JP2002507897A - 遺伝子治療で用いるべきヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はアデノウイルスベクターの新規な生成手段および方法を開示する。本発明の１つの方法は、アデノウイルスベクターの生成方法であって、２つの核酸分子を結合することからなり、少なくとも２つの機能的なアデノウイルス逆方向末端反復配列、機能的なカプセル化シグナルおよび関係の核酸またはそれらの機能的部分、誘導体および／または類似体からなる物理的に結合した核酸の生成を許容するように、互いに結合し得る部分的にオーバーラップしている配列からなる該分子による方法を包含する。さらに本発明は、生成アデノウイルスベクターのための核酸分子を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子治療で用いるべきヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム 本発明は、組換えＤＮＡ技術、さらに詳しくは、遺伝子治療の分野に関する。 特に、本発明は、アデノウイルス、特にヒト組換えアデノウイルスに由来する物 質を用いる遺伝子治療に関する。本発明は、特に、新規ウイルス由来ベクターお よびアデノウイルスに基づくベクターのための新規パッケージング細胞株に関す る。 遺伝子治療は、広範囲の適用が可能であって、それが考えられてきた最近開発 された概念である。遺伝子治療においては、遺伝情報を担う分子は宿主のいくつ かのまたは全ての細胞に導入され、その結果、遺伝情報は機能的様式で宿主細胞 に付加される。遺伝障害を通じて、宿主において存在しないまたは不十分な量で 少なくとも存在するタンパク質または他の物質を補足するための遺伝情報を提供 することによる、遺伝障害の治療、（自己）免疫疾患または感染、または他の処 置のごとき腫瘍および（他の）後天性疾患の治療が含まれる。付加された遺伝情 報は、タンパク質をコードするcDNAのごとき遺伝子または遺伝子の誘導体であり 得る。この場合、機能的様式は、タンパク質が宿主細胞の機構によって発現され 得ることを意味する。また、遺伝情報は、宿主細胞に存在するヌクレオチド（DN AであれまたはRNAであれ）の配列に相補的なヌクレオチドの配列であり得る。こ の場合、機能的様式は、付加されたDNA（核酸）分子また はイン・サイチュ（in situ）にて作製されたそのコピーは、宿主細胞に存在す る相補的配列と塩基対合することができる。 かくして、遺伝子治療には、基本的には、３つの異なるアプローチがあり、１ つは、（哺乳動物）宿主に存在する欠陥を補償することに向けられたものであり ；第２のものは、望まない物質（生物または細胞）の除去または排除に向けられ たものであり、第３のものは、組換えワクチン（腫瘍または外来微生物）の適用 に向けられたものである。 遺伝子治療の目的のために、欠失を担うアデノウイルスは適当なビヒクル(veh icle)として提案されてきた。アデノウイルスはノンエンベロープ(non-envelope d)DNAウイルスである。アデノウイルスに由来する遺伝子導入ベクター（いわゆ る、アデノウイルスベクター）は、それを、かかる目的のための遺伝子導入で特 に有用な多数の特徴を有する。例えば、アデノウイルスの生物学は詳細に特徴付 けられており、アデノウイルスはひどいヒト病因には関連せず、該ウイルスはそ のDNAを宿主細胞に導入するのに極めて効果的であり、該ウイルスは広い種々の 細胞に感染することができ、広い宿主範囲を有し、該ウイルスは相対的には容易 に大量に産生することができ、該ウイルスはウイルスゲノムの初期領域１（E1） における欠失によって複製欠陥とすることができる。 アデノウイルス（Ad）ゲノムは、各ストランド(strand)の５’末端に共有結合 した55-kDa末端タンパク質とのおよそ36000塩基対の線状二本鎖DNA分子である。 該Ad DNAは、血清タイプに応じて、正確な長さで約100 塩基対の同一の逆方向末端反復配列（ITR）を含有する。該ウイルスの複製起点 は正確にゲノム末端のITR内に位置する。DNA合成は、２つの段階で起こる。まず 、複製はストランド置換によって進行し、娘重複(duplex)分子および親置換スト ランドを生じる。置換ストランドは一本鎖であって、いわゆる「パンハンドル」 中間体を形成でき、これは娘重複分子の複製開始および娘重複分子の生成を許し ている。あるいは、複製は、同時にゲノムの両末端から進行することができ、パ ンハンドル構造を形成する必要性をなくする。複製はLechnerら,(1977)J.Mol.Bi ol.174:494-510から適合させた図14にまとめてある。 増殖性感染サイクルの間、該ウイルス遺伝子は２つの相：ウイルスDNA複製ま での期間である初期相、およびウイルスDNA複製の開始と一致する後期相で発現 される。初期相の間、領域E1、E2、E3およびE4によってコードされる初期遺伝子 産物のみが発現され、これは、ウイルス構造タンパク質の合成にために細胞を調 製する多数の機能を行う（Berk,A.J.(1986)Ann.Rev．Genet.20:45-79）。後期相 の間、後期ウイルス遺伝子産物が、初期遺伝子産物に加えて発現され、宿主細胞 DNAおよびタンパク質合成はシャットアウトされる。結果として、細胞は、ウイ ルスDNAおよびウイルス構造タンパク質の産生に貢献するようになる(Tooze，J.( 1981)DNATumor Viruses(改訂版)）、Cold Spring Harbor Laboratory.Cold Spri ng Harbor,New York)。 アデノウイルスのE1領域は標的細胞の感染後に発現されたアデノウイルスの第 １の領域である。この領域は、 ２つの転写ユニット、E1AおよびE1B遺伝子よりなり、その双方は初代（胚）齧歯 類培養のオンコジーン形質転換に必要である。E1A遺伝子産物の主要機能は、休 止細胞を誘導して、細胞周期に入り、細胞DNA合成を再開し、E1B遺伝子およびウ イルスゲノムの他の初期領域(E2、E3およびE4)を転写的に活性化することである 。E1B遺伝子単独での初代細胞のトランスフェクションは、制限されない増殖（ 不滅化）を誘導できるが、その結果、完全な形質転換体は得られない。しかしな がら、E1Aの発現は、ほとんどの場合、その結果、プログラムされた細胞死（ア ポトーシス）の誘導が生じ、偶然的な不滅化のみが得られる（Jochemsenら,(199 87)EMBO J.6:3399-3405）。E1B遺伝子の共発現が、アポトーシスの誘導を防止し 、完全な形態学的形質転換が起こるのに必要である。確立された不滅化細胞株に おいて、E1Aの高レベルの発現は、E1Bの不存在下で、完全な形質転換を引き起こ すことができる（Robertsら,(1985)J.Virol.56:404-413）。 E1Bがコードするタンパク質は、ウイルス複製を可能とする細胞機能を再指令 することにおいてE1Aを助ける。実質的に核に局在する複合体を形成するE1B 55k DおよびE4 33kDタンパク質は、宿主タンパク質の合成を阻害することにおいてお よびウイルス遺伝子の発現を促進することにおいて機能する。それらの主要な影 響は、感染の後期相の開始と同時に、核からのウイルスmRNAの細胞質への選択さ れた輸送を確立することである。E1B 21kDタンパク質は、生産的感染サイクルの 正しい一時的制御で重要であり、それにより、ウイルスのライフサ イクルが完了する前に、宿主細胞の未成熟死滅を防止する。E1B 21kD遺伝子産物 を発現できない突然変異体ウイルスは、宿主細胞染色体DNAの過剰分解（deg−表 現型）によって達成され、増強された細胞病理学効果（cyt−表現型）における 短化感染サイクルを呈する（Tellingら,(1994)J.Virol.68:541-7）。該degおよ びcyt表現型は、加えて、E1A遺伝子が突然変異された場合に抑制され、これは、 これらの表現型がE1Aの機能であることを示す（Whiteら,(1988)J.Viol.62:3445- 3454）。さらに、E1B 21kDaタンパク質は、E1Aが他のウイルス遺伝子を惹起する 速度を遅くする。いずれのメカニズムを介してE1B 21kDがこれらのE1A依存性機 能を静めることは未だ知られていない。 少なくともE1領域が欠失し、目的の遺伝子によって置き換えられる、ヒトアデ ノウイルスに由来するベクターは、臨床前および臨床相における遺伝子治療実験 で広範囲に使用されてきたのであり、遺伝子治療で現在使用される全てのアデノ ウイルスベクターはE1領域において欠失を有し、ここに、新規遺伝情報を導入す ることができる。E1欠失は、組換えウイルス複製を欠陥のあるものとする(Strat ford-Perricaudetら,(1991)51-61頁 InO.Cohen-AdenauerおよびM.Boiron(編):H uman Gene Transfer,John Libbey Eurotext)。 例えば、レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスは、宿主細胞ゲノムに 組み込まれず、非分裂細胞に感染でき、イン・ビボ(in vivo)において組換え遺 伝子を効果的に導入することができる（Brodyら,(1994)Ann NY Acad.Sci.716:90 -101）。これらの特徴は、アデノウイ ルスを、例えば、自殺遺伝子またはサイトカイン遺伝子の腫瘍細胞へのイン・ビ ボ遺伝子導入のための魅力的な候補とする。しかしながら、現在の組換えアデノ ウイルス技術と関連する問題は、組換えアデノウイルスの生産の間における、複 製能力のあるアデノウイルス（RCA） Hum．Gene Ther．5:1485-1492;Imlerら,(1996)Gene Ther.3:75-84）。これは、 組換えベクターおよび該293細胞のごとき補足する細胞株に存在するアデノウイ ルス構築物からのオーバーラップしている配列の間の相同組換えによって引き起 こされる(Grahamら,(1977)J.Gen.Virol.36:59-72)。臨床試験で使用されるべき バッチ（batch）におけるRCAは望まれない。何故ならば、RCAは、i）非制御様式 で複製し；ii）複製欠損組換えアデノウイルスを補足でき、組換えアデノウイル スの未制御増殖を引き起こし、；およびiii）RCAを含有するバッチは、有意な組 織損傷を誘導し、従って、強力な病理学的 Hum.Gene Ther.5:1485-1492）。従って、臨床試験で用いるべきバッチはRCAがな いことが証明されるべきである（Ostrove,J.M.(1994)Cancer Gene Ther.1:125-1 31）。 組換えアデノウイルスベクターの使用に伴うさらなる問題の１つは、アデノウ イルスでの治療に対する宿主防御反応である。略言すれば、組換えアデノウイル スはE1領域に適合する（前記参照）。アデノウイルスE1産物は、他の初期遺伝子 （E2、E3、E4）の転写をトリガーし、これは結果的に後期ウイルス遺伝子の発現 を活性化する。従って、一般に、E1欠失ベクターはいずれの他の アデノウイルス遺伝子も発現しないと考えられた。しかしながら、最近、いくつ かの細胞タイプがE1配列の不存在下でアデノウイルス遺伝子を発現できることが 証明された。これは、いくつかの細胞タイプが、アデノウイルス遺伝子の転写を 駆動する機構を保有することを示す。特に、かかる細胞はE2Aおよび後記アデノ ウイルスタンパク質を合成することが示された。遺伝子治療状況において、これ は、体細胞への治療的組換え遺伝子の導入の結果、治療タンパク質が発現される のみならず、ウイルスタンパク質が合成され得ることを意味する。アデノウイル スタンパク質を発現する細胞は、形質導入細胞を根絶し、炎症を引き起こす細胞 傷害性Ｔリンパ球によって認識され、殺される(Boutら,(1994a)Gene Therapy 1: 385-394;Engelhardtら,(1993)Human Gene Therapy 4:759-769;Simonら,(1993)Hu man Gene Therapy 4:771-780)。この逆反応は遺伝子治療を害するので、治療後 における免疫抑制剤の使用、組換えベクターにおけるアデノウイルスE3領域の保 持(特許出願EP 952022 1B参照)またはE2A領域に点突然変異（特許WO/28938）を 有するヒトアデノウイルスのts突然変異体の使用のごとき、この問題に対するい くつかの解決が提案されている。しかしながら、免疫抑制を回避するためのこれ らの戦略は、それらの制限を有する。突然変異体組換えアデノウイルスの使用は 、ある程度免疫抑制をなくするが、肺において病理学的応答を防止するのに効果 が低い（Engelhardtら,(1994a)Human Gene Ther,5:1217-1229）。E2Aタンパク質 はそれ自体で免疫応答を誘導することができ、それは、後期アデノウイルスタン パク質 の合成に対するスイッチで枢軸的役割を演じる。従って、特許出願WO/28938で特 許されているように、E2領域で突然変異されており、それを温度感受性（ts）と する組換えアデノウイルスを作製するのが魅力的である。従って、このシステム の主要な欠点は、E2タンパク質が非許容的温度で不安定であるにも拘わらず、免 疫原性タンパク質が依然として合成されるという事実である。加えて、該不安定 タンパク質が、程度が低いとはいえ、後期遺伝子発現を活性化することが予測さ れる。ts125突然変異体組換えアデノウイルスが試験されており、延長された（p rolonged）組換え遺伝子発現が報告された(Yangら,(1994b)Nat.Genet.7:362-369 ;Engelhardtら（1994a）Hum.Gene Ther.5:1217-1229;Engelhardtら,(1994b)Proc .Natl.Acad.Sci USA 91:6196-200;Yangら,(1995)J.Virol.69:2004-2015)。しか しながら、コットンラットにおける肺での病因は依然として高く（Engelhardtら ,(1994a)Human Gene Ther.5:1217-1229）、これは、ts突然変異体の使用の結果 、組換えアデノウイルス技術が部分的に改良されるにすぎないことを示す。他の 者（Fangら,(1996)Gene Ther.3:217-222）は、ts125組換えアデノウイルスを用 いてマウスおよびイヌにおいて延長された遺伝子発現を観察しなかった。ts125 突然変異体アデノウイルスの使用に伴うさらなる困難は、高頻度の復帰が観察さ れることである。これらの復帰体（revertant）が真実の復帰体であるか、また は第２の部位の突然変異の結果である(Kruijerら,(1983)Virology 124:425-433; Nicolasら,(1981)Virology 108:521-524)。両タイプの復帰体は常温で機能し、 従っ て、野生型ウイルスと同様の毒性を有するE2Aタンパク質を有する。 E1欠失組換えアデノウイルスは、通常、以下の方法のうちの１つによって作製 される。第１の方法において、アデノウイルスDNAは、それが野生型（wt）であ ろうが、またはE1および／またはE3欠失されていようが、制限酵素、例えばClaI で消化されて、左側ITR、パッケージングシグナルおよびE1配列の少なくとも一 部を除去し、残存するアデノウイルスゲノム断片（1）は精製される。左側ITR、 パッケージングシグナル、注目する遺伝子を持つ発現カセットおよびE1を補足す る細胞株（パッケージング細胞株）において（1）とオーバーラップしているア デノウイルス配列を含有する線状化アダプター構築物（2）との（1）のコトラン スフェクションは、細胞内相同組換えによって組換えアダプター粒子を生起する であろう。別法として、左側ITR、パッケージングシグナル、および注目する遺 伝子を持つ発現カセットを含有するアダプター構築物（3）は、それが、アデノ ウイルスDNA断片（1）に連結でき、続いてパッケージング細胞にトランスフェク ションされるようにされている。これらの方法の不利は、（1）の精製が面倒で あって、wtDNAの不完全な消化の結果、wtアデノウイルスが培養に導入され、汚 染に導かれる。この問題を回避するためのアプローチは、Bettら.(1994)Natl.Ac ad.Sci.USA 91:8802-8806によって記載されたクローンpHBG10の構築によるもの であった。このプラスミドクローンは、パッケージングシグナルおよびE1領域の 一部が欠失され、相互に付着したウイルスITRを持つAd5配列を含有 する。しかしながら、このクローンは、本発明のものを含めたE1−補足細胞株に も存在するアデノウイルス配列を含む（EP 95201611.1参照）。さらに、ITRは相 互に付着され、該クローンは線状化できず、その結果、E1置換プラスミドでの効 果が低い組換えとなる。 第２の方法において、組換えアデノウイルスは、細菌における相同組換え(Cha rtierら,(1996)J.Virol.70,No.7:4805-4810;Crouzetら,(1997)Proc.Natl.Acd.Sc i USA 94:1414-1419)によって、またはコスミドベクターへクローニングし（Fu ら,(1997)Hum．Gene Ther．8:1321-1330）、引き続いてE1補足細胞株にトランス フェクトすることによって、構築される。この方法の不利は、それが、トランス フェクション前に制限酵素消化によって各生成したクローン（^〜35kb）の広範な 分析が、細菌において組換えにより起こった欠失を排除するように要求すること である。加えて、クローン化アデノウイルス配列の使用は、通常に使用されるパ ッケージング細胞と組換えウイルスの間の配列オーバーラップの問題を解決せず 、増殖の間におけるRCAの生産に導く。 使用される第３の方法は、酵母人工染色体（YAC）にクローン化された完全な アデノウイルスゲノム(Ad2;Ketnerら,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:6186-61 90)およびYACクローンにおいて特異的領域を標的化するためのアデノウイルス配 列、注目する遺伝子のための発現カセットおよび陽性および陰性選択マーカーを 含有するプラスミドで出発する、酵母における2−工程遺伝子置換技術である。 この方法は酵母技術および各新しい組換えクローンの広範な分析を要する(大き なサイズのYACSのため、前記方法よりも面倒さえある)。 第４の方法は、E1およびE3配列において欠失を持つAd5配列を担うコスミドク ローン(pAdexlw;Miyakeら，(1996)Medical Sciences 93:1320-1324)を使用する 。このクローンは、外来性発現カセットの挿入を可能とするE1領域の一部を置き 換える単一の制限部位を有する。組換えアデノウイルスの生成のためには、DNA −末端タンパク質複合体（DNA-TPC）を複製能力のあるアデノウイルスAd-dlX(E3 領域においてXbaI欠失を持つ野生型Ad5)で感染させた細胞から単離する。このDN AをEcoT221で消化して、DNAの5'部分を除去し、E1補足細胞にクローン化された コスミドでコトランスフェクトする。細胞内組換えは、組換えウイルスを生成さ せる(Miyakeら，(1996)Medical Sciences 93:1320-1324)。この方法は、複製能 力のあるウイルスDNAを用い、コスミドクローンにおけるE1欠失が、本発明のも のを含めた現在使用されるパッケージング細胞株におけるE1配列との全てのオー バーラップを除去するのに十分でないという不利を有する。かくして、RCAフリ ーの組換えアデノウイルスを生成させる現行の方法は、培養へ野生型ウイルスを 導入する危険性、クローン化アデノウイルス配列の不安定性、生成されるべき各 新しいウイルスのための制限分析による完全な^〜35kb組換えクローンをチェック する必要性、および該システムはE1欠失組換えアデノウイルスにのみ適し、E3置 換を含む組換えアデノウイルスでの使用はかなりの労力であることを含めた、い くつかの不利を有する。さらに、いくつかの方法におけるクローン化アデノウイ ルスDNAの使用にも拘わら ず、293および911細胞のような通常に使用されるパッケージング細胞に存在する アデノウイルス配列との広いオーバーラップは、ウイルスの増殖の間の相同組換 えによるRCAの出現の問題を解決しない。従って、先行技術方法の不利を解決す るRCAフリーの組換えアデノウイルス調製を生成させる方法および手段ならびに 前記した手段に対する要望が執拗に存在する。遺伝子付加は、現在、これまでに 最も広範囲に適用された遺伝子治療技術である。これは、主として、a）相同組 換えは非常に不十分であって、b）相同組換えについては、適当なベクター系が 利用できない比較的大きいDNA断片が必要であるという事実による。かくして、 大きな核酸分子を哺乳動物細胞に効果的に導入するベクター系に対する大きな要 望が現在ある。 組換えアデノウイルスは、組換え遺伝子をラット肝臓およびアカゲザルの気道 上皮細胞に効果的に導入することができる（Boutら,(1994b)Human Gene Therapy 5:3-10;Boutら,(1994a)Gene Therapy 1:385-394）。加えて、(Vincentら,(1996 )J.Neurosurg 85:648-654;Vincentら,(1996b)Hum.Gene Ther.7:197-205)および 他の者(例えば、Haddadaら,(1993),Hum.Gene Ther.4:703-11)は、イン・ビトロ( in vitro)での種々の腫瘍細胞への、およびイン・ビボでの動物モデルにおける 充実性腫瘍（肺腫瘍、神経膠腫）および免疫欠損マウスにおける異種移植（肺） (Blaeseら,Cancer Gene Ther.2:291-297によってレビューされている)への効果 的なイン・ビボでのアデノウイルス媒介遺伝子導入を観察した。 最小アデノウイルスベクターの生成は国際公開第WO 94/12649号公報に開示されている。記載された方法は、最小アデノウイルスベク ター（国際公開第WO94/12649号公報の用語ではシュウド（Pseudo）アデノウイル スベクター（PAV））のパッケージングのためのタンパク質IXの機能を開発する 。PAVは、注目する遺伝子を持つ発現プラスミドを左側（封入(encapsulation)に 必要な配列を含む）および右側アデノウイルスITRの間に挿入することによって 生成される。該PAVはヘルペスウイルスの不存在下において増殖される。PAVの封 入はヘルペスウイルスと比較して好ましい。何故ならば、ヘルペスウイルスは（ パッケージングシグナルにおける突然変異によって、またはそのサイズによって (効果的でなくも37.5kbパッケッジよりも大きいウイルスゲノム)）パッケージン グにつき部分的に欠損しているからである。加えて、本発明者らは、タンパク質 IX遺伝子の不存在下で、PAVが優先的にパッケッジされるであろうことを提案す る。しかしながら、これらのメカニズムのいずれも、PAV／最小ベクターのみの パッケージングを可能とするのに十分に制限的であるようである。パッケージン グシグナルで提案された突然変異は、パッケージングを減少させるが、同パッケ ージング活性がヘルペスウイルスを増殖させるのに必要であるので、絶対的ブロ ックを提供しない。また、ヘルペスウイルスのサイズの増加またはタンパク質IX 遺伝子の突然変異はいずれも、PAVが専らパッケッジされるのを保証しないであ ろう。従って、国際公開第WO94/12649号公報に記載されている方法は、最小アデ ノウイルスベクター／PAVの無ヘルパーストックの生産で有用ではないようであ る。 複製能力があるアデノウイルスである、組換えアデノウイルス、E1−欠失アデ ノウイルスのみならず最小アデノウイルスを生産するための新規組成物および方 法が提供される。該組成物は、二重インサートウイルスの生成に適した構築物を 含む。例えば、E1欠失アデノウイルスを生成させるための本発明によって提供さ れるシステムは、そのうちの第１のものが比較的小さく、操作可能な立体配置(c onfiguration)において、少なくとも左側ITR、パッケージングシグナル、所望な らば注目する核酸分子を持つ発現カセットおよび少なくとも右側ITRを含む少な くとも１つの部分的にオーバーラップしている核酸分子を含む第２の分子の一部 に相同な配列を少なくとも含有するアダプタープラスミドを操作するのが容易で ある２つの核酸分子よりなり、好ましくは、アデノウイルスキャプシドタンパク 質をコードするアデノウイルス配列をさらに含む；および後記する本発明のパッ ケージング細胞。該核酸分子のパッケージング細胞へのコトランスフェクション は、好ましくは、該核酸分子中のオーバーラップしている配列の間の実質的に１ つの相同組換えを介して該核酸分子を一緒に融合すること(welding together)を 可能とする。相同組換えは、パッケージング細胞で複製し、増幅できる組換えウ イルスDNAを生じる。核酸分子は、好ましくは、複製能力のあるアデノウイルス （RCA）の形成に導くことができるパッケージング細胞における補足配列との配 列オーバーラップを有しない。好ましくは、核酸分子上のITRのうちの少なくと も１つには、その制限酵素でのDNAの消化によってITRが、実質的にベクター配列 なしにできるように、アデノ ウイルス配列に存在しない制限酵素認識部位が近接する。このようにして、複製 の開始はより効果的に起こる。本発明によって提供されるシステムは、アデノウ イルスゲノムにおいてさらに、限定されるものではないがE4領域タンパク質、ヘ キソン、ペントンベースタンパク質またはファイバータンパク質またはE2Aタン パク質についてのコード領域における修飾を含めて、修飾したRCAフリーの組換 えアデノウイルスの生産を大いに促進する。 以下の態様は、それと一緒に融合すべきアダプタープラスミドおよび大きな核 酸の組合せに徴して読まれるべきであると理解されるべきである。 本発明の１つの側面において、RCA産生での問題は、本発明者らが、新しい基 本的ベクターとオーバーラップしている配列を有さず、従って、組換えアデノウ イルスの安全な大規模な生産に適したパッケージング細胞を開発した点で、解決 される。 本発明のもう１つの側面において、本発明者らは、従って、組換えアデノウイ ルスゲノムからE2Aコード配列を欠失させ、組換えアデノウイルスベクターを補 足するE1配列を含有する（パッケージング）細胞株にこれらのE1A配列をトラン スフェクトする。 このアプローチにおける主要な問題点は、a）E2Aは非常に高レベルに発現され るべきこと、およびb）E2Aタンパク質は細胞に対して非常に毒性であることであ る。 従って、本発明は、さらにもう１つの側面において、許容温度ではない温度に おいてDNA配列に結合できないタンパク質を生産する、ts125突然変異体E2A遺伝 子の使用を開示する。高レベルのこのタンパク質は、許容 温度に切り換わるまで、細胞中で維持することができる（何故ならば、それはこ の温度で毒性ではないからである）。これは、例えば、tet、メタロチオネイン 、ステロイド誘導性プロモーター、レチノイン酸β−受容体または他の誘導性シ ステムのごとき、誘導性プロモーターの指令下に、突然変異体E2A遺伝子を置く ことと組み合わせることができる。しかしながら、本発明のさらにもう１つの側 面において、毒性野生型E2Aの産生のモーメントを制御するための誘導性プロモ ーターの使用が開示される。 E2A−欠失組換えアデノウイルスの２つの顕著なさらなる利点は、異種配列を 保有する能力の増大および突然変異体E2Aを発現する細胞についての永続的な選 択(permanent selection)である。この第２の利点は、ts125突然変異の高頻度の 復帰に関し；復帰がts125 E2Aを保有する細胞株で起こる場合、これは細胞にと って致死的であろう。従って、ts125突然変異体E2Aタンパク質を発現する細胞に ついての永続的な選択がある。加えて、本発明の１つの態様において、本発明者 らは、E2A−欠失組換えアデノウイルスを生成したので、本発明者らは、本発明 者らのアデノウイルスにおいて復帰の問題を有しないであろう。 本発明のさらにもう１つの態様において、さらなる改良として、パッケージン グ細胞株としての非ヒト細胞株の使用が開示される。 組換えウイルスの臨床的バッチのGMP生産では、他の生物工学的産物の生産で 広く使用されてきた細胞株を使用するのが望ましい。後者の細胞株のほとんどは 、例 えば、ワクチンを生産するのに使用れさてきたサル由来のものである。 ヒトアデノウイルスはサル起源の細胞で複製できないか、または低レベルでの み複製するので、これらの細胞は、組換えヒトアデノウイルスの生産では直接的 には使用できない。アデノウイルス溶解サイクルの初期ないし後期相のスイッチ におけるブロックは、欠陥複製の基礎である。しかしながら、ヒトアデノウイル スゲノムにおける宿主範囲（hr）突然変異は記載されており（hr400-404）、こ れは、サル細胞においてヒトウイルスの複製を可能とする。これらの突然変異は 、E2Aタンパク質をコードする遺伝子に存在する(Klessigら,(1979)Cell 17:957- 966;Klessigら,(1984)Virus Res.1:169-188;Riceら,(1985)J.Virol.56:767-778) (Klessigら,(1984)Virus Res.1:169-188)。さらに、hrおよび温度−感受性ts125 表現型を共に保有する突然変異体ウイルスが記載されている（Broughら,(1985)J .Virol.55,206-212;Riceら,(1985)J.Virol 56:767-778）。 従って、本発明者らは、 a）E1/E2欠損アデノウイルスの複製を可能とするE1配列、および b）E2A過剰発現によって細胞死を防止するためのhr突然変異およびts400と命 名されるts125突然変異を含有するE2A配列(Broughら,(1985)J.Virol.55:206-212 ;Riceら,(1985)J.Virol.56:767-778)、および／または c）誘導性プロモーターの制御下で、hr突然変異を丁度含有するE2A配列、およ び／または d）誘導性プロモーターの制御下にある、hr突然変異およびts125突然変異（ts 400）を含有するE2A配列を保有するサル起源のパッケージング細胞株（例えば、 VERO、CV1）を生成する。 さらに、本発明者らは、（新規かつ改良された）パッケージング細胞株および （新規かつ改良された）組換えアデノウイルスベクターの新規かつ改良された組 合せの構築を開示する。 本発明者らは、以下のものを提供する。 1）Ad5ゲノムのnt．80-5788を保有する二倍体ヒト胚網膜芽細胞（HER）に由来 する新規パッケージング細胞株。ECACCにNo.95062101で寄託された、911と命名 されるこの細胞株は、それを、通常使用される293細胞に対して優れたものとす る（Fallauxら,(1996)Hum.Gene Ther.7:215-222）。 2）丁度E1A遺伝子を発現するが、E1B遺伝子を発現しない新規パッケージング 細胞株。樹立細胞株（そのうち293および911細胞が由来したヒト二倍体細胞では ない）は、E1Bの不存在下でE1Aを発現するヒト二倍体細胞で起こるように、アポ トーシス細胞死を受けることなく、高レベルまでE1Aを発現することができる。 かかる細胞株は、E1B−欠失組換えアデノウイルスをトランス補足する（transco mplement）ことができる。何故ならば、E1B 21kDタンパク質につき突然変異した ウイルスは、野生型アデノウイルスよりも速くウイルス複製と競合することがで きるからである（Tellingら,(1994)J.Virol.68:541-7）。該構築物は後記にて詳 細に記載され、図1−5においてグラフ表示される。該構築物は、異な る樹立細胞株にトランスフェクトされ、E1Aの高発現につき選択される。これは 、選択マーカー遺伝子（例えば、NEO遺伝子）をE1Bプロモーターに直接的に連結 することによってなされる。該E1Bプロモーターは、EIA遺伝子産物によって転写 的に活性化され、従って、選択剤に対する耐性（例えば、NEOの場合はG418が選 択マーカーとして使用される）の結果、E1A遺伝子の所望の発現につき直接的に 選択される。 3）E1B 21kDにつき突然変異されたまたは欠失され、55kDタンパク質を丁度発 現するパッケージング構築物。 4）マーカー遺伝子での選択の必要性なくして、二倍体細胞（もっぱらヒト起 源というのではない）からの補足するパッケージング細胞株の生成で使用される べきパッケージング構築物。これらの細胞はE1Aの発現によって不滅化される。 しかしながら、この特別の場合、E1Bの発現は、E1Aタンパク質によって誘導され るアポトーシスを防止するのに必須である。E1発現細胞の選択は、各々、E1形質 転換ヒト胚性腎臓（HEK）細胞およびヒト胚性網膜芽細胞（HER）である293細胞( Grahamら,(1977)J.Gen.Virol.36:59-72)および911細胞(Fallauxら,(1996)Hum.Ge ne Ther.7:215-222)につき記載されているごとく、フォーカス形成（不滅化）に ついての選択によって達成される。 5）HER細胞の構築物pIG.E1A.E1B（図4）でのトランスフェクションの後、７つ の独立した細胞株を確立することができた。これらの細胞株はPER.C1、PER.C3、 PER.C4、PER.C5、PER.C6、PER.C8およびPER.C9と命名された。PERはPGK-E1-網膜 芽細胞を示す。これらの 細胞株はE1AおよびE1Bタンパク質を発現し、安定であり（例えば、57継代を超え るPER.C6）、E1−欠損アデノウイルスベクターを補足する。PER細胞で得られた 組換えアデノウイルスの収率は、293細胞で得られたものよりもわずかに高い。 これらの細胞株（PER.C6）のうちの１つは番号96022940でECACCに寄託されてい る。 6）拡大されたE1欠失を持つ新しいアデノウイルスベクター（欠失nt.459-3510 ）。それらのウイルスベクターは、該パッケージング細胞株においてE1配列に対 して相同の配列を欠く。（その天然プロモーター配列からの）pIXはベクターか ら発現させることができるにすぎず、パッケージング細胞によって発現させるこ とができないので、これらのアデノウイルスベクターはpIXプロモーター配列お よびpIX遺伝子を含有する（Matsuiら,(1986)Mol.Cell Biol.6:4149-4154,Hoeben およびFallaux,pers.comm.;Imlerら,(1996)Gene Ther.3:75-84）。 7）好ましくは樹立細胞株を発現するE1Aまたは二倍体細胞を発現するE1A+E1B （2-4参照）に基づくパッケージング細胞株を発現するE2A。E2A発現は、誘導性 プロモーターの制御下にあるか、またはE2A ts125突然変異体は誘導性または構 成的プロモーターによって駆動される。 8）E2A配列のさらなる欠失を担う以外は前記した組換えアデノウイルスベクタ ー（６参照）。 9）E1−欠損組換えアデノウイルスをトランス補足できるサル起源からのアデ ノウイルスパッケージング細胞。それらは、好ましくは、pIG.E1A.E1BおよびpIG .NEO でコトランスフェクトされ、NEO耐性につき選択される。E1AおよびE1Bを発現す るかかる細胞は、E1欠損組換えヒトアデノウイルスをトランス補足できるが、サ ル起源の細胞における後期アデノウイルスタンパク質の合成のブロックのため、 不十分に補足するであろう（Klessigら,(1979)Cell 17:957-966）。この問題を 克服するために、本発明者らは、E2A細胞における宿主−範囲突然変異を保有す る組換えアデノウイルスを生成し、ヒトアデノウイルスがサル細胞で複製するの を可能とする。かかるウイルスは、hr−突然変異体からのDNAを相同組換えで使 用する以外は、図12に記載されたごとくに生成される。 10）hr突然変異を保有するE2A配列でコトランスフェクトされる以外は、９で 記載されたサル起源からのアデノウイルスパッケージング細胞。これは、E1およ びE2Aを欠くヒトアデノウイルスの複製を可能とする（８参照）。これらの細胞 株におけるE2Aは、誘導性プロモーターの制御下にあるか、あるいはtsE2A突然変 異体を用いる。後者の場合、E2A遺伝子は、かくして、ts突然変異およびhr突然 変異（ts400由来）を共に担持する。双方の突然変異を保有する複製能力のある ヒトアデノウイルスは記載されている（Broughら,J.Virol.55:206-212;Riceら,( 1985)J.Virol.56:767-778）。 さらに、本発明は、１つの側面において、アデノウイルスゲノムの大きな断片 を含有する新しいコスミドおよびプラスミドベクターならびにこれらのクローン 化アデノウイルス配列を使用することによって組換えアデノウイルスベクターを 生成する改良された方法を提供する。 従って、本発明は、速く、高度に柔軟性であり、信頼でき、標準的なクローニ ング技術のみを必要とする組換えアデノウイルスを生成する新しいシステムを提 供する。新しいシステムは、驚くべきことに、組換えアデノウイルスを生成する ことにおいて効果的である。本発明のパッケージング細胞と組み合わせて、それ は、組換えアデノウイルスのRCAフリーの生成および増殖を保証する。組換えア デノウイルスを生成するための現行の方法に関連した前記リストの問題は、１つ の態様において、適当なパッケージング細胞におけるクローン化アデノウイルス 配列および細胞内相同組換えの機能的組合せを用いることによって達成される。 従って、本発明は、（ゲノム）DNAの非常に大きな断片を保有することができ るベクターを効率的に生成し、生産する方法および手段を提供する。本発明のベ クターは、非常に高い力価まで安全に産生することができ、非常に高い効率で、 ヒト細胞を含めた哺乳動物細胞を形質導入でき、それにより、多数の導入された DNA分子および組換え用の標的DNA分子との大きな相同オーバーラップのため、該 哺乳動物細胞に存在する(ゲノム)DNA分子との相同組換えを好都合とする。１つ の態様において、本発明によるベクターは、ITR配列およびイン・シス（in cis ）でパッケージング（最小アデノウイルスベクター）に必要な配列を除き、でき る限り可能なアデノウイルスゲノムがそれから欠失されたアデノウイルスゲノム に由来するアデノウイルスベクターに基づく。かかるベクターは、38kbまでの外 来性（ゲノム）DNAを収容することができる。 遺伝子置換ベクターとして機能する大きなゲノム配列を持つ最小アデノウイル スベクターは、後記で開示されるプラスミド−ベースの細胞内PCRシステムを用 いて効率的に生成することができ、それにより、汚染ヘルパーウイルスの必要性 を回避する。加えて、本発明者らは、ヘルパーウイルスの必要性なくして最小ア デノウイルスベクターを生産する別の方法を開示する。大きなインサートを持つ 最小アデノウイルスベクターの複製およびパッケージングは、それらを、パッケ ージングシグナルおよびE1配列を除き、複製およびパッケージングに要するアデ ノウイルスゲノムの全ての部分を含有する補足分子との組合せを用いることによ って、達成することもできる。かかる補足分子は、アデノウイルス複製機構によ っては必ずしも複製されない。それは、例えば、SV40複製起点も含有するプラス ミド上にクローン化することができる。SV40ラージタンパク質を（誘導的に）発 現するE1−含有パッケージング細胞における最小アデノウイルスベクターと一緒 でのこのDNAのトランスフェクションは、アデノウイルス分子の複製およびアデ ノウイルスタンパク質の発現に導くであろう。 本発明のさらなる態様は、改良されたアデノウイルスベクター、ならびにかか るベクターの生成および適用のための新規戦略および哺乳動物細胞における線状 DNA断片の細胞内増幅のための方法を提供する。 本発明のいわゆる「最小」アデノウイルスベクターは、ウイルス粒子へのゲノ ムの封入に必要なウイルスゲノムの少なくとも一部、ならびに逆方向末端反復（ ITR）の少なくとも一部または誘導体、すなわち、線状アデノウ イルスゲノムの末端に由来するDNA配列の少なくとも１つのコピーを保有する。 本発明のベクターは、典型的には、導入遺伝子の発現を支配するプロモーター配 列に連結した導入遺伝子を含有する。いわゆる最小アデノウイルスベクターは、 ヘルパーウイルスでの共感染によって、あるいは別法として、後記するパッケー ジング欠損複製ヘルパー系で達成することができる。 適当な細胞株で複製でき、パッケージング欠損複製ヘルパー系として働くこと ができるアデノウイルス−由来のDNA断片は以下のごとくに生成される。これら のDNA断片は、アデノウイルスゲノムの「後記」転写ユニットの転写された領域 の少なくとも一部を保有し、E1領域の少なくとも一部に欠失および封入シグナル の少なくとも一部に欠失を担う。加えて、これらのDNA断片は、逆方向末端反復 （ITR）の少なくとも１つのコピーを含有する。転写されたDNA分子の１つの末端 において、ITRが位置する。他の末端はITR、あるいはITR以外のDNA分子の同一ス トランドの一部に相補的なDNA配列を含有することができる。もし、後者の場合 、２つの相補的な配列をアニールすれば、ヘアピン構造の3'末端ヌクレオチドの 遊離3'−ヒドロキシル基は、細胞および／またはアデノウイルスのコードするDN AポリメラーゼによるDNA合成のためのプライマーとして働くことができ、その結 果、DNA分子の少なくとも一部の二本鎖形態に変換される。さらに、ITRで開始す る複製の結果、２つのITRに近接して挟まれ、オリジナルのトランスフェクトさ れたDNA分子よりも大きい線状二本鎖DNA分子が得られる（図13参照）。この分子 は、DNA分子によって コードされたアデノウイルスタンパク質および宿主細胞ゲノム中の遺伝子によっ てコードされたアデノウイルスおよび細胞タンパク質によって、トランスフェク トされた細胞中でそれ自体複製することができる。このDNA分子は、大きなサイ ズ（39000塩基対より大）のためおよび／または機能的封入シグナルの不存在の ため、封入することができない。このDNA分子は、適当な細胞株における欠損ア デノウイルスベクターの生産のためにヘルパーとして働くことを意図する。 本発明は、適当な哺乳動物細胞における、可変サイズの線状DNA断片の増幅の 方法も含む。これらのDNA断片は、該断片の末端の１つにおけるITRの少なくとも １つのコピーを含有する。前記したごとく、他の末端はITR、あるいはITR以外の DNA分子の同一ストランドの一部に対して相補的なDNA配列を含有することができ る。もし、後者の場合に、２つの相補的な配列をアニールすれば、ヘアピン−構 造の3'末端ヌクレオチドの遊離3'−ヒドロキシル基は、細胞および／またはアデ ノウイルスのコードするDNAポリメラーゼによるDNA合成のためのプライマーとし て働くことができ、その結果、DNA分子の少なくとも一部の二本鎖形態への置換 されたストランドの変換が起こる。さらに、ITRにおける複製開始の結果、オリ ジナルのトランスフェクトされたDNA分子よりも大きい、2つのITRによって近接 して挟まれた、線状二本鎖DNA分子が得られる。両末端にITR配列を含有するDNA 分子は、少なくともアデノウイルスE2タンパク質（すなわち、DNA結合タンパク 質（DBP）、アデノウイルスDNAポリメラーゼ（Ad-pol）、およびプ レ末端タンパク質（pTP））の存在によって、トランスフェクトされた細胞にお いて、それ自体複製することができる。必要なタンパク質は、前記したごとく、 DNA分子それ自体上のアデノウイルスゲノムから、宿主細胞ゲノムに組み込まれ たアデノウイルスE2遺伝子から、または複製ヘルパー断片から発現させることが できる。 いくつかのグループは、DNA分子の末端のITR配列の存在は、もし複製に必要な アデノウイルス−タンパク質が、例えば、ヘルパーウイルスでの感染によってト ランスで提供されるならば、複製することができるアデノウイルスミニ染色体を 生成するのに十分であることを示した(フ（Hu）ら,(1992)Gene 110:145-150);(W angら,(1985)in vivo.Nucl.Acids Res.13:5173-5187);Hayら,(1984)J.Mol.Biol. 174:493-510)。Huら,(1992)Gene 110:145-150は、一本鎖ITRを含有するプラスミ ドのトランスフェクション後に対称なアデノウイルスミニ染色体−ダイマーの存 在および複製を観察した。著者らは、これらのダイマーミニ染色体が、一本鎖IT R DNA分子のテイル−対−テイル（tail-to-tail）連結後に生起することを証明 することができた。欠損アデノウイルスタイプ２粒子から抽出したDNAにおいて 、種々のサイズのダイマー分子が、電子顕微鏡を用いて観察されている（Daniel l(1976)J.Virol.19:685-708）。異なる分子間の非正統的組換えによって不完全 なゲノムが形成され、非正統的塩基対合が起こった配列の位置における変異が不 完全なゲノムの不均一な性質の原因であることが示唆された。このメカニズムに 基づいて、理論的には、正常ゲノムの２倍までの合計の長さを持つ欠損分子を生 成す ることができたと考えられた。かかる分子は、ゲノムのいずれかの末端からの重 複配列を含有することができた。しかしながら、欠損粒子にパッケージされた全 長ウイルスよりも大きいDNA分子はは見出されなかった(Daniell(1976)J.Virol.1 9:685-708)。これは、パッケージングに適用されるサイズ−限定によって説明す ることができた。加えて、ウイルス粒子において、重複左側末端を持つDNA分子 は右側末端を含有するものよりも支配的であることが観察された（Daniell(1976 )J.Virol.19:685-708）。これは、ゲノムのその左側末端近くの封 Virol.66:723-731;Hearingら,(1987)J.Virol.61:2555-2558)。 本アデノウイルス−由来ベクターに伴う主要問題は、 a）ウイルス粒子の強い免疫原性； b）形質導入された細胞に対する細胞傷害性Ｔ−細胞応答の結果となる、アデ ノウイルスベクターに存在するアデノウイルス遺伝子の発現； c）本ベクターに収容することができる少量の異種配列（最大ほぼ8000bpまで の異種DNA）； d）新しいアデノウイルスベクターの生成のための方法および手段の貧弱な頻 度および貧弱な信頼性； である。 Ad A）アデノウイルス粒子の強力な免疫原性の結果、アデノウイルスベクタ ーの単一投与後でさえ、宿主の免疫学的応答が起こる。中和抗体の発生の結果、 ウイルスの引き続いての投与は効果が低く、あるいは完全に効果 がなくさえある。しかしながら、導入された遺伝子の延長されたまたは執拗な発 現は、必要な投与の数を減少させ、問題を回避させることができる。 Ad B）ウィルソン（Wilson）および同僚によって行われた実験は、免疫能力 のある動物へのアデノウイルス媒介遺伝子導入の後に、導入遺伝子の発現が徐々 に減少し、感染のほぼ2〜4週間後に消失することを示した(Yangら,(1994a)Proc. Natl.Acad.Sci USA 91:4407-11;Yangら,(1994b)Nat.Genet.7:362-369)。これは 、形質導入された細胞に対する細胞傷害性T−細胞（CTL）の発生によって引き起 こされる。CTLはウイルスベクターによって発現されたアデノウイルスタンパク 質に対して向けられる。形質導入された細胞において、アデノウイルスDNA−結 合タンパク質（E2A−遺伝子産物）、ペントンおよびファイバータンパク質(後記 −遺伝子産物)の合成は確立することができた。ウイルスベクターによってコー ドされたこれらのアデノウイルスタンパク質は、E1領域の欠失にも拘わらず発現 された。これは、E1領域の欠失がウイルス遺伝子の発現を完全に妨げるのに十分 ではないことを示す（Engelhardtら,(1994a)Human Gene Ther.5:1217-1229）。 Ad C）グラハム（Graham）および同僚による実験は、アデノウイルスが105％ までの正常ゲノムサイズのDNAを封入できることを示した(Benら,(1993)J.Virol. 67:5911-5921)。より大きなゲノムは不安定である傾向にあり、ウイルスの増殖 の間のDNA配列の喪失の結果となる。ウイルスゲノムのE1およびE3領域における 欠失を組み合わせると、ほぼ8.3kbに封入することができ る外来物の最大サイズを増加させる。加えて、E4領域のいくつかの配列は（最大 封入能力へのもう１つの1.8kb領域を付加する）ウイルス増殖に不可欠であるよ うである。また、E2A遺伝子産物が封入細胞株でトランスにて提供される場合、E 2A領域をベクターから欠失させることができ、もう１つの1.6kbを付加する。し かしながら、外来性DNAの最大能力は12kbよりもさらに有意に増加させることが できる。 本発明者らは、38kbまでの外来性DNAを収容することができる組換えアデノウ イルスベクターの無ヘルパー−ストックの生成および産生のための新しい戦略を 開発した。２つの機能的ITR配列、および封入シグナルとして機能できる配列の みが、ベクターゲノムの一部である必要がある。かかるベクターは最小アデノベ クターと呼ばれる。最小アデノベクターについてのヘルパー機能は、宿主細胞ゲ ノムに存在する遺伝子、またはベクターゲノムに存在する遺伝子を除き、所要の 遺伝子産物をコードする全てのウイルス遺伝子を含有する封入欠損−複製能力の あるDNA分子によってトランスにて提供される。 Ad D）先行技術における手段および方法にての新しいアデノウイルスベクタ ーの生成は可能である。しかしながら、先行技術手段および方法は、アデノウイ ルスベクターを生成するにおいて非常に効果的ではなく、さらに該アデノウイル スベクターを生成するプロセスにおいて、多くの他のベクターまたは複製能力の あるアデノウイルスが生産され、生成されたウイルスの徹底的かつ丹念な評価を 必要とする。これは所望の特徴ではなく、特に臨床的状況では、複製能力のある アデノウイルスの存 在は極端に望まれない。加えて、例えば、高処理量（high throughput）スクリ ーニングで使用されるアデノウイルスベクターにおいて発現ライブラリーを生成 させるごとき、特に多くの異なるアデノウイルスベクターを生成する必要がある 状況では、先行技術のアデノウイルスベクター産生システムの効率および信頼性 は未だ不十分である。アデノウイルスベクター生産の信頼性は、通常、生産され た独立したアデノウイルスベクターの数、核酸を機能的に発現できる独立したア デノウイルスベクターの数、または例えば該ベクターが核酸を発現させることを 意図しない場合には、同様の値を決定することができる類似の方法から決定する ことによって測定される。好ましくは、本発明の方法で生産されたアデノウイル スベクターの少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは 少なくとも95％は機能的ベクターであり、該ベクターに存在する場合、該導入遺 伝子および／または注目する核酸を発現することができる。アデノウイルスベク ター生産の信頼性は、特に、多くの異なるアデノウイルスベクターが比較的短期 間で生産される必要がある場合の適用で望まれる。次いで、アデノウイルスベク ターの生産のための信頼性のあるシステムは、関係する時間およびコストを減少 させることができる。好ましくは、平均ベクターについてのアデノウイルスベク ター生産の効率は、10⁶細胞当たりに生産された１を超える独立したベクターで あり、より好ましくは該効率は２×10⁵細胞によって生産された２以上の異なる ベクターであり、最も好ましくは該効率は５×10⁴細胞によって生産された２以 上のベクターである。 開示された発明の適用を以下に概説し、実施例で説明する。IG パッケージング構築物二倍体細胞の使用 構築物、特にpIG.E1A.E1Bは、ヒト胚網膜芽細胞（HER）、ヒト胚腎臓細胞（HE K）、およびヒト胚肺細胞（HEL）のごとき二倍体ヒト細胞をトランスフェクトす るのに使用されるであろう。トランスフェクトされた細胞は、形質転換された表 現型（フォーカス形成）につき選択され、IG.Ad.MLPI.IKのごときE1−欠失組換 えアデノウイルスの増殖を支持するそれらの能力につきテストされるであろう。 かかる細胞株はE1−欠失組換えアデノウイルスの生成および（大規模）生産で使 用されるであろう。組換えアデノウイルスで感染させたかかる細胞は、例えば、 充実性腫瘍の治療のために、組換えアデノウイルスの局所的生産体として、イン ・ビトロで使用されることを意図する。911細胞は組換えアデノウイルスベクタ ーの力価測定、生成および生産で使用される(Fallauxら,(1996)Hum.Gene Ther.7 :215-222)。 pIG.EIA.E1BでトランスフェクトされたHER細胞は、結果として、７つの独立し たクローン（PER細胞と呼ばれる）をもたらす。これらのクローンは、E1欠失（ オーバーラップしていないアデノウイルスベクターを含む）またはE1欠損組換え アデノウイルスベクターの生産で使用され、例えば、E2AまたはE4において突然 変異を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能とするであろう、例えば、E2 BまたはE2A構築物(例えば、ts125E2A、後記参照)、E4等の導入のための基礎を提 供する。加えて、コットンラット（Sigmodon hispidus）(Paciniら, (1984)J.Infect.Dis.150:92-97)、シリアン（Syrian）ハムスター(Morinら,(198 7)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4626-4630)またはチンパンジー（Levreroら,(199 1)Gene 101:195-202）のごとき、ヒトアデノウイルスにつき許容的な他の種の二 倍体細胞はこれらの構築物で不滅化されるであろう。組換えアデノウイルスで感 染させたかかる細胞は、例えば、充実性腫瘍の治療のために、組換えアデノウイ ルスの局所的生産用にイン・ビボで使用されることも意図する。樹立細胞 構築物、特にpIG.E1A.NEOは、樹立細胞、例えば、A549（ヒト気管支癌腫）、K B（口癌腫）、MRC-5（ヒト二倍体肺細胞株）またはGLC細胞株（小細胞肺癌）(de Leijら,(1985)Cancer Res.45:6024-6033;Postmusら,(1988)Eur.J.Clin.Oncol.2 4:753-763)をトランスフェクトするのに使用することができ、NEO耐性につき選 択した。耐性細胞の個々のコロニーを単離し、IG.Ad.MLPI.TKのごとき、E1−欠 失組換えアデノウイルスの増殖を支持するそれらの能力につきテストした。EIA 含有細胞上でのE1欠失ウイルスの増殖が可能である場合、かかる細胞を、E1−欠 失組換えアデノウイルスの生成および生産で使用することができる。また、それ らは、EIA欠失／E1B保持組換えアデノウイルスの増殖でも使用される。 また、樹立細胞はpIG/E1A.E1BおよびpIG.NEO（またはもう１つのNEO含有発現 ベクター）でコトランスフェクトすることができる。G418に対して耐性のクロー ンは、IG.Ad.MLPI.TKのごときE1欠失組換えアデノ ウイルスの増殖を支持するそれらの能力につきテストされ、E1欠失組換えアデノ ウイルスの生成および生産で使用され、二倍体細胞で記載したごとく（前記参照 ）、組換えウイルスの局所的産生のためにイン・ビボで適用されるであろう。 形質転換された二倍体細胞株またはNEO−耐性確立系を含めた全ての細胞株は 、E2AおよびE4のごとき、他の遺伝子において欠失を担う、E1−欠失組換えアデ ノウイルスの増殖を支持する、「次世代」パッケージング細胞株の生成のための 基礎として使用することができる。さらに、それらは、本明細書に開示したごと き最小アデノウイルスベクターの生成のための基礎を提供するであろう。E2 発現細胞株 E2A配列を発現するパッケージング細胞は、E2A−欠失組換えアデノウイルスの 生成および（大規模）産生で使用され、使用されるであろう。 新たに生成されたヒトアデノウイルス・パッケージング細胞株またはヒトアデ ノウイルスに許容的な種に由来する細胞株（E2Aまたはts125E2A;E1A+E2A;E1A+E1 B+E2A;E1A+E2A/ts 125;E1A+E1B+E2A/ts125）またはサル細胞のごとき非許容的細 胞株（hrE1Aまたはhr+ts125E2A;E1A+hrE2A;E1A+E1B+hrE2A;E1A+hrE2A/ts125;E1A +E1B+hrE2A/ts 125）は、E2A欠失組換えアデノウイルスベクターの生成および（ 大規模）産生で使用されるであろう。加えて、それらは、二倍体細胞で記載した ごとく（前記参照）、組換えウイルスの局所的産生のためにイン・ビボで適用さ れるであろう。新規アデノウイルスベクター nt.459-3510のE1欠失を保有する新たに開発されたアデノウイルスベクターは 、遺伝子導入目的で使用されるであろう。また、これらのベクターは、例えば、 E2A、E2BまたはE4につき突然変異されたさらに欠失されたアデノウイルスベクタ ーの開発のための基礎となろう。かかるベクターは、例えば、前記した（1-3参 照）新たに開発されたパッケージング細胞株で生成されるであろう。最小アデノウイルスパッケージングシステム 本発明者らは、（最小アデノウイルスベクターのパッケージングで使用される べき）アデノウイルスベクターパッケージング構築物を開示し、それは、以下の 特徴を有する： a）パッケージング構築物は複製する。 b）該パッケージング構築物はパッケージングシグナルが欠失しているのでパ ッケージすることができない。 c）パッケージング構築物は、内部ヘアピン−形成性配列を含有する（セクシ ョン「実験；提案されたヘアピン」参照、図15参照）。 d）内部ヘアピン構造のため、パッケージング構築物は重複している、すなわ ち、パッケージング構築物のDNAは、それがパッケージング細胞へのトランスフ ェクション前にある限り２倍となる（本発明者らの試料においては、それは35kb から70kbに重複される）。この重複はパッケージングを妨げる。この重複された DNA分子は両末端にITRを有する（例えば、図13参照）。 e）この重複したパッケージング分子は「正常アデノウ イルス」DNA分子のように複製することができる。 f）ゲノムの重複は、最小アデノウイルスベクターをパッケージするのに必要 な、十分なレベルのアデノウイルスタンパク質の生産の前提要件である。 g）パッケージング構築物は、相同組換えによるRCAの生成に導くことができる 最小ベクターまたは細胞配列とオーバーラップしている配列を有しない。 このパッケージングシステムは、最小アデノウイルスベクターを産生するのに 使用されるであろう。例えば、ワクチン接種目的の遺伝子治療のための、最小ア デノウイルスベクターの利点はよく知られている(38kbまでの収容；全ての潜在 的に毒性であって免疫原性のアデノウイルス遺伝子のガッティング（gutting）) 。 （最小アデノウイルスベクターを含めた）本質的遺伝子において突然変異を含 有するアデノウイルスベクターをこのシステムで増殖させることもできる。細胞内E2−発現ベクターの使用 最小アデノウイルスベクターは、パッケージング−欠損複製ヘルパー分子によ ってイン・トランス（in trans）で供されるヘルパー機能を用いて生成される。 アデノウイルス−由来のITR配列は、少なくともE2−遺伝子産物の存在下で、DNA 複製の起源として働く。E2遺伝子産物をベクターゲノム中の遺伝子から発現させ る場合（N.B.遺伝子（類）はE1−非依存性プロモーターによって駆動されなけれ ばならない）、ベクターゲノムは標的細胞で複製することができる。これは、標 的細胞においてかなり増加した数の鋳型分子、およびその結果として、ベクター によってコードされた注目する遺伝子の増 大した発現を可能とする。これは、癌における遺伝子治療のアプローチのために 特に興味がある。線状DNA断片の細胞内増幅の適用 もし線状DNA断片の増幅が所望される場合、同様のアプローチを取ることもで きる。公知または未知の配列のDNA断片は、もし少なくとも１つのITR配列がその 末端近くにまたは末端に位置すれば、E2−遺伝子産物を含有する細胞で増幅させ ることができた。断片のサイズにつき明らかな拘束はない。アデノウイルスゲノ ムよりもかなり大きい各断片（36kb）は、このアプローチを用いて増幅させるこ とができた。従って、該断片を（大腸菌（E.coli）のごとき）細菌に行き来させ ることなく哺乳動物細胞中で大きな断片をクローン化するか、またはダイポリメ ラーゼ鎖反応（P.C.R.）を使用することが可能である。生産的アデノウイルス感 染の最終段階で、単一の細胞はウイルスゲノムの100，000を超えるコピーを含有 することができる。最適状況において、線状DNA断片を同様のレベルまで増幅さ せることができる。従って、（35-kbp断片につき）1000万細胞当たり６以上のジ グ（jig）のDNA断片を抽出することができる。このシステムを用いて、研究また は治療目的で、異種タンパク質（シミアンウイルス40−ベースのCOS−細胞シス テムと同等）を発現させることができる。加えて、該システムを用いて、DNAの 大きな断片中の遺伝子を同定することができる。（ITRSの付加後に）ランダムDN A断片を増幅し、細胞増幅の間に発現させることができる。所望の表現型を持つ 細胞の選抜または選択を用いて、注目する断片を豊富化させ、遺伝子を単離する ことができ る。遺伝子修正ベクター 遺伝子治療手法は２つの異なる概念、すなわち、遺伝子付加および遺伝子置換 に分けることができる。遺伝子付加は、治療核酸分子を患者の体細胞に導入する ことを狙ったものであり、それにより、該治療核酸分子の発現はしばしば異種プ ロモーターおよび転写終結シグナルの制御下となる。例えば、患者が遺伝した病 気に罹る場合、該病気の表現型の原因である欠損の機能的コピーを患者の細胞に 導入し、該治療核酸分子の発現に際して、病気表現型が修正される。遺伝子付加 は、明らかに、腫瘍を治療するために、例えば、HSV-TKのようなサイトカインま たは自殺遺伝子のごときそうでなければ発現されない遺伝子の発現を達成させる のにも使用される。遺伝子置換手法は、病気表現型の原因である欠損遺伝子の少 なくとも１つのコピーを修復することを狙ったものである。これは、遺伝子の機 能的バージョン（version）、またはその遺伝子の突然変異体部位を含むその一 部を、該機能的バージョンおよび該欠損遺伝子の間の相同組換えが起こるように 、導入することによって達成することができる。その結果、欠損遺伝子またはそ の突然変異体部位は、その遺伝子の機能的バージョンまたはその一部によって置 き換えられる。このようにして、患者がそのメンバーである種に対して外来性で ある核酸物質は処理された細胞で発現されないが、突然変異体遺伝子の少なくと も１つの対立遺伝子は修復される。遺伝した病気の大部分については、ヘテロ接 合キャリアーは影響されないか、あるいは少なくともホモ接合患者よりも程度は 低いが影響 される。従って、遺伝子置換を遺伝した障害の修正で使用することができる。こ れは、欠損腫瘍サプレッサー遺伝子の修復も含むことが理解されるべきである。 遺伝子治療目的では、E3領域を保持するのが好ましい。E3含有ベクターは、ア デノウイルス感染細胞のCTL溶解およびTNFによる細胞溶解のごとき宿主細胞応答 を防止し、または低下させることができるので、それらのE3欠失対応体よりも優 れているであろう。 本発明のベクター中の全E3領域を、該部分が依然として感染細胞に対する宿主 の応答を低下させる機能を有する限り、保持する必要がないであろうことは理解 されるであろう。例えば、E3-14.7kD単独の発現は、TNFによって媒介される初期 応答を低下させるのに十分であり得る（Ginsberg,H.S.(1989)Proc.Natl.Acad Sc i.USA 86:3823-3827.Ginsberg,H.S.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1651-165 5）。これらのベクターは、嚢胞性線維症、Duchenne分子ジストロフィー、高コ レステロール血症、血液凝固障害（血友病）等のごとき遺伝病の遺伝子治療で有 用である。それらは、腫瘍、肝炎、（自己）免疫疾患、再狭窄、リウマチ等のご とき後天性疾患の治療で有用である。 遺伝子付加よりも優れた遺伝子置換の利点は、（1）置換遺伝子の発現調節が 内因性発現パターンと同一であること、および（2）ランダム組込みによる挿入 突然変異誘発の危険性がないゆえに、該手法が完全であることを含む。アデノウイルスベクターの生成のためのシステムに基づく組換え核酸 本発明は、１つの側面において、２つの核酸分子を一緒に融合することを含む アデノウイルスベクターの生成方法であって、前記分子が少なくとも２つの機能 的なアデノウイルス逆方向末端反復配列、機能的な封入シグナルおよび目的の核 酸またはそれらの機能的部分、誘導体および／または類似体からなる物理的に結 合した核酸の生成を許しつつ、互いに結合し得る配列を部分的にオーバーラップ することを含む方法を提供する。前記核酸分子はともに、少なくとも左ITR、右I TRおよびアデノウイルス封入シグナルまたはそれらの機能的部分、誘導体および ／または類似体を備えてなる。オーバーラップしている配列とは、相同組換えを 許す充分な核酸配列類似性からなる配列を意味する。配列類似性は、好ましくは 80％より高く、さらに好ましくは95％より高い。オーバーラップしている配列と は、たとえば制限酵素部位の相補的末端も意味し、前記核酸は該相補的末端のハ イブリダイゼーションを介して結合している。前記一緒に融合することは、２つ の核酸分子を物理的に結合し得る、いかなる手段を介して行なわれてよい。好ま しくは前記一緒に融合することは、前記核酸分子の制限酵素の消化による相補的 末端を結合することを介して行なわれる。さらに好ましくは前記一緒に融合する ことは前記核酸におけるオーバーラップしている配列の相同組換えを介して行な われる。 本発明は、１つの態様において、相同組換えを介し、部分的にオーバーラップ している配列からなる２つの核酸分子を一緒に融合することを含むアデノウイル スベクターの生成方法であって、該オーバーラップしている配 列が、少なくとも２つの機能的なアデノウイルス逆方向末端反復配列、機能的な 封入シグナルおよび目的の核酸またはそれらの機能的部分、誘導体および／また は類似体からなる物理的に結合した核酸の生成を導く本質的に唯一の相同組換え を許すアデノウイルスベクターの生成方法を提供する。本発明のこの態様におい て、前記部分的にオーバーラップしている配列が、複製されることができ、かつ 要求されるトランス作用機能の存在下で、アデノウイルス粒子にパッケージされ ることができる機能的なアデノウイルスベクターの生成へ導く本質的に唯一の相 同組換えを許すことが、きわめて重要である。本質的に唯一とは、それぞれの核 酸において前記オーバーラップしている配列が本質的に唯一の連続的な配列から なることを意味し、ここで機能的なアデノウイルスの生成へ導く相同組換えが起 きてもよい。前記連続的な配列のなかで、相同組換えの発生の実際の数が１より 高くてもよい。非連続的なオーバーラップしている配列は、前記方法の信頼性を 減じるので、望まれない。また、非連続的なオーバーラップしている配列は、前 記方法の全体的な効率を減じ、おそらく所望でない相同組換え産物の生成のため 望まれない。 本発明の好ましい態様は、本発明の方法であって、前記核酸分子の両方が唯一 のアデノウイルス逆方向末端反復配列またはそれらの機能的部分、誘導体および ／または類似体からなる方法を提供する。 本発明の１つの側面において、前記２つの核酸分子の１つまたは両方が前記一 緒に融合することに先立って修飾をうけている。該修飾は、前記２つの核酸分子 の１つ または両方の生成へ導く異なる核酸分子の一緒に融合することを含んでもよい。 好ましい態様において、前記異なる核酸分子は部分的にオーバーラップしている 配列の相同組換えを介して互いに結合する。 本発明の１つの側面において、前記一緒に融合することが細胞またはそれらの 機能的な断片、誘導体および／または類似体において行なわれる。好ましくは、 前記細胞が哺乳動物細胞である。好ましい態様において、前記核酸分子は、前記 一緒に融合することに先立って前記哺乳動物細胞において複製し得ない。前記複 製は、おそらく所望でない相同組換えのための追加の標的を提供することにより 、本発明の方法の信頼性を減じるので、望まれない。また、おそらく前記複製は 基質または前記アデノウイルスベクターの複製と関係するアデノウイルスの機能 と競合し、本発明の方法の効率を減じるので、前記複製は望まれない。 好ましい態様において、前記核酸分子のうちの１つは相対的に小さく、かつそ の他は相対的に大きい。この形態は有利である。なぜなら、この形態は前記相対 的に小さい核酸分子の操作を簡単にし、たとえば小さい核酸分子の大量の生成を 許すからである。前記小さい核酸分子は、たとえばアデノウイルスベクターライ ブラリーの生成のための異なる目的の核酸を含む。また、前記形態は好ましい。 なぜなら、この形態は質を試験した大きい核酸分子の大バッチ(large batch)の 産生を許すからである。たとえば細菌において、大きい核酸分子の増幅は充分な 量の大きい核酸を得ることの観点から困難である。また、前記大きな核酸の小さ な修飾が簡単には検出できないの で、たとえば細菌において、大きい核酸分子の増幅は、制御することが困難であ る。さらに、いくつかの大きなベクターが、ほかよりも細菌または酵母において 、より安定であることがはっきりと理解されないからである。しかしながら、前 記形態は、大きい核酸分子の標準的なバッチの生成を許す。それは、たとえば対 照のアデノウイルスを生成することにより、充分に試験されることができ、その 産生の効率と信頼性が知られ、前記大きい核酸分子の新しいバッチのパラメータ ーを決定する。一度確認した前記バッチは大量の異なる小さい核酸分子と前記大 きな分子を組合わせることをにより、異なるアデノウイルスベクターを大量に生 成するために用いられ得る。したがって、前記システムは、本発明の大きい核酸 分子を備えたベクターの選択および／または操作を許し、その結果、完全な大き い核酸の適切な収量を許す 本発明の一態様において、前記核酸分子の少なくとも１つが、他の核酸から一 端が本質的に自由であるアデノウイルス逆方向末端反復配列を含む。一端が本質 的に自由であるアデノウイルス逆方向末端反復配列は、本発明の方法または手段 によるアデノウイルスベクターの生成のために必須ではない。しかしながら、一 端が本質的に自由であるアデノウイルス逆方向末端反復配列は、本質的に自由で ないアデノウイルス逆方向末端反復配列と比較して、アデノウイルスベクター産 生の効率を高める。本質的に自由とは、前記逆方向末端反復配列の外部に向かう 末端が追加の核酸塩基に本質的に自由であることを意味する。いくつかの追加の 塩基はアデノウイルスベクターの生成に有意に影響しない。とくに前記追加の塩 基 が50塩基以下、好ましくは30塩基以下およびさらに好ましくは10塩基以下の場合 、影響しない。好ましくは、左ITRおよび右ITRの両方を、外部に向かう側におい て、他の核酸に本質的に自由にする。好ましくは、前記アデノウイルス逆方向末 端反復配列を、前記アデノウイルス逆方向末端反復配列の近くにある制限酵素部 位の制限酵素消化により、一端において他の核酸に本質的に自由にする。好まし くは、前記核酸分子において、前記制限酵素部位が、アデノウイルスベクターの 部分となる核酸中の他の場所にない。 １つの側面において、本発明は、アデノウイルスベクターの生成のための本発 明の方法を提供しており、前記細胞に存在する核酸が、複製コンピテントアデノ ウイルスの形成へ導く配列のオーバーラップを含まない方法を提供する。アデノ ウイルスベクターの生成のための他のシステムは、アデノウイルスベクターの生 成および／または増殖において、複製コンピテントアデノウイルスの生成を充分 に抑制しない。本発明の１つの側面において、たとえばE1領域とアデノウイルス ベクター間の潜在的な相同組換えを妨げるシステムを介して、複製コンピテント アデノウイルスの生成は妨げられる。アデノウイルスベクターが臨床的な設定に おいて用いられる場合、複製コンピテントアデノウイルスの生成を妨げることが 、ひじょうに望まれる。複製コンピテントアデノウイルスの生成を妨げることに よって、アデノウイルス産生の信頼性が増大する。また、複製コンピテントアデ ノウイルスの生成を妨げることによって、アデノウイルスベクター産生の効率が 増大する。 本発明の一態様は、本発明の方法を提供しており、前記細胞の染色体の核酸が 、少なくともアデノウイルスE1領域の機能的部分、またはその機能的な誘導体お よび／または類似体を含む方法を提供する。好ましくは、前記細胞はPER.C6細胞 （ECACC受託番号96022940）またはそれの機能的な誘導体および／または類似体 である。 他の態様において、前記細胞中の前記核酸がさらに、アデノウイルスE2領域お よび／またはアデノウイルスE4領域タンパク質をコードする核酸を含む。 他の態様において、本発明は、アデノウイルスベクターの生成のための方法ま たは手段を提供しており、少なくとも１つの前記核酸分子が直鎖状である。直鎖 状分子はアデノウイルスベクター産生のために必須ではないが、環状またはスー パーコイル状分子を用いる場合に比べて、アデノウイルスベクター産生の効率が 増大する。 １つの態様において、本発明は、本発明による方法であって、少なくとも１つ の前記分子が、少なくとも２つの異なるアデノウイルス血清型由来のアデノウイ ルスキャプシドタンパク質をコードしている核酸を含む方法を提供している。本 発明の本態様は、たとえば、少なくとも２つの異なるアデノウイルス血清型から のタンパク質からなるキメラキャプシドによるアデノウイルス粒子の生成に有用 である。キメラキャプシドの１つの有利な特徴はアデノウイルスベクターの組織 向性を変える能力である。アデノウイルス粒子のキャプシドは、他のものの中で 、粒子が一定の細胞型に侵入し得る（組織向性）か否かの主要な決定子である。 そしてキャプシドを変えることにより、アデノウイルスベクターの組織向性は特 別 な必要性を満足するように変えられ、かつ設計され得る。好ましくは、前記キャ プシドは、アデノウイルス16などのＢ亜群型アデノウイルスのファイバータンパ ク質の少なくとも１つの組織向性決定部分とアデノウイルス５などのＣ亜群型ア デノウイルス由来の少なくとも１つの他のキャプシドタンパク質とを備えている 。好ましくは、前記アデノウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸を含 む前記核酸分子が大きい核酸分子である。したがって前記キメラキャプシドへパ ッケージしたアデノウイルスベクターのライブラリーの容易な生成が可能である 。 他の態様において、本発明は、本発明の方法を提供しており、前記核酸分子の 前記一緒に融合することが、少なくとも２つの機能的なアデノウイルス逆方向末 端反復配列、機能的な封入シグナル、タンパク質をコードする少なくとも１つの E2領域および／またはタンパク質をコードする少なくともひとつのE4領域および 関連の核酸またはそれらの機能的部分、誘導体および／または類似体からなる物 理的に結合した核酸の生成へ導き、タンパク質をコードする少なくとも１つの前 記E1領域が、条件付活性プロモーターの転写制御下にある方法を提供する。条件 付活性プロモーターとは、ある細胞型において活性であって、他の細胞型におい て活性でないプロモーターを意味する。この態様の方法は、条件付活性プロモー ターが前記細胞において活性であることを提供する細胞において複製し得る分子 の生成に、とくに有用である。このような分子は、たとえば導入遺伝子のきわめ て高い発現がとくに抗原提示細胞において要求されるワク チン接種において有用である。この態様のベクターに、さらにアデノウイルスキ ャプシドタンパク質を発現する能力を与えた場合、複製し得る前記ベクターは、 条件付活性プロモーターが細胞において活性である該細胞において、パッケージ されることも可能である。したがって、条件付複製不全アデノウイルスベクター を形成すること。 他の態様において、本発明は、本発明の方法であって、前記物理的に結合する 核酸が、２つの逆方向末端反復配列および機能的なパッケージ化シグナルまたは それらの機能的部分、誘導体および／または類似体 である機能的なアデノウイルス核酸を含み、かつ前記物理的に結合する核酸が２ つの核酸分子を一緒に融合することにより生成され、前記分子が、前記物理的に 結合する核酸の生成を許しつつ、互いに結合し得る部分的なオーバーラップして いる配列を含む方法を提供する。前記物理的に結合する核酸は、好ましくは、さ らに目的の核酸を含む。この設定は好ましい。この設定は、異なる目的の核酸を 含む異なる相対的に小さい核酸分子と１つの試験し、かつ確認した大きい核酸分 子とを結合することにより、最小アデノウイルスベクターの迅速な生成を許す。 さらに本発明は、E2A遺伝子の欠失したアデノウイルスベクターの生成のため の方法であって、細胞に前記核酸分子を与え、かつ該細胞を増殖することからな る方法を提供する。該方法において、第１の核酸が、アデノウイルス逆方向末端 反復配列および封入シグナルまたはそれらの機能的部分、誘導体および／または 類似体、および第２の核酸分子とともに結合されることを許す部分的 にオーバーラップしている配列を含み、 該第２の核酸分子が、アデノウイルス逆方向末端反復配列またはそれらの機能的 部分、誘導体および／または類似体、E2A遺伝子の少なくとも部分および部分的 なオーバーラップしている配列の欠失からなり、 前記細胞が機能的なE2A、好ましくは温度感受性のE2Aを発現することができる。 前記核酸の両方またはどちらか１つは、さらにプロモーターとポリアデニル化シ グナルのような転写ユニットまたはそれらの機能的部分、誘導体および／または 類似体に、操作可能に結合した目的の核酸を含んでもよい。前記部分的にオーバ ーラップしている配列の一緒に融合することは、２本鎖の核酸を正確に結合し得 るいかなる手段によって達成されてよい。好ましくは、前記部分的にオーバーラ ップしている配列は１つの相同組換えによって互いに結合される。好ましい態様 において、前記第２の核酸は、少なくとも前記細胞にあるすべてのE2A配列を欠 失しており、それにより相同組換えを防ぐ。該相同組換えは、前記一緒に融合す ることからもたらされる前記第２の核酸またはその誘導体の前記E2Aの欠失を完 全に破壊する。 さらに本発明は、細胞に核酸分子を与え、該細胞を増殖することを含む、E3領 域に欠失のある複製コンピテントアデノウイルスを生成する方法であって、第１ の核酸が、アデノウイルス逆方向末端反復配列および封入シグナルまたはそれら の機能的部分、誘導体および／または類似体、条件付で機能的なE1領域、および 部分的にオーバーラップしている配列を含み、第２の核酸分子と再び結合するこ とを許す方法を提供する。該第２の核酸は、 アデノウイルス逆方向末端反復配列またはその機能的部分、誘導体および／また は類似体、E3領域の欠失および部分的オーバーラップしている配列を含む。好ま しくは、前記第２の核酸が、E3領域の目的の核酸を含む。さらに好ましくは、前 記目的の核酸が、E3プロモーターに操作可能に結合される。前記目的の核酸は、 自殺遺伝子、サイトカインまたはマーカー遺伝子であってもよい。前記第２の核 酸分子は、２つの部分的にオーバーラップする、より小さい核酸分子の相同組換 えによって前記細胞で生成されてもよい。当該より小さい核酸分子の１つは、目 的の核酸を持つか、または持たない前記E3領域の欠失からなり、かつ当該より小 さい核酸分子の１つだけが、アデノウイルス逆方向末端反復配列を含む。該アデ ノウイルス逆方向末端反復配列は、好ましくは、部分的にオーバーラップしてい る配列の反対側の前記より小さい核酸分子の一端に位置づけられる。さらに本発 明は、細胞に核酸分子を与え、該細胞を増殖することを含む、後期遺伝子の少な くとも１つの修飾とともにアデノウイルスベクターを生成する方法を提供する。 この方法において、第１の核酸分子が、アデノウイルス逆方向末端反復配列およ び封入シグナルまたはそれらの機能的部分、誘導体、および／または類似体、お よび部分的にオーバーラップしている配列、および第２の核酸分子とともに結合 されることを許す部分的にオーバーラップしている配列を含み、該第２の核酸分 子が、アデノウイルス逆方向末端反復配列またはそれらの機能的部分、誘導体お よび／または類似体、後期遺伝子の少なくとも１つの修飾および部分的にオーバ ーラップしている配列を含む。前記後期遺 伝子の少なくとも１つの修飾は、キャプシドタンパク質、好ましくはペントンま たはヘキソンまたはファイバーの１つにおける修飾であり、またはさらに好まし くは、キャプシドタンパク質、より好ましくはヘキソンおよびファイバーの２以 上の修飾である。前記修飾は、変異誘発、欠失、挿入またはそれらの組合せによ り、ヌクレオチド配列の変化であってもよく、たとえば免疫原性、感染能または 安定性における前記アデノウイルスベクターの機能的変化へ導く。好ましくは、 前記修飾は、１または２以上の異なるヒトまたは動物のアデノウイルス血清型か らの相当するキャプシド遺伝子の全部または部分の交換により生成した前記キャ プシド遺伝子の修飾であって、たとえば免疫原性、感染能または安定性における 前記アデノウイルスベクターの機能的変化へ導く。前記第２の核酸分子が、前記 細胞において、２つの部分的にオーバーラップするより小さい核酸分子の相同組 換えによって生成してもよく、少なくとも１つの当該より小さい核酸分子が、１ または２以上のキャプシド遺伝子における前記修飾を含み、１つの前記より小さ い核酸分子だけが、アデノウイルス逆方向末端反復配列またはそれの機能的部分 、誘導体および／または類似体を含む。該アデノウイルス逆方向末端反復配列ま たはそれの機能的部分、誘導体および／または類似体は、好ましくは、前記部分 的にオーバーラップしている配列の反対側の前記より小さい核酸分子の一端に位 置づけられる。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082122として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082119として寄 託した組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082117として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082114として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082120として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082121として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082116として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082115として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、ECACCに番号P97082118として寄託した組換え核酸を提供する 。 さらに本発明は、組換え核酸pWE/Ad.AflII-EcoRIを提供する。 さらに本発明は、図21および図22において示された、アデノウイルス由来ヌク レオチド1-454およびアデノウイルスヌクレオチド3511-6095を含む組換え核酸を 提供する。 さらに本発明は、組換え核酸pAd5/CLIPを提供する。 さらに本発明は、組換え核酸pAd5/L420-HSAを提供する。 さらに本発明は、組換え核酸pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIIIΔgp19KΔXbaIを提供する 。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記核酸がさらに導入遺 伝子を含む組換え核酸を提供す る。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記導入遺伝子が操作可 能にE3プロモーターを結合している組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記導入遺伝子が、自殺 遺伝子、サイトカイン遺伝子またはレポーター遺伝子からなる組換え核酸を提供 する。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記自殺遺伝子がHSV-TK 遺伝子である組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記導入遺伝子がhIL-1 α、ラットIL-3およびヒトIL-3からなる群より選択されたコード配列からなる組 換え核酸を提供する。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記導入遺伝子がルシフ ェラーゼ遺伝子またはLacZ遺伝子からのコード配列からなる組換え核酸を提供す る。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記導入遺伝子がヒトce NOS遺伝子からのコード配列からなる組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、組換え核酸のE3領域における欠失からなる本発明による組換 え核酸を提供する。 さらに本発明は、組換え核酸のgp19K領域における欠失からなる本発明による 組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、アデノウイルスに基づくか、または由来するヌクレオチド配 列を含む組換え核酸であって、前記ヌクレオチド配列が機能的な封入シグナル、 および２つの機能的な逆方向末端反復配列またはそれらの機能 的な断片または誘導体を含み、前記組換え核酸が機能的なアデノウイルス遺伝子 を持たず、前記組換え核酸を細胞に転移し、細胞において複製コンピテントウイ ルスへ導く相同組換えを許すオーバーラップしている配列を持たない組換え核酸 を提供する。好ましくは、前記組換え核酸は、さらに異種のヌクレオチド配列を 含む。 さらに本発明は、組換え核酸pMV/L420-Hを提供する。 さらに本発明は、組換え核酸pMV/CMV-LacZを提供する。 さらに本発明は、アデノウイルスに基づくか、または由来するヌクレオチド配 列を備えた組換え核酸であって、該ヌクレオチド配列が複製およびキャプシド遺 伝子発現のために必要で充分なアデノウイルス配列からなり、 該ヌクレオチド配列が少なくともE1領域および該アデノウイルスの封入シグナル の欠失からなり、 前記組換え核酸を細胞に転移し、細胞において複製コンピテントウイルスへ導く 相同組換えを許す配列を含まない組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、組換え核酸pWE/Ad.Δ5'を提供する。 さらに本発明は、アデノウイルスに基づくか、または由来するヌクレオチド配 列を備えた組換え核酸であって、該ヌクレオチド配列が複製およびキャプシド遺 伝子発現に必要な充分なアデノウイルス配列、および前記核酸の同じ鎖の上流部 分に対する相補配列を備え、 前記相補配列が、核酸ポリメラーゼのための開始部位として機能するため、前記 上流部分と塩基対を形成することができ、 前記ヌクレオチド配列が、前記アデノウイルスの１つの 逆方向末端反復配列、E1領域および封入シグナルの欠失からなり、 前記核酸が、前記組換え核酸を細胞に転移し、細胞において複製コンピテントウ イルスへ導く相同組換えを許すオーバーラップしている配列を含まない組換え核 酸を提供する。好ましくは、前記分子はpWE/AAV.Δ5'である。 さらに本発明は、アデノウイルスに基づくか、または由来するヌクレオチド配 列を備えた組換え核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、アデノウイルスに依 存しない複製のための配列、および複製に必要な充分のアデノウイルス配列を含 み、 前記ヌクレオチド配列が、アデノウイルスのE1領域および封入シグナルを少なく とも１つの欠失からなり、 前記核酸が、前記核酸を細胞に転移し、細胞において複製コンピテントウイルス へ導く相同組換えを許すオーバーラップしている配列をもたない組換え核酸を提 供する。好ましくは、前記ヌクレオチド配列が、さらに少なくとも１つの前記ア デノウイルスの逆方向末端反復配列を含む。好ましくは、前記アデノウイルスに 依存しない複製のための配列がSV40の複製起点を含む。 さらに本発明は、組換え核酸pWE/Ad-Hを提供する。 さらに本発明は、アデノウイルスに基づくか、または由来のヌクレオチド配列 を備えたアダプタープラスミドであって、 該ヌクレオチド配列が、操作可能な立体配置において、少なくとも１つの機能的 な逆方向末端反復配列と、 １つの機能的封入シグナルと、 相同組換えおよび複製欠損組換えアデノウイルスゲノム の生成を許すアデノウイルス配列 とを備え、 前記アダプタープラスミドが、前記アダプタープラスミドを細胞に転移し、細胞 において複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許す配列をもたない アダプタープラスミドを提供する。好ましくは、前記アダプタープラスミドは、 E1領域配列をもたない。好ましくは、前記アダプタープラスミドはマルチクロー ニング部位からなる。また、さらに前記マルチクローニング部位へ挿入された核 酸からなる、本発明によるアダプタープラスミドが好ましい。 他の態様において本発明は、 E1欠失およびgp19K欠失を有する組換えアデノウイルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１のヌクレオチド配列を備え たアダプタープラスミドと、 ii）アデノウイルスに基づくか、または由来する少なくとも１つの第２のヌクレ オチド配列を備えた組換え核酸によってトランスフェクトしたアデノウイルス相 補配列とからなる細胞をE1欠失およびgp19K欠失を有する組換えアデノウイルス が生成する条件下で増殖する工程からなり、 操作可能な立体配置における前記第１のヌクレオチド配列が、 １つの機能的な逆方向末端反復配列と、 １つの機能的な封入シグナルと、 細胞において複製欠損組換えアデノウイルスゲノムの生成を導く相同組換えを許 すアデノウイルス配列 とを備え、 前記アダプタープラスミドがE1領域配列をもたずに、前記細胞に転移され、 前記少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列が 複製のための１つの逆方向末端反復配列および充分なアデノウイルス配列と、 前記アダプタープラスミドと部分的なオーバーラップとからなり、 前記少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列が少なくともE1領域、封入シグナ ルおよびgp19K配列の欠失からなり、 前記相補配列、第１のヌクレオチド配列および少なくとも１つの第２のヌクレオ チド配列が、複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許すオーバーラップ している配列をもたない、 E1欠失およびgp19K欠失を有する組換えアデノウイルスの生成方法を提供する。 好ましくは、前記アダプタープラスミドが、さらに前記E1領域欠失へ挿入された 第１の異種のヌクレオチド配列を含み、かつ前記組換え核酸が、さらに前記gp19 K領域へ挿入された第２の異種のヌクレオチド配列を含む。 他の態様において、本発明は、 組換えアデノウイルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１のヌクレオチド配列を備え た第１の組換え核酸と、 ii）アデノウイルスに基づくか、または由来する第２のヌクレオチド配列を備え た第２の組換え核酸 とによってトランスフェクトしたアデノウイルス相補配 列を含む細胞を組換えアデノウイルスが生成する条件下で増殖する工程からなり 、 前記第１のヌクレオチド配列が、機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な逆 方向末端反復配列またはそれらの機能的な断片または誘導体を備え、かつ前記第 １の組換え核酸が機能的なアデノウイルス遺伝子をもたず、 前記第２のヌクレオチド配列が複製のための充分なアデノウイルス配列からなり 、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくとも該アデノウイルスのE1領域および封入 シグナルの欠失からなり、 前記相補配列、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列が、 複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許すオーバーラップしている配列 をもたない 組換えアデノウイルスの生成方法を提供する。 他の態様において、本発明は、 組換えアデノウイルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１のヌクレオチド配列を備え た第１の組換え核酸と、 ii）アデノウイルスに基づくか、または由来する第２のヌクレオチド配列を備え た第２の組換え核酸 とによってトランスフェクトしたアデノウイルス相補配列からなる細胞を組換え アデノウイルスが生成する条件下で増殖する工程からなり、 前記第１のヌクレオチド配列が、機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な逆 方向末端反復配列またはそれらの機能的な断片または誘導体を備え、かつ前記第 １の組換え核酸が機能的なアデノウイルス遺伝子をもたず、 前記第２のヌクレオチド配列がアデノウイルスに依存しない複製のための配列お よび複製に必要な充分なアデノウイルス配列からなり、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくとも該アデノウイルスのE1領域および封入 シグナルの欠失からなり、 前記相補配列、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列が、 複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許すオーバーラップしている配列 をもたない 組換えアデノウイルスの生成方法を提供する。好ましくは、前記細胞が、前記細 胞がSV40ラージT抗原タンパク質またはその機能的断片を発現する少なくとも１ つの核酸分子を含む。さらに好ましくは、前記第２の組換え核酸分子が複製され る。 １つの態様において、本発明は、アデノウイルスに基づくか、または由来する ゲノムを含む複製欠損アデノウイルスであって、 前記ゲノムが、少なくとも機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な逆方向末 端反復配列またはそれらの機能的断片または誘導体からなり、 前記ゲノムが、 機能的なアデノウイルス遺伝子を含まず、前記複製欠損アデノウイルスを細胞に 転移され、細胞において複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許すオー バーラップしている配列を持たない複製欠損アデノウイルスを提供する。好まし くは、前記複製欠損アデノウイルスは、さらに１または２以上の発現カセットを 含む。好ましくは、前記発現カセットは、転写調節配列に機能的に結合 する遺伝子からなる。 １つの態様において、前記複製欠損アデノウイルスは、さらに１または２以上 の非アデノウイルス核酸配列を含む。好ましくは前記１または２以上の非アデノ ウイルス核酸配列は、E1領域またはE3領域gp19K遺伝子に挿入される。 他の側面において、本発明は、本発明による複製欠損アデノウイルスのゲノム を備えた、ヒト以外の細胞を提供する。好ましくは、該細胞は哺乳動物細胞であ る。 他の側面において、本発明は、細胞が形質導入される条件下で、本発明による 複製欠損アデノウイルスと細胞を接触させる工程を含む、細胞を形質導入するた めの方法を提供する。 他の側面において、本発明は、本発明により産生されたヒト以外の細胞、好ま しくは該細胞が哺乳動物細胞である細胞を提供する。 １つの態様において、本発明は、組換えアデノウイルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１のヌクレオチド配列を備え た第１の組換え核酸と、 ii）アデノウイルスに基づくまたは由来する第２のヌクレオチド配列からなる第 ２の組換え核酸 とによってトランスフェクトしたアデノウイルス相補配列を含む細胞を組換えア デノウイルスが生成する条件下で増殖する工程からなり、 前記第１のヌクレオチド配列が機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な逆方 向末端反復配列またはそれらの機能的な断片または誘導体を備え、かつ前記第１ の組換 え核酸が機能的なアデノウイルス遺伝子をもたず、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくともすべての複製に充分なアデノウイルス 配列、またはそれらの機能的断片または誘導体、および前記核酸と同じ鎖の上流 部分に対する相補配列からなり、 前記相補配列が、前記上流部分が核酸ポリメラーゼのための開始部位として機能 するために、前記上流部分と塩基対を形成することができ、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくとも前記アデノウイルスの１つの逆方向末 端反復配列、E1領域および封入シグナルの欠失からなり、 前記相補配列、前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列 が複製コンピテントウイルスを導く相同組換えを許容するオーバーラップしてい る配列をもたない 組換えアデノウイルスの生成方法を提供する。 他の側面において、本発明は、本発明による組換え核酸および／またはアダプ タープラスミドを含む細胞を提供する。 さらなる側面において、本発明は、宿主細胞ゲノムにおける欠損遺伝子の置換 方法であって、 前記宿主細胞ゲノムにおいて、前記欠損遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が 置換される条件下で前記欠損遺伝子の機能的バージョンまたはその部分を含む複 製欠損アデノウイルス由来の組換え核酸分子とともに、前記宿主細胞を増殖する 工程からなる方法を提供する。 １つの態様において、本発明は、本発明による細胞を形質導入するための方法 であって、前記複製欠損アデノ ウイルスがアデノウイルス遺伝子を発現しない方法を提供する。好ましくは、前 記欠損遺伝子が欠損腫瘍抑制遺伝子である。 さらに本発明は、本発明による複製欠損アデノウイルスのゲノムを含む分離さ れた細胞を提供する。好ましくは、該細胞が、ヒト細胞である。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記E3領域における欠失 が導入遺伝子と置換されている組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸であって、前記gp19K領域における 欠失が導入遺伝子と置換されている組換え核酸を提供する。 さらに本発明は、本発明による方法であって、前記少なくとも１つの第２の核 酸が、第１および第２の分子を含み、前記第１の分子が3'末端に前記アダプター プラスミドとの部分的オーバーラップを有し、かつ前記第２の分子が前記逆方向 末端反復配列および前記gp19K配列の欠失を含む領域を含む方法を提供する。 さらに本発明は、アデノウイルスに基づくか、または由来のゲノムを含む複製 欠損アデノウイルスであって、該ゲノムがE1領域中およびE1領域の第１の欠失お よびgp19K領域中の第２の欠失を含む複製欠損アデノウイルスを提供する。好ま しくは、前記導入遺伝子の転写がE3プロモーターに支配されている。 さらに本発明は、本発明による組換え核酸および／またはアダプタープラスミ ドを含む分離された細胞を提供する。好ましくは前記細胞がヒト細胞である。 以下の実施例は例証として述べられるが、限定として 述べられていない。実施例 実施例Ｉ E1 欠損組換えアデノウイルスベクターをトランス相補transcomlement)できる細 胞株の生成 １．911細胞株 E1欠失組換えアデノウイルスをトランス相補できるアデノウイルス５型のE1配 列を保持する細胞株が作られている（Fallauxら(1996)Hum.Gene Ther.7:215-222 ）。この細胞株は、Ad5のnt.80-5788を含有するpAd5XhoICによるヒト二倍体ヒト 胚網膜芽細胞（HER）のトランスフェクションによって得られたもので、生成し た形質転換体の一つが911と名づけられた。この細胞株はE1欠損組換えアデノウ イルスの増殖に役立つことが示されている。これは293細胞より優れていること がわかった。293細胞とは異なり、911細胞は完全に形質転換された表現型を欠き 、おそらくそれがアデノウイルスパッケージング株としてよりよく機能する原因 だろう。すなわち、より早くプラークアッセイを行うことができ（293では8〜14 日だが、4〜5日）、911細胞の単層はプラークアッセイに必要とされる寒天重層 下でよりよく生存でき、E1欠失ベクターがより高度に増幅される。 また、剪断されたアデノウイルスDNAでトランスフェクトされた293細胞とは異 なり、911細胞は明確な構築物を使ってトランスフェクトされた。911細胞のトラ ンスフェクション効率は293細胞のそれに匹敵する。新しいパッケージング構築物 アデノウイルス配列の供給源 アデノウイルス配列はヒトアデノウイルス５型のnt.80-9460を含有するpAd5.S alB(Bernardsら(1983)Virology 127：45-53)か、野生型Ad5 DNAから得られる。p Ad5.SalBをSalIとXhoIで消化し、大断片を再連結し、その新しいクローンをpAd5 .X/Sと命名した。pTN構築物（オランダ・IntroGene社のR.Vogels博士が構築した もの）をヒトPGKプロモーターとNEO遺伝子の供給源として使用した。ヒトPGKプロモーターとNEO^R遺伝子 新しいパッケージング構築物中のE1A配列の転写は、pUC119（Vieriaら(1987)3 -11頁：Methods in Enzymology（Acad.Press社））を骨格として使用するプラス ミドpTN(R.Vogels氏から寄贈)由来のヒトPGKプロモーター(Michelsonら(1983)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 80:472-476；Singer-Samら(1984)Gene 32:409-417)によ って制御される。このプラスミドを、B型肝炎ウイルス（HBV）ポリアデニル化シ グナルに融合したNEO遺伝子の供給源としても使用した。E1 遺伝子へのPGKプロモーターの融合（図1） Ad5のE1配列（ITR、複製起点およびパッケージングシグナル）を異種配列で置 換するために、本発明者らは、プライマーEa1とEa2（表１参照）を用い、PCRに よってAd5のE1配列（nt.459からnt.960まで）を増幅した。得られたPCR産物をCl aIで消化し、ClaIとEcoRVで前もって消化しておいたBluescript（Stratagene社 ）に連結して、構築物pBS.PCRIを得た。 ベクターpTNを制限酵素EcoRI（部分的）とScaIで 消化し、PGKプロモーター配列を含有するDNA断片を、ScaIとEcoRIで消化したPBS .PCRIに連結した。得られた構築物PBS.PGK.PCRIは、nt.459からnt.916までのAd5 E1配列に操作可能に連結されたヒトPGKプロモーターを含有する。pIG.E1A.E1B の構築（図2） pIG.E1A.E1B.XはPGKプロモーターの指揮下にE1Aコード配列とE1Bコード配列を 含有する。この構築物にはnt.459からnt.5788までのAd5配列が存在するので、ア デノウイルスのpIXタンパク質もこのプラスミドによってコードされる。pIG.E1A .E1B.Xは、pAT-X/SのScaI-BspEI断片をPBS.PGK.PCRI(E1A配列に結合されたPGKプ ロモーターを含有する)の対応する断片で置換することによって作製された。pIG.E1A.NEO の構築（図3） 完全なE1Bプロモーターを導入し、このプロモーターをE1B 21kDのAUGコドンが NEO^RのAUGコドンとして正確に機能するように融合させるために、プライマーEa3 とEp2を使ってE1Bプロモーターを増幅した。ここにプライマーEp2はそのPCR断片 にNcoI部位を導入する。PCRIIと命名された得られたPCR断片をHpaIとNcoIで消化 し、HpaIとNcoIで前もって消化しておいたpAT-X/Sに連結した。得られたプラス ミドをpAT-X/S-PCR2と命名した。NEO遺伝子とＢ型肝炎ウイルス(HBV)ポリアデニ ル化シグナルの一部を含有するpTNのNcoI-StuI断片を、NcoIとNruIで消化してあ るpAT-X/SPCR2にクローニングした。得られた構築物はpAT.PCR2.NEOであった。p AT.PCR2.NEOのScaI-SalI断 片をpTNの対応する断片で置換してpAT.PCR2.NEO.p(A)を得ることにより、ポリア デニル化シグナルを完成させた。pAT.PCR2.NEO.p(A)のScaI-XbaIを、E1A遺伝子 に連結されたPGKプロモーターを含有するpIG.E1A.E1B-Xの対応する断片で置換し た。得られた構築物をpIG.E1A.NEOと命名したが、これはAd5 E1配列(nt.459から nt.1713まで)をヒトPGKプロモーターの制御下に含有する。pIG.E1A.E1B の構築（図4） pIG.E1A.E1BはE1Aタンパク質とE1Bタンパク質をコードするAd5のnt.459からnt .3510までを含有する。E1B配列はnt.3511のスプライス受容部位で終わっている 。この構築物にはpIX配列は存在しない。 pIG.E1A.E1Bは次のように作製した：E1B 55kDのN末端アミノ酸をコードする配 列をプライマーEb1とXhoI部位を導入するEb2を使って増幅した。得られたPCR断 片をBglIIで消化し、pAT-X/SのBglII/NruIにクローニングすることにより、pAT- PCR3を得た。pIG.E1A.NEOのXba-SalI断片とpAT.PCR3のXbaI-XhoI断片の交換によ り、pIG.E1A.NEOのHBVポリ(A)配列をpAT-PCR3のE1B配列の下流に導入した。pIG.NEO の構築（図5） この構築物は、樹立細胞をEIA.E1B構築物でトランスフェクトしてNEO選択が必 要な場合に役立つ。NEO発現はE1Bプロモーターによって指示されるので、NEO耐 性細胞はE1Aを共発現すると期待され、それはそれら細胞の長期培養中にE1の発 現レベルを高く保つためにも有利である。pIG.NEOは、Ad5 E1Bプロモーターの 制御下にNEO遺伝子を含有するpIG.E1A.NEOのHpaI-ScaI断片を、EcoRVとScaIで消 化したpBSにクローニングすることによって生成させた。構築物の試験 構築物pIG.E1A.NEO、pIG.E1A.E1B.XおよびpIG.E1A.E1Bの完全性を制限酵素マ ッピングによって評価し、さらに、PCR分析によって得られるそれら構築物の一 部を配列分析によって確認した。ヌクレオチド配列の変化は見出されなかった。 それらの構築物を初代BRK(乳呑みラット腎臓)細胞にトランスフェクトし、そ れらの細胞を不死化する能力（pIG.E1A.NEO）または完全に形質転換する能力（p Ad5.XhoIC、pIG.E1A.E1B.XおよびpIG.E1A.E1B）について試験した。６日齢WAG-R ijラットの腎臓を分離し、ホモジナイズし、トリプシン処理した。BRK細胞培養 のサブコンフルエント(subconfluent)培養皿(直径5cm)を１または5μgのpIG.NEO 、pIG.E1A.NEO、pIG.E1A.E1B、pIG/E1A.E1B.X、pAd5XhiICでトランスフェクトす るか、pIG.E1A.NEOと、Ad5.E1B遺伝子をSV40初期プロモーターの制御下に持つPD C26（Elsenら(1983)Virology 128:377-390）とでトランスフェクトした。トラン スフェクションの３週間後に、フォーカスが現れてから、それらの培養皿を固定 し、ギムザ染色し、フォーカスを数えた。 生成したアデノウイルスパッケージング構築物の概要とそれらのBRK形質転換 能力を図６に示す。これらの結果は、構築物pIG.E1A.E1BとpIG.E1A.E1B.XがBRK 細胞を用量依存的に形質転換できることを示している。 形質転換の効率はどちらの構築物も同等であり、911細胞を作製するために使用 された構築物、すなわちpAd5.XhoICで見られたものに匹敵する。 予想通り、pIG.E1A.NEOはBRKをほとんど不死化できなかった。しかし、E1B発 現構築物（PDC26）のコトランスフェクションは形質転換体数の有意な増加をも たらし（18対1）、pIG.E1A.NEOによってコードされるE1Aが機能的であることを 示した。したがって本発明者らは、これら新たに生成したパッケージング構築物 が新しいアデノウイルスパッケージングシステムの生成に適していると結論する 。新しいパッケージング構築物による細胞株の生成、細胞株および細胞培養 ヒトA549気管支癌細胞（Shapiroら(1978)Biochem.Biophys.Acta 530:197-207 ）、ヒト胎児網膜芽細胞（HER）、Ad5-E1形質転換ヒト胎児腎臓（HEK）細胞（29 3；Grahamら(1977)J.Gen.Virol.36:59-72）とAd5形質転換HER細胞（911；Fallau xら(1996)Hum.Gene Ther.7:215-222）およびPER細胞を、10％ウシ胎仔血清（FCS ）と抗生物質類を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中、5％CO₂雰囲 気下に37℃で生育した。細胞培養培地、試薬類および血清はGibco Laboratories 社（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。プラスチック培養器具 はGreiner社（ドイツ・ニュルチンゲン）とCorning社（ニューヨーク州コーニン グ）から購入した。ウイルスとウイルス技術 組換えアデノウイルスベクターIG.Ad.MLP.nls.lacZ、 IG.Ad.NILP.luc、IG.Ad.MLP.TKおよびIG.Ad.CW.TKの構築はヨーロッパ特許出願 公開第EP95202213号公報に詳述されている。組換えアデノウイルスベクターIG.A d.MIP.nls.lacZは、β-ガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺伝子を、Ad2 主要後期プロモーター（MLP）の制御下に含有し、IG.AdMLP.lucはAd2 MLPによっ て制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有し、アデノウイルスベクターIG .Ad.NLP.TKとIG.Ad.CMV.TKは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝 子をそれぞれAd2 MLPとサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー/プロモータ ーの制御下に含有する。トランスフェクション トランスフェクションはすべて、GIBCOリン酸カルシウムトランスフェクショ ンシステム（GIBCO BRL Life Technologies社，米国ゲーサースバーグ）により 、製造者のプロトコルに従って、リン酸カルシウム沈殿DNA法（Grahamら(1973)V irology 52：456-467）で行った。ウェスタンブロッティング 指数増殖期の293細胞、911細胞、Ad5-E1形質転換A549およびPER細胞のサブコ ンフルエント培養物をPBSで洗浄し、Fos-RIPA緩衝液（10mMトリス（pH7.5）、15 0mM NaCl、1％NP40、01％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1％NA-DOC、0.5mmフ ェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、0.5mMトリプシン阻害剤、50mMNaFお よび1mMバナジン酸ナトリウム）中でこすり落とした。室温で10分後に、溶解液 を遠心分離によって 清澄化した。タンパク質濃度をBioRadタンパク質検定キットで測定し、25μgの 全細胞タンパク質を12.5％SDS-PAAゲルにのせた。電気泳動後に、タンパク質を ニトロセルロースに移した(300mAで１時間)。染色済み標品（米国Sigma社）を平 行して泳動した。フィルターを、TBST（10mMトリス、pH8.15mMNaClおよび0.05％ Tween-20）中、1％ウシ血清アルブミン（BSA）で１時間遮断した。一次抗体はマ ウスモノクローナル抗Ad5-EIB-55-kDA抗体A1C6（Zantemaら、未公表）、ラット モノクローナル抗Ad5-E1B-221-kDa抗体C1G11（Zantemaら(1985)Virology 142：4 4-58）とした。二次抗体はセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗 体（Promega社）とした。シグナルは増大した化学発光（enhanced chemolumines cence）（英国Amersham社）によって視覚化した。サザンブロット分析 高分子量DNAを単離し、10μgを完全に消化し、0.7％アガロースゲルで分画し た。HybondN+(英国Amersham社）へのサザンブロットトランスファーは0.4M NAOH 、0.6M NaClトランスファー溶液で行った(ChurchおよびGilbert,1984)。ハイブ リダイゼーションは、pAd5.SalBから得られる2463ヌクレオチドのSspI-HindIII 断片を使って行った（Bernardsら(1983)Virology 127:45-53）。この断片はAd5 のbp.342-2805からなる。その断片を、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー とクレノーDNAポリメラーゼを使って、α^-32P=dCTPで標識した。そのサザンブロ ットをKodak XAR-5フィルムに−80℃で露出し、蛍光体撮像装置（Phosphor-Imag er）スクリーン に露出して、それをB&Lシステムズ・モレキュラー・ダイナミック・ソフトウェ アで分析した。A549 Ad5-E1形質転換A549ヒト気管支癌細胞株を、pIG.E1A.NEOによるトランスフェ クションとG418耐性の選択によって生成させた。31個のG418耐性クローンを樹立 した。pIG.E1A.E1BとpIG.NEOのコトランスフェクションにより、７つのG418耐性 細胞株が得られた。PER Ad5-E1形質転換ヒト胎児網膜（HER）細胞を、初代HER細胞のプラスミドpIG.E1 A.E1Bによるトランスフェクションで生成させた。形質転換された細胞株を十分 に独立しているフォーカスから樹立した。本発明者らは７つのクローン細胞株を 樹立することができた。本発明者らはそれらをPER.C1、PER.C3、PER.C4、PER.C5 、PER.C6、PER.C8およびPER.C9と名付けた。これらPERクローンの一つ、すなわ ちPER.C6は、ECACCに受託番号96022940として寄託されている。形質転換A549およびPER細胞におけるAd5 E1A遺伝子とE1B遺伝子の発現 樹立A549およびPER細胞におけるAd5 E1Aタンパク質と55kDaおよび21kDaE1Bタ ンパク質の発現を、モノクローナル抗体（mAb）を用いたウェスタンブロティン グで調べた。mAb M73はE1A産物を認識し、MabAIC6とC1G11はそれぞれ55kDa E1B タンパク質と21kDa E1Bタンパク質に対するものである。これらの抗体は親A549 細胞または初代HER細胞から得られる抽出物中のタンパク質を認識しなかった（ 非掲載データ）。 pIG.NEOとpIG.E1A.E1Bのコトランスフェクションによって生成したA549クローン はいずれも検出可能なレベルのE1AまたはE1Bタンパク質を発現しなかった(非掲 載)。pIG.E1A.NEOによるトランスフェクションで生成したA549クローンの一部は 、Ad5 E1Aタンパク質を発現したが（図7）、そのレベルは293細胞から得られる タンパク質溶解物中に検出されるものよりはるかに低かった。PER細胞から得ら れるタンパク質抽出物中に検出される定常状態E1Aレベルは、A549由来の細胞か ら得られる抽出物中に検出されるものよりはるかに高かった。すべてのPER細胞 株は同等レベルのE1Aタンパク質を発現した（図7）。E1Bタンパク質の発現は、 特にE1B 55kDaの場合は、より可変的だった。911と293を比較すると、PERクロー ンの大半は高レベルのE1B 55kDaおよび2kDaを発現する。E1B 21kDaの定常状態レ ベルはPER.C3で最も高かった。PERクローンはいずれも、細胞の連続継代培養時 にAd5 E1遺伝子の発現を失わなかった（非掲載）。本発明者らはPER細胞におけ るE1発現のレベルが、少なくとも100個体数倍加期間にわたって、安定なままで あることを見出した。本発明者らはPERクローンをより詳細に特徴づけることに した。PER クローンのサザン分析 各PERクローンにおけるAd5-E1コード配列の配置を調べるために、本発明者ら はサザン分析を行った。細胞DNAをすべてのPERクローンと、293細胞および911細 胞から抽出した。そのDNAを、Ad5 E1領域中で１回だけ切断するHindIIIで消化し た。放射標識Ad5-E1特異的プローブを使ったHindIII消化DNAでのサザンハ イブリダイゼーションにより、PERクローンのゲノムに数コピーのpIG.E1A.E1Bが 組み込まれていることが明らかになった。図８は、様々なPER細胞株の高分子量D NAでのE1配列の分布パターンを示す。コピーが単一バンドに濃縮されることから 、それらが縦列型反復配列として組み込まれることが示唆される。PER.C3、C5、 C6およびC9については、pIG.E1A.E1Bの短縮型(truncated)コピーの存在を示す低 分子量のハイブリッド形成バンドも見つかった。蛍光体撮像装置（Phosphor-Ima ger）を使ってコピー数を決定した。本発明者らは、PER.C1、C3、C4、C5、C6、C 8およびC9がそれぞれ2、88、5、4、5、5および３コピーのAd5 E1コード領域を含 有し、911細胞と293細胞がそれぞれ１および４コピーのAd5 E1配列を含有すると 見積もった。トランスフェクション効率 組換えアデノベクターはアダプタープラスミドとAd5の大ClaI断片の293細胞へ のコトランスフェクションによって生成される（ヨーロッパ特許出願公開第EP95 202213号公報）。組換えウイルスDNAは、そのプラスミドとアデノウイルスDNA中 に存在する相同なウイルス配列間の相同組換えによって形成される。この方法の 効率は、代替法の効率と同様に、ヘルパー細胞のトランスフェクション性(trans fectability)に著しく依存する。そこで本発明者らは、大腸菌β-ガラクトシダ ーゼをコードするLacZ遺伝子をリポーターとして使用することにより、いくつか のPERクローンのトランスフェクション効率を911細胞と比較した（図9）。組換えアデノウイルスの産生 様々なアデノウイルスベクターによる293、911、PER.C3、PER.C5およびPER.C6 の接種後に得られる組換えアデノウイルスの収量を表IIに記載する。 これらの結果は、PER細胞で得られる組換えアデノウイルスベクター収量が既 存の細胞株で得られるものと少なくとも同程度に高いことを示している。また、 新規アデノウイルスベクターIG.Ad.MLPI.TKの収量は他のウイルスベクターで得 られる収量と同等またはそれ以上である。新しいアデノウイルスベクターの生成（図10） 使用した組換えアデノウイルスベクター（ヨーロッパ特許出願公開第EP952022 13号公報参照）は、459からnt.3328までのE1配列が欠失される。構築物pE1A.E1B は459からnt.3510までのAd5配列を含有するので、パッケージング構築物pIG.E1A .E1Bと例えばIG.Ad.MLP.TKなどの組換えアデノウイルス中のE1B配列間には183ヌ クレオチドの配列オーバーラップがある。このオーバーラップしている配列を新 しいアデノウイルスベクターから欠失させた。また、元の構築物中に存在するLa cZ由来の非コード配列も欠失させた。これは、プライマーSV40-1（BamHI部位を 導入する）とSV40-2(BglII部位を導入する)を使ったpMLP.TKからのSV40ポリ（A ）配列のPCR増幅によって達成した(図10参照)。また、この構築物中に存在するA d5配列をnt.2496（Ad5-1、BgIII部位を導入する）からnt.2779（Ad5-2）まで増 幅した。両PCR断片をBgIIIで消化し、連結した。その連結産物をプライマーSV40 -1とAd5-2を使ってPCR増幅した。得られたPCR産物をBamHIとAflIIで切断 し、同じ酵素で前もって消化しておいたpMLP.TKに連結した。得られた構築物は 、pMLPI.TKと命名し、nt.459からnt.3510までのアデノウイルスE1配列に欠失を 含む。パッケージングシステム 配列オーバーラップを一切持たない新しいパッケージング構築物pIG.E1A.E1B と組換えアデノウイルスpMLPI.TKの組み合わせを図11に示す。この図には元の状 態も記載し、そこには配列オーバーラップを示す。pIG.E1A.E1BとpMLPI.TKの間 にオーバーラップしている配列がないこと（図11a）は、このパッケージング構 築物と組換えウイルスの間で相同組換えが起こる可能性を排除するので、これは 元の状態と比較して組換えアデノウイルスの産生に関して有意義な改良である。 図11bにはpIG.E1A.NEOとIG.Ad.MLPI.TKに関する状況を示す。樹立細胞にトラ ンスフェクトされた場合、pIG.E1A.NEOはE1欠失組換えアデノウイルスの増殖を 支援するのに足りると予想される。この組み合わせは配列オーバーラップを一切 持たず、相同組換えによるRCAの生成が防止される。また、この便利なパッケー ジングシステムは、E1A配列だけが欠失されE1B配列が欠失されない組換えアデノ ウイルスの増殖を可能にする。 E1Bタンパク質、特にEIB 19kDは、感染したヒト細胞が腫瘍壊死因子（TNF）に よって溶解されるのを防止できるので、E1Aの不在下にE1Bを発現させる組換えア デノウイルスは魅力的である（Goodingら(1991)J.Viol.65:3083-3094）。pMLPI.TK 由来の組換えアデノウイルスの生成 SalIで直鎖化したpMLPI.TKDNAとClaIで直鎖化したAd5野生型DNAによる293細胞 のコトランスフェクションで組換えアデノウイルスを生成させた。その方法を図 12に模式図的に示す。実施例２ 組換えアデノウイルスベクターの迅速なRCAフリー（RCA-free）の生成用のプラ スミド型システム Ａ．アデノウイルスクローンの構築 pBr/Ad.Bam-rITR （ECACC寄託物P970821212） ITR配列の平滑末端クローニングを容易にするために、野生型ヒトアデノウイ ルス５型（Ad5）DNAを過剰量のdNTPの存在下にクレノー酵素によって処理した。 クレノー酵素の不活化およびフェノール/クロロホルム抽出とそれに続くエタノ ール沈殿による精製後に、DNAをBamHIで消化した。このDNA沈殿物をそれ以上精 製することなく、次のように調製したpBr322由来のベクターDNAとの連結反応に 使用した：pBr322DNAをEcoRVとBamHIで消化し、TSAP酵素（Life Technologies社 ）による処理で脱リン酸化し、LNPアガロースゲル（SeaPlaque GTG）で精製した 。コンピテント大腸菌DH5α（Life Techn.社）への形質転換とアンピシリン耐性 コロニーの分析後に、Ad5中のBamHI部位から右ITRに達するインサートに予想さ れる消化パターンを示す一つのクローンを選択した。右ITRのクローニング境界 の配列分析を行ったところ、ITRの最も3'側のG残基が欠けていることが明らかに なり、ITRの残りの部分は正しいことがわかった。その欠落G残基は複製中に他の ITRによって補完される。pBr/Ad.Sal-rITR （ECACC寄託物P97082119） pBr/Ad.Bam-rITRをBamHIとSalIで消化した。アデノウイルスインサートを含む ベクター断片をLMPアガロース（SeaPlaque GTG）で単離し、野生型Ad5 DNAから 得た4.8kb SallBamHI断片に連結し、ジーンクリーンII（Geneclean II）キット （Bio 101社）で精製した。一つのクローンを選択し、Ad5配列の完全性を制限酵 素分析で確認した。クローンpBr/Ad.Sal-rITRはbp 16746にあるSalI部位からrIT Rまでで、（最も3'側のＧ残基を欠く）rITRを含むアデノ５型配列を含有する。 pBr/Ad.Cla-Bam （ECACC寄託物P97082117） 野生型アデノ５型DNAをClaIとBamHIで消化し、電気溶出で20.6kb断片をゲルか ら単離した。pBr322を同じ酵素で消化し、ジーンクリーン（Geneclean）を使っ てアガロースゲルから精製した。両断片を連結し、コンピテントDH5αに形質転 換した。得られたクローンpBr/Ad.Cla-Bamを制限酵素消化によって分析したとこ ろ、bp919から21566までのアデノウイルス配列を持つインサートを含有すること が明らかになった。 pBr/Ad.AfII-Bam （ECACC寄託物P97082114） クローンpBr/Ad.Cla-BamをEcoRI(pBr322中)で直鎖化し、AflIIで部分消化した 。AflIIを65℃で20分間熱失活させた後、断片の両端をクレノー酵素で補充した 。次にそのDNAを、PacI部位を含む平滑二本鎖オリゴリンカー（5'-AATTGTCTTAAT TAA CCGCTTAA-3'）に連結した。このリンカーは二本のオリゴヌクレオチド5'-AAT TGTCTTAATTAACCGC-3'と5'-AATTGCGGTTAATTAAGAC-3'をアニーリングした後、クレ ノー酵素で平滑 化することによって作製した。緩衝液を変えるために連結したDNAを沈殿させた 後、そのオリゴのコンカテマーを除去するために、その連結産物を過剰のPacI酵 素で消化した。bp3534から21566までのAd5配列を含有する22016bpの部分断片をL MPアガロース(SeaPlaque GTG)で単離し、再連結し、コンピテントDH5αに形質転 換した。大きいアデノ断片を保っていて、PacI部位を含有することがわかった一 つのクローンを選択し、（失われた）AflII部位へのPacIリンカーの正しい挿入 を確認するために、その5'末端を配列決定した。 pBr/Ad.Bam-rITRpac#2 （ECACC寄託物P97082120）とpBr/Ad.Bam-rITR#8（ECACC 寄託物P97082121） クローンpBr/Ad.Bam-rITR中のAd5のITR近くにPacI部位を挿入できるように、p Br322骨格中のClaI部位とITR配列の開始点の間の約190ヌクレオチドを除去した 。これは次のように行った：pBr/Ad.Bam-rITRをClaIで消化し、ヌクレアーゼBal 31で様々な時間（2'、5'、10'および15'）処理した。ヌクレオチド除去の程度は 、同じ緩衝液と条件を使って、pBr322 DNA（やはりClaI部位で消化したもの）で の別途の反応で追跡した。Bal31酵素を75℃で10分間のインキュベーションによ って失活させ、DNAを沈殿し、より少量のTE緩衝液に再懸濁した。平滑末端を保 証するため、さらにDNAを過剰のdNTPの存在下にT4DNAポリメラーゼで処理した。 SalIによる（対照）pBr322 DNAの消化後、10分間または15分間処理した試料に良 好な分解（〜150bp）が観察された。次に、10分間または15分間処理したpBr/Ad. Bam-rITR試料を上述の平滑PacIリンカーに連 結した（pBr/Ad.AflII-Bam参照）。連結産物を沈殿によって精製し、過剰のPacI で消化し、LMPアガロースゲルでリンカーから分離した。再連結後に、DNAをコン ピテントDH5aに形質転換し、コロニーを分析した。ほぼ望ましい長さの欠失を示 す10個のクローンを選択し、それらをTトラックシークエンシング（T7シークエ ンシングキット、Pharmacia Biotech社）でさらに分析した。RITRのすぐ下流に 挿入されたPacIリンカーを持つ２つのクローンが見つかった。PacIによる消化後 に、クローン#2には28bp、クローン#8には27bpが、そのITRに加えられていた。 pWE/Ad.AflII-rITR （ECACC寄託物P97082116） さらに大きいAd5インサートをクローン化するために、コスミドベクターpWE15 (Clontech社)を使用した。まず、単一のPacI部位を含有するリンカーをpWE15のE coRI部位に挿入して、pWE.pacを作製した。そのために、pBr/Ad.AflII-BamHIに ついて記述したような二本鎖PacIオリゴ、ただしここではEcoRI突出末端を持つ ものを使用した。次に、下記の断片をアガロースゲルから電気溶出によって単離 した:PacIで消化したpWE.pac、PacIとBamHIで消化したpBr/AflII-Bam、およびBa mHIとPacIで消化したpBr/Ad.Bam-rITR#2。これらの断片を合わせて記載し、λフ ァージパッケージング抽出物（Stratagene社）を使用して製造者のプロトコルに 従ってパッケージングした。宿主細菌への感染後に、コロニーを平板上で生育し 、完全なインサートの存在について分析した。pWE/Ad.AflII-rITRは、bp 3534(A flII部位)から右ITR(最も3'側のG残基を欠く右ITRを含む)ま で、すべてのアデノウイルス５型配列を含有する。 pBr/Ad.IITR-Sal （9.4）（ECACC寄託物P97082115） アデノ５野生型DNAを過剰のdNTPの存在下にクレノー酵素で処理し、次にSalI で消化した。得られた断片のうちの２つ(それぞれ左ITR-Sal(9.4)およびSal(16. 7)-右ITRと命名)をLMPアガロース（Seqplaque GTG）で単離した。pBr322 DNAをE coRVとSa1Iで消化し、ホスファターゼ（Life Technologies社）で処理した。ベ クター断片をジーンクリーン（Geneclean）法（BIO 101社）を使って単離し、Ad 5 SalI断片に連結した。9.4kb断片との連結産物だけがインサートを持つコロニ ーを与えた。クローニング境界の分析と配列決定後に、完全なITR配列を含み、b p9462にあるSalI部位に達する１つのクローンを選択した。 pBr/Ad.1ITR-Sal(16.7) （ECACC寄託物P97082118） pBr/Ad1ITR-Sal（9.4）をSalIで消化し、脱リン酸化する（TSAP、Life Techno logies社）。このクローンをAd5中の第３のSalI部位まで伸長するために、pBr/A d.Cla-BamをBamHIで直鎖化し、SalIで部分消化した。9462-16746のアデノウイル ス配列を含有する7.3kbのSalI断片をLMPアガロースゲルで単離し、SalIで消化し たpBr/Ad.IITR-Sal（9.4）ベクター断片に連結した。 pWE/Ad.AflII-EcRI pWE.pacをClaIで消化し、その5'突出末端をクレノー酵素を用いて補充した。 次にそのDNAをPacIで消化し、アガロースゲルから単離した。pWE/AflII-rITRをE coRIで消化し、クレノー酵素で処理した後、PacIで消 化した。アデノウイルス配列を含有する大きい24kb断片をアガロースゲルから単 離し、ClaIで消化し平滑化したpWE.pacベクターに、Clontech製のライゲーショ ン・エキスプレス（Ligation Express^tm）キットを用いて連結した。Stratagene 製のウルトラコンピテント（Utracompetent）XL10-Gold細胞の形質転換後に、予 想されるインサートを含有するクローンを同定した。pWE/AflII-EcoRIはbp 3534 -27336のAd5配列を含有する。Ｂ．新しいアダプタープラスミドの構築 組換えアデノウイルスとパッケージング細胞株中のE1配列の間に配列オーバー ラップが存在しないことは、新しい組換えウイルスの安全なRCAフリーの生成と 増殖にとって必須である。アダプタープラスミドpMLPI.TK(図10)は、本発明の改 良型パッケージング細胞株と組み合わせて本発明に従って使用するように設計さ れたアダプタープラスミドの一例である。このプラスミドを、特異的プロモータ ーと遺伝子配列からなる核酸分子を容易に交換できる新しいベクターを作製する ための出発物質として使用した。 まず、PCR断片を、pZipΔMo+PyF101（N^-）テンプレートDNA（PCT/NL96/00195 に記載）から、次のプライマーを使って生成させた:LTR-1:5'-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CAT GGA AAA ATA CAT AAC TG-3'およびLTR-2：5'-GCG GAT CCT TCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGG GCG ACT CAG TCA ATC G-3'。Pwo DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim社）を製造者のプロト コルに 従って次の温度サイクルで使用した:95℃で５分間、55℃で３分間および72℃で １分間を１回；95℃で１分間、60℃で１分間、72℃で１分間を30サイクル、次に 72℃で10分間を１回。次にそのPCR産物をBamHIで消化し、PvuIIおよびBamHIで消 化したpMLP10（Levreroら(1991)Gene 101:195-202）ベクターに連結することに より、ベクターpLTR10を作製した。このベクターはbp 1からbp 454までのアデノ ウイルス配列を含有し、その後ろに、野生型エンハンサー配列が突然変異型ポリ オーマウイルス（PyF101）由来のエンハンサーで置換されているMo-MuLV LTRの 一部を含むプロモーターが続いている。そのプロモーター断片をL420と命名した 。 次に、マウスHSA遺伝子のコード領域を挿入した。pLTR10をBstBIで消化した後 、クレノー処理とNcoIによる消化を行った。HSA遺伝子は、次のプライマーを用 いて、pUC18-HSA(Kayら(1990)J.Immunol.145:1952-1959)でのPCR増幅によって得 た：HSA1，5'-GCG CCA CCA TGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3'およびHSA2，5'-GTTA GA TCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATG TAG AA-3'。その26 9bp増幅断片をNcoI部位とBglII部位を使ってシャトルベクターにサブクローニン グした。配列決定により、HSA遺伝子の正しいが、しかしTAG停止コドンのすぐ後 ろに余分なTAG挿入を持つコード配列の組込みが確認された。次に、HSA遺伝子の コード領域を、そのTAG重複を含めて、NcoI（付着）-SalI（平滑）断片として切 り出し、pLTR10由来の3.5kbNcoI（付着）/BstBI(平滑）断片にクローニングする ことにより、pLTR-HSA10を得た。 最後に、pLTR-HSA10をEcoRIとBamHIで消化した後、左ITR、パッケージングシ グナル、L420プロモーターおよびHSA遺伝子を含有する断片を、同じ酵素で消化 したベクターpMLPI.TKに挿入することにより、そのプロモーターと遺伝子配列を 置換した。これにより、プロモーターと遺伝子配列の周辺に便利な種々の制限酵 素の認識部位を含有する新しいアダプタープラスミドpAd/L420-HAS（図21）が得 られた。SnaBIとAvrIIはプロモータ配列を交換するためにHpaI、NheI、KpnI、Hi ndIIIと組み合わせることができ、後者はこの構築物中の遺伝子を置換するため にHSAコード領域の3'側にあるClaIまたはBamHI部位と組み合わせることができる 。 核酸分子の容易な交換が可能なように設計されたもう一つのアダプタープラス ミドを、pAd/L420-HSA中のプロモーター、遺伝子およびポリA配列を、CMVプロモ ーター、マルチクローニング部位、イントロンおよびポリAシグナルで置き換え ることによって作製した。そのために、pAd/L420-HSAをAvrIIとBglIIで消化した 後、平滑末端を得るためにクレノーで処理した。pBr322ベクター配列とアデノウ イルス配列を持つ5.1kb断片を単離し、HhaIおよびAvrIIによる消化とそれに続く T4DNAポリメラーゼでの処理によって得たpcDNA1/amp（Invitrogen社）の平滑末 端1570bp断片に連結した。このアダプタープラスミドをpCLIPと命名した(図22) 。Ｃ．組換えアデノウイルスの生成 野生型E3配列を持つE1欠失組換えアデノウイルス 新しいプラスミド型システムでE1欠失組換えアデノ ウイルスを生成させるために、次の構築物を調製した：オーバーラップしている アデノウイルスゲノム断片の3'側を切断する制限酵素によって直鎖化された目的 遺伝子を持つ発現カセットを含有するアダプター構築物で、好ましくはpBr322ベ クター配列を一切含まないもの；およびPacIで消化された相補アデノウイルスゲ ノム構築物pWE/Ad.AflII-rITR。 これら２つのDNA分子をフェノール/クロロホルムeとETOH沈殿によってさらに 精製する。これらのプラスミドのアデノウイルスパッケージング細胞株、好まし くは本発明の細胞株へのコトランスフェクションは、アダプターと相補構築物の 間の一段階相同組換えによって、複製不能アデノウイルスを生成する（図23）。 あるいは、pWE/Ad.AflII-rITRの代わりに他の断片を使用することもでき、例え ばEcoRIとBamHIで消化されたpBr/Ad.Cla-BamまたはPacIとBamHIで消化されたpBr /Ad.AflII-BamHIを、SalIで消化されたpBr/Ad.Sal-rITRと組み合わせることがで きる。 組換えアデノウイルスは上記プラスミドの上記細胞への導入に続いて産生され る。当業者は本発明から逸脱することなく他のアダプターと相補プラスミドの組 み合わせも使用できると理解すべきである。 以下に概略を述べる、本発明の限定しない実施例としての一般的プロトコルは 、様々なアダプタープラスミドとAd.AflII-rITR断片を使っていくつかの組換え アデノウイルスを産生するために行われた。アデノウイルスパッケージング細胞 （PER.C6）を〜25cm²のフラスコに接種し、翌日、それらが集密度(confluency) 〜80％になった ところで、DNAとリポフェクタミン剤(Life Technologies社)の混合物で、製造者 の説明通りにトランスフェクトした。通例、40μlのリポフェクタミン、４μgの アダプタープラスミドおよび４μgの相補アデノウイルス断片AflII-rITR（二重 相同組換えの場合は３つのプラスミド全てを２μg）を使用した。pAd/CMV-LacZ アダプターを用いた対照トランスフェクションで測定したところ、これらの条件 で〜50％の一過性トランスフェクション効率（トランスフェクション後48時間） が得られた。２日後、細胞を〜80cm²のフラスコに継代し、さらに培養した。約 ５日（単一相同組換えの場合）から11日（二重相同組換えの場合）後に細胞変性 効果（CPE）が見られ、機能的アデノウイルスが形成したことが示された。完全 なCPEが起こったら細胞と培地を収集し、凍結-融解操作によって組換えウイルス を放出させる。完全なCPEの発生にもかかわらず、初期段階で力価が変わりやす いことがわかったので、80cm²フラスコでの追加の増幅段階を慣例的に行った。 増幅後に、ウイルスを収集し、PER.C6-細胞でプラーク精製した。個々のプラー クを活性な導入遺伝子を持つウイルスについて試験した。 ヒトインターロイキン-3遺伝子（図１参照、国際公開第WO88/04691号公報）、 ヒト内皮酸化窒素遺伝子（Janssensら(1992)J.Biol.Chem.267:14519-14522）、T clAトランスポザーゼ遺伝子（Vosら(1993)Genes Dev.7:1244-1253）または細菌L acZ遺伝子（Kalderonら(1984)Cell 39:499-509）を含有する４種類の組換えアデ ノウイルスが、このプロトコルを使って産生されている。いずれの場合も、機能 的アデノウイルスが形成さ れ、単離されたプラークはいずれも活性な導入遺伝子を持つウイルスを含有した 。 E3 またはE4領域に修飾を持つE1欠失組換えアデノウイルス E3機能は組換えウイルスの複製、パッケージングおよび感染には必要でないの で、E1領域での置換に加えて、アデノウイルス中のE3領域を欠失させるか、E3領 域の一部を置換することが可能である。これは、パッケージ可能な最大サイズ（ 野生型ゲノムの長さの約105％）を超えないで、より大きなインサートを使用す るか、２以上の遺伝子を挿入する機会を与える。これは例えば、pBr/Ad.Bam-rIT Rクローン中のE3領域の一部をXbaIによる消化と再連結で欠失させることによっ て行うことができる。これにより、既知のE3コード領域すべてを含むAd5野生型 配列28592-30470が除去される。もう一つの例は、E3領域中のgp19Kのコード領域 を、新しい配列の挿入を可能にするポリリンカーで正確に置換することである。 これは他の全てのコード領域を無傷のままにしておき、導入遺伝子はE3プロモー ターとpA配列によって制御されるので異種プロモーターの必要をなくしてコード 配列により多くのスペースを残し、少なくとも対照E1置換ベクターと同等に良好 な極めて高い導入遺伝子発現をもたらす。 この目的を達するために、E3領域の5'部分を含有する野生型Ad5由来の2.7kb E coRI断片をpBluescript(KS−)（Stratagene社）のEcoRI部位にクローニングした 。次に、ポリリンカー中のHindIII部位を、EcoRVおよびHincIIによる消化とそれ に続く再連結で除去した。得ら れたクローンpBS.Eco-Eco/ad5ΔHIIIを使ってgp19Kコード領域を欠失させた。プ ライマー1(5'-GGG TAT TAG GCC AA AGG CGC A-3')および2(5'-GAT CCC ATG GAA GCT TGG GTG GCG ACC CCA GCG-3')を使って、pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIIIから野生型 Ad5 DNA中の配列28511から28734に対応する配列を増幅した。同じDNAにプライマ ー3（5'-GAT CCC ATG GGG ATC CTT TAC TAA GTT ACA AAG CTA-3'）と4（5'-GTC GCT GTA GTT GGA CTG G-3'）を使って、29217から29476までのAd5配列を増幅し た。得られた２つのPCR断片を、新たに導入されたNcoI部位を利用して互いに連 結した後、XbaIとMunIで消化した。次にこの断片を、XbaIとMunIで部分消化して おいたpBs.EcoEco/ad5ΔHIIIベクターに連結することにより、pBS.EcoEco/ad5Δ HIII.Δgp19Kを生成させた。 HindIIIとBamHI部位に外来遺伝子を挿入できるように、pBS.Eco-Eco/ad5ΔHII I.Δgp19K中にXbaI欠失を作ってBluescriptポリリンカー中のBamHI部位を除去し た。得られたプラスミドpBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19KΔXbaIは、Ad5中の配列 28733(HindIII)と29218（BamHI）に対応する単一のHindIII部位とBamHI部位を含 有する。これらの部位への外来遺伝子の導入後に、欠失させたXbaI断片を再導入 するか、そのインサートをpBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19KにHindIIIと例えばMu nIとを使って再クローニングする。この方法を用いて、本発明者らはHSV-TK(McK night(1980)Nucl.Acid.Res.8:5949-5964およびVincentら(1996)Hum.Gene Ther.7 :197-205)、hIL-1α(Esandiら(1998) Gene Therapy 5:778-788)、ラットIL-3β(Esandiら(1998)Gene 211(1):151-158) 、ルシフェラーセ(De Witら(1987)Mol.Cell Biol.7:725-737)またはLacZを発現 させるプラスミドを作製した。pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19Kプラスミド中の 単一のSrlI部位とNotI部位（挿入された目的遺伝子を持つものまたは持たないも の）は、pBr/Ad.Bam-rITRの対応する領域に目的遺伝子を含有する領域を移して 、構築物pBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K（挿入された目的の遺伝子を持つものまたは持 たないもの）を得るために使用される。この構築物は、組換えアデノウイルスを 作出するために上述のように使用される。そのウイルスでは、挿入された遺伝子 の発現がアデノウイルスE3プロモーターによって制御される。 E1とE3が共に欠失した組換えウイルスは、本発明のE1置換用アダプタープラス ミドで目的の第１の遺伝子が挿入されているものまたは挿入されていないもの、 pWE/Ad-AflII-EcoRI断片およびpBr/Ad.Bam-rITRΔgp19Kプラスミド（目的の第２ の遺伝子が挿入されているものまたは挿入されていないもの）を含むプラスミド 型システムを用いて、E1置換ベクターについて上述したような二重相同組換え法 によって生成される。 非限定的な例として、E1領域にマウスHSA遺伝子を含有し、gp19K領域にホタル ルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換えアデノウイルスの生成と機能性について 説明する。ルシフェラーゼ遺伝子をpAd/MLP-Luc（EP0707071に記載）からHindII I-BamHI構築物として切り出し、pBS.Eco-Eco/ad5ΔHIII.Δgp19KΔXbaIのHindII I-BamHI部位にクローニングした。次に、ル シフェラーゼ遺伝子を含有するMscI-MunI断片をpBS.Eco-Eco/ad5Δgp19Kの対応 する部位にクローニングしてpBS.Eco-Eco/ad5Δgp19K.lucを得た。これによって Eco-Eco断片が修復されるが、gp19Kの代わりにルシフェラーゼ遺伝子を持つよう になっている。 さらなる操作を簡単にするために、ルシフェラーゼインサート中の内部EcoRI 部位を、ルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列を変化させないで突然変異させた 。一つのEcoRI部位はルシフェラーゼインサートの5'非コード領域中のHindIII部 位に隣接し、もう一つは開始ATGの3'側588bpの位置にあった。695bpのPCR産物を プライマー5'-CGA TAA GCT TAA TTC CTT TGT GTT T-3'と5'-CTT AGG TAA CCC A GT AGA TCC AGA GGA GTT CAT-3'を使って生成させ、HindIIIとBstEIIで消化した 。次にその断片をHindIII-BstEII消化したpBS.Eco-Eco/ad5Δgp19K.lucに連結す ることにより、このベクター中の対応するインサートを置換した。得られた構築 物をpBS.EcoEco/ad5Δgp19K.luc²と呼ぶ。次に、ルシフェラーゼ遺伝子とE3領域 の一部をこのクローンからSrfIとNotIで切り出し、pBr/Ad.Bam-rITR中の対応す る部位に導入して、クローンpBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K/luc²を得た。 二重インサートウイルスにおけるE1の置換に使用されるアダプタープラスミド pAd5/SI1800HSAは、レトロウイルスLTRに基づくプロモーターによって制御され るマウスHSA遺伝子を含有する。このアダプタープラスミドは、後述するpAd5/L4 20-HSA構築物から、プロモーター配列の置換によって生成させた。まず、L420プ ロモ ーター断片を増幅する場合と同じプライマー（後述）を用いて、WO95/34669に記 載のMFG-Sベクターに基づくレトロウイルスベクターで、PCR産物を生成させた。 このPCRにより、MFG-Sベクター中のbp453-877に対応する配列が増幅される。次 に、pAd5/L420-HSA（図21）中のL420プロモーターを、単一のAvrII部位とHindII I部位を使って、そのPCR断片と交換する。次に、得られた構築物pAd5/S430-HSA をNheIとScaIで消化し、HSA遺伝子、pA配列、Ad5配列およびアンピシリン遺伝子 中のScaI部位までのベクター配列を含有する4504bp断片を単離した。 構築物pAd5/S430-HSAをXbaIとScaIでも消化し、1252bp断片（アンピシリン遺 伝子の残りの部分と、アデノウイルス由来の左ITRとパッケージングシグナルお よびS430プロモーターの5'部分を含有する）を単離した。1576bpの第３の断片を 、MFG-S系レトロウイルスベクターから、XbaI消化後に単離した。これはbp695-2 271に対応するMFG-S配列を含有する。 これら３つの単離された断片を連結することによって、アダプタープラスミド pAd5/S1800-HSAを構築した。二重インサートウイルスAd5/S1800-HSA.E3lucは、P ER.C6に次のDNA断片をトランスフェクトすることによって（上述のように）生成 させた：EcoRIとSalIで消化したpAd5/S1800-HSA（2μg）＋PacIとEcoRIで消化し たpWE/Ad.AflII-EcoRI（2μg）＋SalIで消化したpBr/Ad.Bam-rITRΔgp19klac^Z。 CPEが起こった時に、ウイルスを収集し、PER.C6細胞での連続継代によって増幅 した。このHSA-Lucウイルスの活性を、E1領域に S1800-HSAまたはCMV-Luc転写単位を含有する単一インサートΔE1ウイルスと比較 した。A549細胞を2×10⁵細胞/ウェルの密度で接種し、５時間後に様々な量のウ イルスに感染させた。２日後に導入遺伝子の発現を測定した。ルシフェラーゼ活 性はルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社）を使って測定し、マウスHSA 遺伝子の発現量はα-HSA抗体（M1/69、Pharmingen社）を使って測定した。その 結果を表IIIに示す。 この実験は、プラスミドに基づく組換えシステムを使って二重インサートウイ ルスを作製できることと、両インサートが機能的であることを示している。さら に、二重インサートウイルスのルシフェラーゼ活性は、対照ウイルスのCMV制御 ルシフェラーゼ活性に匹敵する。したがって本発明者らは、E3プロモーターは、 E1Aタンパク質が存在しなくても、A549細胞内で高度に活性であると結論する。 E3領域での操作に加えて、E4領域（の部分）の変化も、pBr/Ad.Bam-rITRで容 易に達成できる。しかし、そのようなウイルスの生成と増殖はトランスに相補性 を要求する場合がある。実施例３ ヘアピン構造を形成できる合成DNA配列が、アデノウイルス遺伝子を含有しそれ を発現する細胞中で二本鎖DNA分子を生成するための逆鎖合成のプライマーとし て働く能力を持つことの証明 使用するプラスミドの命名規則： p プラスミド I ITR（アデノウイルス逆方向末端反復配列） C サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー/プロモーターコンビネー ション L ホタルルシフェラーゼコード配列hac，haw制限エンドヌクレアーゼAsp 718による消化後に形成されうるそれぞれ正方向および逆方向の潜在的ヘアピン （図15） この命名規則は次のように例示される。pICLhawは、アデノウイルスITRを含有 し、その後ろにCMVに制御されたルシフェラーゼと逆（非機能的）方向のAsp718 ヘアピンが続いているプラスミドである。プラスミドpICLhac、pICLhaw、pICLI およびpICLを標準的技術を使って作製した。これらプラスミドの概略図を図16〜 19に示す。 プラスミドpICLは次のプラスミドから誘導される： nt.1 457pMLPIO(Levreroら(1991)Gene101:195-202) nt.458 1218 pCMVβ（Clontech社、EMBLバンク番号U02451） nt.1219 3016 pMLP.luc（IntrogGene社、未公表） nt.3017 5620 pBLCAT5（Steinら(1989)Mol.Cell Biol.9:4531-4）。 このプラスミドは次のように構築された： プラスミドpMLP10のtet遺伝子をBamHI-SalI断片の欠失によって不活化するこ とにより、pBLP10ΔSBを得た。プライマーセットPCR/MLP1とPCR/MLP3を使って、 合成SalI制限部位が隣接したAd5-ITRを含有する210bp断片を、pMLP10 DNAをテン プレートとして増幅した。そのPCR産物を酵素EcoRIとSgrAIで消化 して196bpの断片を生成させた。プラスミドpMLP10ΔSBをEcoRIとSgrAIで消化す ることによってITRを除去した。この断片をEcoRI-SgrAI処理したPCR断片で置換 することによってpMLP/SALを生成させた。 プラスミドpCMV-LucをPvuIIで完全に消化し、再環状化することによって、SV4 0由来のポリアデニル化シグナルとAd5左末端を除くAd5配列を除去した。得られ たプラスミドpCMV-LucΔAdで、そのAd5 ITRを、XmnI-SacII断片の交換により、 プラスミドpMLP/SAL由来のSal部位隣接ITRで置換した。得られたプラスミドpCMV -LucΔAd/SAL、Ad5左末端およびCMV制御ルシフェラーゼ遺伝子をSalI-SmaI断片 として単離し、SalIとHpaIで消化したプラスミドpBLCATSに挿入してプラスミドp ICLを形成させた。プラスミドpICLを図19に示し、その配列を図20に示す。 プラスミドpICLは次の特徴を含有する： nt.1-457 Ad5左末端（ヒトアデノウイルス５型の配列1-457） nt.458-969 ヒトサイトメガロウイルスエンハンサーと極初期プロモーター（ Boshartら(1985)Cell 41:521-530）（プラスミドpCMVβ（Clontech社・米国パロ アルト）由来） nt.970-1204 SV40 19Sエキソンと短縮型16/19Sイントロン（プラスミドpCMVβ 由来） nt.1218-2987ホタルルシフェラーゼ遺伝子(pMLP.luc由来) nt.3018-3131プラスミドpBLCAT5由来の後期転写物 から得られるSV40直列ポリアデニル化シグナル nt.3132-5620pUC12骨格(プラスミドpBLCAT5由来) nt.4337-5191 β-ラクタマーゼ遺伝子（Amp耐性遺伝子、逆方向）プラスミドpICLhacおよびpICLhaw プラスミドpICLhacとpICLhawを、制限酵素Asp718でpICLを消化することによっ て、プラスミドpICLから誘導した。直鎖化したプラスミドをウシ腸アルカリホス ファターゼで処理することによって51リン酸基を除去した。部分的に相補的な合 成一本鎖オリゴヌクレオチドHp/asp1とHp/asp2をアニールさせ、それらの5'末端 をT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。 リン酸化した二本鎖オリゴヌクレオチドを、脱リン酸化したpICL断片と混合し 、連結した。その合成オリゴヌクレオチドが単コピーだけプラスミドに挿入され ているクローンを単離し、制限酵素消化物を用いて特徴づけた。Asp718部位への オリゴヌクレオチドの挿入は、一方の接合部ではAsp718認識部位を再生するが、 他方の接合部ではその認識部位が破壊されることになる。挿入されたオリゴヌク レオチドの方向と完全性を、選択したクローンで、配列分析によって確認した。 正しい向きのオリゴヌクレオチドを含有するクローン（Asp718部位が3205EcoRI 部位に近い）をpICLhacと名付けた。逆向きのオリゴヌクレオチドを持つクロー ン（Asp718部位がSV40由来のポリシグナルに近い）をpICLhawと命名した。プラ スミドpICLhacとpICLhawを図16と17に示す。 プラスミドpICLIを、Ad5-ITRを含有するpICL由来のSalI-SgrAI断片をpICLのAs p718部位に挿入することによって、プラスミドpICLから作製した。194bpSalI-Sg rAI断片をpICLから単離し、大腸菌DNAポリメラーゼI（クレノー断片）と各種dNT Pを使ってその付着末端を平滑末端に変換した。Asp718付着末端は、緑豆（mungb ean）ヌクレアーゼによる処理で平滑末端に変換した。連結によって、プラスミ ドpICLのAsp718部位にITRを含有するクローンを生成させた。ITR断片を正しい向 きに含有する１クローンをpICLIと名付けた（図18）。 アデノウイルスAd-CMV-hcTKの生成．組換えアデノウイルスを特許出願第95202 213号に記載の方法に従って構築した。組換えアデノウイルスを生成させるには ２つの成分が必要である。第一に、ITRとパッケージングシグナルを含むアデノ ウイルスゲノムの左末端、目的の遺伝子を持つ発現カセット、および相同組換え に使用されうるアデノウイルスゲノムの一部を含有するアダプタープラスミド。 これに加えて、上述のアダプタープラスミドとの組換えにはアデノウイルスDNA が必要である。Ad-CMV-hcTKの場合、プラスミドPCMV.TKが基礎として使用された 。このプラスミドはアデノウイルス５型ゲノムのnt.1-455、PCMVβ（Clontech社 、CMVエンハンサープロモーターとシミアンウイルス40の16S/19Sイントロンを含 有するPstI-StuI断片）由来のnt.456-1204、単純ヘルペスウイルスチミジンキナ ーゼ遺伝子(ヨーロッパ特許出願第95202213.5号公報に記載)、SV40由来のポリア デニル化シグナル（SV40配列のnt.2533- 2668)を含有し、その後ろにAd5のBglII-ScaI断片(Ad5配列のnt.3328-6092)が続 いている。これらの断片はpMLP10由来（Levreroら（1991）Gene 101:195-202） の骨格中に存在する。プラスミドpAD-CNWhc-TKを生成させるために、プラスミド PCMV.TKをClaI（単一のClaI部位がTKオープンリーディングフレームのすぐ上流 に位置する）で消化し、ウシ腸アルカリリン酸で脱リン酸化した。ヘアピン構造 を生成させるために、合成オリゴヌクレオチドHP/cla2とHP/cla2をアニールし、 それらの5'-OH基をT4ポリヌクレオチドキナーゼとATPでリン酸化した。その二本 鎖オリゴヌクレオチドを直鎖化したベクター断片と連結し、大腸菌「Sure」株の 形質転換に使用した。このオリゴヌクレオチドのClaI部位への挿入は、そのClaI 認識部位を破壊することになる。このオリゴヌクレオチドは、その末端に新しい ClaI部位を含有している。選択したクローンで、挿入されたオリゴヌクレオチド の向きと完全性を配列分析によって確認した。オリゴヌクレオチドを正しい方向 に含有する（ITR側にClaIがある）クローンをpAd-CMV-hcTKと名付けた。このプ ラスミドをClaI消化野生型アデノウイルス５型DNAと一緒に911細胞にトランスフ ェクトした。CMV-hcTK発現カセットがE1配列を置換している組換えアデノウイル スを標準的な方法で分離し、増殖させた。 複製がITRで始まった後に置換鎖での逆鎖合成のプライマーとしてヘアピンが 使用されうるかどうかを調べるために、プラスミドpiCLhacを911細胞、すなわち アデノウイルスE1領域で形質転換されたヒト胚網膜芽細胞に導入した。プラスミ ドpICLhawを対照とした。これ はオリゴヌクレオチド対HP/asp1および2を逆方向に含有するが、その他の点では プラスミドpICLhacと完全に同一である。これらの試験にはプラスミドpICLIとpI CLも含めた。プラスミドpICLIでは、ヘアピンがアデノウイルスITRで置換されて いる。プラスミドpICLはヘアピンもITR配列も含有しない。これらのプラスミド は末端ヘアピン構造ゆえの複製効率を決定するための対照とした。DNA複製に必 要なE1タンパク質（これらは911細胞によって産生される）以外のウイルス産物 を提供するために、培養をトランスフェクション後にウイルスIG.Ad.MLPI.TKに 感染させた。トランスフェクトされたDNA分子の適切な複製を実証するために、 いくつかのパラメーターが調べられた。まず、上述のプラスミドでトランスフェ クトされIG.Ad.MLPI.TKウイルスに感染させた細胞から抽出したDNAが、サザンブ ロッティングにより、予想される複製中間体の存在と重複ゲノムの存在について 分析された。さらに、トランスフェクトされたIG.Ad.hMPI.TK感染細胞集団から 、ルシフェラーゼ陰性細胞にルシフェラーゼマーカー遺伝子を導入してそれを発 現させることのできるウイルスが分離された。 プラスミドpICLhac、pICLhaw、pICLIおよびPICLのプラスミドDNAを制限エンド ヌクレアーゼSalIで消化し、得られたDNA断片の４ヌクレオチド一本鎖突出部分 を除去するために緑豆ヌクレアーゼで処理した。この方法で、ＤＮＡ断片上の天 然アデノウイルス5'ITR末端を作製した。次に、ヘアピン構造を形成できる末端 を生成させるために、pICLhacプラスミドとpIChawプラスミドの両方を制限エン ドヌクレアーゼAsp718で消化し た。消化したプラスミドを標準的リン酸カルシウム共沈法を使って、各プラスミ ドにつき４枚の培養皿で、911細胞に導入した。トランスフェクション中に、１ 細胞あたり５つの感染性IG.Ad.MLPI.TK粒子を使って、各プラスミドにつき２つ の培養物をIG.Ad.MLPI.TKウイルスに感染させた。トランスフェクションの20時 間後とトランスフェクションの40時間後に、一つのAd.tkウイルス感染培養と一 つの非感染培養を使って、低分子量DNAをヒルト（Hirt）が考案した（Einerhand ら（1995）Gene Therapy 2:336-343に記述されているような）方法で単離した。 単離したDNAの部分標本(aliquot)をサザン分析に使用した。制限エンドヌクレア ーゼEcoRIによる試料の消化後に、ルシフェラーゼ遺伝子をプローブとして使用 することにより、約2.6kbのハイブリッド形成断片が、プラスミドpICLhacでトラ ンスフェクトされたアデノウイルス感染細胞から得た試料だけから検出された。 この断片のサイズは、ルシフェラーゼマーカー遺伝子の予期される重複と合致し た。これは、挿入されたヘアピンが逆鎖合成のプライマーとして働きうるという 結論を裏付けるものである。IG.Ad.MLPI.TKウイルスを省くか、ヘアピンオリゴ ヌクレオチドを逆向きに挿入した場合は、ハイブリッド形成断片は存在しなかっ た。 制限エンドヌクレアーゼDpn1はテトラヌクレオチド配列5'-GATC-3'を認識する が、メチル化DNAだけを切断する(すなわち大腸菌中で増殖されそこから得られた プラスミドDNAだけを切断し、哺乳類細胞中で複製されたDNAは切断しない)。制 限エンドヌクレアーゼMboIは同じ配列を認識するが、非メチル化DNA(すなわち哺 乳類細胞中で増殖されたDNA)だけを切断する。トランスフェクトされた細胞から 単離されるDNA試料をMboIおよびDpnIと共にインキュベートし、サザンブロット で分析する。その結果、pICLhacとpICLIプラスミドをトランスフェクトされた細 胞だけに、MboI処理試料中には存在しない大きいDpnI耐性断片が存在することが 明らかになった。これらのデータは、プラスミドpICLIとpICLhacのトランスフェ クション後に初めて、それら断片の複製と重複が起こることを証明している。 これらのデータは、アデノウイルス感染細胞において、一端にはアデノウイル ス由来の逆方向末端反復配列（ITR）を持ち、他端には同じ鎖上の配列にアニー ルできるヌクレオチド配列を持つ線状DNA断片が、一本鎖型で存在する場合にヘ アピン構造を生成し、両端に逆方向末端反復配列を持つ構造に変換されることを 示している。得られたDNA分子は野生型アデノウイルスゲノムと同じ機序によっ て複製されるだろう。実施例４ ルシフェラーゼマーカー遺伝子、単コピーのITR、包膜シグナル（encaosidation signal）およびヘアピン構造を形成できる合成DNA配列を含有するDNA分子が、 ビリオンに包膜されうるDNA分子を生成させるのに十分であることの証明 実施例３で生成した、2コピーのCMV-Lucマーカー遺伝子を含有するDNA分子が ウイルス粒子に包膜され（encapsulated）うることを立証するために、残り２つ の培養物から３サイクルの凍結−融解破壊操作によってウイルスを収集し、それ を使ってマウス線維芽細胞を感 染させた。感染の48時間後に、感染細胞をルシフェラーゼ活性についてアッセイ （assay）がなされる。ルシフェラーゼ活性がウイルス粒子ではなく遊離DNAの移 入によって誘導された可能性を排除するために、ウイルスストックをDNアーゼＩ で処理してDNA汚染物質を除去した。さらに、もう一つの対照として、ウイルス ストックの一部を56℃で60分間インキュベートした。この熱処理は汚染DNAには 影響しないが、ウイルスを不活化する。有意なルシフェラーゼ活性は、pICLhcお よびPICLIプラスミドをトランスフェクトしたIG.Ad.MLPI.TK感染細胞由来のウイ ルスストックによる感染後の細胞だけに見出された。非感染細胞にも、pICLhwと pICLをトランスフェクトした感染細胞にも、有意なルシフェラーゼ活性は見られ なかった。熱不活化はルシフェラーゼ発現を完全に排除したが、DNアーゼＩ処理 では排除されず、遊離の（汚染）DNA断片ではなくアデノウイルス粒子がルシフ ェラーゼレポーター遺伝子の移入を担っていることが立証された。 これらの結果は、これら小さいウイルスゲノムがアデノウイルス粒子に封入さ れうることを示し、線状DNA断片のアデノウイルス粒子への封入にはITRと封入シ グナル（encapsulation signal）で足りることを示唆する。これらのアデノウイ ルス粒子は効率のよい遺伝子導入に使用できる。アデノウイルス遺伝子の少なく とも一部（すなわちE1、E2、E4およびＬとVA）を含有し発現させる細胞に導入さ れた場合、少なくとも一つのITR、封入シグナルの少なくとも一部およびヘアピ ン構造を形成できる合成DNA配列を含む組換えDNA分子は、ウイルス 粒子に封入されうる組換えゲノムを自律的に生成させる固有の能力を持つ。その ようなゲノムとベクター系は遺伝子導入に使用できる。実施例５ アデノウイルス５型ゲノムのヌクレオチド3510-35953（すなわち9.7-100メイ単 位）を含有し(したがってE1タンパク質コード領域、右側ITRおよび包膜配列を欠 き)、ITR以外に、一本鎖型として存在する場合にそのDNA分子の同じ鎖の一部に 相補的であって、その結果、ヘアピン構造を形成できる末端DNA配列を含有するD NA分子が、911細胞中で複製できることの証明 上述のICLhacベクターゲノムおよび同様に最小のアデノベクターがヘルパー細 胞によってアデノウイルス粒子に封入されうるために必要なアデノウイルス産物 を提供できる複製DNA分子を開発するため、Ad-CW-hcfKアデノウイルスベクター を開発した。CMVエンハンサー/プロモーター領域とチミジンキナーゼ遺伝子の間 に、アニールしたオリゴヌクレオチド対（表1）HP/cla1および２を挿入した。標 準的方法を用いてベクターAd-CMV-hcTKを911細胞で増殖、産生した。アデノウイ ルスAdCMV-hcTKのDNAを、標準的技術により、CsCl密度勾配遠心分離で精製した ウイルス粒子から単離した、そのウイルスDNAを制限エンドヌクレアーゼClaIで 消化した。消化したDNAを0.7％アガロースゲルでサイズ分画し、大断片を単離し 、さらなる実験に使用した。911細胞の培養物に、Ad-CMV-hcTK DNAの大ClaI断片 を、標準的リン酸カルシウム共沈法でトランスフェクトした。プラスミドpICLha cを使った先の実験と同様に、Ad- CMV-hcは右側ITRから複製を開始する。いったんＩ鎖が置換されると、その断片 の左側末端にヘアピンが形成されうる。これは、右側に向かう鎖のDNAポリメラ ーゼ伸長を促進する。この過程は、置換された鎖がその二本鎖型に完全に変換さ れるまで進行する。最後に右側ITRが再生され、その位置で、通常のアデノウイ ルス複製開始と伸長が起こる。ポリメラーゼはヘアピンをリードスルーすること によって、分子を重複させる。一端にアデノウイルスITR配列を持ち、他端にヘ アピン構造を形成できるDNA配列を持つ33250bpの投入（input）DNA分子は、両端 がITR配列を持つように重複される。得られるDNA分子は約66500bpのパリンドロ ーム構造からなる。 この構造は、トランスフェクト細胞から抽出された低分子量DNAに、サザン分 析を用いて検出される。DNA断片のパリンドローム性は、適当な制限エンドヌク レアーゼによる低分子量DNAの消化と、HSV-TK遺伝子をプローブとするサザンブ ロッティングで立証できる。この分子は、トランスフェクトされた細胞中で、そ の細胞中に存在するアデノウイルス遺伝子産物ゆえに、それ自体を複製できる。 一部のアデノウイルス遺伝子は標的細胞のゲノムに組み込まれたテンプレートか ら発現され（すなわちE1遺伝子産物）、他の遺伝子は複製DNA断片そのものに内 在する。この線状DNA断片はウイルス粒子には封入されえない。封入に必要なす べてのDNA配列を欠くばかりでなく、そのサイズも封入されるには大きすぎる。実施例６ アデノウイルス５型ゲノムのヌクレオチド3503-35953（すなわち9.7-100マップ 単位）を含有し（したがってE1タンパク質コード領域、右側ITRおよび包膜配列 を欠き）、ITR以外に、そのDNA分子の同じ鎖の一部に相補的であって、その結果 、ヘアピン構造を形成できる末端DNA配列を含有するDNA分子が、911細胞中で複 製でき、pICLIとpICLhac由来のDNA断片を包膜するのに必要なヘルパー機能を提 供できることの証明 次の一連の実験の目的は、実施例３および４に記述した最小アデノベクターを 封入するために、実施例５に記述したDNA分子を使用できることを立証すること である。 Ad-CW-hcTK DNAのエンドヌクレアーゼClaI消化後に単離した大断片を、エンド ヌクレアーゼセSalI、緑豆ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼAsp718処理したプ ラスミドpICLhac、または同様に処理した対照プラスミドpICLhawと共に、（実施 例５に記述したように）911細胞に導入した。48時間後に、トランスフェクトさ れた細胞（transfected cell）集団の凍結-融解破砕によってウイルスを単離し た。混入している遊離のDNAを除去するために、そのウイルス調製物をDNアーゼ Ｉで処理した。次に、そのウイルスを使ってRat2線維芽細胞を感染させた。感染 の48時間後に、細胞をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。pICLhacプラ スミドをトランスフェクトした細胞から単離されたウイルスに感染させた細胞だ けに、有意なルシフェラーゼ活性が示され、pICLhawプラスミドをトランスフェ クトしたものにはルシフェラーゼ活性が示されなかった。ルシフェラーゼ活 性は感染前のウイルスの熱不活化によって完全に消失し、ルシフェラーゼ遺伝子 がウイルス粒子によってトランスフェクトされることを示した。ウイルスストッ クによる911細胞の感染は何の細胞変性効果ももたらさず、911細胞で増殖する感 染性ヘルパーウイルスを伴わずにpICLhacが生産されることを示した。これらの 結果は、提案された方法を使って、アデノウイルス形質転換ヒト細胞または非ア デノウイルス形質転換ヒト細胞で自律的に複製できる感染性ヘルパーウイルスを 全く含まない最小アデノウイルスベクターのストックを生産できることを証明し ている。実施例７ 最小アデノウイルスベクターの生成および産生用のプラスミドの構築 最小アデノウイルスベクターは、操作可能に連結された成分として、導入され る外来核酸分子を伴ってまたはこれを伴わずに、複製とパッケージングに必要な アデノウイルス由来のシスエレメント（cis elements）を含有する。最近、アデ ノウイルスベクター（stuffer）の効率的なパッケージングの下限がゲノム長の7 5％と決定された（ParksおよびGraham、1997［要引用］）。様々な長さのスタッ ファー断片を柔軟に組み入れることができるように、最小アデノウイルスベクタ ーにマルチクローニング部位（MCS）を導入した。本発明の最小アデノウイルス ベクターを得るために、次の構築物を作製した：pAdlL420-HSA(図21)をBglIIとS alIで消化し、ベクター含有断片を単離した。この断片はAd5の左ITRとパッケー ジングシグナルおよび修飾レトロウイルスLTRに よって制御されるマウスHSA遺伝子を含有する。アデノウイルスの右ITRを、pBr/ Ad.BamHI-rITRテンプレートDNA上で、次のプライマーを用いて増幅した：PolyL- ITR ：5'-AAC-TGC-AGA-TCT-ATCGAT-ACT-AGT-CAA-TTG-CTC-GAG-TCT-AGA-CTA-CGT-C AC-CCG-CCC-CGT-TCC-3'およびITR-BSN：5'-CGG-GAT-CCG-TCG-ACG-CGG-CCG-CAT-C AT-CAA-TAA-TAT-ACC3'。増幅された断片をPstIとBamHIで消化し、同じ酵素で消 化したpUC119にクローニングした。ITRとMCSの正しい増幅を配列で確認した後、 BglII-SalI断片を単離し、上述のBglII/SalI消化pAd/L420-HSA断片にクローニン グした。得られたクローンをpAd/L420-HSA.ITRと名付けた。 30kbを超える長さの構築物を操作できるように、最小アデノウイルスベクター pAd/L420-HSAをコスミドベクターバックグラウンドにサブクローニングした。こ の目的を達するために、コスミドベクターpWE15を修飾してその骨格中の制限部 位を除去した。pWE15をPstIで消化し、4kbと2.36kbの断片をアガロースゲルから 単離し、互いに連結した。その結果得られた、SV40oril初期プロモーターとネオ マイシン耐性コード配列が除去されたクローンを、pWE20と名付けた。次にpWE20 をClaIとHindIIIで消化し、その付着末端をクレノー酵素で補充した。6354bpの 平滑断片を、5'-CGATGCATCG-3'という配列を持つリン酸化したNsiIリンカーに連 結した。連結したDNAをフェノール/クロロホルム抽出し、緩衝液を交換するため にEtOHで沈殿させ、過剰のNsiIで消化した。消化されたDNAを電気泳動によって リンカーから 分離し、単離し、再連結した。得られたクローンをpWE25と名付けた。NsiIリン カーの正しい挿入を制限酵素消化と配列決定によって確認した。最小アデノウイ ルスを構築するために、pAd/L420-HSA.ITRをScaIとNotIで消化し、アデノITRと アンピシリン遺伝子の一部を含む2kb断片を、ScaIとNotIで消化したpWE25にクロ ーニングした。得られたクローンをpMV/L420Hと名付けた（図24）。このクロー ンは、プロモーターおよび/または遺伝子を交換するために容易に操作すること ができ、また、通常のプラスミド骨格中に容易にはクローニングされない長さの DNA断片を挿入できる。 プラスミドpMV/CMV-LacZは、L420-HSA断片（SnaBI-BamHI）を、CMVプロモータ ーとLacZコード配列を含有するpcDNA3-nlsLacZ由来の断片（Nrul-BamHI）と交換 することによって作製した。pcDNA3-nlsLacZは、nlsLacZコード配列のPCR増幅後 に得られるKpnI-BamHI断片を、KpnIとBamHIで消化したpcDNA3（Invitrogen社） に挿入することによって構築した。プライマー１：5'-GGG-GTG-GCC-AGG-GTA-CCT -CTA-GGC-TTT-TGC-AA-3'および２：5'-GGG-GGG-ATC-CAT-AAA-CAA-GTT-CAG-AAT-C C-3'を使用して、pMLP.nlsLacZテンプレートDNAでPCR反応を行った。911細胞で の一過性トランスフェクション実験でβ-ガラクトシダーゼ発現をアッセイする ことによって正しい増幅とクローニングを確認した。 ベクターpAd/MLPnlsLacZは次のように作製した：pMLP10（Levreroら（1991）G ene 101:195-202）をHindIIIとBamHIで消化し、３つの部分の連結でL7RH β-gal（Kalderonら(1984)Cell 499-509）由来の3.3kbAvrII-BamHI断片と、Hind IIIおよびXbaI突出部を持つ合成リンカーとに連結した。このリンカーは、配列5 '-AGC TTG AAT TCC CGG GTA CCT-3'と5'-CTA GAG GTA CCC GGG AAT TCA-3'の２ つのオリゴヌクレオチドをアニールすることによって作製した。得られたクロー ンをpMLP.nlsLacZ/-Adと名付けた。次に、pMLP.nlsLacZ/-AdをBamHIとNruIで消 化し、そのベクター含有断片をpAd5SalB（Bernardsら（1982）Virology 120:422 -432）由来の2766bpBglII-ScaI断片に連結した。これにより、アダプタープラス ミドpMLP.nlsLacZ（EP0707071に記載）が得られた。 最小アデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス遺伝子産物の発現によ ってのみ達成できる。大量のウイルス産生を持続させるほど高いレベルでのアデ ノウイルス遺伝子産物の発現には、コード核酸分子の複製が必要である。したが って通常は、最小アデノウイルベクターを相補するために、複製性ヘルパーウイ ルスが使用される。しかし本発明は、ヘルパーウイルスを使用しない最小アデノ ウイルスベクター用のパッケージングシステムを提供する。本発明方法の一つは 、5'-ITRおよび3510と35938の間にある全てのアデノウイルス配列（すなわち、E 1領域とパッケージングシグナルを除く完全なアデノウイルスゲノム）を含有す る複製性DNA分子を利用する。構築物pWE/Ad.Δ5'（図25）は、２つのアデノウイ ルスITRを含有する本発明の複製性分子の一例である。pWE/Ad.Δ5'．これは３つ の断片からコスミドベクターバックグラウンドに作製された。まず、Ad5の5'ITR を 次のプライマーを使って増幅した：ITR-EPH ：5'-CGG-AAT-TCT-TAA-TTA-AGT-TAA-CAT-CAT-CAA-TAA-TAT-ACC-3'およびITR-pIX ：5'-ACG-GCG-CGC-CTT-AAG-CCA-CGC-CCA-CAC-ATT-TCA-GTA-CGT-ACT-AGT- CTA-CGT-CAC-CCG-CCC-CGT-TCC-3’ 得られたPCR断片をEcoRIとAscIで消化し、同じ酵素で消化したベクターpNEB193( New England Biolabs社)にクローニングした。得られた構築物をpNEB/ITR-pIXと 名付けた。配列決定により、GenBank（アクセッション（Accession）番号M73260 /M29978）に従って予想される配列との一つのミスマッチを除いて(すなわちAflI I部位のすぐ上流に余分なＣ残基が見出された)、pIXプロモーター（Ad5配列3511 から3538）に連結された左ITR（Ad5配列１から103）におけるAd5配列の正しい増 幅が確認された。このITR-pIX断片をEcoRIとAflIIで単離し、Ad5配列3539-21567 を含有するEcｏRI-AflIIベクター断片に連結した。後者の断片はpBr/Ad.Cla-Bam （上記）のEcoRIによる消化とAflIIによる部分消化によって得た。得られたクロ ーンをpAd/LITR(Δ5')-BamHIと名付けた。最終構築物pWE/Ad.Δ5'は、PacIで消 化したコスミドベクターpWE15.Pac(上記)を、PacI-BamHIで消化したpAd/LITR（ Δ5'）-BamHIと、PacI/BamHIで消化したpBr/Ad.Bam-rITR.pac#2（上記）に連結 することによって作製した（図25）。 本発明に従ってヘルパーウイルスを使用しないで最小アデノウイルスベクター 用のパッケージングシステムを作るもう一つの方法は、E1領域とパッケージング シグナ ルを除く全アデノウイルスゲノムを含有する複製性DNA分子であって、そのITRの 一つが、ITR以外の同じ鎖の一部に相補的なDNA配列を含有していてヘアピン構造 を形成できる断片で置換されているものを使用することである（図10）。非限定 的な例として、ITR以外の同じ鎖の一部に相補的な上記DNA配列は、アデノ随伴ウ イルス（AAV）末端反復配列から誘導される。そのような複製性DNA分子は、pWE/ Ad.Δ5'について記述したものと同じクローニング法に従って作製されるが、こ こではアデノウイルスpIXプロモーターの一部に連結されたAAV末端反復配列から 出発する。この目的を達するために、構築物pNEB/ITR-pIX中のHpaI部位とSpeI部 位の間のアデノウイルスITR配列を、AAV ITRを含有するpsub201（＋）（Samulsk iら（1989）J.Viol.63:3822-3828）由来のPvuII/XbaI断片を導入することによっ て、AAVITRと交換した。これによって、E1相補細胞株中で複製する構築物pWE/AA V.Δ5'が得られる。 最小アデノウイルスベクター用のもう一つの代替パッケージングシステムを以 下に説明するが、これはSV40の複製システムを利用する。この方法での機能的ヘ ルパー分子は少なくとも、最小構築物のパッケージングを持続させるのに必要な アデノウイルス配列を含有するが、E1配列とパッケージングシグナルを含有せず 、好ましくはITRも欠く。このアデノウイルス由来の物体は、細菌での増殖に必 要な配列に加えて、SV40ウイルス由来の複製起点を含有するベクター上に存在す る必要がある。そのような分子を上述の最小アデノウイルスベクターと共に、E1 タンパク質のほかにSV40由来のラージＴ抗原 タンパク質を発現させるパッケージング細胞株（例えばPER.C6）にトランスフェ クションすると、アデノウイルス由来のヘルパー構築物のラージＴ依存的複製が 起こる。この複製は、最小アデノウイルスベクターの複製とウイルス粒子へのパ ッケージングに必要な高レベルのアデノウイルスタンパク質をもたらす。この方 法では、最小アデノウイルスベクター構築物とヘルパー分子の間の相同組換えに つながる配列オーバーラップがない。また、ヘルパー分子と、一方では最小アデ ノウイルスベクターとの、また他方ではパッケージング細胞中のE1配列との相同 組換えにつながる配列オーバーラップもない。 40kbアデノウイルス構築物の複製を、SV40ラージＴタンパク質を発現する細胞 で調べた。ここでは、2×10⁶個のCos-1細胞に、T25フラスコで、リポフェクタミ ン試薬（Life techn.社）と複合体化した次の構築物をトランスフェクトした:8k bコスミドベクターpWE.pac、40.5kb構築物pWE/Ad.AflII-rITR、および40.6kb構 築物pWE/Ad.Δ5'の３つのクローン（#1、#5および#9）（後述）。対照トランス フェクションは、PacI酵素で消化した構築物pWE.pacとpWE/Ad.AflII-rITRおよび SV40ori配列を持たないCMV-LacZ発現ベクターで行った。CMV-LacZベクターを用 いた別個のトランスフェクションと48時間後のX-gal染色によって決定したトラ ンスフェクション効率は50％だった。全ての細胞を、トランスフェクションの48 時間後に収集し、（Einerhandら（1995）Gene Therapy 2:336-343に記述されて いるような）ヒルト（Hirt）法に従ってDNAを抽出した。最終ペレットを50μlの TE+RNアーゼ（20μg/ml）に再 懸濁し、10μlの試料をMboIで消化した（35単位、37℃でオーバーナイト）。未 消化試料（5μl）とMboI消化試料を0.8％アガロースゲルで泳動し、ナイロンフ ィルター（Amersham社）にトランスファーし、標準的な方法で放射活性プローブ にハイブリッド形成させた。一つのプローブはコスミドベクターpWE.pacの887bp DpnI断片から誘導し、一つはアデノウイルス配列の1864bpBsrGI-BamHI断片から 誘導した。これらのプローブはMboI消化物中のそれぞれ887bpバンドと1416bpに ハイブリッド形成する。細菌起源の投入DNAはメチル化されているので、MboIで は消化されない。この方法で、真核細胞中で複製されるDNAを特異的に検出でき る。図26Aは構築物pWE/Ad.Δ5'の概略図と、SV40複製起点、pWE由来のプローブ およびアデノウイルス由来のプローブの位置を示す。下側はアデノウイルスプロ ーブ(Ｂ)とpWEプローブ（Ｃ）にハイブリッド形成させたサザンブロットのオー トラジオグラムを表す。試料充填の説明については図面の説明を参照されたい。 これらの実験は、SV40oriを保持するプラスミドをトランスフェクトされているC os-1細胞から得た物質を含むレーンの全てが、MboI感受性DNAを含有し、予想さ れる長さの特異的なバンドを示すことを明らかにしている。PacI消化物質をトラ ンスフェクトされたCos-1細胞のレーン（レーンB17/18およびC15-18）における 複製に特有のバンドは、おそらく不完全なPacI消化に由来するのだろう。これら の実験から、真核細胞中でSV40ラージT/ori系をもつ大きいDNA断片を複製させる ことが可能だと結論できる。実施例８ 上述のクローンpWE/Ad.D5'から出発して、ITR配列を欠く機能的アデノウイル スヘルパー分子を構築した。pWE/Ad.D5'をBstl107Iで消化し、その17.5kbのベク ター含有断片を再連結してpWE/Ad.D5'-Bstl107Iを得た。次に、このクローンを 使って、右ITRを含まないアデノウイルスゲノム配列の3'部分を増幅した。プラ イマーAd3'/Forw：5'-CGG AAT TCA TCA GGA TAG GGC GGT GG-3'とAd3'/Rev:5'-C GG GAT CCT ATC GAT ATT TAA ATG TTT TAG GGC GGA GTA ACT TG-3'を使って、26 45bpのPCR断片を生成させた。その増幅断片をEcoRIとBamHIで消化し、同じ酵素 で消化したpBr322にサブクローニングした。配列決定による正しい増幅の確認後 に、このクローンの2558bp SbfI-ClaI断片を、同じ酵素で消化したpWE/Ad.D5'-B stl107Iに再クローニングした。得られた構築物は右ITRを欠き、pWE/Δr1-Bstl1 07Iと名付けられる。次に、このクローン中の左ITRを、次のプライマーをアニー ルさせることによって作製したPacIとAflII突出部を持つリンカーで置換した：P A-pIX15'-TAA GCC ACT AGT ACG TAC TGA AAT GTG TGG GCG TGG C-3'およびPA-pI X2 5'-TTA AGC CAC GCC CAC ACA TTT CAG TAC GTA CTA GTG GCT TAAT-3'。これ によって左ITRが除去され、pIXプロモーターの正しい配列が修復された。そのク ローンをpWE/ΔITRBstl107Iと名付ける。二本鎖リンカーの正しい挿入を、配列 決定によって確認した。次に欠失させたBstl107I断片をpWE/ΔITR-Bstl107Iにク ローニングし戻し、制限消化によって正しい向きをチェックした。得られたク ローンをpWE/Ad-Hと名付ける。アデノウイルスE1タンパク質とSV40ラージＴ抗原 を発現させるパッケージング細胞へのこのDNA分子のトランスフェクションに続 いてその分子の複製が起こり、その分子上のアデノウイルス物質によってコード されるアデノウイルスタンパク質が高レベルにもたらされる。 実施例９アダプタープラスミドのさらなる修飾 pAd5/Clip(実施例2Bに記述)中の左ITRからのベクター配列の除去を可能にする ため、このプラスミドをEcoRIで部分消化し、その線状断片を単離した。配列5'- TTAAGTCGAC-3'のオリゴをそれ自体にアニールさせて、SalI部位とEcoRI突出部を もつリンカーを生じさせた。そのリンカーを部分消化したpAd5/Clipベクターに 連結し、pAd5/Clip中の左アデノウイルスITRの23bp上流にあるEcoRI部位に挿入 されたリンカーを持つクローンを選択して、pA-d5/Clipsalとした。同様にpAd5/ Clip中のEcoRI部位を、（実施例２に記述したように）5'-AATTGTCTTAATTAACCGCA ATT-3'という配列のリンカーの挿入によって、PacI部位に変化させた。pAd5/Cli pをEcoRIで部分消化し、脱リン酸化し、EcoRI突出部を持つPacIリンカーに連結 した。コンカテマーを除去するためにその連結混合物をPacIで消化し、アガロー スゲルから単離し、再連結した。得られたベクターをpAd5/Clippacと名付けた。 これらの変化により、プラスミドベクター配列から左ITRを遊離させる自由度が より高くなる。 またベクターpAd5/L420-HSAを、左ITRの上流にSalI またはPacI部位が生成するようにも修飾した。ここではpAd/L420-HSAをEcoRIで 消化し、上述のPacIリンカーに連結した。その連結混合物をPacIで消化し、コン カテマー化したリンカーを除去するためにアガロースゲルから線状DNAを単離し た後、再連結した。これによってアダプタープラスミドpAd5/L420-HSApacを得た 。この構築物を使って、次のようにpAd5/L420-HSAsalを生成させた：pAd5/L420- HSApacをScaIとBsrGIで消化し、そのベクター断片を、同じ酵素によるpAd5/Clip salの消化後に単離される0.3kb断片に連結した。 アダプタープラスミドAdMireとAdAptの生成 ポリリンカー配列だけを含有し、プロモーターまたはポリＡ配列を含有しない アダプタープラスミドを作製するために、pAd5/L420-HSApacをAvrIIとBgIIIで消 化した。そのベクター断片を同じ制限酵素で消化したリンカーオリゴヌクレオチ ドに連結した。そのリンカーは、次の配列をもつオリゴをアニールすることによ って作製した： PLL-1：5'-GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACC GGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GG A TCC TCT AGA CGA GAT CTG G-3'および PLL-2：5'-CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATC CGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TA C CAA GCT TCC TAG GGA TGG C-3'。 アニールしたリンカーをAvrIIとBgIIIで消化し、カラム精製（Qiaquickヌクレオ チド除去キット）により製造者の勧告に従って小さい末端から分離した。次にそ のリンカーをAvrII/BglII消化pAd5/L420-HSApac断片に連 結した。リンカーが組み込まれているクローンを選択し、AdMireと命名し、イン サートの完全性をチェックするために配列決定した。アダプタープラスミドAdMi reには完全な発現カセットを容易に挿入できる。 ヒト細胞における高い発現レベルを媒介するヒトCMVプロモーターを含有する アダプタープラスミドを次のように構築した：pAd5/L420-HSApacをAvrIIで消化 し、5'突出末端をクレノー酵素を使って補充した。HindIIIによる第２の消化で 、L420プロモーター配列が除去された。ベクター断片を単離し、CMVプロモータ ー配列を含有するPCR断片に連結した。このPCR断片は、pCMVLacI（Stratagene社 ）のCMV配列を次のプライマーで増幅して得られた： CMVplus：5'-GATCGGTACCACTGCAGTGGTCAATATTGGCCATTAGCC-3'および CMVminA：5'-GATCAAGCTTCCAATGCACCGTTCCCGGC-3'。 そのPCR断片をまずPstI（CMVplusの下線部）で消化した後、その3'-突出末端をT 4DNAポリメラーゼによる処理で除去した。次に、そのDNAをHindIII(CMVminAの下 線部)で消化し、AvrIIとHindIIIで消化した上記pAd5/L420-HSApacベクター断片 に連結した。得られたプラスミドをpAd5/CMV-HSApacと名付けた。次にこのプラ スミドをHindIIIとBamHIで消化し、ベクター断片を単離し、HindIIIとBglIIによ るAdMireの消化後に得られるポリリンカー配列に連結した。得られたプラスミド をAdAptと名付けた。アダプタープラスミドAdAptは、ヒトCMVプロモーターのヌ クレオチド−735から＋95までを含有する（Boshartら、1985；M.Boshart、 F.Weber、G.Jahn、K.Dorsch-Hasler、B.FleckensteinおよびW.Schaffner「A ver y strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of huma n cytomegalovirus（訳：ヒトサイトメガロウイルスの極初期遺伝子の上流に極 めて強力なエンハンサーが確認される）」Cell 41、521-530、1985）。左ITRの 上流にあるPacI部位の代わりにSaII部位を含有するもう一つのタイプのこのアダ プタープラスミドを、pClipsalから得た0.7kb ScaI-BsrGI断片を、ScaIで消化し BsrGIで部分消化したAdAptに挿入することによって作製した。このクローンをAd Apt.salと名付けた。 実施例10アデノウイルスプラスミドの修飾 pWE/Ad.AflII-rITRΔE2Aの生成 pWE/Ad.AflII-rITR(ECACC寄託物P97082116)からのE2Aコード配列の欠失を次の ように行った。E2Aコード領域に隣接する左右のアデノウイルス配列を、Expand PCRシステム（Boehringer社）を使ったPCR反応で製造者のプロトコルに従って、 プラスミドpBr/Ad.Sal.rITR（ECACC寄託物P97082119）から増幅した。次のプラ イマーを使用した。 右隣接配列（Ad5ヌクレオチド24033-25180に対応） ΔE2A.SnaBI：5'-GGC GTA CGT AGC CCT GTC GAA AG-3' ΔE2A.DBP-start：5'-CCA ATG CAT TCG AAG TAC TTC CTT CTC CTATAG GC-3' 増幅したDNA断片をSnaBIとNsiI(NsiI部位はプライマーΔE2A.DBP-start中に作ら れる；下線部)で消化し た。 左隣接配列（Ad5ヌクレオチド21557-22442に対応） ΔE2A.DBP-stop：5'-CCA ATG CAT ACG GCG CAG ACG G G-3' ΔE2A.BamHI：5'-GAG GTG GAT CCC ATG GAC GAG-3' 増幅したDNAをBamHIとNsiI（NsiI部位はプライマーΔE2A.DBP-stop中に作られる ；下線部）で消化した。次に、消化したDNA断片を、SnaBI/BamHI消化したpBr/Ad .Sal-rITRに連結した。配列決定により、プラスミドpBr/Ad.Sal-rITRΔE2Aにお ける単一のNsiI部位を持つDBPコード領域の正確な置換が確認された。この単一 のNsiI部位は、組換えベクターによって形質導入されるべき遺伝子の発現カセッ トを導入するために使用できる。 トップ鎖中の位置24048にある100KエンコードL4遺伝子のスプライス受容部位 が傷つかないように、E2Aコード配列の欠失を行った。また、E2Aコード配列の左 側にある元のE2A-RNAおよびL3-RNAのポリアデニル化シグナルも傷つけないよう にした。これにより、アデノウイルス生活環中のL3遺伝子と100K L4タンパク質 をコードする遺伝子の適切な発現が保証される。 次にプラスミドpWE/Ad.AflII-rITRΔE2Aを作製した。プラスミドpBr/Ad.Sal-r ITRΔE2AをBamHIとSpeIで消化した。E2Aコード領域が単一のNsiI部位で置換され ている3.9kb断片を単離した。pWE/Ad.AflII-rITRをBamHIとSpeIで消化した。E2A コード配列を含有するBamHI/SpeI断片が除去された35Kb DNA断片を単離し た。その断片を連結し、λファージパッケージングエキストラクツにより、製造 者（Stratagene社）のプロトコルに従ってパッケージングして、プラスミドpWE/ Ad.AflII-rITRΔE2Aを得た。 このコスミドクローンは、機能的E2A遺伝子産物を発現させるパッケージング 細胞へのPacI消化DNAと消化したアダプタープラスミドとのコトランスフェクシ ョンによって、E2Aが欠失したアデノウイルスベクターを生成させるのに使用で きる。E2A相補細胞株の例については後述する。 pWE/Ad.AflII-rITRspの生成 ベクターpWE/Ad.AflII-rITR中の3'ITRは末端Ｇヌクレオチドを含まない。さら に右ITRからほとんど30bp離れたところにPacI部位がある。これらの特徴は、3'I TRでの複製の非効率な開始ゆえに、ウイルス生成の効率を低下させるかもしれな い。ウイルス生成中は、アダプタープラスミド中の左ITRが無傷であり、相同組 換え後のウイルスDNAの複製を可能にすることに注意されたい。 3'ITRにおける複製開始の効率を向上させるために、pWE/Ad.AflII-rITRを次の ように修飾した。構築物pBr/Ad.Bam-rITRpac#2をまずPacIで消化した後、AvrII で部分消化し、17.8kbのベクター含有断片を単離し、SAP酵素（Boehringer Mann heim社）で脱リン酸化した。この断片はヌクレオチド35464から3'ITRまでのアデ ノ配列を欠く。pWE/Ad.AflII-rITR由来のDNAをテンプレートとし、プライマーIT R-EPH：5'-CGG AAT TCT TAA TTA AGT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3'とAd101 ：5'-TGA TTC ACA TCG GTC AGT GC-3'を使って、 3'Ad5配列に対応する630bpのPCR断片を生成させた。次にこのPCR断片をベクター pCR2.1（Invitrogen社）にクローニングし、そのPCR断片を含有するクローンを 単離し、そのDNAの正しい増幅をチェックするために配列決定した。次にそのPCR クローンをPacIとAvrIIで消化し、0.5kbアデノインサートを、PacI/部分AvrII消 化pBr/Ad.Bam-rITRpac#2断片に連結して、pBr/Ad.Bam-rITRspとした。次に、こ の構築物を使って、アデノ配列3534-35938に対応するインサートを持つコスミド クローンを（実施例２に記述したように）生成させた。このクローンをpWE/AflI I-rITRspと名付けた。 ファイバーをコードするDNAを欠くアデノウイルステンプレートクローンの生成 アデノウイルス感染は２つのキャプシドタンパク質ファイバーとペントンによ って媒介される。細胞へのウイルスの結合は、突き出したファイバータンパク質 の、細胞表面上のレセプターとの相互作用によって達成される。次にペントンタ ンパク質の、細胞表面上のインテグリンとの相互作用の後に、インターナリゼー ションが起こる。ＣおよびＢ亜群のアデノウイルスの少なくとも一部は、細胞結 合に異なるレセプターを使用し、それゆえに異なる細胞タイプに対して異なる感 染効率を持つことが示されている。したがって、キャプシド中のファイバーを変 えることにより、アデノウイルスの感染スペクトルを変えることができる。アデ ノウイルス血清型５のファイバーコード配列は、ヌクレオチド31042と32787の間 にある。ファイバーをコードするアデノウイルス血清型５DNAを除去するために 、本発明者らは構築物pBr/Ad.Bam- rITRから出発した。まず、この構築物からNdeI部位を除去した。そのために、pB r322プラスミドDNAをNdeIで消化した後、その突出末端をクレノー酵素で補充し た。次にこのpBr322プラスミドを再連結し、NdeIで消化し、大腸菌DH5αに形質 転換した。得られたpBr/ΔNdeIプラスミドをScaIとSalIで消化し、得られた3198 bpベクター断片を、pBr/Ad.BamrITR由来の15349bp ScaI-SalI断片に連結して、 プラスミドpBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIを得た。したがってこれは単一のNdeI部位を 含有する。次に、オリゴヌクレオチドNY-up:5'-CGA CAT ATG TAG ATG CAT TAG T TT GTG TTA TGT TTC AAC GTG-3'と、NY-down：5'-GGA GAC CAC TGC CAT GTT-3' を使ってPCRを行った。増幅されたファイバーDNAのクローニングを容易にするた めに、増幅中に、NdeI（太字）とNsiI制限部位（下線部）の両方が導入された。 増幅は94℃で45秒、60℃で１分および72℃で45秒を１サイクルとする25サイクル からなった。このPCR反応は25pmolのオリゴヌクレオチドNY-upまたはNY-down、2 mM dNTP、1.5mM MgCl₂を含むPCR緩衝液および１単位のエロンガーゼ(Elongase) 耐熱性ポリメラーゼ（オランダ・Gibco社）を含んだ。そのPCR産物の10分の１を アガロースゲルで泳動したところ、±2200bpの予想DNA断片が増幅されることが 明らかになった。次にこのPCR断片をジーンクリーン（Geneclean）キットシステ ム（Bio101社）を使って精製した。次に、構築物pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIとPCR産 物の両方を制限酵素NdeIとSbfIで消化した。次にPCR断片を、T4リガーゼ酵素を 使って、NdeIおよびSbfI消化した pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIにクローニングして、pBr/Ad.BamRΔFibを生成した。 このプラスミドには、除去されたファイバー配列の代わりに挿入された単一の NdeIおよびNsiI部位を使って、任意のPCR増幅ファイバー配列を挿入できる。後 述するパッケージング細胞における二重相同組換えにより、アダプタープラスミ ド、PacIとEcoRIで消化した構築物pBr/Ad.AflII-EcoRI、および異種ファイバー 配列が挿入されているpBr/Ad.BamRΔFib構築物を使用して、ウイルスを生成させ ることができる。ウイルス生成の効率を増加させるために、構築物pBr/Ad.BamR ΔFibを、右ITRに隣接するPacI部位が生成するように修飾した。ここでは、pBr/ Ad.BamRΔFibをAvrIIで消化し、5kbアデノ断片を単離し、ベクターpBr/Ad.Bam-r ITR.pac#8（実施例２に記載）に導入して、対応するAvrII断片を置換した。得ら れた構築物をpBr/Ad.BamRΔFib.pacと名付けた。 いったん異種ファイバー配列をpBr/Ad.BamRΔFib.pacに導入したら、そのファ イバー修飾右側アデノウイルスクローンを、実施例２にpWE/Ad.AflII-rITRにつ いて記述したように、大きいコスミドクローンに導入できる。そのような大きな コスミドクローンにより、回だけの相同組換えによるアデノウイルスの生成が可 能になり、その方法を極めて効率のよいものにする。 ヘキソンをコードするDNAを欠くアデノウイルスクローンの生成 アデノウイルス５型に基づく組換えアデノウイルスを用いる遺伝子治療法の主 な制限は、ヒト血清中に中和抗 体が存在することである。80〜90％もの人々がAd5に対する中和免疫性を持つ。 中和抗体の大半はヘキソンタンパク質に向けられる。異なる血清型に由来するヘ キソンタンパク質は、ウイルスの外側に露出していると予想されるループ中に存 在する極めて可変的な領域を示す（Athappillyら（1994）J.Mol.Biol.242,430-4 55）。大半の型特異的エピトープはこれらの著しく可変的な領域にマッピングさ れている（Toogoodら（1989）J.GenVirol.70,3203-3213）。したがってヘキソン 配列（の一部）を異なる血清型由来の対応する配列で置換することは、Ad5に対 する（既存の）中和抗体を回避する有効な戦略である。アデノウイルス血清型５ のヘキソンコード配列はヌクレオチド18841と21697の間にある。 代替アデノウイルス血清型由来のヘキソンコード配列の、アデノウイルス血清 型５骨格への容易な交換を助けるために、まずシャトルベクターを作製した。こ のサブクローンpBr/Ad.Eco-PmeIは、まずプラスミドpBr322をEcoRIとEcoRVで消 化し、pWE/Ad.AflII-Ecoの14kbPmeI-EcoRI断片を挿入することによって作製され た。このシャトルベクター中に、SanDIによる消化と再連結によって1430bp SanD I断片の欠失を作って、pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDiを得た。除去された断片は単一 のSpeI部位とMunI部位を含有する。pBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDIから、ヘキソンをコ ードするアデノウイルス血清型5DNAを欠失させた。ここでは、ヘキソン隣接配列 をPCRで増幅し、互いに連結することによって、ヘキソンコード領域を置換する 単一の制限部位を生成させた。これらのPCR反応には、４つの異なるオリゴヌク レ オチドΔhex1〜Δhex4が必要だった。 Δhex1：5'-CCT GGT GCT GCC AAC AGC-3' Δhex2：5'-CCG GAT CCA CTA GTG GAA AGC GGG CGC GCG-3' Δhex3：5'-CCG GAT CCA ATT GAG AAG CAA GCA ACA TCA ACA AC-3' Δhex4：5'-GAG AAG GGC ATG GAG GCT G-3' オリゴヌクレオチドΔhex1とΔhex2を使って得られる±1100bpの増幅DNA産物をB amHIとFseIで消化した。オリゴヌクレオチドΔhex3とΔhex4を使って得られる± 1600bpの増幅DNA産物をBamHIとSbfIで消化した。次に、これらの消化したPCR断 片をアガロースゲルから精製し、３部分の連結反応でT4リガーゼ酵素を用いて、 FseIとSbfIで消化したpBr/Ad.Eco-PmeIΔSanDIに連結した。この構築物を部分的 に配列決定して、正しいヌクレオチド配列と単一の制限部位MunIとSpeIの存在を 確認した。 pBr/Ad.Eco-PmeΔHexonは、単一の制限部位MunIおよびSpeIをヘキソン配列の それぞれ5'および3'末端に導入するプライマーを用いて、異なる血清型に由来す るウイルスDNAから増幅される異種ヘキソン配列を導入するためのシャトルベク ターとして役立つ。次にそのヘキソン修飾配列はAscI断片の交換によって構築物 pWE/Ad.AflII-rITRに導入されて、pWE/Ad.AflII-rITRHexXXを生成する。ここにX Xはヘキソン配列を増幅するために使用した血清型を表す。 ペントンをコードするDNAを欠くアデノウイルスクローンの生成 アデノウイルス５型ペントン遺伝子は配列14156と15869の間に位置する。ペン トン基部は、標的細胞へのウイルスのインターナリゼーションを媒介するウイル スアデノウイルスキャプシドタンパク質である。少なくとも一部の血清型（Ｃお よびＢ型）は、ペントン中のRGD配列の、細胞表面上のインテグリンとの相互作 用によってこれを達成することが示されている。しかしＦ型アデノウイルスはRG D配列を持たず、Ａ群とＤ群の大半のウイルスについては、ペントン配列が知ら れていない。したがってペントンは標的細胞特異性に関与するのかもしれない。 さらにペントンタンパク質は、キャプシドタンパク質として、アデノウイルスの 免疫原性に関与する。個々体は、遺伝子治療法の候補者である患者を含めて、そ の血清中にペントンタンパク質に対する既存の抗体を有しうる。したがってAd5 ペントン配列を他の血清型由来のペントン配列で置換することは、そのウイルス の感染特異性と免疫原性に影響を及ぼすだろう。Ad5に異種ペントン配列を導入 できるように、本発明者らは後述のプラスミドに基づく系を利用した。まず、構 築物pWE/Ad.AflII-EcoRI（実施例２に記載）から得られる7.2kb NheI-EcoRV断片 を、同じ酵素で消化したpBr322に挿入することによって、ペントン配列用のシャ トルベクターを作製した。得られたベクターをpBr/XNと名付けた。このプラスミ ドからAd5ペントン配列を欠失させて、単一の制限部位で置換した後、他の血清 型由来の新しいペントン配列を導入するために使用する。ここでは、pBr/XN中の ペントンの左隣接配列を、次のプライマーを用いてPCR増幅した： DP5-F：5'-CTG TTG CTG CTG CTA ATA GC-3'および DP5-R：5'-CGC GGA TCC TGT ACA ACT AAG GGG AAT ACA AG-3'。 DP5-Rは右隣接配列への連結用にBamHI部位（下線部）を持ち、また元のAd5ペン トン領域の5'末端に単一のBsrGI部位（太字）を導入する。 右隣接配列は、 DP3-F：5'-CGC GGA TCC CTT AAG GCA AGC ATG TCC ATC CTT-3'および DP3-3R：5'-AAA ACA CGT TTT ACG CGT CGA CCT TTC-3' を使って増幅した。DP3-Fは左隣接配列への連結用にBamHI部位（下線部）を持ち 、また元のAd5ペントン領域の3'末端に単一のAflII部位（太字）を導入する。得 られた２つのPCR断片をBamHIで消化し、互いに連結した。次に、その連結混合物 をAvrIIとBglIIで消化した。pBr/XNもAvrIIとBglIIで消化し、そのベクター断片 を、消化し連結したPCR断片に連結した。得られたクローンをpBr/Ad.Δpentonと 名付けた。Ad5以外の血清型に由来するペントンコード配列を、その5'末端と3' 末端がそれぞれBsrGI部位とAflII部位を含有するようにPCR増幅した。それら異 種ペントン配列をpBr/Ad.Δpentonに導入することによってpBr/Ad.pentonXXが生 成する。ここにXXは挿入されるペントン配列を増幅するのに使用した血清型に対 応する血清型の番号を表す。次に、共通するFseI断片を交換することによって、 pWE/Ad.AflII-rITR構築物に新しいペントン配列を導入した。pWE/Ad.AflII-rITR の代わりに、pBr/Ad.pentonXX から得られるFseI断片を、修飾ヘキソンおよび/またはファイバー配列を持つpWE /Ad.AfllII-rITRベクターに挿入することもできることは重要である。このよう にして、アデノウイルスを生成するためのプラスミドに基づくシステムは、標的 細胞の感染の効率と特異性および免疫原性に関して望ましい特徴を持つアデノウ イルスの自由度の高い設計を可能にする。 実施例11 複製性ウイルスの生成 後述の組換えアデノウイルスを生成するためのプラスミドに基づくシステムは 、複製性ウイルスを生成させるのにも極めてよく適している。複製性ウイルスは 、腫瘍細胞の根絶を目指す遺伝子治療法に使用できる。例えば、単純ヘルペスウ イルス−１チミジンキナーゼ遺伝子(Hsv-tk)を発現させる複製性アデノウイルス を用いた自殺遺伝子治療法は、そのベクターがより広く蔓延するため、向上した 効力を持ちうる。安全性は、ガンシクロビルの投与によっていつでも複製をブロ ックできることによって確保される。 HSV-tkまたはマーカー遺伝子を発現させる複製性ウイルスを、実施例２に記載 の二重相同組換え系で生成させた。ここでは次の構築物をパッケージング細胞に トランスフェクトする： − ベクター配列からアデノインサートを遊離させるためにEcoRIとSalIで消化 したpBr/Ad.lITR-SalI(9.4) − PacIとEcoRIで消化したpWE/Ad.AflII-EcoRI − SalIで消化したpBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K/luc²ま たはpBr/Ad.Bam-rITRΔgp19K/TK ここで、三番目の構築物は、E3領域に修飾を持つE1欠失ウイルスについて実施 例２に記述したようにマーカー遺伝子（ルシフェラーゼ）またはHSV-tk遺伝子で gp19Kコード領域を置換することによって作製されるpBr/Ad.Bam-rITR構築物の誘 導体である。 pBr/Ad.Bam-rITRの代わりに、pBr/Ad.Bam-rITRpac#2または#8、またはpBr/Ad.Ba m-rITRspにも、E3領域の修飾を導入できる。これにより、PacIによる消化でベク ター配列から右ITRを遊離させることができるようになり、ウイルスを生成させ る効率が増加する。 実施例12 上記プラスミドに基づくシステムを用いた組換えウイルスの生成は極めて効率が よく信頼できる 組換えウイルスの生成法は既にいくつか記述されている。それらの方法の一つ は、直鎖化されたアダプタープラスミドと共にパッケージング細胞にコトランス フェクトされる環状の大きなアデノウイルスプラスミドを利用する（Bettら、19 94）。この方法の効率は、ITRが大きなアデノウイルスプラスミド中でその末端 同士が（head-to-head）連結されているという事実ゆえに低い。他の方法では、 組換えウイルスDNAクローンをもたらす特殊化した細菌での組換え段階を利用す る（Chartierら,1996；Crouzetら,1997；Heら,1998）。クローンの制限分析と正 しい組換え体の選択後に、大バッチのDNAを製造するために異なる細菌株を形質 転換する必要がある。次に、直鎖化した断片がパッケージング細胞にトランスフ ェクトされ、トランスフェクション後１週間以内 に組換えウイルスが現れる。 以下に記述するプラスミドシステムは、上述の方法とは異なる。このシステム は、標準的な細菌における小さいアダプタープラスミドの容易な操作性と、直鎖 化した大きいアデノウイルスプラスミドによるパッケージング細胞での効率のよ い相同組換えとを併せ持つ。 E1相補パッケージング細胞における相同組換えの高い効率は下記の実験で例示 される。 96ウェルマイクロタイター組織培養プレート（プレート1）（オランダ・Grein er社、カクログ番号6555180）をまず、滅菌水に溶解したポリ-L-リジン(PLL、0. 1mg/ml)（Sigma社）で、各ウェルを室温にて20〜120分間インキュベートするこ とによってコーティングした。あるいは、コーティング済みの96ウェルプレート も使用できる（Becton and Dickinson社）。PLLと共にインキュベートした後、 各ウェルを100μlの滅菌水で２回洗浄し、室温で少なくとも２時間乾燥した。ト ランスフェクションの前日に、PER.C6細胞をトリプシン-EDTAを使って収集し、 計数した。次に細胞を100μlあたり45,000細胞の懸濁液に希釈し、次いでPLL被 覆96ウェルプレートの各ウェルに100μlを接種した。翌日、2.6μlのSalI直鎖化 pAd/CMV-LacZと2.6μlのPacI直鎖化pWE-Ad.AflII-rITRプラスミドDNA（共に1μg /μl）と95μlの無血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を、74.4μlの無血 清DMEMに希釈した25.6μlのリポフェクタミンと、リポフェクタミンをDNA混合物 に添加することによって混合した。そのDNA/リポフェクタミン混合物を室温に30 分間放置した後、1.3mlの無血清培地 を加えた。次に後者の混合物を、トランスフェクションに先立って200μlのDMEM で洗浄しておいたPER.C6接種ウェルに加えた（各ウェル30μl）。湿潤CO₂培養器 （37℃、10％CO₂）中で３時間後に、10％ウシ胎児血清、10mM MgCL₂を含む200μ lのDMEMを各ウェルに加え、そのプレートを湿潤CO₂培養器（37℃、10％CO₂）に 戻した。翌日、各ウェルの培地を、200μl DMEM、10％FCS、10mM MgCl₂で置換し た。次にそれらのプレートを湿潤CO₂培養器にさらに３日間放置し、その後、ウ ェルを−20℃で少なくとも１時間の凍結操作にかけ、次に融解して、ピペッティ ングを繰返すことによって再懸濁した。トランスフェクション効率を追加のプレ ートでlacZ染色法で測定したところ、トランスフェクトしたPER.C6細胞の各ウェ ルについて約40％であることがわかった。凍結/融解したトランスフェクト細胞 のうち100μlを、PLL被覆プレートなしで上述のように接種した新しいPER.C6細 胞を含むプレート（プレート2）の各ウェルに移した。第１のトランスフェクト プレートの凍結/融解細胞溶解液と共にインキュベートしたPCR.C6細胞を含む第 ２の96ウェルプレートをCPEについてチェックした。それらのウェルの少なくと も5％が明らかなCPEを２日後に示した。プレート１から得た溶解液による感染の ４日後に、そのプレートを１回の凍結-融解サイクルにかけ、各溶解ウェルから 得た10μlを、A549細胞（前日にDMEM、10％FCS中、100μlに接種した1×10⁴細胞 /ウェル）を接種したプレートのウェルに加えた。感染の２日後に、ウェルをlac Z活性について染色した。感染ウェルのうち、96％が感染され、青く染まった。 染色された全てのウェ ルと多数のウェルが100％の青色染色を、したがって、lacZを保持するアデノウ イルスベクターによる全ての細胞の形質導入を示した。組織培養フラスコでのMO I実験から外挿して、ウェル産生ウイルスのアデノウイルス力価は1mlあたり約10⁶ 〜10⁷感染単位だった。 LacZウイルスを含有するウェルのパーセンテージが高いことから、本発明者ら は、後述するアデノウイルス生成用のプラスミドに基づくシステムが極めて効率 的であると結論する。 極めて効率的であることに加えてこのシステムは極めて確実でもある。実施例 ２（セクションC）に記述したような常用のウイルス生成法を用いて、本発明者 らは完全なCPEを示すアデノウイルス感染細胞を含むT80フラスコを得る。合計16 回のトランスフェクションで様々な導入遺伝子（ルシフェラーゼ、LacZ、ラット IL-3、ヒトIL1α、HSV1-TK、ceNOS、hgp100）と様々なプロモーター（MLP、CMV 、E3またはレトロウイルスLTR）を保持するアダプタープラスミドとのコトラン スフェクション後に得られた様々なウイルスストックをプラーク精製にかけ、個 々のプラークを導入遺伝子の発現について試験した。合計145プラークのうち、 陰性であることがわかったのは２つだけだった。第１のプラーク精製で得た陽性 プラークを２回目のプラーク精製にかけると、試験したすべてのプラークが陽性 であることがわかった（試験した144中144）。これは、本発明のプラスミドに基 づくシステムが極めて確実であることを明らかに示している。 実施例13 大きいインサートを持つ最小アデノウイルスベクターの生成 実施例７および８では、E1発現パッケージング細胞における最小アデノウイル スベクターの産生方法について説明した。ここに述べる最小ベクターは目的遺伝 子の発現カセットとアデノウイルスITRおよびパッケージング配列だけを含有す る。アデノウイルスの効率的なパッケージングには、＞27kbのゲノム長さが必要 である（ParksおよびGraham,1997;J.Virol.71,3293-3298）。それゆえ、高い力 価の最小アデノウイルスを生産できるようにするには、最適なパッケージングサ イズに達するようにベクターにスタッファー（stuffer）DNAを含める必要がある 。遺伝子修正ベクターを設計する場合、標的とされるゲノム部位に相同なゲノム DNAの大きい断片を含めることができ、あるいはそれが必要でさえある。他の例 では、目的の遺伝子がパッケージングサイズを満たすほどには大きくなく、スタ ッファーを含める必要があるかもしれない。本発明者らはここに、スタッファー DNAを持つ、より大きい最小ベクターの構築と、そのようなベクターの生産法を 記述する まず、ベクターpMV/L420H(図24)とpMV/CMV-LacZを、左ITRに隣接する第２のNo tI部位が生成するように修飾した。ここでは、pMV/L420HをEcoRIで部分消化し、 線状断片を単離した。その断片を、5'-AATTGCGGCCGC-3'という配列のオリゴヌク レオチドをアニールすることによって得た二本鎖リンカーに連結した。正しいEc oRI部位に挿入されたNotIリンカーを持つクローンを選択した。このクローンをp MV/L420H.nn と名付けた。次に、pMV/CMV-LacZをScaIとBsrGIで消化し、アデノウイルスITRと Amp遺伝子の一部を欠く7kbp断片を単離した。次にこの断片を、pMV/L420H.nnか ら得られる0.7kbp ScaI-BsrGI断片に連結した。これにより、pMV/CMV-LacZ.nnが 得られた。両最小ベクターpMV/L420H.nnとpMV/CMV-LacZ.nnでは、ITRにNotI部位 が隣接している。これらのクローンは、そのベクター骨格がpWE15に基づくコス ミドベクターなので、スタッファーDNAの大きい断片を挿入するために使用でき る。スタッファーインサートは、活性な転写領域を含まないDNAの断片であれば なんでもよい。あるいは、上述の最小ベクターはゲノムDNAの大きな断片を挿入 するためにも使用できる。マーカー遺伝子が必要でない場合は、HSA遺伝子また はLacZ遺伝子の発現カセットが、その発現カセットの5'末端にあるAvrII部位のS naBIと、3'末端にある単一の部位を利用して、ゲノム断片で置換されるように、 挿入を行うことができる。好適なスタッファーDNAの一例は、ヒトジストロフィ ン（Dysthrophin）ゲノムDNAの第44イントロンの一部である（GenBankアクセッ ションコード：M86524）。上述の最小アデノウイルスベクターと31.7kbのジスト ロフィン（dystrophin）イントロン配列を含有する大きいコスミドクローンの生 成を以下に説明する。ここではジストロフィン配列をXhoIとBstBIで消化し、31. 7kb断片を単離する。その断片の一部を付着末端のままにしておき、一部をクレ ノーで補充する。次にpMV/L420H.nnをXhoIとClaIで消化し、付着末端を持つジス トロフィン断片に連結する。pMV/CMV-LacZ.nnをXhoIで消化し、 クレノー酵素で平滑化し、平滑化したジストロフィン断片に連結する。両方の連 結産物を上述のようにパッケージングする。この方法で生成した大きいクローン は、おそらくは大きいインサートとアデノウイルスの逆方向末端反復配列が２つ 存在するために、細菌では不安定な傾向がある。これら大きい最小ベクターを生 成するための改良された方法を以下に説明する。この方法では組換えウイルスの 生成にパッケージング細胞での強力な相同組換えシステムを利用する。 パッケージング細胞での相同組換えによる最小アデノウイルスベクターの生成 pMV/CMV-LacZ.nnをXhoIとNsiIで消化し、末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化 した。その線状断片を単離し、ジストロフィンイントロンから得られる、やはり T4 DNAポリメラーゼで平滑化した約17.5kbpのXhoI/KpnI断片に連結する。ジスト ロフィン断片を5'から3'に向かう方向に含有するクローンを選択した。pMV/CMV- LacZ.Dys5'と名付けたこのクローンは、LacZ発現カセットとジストロフィンイン サートの5'部分に加えて、アデノウイルスの左ITRとパッケージングシグナルを 含有する。次に、pMV/CMV-LacZ.nnをBglIIで消化することによって第２のクロー ンを作製した。次にその線状断片をNotIで部分的に消化し、その6.4kbベクター 断片をクレノーで平滑化し、単離した。次にこの断片を、T4 DNAポリメラーゼで 平滑化した18.8kbのPvuI-BstBIジストロフィン断片に連結した。ジストロフィン 断片を5'から3'に向かう方向に含有するクローンを選択した。pMV/Dys3'-ITRと 名付けたこのクローンは、 pMV/CMV-LacZ.Dys5'中のジストロフィン断片と4.5kbのオーバーラップを持つジ ストロフィンインサートを含有する。 全長31.7kb XhoI-BstBI断片を含有する最小アデノウイルスベクターは、アデ ノウイルスパッケージング細胞（例えばPER.C6)に、pMV/CMV-LacZ.Dys57およびp MV/Dys3'と、本発明に記述したようなアデノウイルスヘルパープラスミド、例え ばpWE/Ad.D5'またはpWE/AdHおよびSV40ラージＴ発現構築物(実施例７と８を参照 )をコトランスフェクトすることによって生成する。ここでは、pMV/CMV-LacZ.Dy s5'構築物をNotIおよびBstBIで消化し、MV/Dys3'をNotIおよびPvuIで消化して、 ベクター配列からITRを遊離させ、ジストロフィンインサートに結合するベクタ ーDNAの量を最小にし、そうすることによって、相同組換えと複製を可能にする 。 図面の簡単な説明 図１ pBS.PGK.PCRIの構築。pBS.PGK.PCRIはアデノウイルス５（Ad5）E1ヌ クレオチド459-916に操作可能に連結したヒトホスホグリセレートキナーゼプロ モーター（PGK）をコードする。このプラスミドを構築するには、Ad5ヌクレオチ ド459-916をプライマーEa-1およびEa-2でPCR増幅し、ClaIで消化し、pBluescrip t（Stratagene）のClaI-EcoR V部位にクローン化し、その結果、pBS.PCR1が得ら れる。PGKプロモーターを、SacIでの完全な消化およびEcoRIでの部分的消化によ ってpTNから切り出し、pBS.PCRIの対応する部位にクローン化し、その結果、pBS .PGK.PCRIが得られる。 図２ pIG.E1A.E1B.Xの構築。pIG.E1A.E1B.Xは、ヒトPGKプロモーターに操 作可能に連結したAd5ヌクレオチド459-5788（E1AおよびE1B領域）をコードする 。pIG.E1A.E1B.XはAd5 pIXタンパク質もコードする。pIG.E1A.E1B.Xは、pAT-X/S のScaI-BspEI断片をpBS.PGK.PCRIの対応する断片で置き換えることによって構築 される。 図３ pIG.EIA.NEO.の構築。pIG.E1A.NEOは、ヒトPGKプロモーターに操作可 能に連結したAd5ヌクレオチド459-1713をコードする。また、ネオマイシン耐性 遺伝子（Neo^R）およびＢ型肝炎ウイルス（HBV）ポリ（A）シグナルに機能的に連 結したE1Bプロモーターがコードされる。このプラスミドを構築するには、E1Bプ ロモーターおよびE1B 21kDaタンパク質の開始コドン(ATG)をプライマーEa-3およ びEp-2でPCR増幅し、ここに、Ep-2は21kDaタンパク質開始コドンにおいてNcoI部 位（5'-CCATGG）を導入する。PCR産物（PCII）をHpaIおよびNcoIで消化し、pAT- X/Sの対応する部位に連結し、pAT-X/S-PCR2を生成した。Neo^RおよびHBVポリ（A ）部位の一部を含有する、pTNのNcoI-StuI断片をpAT-X/S-PCR2のNcoI-NruI部位 に連結させ、pAT-PCR2-NEOを得た。HBVポリ（A）シグナルは、pAT-PCR2-NEOのSc aI-SalI断片をpTNの対応する断片で置き換え、pAT.PCR2.NEO.p(A)を生じさせ、p AT.PCR2.E1B.p(A)のScaI-XbaI断片をpIG.E1A.E1B.Xの対応する断片で置き換え、 pIG.E1A.NEOを生じさせることによって完成した。 図４ pIG.E1A.E1Bの構築。pIG.E1A.E1Bは、PGK プロモーターおよびHBVポリ（A）シグナルに操作可能に連結させたAd5ヌクレオ チド459-3510（E1AおよびE1Bタンパク質）を含有する。このプラスミドは、XhoI 部位を導入する、プライマーEb-1およびEb-2での、E1B55kDタンパク質のN-末端 アミノ酸のPCR増幅によって構築し、BglIIで消化し、pAT-X/SのBgl II-Nru-I部 位にクローン化し、pAT-PCR3を得た。pAT-PCR3のXbaI-XhoI断片をpIG.E1A.NEOの （HBVポリ（A）部位を含有する）XbaI-SalI断片で置き換えて、pIG.E1A.E1Bを得 た。 図５ pIG.NEOの構築。pIG.NEOはE1Bプロモーターに操作可能に連結したNEO^R を含有する。pIG.NEOは、E1BプロモーターおよびNeo^Rを含有するpIG.E1A.NEOの HpaI-ScaI断片をpBSのEcoR V-ScaI部位に連結することによって構築した。 図６ アデノウイルスパッケージング構築物による初代ベイビーラット腎臓 （BRK）細胞の形質転換。BRK細胞のサブコンフルエントのディッシュ（subconfl uent dishes）を、SV40初期プロモーターの制御下でAd5 E1B遺伝子を発現する、 １または５μｇのpIG.NEO、pIG.E1A.NEO、pIG.E1A.E1B.、pIG.E1A.E1B.X、pAd5X hoIC、またはpIG.E1A.NEOプラスpDC26いずれかでトランスフェクトした。トラン スフェクションの３週間後に、フォーカスが目に見え、細胞を固定し、ギムザ染 色し、フォーカスを計数した。示された結果は５連のディッシュ当たりのフォー カスの平均数である。 図７ pIG.E1A.NEOでトランスフェクトされたA549クローンおよびpIG.E1A.E 1B（PERクローン）でトラン スフェクトされたヒト胚網膜芽細胞（HER細胞）のウェスタンブロット分析。ト ランスフェクトされたA549細胞およびPER細胞におけるAd5 E1AおよびE1B 55kDお よび21kDタンパク質の発現は、E1A遺伝子産物およびMabs AIC6およびC1G11を認 識し、各々、E1B 55kDaおよび21kDaタンパク質を認識するマウスモノクローナル 抗体（Mab）M73でのウェスタンブロットによって測定した。Mab結合は、ホース ラディッシュペルオキシダーゼ−標識ヤギ抗−マウス抗体および増強された化学 ルミネセンスを用いて可視化した。293および911細胞を対照として供した。 図８ 293、911およびPER細胞株のサザーンブロット分析。細胞DNAを抽出し 、HindIII消化し、電気泳動し、Hybond N+膜（Amersham）に移した。pAd5.SalB のSspI-HindIII断片（Ad5ヌクレオチド342-2805）のランダムプライミングによ って生じた放射標識プローブにハイブリダイズさせた。 図９ PER.C3、PER.C5、PER.C6および911細胞のトランスフェクション効率 。細胞を6−ウェルプレート中で培養し、リン酸カルシウム共沈殿によって5μgp RSV,LacZで二連にてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に 、細胞をX-Galで染色し、青色の細胞を計数した。示された結果は、ウェル当た りの青色の細胞の平均パーセンテージである。 図10 アデノウイルスベクターpMLPI.TKの構築。 パッケージング構築物pIG.E1A.E1Bとの配列オーバーラップを有しないようにpML PI.TKを消化した。 pMLPI.TKは、pIG.E1A.E1Bとの配列オーバーラップの 領域の欠失およびLacZに由来する非コード配列の欠失によって、pMLPI.TKから誘 導した。pMLP.TKのSV40ポリ（A）配列を、BamHI部位を導入するプライマーSV40- 1およびBgl II部位を導入するSV40-2をPCR増幅した。pMLP.TKAd5配列2496ないし 2779を、Bgl II部位およびAd5-2を導入するプライマーAd5-1でPCR増幅した。両P CR産物をBgl II消化し、連結し、プライマーSV40-1およびAd5-2でPCR増幅した。 この第３のPCR産物をBamHIおよびAfl III消化し、pMLP.TKの対応する部位に連結 して、PMLPI.TKを得た。 図11A-B 新しいパッケージング構築物は新しいアデノウイルスベクターと の配列オーバーラップを有しない。パッケージング構築物である、911細胞で発 現されたpAd5XhoICと相同組換えおよび複製能力のあるアデノウイルスの形成の 結果となり得るアデノウイルスベクターpMLP.TKとの間の配列オーバーラップの 領域を示す（パネルA）。対照的に、新しいパッケージング構築物である、PER.C 6細胞で発現されたpIG.E1A.E1Bと新しいアデノウイルスベクターであるpMLPI.TK (パネルA)との間の、あるいは新しいパッケージング構築物であるpIG.E1A.NEOと 相同組換えおよび複製能力のあるアデノウイルスの結果となり得るアデノウイル スベクターpMLPI.TK（パネルB）との間の配列オーバーラップの領域はない。 図12 組換えアデノウイルスIG.Ad.MLPI.TKの生成 組換えアデノウイルスであるIG.Ad.MLPI.TKは、Sal I線状化pMLPI.TKおよびCl a I消化の野生型Ad5 DNA の右側アームでの293細胞のコトランスフェクションによって生成した。線状化p MLPI.TKおよび野生型Ad5DNAの間の相同組換えは、ヌクレオチド459-3510のE1欠 失を含有するIG.Ad.MLPI.TK DNAを生じる。293細胞は欠失されたAd5ゲノムをト ランス補足し、それにより、IG.Ad.MLPI.TK DNAの複製およびウイルス粒子への そのパッケージングを可能とする。 図13 アデノウイルス重複タンパク質を発現する細胞において重複し、複製 するアデノウイルス−由来の組換えDNA分子のデザインのための原理。E1、E2、E 3、E4、およびＬ領域のおおよその位置を示すアデノウイルス二本鎖DNAゲノムの ダイアグラムを示す。5'−末端に付着させた末端ポリヌクレオチド（TP）は塗り 潰した丸によって示される。アデノウイルスゲノムの右側アームは、制限酵素消 化による左側アームの除去によって精製することができる。293または911細胞へ の右側アームのトランスフェクションに続き、右側アーム上にコードされたアデ ノウイルスDNAポリメラーゼ（白色矢印）は、一本鎖形態のみを生じるであろう 。二本鎖または一本鎖DNAも、１つの末端においてITRを欠くので、複製すること ができない。DNAポリメラーゼ用の基質として働くことができる3'−末端にヘア ピン構造を形成できる配列を一本鎖DNAに供給することは、当該分子の全長に沿 ってヘアピン構造を延長するであろう。また、この分子は、DNAポリメラーゼ用 の基質として働くことができるが、生成物は、アデノウイルスタンパク質の存在 下で複製することができる両末端でITRとの重複した分子である。 図14 アデノウイルスゲノム複製 アデノウイルスゲノムは頂部の左側に示される。複製起点は、ゲノム末端にお いて左側および右側ITR内に位置する。DNA複製は２工程で起こる。複製は１つの ITRから進行し、娘重複と、アデノウイルスDNA結合性タンパク質（DBP、塗りつ ぶしていない丸）でコートされ、両末端におけるITR配列のアニーリングによっ てパンハンドル構造を形成することができる置換された親一本鎖とを生じる。該 パンハンドルは二本鎖ゲノムDNAを生じさせるためのDNAポリメラーゼ（Pol：白 色矢印）のための基質である。別法として、複製は両ITRから進行し、２つの娘 分子を生じ、それにより、パンハンドル構造のための要件を軽減する。 図15 HP/asp配列を含有する一本鎖DNA分子の潜在的ヘアピン立体配座 クローン化オリゴヌクレオチド、HP/asp1およびHP/asp2を含有するpICLhaのAs p718 I消化は、一端におけるAd5 ITRを持つ線状二本鎖DNAおよび他の末端におけ るHP/asp配列を生じる。アデノウイルスE2領域を発現する細胞において、一本鎖 DNAは5'−末端のAd5 ITRおよび3'−末端のヘアピン立体配座にて生産される。一 旦形成されたら、ヘアピンは、一本鎖DNAを二本鎖DNAに変換するための、細胞お よび／またはアデノウイルスDNAポリメラーゼ用のプライマーとして働くことが できる。 図16 pICLhacのダイアグラム pICLhacはpICLの全ての要素（図19）を含有するが、Asp718部位において、図1 5に示されたヘアピン構造を 生じるであろう向きのHP/asp配列も含有し、続いてAsp718消化により線状化され 、アデノウイルスE2タンパク質を発現する細胞へトランスフェクトされる。 図17 pICLhawのダイアグラム pICLhawは、挿入されたHP/asp配列が反対向きである以外は、pICLhac(図16)と 同一である。 図18 pICLI.の模式的表示 pICLIはpICLの全ての要素を含有するが（図19）、Aap718部位に、Ad5 ITRを含 有する。 図19 pICLのダイアグラム pICLは以下の（i）ヌクレオチド1-457、左側ITRを含めたAd5ヌクレオチド1-45 7、(ii)ヌクレオチド458-969、ヒトCMVエンハンサーおよび即時型プロモーター 、(iii)ヌクレオチド970-1204、SV40 19Sエクソンおよび切形16/19Sイントロン 、（iv）ヌクレオチド1218-2987、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、(v)ヌクレオチ ド3018-3131、後期転写体からのSV40タンデムポリアデニル化シグナル、（vi） ヌクレオチド3132-5620、Asp718部位を含むpUC12配列、および（vii）逆向きの アンピシリン耐性遺伝子に由来する。 図20 pBR322（プラスミド）またはpWE15（コスミド）由来ベクターにおい てクローン化したアデノウイルス断片の模式的外観を示す。頂部の線は、そのIT R(塗り潰した三角形)と近接して挟まれ、示されたいくつかの制限部位を持つ完 全なアデノウイルスゲノムを示す。制限部位に続く数は、Ad5ゲノムにおける近 似的消化部位（kb単位）を示す。 図21 アダプタープラスミドpAd/L420-HSAの図 面 図22 アダプタープラスミドpAd/Clipの図面 図23 プラスミド−ベースのシステムを用いる組換えアデノウイルスの生成の 模式的表示 頂部において、Ad5のゲノム組織は、異なる初期および後記転写領域、および フランキングITRを表す塗り潰した箱で与える。中央は、単一の相同組換えで用 いた２つのDNAを表し、パッケージング細胞へのトランスフェクション後に、組 換えウイルスに至る（底部に表示）。 図24 最小アデノウイルスベクターpMY/L420Hの図面 図25 ヘルパー構築物PWE/AdΔ5'の生成のためのクローニング工程の模式的 表示である。 図26 Cos-1細胞における大きなアデノウイルス構築物のＳＶ40−ラージT/o ri媒介複製についての証拠 Ａ）構築物pWE/Ad.Δ5'の模式的表示およびSV40 ori配列およびプローブを調 製するのに用いた断片の位置。Ｂ）アデノウイルスプローブにハイブリダイズし たサザーンブロットのオートラジオグラム。Ｃ）pWEプローブにハイブリダイズ したサザーンブロットのオートラジオグラム。レーン１、マーカーレーン:EcoRi およびHidIIIで消化したλDNA。レーン４は空である。レーン２、５、７、９、1 1、13、15および17は未消化DNAを含有し、レーン３、６、８、10、12、14、16お よび18はMboI消化DNAを含有する。全てのレーンは、pWE.pac（レーン２および３ ）、pWE/Ad.Δ5'構築物＃１（レーン５および６）、＃５（レーン７および８） および＃９（レーン９および10）、pWE/Ad.AfIII-rITR（レーン11および12）、 pMV/CMV-LacZ（レーン13および14）、PacIで消化したpWE.pac（レーン15および1 6）またはPacIで消化したpWE/Ad.AfIII-rITR（レーン17および18）でトランスフ ェクトされた明細書に記載のCos-1細胞からのDNAを含有する。矢印は、1416bp（ B）および887bp（C）の予測された陽性シグナルを指す。 本明細書で言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当 業者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の 刊行物または特許出願を具体的にかつ個々に示して引用により本明細書に一体化 させるように、全ての刊行物および特許出願はここに引用して本明細書に同程度 に一体化させる。 さて、本発明を十分に記載してきたが、添付の請求の範囲の精神または範囲を 逸脱することなく、多くの変化および修飾を施すことができるのは当業者に明ら かであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. ２つの核酸分子を一緒に融合することからなるアデノウイルスベクターの生 成方法であって、前記分子が少なくとも２つの機能的なアデノウイルス逆方向末 端反復配列、機能的な封入シグナルおよび目的の核酸またはそれらの機能的部分 、誘導体および／または類似体からなる物理的に結合した核酸の生成を許しつつ 、互いに結合し得る配列を部分的にオーバーラップすることからなる方法。 2. 相同組換えにより、部分的にオーバーラップしている配列からなる２つの核 酸分子を一緒に融合することを含むアデノウイルスベクターの生成方法であって 、 該オーバーラップしている配列が、少なくとも２つの機能的なアデノウイルス 逆方向末端反復配列、機能的な封入シグナルおよび目的の核酸またはそれらの機 能的部分、誘導体および／または類似体からなる物理的に結合した核酸の生成を 導く本質的に唯一の相同組換えを許すアデノウイルスベクターの生成方法。 3. 前記核酸分子の両方が、唯一のアデノウイルス逆方向末端反復配列またはそ れらの機能的部分、誘導体および／または類似体からなる請求の範囲第１項また は第２項記載の方法。 4. 前記一緒に融合することが細胞またはそれらの機能的な断片、誘導体および ／または類似体において行なわれる請求の範囲第１項、第２項または第３項記載 の方法。 5. 前記細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第４項記 載の方法。 6. 前記核酸分子が、前記一緒に融合することに先立って前記哺乳動物細胞にお いて複製し得ない請求の範囲第５項記載の方法。 7. 前記核酸分子のうちの１つは相対的に小さく、かつその他は相対的に大きい 請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項または第６項記載の方法。 8. 前記核酸分子の少なくとも１つが、一方の側において他の核酸から本質的に 自由であるアデノウイルス逆方向末端反復配列からなる請求の範囲第１項、第２ 項、第３項、第４項、第５項、第６項または第７項記載の方法。 9. 前記アデノウイルス逆方向末端反復配列が、制限酵素を用いて、一方の側に おいて他の核酸に本質的に自由にされてなる請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記制限酵素が、前記核酸分子におけるアデノウイルスベクター核酸中にな い部位に作用してなる請求の範囲第９項記載の方法。 11．前記細胞に存在する核酸が、複製コンピテントアデノウイルスの形成へ導き うる配列のオーバーラップを含まない請求の範囲第４項、第５項、第６項、第７ 項、第８項、第９項または第10項記載の方法。 12．前記細胞の染色体の核酸が、少なくともアデノウイルスE1領域の機能的部分 、またはその機能的な誘導体および／または類似体からなる請求の範囲第４項、 第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第10項または第11項記載の方法。 13．前記細胞が、PER.C6細胞（ECACC受託番号 96022940）またはそれの機能的な誘導体および／または類似体である請求の範囲 第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第10項、第11項または第12 項記載の方法。 14．前記細胞中の前記核酸が、さらにアデノウイルスE2領域および／またはアデ ノウイルスE4領域タンパク質をコードする核酸からなる請求の範囲第４項、第５ 項、第６項、第７項、第８項、第９項、第10項、第11項、第12項または第13項記 載の方法。 15．少なくとも１つの前記核酸分子が直鎖状である請求の範囲第１項、第２項、 第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項、第10項、第11項、 第12項、第13項または第14項記載の方法。 16．少なくとも１つの前記分子が、少なくとも２つの異なるアデノウイルス血清 型由来のアデノウイルスキャプシドタンパク質をコードしている核酸からなる請 求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、 第９項、第10項、第11項、第12項、第13項、第14項または第15項記載の方法。 17．前記核酸分子の前記一緒に融合することが、少なくとも２つの機能的なアデ ノウイルス逆方向末端反復配列、機能的な封入シグナル、タンパク質をコードす る少なくとも１つのE2領域および／またはタンパク質をコードする少なくとも１ つのE4領域および関連の核酸またはそれらの機能的部分、誘導体および／または 類似体からなる物理的に結合した核酸の生成へ導き、タンパク質をコードする少 なくとも１つの前記E1領域が、条件付活性プロモーターの転写制御下にある請 求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、 第９項、第10項、第11項、第12項、第13項、第14項、第15項または第16項記載の 方法。 18．番号P97082122、番号P97082119、番号P97082117、番号P97082114、番号P970 82120、番号P97082121、番号P97082116、番号P97082115または番号P97082118でE CACCに寄託した組換え核酸またはそれらの機能的部分、誘導体および／または類 似体。 19．組換え核酸pWE/Ad.AflII-EcoRI、pAd5/CLIP、pAd5/L420-HAS、pBS.Eco-Eco/ ad5ΔHIIIΔgp19KΔXbaI、pMV/L420-H、pMV/CMV-LacZ、pWE/Ad.Δ5'、pWE/AAV. Δ5'、pWE/Ad-H。 20．図21および図22に示されたアデノウイルス由来ヌクレオチド1-454およびア デノウイルスヌクレオチド3511-6095からなる組換え核酸。 21．ECACCに番号P97082122、番号P97082119、番号P97082120、番号P97082116で 寄託したE3領域に欠失を含む組換え核酸。 22．前記欠失がgp19K領域からなる請求の範囲第21項記載の組換え核酸。 23．アデノウイルスに基づくか、または由来するヌクレオチド配列を備えた組換 え核酸であって、 該ヌクレオチド配列が複製およびキャプシド遺伝子発現のために必要で充分な アデノウイルス配列からなり、 該ヌクレオチド配列が少なくともE1領域および該アデノウイルスの封入シグナ ルの欠失からなる組換え核酸。 24．アデノウイルスに基づくか、または由来するヌクレオチド配列を備えた組換 え核酸であって、 該ヌクレオチド配列が複製およびキャプシド遺伝子発現に必要な充分なアデノ ウイルス配列、および前記核酸の同じ鎖の上流部分に対する相補配列を備え、 前記相補配列が、核酸ポリメラーゼのための開始部位として機能するため、前 記上流部分と塩基対を形成することができ、 前記ヌクレオチド配列が、前記アデノウイルスの１つの逆方向末端反復配列、 E1領域および封入シグナルの欠失からなる組換え核酸。 25．アデノウイルスに基づくか、または由来するヌクレオチド配列を備えた組換 え核酸であって、 前記ヌクレオチド配列が、アデノウイルスに依存しない複製のための配列、お よび複製に必要な充分のアデノウイルス配列からなり、 前記ヌクレオチド配列が、アデノウイルスのE1領域および封入シグナルを少な くとも１つの欠失からなる組換え核酸。 26．前記アデノウイルスに依存しない複製のための配列が、SV40の複製起点を含 む請求の範囲第25項記載の組換え核酸。 27．前記ヌクレオチド配列が、さらに少なくとも１つの前記アデノウイルスの逆 方向末端反復配列を含む請求の範囲第25項または第26項記載の組換え核酸。 28．前記ヌクレオチド配列が、前記核酸が転移された細胞において複製コンピテ ントウイルスへ導く相同組換えを許すオーバーラップしている配列をもたない請 求 の範囲第18項、第19項、第20項、第21項、第22項、第23項、第24項、第25項、第 26項または第27項記載の組換え核酸。 29．アデノウイルスに基づくか、または由来のヌクレオチド配列を備えたアダプ タープラスミドであって、 該ヌクレオチド配列が、 操作可能な立体配置において、 少なくとも１つの機能的な逆方向末端反復配列、 １つの機能的封入シグナル、および 相同組換えおよび複製欠損組換えアデノウイルスゲノムの生成を許すアデノウ イルス配列 を備えたアダプタープラスミド。 30．前記アダプタープラスミドが、前記アダプタープラスミドを細胞に転移され 、細胞において複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許す配列をもたな い請求の範囲第29項記載のアダプタープラスミド。 31．E1領域配列をもたない請求の範囲第30項記載のアダプタープラスミド。 32．さらにマルチクローニング部位および／または導入遺伝子などの目的の核酸 を含む請求の範囲第29項、第30項または第31項記載のアダプタープラスミド。 33．前記導入遺伝子が操作可能にE3プロモーターに連結されている請求の範囲第 18項、第19項、第20項、第21項、第22項、第23項、第24項、第25項、第26項、第 27項または第28項記載の組換え核酸、または請求の範囲第29項、第30項、第31項 または第32項記載のアダプタープラスミド。 34．E1欠失およびgp19K欠失を有する組換えアデノウ イルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１のヌクレオチド配列を備え たアダプタープラスミドと、 ii）アデノウイルスに基づくか、または由来する少なくとも１つの第２のヌクレ オチド配列からなる組換え核酸 とによってトランスフェクトしたアデノウイルス相補配列からなる細胞をE1欠失 およびgp19K欠失を有する組換えアデノウイルスが生成する条件下で増殖する工 程からなり、 前記第１のヌクレオチド配列が、操作可能な立体配置において １つの機能的な逆方向末端反復配列と、 １つの機能的な封入シグナルと、 細胞において複製欠損組換えアデノウイルスゲノムの生成を導く相同組換えを許 すアデノウイルス配列 とを備え、 前記アダプタープラスミドがE1領域配列をもたずに、前記細胞に転移され、 前記少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列が 複製のための１つの逆方向末端反復配列および充分なアデノウイルス配列と、 前記アダプタープラスミドと部分的なオーバーラップとからなり、 前記少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列が少なくともE1領域、封入シグナ ルおよびｇｐ19K配列の欠失からなり、 前記相補配列、第１のヌクレオチド配列および少なく とも１つの第２のヌクレオチド配列が、複製コンピテントウイルスへ導く相同組 換えを許すオーバーラップしている配列をもたない E1欠失およびgp19K欠失を有する組換えアデノウイルスの生成方法。 35．前記アダプタープラスミドが、さらに前記E1領域欠失へ挿入された第１の異 種のヌクレオチド配列からなり、かつ前記組換え核酸が、さらに前記gp19K領域 へ挿入された第２の異種のヌクレオチド配列からなる請求の範囲第34項記載の方 法。 36．組換えアデノウイルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１のヌクレオチド配列から なる第１の組換え核酸と、 ii）アデノウイルスに基づくか、または由来する第２のヌクレオチド配列を備 えた第２の組換え核酸 とによってトランスフェクトしたアデノウイルス相補配列からなる細胞を組換 えアデノウイルスが生成する条件下で増殖する工程からなり、 前記第１のヌクレオチド配列が、機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な 逆方向末端反復配列またはそれらの機能的な断片または誘導体を備え、かつ 前記第１の組換え核酸が機能的なアデノウイルス遺伝子をもたず、 前記第２のヌクレオチド配列が複製のための充分なアデノウイルス配列を備え 、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくとも該アデノウイルスのE1領域および封 入シグナルの欠失からなり、 前記相補配列、該第１のヌクレオチド配列および該第 ２のヌクレオチド配列が、複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許すオ ーバーラップしている配列をもたない 組換えアデノウイルスの生成方法。 37．組換えアデノウイルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１のヌクレオチド配列を備 えた第１の組換え核酸と、 ii）アデノウイルスに基づくか、または由来する第２のヌクレオチド配列を備 えた第２の組換え核酸 とによってトランスフェクトしたアデノウイルス相補配列を含む細胞を組換え アデノウイルスが生成する条件下で増殖する工程を含み、 前記第１のヌクレオチド配列が、機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な 逆方向末端反復配列またはそれらの機能的な断片または誘導体を備え、かつ 前記第１の組換え核酸が機能的なアデノウイルス遺伝子をもたず、 前記第２のヌクレオチド配列がアデノウイルスに依存しない複製のための配列 および複製に必要な充分なアデノウイルス配列を備え、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくとも該アデノウイルスのE1領域および封 入シグナルの欠失からなり、 前記相補配列、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列が 、複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許すオーバーラップしている配 列をもたない 組換えアデノウイルスの生成方法。 38．前記細胞がSV40ラージT抗原タンパク質またはそ の機能的断片を発現する少なくとも１つの核酸分子からなる請求の範囲第37項記 載の方法。 39．前記第２の組換え核酸分子が複製される請求の範囲第37項または第38項記載 の方法。 40．アデノウイルスに基づくか、または由来するゲノムを含む複製欠損アデノウ イルスであって、 前記ゲノムが、少なくとも機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な逆方向 末端反復配列またはそれらの機能的断片または誘導体からなり、 前記ゲノムが、 機能的なアデノウイルス遺伝子を含まず、前記複製欠損アデノウイルスが転移 された細胞において複製コンピテントウイルスへ導く相同組換えを許すオーバー ラップしている配列をもたない 複製欠損アデノウイルス。 41．１つまたは２つ以上の目的の核酸をさらに含む請求の範囲第40項記載の複製 欠損アデノウイルス。 42．請求の範囲第40項または第41項記載の複製欠損アデノウイルスのゲノムから なる非ヒト細胞。 43．前記細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第42項記載の非ヒト細胞。 44．細胞が形質導入される条件下で、請求の範囲第40項または第41項記載の複製 欠損アデノウイルスと前記細胞を接触させる工程からなる細胞の形質導入方法。 45．前記細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲第44項記載の方法により産生され た非ヒト細胞。 46．組換えアデノウイルスの生成方法であって、 i）アデノウイルスに基づくか、または由来する第１の ヌクレオチド配列を備えた第１の組換え核酸と、 ii）アデノウイルスに基づくまたは由来する第２のヌクレオチド配列を備えた 第２の組換え核酸 とによってトランスフェクトしたアデノウイルス相補配列を含む細胞を組換え アデノウイルスが生成する条件下で増殖する工程からなり、 前記第１のヌクレオチド配列が機能的な封入シグナルおよび２つの機能的な逆 方向末端反復配列またはそれらの機能的な断片または誘導体を備え、かつ前記第 １の組換え核酸が機能的なアデノウイルス遺伝子をもたず、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくともすべての複製に充分なアデノウイル ス配列、またはそれらの機能的断片または誘導体、および前記核酸と同じ鎖の上 流部分に対する相補配列からなり、 前記相補配列が、前記上流部分が核酸ポリメラーゼのための開始部位として機 能するために、前記上流部分と塩基対を形成することができ、 前記第２のヌクレオチド配列が少なくとも前記アデノウイルスの１つの逆方向 末端反復配列、E1領域および封入シグナルの欠失からなり、 前記相補配列、前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配 列が複製コンピテントウイルスを導く相同組換えを許容するオーバーラップして いる配列をもたない、 組換えアデノウイルスの生成方法。 47．請求の範囲第18項、第19項、第20項、第21項、第22項、第23項、第24項、第 25項、第26項、第 27項、第28項または第33項記載の組換え核酸、または請求の範囲第40項、第41項 、第55項または第56項記載の複製欠損アデノウイルスベクターおよび／または請 求の範囲第29項、第30項、第31項または第32項記載のアダプタープラスミドから なる細胞。 48．宿主細胞ゲノムにおける欠損遺伝子の置換方法であって、 前記宿主細胞ゲノムにおいて、前記欠損遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子 が置換される条件下で 前記欠損遺伝子の機能的バージョンまたはその部分を含む複製欠損アデノウイ ルス由来の組換え核酸分子とともに前記宿主細胞を増殖する工程からなる方法。 49．前記複製欠損アデノウイルスがアデノウイルス遺伝子を発現しない請求の範 囲第44項記載の方法。 50．前記欠損遺伝子が欠損腫瘍抑制遺伝子である請求の範囲第44項記載の方法。 51．請求の範囲第40項、第41項、第55項または第56項記載の複製欠損アデノウイ ルスのゲノムからなる分離された細胞。 52．前記細胞がヒト細胞である請求の範囲第51項記載の分離された細胞。 53．前記E3領域における欠失が導入遺伝子と置換されている請求の範囲第18項、 第19項、第20項、第21項、第22項、第23項、第24項、第25項、第26項、第27項ま たは第28項記載の組換え核酸。 54．請求の範囲第34項または第35項記載の方法であって、前記少なくとも１つの 第２の核酸が、第１および第２の分子を含み、前記第１の分子が3'末端に前記ア ダプタープラスミドとの部分的オーバーラップを有し、かつ前記第２の分子が前 記逆方向末端反復配列および前記gp19K配列の欠失を含む領域からなる方法。 55．アデノウイルスに基づくか、または由来のゲノムを含む複製欠損アデノウイ ルスであって、該ゲノムがE1領域中およびE1領域の第１の欠失およびgp19K領域 中の第２の欠失を含む複製欠損アデノウイルス。 56．前記導入遺伝子の転写がE3プロモーターに支配されている請求の範囲第55項 記載の複製欠損アデノウイルス。 57．請求の範囲第18項、第19項、第20項、第21項、第22項、第23項、第24項、第 25項、第26項、第27項、第28項または第33項記載の組換え核酸、または請求の範 囲第40項、第41項、第55項または第56項記載の複製欠損アデノウイルスベクター および／または請求の範囲第29項、第30項、第31項または第32項記載のアダプタ ープラスミドからなる分離された細胞。 58．前記細胞がヒト細胞である請求の範囲第57項記載の分離された細胞。