한 제한된 계통진화 재구성으로 시미안 아데노바이러스가 보통의 침팬지 및 인간 아데노바이러스와 꽤 멀다는 것이 밝혀졌다[Virus Taxonomy : VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2005)]. 영장류를 감염시키는 아데노바이러스의 계통 발생론은 예를 들면 Roy et al ., PLoS Pathog ., 5(7): e100050. doi: 10.1371/journal.ppat.1000503(2009)에 기재되어 있다.
다양한 기원, 항원형 또는 항원형의 혼합물은 시미안 아데노바이러스 벡터에 대한 바이러스 게놈(예컨대 미국 특허 제7,247,472호 및 제7,491,508호에 기재된 것과 같음)의 원천으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 시미안 아데노바이러스는 항원형 1, 3, 6, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 39, 48, 49, 50 또는 임의의 다른 시미안 아데노바이러스 항원형일 수 있다. 시미안 아데노바이러스는 예컨대 예를 들면 SV, SAdV 또는 SAV인 당업계에 공지되어 있는 임의의 적당한 약어를 사용하여 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 시미안 아데노바이러스 벡터는 항원형 3, 6, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38 또는 39의 시미안 아데노바이러스 벡터이다. 몇몇 실시형태에서, 시미안 아데노바이러스 벡터는 항원형 7, 11, 16, 18 또는 38로 구성된다. 하나의 실시형태에서, 시미안 아데노바이러스 벡터는 항원형 7이다. 원숭이로부터 분리된 이러한 시미안 아데노바이러스는 인간 항원형 5 아데노바이러스에 대해 낮은 서열 상동성을 가지며, 장 F 및 G 항원형 아데노바이러스와 분명하게 차이가 있지만 더 밀접하게 관련이 있다. 이것들은 하나의 섬유 유전자 대신에 두 개의 상이한 섬유 유전자(장섬유 및 단섬유)를 함유하며, 이는 이들이 점막 면역 반응을 자극하도록 기대되는 장 친화성(gut-tropic) 인간 아데노바이러스와 유사하게 장 점막을 표적으로 할 수 있다는 것을 제시한다. 또한, 바이러스 헥손 단백질 사이의 비교로 시미안 아데노바이러스 항원형 7, 11, 16 및 38은 인간 아데노바이러스와 먼 관련성이 있으며, 다른 기관보다 장 친화성 아데노바이러스(인간 Ad40, 41 및 52)로 더 밀접하게 분류된다.
임의의 항원형의 야생형 시미안 아데노바이러스는 임의의 적당한 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 예를 들면, 시미안 아데노바이러스는 장 생검, 배설물 세안액, 코 세안액, 폐 세안액 및 다른 신체 배설물을 포함하는 원숭이 생검 및 신체 배설물로부터 당업계의 표준 방법을 사용해서 분리할 수 있다. 야생형 시미안 아데노바이러스는 또한 시판되는 공급처, 예컨대 미국 미생물 보존 센터(버지니아주 매너서스시에 소재한 ATCC, Manassas, Virginia)에서 이용가능하다.
몇몇 실시형태에서, 시미안 아데노바이러스는 개코원숭이(예를 들면, ATCC-VR 275) 또는 붉은털 원숭이 또는 아프리카 녹색 원숭이(예를 들면, ATCC-VR 196, ATCC-VR 201, ATCC-VR 209, ATCC-VR 353, ATCC-VR 355, ATCC-VR 541, ATCC-VR 941, ATCC-VR 942 및 ATCC-VR 943)로부터 분리된다.
본 발명은 대부분의 경우에 숙주 범위 차단을 바람직하게 완벽하게 경감시켜 인간 세포에서 개선된 원숭이 아데노바이러스 복제를 제공한다. 본 명세서에서 나타낸 자료로 원숭이 아데노바이러스가 인간 세포에서는 성장하지 않는 것을 확인하였으며, 원숭이 세포와 비교하여 인간 아데노바이러스 구성요소을 갖는 인간 세포에서 원숭이 아데노바이러스의 동일하거나 또는 훨씬 더 우월한 성장을 입증하였다(실시예 1 참조). 실시예 1은 Savitskaya 등의 supra에서 보고한 40배 결핍과는 대조적으로 원숭이 세포와 비슷하거나 또는 더 높게 최소의 인간 아데노바이러스 구성요소을 갖는 인간 세포 주 상에서 원숭이 아데노바이러스 자손의 높은 생산력을 보여준다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 범위 제한은 아데노바이러스 감염 중 발현된 인간 아데노바이러스 E4 ORF6 단백질(34K)과 함께 인간 배아 신장 세포 주 293(HEK-293) 상에서 원숭이 바이러스를 증식시켜 제거할 수 있다. 놀랍게도, 실시예 1의 HEK-293 세포에서 34K 단백질의 발현은 검출하기에는 너무 낮으며, 이는 VK-10-9 세포에 있어서 이전에 보고된 것을 연상시킨다[Krougliak and Graham, Hum . Gene Ther ., 6: 1575(1995)]. 따라서, 실시예 1에서의 인간 세포 주가 원숭이 아데노바이러스에 있어서의 원숭이 세포인 것과 같이 원숭이 아데노바이러스에 있어서 동일하게 허용된다는 것을 예상하지 못했다(자료는 도시하지 않았음).
따라서, 본 발명에 따르면 인간 세포 상에서 성장하는 원숭이 아데노바이러스의 숙주 범위 제한을 극복하기 위해서, 인간 아데노바이러스 E4의 일부 또는 서브셋은 ORF6 내의 인간 세포 주에서의 복제 차단을 극복하는 E4의 기능처럼 전체 E4 부위 대신에 세포 내 바이러스 복제동안 발현되어야 한다. 원숭이 아데노바이러스 성장을 완전하게 지지하기 위한 VK-10-9 세포의 실패 원인은 세포에 삽입되는 인간 E4 서열에서의 억제 기능이 존재하기 때문일 가능성이 있다. 따라서, 숙주 범위 결정 인자는 모든 E4를 포함하지 않으며, E2A를 포함하지 않는다. 더 정확히 말하면, 숙주 범위 결정 인자는 E4 ORF6이며, 명백하게는 E4 내의 다른 인자 중 하나 단독 또는 암호화된 것을 결합한 것이 아니다. 특히, E4 ORF6의 발견이 충분한 것을 고려하여 Savitskaya 등의 supra에서의 자료로 인해 E4가 많은 것보다 적어야 하며, 인간 세포에서 원숭이 아데노바이러스의 성장을 억제하는 VK-10-9 세포에 포함된 인간 아데노바이러스 E4에서 성분이 있을 수 있다고 재해석될 수 있다.
인간 세포 상에 원숭이 아데노바이러스의 복제를 허용하는 인간 아데노바이러스 구성요소의 확인은, 이에 제한하지는 않지만, 원숭이 아데노바이러스에 기반한 생성물의 실현 가능한 제조와 같은 많은 이점을 갖는다. 또한, 인간 세포 상의 원숭이 아데노바이러스에 대한 숙주 범위 차단을 경감시킬 필요가 있는 E4 성분을 감소시키는 능력은 요구되는 모든 E4와 비교해서 명백한 이점을 갖는다. E4 요구 사항의 단순화로 E4 서열 발현의 적당한 조절 및 DNA 서열의 조작을 용이하게 할 수 있다. 상기는 인간 세포 상에서 원숭이 바이러스를 증식시키는 시스템 도안을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 인간 아데노바이러스 E4 서열의 서브셋은 원숭이 아데노바이러스 중에 포함되고, 세포의 게놈에 통합되거나, 인간세포 또는 원숭이 아데노바이러스와 관련이 없는 별도의 염색체에 존재할 수 있다. E4 ORF6을 포함하는 E4 서열의 서브셋으로만 작업하면 이들 서열 발현 조절을 용이하고 더 확실하게 할 수 있다. 이러한 향상된 제어로 원숭이 아데노바이러스가 사용될 수 있는 상업적 및 과학적 응용을 확대하고, 상품의 비용을 감소시킬 수 있는 원숭이 아데노바이러스의 수율을 높일 수 있다.
인간 세포 상에서의 원숭이 아데노바이러스의 복제를 허용하기에 충분한 인간 아데노바이러스 구성요소 확인의 또 다른 이점은 조건부 복제 아데노바이러스(conditionally replicating adenovirus ; CRAD)를 발생시키는 능력이다. 예를 들면, 주어진 질병, 증상, 상태, 조직 또는 세포 타입에 특이적인 발현 제어 요소 하에서 원숭이 아데노바이러스 내 인간 아데노바이러스 E1 및 E4 ORF6 서열의 포함은, 필요하다면 단지 제어 방식으로 원숭이 바이러스를 복제한다. CRAD에 대한 응용은 많으며, 예를 들면 암 세포의 용해, 바이러스 벡터 복제 조건 하에서만의 치료 유전자의 발현 및 제한된 복제 백신을 포함한다.
인간 세포 상에서 원숭이 아데노바이러스의 상당한 복제를 위해 충분한 인간 아데노바이러스 구성요소 확인의 또 다른 이점은 이식 유전자 발현 카세트가 원숭이 아데노바이러스 게놈에 포함되는 아데노바이러스 유전자 전달 벡터를 발생시키는 능력이다. 인간 세포 주-인간 아데노바이러스 시스템 상에서 증식하는 원숭이 아데노바이러스로부터 유래된 아데노바이러스 벡터는 하기와 같은 이점을 갖는다: (1) 원숭이 아데노바이러스에 대한 인간 군에서의 이미 존재하는 면역성의 부재, (2) 인간 군의 강화된 안전성을 위한 복제에 대한 종-특이적 차단, 및 (3) 비-인간 세포 주 상에서의 제조로부터 비의도적 이종 병원균의 위험을 피함. 예를 들면, 원숭이 폴리오마 바이러스 SV40은 원숭이 세포 상에서 제조되는 인간 백신 생성물의 배치를 오염시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
시미안 아데노바이러스 벡터를 제조하기 위한 상보적 세포 주는 이에 제한하지는 않지만 하기를 포함한다: 293 세포[예를 들면, Graham et al ., J. Gen . Virol., 36:59-72(1977)에 기재됨], PER.C6 세포[예를 들면, 국제 특허 출원 WO97/00326 및 미국 특허 제5,994,128호 및 제6,033,908호에 기재됨] 및 293-ORF6 세포[예를 들면, 국제 특허 출원 WO95/34671 및 Brough et al ., J. Virol ., 71:9206-9213(1997)에 기재됨]. 추가 상보적 세포는 예를 들면 미국 특허 제6,677,156호 및 제6,682,929호 및 국제 특허 출원 WO03/20879에 기재되어 있다. 몇몇 예로서, 세포 게놈은 복제-결핍 아데노바이러스 벡터의 결핍 모두에 대해 상보적인 유전자 생성물인 핵산 서열을 포함할 필요는 없다. 복제-결핍 아데노바이러스 벡터에서의 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능의 부족은 헬퍼 바이러스, 예를 들면 원하는 아데노바이러스 벡터의 복제에 필요한 하나 이상의 필수 유전자 기능을 도중에 제공하는 아데노바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 흔히 감염성 헬퍼 바이러스의 패키징을 방지하도록 유전자조작된다. 예를 들면, 아데노바이러스 게놈의 E1 부위의 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능은 상보적 세포에 의해 제공되는 반면에 아데노바이러스 게놈의 E4 부위의 복제-필수 유전자 기능은 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다.
이상적으로, 복제-결핍 시미안 아데노바이러스 벡터는 복제-컴피턴트 아데노바이러스(RCA) 오염이 실질적으로 없는 약학적인 조성물인 조성물에 존재한다(예를 들어, 상기 조성물은 조성물 중에서 총 아데노바이러스를 기본으로 복제-컴피턴트 아데노바이러스의 약 1% 이하를 포함함). 가장 바람직하게, 상기 조성물은 RCA가 없다. RCA가 없는 아데노바이러스 벡터 조성물 및 스톡은 미국 특허 제5,944,106호, 미국 특허 출원 제2002/0110545 A1호 및 국제 특허 출원 WO95/34671에 기재되어 있다.
시미안 아데노바이러스 벡터가 복제-결핍이 아니라면, 이상적으로 시미안 아데노바이러스 벡터는 표적 조직내로 벡터의 복제를 제한하도록 조작된다. 예를 들면, 시미안 아데노바이러스 벡터는 의사에 의해 미리 결정된 조건하에서 복제하도록 제작된 조건부-복제 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들면, 복제-필수 유전자 기능, 예를 들면, 아데노바이러스 초기 부위에 의해 암호화되는 유전자 기능은 유도가능하며, 억제할 수 있거나 또는 조직-특이적인 전사 제어 서열, 예를 들면 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 실시형태에서, 복제는 전사 제어 서열과 상호작용하는 특이적 인자의 존재 또는 부재가 요구된다. 바이러스 감염 처리로, 예를 들면 지속적으로 항원을 제조하고, 면역 세포 생성을 제어하기 위해서 림프절에서 아데노바이러스 벡터 복제를 제어하는 것이 유리할 수 있다. 조건부-복제 아데노바이러스 벡터는 추가로 미국 특허 제5,998,205호에 기재되어 있다.
원숭이 아데노바이러스의 유용성 중의 하나는 세포로 단백질 또는 단백질의 일부를 운반하는 것이다. 단백질을 운반하는 하나의 방법은 바이러스 캡시드의 피복 단백질 중 하나에 이들을 묶는 것이다. 캡시드는 상기를 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다. 캡시드에 비-아데노바이러스 물질을 묶기 위해 변형된 다수의 바이러스 캡시드 예가 존재한다. 몇몇 변형은 꼭 맞는 단백질성인 반면에 다른 것들은 아니다. 아데노바이러스 캡시드에 연결될 수 있는 물질의 예로는 항체, 수용체, PEG 및 가교 화학물질을 포함한다. 바이러스 캡시드 유전자는 또한 외래 유전자 또는 이의 일부를 포함하도록 유전적으로 변형되어 외래 유전자 생성물이 바이러스 입자의 일부가 되는 바이러스 캡시드 단백질의 일부가 될 수 있다. 단백질의 효과는 이의 내면화 여부에 관계없이 세포 상에서 발휘될 수 있다. 내면화되지 않는다면 원하는 결과를 유도하는 세포 경로를 활성화시키거나 또는 불활성화시킬 수 있다. 또한, 원숭이 바이러스가 내면화되면 단백질은 세포 상에 미치는 효과를 끌어낼 수 있다. 단백질은 또한 단백질 자체에 대해 잠재적으로 면역 반응을 자극할 수도 있다. 캡시드 단백질 섬유, 헥손, pIX 및 펜톤은 모두 비-아데노바이러스 단백질 또는 이의 단백질 및 비-단백질성 물질을 포함하도록 변형될 수 있다고 확인되었다.
바이러스 캡시드의 변형은 추가의 이점을 가질 수 있다. 바이러스의 자연 발생적 향성은 변경될 수 있다. 바이러스는 새로운 수용체로 전송될 수 있으며, 이의 정상 수용체와의 상호작용은 폐지될 수 있고, 이의 정상 수용체와의 상호작용이 강화될 수 있다. 원숭이 아데노바이러스의 전송은 목적하는 세포 타입으로 이를 유도함으로써 바이러스의 목적하는 활성을 증가시킬 수 있거나 또는 목적하지 않은 결과를 획득할 수 있는 세포 타입을 피하도록 도울 수 있다. 변형은 또한 면역 시스템의 회피를 유도할 수도 있다. 다수의 캡시드 단백질을 동시에 변형시킬 수 있다.
아데노바이러스의 피복 단백질은 잠재적인 숙주 세포 상에서 수용체에 대한 아데노바이러스의 결합 특이성 또는 인식을 변경하도록 조작될 수 있다. 아데노바이러스에 있어서, 이러한 조작으로는 아데노바이러스 피복 단백질(예를 들면 섬유, 펜톤 또는 헥손) 부위의 결실, 다양한 천연 또는 비천연 리간드를 피복 단백질의 일부에 삽입 등을 포함할 수 있다. 피복 단백질의 조작으로 아데노바이러스에 의해 감염된 세포의 범위를 넓힐 수 있거나 또는 특이적 세포 타입으로의 아데노바이러스의 표적화가 가능할 수 있다.
시미안 아데노바이러스 벡터는 잠재적인 숙주 세포 상의 수용체에 대한 아데노바이러스의 인식 또는 결합 특이성을 변경시키도록 조작될 수 있다. 아데노바이러스에 있어서, 이러한 조작으로는 아데노바이러스 피복 단백질(예를 들면, 섬유, 펜톤 또는 헥손) 부위의 결실, 피복 단백질의 일부로 다양한 천연 또는 비천연 리간드의 삽입 등을 포함할 수 있다. 피복 단백질의 조작으로 시미안 아데노바이러스 벡터에 의해 감염된 세포의 범위를 넓힐 수 있거나 또는 특이적 세포 타입으로 시미안 아데노바이러스 벡터의 표적화가 가능할 수 있다. 혈액에서 발견되는 단백질, 예컨대 아데노바이러스 벡터 생물학에 영향을 줄 수 있는 응집 인자 X(FX)와의 상호작용을 피할 수 있다. 헥손의 변형은 FX와의 상호작용을 피할 수 있는 바람직한 방법이다.
숙주 세포에 대한 천연 결합, 예컨대 섬유 단백질과 그것의 세포 수용체의 천연 결합을 변경하기 위한 임의의 적당한 기술을 적용할 수 있다. 예를 들면, 섬유 길이를 변경하여 세포에 대한 천연 결합을 제거할 수 있다. 상기는 선택적으로 펜톤 베이스(penton base) 또는 섬유 놉(fiber knob)에 결합 서열을 첨가하여 획득될 수 있다. 이러한 결합 서열의 첨가는 이중특이적 또는 다중특이적 결합 서열을 경유해서 직접적으로 또는 간접적으로 실행될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 아데노바이러스 섬유 단백질은 섬유 샤프트에서 아미노산 수를 줄이도록 변형하여 "짧은-샤프트형(short-shafted)" 섬유를 형성할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제5,962,311호에 기재되어 있음). 짧은-샤프트형 아데노바이러스 섬유 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 사용하면 이의 세포-표면 수용체로의 아데노바이러스 섬유 결합 효율성 또는 수준을 감소시키고, 이의 세포-표면 수용체로의 아데노바이러스 펜톤 베이스 결합을 증가시켜 주어진 세포로의 아데노바이러스 결합 특이성을 증가시킨다. 대안으로, 짧은-샤프트형 섬유를 포함하는 시미안 아데노바이러스 벡터의 사용은 펜톤 베이스 또는 섬유 놉 중 하나에 비천연 아미노산 서열의 도입으로써 원하는 세포-표면 수용체로 시미안 아데노바이러스 벡터의 표적화를 가능하게 할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 천연 물질 결합과 관련된 아미노산 잔기를 암호화하는 핵산 잔기가 변경, 보충 또는 결실되어[예를 들어, 국제 특허 출원 WO00/15823, Einfeld et al ., J. Virol ., 75(23):11284-11291(2001) 및 van Beusechem et al ., J. Virol ., 76(6):2753-2762(2002) 참조] 돌연변이된 핵산 잔기를 포함하는(또는 이에 의해 암호화되는 섬유 단백질을 갖는) 시미안 아데노바이러스 벡터는 그것의 천연 물질과 덜 결합할 수 있다.
놉과 천연 세포 수용체 사이의 상호작용을 중재하거나 또는 돕는 섬유 단백질의 임의의 적당한 아미노산 잔기(들)는 섬유 단백질이 삼량체화 할 수 있는 한 돌연변이되거나 또는 제거될 수 있다. 유사하게, 아미노산은 섬유 단백질이 삼량체화 능력을 유지하는 한 섬유 놉에 첨가될 수 있다. 적당한 잔기는 섬유 놉 도메인의 노출 루프, 예컨대 AB 루프, DE 루프, FG 루프 및 HI 루프내에 아미노산을 포함한다.
펜톤 베이스과 인테그린 사이의 상호작용을 중재하거나 또는 보조하는 펜톤 베이스 단백질의 임의의 적당한 아미노산 잔기(들)는 돌연변이되거나 또는 제거될 수 있다. 임의의 잔기는 예를 들면 시미안 아데노바이러스 펜톤 베이스 단백질의 초가변 부위내에 위치하는 RGD 아미노산 서열 모티프를 포함한다. 펜톤 베이스 단백질 상의 천연 인테그린 결합 부위는 또한 천연 RGD 모티프를 암호화하는 핵산 서열 변형에 의해 방해되어 천연 RGD 아미노산 서열이 예컨대 아데노바이러스 펜톤 베이스 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 인접하거나 또는 그 내로 DNA 서열을 삽입함으로써 인테그린 수용체에 결합하기 위해 형태학적으로 접근하기 어려울 수 있다.
시미안 아데노바이러스 벡터는 이들의 각각의 천연 세포 결합 부위에 결합하지 않는 펜톤 베이스 단백질 및 섬유 단백질을 포함할 수 있다. 대안으로, 시미안 아데노바이러스 벡터는 상응하는 야생형 피복 단백질보다 친화력이 적지만 이들의 각각의 천연 세포 결합 부위에 결합하는 펜톤 베이스 단백질 및 섬유 단백질을 포함한다. 시미안 아데노바이러스 벡터는 변형된 아데노바이러스 섬유 단백질 및 펜톤 베이스 단백질이 동일한 항원형의 비-변형 아데노바이러스 섬유 단백질 및 펜톤 베이스 단백질보다 적어도 약 5배, 10배, 20배, 30배, 50배 또는 100배 적은 친화력으로 이들의 각각의 천연 세포 결합 부위에 결합한다면, 천연 세포 결합 부위와 감소된 결합을 나타낸다..
시미안 아데노바이러스 벡터는 또한 물질(즉 리간드), 예컨대 천연 세포 수용체와는 다른 세포 수용체에 결합하는 비천연 아미노산 서열을 포함하는 키메라 피복 단백질을 포함할 수도 있다. 키메라 아데노바이러스 피복 단백질의 비천연 아미노산 서열은 키메라 피복 단백질을 포함하는 시미안 아데노바이러스 벡터가 비천연 아미노산 서열이 없는 상응하는 아데노바이러스에 의해 자연적으로 감염되지 않은 숙주 세포(즉 상응하는 야생형 아데노바이러스에 의해 감염되지 않은 숙주 세포)에 결합하도록 하고, 바람직하게는 상기 숙주 세포를 감염시키며, 비천연 아미노산 서열이 없는 상응하는 아데노바이러스보다 더 큰 친화력으로 상응하는 야생형 아데노바이러스에 의해 자연적으로 감염되는 숙주 세포에 결합시키고, 또는 비-목표 세포보다 더 큰 친화력으로 특정 목표 세포에 결합시킨다. "비천연" 아미노산 서열은 아데노바이러스 피복 단백질에 자연적으로 존재하지 않는 아미노산 서열 또는 아데노바이러스 피복 중에서 발견되지만, 캡시드 내에서 비천연 위치에 배치되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. "우선적 결합(preferentially binds)"은 비천연 리간드가 여러 수용체, 예컨대 예를 들면 αvβ1 인테그린에 결합하는 것보다 적어도 3배 큰 친화력(예를 들면, 적어도 약 5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 35배, 45배 또는 50배 더 큰 친화력)으로 비천연 아미노산 서열이 수용체, 예컨대 예를 들면 αvβ3 인테그린과 결합하는 것을 의미한다.
시미안 아데노바이러스 벡터는 야생형 아데노바이러스 코트 단백질보다 더 효과적으로 면역 세포에 결합하는 능력을 키메라 피복 단백질에 부여하는 비천연 아미노산 서열을 포함하는 키메라 피복 단백질을 포함할 수 있다. 특히, 시미안 아데노바이러스 벡터는 면역 세포, 바람직하게는 항원 전달 세포(antigen presenting cells), 예컨대 수지상 세포, 단핵 세포 및 마크로파지에 의해 시미안 아데노바이러스 벡터의 흡수를 용이하게 하는 비천연 아미노산 서열을 포함하는 키메라 아데노바이러스 섬유 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 시미안 아데노바이러스 벡터는 수지상 세포로의 시미안 아데노바이러스 벡터의 형질 도입 효율성을 증가시키는 RGD 모티프를 포함하는 아미노산 서열(예를 들면, 비-네이티드 아미노산 서열)을 포함하는 키메라 섬유 단백질을 포함한다. RGD-모티프 또는 임의의 비천연 아미노산 서열을 이상적으로 HI 루프와 같은 아데노바이러스 놉의 노출 루프에서 아데노바이러스 섬유 놉 부위로 삽입되는 것이 바람직하다. 비천연 아미노산 서열은 또한 선택적으로 간격 서열을 경유해서 아데노바이러스 섬유 단백질의 C-말단에 첨부할 수 있다. 바람직하게 간격 서열은 백만 및 이백만 아미노산 사이를 포함하며, (필요하지는 않지만) 의도적 기능을 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 시미안 아데노바이러스 벡터는 진핵 세포의 특이적 타입에 있어서는 선택적이지 않은 키메라 바이러스 피복 단백질을 포함할 수 있다. 상기 키메라 피복 단백질은 내부 피복 단백질 서열을 대신하거나 이에 비천연 아미노산 서열을 삽입시키거나 또는 코드 단백질의 N- 또는 C-말단에 비천연 아미노산 서열을 부착시켜 야생형 단백질과는 상이하다. 예를 들면, 약 5개 내지 약 9개 리신 잔기(바람직하게는 7개의 리신 잔기)를 포함하는 리간드는 비-기능적 간격 서열을 경유해서 아데노바이러스 섬유 단백질의 C-말단에 부착될 수 있다. 본 실시형태에서, 키메라 바이러스 피복 단백질은 미국 특허 제6,465,253호 및 국제 특허 출원 WO97/20051에 기재된 것과 같이 야생형 바이러스 코트보다 더 넓은 범위의 진핵 세포에 효과적으로 결합된다.
잠재적인 숙주 세포를 인식하는 시미안 아데노바이러스 벡터의 능력은 피복 단백질의 유전적 조작 없이, 즉 이중-특이적 분자를 사용하여 조작될 수 있다. 예를 들면, 특별한 세포 표면 결합 부위에 선택적으로 결합하는 도메인 및 펜톤 베이스-결합 도메인을 포함하는 이중특이성 분자와 아데노바이러스의 복합체화로 특정 세포 타입에 대한 시미안 아데노바이러스 벡터의 표적화가 가능하다. 또한, 항원은 비-유전적 수단을 통해 아데노바이러스 입자의 표면에 콘쥬게이트될 수 있다.
비천연 아미노산 서열은 키메라 아데노바이러스 피복 단백질을 형성하기 위해 임의의 아데노바이러스 피복 단백질에 콘쥬게이트될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 비천연 아미노산 서열은 섬유 단백질, 펜톤 베이스 단백질, 헥손 단백질, 단백질 IX, VI 또는 IIIa 등에 콘쥬게이트되거나, 이들에 삽입되거나 또는 이들에 부착될 수 있다. 이러한 단백질을 이용하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,543,328호; 제5,559,099호; 제5,712,136호; 제5,731,190호; 제5,756,086호; 제5,770,442호; 제5,846,782호; 제5,962,311호; 제5,965,541호; 제5,846,782호; 제6,057,155호; 제6,127,525호; 제6,153,435호; 제6,329,190호; 제6,455,314호; 제6,465,253호; 제6,576,456호; 제6,649,407호; 제6,740,525호; 및 제6,951,755호, 및 국제 특허 출원 WO96/07734, WO96/26281, WO97/20051, WO98/07877, WO98/07865, WO98/40509, WO98/54346, WO00/15823, WO01/58940 및 WO01/92549 참조). 키메라 아데노바이러스 피복 단백질은 당업계에 공지된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 발생시킬 수 있다. 바람직하게, 키메라 아데노바이러스 피복 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 아데노바이러스 게놈 내에 위치하며, 야생형 아데노바이러스에서 피복 단백질의 발현을 조절하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 대안으로, 키메라 아데노바이러스 피복 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 아데노바이러스 게놈 내에 위치하며, 키메라 피복 단백질의 효과적인 발현을 위해 요구되는 유전적 요소를 포함하는 발현 카세트의 일부이다.
키메라 아데노바이러스 피복 단백질의 피복 단백질 부분은 비천연 아미노산 서열이 부착되는 완전한 길이의 아데노바이러스 피복 단백질일 수 있거나, 또는 예를 들면 내부로 또는 C- 및/또는 N-말단에서 절단될 수 있다. 그러나, 변형된(비천연 아미노산의 존재를 포함함) 키메라 피복 단백질은 아데노바이러스 캡시드에 포함될 수 있는 것이 바람직하다. 비천연 아미노산 서열이 섬유 단백질에 부착되면, 바이러스 단백질 또는 섬유 모노머 사이의 상호작용이 방해되는 것이 바람직하다. 따라서, 비천연 아미노산 서열은 그 자체가 올리고머화 도메인이 아닌 것이 바람직하며, 따라서 아데노바이러스 섬유의 삼량체화 도메인과 반대로 상호작용할 수 있다. 바람직하게, 비천연 아미노산 서열은 비리온 단백질에 첨가되며, 비천연 아미노산 서열을 최대로 노출시키기 위해서 물질, 세포 표면-수용체 또는 면역 세포(예를 들면, 기질과 접하는 잔기에 부착되고, 펩티드 스페이서(spacer) 상에 위치된 아데노바이러스 단백질의 N- 또는 C-말단 등)로의 노출을 용이하게 하는 것에 관한 방식으로 포함된다. 이상적으로, 비천연 아미노산 서열은 섬유 단백질의 C-말단에서 아데노바이러스 섬유 단백질에 포함되거나(스페이서를 통해 부착됨) 또는 섬유의 노출된 루프(예를 들어 HI 루프)에 포함되어 키메라 피복 단백질을 만든다. 비천연 아미노산 서열이 펜톤 베이스의 일부를 대체하거나 또는 이에 부착되면, 물질, 세포 표면 수용체 또는 면역 세포와의 접촉을 확실하게 하기 위해서 초가변 부위내에 있는 것이 바람직하다. 비천연 아미노산 서열이 헥손에 부착되면 초가변 부위내에 있는 것이 바람직하다[Crawford-Miksza et al ., J. Virol ., 70(3): 1836-44(1996)]. 비천연 아미노산이 pIX의 일부에 부착되거나 또는 이의 일부를 교체하면, pIX의 C-말단 내에 있는 것이 바람직하다. 아데노바이러스 입자 표면으로부터 떨어져서 비천연 아미노산 서열을 연장시키기 위한 스페이서 서열의 사용은 수용체와 결합에 더 이용될 수 있고, 비천연 아미노산 서열과 아데노바이러스 섬유 모노머 사이의 임의의 입체 상호작용을 감소시킬 수 있다.
다른 실시형태에서(예를 들면, 특정의 유전자 조작된 세포 타입 내에서의 정제 또는 증식을 용이하게 하기 위해), 비천연 아미노산(예를 들면, 리간드)는 세포-표면 단백질 이외의 화합물과 결합할 수 있다. 따라서, 상기 리간드는 혈액 및/또는 림프-유래(lymph-borne) 단백질(예를 들면, 알부민), 합성 펩티드 서열, 예컨대 폴리아미노산(예를 들면 폴리리신, 폴리히스티딘 등), 인공 펩티드 서열(예를 들면 FLAG) 및 RGD 펩티드 단편과 결합할 수 있다[Pasqualini et al ., J. Cell . Biol., 130: 1189(1995)]. 리간드는 심지어 비-펩티드 물질, 예컨대 가소성[예를 들면, Adey et al ., Gene , 156: 27(1995)], 비오틴[Saggio et al ., Biochem. J., 293: 613(1993)], DNA 서열[Cheng et al ., Gene , 171:1 (1996) 및 Krook et al ., Biochem . Biophys ., Res . Commun ., 204: 849(1994)], 스트렙타비딘[Geibel et al ., Biochemistry , 34: 15430(1995) 및 Katz, Biochemistry , 34: 15421(1995)], 니트로스트렙타비딘[Balass et al ., Anal . Biochem ., 243: 264(1996)], 헤파린[Wickham et al ., Nature Biotechnol ., 14: 1570-73(1996)] 및 기타 물질을 결합시킬 수 있다.
세포 표면 수용체에 대한 아데노바이러스 피복 단백질의 천연 결합의 파쇄는 또한 선천적 또는 수득된 숙주 면역 시스템과 덜 상호작용하도록 할 수 있다. 아데노바이러스 벡터 투여로 염증이 유발되고, 선천적 및 수득된 면역 메커니즘 둘 다를 활성화시킨다. 아데노바이러스 벡터는 벡터의 초기 투여 이후에 이식 유전자 발현의 지속을 제한하는 항원-특이적(예를 들면, T-세포 의존적) 면역 반응을 활성화시킨다. 또한, 아데노바이러스 벡터로의 노출로 아데노바이러스 벡터의 이후 투여로부터 유전자 발현을 불가능하게 할 수 있는 B 세포에 의해 중화 항체의 생성을 자극한다[Wilson & Kay, Nat . Med ., 3(9):887-889(1995)]. 실제로, 벡터의 반복된 투여 효율성은 숙주 면역으로 심각하게 제한될 수 있다. 체액성 면역성의 자극에 더해서, 세포-중재 면역 기능은 신체로부터 바이러스의 클리어런스(clearance)를 초래한다. 바이러스의 신속한 클리어런스는 선천적 면역 메커니즘에 의한 결과이며[예를 들어, Worgall et al ., Human Gene Therapy , 8: 37-44(1997) 참조], 간에서 발견되는 쿠퍼 세포와 관련이 있는 것으로 보인다. 따라서, 아데노바이러스 섬유 단백질 및 펜톤 베이스 단백질의 천연 결합의 제거에 의해서, 아데노바이러스 벡터의 면역 시스템 인식이 감소하여 숙주에 의한 벡터 내성이 증가한다.
아데노바이러스에 대한 이미 존재하는 숙주 면역을 피하는 방법은 아데노바이러스 피복 단백질을 변형시키는 단계를 포함하여 숙주 면역 시스템에 의해 감소된 인식을 나타낸다. 변형된 피복 단백질은 펜톤, 섬유 또는 헥손 단백질인 것이 바람직하다. 더 바람직하게, 변형된 피복 단백질은 헥손 단백질이다. 상기 피복 단백질은 임의의 적당한 방식으로 변형될 수 있지만, 피복 단백질의 다양성을 발생시켜 변형시키는 것이 바람직하다. 바람직하게, 이러한 피복 단백질 변이체는 이미 존재하는 숙주 아데노바이러스-특이적 중화 항체에 의해 인식되지 않는다. 다양성은 예를 들면, 지시된 진화[즉, 폴리뉴클레오티드 셔플링(polynucleotide shuffling)] 및 실수-유발 PCR[예를 들면, Cadwell, PCR Meth . Appl ., 2:28-33(1991), Leung et al ., Technique , 1: 11-15(1989) 및 Pritchard et al ., J. Theoretical Biol ., 234:497-509(2005) 참조]을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법을 사용하여 발생시킬 수 있다. 면역 회피는 또한 페길화(pegylation) 등을 포함한다.
아데노바이러스 피복 단백질은 또한 피복 단백질의 부위를 결실하고, 이를 또 다른 아데노바이러스 항원형의 피복 단백질로부터 상응하는 부위, 특히 인간에서 면역성이 적은 항원형으로 대체하여 이미 존재하는 숙주 면역성을 피하기 위해 변형될 수도 있다. 이러한 점에서, 섬유 단백질, 펜톤 베이스 단백질 및/또는 헥손 단백질 내의 아미노산 서열은 제거되고, 여러 아데노바이러스 항원형으로부터 상응하는 서열로 대체될 수 있다. 따라서, 예를 들면 섬유 단백질이 이미 존재하는 숙주 면역성을 피하기 위해 변형되는 경우, 시미안 아데노바이러스 섬유 단백질의 놉 부위로부터 아미노산 잔기를 결실하고, 여러 항원형, 예컨대 본 명세서에서 기재한 항원형들의 시미안 아데노바이러스로부터 상응하는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 마찬가지로, 펜톤 베이스 단백질이 변형되어 이미 존재하는 숙주 면역성을 회피할 때, 시미안 아데노바이러스 펜톤 베이스 단백질의 초가변성 부위 내의 아미노산 잔기를 결실하고, 여러 항원형, 예컨대 본 명세서에서 기재하는 항원형들의 시미안 아데노바이러스로부터 상응하는 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 바람직하게, 시미안 아데노바이러스 벡터의 헥손 단백질은 이러한 방식으로 변형되어 이미 존재하는 숙주 면역성을 피한다. 이러한 점에서, 헥손 단백질의 루프내에서 발생하는 초가변성 부위 중 하나 이상 내의 아미노산 잔기는 여러 항원형의 시미안 아데노바이러스로부터의 상응하는 아미노산 잔기로 대체된다. 전체 루프 부위는 헥손 단백질로부터 제거될 수 있으며, 또 다른 시미안 아데노바이러스 항원형의 상응하는 루프 부위로 대체될 수 있다. 대안으로 루프 부위의 일부는 시미안 아데노바이러스 벡터 헥손 단백질로부터 제거될 수 있으며, 또 다른 아데노바이러스 항원형(시미안 또는 인간)의 헥손 루프의 상응하는 일부분으로 대체될 수 있다. 시미안 아데노바이러스 벡터의 하나 이상의 헥손 루프 또는 이의 일부는 제거될 수 있으며, 임의의 다른 아데노바이러스 항원형(시미안 또는 인간), 예컨대 본 명세서에서 설명하는 것들로부터 상응하는 서열로 대체될 수 있다. 헥손 단백질의 변형 방법은 예를 들면 문헌[Rux et al ., J. Virol ., 77:9553-9566(2003)] 및 미국 특허 제6,127,525호에 기재되어 있다. 헥손 단백질의 초가변성 부위는 또한 랜덤 펩티드 서열 또는 질병-유발 병원성(예를 들면, HIV)로부터 유래된 펩티드 서열로 대체될 수 있다.
아데노바이러스 피복 단백질에 대한 변형은, 예를 들면 미국 특허 제5,543,328호; 제5,559,099호; 제5,712,136호; 제5,731,190호; 제5,756,086호; 제5,770,442호; 제5,846,782호; 제5,871,727호; 제5,885,808호; 제5,922,315호; 제5,962,311호; 제5,965,541호; 제6,057,155호; 제6,127,525호; 제6,153,435호; 제6,329,190호; 제6,455,314호; 제6,465,253호; 제6,576,456호; 제6,649,407호; 제6,740,525호; 및 제6,951,755호; 및 국제 특허 출원 WO96/07734, WO96/26281, WO97/20051, WO98/07865, WO98/07877, WO98/40509, WO98/54346, WO00/15823, WO01/58940 및 WO01/92549에 기재되어 있다.
원숭이 아데노바이러스는 또한 유전 물질을 세포에 운반하기 위해 사용될 수도 있다. 유전적 물질은 통상적으로 DNA이다. 원숭이 바이러스 게놈에 삽입되는 임의의 DNA는 본 명세서에서 이종 핵산 서열 또는 "hDNA"로 나타낸다. 상기 hDNA는 당업계에 공지되어 있는 다수의 기능을 가질 수 있다. 상기 hDNA는 제어 특성을 가질 수 있다. 더 일반적인 요소 중 일부는 두서너 가지 예만 들면 전사, 예컨대 프로모터, 인헨서, 전사 터미네이터, 스플라이싱 인자, 매트릭스 부착 조절 인자, 전사 인슐레이터 및 폴리아데닐화 서열을 조절한다. RNA가 상기 hDNA로부터 발생된다면 기능을 가질 수 있다. 이러한 기능 중 일부는 사실상 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스RNA, VA RNA로 나타내는 것과 같은 조절이다. 상기 RNA는 또한 폴리펩티드, 예컨대 단백질을 암호화할 수 있다. 단백질은 천연일 수 있고 또는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 RNA, 번역 및 단백질 안정성의 수준을 조절하는 많은 방법이 있다.
조절 RNAs 및 폴리펩티드가 가질 수 있는 많은 기능이 있다.
이종 핵산 서열은 바람직하게 병원체의 항원을 암호화한다. 상기 병원체는 바이러스, 예컨대 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 구제역(FMDV), 단순 포진 바이러스(HSV), C형 간염 바이러스(HCV), 에볼라 바이러스 또는 마르부르그 바이러스일 수 있다. 상기 병원체는 또한 기생충, 예를 들면 말라리아를 야기하는 플라스모디엄(Plasmodium) 기생충(예를 들면, 플라스모디엄 팔시파럼(Plasmodium falciparum))일 수 있다. 대안으로, 이종 핵산 서열은 예를 들면 애토날 상동 단백질(예를 들면, HATH1 또는 MATH1), TNF-α 또는 색소 상피성 인자(PEDF)를 암호화할 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 복제 가능(replication competent)일 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 아데노바이러스 게놈에서 돌연변이(예를 들면, 결실, 삽입 또는 치환)를 가질 수 있다. 그러나 바람직하게 아데노바이러스 벡터는 복제-결핍이다. "복제-결핍(replication-deficient)"이라는 것은 아데노바이러스 벡터가 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능이 없는 아데노바이러스 게놈을 포함한다(즉, 이에 따라서 아데노바이러스 벡터가 통상적인 숙주 세포, 특히 본 발명의 방법의 과정에서 아데노바이러스 벡터에 의해 감염될 수 있는 인간 환자의 것에서 복제할 수 없음). 본 명세서에서 사용하는 것과 같이 유전자, 유전자 기능, 또는 유전자 또는 게놈 부위에서의 결핍은 핵산 서열이 전체 또는 부분적으로 결실되는 유전자 기능을 손상시키거나 또는 없애기 위해 바이러스 게놈의 충분한 유전적 물질의 결핍으로서 규정한다. 유전적 물질의 결핍이 바람직한 반면에, 첨가 또는 치환에 의한 유전적 물질의 돌연변이는 또한 유전자 기능을 방해하기 위해 적당하다. 복제-필수 유전자 기능은 복제(예를 들면, 증식)에 필요하고, 예를 들면 아데노바이러스 초기 부위(예를 들면, E1, E2 및 E4 부위), 후기 부위(예를 들면, L1-L5 부위), 바이러스 패키징에 관련된 유전자(예를 들면, IVa2 유전자) 및 바이러스-관련 RNAs(예를 들면, VA-RNA1 및/또는 VA-RNA-2)에 의해 암호화되는 유전자 기능이다. 더 바람직하게, 복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈 중 하나 이상의 부위의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능에서의 아데노바이러스 게놈 결핍을 포함한다. 바람직하게, 아데노바이러스 벡터는 바이러스 복제에 필요한 아데노바이러스 게놈의 E1A 부위, E1B 부위 및 E4 부위의 적어도 하나의 기능에서의 결핍이다(E1-결핍 또는 E4-결핍 아데노바이러스 벡터를 의미함). E1 부위의 결핍에 더해서, 재조합 아데노바이러스는 또한 국제 특허 출원 WO00/00628에 기재된 것과 같이, 주요한 후기 프로모터(MLP)에서 돌연변이를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 비필수 E3 부위(예를 들면, E3 부위의 Xba I 결실)의 적어도 하나의 유전자 기능 및 E1 부위의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제-필수 유전자 기능)에서의 결핍이다(E1/E3-결핍 아데노바이러스 벡터를 의미함). E1 부위에 대하여 아데노바이러스 벡터는 E1B 부위의 모두 또는 일부 및 E1A 부위의 모두 또는 일부에서의 결핍일 수 있다. 이에 제한하지는 않지만 본 실시형태를 설명하기 위해서 항원형 35 아데노바이러스 벡터는 뉴클레오티드 570 내지 3484의 E1 결핍을 포함할 수 있다. 아데노바이러스 벡터가 단지 아데노바이러스 게놈의 하나의 부위에서의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능이라면(예를 들면, E1- 또는 E1/E3-결핍 아데노바이러스 벡터), 아데노바이러스 벡터는 "단일 복제-결핍(singly replication-deficient)"이라고 한다.
본 발명의 시미안 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 두 개 이상의 부위 각각에서 하나 이상의 복제-필수 유전자 기능에서 아데노바이러스 벡터가 결핍된 것을 의미하는 "다중 복제-결핍(multiply replication-deficient)"일 수 있다. 예를 들면, 상기에서 언급한 E1-결핍 또는 E1/E3-결핍 아데노바이러스 벡터는 E4 부위의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능에서의 추가 결핍(E1/E4- 또는 E1/E3/E4-결핍 아데노바이러스 벡터를 의미함)일 수 있거나/있는 E2 부위의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능에서의 추가 결핍(E1/E2- 또는 E1/E2/E3-결핍 아데노바이러스 벡터를 의미함)일 수 있으며, 바람직하게는 E2A 부위의 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능에서의 추가 결핍(E1/E2A- 또는 E1/E2A/E3-결핍 아데노바이러스 벡터를 의미함)일 수 있다.
예를 들면, 아데노바이러스 게놈의 E1, E3 및 E4 부위의 모두 또는 일부를 제거함으로써, 수득된 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 캡시드로 패키징되는 능력을 보유하면서 외인성 핵산 서열의 삽입물을 허용할 수 있다. 핵산 서열은 아데노바이러스 게놈의 E1 부위, E3 부위 또는 E4 부위에 위치할 수 있다. 실제로, 핵산 서열은 위치가 아데노바이러스 벡터의 패키징을 방해하거나 또는 핵산 서열의 발현을 방지하지 않는한 아데노바이러스 게놈의 어디든 삽입될 수 있다. 또한 아데노바이러스 벡터는 동일한 항원을 암호화하는 다수(즉, 두 개 이상)의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안으로, 아데노바이러스 벡터는 두 개 이상의 여러 항원을 암호화하는 다수의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 각 핵산 서열은 의사에 의해서 목적하는 발현에 따라서 다르게 동일한 프로모터 또는 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 아데노바이러스 게놈의 여러 부위 또는 아데노바이러스 게놈의 동일한 부위(예를 들면, E4 부위)에 삽입될 수 있다.
E1 및 E4 부위의 복제-필수 유전자 기능에서 특히 복제-결핍을 증가시키는 경우에 시미안 아데노바이러스 벡터는 단일 복제-결핍 아데노바이러스 벡터, 특히 E1-결핍 아데노바이러스 벡터에 의해 획득되는 것과 유사한 상보적인 세포 주에서 바이러스 성장을 제공하기 위한 간격 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 간격 서열은 목적하는 길이, 예컨대 적어도 약 15 염기쌍(예를 들면, 약 15 염기쌍 내지 약 12,000 염기쌍), 바람직하게는 약 100 염기쌍 내지 약 10,000 염기쌍, 더 바람직하게는 약 500 염기쌍 내지 약 8,000 염기쌍, 훨씬 더 바람직하게는 약 1,500 염기쌍 내지 약 6,000 염기쌍, 가장 바람직하게는 약 2,000 염기쌍 내지 약 3,000 염기쌍 길이인 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 서열들을 함유할 수 있다. 스페이서 요소 서열은 아데노바이러스 게놈에 대해서 코딩 또는 비-코딩 및 천연 또는 비천연일 수 있지만, 결핍 부위에 대해서 복제-필수 기능을 회복시키지는 못한다. 스페이서 요소는 아데노바이러스 게놈의 E4 부위에 위치하는 것이 바람직하다. 아데노바이러스 벡터에서의 간격의 사용은 미국 특허 제5,851,806호에 기재되어 있다.
적어도 E4-결핍 아데노바이러스 벡터는 생체내 제한된 시간 동안 높은 수준으로 이식 유전자를 발현시키며, 적어도 E4-결핍 아데노바이러스 벡터에서 이식 유전자의 발현 지속은 작용 전달 인자, 예컨대 그 중에서도 HSV ICP0, Ad pTP, CMV-IE2, CMV-IE86, HIV tat, HTLV-tax, HBV-X, AAV Rep 78, HSV ICP0와 같이 기능을 하는 U205 골육종 세포 주로부터의 세포 인자 또는 신경 성장 인자에 의해서 유도되는 PC12 세포에서의 세포 인자의 활성을 통해서 조절될 수 있는 것이 확인되었으며, 상기는 예를 들면, 미국 특허 제6,225,113호, 미국 특허 출원 2002/0031823 A1 및 국제 특허 출원 WO00/34496에 기재되어 있는 것과 같다. 상기를 고려하여, 다중 결핍 아데노바이러스 벡터(예를 들면, 적어도 E4-결핍 아데노바이러스 벡터) 또는 제2 발현 벡터는 바람직하게 핵산 서열의 발현 지속을 조정하는 작용 전달 인자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 항원 DNA의 지속 발현은 면역 내성을 발생시키는 경우에 요망될 수 있다.
시미안 아데노바이러스 벡터는 단지 아데노바이러스 게놈의 초기 부위, 단지 아데노바이러스 게놈의 후기 부위 및 아데노바이러스 게놈의 초기 및 후기 부위 둘 다의 복제-필수 유전자 기능에서 결핍될 수 있다. 시미안 아데노바이러스 벡터는 또한 적어도 바이러스 역 말단 반복부위(ITRs) 및 하나 이상의 프로모터 또는 바이러스 ITRs 및 패키징 신호가 무결함으로(즉, 아데노바이러스 앰플리콘) 남아 있는 것이 바람직한 경우, 시미안 아데노바이러스 벡터는 또한 제거된 전체 아데노바이러스 게놈을 필수적으로 가질 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 시미안 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 천연 핵산 서열이 없는 아데노바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 아데노바이러스 게놈의 복제 및 아데노바이러스 캡시드 단백질로의 패키징에 필요한 아데노바이러스 게놈 인자를 보유할 수 있다. 서열을 코딩하는 아데노바이러스 단백질이 부족한 최소의 아데노바이러스 벡터는 "헬퍼-의존적(helper-dependent)" 아데노바이러스 벡터라고 하며, 흔히 효과적인 증식을 위해 헬퍼 아데노바이러스에 의한 상보성이 요구된다. 다중 복제-결핍 아데노바이러스 벡터를 포함하는 적당한 복제-결핍 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 제5,837,511호; 제5,851,806호; 제5,994,106호; 제6,127,175호; 및 제6,482,616호; 미국 특허 출원 2001/0043922 A1, 2002/0004040 A1, 2002/0031831 A1 및 2002/0110545 A1, 및 국제 특허 출원 WO94/28152, WO95/02697, WO95/16772, WO95/34671, WO96/22378, WO97/12986, WO97/21826 및 WO03/022311에 기재되어 있다.
아데노바이러스 벡터가 복제-결핍이 아니라면, 이상적으로 아데노바이러스 벡터는 목표 조직내로 벡터의 복제를 제한하도록 조작된다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는 의사에 의해서 미리 결정된 조건하에서 복제되도록 만들어진 조건부-복제 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들면, 복제-필수 유전자 기능, 예를 들면 아데노바이러스 초기 부위에 의해서 암호화되는 유전자 기능은 유도가능하고, 억제할 수 있거나 또는 조직-특이적인 전사 제어 서열, 예를 들면 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 실시형태에서, 복제는 전사 제어 서열과 상호작용하는 특이적 인자의 존재 또는 부재가 필요하다. 자가 면역 질환 치료에서, 예를 들면, 림프절에서 아데노바이러스 벡터 복제를 제어하여 지속적인 항원 생산을 수득하고, 면역 세포 생성을 제어하는 것이 유리할 수 있다. 조건부-복제 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 제5,998,205호에 추가로 기재되어 있다.
원숭이 아데노바이러스에서 다량의 hDNA를 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 상기는 예를 들면 큰 제어 서열을 필요로 하거나, 다중 전사 유닛이 필요하거나, 또는 전사물이 큰 경우에 발생할 수 있다. 아데노바이러스의 패키징 크기의 상한선은 이의 야생형 게놈의 대략 105%이므로, 큰 게놈을 갖는 바이러스는 제조하기 어려우며, 흔히 불안정하다.
상기 패키징 및 안정성을 극복하기 위해서 제한 바이러스 DNA 서열을 결실하여 다량의 hDNA를 수용할 수 있다. 바이러스로부터 제거될 수 있으며, 감염성 바이러스 입자를 여전히 발생시킬 수 있는 적어도 세 개의 바이러스 부위(즉, E1, E3 및 E4 부위)가 있다. 이러한 바이러스 부위 각각은 다중 전사물 및 단백질을 위해 암호화하는 폴리아데닐화 신호 및 적어도 하나의 프로모터로 구성된다. 이러한 부위의 모두 또는 일부는 바이러스 게놈에서 결실될 수 있다. hDNA는 이러한 부위 중 각각을 교체하기 위해 삽입 또는 사용된다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 부위는 E1, E3 및 E4 변형 바이러스를 수득하기 위해서 한 번에 하나 또는 결합해서 변형될 수 있다. 상기는 추가로 유연성을 확대시키고, 이에 따라서 원숭이 바이러스의 이용성을 확대시킨다.
바이러스로부터 E1, E3 및 E4 부위의 제거는 원숭이 아데노바이러스의 사용에 추가의 이점을 갖는다. 이러한 부위는 추가의 바이러스 단백질의 발현을 자극하거나 또는 직접적으로 숙수 세포를 변경할 수 있는 다중 제어 단백질을 암호화하기 위한 것으로 공지되어 있다. 특히 상기 E1 및 E4 부위는 종양 유전자를 암호화하는 것으로 공지되어 있다. 여러 응용에서, 상기 바이러스의 유전자가 발현되지 않는 것이 바람직하다. 적은 바이러스 유전자 발현의 이점 중 몇몇은 투여될 수 있는 증가된 바이러스 투여량 및 동물로의 바이러스를 투여하는 경우의 면역 감시의 회피, 즉 유전자 발현과 같은 추가된 hDNA로부터의 개선된 활성이다. hDNA 유전자 제어를 개선시키고 투여량을 증가시키는 능력은 응용 범위를 넒혀 원숭이 바이러스의 이용성을 증가시킨다. 따라서, 바이러스 DNA의 결실로 바이러스가 수용될 수 있고, 바이러스로부터 해로운 서열을 제거할 수 있는 hDNA의 양을 증가시켜 바이러스의 이용성을 증가시킬 것이다.
본 명세서에서 기재하는 기술은 결실된 원숭이 아데노바이러스의 구성을 지지한다. 상기에서 언급한 것과 같이, 아데노바이러스 E1 부위는 제어 단백질을 위해 암호화한다. E1 기능의 부재시에 아데노바이러스는 복제 결핍성이다(또한, "복제-결핍"이라고도 함). 하기의 실시예에서는 E-결실 원숭이 아데노바이러스의 복제 결핍의 완전한 상보성은 인간 아데노바이러스 E1 및 E4ORF6으로 획득된다고 설명하고 있다(실시예 3 참조). 따라서, 원숭이 세포 상에서의 원숭이 아데노바이러스의 성장에 필수적인 이러한 부위는 인간 세포 주-인간 아데노바이러스 시스템에서 성장에 있어서는 비-필수적이다(실시예 3). E3 부위에 의해 암호화되는 단백질은 바이러스 성장에 불필요하다. E3 결실의 아데노바이러스는 E1 및 E4 결실의 바이러스에서도 용이하게 생성된다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 놀랍게도, 다수의 공지된 E4 단백질 중 인간 세포(ORF6)에 대한 원숭이 아데노바이러스의 넓어진 숙주 범위를 초래하는 하나는 또한 E4 결실 아데노바이러스를 상보적으로 성장시킬 수도 있다. 동일한 군 C 항원형으로부터의 E1 및 E4 둘 다의 발현은 E1-, E3-, E4-결실의 비-종 C 아데노바이러스의 성장을 지지하는 것으로 나타났다[Tatsis et al ., Gene Ther ., 13(5): 421-9(2006)].
원숭이 아데노바이러스로부터 유래된 아데노바이러스 벡터는 하기의 응용에 유용하다: (1) 감염성 질환 표시를 위한 백신 벡터, (2) 항암 응용을 위한 백신 벡터, (3) 급성 및 만성 질환 조정을 위한 치료적 단백질을 암호화하는 이식 유전자의 전달.
원숭이 아데노바이러스 벡터는 포유류에서 면역 반응을 유도(백신 접종)하기 위해 사용될 수 있다. 이에 대해서, 인간 아데노바이러스의 광범위한 사용은 벡터의 면역원성에 의해 적어도 일부분이 저지된다. 다수의 미국 집단은 야생형 인간 아데노바이러스에 노출되며, 인간 아데노바이러스-계 유전자 전달 벡터에 대해 이미 존재하는 면역성이 발달되었다. 결과로서, 인간 아데노바이러스 벡터는 이미 존재하는 숙주 면역 반응에 의해서 불활성화되어 벡터의 효율성을 감소시킨다. 신체에서의 아데노바이러스 벡터의 청소 및/또는 중화 반응은 DNA 백신으로서의 이러한 벡터의 사용을 복잡하게 만든다. DNA 백신은 숙주 세포로 항원-암호화 DNA를 전하기 위해 유전자 전달 백터를 이용한다. 생체내 항원성 단백질을 생성함으로써, 면역 시스템의 체액 및 세포-중재 암(arm)을 활성화시켜 외래 단백질을 신체에 주입시키는 전통적인 백신과 비교해서 항원에 대항하는 더 완벽한 면역 반응을 발생시킨다. 유전자 운반 비히클로서 인간 아데노바이러스 벡터의 유리한 특성에도 불구하고, 벡터의 면역원성은 병원체에 대항하는 면역 시스템을 "부스팅(boosting)"하기 위해 유리할 수 있는 효과적인 반복 투여를 방지하며, 결과적으로 숙주 세포에 그것의 페이로드(payload)를 전달하는 소 분획 용량의 아데노바이러스 벡터를 초래한다.
원숭이 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스에 대해 이미 존재하는 면역성에 의해 중재되는 중화반응 및/또는 클리어런스를 받지 않을 것이다. 또한, 두 개 이상의 원숭이 아데노바이러스 벡터의 결합으로 인간 아데노바이러스 벡터의 반복된 투여에 의해 나타나는 억제를 피할 것이며; 이에 따라 병원체에 대항하는 면역 시스템을 부스팅할 가능성이 있을 것이다. 따라서, 원숭이 아데노바이러스 벡터는 이들의 결점이 없는 인간 아데노바이러스 벡터의 동일한 이점을 제공한다.
본 발명의 아데노바이러스의 하나의 실시형태는 면역 반응을 유도하기 위해 포유류에서 발현되는 항원을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. "항원"은 포유류에서 면역 반응을 촉발시키는 분자이다. "면역 반응"은 예를 들면 면역 효능 세포의 활성화 및/또는 항체 생성을 수반할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 항원은 보호 면역성을 유도하는 것이 바람직한 포유류에서 면역 반응을 이상적으로 유발하는 바이러스, 박테리아, 기생충, 곰팡이, 원생동물, 프리온, 세포 또는 세포외 유래의 펩티드 또는 단백질을 포함하는 임의의 단백질성 분자의 임의의 서브유닛을 포함할 수 있다. 또한 항원은 자기-항원, 즉 신체가 외래 침략자(foreign invader)로서 실수로 인식하는 자가 조직의 단백질일 수도 있다.
하나의 실시형태에서, 상기 항원은 바이러스 항원이다. 상기 바이러스 항원은, 이에 제한되지는 않지만, 하기의 바이러스 과 중 임의의 것으로부터의 바이러스를 포함하는 임의의 바이러스로부터 분리될 수 있다: 아레나바이러스과( Arenaviridae), 아테리바이러스( Arterivirus), 아스트로바이러스과( Astroviridae), 바큘로 바이러스과( Baculoviridae), 바드나바이러스(Badnavirus), 바르나바이러스과(Barnaviridae), 비르나바이러스과(Birnaviridae), 브로모바이러스과(Bromoviridae), 부니아바이러스과(Bunyaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 캐필로바이러스(Capillovirus), 카라바이러스(Carlavirus), 칼리모바이러스(Caulimovirus), 서코바이러스과(Circoviridae), 클로스테로바이러스(Closterovirus), 코모바이러스과(Comoviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae)[예를 들면, 코로나바이러스, 예컨대 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스], 코르티코바이러스과(Corticoviridae), 시스토바이러스과(Cystoviridae), 델타바이러스(Deltavirus), 디안토바이러스(Dianthovirus), 에나모바이러스(Enamovirus), 필로바이러스과(Filoviridae)[예를 들면, 마르부르그 바이러스 및 에볼라 바이러스(예를 들면, 자이르(Zaire), 레스턴(Reston), 아이보리 코스트(Ivory Coast) 또는 수단(Sudan) 바이러스주)], 플라바이러스과(Flavirididae)(예를 들면, C형 간염 바이러스, 뎅그 바이러스 1, 뎅그 바이러스 2, 뎅그 바이러스 3 및 뎅그 바이러스 4), 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae)(예를 들면, B형 간염 바이러스), 허피스바이러스과(Herpesviridae)(예를 들면, 인간 헤르페스 바이러스 1, 2, 3, 4, 5 및 6, 및 사이토메갈로바이러스), 하이포바이러스과(Hypoviridae), 이리도바이러스과(Iridoviridae), 레비바이러스과(Leviviridae ), 리포트릭스바이러스과(Lipothrixviridae), 마이크로바이러스과(Microviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)(예를 들면, 인플루엔자바이러스 A 및 B), 파포바바이러스(Papovaviridae), 파라믹소바이러스과( Paramyxoviridae)(예를 들면, 홍역, 유행성 이하선염 및 인간 호흡기 세포 융합 바이러스), 파르보바이러스과(Parvoviridae), 피코르나바이러스과(Picornaviridae)(예를 들면, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 헤파토바이러스 및 아프토바이러스), 폭스바이러스과(Poxviridae)(예를 들면, 백시니아 바이러스), 레오바이러스과(Reoviridae)(예를 들면, 로타바이러스), 레트로바이러스과(Retroviridae)[예를 들면, 렌티바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1 및 HIV 2], 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 및 토티바이러스과(Totiviridae). 하나의 실시형태에서, 본 발명의 방법의 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원이다. 상기 항원은 예를 들면 RSV 바이러스주 A 또는 바이러스주 B 항원, 예컨대 F, G, M, M1, M2, SH 또는 NS1 또는 NS2 단백질 모두 또는 일부, 또는 이러한 단백질 중 하나 이상 중 모두 또는 일부의 융합일 수 있다. 또한 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화되는 항원은 레트로바이러스 항원일 수도 있다. 상기 레트로바이러스 항원은 예를 들면 HIV 항원, 예컨대 gag, env 또는 pol 단백질 모두 또는 일부일 수 있다. HIV의 임의의 클레이드는 클레이드 A, B, C, MN 등을 포함하는 항원 선택용으로 적당하다. 몇몇 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화되는 적어도 하나의 항원은 단순 포진 바이러스 2(HSV-2) 항원이다. 본 발명의 방법에 있어서의 적당한 SARS 바이러스 항원은 예를 들면 UL19, UL47 또는 gD 단백질 모두 또는 일부를 포함한다. 본 명세서에서 특이적으로 인용되는 항원 펩티드는 단지 임의의 바이러스 단백질이 본 발명의 맥락에 사용될 수 있는 것과 같이 예시적인 것이다.
또한 항원은 기생충 항원, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 포자충 항원일 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열은 플라스모디엄(Plasmodium) 항원, 예컨대 포자소체막 단백질, 포자소체 표면 단백질, 간 단계 항원, 꼭지면 세포막 관련 단백질 또는 분열소체 표면 단백질을 암호화할 수 있다.
대안으로 또는 추가적으로, 아데노바이러스 벡터에 의해서 암호화되는 적어도 하나의 항원은 박테리아 항원이다. 상기 항원은 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함하는 임의의 박테리아로부터 유래될 수 있다: 악티노마이세스( Actinomyces), 아나베나(Anabaena), 바실러스(Bacillus), 박테로이드(Bacteroides), 델로비브리오(Bdellovibrio), 카울로박터(Caulobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클로로비움(Chlorobium), 크로마티움( Chromatium ㅍ, 클로스트리듐( Clostridium), 사이토파가(Cytophaga), 다이노코쿠스(Deinococcus), 에스케리키아(Escherichia), 할로박테리움(Halobacterium), 헬리오박터(Heliobacter), 히포미크로븀(Hyphomicrobium), 메타노박테리움(Methanobacterium), 마이크로코쿠스(Micrococcus ), 마이오박테리움(Myobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 믹소코쿠스(Myxococcus), 나이세리아(Neisseria), 니트로박터(Nitrobacter), 오실라토리아(Oscillatoria), 프로클로론(Prochloron), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 포도스피릴룸(Phodospirillum), 리케치아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스피릴룸(Spirillum), 스피로헤타(Spirochaeta), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 설폴로버스(Sulfolobus), 테르모플라스마(Thermoplasma), 티오바실러스( Thiobacillus) 및 트레포네마(Treponema). 하나의 실시형태에서, 핵산 서열에 의해 암호화되는 적어도 하나의 항원은 슈도모나스(Pseudomonas) 항원 또는 헬리코박터(Heliobacter) 항원이다.
완전 및 무결함 바이러스 또는 박테리아 단백질은 면역 반응을 생성하기 위해 필요하지 않다는 것이 명백할 것이다. 실제로, 대부분의 항원 에피톱은 비교적 크기가 작고, 이에 따라서 단백질 단편이 포유류의 면역 시스템에 노출되는데 충분할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 하나 이상의 항원의 두 개 이상의 항원 에피톱 사이에서 발생할 수 있다. 예를 들면, HIV gp 120 또는 gp 160 모두 또는 일부는 HIV pol 단백질 모두 또는 일부에 융합되어 단일 에피톱에 의해 발생되는 것과 비교해서 HIV 병원체에 대항하는 더욱 완벽한 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 포유류에 대한 아데노바이러스 벡터에 의한 융합 단백질의 운반은 다중 항원에 대한 면역 반응의 노출을 허용하며, 이에 따라서 단일 백신 조성물이 다중 병원체에 대항하는 면역성을 제공할 수 있도록 한다.
항원을 암호화하는 것을 포함하는 핵산 서열은 핵산 서열의 타입 또는 임의의 특정 기원으로 제한되지 않는다. 상기 핵산 서열은 재조합 DNA가 될 수 있으며, 게놈 DNA도 될 수 있고, 잠재적인 항원 에피톱의 DNA 라이브러리로부터 수득될 수 있거나 또는 합성적으로 발생될 수 있다. 상기 핵산 서열은 암호화된 항원의 생성 및 핵산 서열의 효과적인 발현을 위해 필요한 유전적 인자를 추가적으로 포함하는 발현 카세트의 일부로서 존재할 수 있다. 이상적으로, 항원-암호화 핵산 서열은 실시가능하게 본 명세서에서 기재하는 것과 같이 폴리아데닐화 서열 및 프로모터에 연결된다. 프로모터는 항원(들)의 발현 수준 및 목적하는 패턴과 활성의 특정 패턴을 매칭시켜 본 발명의 방법에 사용하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는 다른 항원을 암호화하는 두 개 이상의 핵산 서열을 포함하며, 별개의 발현 프로파일을 표시하는 다른 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 첫 번째 프로모터는 항원 생성의 초기 피크를 조정하기 위해 선택되어 암호화된 항원에 대항하는 면역 시스템을 프라이밍한다. 두 번째 프로모터는 동일하거나 또는 상이한 항원의 생성을 위해 선택되어 첫 번째 프로모터의 며칠 후에 발현이 피크를 이루어 항원에 대한 면역 시스템을 "부스팅"시킨다. 대안으로, 혼성 프로모터는 다수의 프로모터의 원하는 측면과 조합하여 제작될 수 있다. 예를 들면, RSV 프로모터의 높은 활성 유지 수준과 활성의 CMV 프로모터의 초기 러시를 조합하는 CMV-RSV 혼성 프로모터는 특히 본 발명의 많은 실시형태에서 사용에 대해 바람직하다. 이러한 항원이 진핵 세포에 대해 독성이 있을 수 있는 경우 아데노바이러스 벡터를 증식시키기 위해 사용되는 상보적 세포 주에서 활성을 감소시키도록 프로모터를 변형시키는 것이 유리할 수 있다.
하기의 실시예는 추가로 본 발명을 설명하지만, 물론 이의 범주를 제한하는 임의의 방법으로서 이해되어서는 안 된다.
실시예 1
본 실시예는 원숭이 아데노바이러스 플라크 형성이 인간 아데노바이러스 구성요소 E1 및 E4ORF6을 발현시키는 인산 세포 주 상에서 매우 효율적이라는 것을 설명한다.
원숭이 아데노바이러스는 인간 세포 상에서 복제로부터 제한되며, 인간 아데노바이러스 인자는 이러한 제한을 극복한다. 본 명세서에서 설명하고 있는 것과 같이, 본 발명은 두 가지의 예상치 못한 결과를 갖는다: 완전한 E4 부위를 함유하는 것 이상으로 인간 세포 상에서 원숭이 아데노바이러스의 개선된 성장, 및 이들의 성장에 있어서 재조합된 이들의 천연 숙주 세포 주와 비교해서 인간 세포 상에서 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는데 우월함. 두 가지 방법론이 성장을 규정하기 위해 사용되었다. 플라크 형성 방법은 매우 낮은 감염다중도(multiplicity of infection : MOI) 조건 하에서 성장을 결정하기 위해 사용하였으며, 하나 이상의 감염 사이클이 긍정적인 결과, 즉 세포 단층에서의 플라크를 발생시키기 위해 필요하다. 따라서, 플라크 형성 방법은 진정으로 바이러스의 지속적인 성장을 설명한다: 단일 감염 바이러스 입자는 단일 세포를 감염시키며, 바이러스 생명 주기가 충분하게 완성되고, 뒤이어 바이러스 자손에 의한 이웃 세포의 감염이 이루어지는 것 등. 두 번째 방법은 바이러스 복제 단판으로부터 생성되는 감염성 바이러스 자손의 수를 평가한다. 이러한 방법은 단일 방출량 성장 평가로 알려진 단층에서의 필수적인 모든 세포의 동시 발생 감염이 기준이다.
모든 E4 인자 중에서 ORF6이 인간 세포 상에서의 원숭이 아데노바이러스의 증식에 충분하다는 것을 본 명세서에서 설명한다. 예상외로 인간 세포 주는 바이러스 성장을 평가하는 표준 방법, 즉 플라크 형성에 대한 원숭이 아데노바이러스의 능력을 지지하는 것에 있어서 원숭이 세포 주보다 뛰어나다. 각각 레서스(Rhesus) 및 버빗(Vervet) 원숭이로부터 각각 분리된 원숭이 아데노바이러스, SV-11 및 SV-38은 293-ORF6, BSC-1, LLC-MK2(MK2), Vero 및 CV-1 세포 상에 플라크를 형성하였다. 293-ORF6외의 세포 주는 원숭이에서 유래한다. BSC-1 및 MK-2는 이의 위에서 바이러스를 증식시키기 위해서 미국 미생물 보존 센터(ATCC)에서 추천되는 세포 주이다. 바이러스 둘 다의 단계 희석법은 사용하여 60 mm 배양 접시에 80% 융합되는 각 세포 주를 감염시킨다. 감염 조건은 매 15분 마다 진동시키면서 1 시간 동안 바이러스 500 ㎕이다. 이후에 바이러스를 제거하고, 세포에는 EMEM + 2% FBS 및 0.9% 아가로스로 오버레이시켰다. 14일 후 플라크를 카운팅하였다. 293-ORF6 세포는 시험한 다른 세포 주 중 임의의 것보다 적어도 10배 더 나은 가장 높은 플라크형성 효율을 나타냈다(표 1). 이전에 인간 아데노바이러스 2로부터의 전체 E4 부위를 함유하는 인간 세포 상에서의 플라크형성된 원숭이 바이러스는 CV-1 세포와 비교해서 플라크 형성 효율성이 40배 낮다는 것이 보고되었다. 본 발명에서는 플라크 형성능에 의해 측정된 것과 같이 성장이 명백하게 400배 개선되었다. 본 명세서에서 설명하는 것과 같이, 본 발명은 두 개의 예상치 못한 결과를 가져왔다: 전체 E4 부위를 함유하는 것에 비해서 인간 세포 상에서의 원숭이 아데노바이러스의 개선된 성장 및 이들의 성장에 대해서 추전된 이들의 천연 숙주 세포 주와 비교해서 인산 세포 상에서 원숭이 아데노바이러스를 증식시키는데 우월함.
세포 주 바이러스 역가( PFU * / ㎖ )
BS-C-1 SV-11 1.67 × 108
CV-1 SV-11 2.89 × 107
LLC-MK2 SV-11 2.54 × 107
Vero SV-11 1.94 × 108
293-ORF6 SV-11 6.36 × 109
BSC-1 SV-38 1.27 × 107
CV-1 SV-38 4.09 × 106
LLC-MK2 SV-38 1.0 × 107
Vero SV-38 6.66 × 106
293-ORF6 SV-38 2.26 × 108
* 플라크 형성 유닛
실시예 2
본 실시예에서는 인간 아데노바이러스 종 C 인자가 있는 인간 세포 상에서의 원숭이 아데노바이러스 자손의 높은 역가를 발생시킨 것을 설명한다.
인간 아데노바이러스 E1 및 E4 Orf6의 결합이 인간 세포에서 원숭이 아데노바이러스 복제에 대한 제한 차단을 극복하기 위해 충분한지의 여부를 결정하기 위해 단일 방출량 성장 실험을 실행하였다. Ad5 인자(A549), Ad5 E4ORF6(A549+Ad5 E4ORF6), Ad5 E1(293) 또는 Ad5 E1 및 E4ORF6(293-ORF6)를 발현시키지 않는 인간 세포를 웰 당 1.5 × 106으로 6-웰 플레이트에 세 차례 플레이팅하였다. 원숭이 아데노바이러스 복제를 허용하는 아프리카 녹색 원숭이에서 유래된 BSC-1 세포를 웰 당 1 × 105 세포로 플레이팅하였다. 모든 세포는 10% FCS가 있는 DMEM에 유지하고, 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 다음 날 세포에 2 시간 동안 웰 당 300 ㎕로 3(도 2a) 또는 1(도 2b) 포커스 형성 단위(FFU)/세포의 MOI에서 CsCl2 구배-정제 원숭이 아데노바이러스 스톡으로 감염시킨 후에 흡입 및 5% FCS 및 100 uM ZnCl2가 있는 DMEM 3㎖로 오버레이하여 A549+Ad5 E4ORF6 및 293-ORF6 세포에서 E4ORF6 발현 유도를 허용하였다. 다음에 세포를 배양하고, 72 시간 감염 후에 수집하였다. 바이러스 입자를 드라이 아이스 및 37℃ 수조로의 노출을 교대로 하는 것으로 구성된 3회 냉동-해동 사이클에 의해서 세포로부터 방출시켰다. 바이러스-세포 용해물에서의 자손 비리온의 수는 문헌[Vaccine , 25: 2074-2084(2007)]에 기재된 FFU 분석을 사용하여 평가하였다.
인간 세포 주 상에서의 원숭이 아데노바이러스에 의한 감염성 자손의 발생은 Ad5 E4 ORF6을 발현시키는 A549 세포 및 A549와 비교해서, 293-ORF6 세포가 가장 높았다(도 2a). 유사하게, MOI 1에서의 바이러스 자손의 발생이 원숭이 세포 주 BSC-1에서와 같이 293-ORF6 세포 상에서 적어도 효과적이었다(도 2b). 몇몇 경우에 10 내지 1,000배 이상의 바이러스 자손이 BSC-1 세포와 비교해서 293-ORF6 세포로부터 생성되었다. 대조적으로, 293 세포 상에서의 원숭이 아데노바이러스 복제는 BSC-1 세포에서보다 덜 효과적이었다. 따라서, E1 및 E4ORF6의 존재로 인간 세포에서의 숙주 복제 차단이 극복되었다. 상기는 추가로 293-ORF6 세포 상에서 자라는 경우 정제 후에 세포 당 90,090 입자가 수득되는 SV-1으로도 입증되었다. 최종적으로, 293-ORF6 세포 상에서의 감염성 자손의 발생은 BSC-1 세포 상에서보다 1,000배까지 높았으며, 이는 E1 및 E4ORF6을 발현시키는 인간 세포 상에서의 원숭이 아데노바이러스 성장은 원숭이 아데노바이러스 성장에 있어서 추천되는 천연 숙주 세포 주 상에서보다 현저하게 높았다.
종합하면, 원숭이 아데노바이러스의 플라크 형성 효율성 및 단일 방출량 성장 분석은 원숭이 아데노바이러스가 293-ORF6 세포에서 효과적으로 복제되며, 인간 아데노바이러스 구성요소(Ad5 E1 및 E4ORF6)의 결합된 발현으로 인간 복제 차단이 극복된다는 것을 설명한다. 또한, 상기는 군 중에서 유효한 대표인 8개의 원숭이 아데노바이러스로도 증명되었다.
실시예 3
본 실시예는 인간 아데노바이러스 구성요소을 갖는 인산 세포에서 E1이 결실된 원숭이 아데노바이러스 벡터의 증식 및 제작을 설명한다.
3개의 상이한 종(버빗(Vervet), 사이노몰거스(Cynomolgus) 및 레서스 원숭이(Rhesus macaque))으로부터의 7개의 상이한 원숭이 아데노바이러스는 발현 카세트로 교체된 이들의 E1 부위를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 원숭이 아데노바이러스는 ATCC로부터 수득된 SV-1, SV-7, SV-11, SV-16, SV-18, SV-38 및 SV-39이다. 왼쪽 ITR 내지 E1a 프로모터의 클로닝을 용이하게 하기 위해서, 야생형 바이러스의 오른쪽 ITR 바로 옆의 서열 및 pIX 프로모터 부위를 결정하였다. EI 결실은 E1a 프로모터 및 E1 단백질을 불활성시키지만, pIX 바이러스 프로모터, 바이러스 패키징 신호 및 복제 원점을 보유하도록 설계하였다. 이러한 서열의 확인은 공지된 아데노바이러스 게놈에 대한 이들의 상동성에 의해서 결정하였고, 공공연하게 이용가능한 소프트웨어, 예를 들면 미국 국립생물공학 정보센터 및 전문 단백질 분석 시스템인 버클리 초파리 게놈 프로젝트에서 확인된 것을 사용하여 확인할 수 있다. 일반적으로, E1 결실은 E1a 프로모터 TATA 박스의 50 염기쌍(bp) 5' 내에서 시작되어, pIX 프로모터의 50 내지 300 bp 5'에서 종결된다. 이는 단지 결실이 이루어질 수 있는 장소의 예이며, 이러한 결실은 바이러스 벡터의 응용에 따라 다르게 변경될 수 있기 때문이다. 예를 들면, SV-38 유래 벡터에 있어서의 E1 결실은 아데노바이러스 벡터를 제작하기 위해서 E1a 프로모터의 완벽한 제거가 필요하지 않다는 것을 설명하는 대부분의 E1a 프로모터를 보유한다.
이러한 바이러스를 구성하는 여러 방법이 있지만, 필수적으로 두 단계를 수반한다. 원하는 바이러스 벡터 게놈은 박테리아에서 발생된 이후에 293-ORF6 세포로 상기 게놈을 트랜스펙션하여 바이러스 입자를 만든다.
박테리아에서 바이러스 벡터 게놈을 제작하기 위한 일반적인 절차는 도 3에 개략적으로 나타냈으며, 이를 조금 변화시킬 수 있다. 당업계에 공지된 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여, 셔틀 플라즈미드를 바이러스 ITR(반점 박스), 패키징 신호(Ψ), E1 부위를 교체하는 발현 카세트 및 바이러스 오른쪽 ITR이 뒤따르는 pIX 프로모터를 포함하도록 제작한다. 본 실시예에서 발현 카세트는 CMV 프로모터(화살표), 열린 해독 틀(orf) 및 SV40 폴리아데닐화 신호(SV)로 구성된다. 발현 카세트의 배향 및 조성은 예시적인 것이며, 이에 제한되지는 않는다. 상기 플라즈미드는 다른 복제 원점이 또한 사용할 수 있지만, 낮은 복제 수의 박테리아 복제 원점, 예컨대 p15를 함유하는 것이 바람직하다. 카나마이신과 같은 항생물질에 대한 저항성(Kan r)을 제공하는 유전자의 포함은 플라즈미드를 은닉한 박테리아에 대한 선택에 유용하다. 아데노바이러스 벡터 게놈을 구성하기 위해서, pIX에서 오른쪽 ITR까지의 바이러스 게놈의 나머지를 상동 제조합에 의해서 셔틀 플라즈미드로 클로닝한다. 이것을 달성하기 위해서, 재조합 가능 박테리아, 예컨대 BJ5183을 pIX와 오른쪽 ITR 사이의 엔도뉴클레아제로 제한된 셔틀 플라즈미드의 ~50 ng와 정제된 바이러스 게놈의 100 ng으로 형질전환시킨다. 재조합에 있어서의 셔틀 플라즈미드의 pIX와 오른쪽 ITR 사이 및 바이러스 게놈(X) 각각의 상동성 중 적어도 50 bp를 갖는 것이 바람직하다. 제한 분해, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 DNA 시퀀싱을 포함하는, 클로닝된 아데노바이러스 벡터 게놈으로 박테리아를 확인하기 위한 당업계에 공지된 다수의 방법이 있다. 예를 들면 바이러스 헥손 유전자의 시퀀싱은 아데노바이러스의 동일성을 추가로 확인하기 위해서 사용될 수 있다. 하기의 헥손 서열에 대한 상동성은 아데노바이러스 및 이들의 유도체의 동일성을 추가로 확인하기 위해서 사용되었다: SV-1(서열 번호: 22); SV-7(서열 번호: 23); SV-11(서열 번호: 24); SV-16(서열 번호: 25); SV-18(서열 번호: 26); SV-38(서열 번호: 27); SV-39(서열 번호: 28). 바이러스 벡터 게놈이 확인되면, 플라즈미드를 사용해서 RecA - 박테리아 균주, 예컨대 플라즈미드가 증폭 및 정제되는 DH10B를 형질전환시킨다.
다음에, 두 번째 단계, 즉 게놈 플라즈미드로부터 감염성 바이러스의 전환(구제)은 하기와 같이 실행하였다. 게놈 플라즈미드를 제한 효소로 분해하여 플라즈미드 백본으로부터 ITRs 둘 다를 방출하고, 페놀:클로로포름:아이소아밀 알콜 추출 및 에탄올 침전으로 정제하며, pH 8.0의 10 mM Tris 및 1 mM EDTA에 현탁한다. 다음에 60 mm 플레이트 당 ~1.5 × 106 세포, 즉 293-ORF6 세포 주를 폴리펙트 시약(Qiagen)으로 분해된 플라즈미드 5 ug으로 트랜스펙션하였다. 감염 5일 후에, 세포를 수확하고, 3회 냉동-해동 사이클 다음에 세포 용해물을 신선한 세포로 계대 배양하였다. 세포-바이러스 용해물을 완전한 세포변성 효과(cytopathic effect : c.p.e.)가 관찰될 때까지 3일 내지 5일 간격으로 상기 방식을 사용해서 연속적으로 계대 배양하였다. 정제된 아데노바이러스 스톡을 문헌[Gall JG, et al ., Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes. Mol Biotechnol . 35(3):263-73(2007), PubMed PMID: 17652790]에 기재된 것과 같이 감염된 세포로부터 발생시켰다. 요약하면, 감염된 세포를 수집하고, 배양 배지를 폐기하였다. 세포는 3회의 냉동-해동 사이클로 25 mM Tris pH 7.5, 75 mM NaCl, 5 mM MgCl2 완충액 중에 용해하고, 상온에서 밤새 100 유닛/㎖로 Benzonase(상표명)으로 처리하였다. 세슘 클로라이드 등밀도 구배 원심분리를 실행하고, 총 입자 유닛 역가를 하기에 기재된 것과 같이 260 nm에서 흡광도에 의해 결정하였다[Mittereder, N., et al ., Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol . 70:7498-7509(1996)]. 활성 입자 역가는 하기에서 기재된 것과 같이 Ad2 헥손 항체로 형광 포커스 유닛(FFU) 분석으로 결정하였다[Gall JG, et al ., Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes. Mol Biotechnol . 35(3): 263-73(2007), PubMed PMID: 17652790.; 및 Lemiale F, et al ., Novel adenovirus vaccine vectors based on the enteric-tropic serotype 41. Vaccine 25(11): 2074-84(2007), Epub 2006 Nov 28. PubMed PMID: 17250935, PubMed Central PMCID: PMC2584667]. 바이러스 제제는 49 +/- 23(n=6)의 감염성 입자에 대한 총 입자의 평균 비율을 갖는 높은 품질이며, 정제 후 세포 당 37,000 입자까지의 높은 수율을 갖는다. 각 바이러스의 동일성은 부분적 DNA 시퀀싱 및 진단 PCR에 의해 확인하였다. 발현 카세트의 기능성은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.
도 3 및 본 명세서에서 기재하는 구제 셔틀 플라즈미드를 제작하기 위해 사용되는 바이러스 서열의 동일성은 하기에 나타낸다. 모든 서열은 표준 바이러스 게놈의 왼쪽에서 오른쪽 배향으로 나타냈다. 표준 바이러스 게놈에서 E1 부위는 바이러스 게놈의 왼쪽 끝에 있다. 왼쪽 ITR, 패키징 신호를 포함하지만 완벽한 E1a 프로모터는 전혀 없는 서열을 "왼쪽 서열(Left hand sequence)"이라고 한다. pIX 부위에서 상동 재조합에 사용되는 서열을 "pIX 부위 서열(pIX region sequence)"라고 한다. 상동 재조합에 사용되는 오른쪽 ITR의 일부로 구성되는 서열을 "오른쪽 서열(Right sequence)"이라고 한다. 모든 서열은 표준 5'에서 3' 방향으로 나타냈다.
SV-1: 왼쪽 서열:(서열 번호: 1); pIX 부위 서열:(서열 번호: 2); 오른쪽 서열:(서열 번호: 3).
SV-7: 왼쪽 서열:(서열 번호: 4); pIX 부위 서열:(서열 번호: 5); 오른쪽 서열:(서열 번호: 6).
SV-11: 왼쪽 서열:(서열 번호: 7); pIX 부위 서열:(서열 번호: 8); 오른쪽 서열:(서열 번호: 9).
SV-16: 왼쪽 서열:(서열 번호: 10); pIX 부위 서열:(서열 번호: 11); 오른쪽 서열:(서열 번호: 12).
SV-18: 왼쪽 서열:(서열 번호: 13); pIX 부위 서열:(서열 번호: 14); 오른쪽 서열:(서열 번호: 15).
SV-38: 왼쪽 서열:(서열 번호: 16); pIX 부위 서열:(서열 번호: 17); 오른쪽 서열:(서열 번호: 18).
SV-39: 왼쪽 서열:(서열 번호: 19); pIX 부위 서열:(서열 번호: 20); 오른쪽 서열:(서열 번호: 21).
실시예 4
본 실시예에서는 E1 부위 서열이 결실된 원숭이 아데노바이러스가 복제-결핍이라는 것을 설명한다.
E1-결실은 실시예 3에서 설명한 것과 같이 원숭이 아데노바이러스 SAV7, SAV11 및 SAV16으로 제작하였다. 상기 E1-결실은 E1A의 프로모터, E1A 코딩 부위 전체, E1B 프로모터, E1B 21K 단백질 상동성 코딩 부위 및 대부분의 E1B 55K 상동성 코딩 부위의 5' 말단을 제거하기 위해 도안하였다. 또한, 실시예 3 및 Gall JG, et al ., Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes. Mol . Biotechnol . 35(3):263-73(2007), PubMed PMID: 17652790에 기재된 것과 같은 암호화된 단백질 생성물이 없는 발현 카세트를 E1 결실 위치에 삽입하였다. 이러한 서열의 제거로 바이러스의 복제가 변경되었는지의 여부를 결정하기 위해서, 원숭이 세포를 바이러스로 감염시키고, 감염성 바이러스 자손을 측정하였다. 원숭이 유래의 두 개의 세포 주 둘 다를 사용하였고, 판매회사(ATCC)가 원숭이 아데노바이러스의 증식에 있어서 추천하였다. LLC-MK2 세포 주는 레서스 원숭이[rhesus macaque(마카카 물라타(Macaca mullata))]로부터의 신장 주이며, BSC-1 세포 주는 아프리카 녹색 원숭이(Cercopithecus aethiops)로부터의 신장 주이다. 6-웰 플레이트의 웰 당 3 × 105 세포로 플레이팅된 세포 주의 부착 배양물을 E1-결실 및 야생형 아데노바이러스 각각의 세포 당 100개 입자로 감염시켰다. 감염 후 72 및 96 시간(hpi)에, 세포 및 배지를 수집하고, 3회 냉동-해동 사이클(드라이 아이스에서 ~ 10분간 냉동, 37℃ 수조에서 ~ 10 분간 해동)을 실행하여 세포를 용해하였다. 세포 용해물을 하기에서 기재한 것과 같이 형광 포커스 유닛(FFC) 분석으로 감염성 바이러스에 대해서 분석하였다[Gall JG, et al ., Rescue and production of vaccine and therapeutic adenovirus vectors expressing inhibitory transgenes. Mol . Biotechnol. 35(3): 263-73(2007), PubMed PMID: 17652790.; 및 Lemiale F, et al., Novel adenovirus vaccine vectors based on the enteric-tropic serotype 41. Vaccine 25(11): 2074-84(2007), Epub 2006 Nov 28. PubMed PMID: 17250935, PubMed Central PMCID: PMC2584667]. 야생형 바이러스로 감염된 세포로부터 발생된 용해물에서 바이러스 자손의 높은 역가가 나타났으며(표 2); 이에 따라 세포 배양물은 시미안 아데노바이러스로 허용되었다. 중요하게, 분석 정량 한계 25,325 25,875 FFU/㎖(세포 배양 웰 및 비희석 용해물 당 현미경 필드, 즉 1013 필드 당 최소 5 포커스)로 E-결실 시미안 아데노바이러스로 감염된 세포로부터의 용해물에서 검출된 자손 비리온은 없었다. 정량 한계에 대한 야생형 바이러스의 각 항원형으로 획득된 최대 역가의 비교로 적어도 19,348 인자까지의 SAV7; 적어도 10,266 인자까지의 SAV11; 및 적어도 5,133 인자까지의 SAV16의 감소된 복제를 보여준다. 또한, 널 바이러스(null virus) 감염으로부터의 용해물로 감염된 웰에서 관찰된 포커스는 없었으며, 추가로 5 FFU/㎖의 검출 한계로 분석 한계가 낮아졌다. 검출 한계에 대한 야생형 바이러스의 각 항원형으로 획득된 최대 역가의 비교로 SAV7, SAV11 및 SAV16 각각에 있어서 9.8 × 107, 5.2 × 107 및 2.6 × 107의 인자까지 감소된 복제가 설정되었다. 따라서, E-결실된 시미안 아데노바이러스는 복제-결핍이었다.
바이러스 자손 세대(FFU/㎖)
바이러스 BSC-1 LLC-MK2
72 hpi 96 hpi 72 hpi 96 hpi
SAV7 널 0 0 0 0
SAV11 널 0 0 0 0
SAV16 널 0 0 0 0
SAV7 WT 2.5E + 08 3.7E + 08 2.7E + 07 4.9E + 08
SAV11 WT 2.6E + 08 n.d.* 1.9E + 08 n.d.
SAV16 WT 5.7E + 06 1.3E + 08 2.0E + 06 5.0E + 06
* n.d.= 실행되지 않음.
본 명세서에 인용된 간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은, 각 참고문헌이 개별적이고 구체적으로 참고에 의해 포함되는 것으로 나타나며 그것의 전문이 본 명세서에 설명되는 것과 동일한 정도로, 참고로써 포함된다.
본 발명을 설명하는 내용(특히 하기의 청구의 범위의 내용)에서 단수 용어 및 이와 유사한 지시 대상의 사용은 맥락에 의해 명백하게 부인되거나 또는 본 명세서에서 다르게 지시하지 않는 한 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 구성된다. "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"이라는 용어는 다르게 언급하지 않는 한 확장 가능한 용어[즉, "포함하지만, 이에 제한되지 않는"을 의미함]로 구성된다. 본 명세서에서 값 범위의 설명은 주로 본 명세서에서 다르게 지시하지 않는 한 범위 내에 있는 각각의 별개의 값을 개별적으로 나타내는 속기 방법으로서 제공되는 것으로서 의도되며, 각 별개의 값은 개별적으로 본 명세서에서 인용되는 것과 같이 명세서에 포함된다. 본 명세서에서 기재된 모든 방법은 본 명세서에서 다르게 지시하거나 또는 맥락에 의해서 명백하게 부인되지 않는다면 임의의 적당한 순서로 실행될 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 임의의 및 모든 예들 또는 예시적인 언어[예를 들면, "예컨대"]의 사용은 주로 다르게 청구하지 않는 한 본 발명의 범주 상의 제한을 포함하지 않으며, 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것으로 의도된다. 명세서에서는 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 비-청구적 요소를 나타내는 것으로서 구성되어야 하는 것은 없다.
본 발명의 바람직한 실시형태는 본 발명을 실행하기 위해 본 발명자들에게 공지되어 있는 최상의 방식을 포함하여, 본 명세서에서 기재되어 있다. 이러한 바람직한 실시형태의 변형은 상기에서 기재한 설명을 읽을 때, 당업계에 통상의 지식을 가진 자들에 의해 명백하게 될 수 있으며, 본 발명자들은 특별히 본 명세서에서 기재한 것과 같은 것과는 다르게 본 발명을 실행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법에 의해서 허락된다면 본 명세서에서 첨부된 특허청구범위에서 인용된 대상 문제의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 이의 모든 가능한 변형에서 상기에서 기재한 요소의 결합도 맥락에 의해서 명확하게 부인되지 않거나 또는 본 명세서에서 다르게 지시하지 않는 한 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENVEC, INC. <120> SIMIAN ADENOVIRUS AND METHODS OF USE <130> WO2011/057248 <140> PCT/US10/055991 <141> 2010-11-09 <150> US 61/259,343 <151> 2009-11-09 <160> 28 <170> PatentIn version 1.71 <210> 1 <211> 387 <212> DNA <213> simian adenovirus SV-1 <400> 1 catcatcaat aatatacctt attctggaaa cgtgccaata tgataatgag cggggaggag 60 cgaggcgggg ccggggtgac gtgcggtgac gtggggtgac gcggggtggc gcgagggcgg 120 ggcgggagtg gggaggcgct tagtttttac gtatgcggaa ggaggtttta taccggaagt 180 tgggtaattt gggcgtatac ttgtaagttt tgtgtaattt ggcgcgaaaa ccgggtaatg 240 aggaagttga ggttaatatg tactttttat gactgggcgg aatttctgct gatcagcagt 300 gaactttggg cgctgacggg gaggtttcgc tacgtggcag taccacgaga aggctcaaag 360 gtcccattta ttgtactcct cagcgtt 387 <210> 2 <211> 561 <212> DNA <213> simian adenovirus SV-1 <400> 2 taaccctgaa cgttaccgag gagctgagga cggaccacca catgctgtct tgcctgcgta 60 ccgactatga atccagcgat gaggagtgag gtgaggggcg gagccacaaa gggtataaag 120 gggcatgagg ggtgggcgcg gtgtttcaaa atgagcggga cgacggacgg caatgcgttt 180 gaggggggag tgttcagccc atatctgaca tctcgtcttc cttcctgggc aggagttcgt 240 cagaatgtag tgggctccac cgtggacgga cggccggtcg cccctgcaaa ttccgccacc 300 ctcacctatg ccaccgtggg atcatcgttg gacactgccg cggcagctgc cgcttctgct 360 gccgcttcta ctgctcgcgg catggcggct gattttggac tatataacca actggccact 420 gcagctgtgg cgtctcggtc tctggttcaa gaagatgccc tgaatgtgat cttgactcgc 480 ctggagatca tgtcacgtcg cctggacgaa ctggctgcgc agatatccca agctaacccc 540 gataccgctt cagaatctta a 561 <210> 3 <211> 900 <212> DNA <213> simian adenovirus SV-1 <400> 3 acacagtgta aaatgttcag ccaaaaatca ctaagctgct cctttaaaaa gtccagtact 60 tctatattca gttcgtgcaa gtactgaagc aactgtgcgg gaatatgcac agcaaaaaaa 120 atagggcggc tcagatacat gttgacctaa aataaaaaga atcattaaac taaagaagcc 180 tggcgaacgg tgggatatat gacacgctcc agcagcaggc aagcaaccgg ctgtccccgg 240 gaaccgcggt aaaattcatc cgaatgatta aaaagaacaa cagagacttc ccaccatgta 300 ctcggttgga tctcctgagc acagagcaat acccccctca cattcatatc cgctacagaa 360 aaaaaacgtc ccagataccc agcgggaata tccaacgaca gctgcaaaga 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actgcgctac cgctccatgc tgctgggcaa cggccgctac 1560 gtacccttcc acatccaagt gccccagaaa ttcttcgcca tcaaaaacct cctgctcctc 1620 cccgggtcct acacctacga gtggaacttc cgcaaggacg tcaacatgat cctccagagc 1680 agcctgggta acgacctccg cgtcgacggg gccagcgtca ggttcgacag catcaacctg 1740 tacgccaact tcttccccat ggcccacaac accgcctcca cgctcgaggc catgctgcgc 1800 aacgacacca acgaccagtc gttcaacgac tacctctgcg ctgccaacat gctctacccc 1860 atccccgcca acgccaccag cgtgcccatc tccattccct cgcggaactg ggccgccttc 1920 cggggctgga gcttcacccg gctcaagacc aaggagaccc cctctctggg ctccggcttc 1980 gatccctact tcacctactc gggctccatc ccctacctgg acggcacctt ctacctcaac 2040 cacactttca agaaggtctc catcatgttc gactcctccg tcagctggcc cggcaacgac 2100 cgcctgctga cccccaacga gttcgagatc aagcgcaccg tggacgggga agggtacaac 2160 gtggcccagt gcaacatgac caaggactgg ttcctcatcc agatgctcag ccactacaac 2220 atcggctacc agggcttcta cgtgcccgag ggctacaagg acaggatgta ctctttcttc 2280 cgcaacttcc aacccatgag ccgccaggtg gtcgacacca ccacctacac cgactacaaa 2340 aacgtcaccc tccccttcca gcacaacaac tcggggttcg tgggatacat gggccccacc 2400 atgcgcgagg ggcaggccta ccccgccaac tacccctacc ccctgatcgg caagaccgcc 2460 gtgcccagcc tcacgcagaa aaagttcctc tgcgaccgca ccatgtggcg catccccttc 2520 tccagtaact tcatgtccat gggggcgctc accgacctgg ggcagaacat gctgtacgcc 2580 aactccgccc acgccctcga catgaccttc gaggtggacc ccatggatga gcccacgctt 2640 ctctatgttc tgttcgaagt gttcgacgtc gtgcgcatcc accagccgca ccgcggcgtc 2700 atcgaggccg tctacctgcg cacgccgttc tcggccggta acgccaccac c 2751 <210> 27 <211> 2796 <212> DNA <213> simian adenovirus SV-38 <400> 27 atggccaccc catcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatcgccgg gcaggacgcc 60 tcggagtacc tgagtcccgg cctcgtgcag tttgcccgcg ccaccgacac ctacttcagc 120 ttgggaaaca agtttagaaa ccccaccgtg gcccccaccc acgatgtgac cacggaccgc 180 tcgcagaggc tgaccctgcg ttttgtgccc gtagaccggg aagacaccgc gtactcttac 240 aaagtgcgct tcaccctggc tgtaggagac aacagagtgt tggacatggc cagcacgtat 300 ttcgacattc gcggaatgtt agatcgcggt cccagcttta aaccctattc tggcaccgct 360 tacaactctt tagctcctaa aggcgctcca aacccgagtc 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taaaaaggtg 2100 tccatcatgt ttgactcatc ggtcagctgg cccggcaacg accgcctgct aacgcccaac 2160 gagttcgaaa ttaagcgttc ggtagacggt gaagggtaca acgtggccca aagcaacatg 2220 accaaggact ggttcctgat tcaaatgctc agccactaca acatcggcta ccagggcttc 2280 tacgtgcccg aaaactacaa ggaccgcatg tactccttct tcagaaactt ccaacctatg 2340 agtcggcagg tggtagactc ggttaactat gctaactaca aggaagtaaa aatgccattc 2400 cagcacaata actccggctt tgtggggtac atgggaccta ccatgagaga aggacaggcc 2460 tacccggcca attatccata tcccctaatt ggccaaaccg ccgttcccag tctcacgcaa 2520 aaaaagttcc tctgcgaccg ggtgatgtgg aggatcccct tctctagcaa cttcatgtct 2580 atgggctccc tcaccgacct ggggcagaac atgctgtacg ccaactccgc tcacgccttg 2640 gatatgacct ttgaggtgga tcccatggat gagcccacgc ttctctatgt tctgtttgaa 2700 gttttcgacg tggtgcgcat ccaccagccg caccgcggcg tcatcgaggc cgtctacctg 2760 cgcacacctt tctctgccgg taacgccacc acctaa 2796 <210> 28 <211> 1726 <212> DNA <213> simian adenovirus SV-39 <400> 28 agtttgcccg tgcgacggaa acctacttct cactgggcaa caagttcagg aaccccaccg 60 tggcgcccac ccacgacgtc accaccgatc ggtcccagcg actgacaatc cgcttcgtcc 120 ccgtggacaa ggaagacacc gcttactcct acaaaacccg cttcacgctg gccgtgggcg 180 acaaccgggt gctagacatg gccagtacct actttgacat ccgcggcgtg atcgaccgcg 240 gacctagctt caagccttac tccggcacgg cttacaactc actggctccc aaaggggcgc 300 ccaacaacag ccaatggaac gccacagata acgggaacaa gccagtgtgt tttgctcagg 360 cagcttttat aggtcaaagc attacaaaag acggagtgca aatacagaac tcagaaaatc 420 aacaggctgc tgccgacaaa acttaccaac cagagcctca aattggagtt tccacctggg 480 ataccaacgt taccagtaac gctgccggac gagtgttaaa agccaccact cccatgctgc 540 catgttacgg ttcatatgcc aatcccacta atccaaacgg gggtcaggca aaaacagaag 600 gagacatttc gctaaacttt ttcacaacaa ctgcggcagc agacaataat cccaaagtgg 660 ttctttacag cgaagatgta aaccttcaag cccccgatac tcacttagta tataagccaa 720 cggtgggaga aaacgttatc gccgcagaag ccctgctaac gcagcaggcg tgtcccaaca 780 gagcaaacta cataggtttc cgagataact ttatcggttt aatgtattat aacagcacag 840 ggaacatggg agttctggca ggtcaggcct cgcagttaaa cgcagttgta gacctgcaag 900 atcgaaacac ggaactgtcc tatcagctaa tgctagatgc tctgggtgac agaactcgat 960 atttctcaat gtggaatcag gccgtggaca gctacgatcc agacgttagg attatcgaga 1020 accatggggt ggaagacgag ctgcccaatt actgttttcc actcccaggc atgggtattt 1080 ttaactccta caagggggta aaaccacaaa atggcggtaa tggtaactgg gaagcaaacg 1140 gggacctatc aaatgccaat gagatcgctt taggaaacat ttttgccatg gaaattaacc 1200 tccacgcaaa cctgtggcgc agcttcttgt acagcaatgt ggcgctgtac ctgccagaca 1260 gctataaatt cactcccgct aacatcactc tgcccgccaa ccaaaacacc tacgagtata 1320 tcaacgggcg cgtcacttct ccaaccctgg tggacacctt tgttaacatt ggagcccgat 1380 ggtcgccgga tcccatggac aacgtcaacc cctttaacca tcaccggaac gcgggcctcc 1440 gttaccgctc catgctgctg ggaaatggac gcgtggtgcc tttccacata caagtgccgc 1500 aaaaattttt cgcgattaag aacctcctgc ttttgcccgg ctcctacact tacgagtgga 1560 gcttcagaaa agacgtgaac atgattctgc agagcaccct gggcaatgat cttcgagtgg 1620 acggggccag cgtccgcatt gacagcgtca acttgtacgc caactttttc cccatggcgc 1680 acaacaccgc ttctaccttg gaagccatgc tgcgaaacga caccaa 1726

Claims (19)

  1. 원숭이 아데노바이러스의 증식 방법으로서,
    세포를 상기 원숭이 아데노바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 세포는 인간 아데노바이러스의 E4 ORF6으로 필수 구성되는 E4 부위의 일부분에 의해서 암호화되는 유전자 생성물 및 E1A 부위 및 E1B 부위 중 하나 또는 둘 다에 의해서 암호화되는 유전자 생성물을 발현시킴으로써, 원숭이 아데노바이러스를 세포에서 증식시키는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 아데노바이러스는 종 C 인간 아데노바이러스인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 E4 부위의 일부분은 E4 ORF6인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포는 HEK-293 세포 또는 PerC.6 세포인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 복제-결핍인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 증식을 위해 아데노바이러스 게놈의 E1A 부위, E1B 부위 및 E4 부위 중 하나 이상의 상보성이 필요한 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 E1 부위에서의 결핍 및 E4 부위 중 적어도 일부분에서의 결핍을 포함하는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 E3 부위에서의 결핍을 더 포함하는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  10. 원숭이 아데노바이러스의 증식 방법으로서,
    세포를 상기 원숭이 아데노바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 원숭이 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스의 하나 이상의 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 유전자 생성물은 인간 세포에서의 숙주 복제 차단을 극복하거나 또는 경감시키는 것을 초래하는 E4 부위 중 일부분에 의해서 암호화되는 유전자 생성물을 포함하며, 상기 일부분은 E4 ORF6으로 필수 구성됨으로써, 원숭이 아데노바이러스를 세포에서 증식시키는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 종 C 인간 아데노바이러스 유전자 생성물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 생성물은 인간 아데노바이러스의 E1A 부위 및 E1B 부위 중 하나 또는 둘 다에 의해서 암호화되는 유전자 생성물을 포함하는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 E4 부위 중 일부분은 E4 ORF6인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포는 HEK-293 세포 또는 PerC.6 세포인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 복제-결핍인 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 증식을 위해 아데노바이러스 게놈의 E1A 부위, E1B 부위 및 E4 부위 중 하나 이상의 상보성이 필요한 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 E1 부위에서의 결핍 및 E4 부위 중 적어도 일부분에서의 결핍을 포함하는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 원숭이 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 E3 부위에서의 결핍을 더 포함하는 것인, 아데노바이러스의 증식 방법.
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