JP2024518553A - アデノウイルスヘルパープラスミド - Google Patents
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Abstract
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルスの産生のための改善されたアデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。【選択図】図１８
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年５月１３日出願の米国仮出願第６３／１８８，２９４号の利益を主張する。
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年５月１３日出願の米国仮出願第６３／１８８，２９４号の利益を主張する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）技術は、早くも、遺伝性疾患の遺伝子療法の主要な形態となっている。ＡＡＶは、ＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞を含む多様な宿主細胞系において大規模に産生することができる。従来的には、哺乳動物細胞におけるＡＡＶの産生は、宿主細胞への複数のプラスミド、例えば、目的のヒト遺伝子または複数の遺伝子、ならびにウイルス複製及びパッケージングでは重要な様々なウイルス遺伝子をコードするプラスミドの導入に関与する。適切な複製に必要な遺伝子の数に起因して、従来的には、これらは２つまたは３つの別々のプラスミド上で送達される。
「アデノウイルスヘルパー」プラスミドと称される１つのかかるプラスミドは、宿主細胞からのＡＡＶ産生に重要な遺伝子を含有する。Ｅ２ａ、ＶＡ ＲＮＡ、及びＥ４遺伝子を含有するアデノウイルスヘルパープラスミドは、哺乳動物宿主細胞系におけるＡＡＶ産生を促進するのに重要であることが示されている。
過去２０年にわたる大幅な進歩にもかかわらず、ＡＡＶ産生のコスト及び安全性に関する懸念は、ＡＡＶ技術の療法的潜在性を限定し続けている。これらの懸念は、部分的には、ＡＡＶ産生を支援するために単一のヘルパープラスミド上に多数の遺伝子を提供することに起因する、多くのヘルパープラスミドのサイズの大きさに起因する。安全性の懸念は、ＡＡＶ複製に必要ではない、低レベルではあるが潜在的な細胞傷害性及び／または炎症性ウイルスタンパク質の産生に部分的には起因する。
いくつかの実施形態では、本開示は、とりわけ、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、当該技術分野では既知のものと比較してサイズが低減されたアデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ２ａ、ＶＡ ＲＮＡ、Ｅ４；及びＬ４領域をコードするヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアデノウイルスヘルパープラスミドは、他のウイルスからのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ＨＳＶ－１ ＵＬ３０、ＨＳＶ－１ ＵＬ４２、及び／またはＨＳＶ－１ ＵＬ２９を含む他のウイルスからのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、線維タンパク質；Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）、ペントン周辺へキソン（ｐｅｒｉｐｅｎｔｏｎａｌ Ｈｅｘｏｎ）関連タンパク質、及びＬ４領域のうちの１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含まない、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ２ａタンパク質、ＶＡ ＲＮＡ、Ｅ４、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）、ペントン周辺ヘキソン関連タンパク質、及びＬ４領域の断片、一部分、または部分的な形態を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ヘキソン関連前駆体（Ｌ４ ｐＶＩＩＩ）タンパク質、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼのうちの１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含まない、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ４ｏｒｆ１及びＥ４ｏｒｆ２のうちの１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含まない、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるアデノウイルスヘルパープラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ２ａタンパク質の発現が、Ｅ２ａプロモータ、チキンβ－アクチンプロモータ、及びＳＶ４０プロモータのうちの１つ以上の制御下にある、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ４オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）の発現が、チキンβ－アクチンプロモータ及びＳＶ４０プロモータのうちの１つ以上の制御下にある、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１～３、５、７、９、１１～１２、１４～２０、２２、２４、２６～２９、３１、３３、３５～３７、３９～７０、７２、７４、７６、７８、または８０と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４、６、８、１０、１３、２１、２３、２５、３０、３２、３４、３８、７１、７３、７５、７７、７９、または８１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４１～６６のうちのいずれか１つと少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。
定義
薬剤：一般に、本明細書で使用される「薬剤」という用語は、実体（例えば、脂質、金属、核酸、ポリペプチド、多糖、小分子など、またはそれらの複合体、組み合わせ、混合物、もしくは系［例えば、細胞、組織、生物］）、または現象（例えば、熱、電流または電界、磁力または磁界など）を指すために使用される。適切な状況下では、当業者には文脈から明らかになるように、この用語は、細胞もしくは生物、またはその画分、抽出物、もしくは成分である、またはそれを含む実体を意味するように用いられ得る。あるいはまたは加えて、文脈が明らかにするであろうように、この用語は、天然に見出される及び／または天然から得られるという点で天然産生物を指すために使用され得る。場合によっては、再び、文脈から明らかであろうように、この用語は、人の手による作用を通じた設計、操作、及び／または産生される、及び／または天然では見出されないという点で人工的である、１つ以上の実体を指すために使用され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、単離形態または純粋形態で利用され得、いくつかの実施形態では、薬剤は、粗形態で利用され得る。いくつかの実施形態では、潜在的な薬剤は、例えば、それらの中の活性薬剤を同定または特徴付けるためにスクリーニングされ得る、コレクションまたはライブラリとして提供され得る。場合によっては、「薬剤」という用語は、ポリマーであるかまたはポリマーを含む化合物または実体を指し得、場合によっては、この用語は、１つ以上のポリマー部分を含む、化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、「薬剤」という用語は、ポリマーではない、及び／または任意のポリマー及び／または１つ以上の特定のポリマー部分を実質的に含まない、化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、いかなるポリマー部分も欠いているかまたは実質的に含まない、化合物または実体を指し得る。
薬剤：一般に、本明細書で使用される「薬剤」という用語は、実体（例えば、脂質、金属、核酸、ポリペプチド、多糖、小分子など、またはそれらの複合体、組み合わせ、混合物、もしくは系［例えば、細胞、組織、生物］）、または現象（例えば、熱、電流または電界、磁力または磁界など）を指すために使用される。適切な状況下では、当業者には文脈から明らかになるように、この用語は、細胞もしくは生物、またはその画分、抽出物、もしくは成分である、またはそれを含む実体を意味するように用いられ得る。あるいはまたは加えて、文脈が明らかにするであろうように、この用語は、天然に見出される及び／または天然から得られるという点で天然産生物を指すために使用され得る。場合によっては、再び、文脈から明らかであろうように、この用語は、人の手による作用を通じた設計、操作、及び／または産生される、及び／または天然では見出されないという点で人工的である、１つ以上の実体を指すために使用され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、単離形態または純粋形態で利用され得、いくつかの実施形態では、薬剤は、粗形態で利用され得る。いくつかの実施形態では、潜在的な薬剤は、例えば、それらの中の活性薬剤を同定または特徴付けるためにスクリーニングされ得る、コレクションまたはライブラリとして提供され得る。場合によっては、「薬剤」という用語は、ポリマーであるかまたはポリマーを含む化合物または実体を指し得、場合によっては、この用語は、１つ以上のポリマー部分を含む、化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、「薬剤」という用語は、ポリマーではない、及び／または任意のポリマー及び／または１つ以上の特定のポリマー部分を実質的に含まない、化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、いかなるポリマー部分も欠いているかまたは実質的に含まない、化合物または実体を指し得る。
およそ／約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、記載の参照値と同様である値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかではない限り、記載の参照値のいずれかの方向（上回るかまたは下回る）に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に収まる値の範囲を指す（かかる数が、取り得る値の１００％を超える場合を除く）。
同等な：本明細書で使用される場合、「同等な」という用語は、互いに同一ではない場合があるが、それらの間の比較を可能にするのに十分に同一である２つ以上の薬剤、実体、状況、条件のセットなどを指すので、当業者は、観察された差または類似性に基づいて結論を合理的に引き出すことができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、条件、状況、個体、または集団の同等なセットは、複数の実質的に同一の特徴及び１つまたは少数の様々な特徴によって特徴付けられる。当業者は、文脈に応じて、任意の所与の状況において、２つ以上のかかる作用因子、実体、状況、条件のセットなどが同等とみなされるために、どの程度の同一性が必要とされるかを理解するであろう。例えば、当業者は、異なる状況、個体、または集団のセットの下でまたはそれらを用いて得られた結果または観察された現象における差が、これらの変動する特徴における変動によって引き起こされるかまたはこの変動によって示されるという合理的な結論を保証するのに十分な数及び種類の実質的に同一の特徴によって特徴付けられる場合、状況、個体、または集団のセットは、互いに同等であることを理解するであろう。
に対応する：本明細書で使用される場合、「に対応する」という用語は、適切な参照化合物または組成物との比較を通じて、化合物または組成物における構造的要素の位置／素性を示すために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ポリマー中のモノマー残基（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸残基またはポリヌクレオチド中の核酸残基）は、適切な参照ポリマー中の残基「に対応する」ものとして同定され得る。例えば、単純化の目的のために、ポリペプチド中の残基が、多くの場合、参照関連ポリペプチドに基づく正規の番号付けシステムを使用して示されるので、例えば、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸は、実際には特定のアミノ酸鎖中の１９０番目のアミノ酸である必要はなく、むしろ、参照ポリペプチド中に１９０で見出される残基に対応することを、当業者は理解し、当業者は、「対応する」アミノ酸をどのように同定するかを容易に理解するであろう。例えば、当業者は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＣＵＳＡＳＷ＋＋、ＤＩＡＭＯＮＤ、ＦＡＳＴＡ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ／ＧＬＳＥＡＲＣＨ、Ｇｅｎｏｏｇｌｅ、ＨＭＭＥＲ、ＨＨｐｒｅｄ／ＨＨｓｅａｒｃｈ、ＩＤＦ、Ｉｎｆｅｒｎａｌ、ＫＬＡＳＴ、ＵＳＥＡＲＣＨ、ｐａｒａｓａｉｌ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｓｅａｒｃｈ、ＳｃａｌａＢＬＡＳＴ、Ｓｅｑｕｉｌａｂ、ＳＡＭ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＳＷＡＰＨＩ、ＳＷＡＰＨＩ－ＬＳ、ＳＷＩＭＭ、またはＳＷＩＰＥなどのソフトウェアプログラムを含み、例えば、本開示に従って、ポリペプチド及び／または核酸中の「対応する」残基を同定するために利用することができる、様々な配列アラインメント戦略を認識しているであろう。
下流：本明細書で使用される場合、「下流」という用語は、参照核酸配列と比較した核酸配列の場所または位置、特に、ＲＮＡ転写中に、参照配列によってコードされる転写されるＲＮＡ分子の３’末端に近い位置を指す。例えば、配列Ａが配列Ｂの下流にあるような２つの配列Ａ及びＢでは、配列Ｂの転写は、配列Ａに向かって進む。
核酸：本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているかまたは組み込まれ得る、任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているかまたは組み込まれ得る、化合物及び／または物質である。文脈から明らかであろうように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指し、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるかまたはＲＮＡを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるかまたはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、またはそれからなり、ペプチド核酸は、当該技術分野では既知であり、ホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を骨格に有し、本発明の範囲内であるとみなされる。あるいはまたは加えて、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート化塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然核酸のものと比較して修飾された、１つ以上の糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産生物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的なテンプレートに基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組換え細胞または系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の残基長である。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に一本鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である、少なくとも１つの因子を含む、ヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
操作可能に連結された：本明細書で使用される場合、「操作可能に連結された」という用語は、記載の構成要素が、それらがその意図された様式で機能することを可能にする関係にある、並列関係を指す。機能的因子に「操作可能に連結された」制御因子は、機能的因子の発現及び／または活性が、制御因子と適合する条件下で達成されるような方式で会合している。いくつかの実施形態では、「操作可能に連結された」制御因子は、目的のコード因子と連続しており（例えば、共有結合しており）、いくつかの実施形態では、制御因子は、目的の機能的因子に対してトランスで、または目的の機能的因子からある距離で、作用する。
産生細胞：本明細書で使用される場合、「産生細胞」という用語は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するために使用される任意の細胞を指す。いくつかの実施形態では、産生細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、形質転換された哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはそれらの誘導体である。
形質転換：本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、外因性ＤＮＡが宿主細胞に導入される任意のプロセスを指す。形質転換は、当該技術分野では周知の様々な方法を使用して、天然または人工の条件下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に依存し得る。いくつかの実施形態では、特定の形質転換方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、交配、リポフェクションを挙げることができる。いくつかの実施形態では、「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが自律複製プラスミドとして、または宿主染色体の一部としてのいずれかで複製することが可能であるという点で安定的に形質転換される。いくつかの実施形態では、形質転換された細胞は、限定的な期間の間、導入された核酸を一過性に発現する。
上流：本明細書で使用される場合、「上流」という用語は、参照核酸配列と比較した核酸配列の場所または位置、特に、ＲＮＡ転写中に、参照配列によってコードされる転写されるＲＮＡ分子の５’末端に近い位置を指す。例えば、配列Ａが配列Ｂの上流にあるような２つの配列Ａ及びＢでは、配列Ｂの転写は、配列Ａから離れて進む。
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルスゲノムに追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞内でベクターが自律的に複製することが可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性の哺乳動物ベクターなど）。他のベクター（例えば非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクターは、ベクターに操作可能に連結された遺伝子の発現を誘導することが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換の標準的な技術（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野では一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように行われ得る。上記の技術及び手順は一般に、当該技術分野では周知の従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通して引用され、考察される、一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されるようにして行うことができる。例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
［発明を実施するための形態］
［発明を実施するための形態］
アデノウイルスがＡＡＶ複製に提供するヘルパー機能は、以前に記載されている。任意の特定の仮説に拘束されることを望むものではないが、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質は、ＡＡＶ Ｐ５ ｒｅｐプロモータを結合及び活性化することによってＡＡＶ遺伝子発現を活性化すると記載されている。同様に、別のアデノウイルスタンパク質であるＥ２Ａは、ＡＡＶ Ｐ５プロモータ転写を活性化すると記載されている。Ｅ２Ａはまた、ウイルス関連ＲＮＡ Ｉ（ＶＡ ＲＮＡＩ）と協働して、ＡＡＶ ＲＮＡの翻訳を向上すると記載されている。アデノウイルスＥ４ｏｒｆ４は、Ｇ２／Ｍ境界で細胞周期停止を誘導する、ならびにＡＡＶ産生を補助すると示されている。アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６は、インビトロ及びインビボの両方のウイルスＤＮＡ複製の速度制限ステップである、一本鎖組換えＡＡＶゲノムの二本鎖ゲノムへの変換を向上すると記載されている。ＶＡ ＲＮＡＩはまた、ＡＡＶ複製を支援すると記載されている。ＶＡ ＲＮＡＩは、二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）と物理的に相互作用し、ウイルスタンパク質産生を阻害する抗ウイルス免疫応答を誘発するであろうと記載されている。
以前の研究は、Ｅｌ遺伝子を提供するＨＥＫ２９３細胞における効率的な組換えＡＡＶ産生のためのトランスでの遺伝子の最小セットが、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、及びＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子であることを示唆している。この遺伝子セットを含有するｐＸＸ６と名付けられたヘルパープラスミドは、アデノウイルスを含まない組換えＡＡＶの産生に使用される。
臨床用途のＡＡＶベクターの開発及び最適化における１つの主要な継続的な課題は、産生されるウイルスの量を増加させることである。それらの非増殖性の性質に起因して、それらの産生は、パッケージング細胞株（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、ＨＥＫ２９３もしくはＨＥＫ２９３Ｔ、または昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９）へのパルボウイルスゲノム構成要素のトランスフェクション効率にのみ依存する。したがって、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）産生を増加させる手段を開発することは、依然として非常に重要である。
臨床用途のｒＡＡＶの産生に関連する他の主要な課題は、かかるｒＡＡＶを大量に産生するためのコスト、及びまた最終産生物自体の安全性に関連する。例えば、ｐＸＸ６－８０などの市販のヘルパープラスミドは、低レベルのＡｄ線維タンパク質を転写するように思われる。重要なことに、線維タンパク質は、ＡＡＶ産生に必要ではなく、ヒトにおいて免疫原性であり得る。加えて、ｐＸＸ６－８０のサイズは、１８ｋｂを上回り、やや大きい。この大きいプラスミドサイズは、その製造の難しさ及びコストを増加させ、臨床グレードのＡＡＶの製造のためにＧＭＰプラスミドを元とする場合、非常に影響を与え得る。
アデノウイルスヘルパープラスミドの異なるバージョンは、例えば、（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａで誘導された）ｐＦＡｄＤｅｌｔａＦ６及びｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含む他のものによって誘導されている。ｐＦＡｄＤｅｌｔａＦ６プラスミドは、ｐＸＸ６－８０よりも約３ｋｂ小さいが、線維遺伝子配列を保持する。Ａｇｉｌｅｎｔから入手可能であるｐＨｅｌｐｅｒプラスミドは、ｐＸＸ６－８０よりも小さく、約１１．６ｋｂである。しかしながら、それは、ＡＡＶ産生で使用されるプラスミドでは一般に推奨されないアンピシリン耐性遺伝子を含有する。
本開示は、本明細書に記載の組成物及び方法を提供することによって、上記の技術的課題に対処する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ウイルスヘルパータンパク質をコードするアデノウイルスＤＮＡ配列を含む、アデノウイルス由来ヘルパープラスミド（アデノウイルスヘルパープラスミド）に関する。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生方法において使用される。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ｒＡＡＶの産生を増加させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、アデノウイルスではない供給源に由来するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、アデノウイルス以外のウイルスに由来するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルスタンパク質Ｅ２ａ及びＥ４をコードするアデノウイルスヌクレオチド配列の全部または一部分、ならびに非コードＲＮＡ ＶＡ ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、主要な市販のアデノウイルスヘルパープラスミドよりも小さく、かつ産生細胞発現系におけるｒＡＡＶのより安全かつより低コストの産生を可能にする、改善されたアデノウイルスヘルパープラスミドについて記載する。
いくつかの実施形態では、本開示は、現在利用可能なアデノウイルスヘルパープラスミド（例えば、１８．９３２ｋｂｐのｐＸＸ６－８０、１８．８７６ｋｂｐのｐＡＬＤ－Ｘ８０、１１．６３５ｋｂｐのｐＨｅｌｐｅｒ、１５．４２０ｋｂｐのｐＦＡｄＤｅｌｔａＦ６）と比較して全体的なサイズが低減されている、アデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、より小さいサイズを有するアデノウイルスヘルパープラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、およそ６．５ｋｂ～１５．５ｋｂである。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、およそ６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または１６ｋｂであるサイズを有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、およそ６～７ｋｂ、６．５～７．５ｋｂ、７－８ｋｂ、７．５～８．５ｋｂ、８～９ｋｂ、８．５～９．５ｋｂ、９～１０ｋｂ、９．５～１０．５ｋｂ、１０～１１ｋｂ、１０．５～１１．５ｋｂ、１１～１２ｋｂ、１１．５～１２．５ｋｂ、１２～１３ｋｂ、１２．５～１３．５ｋｂ、１３～１４ｋｂ、１３．５～１４．５ｋｂ、１４～１５ｋｂ、１４．５～１５．５ｋｂ、１５～１６ｋｂであるサイズを有する。本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドのより小さいサイズは、ＡＡＶの大規模製造に必要な量でのＡＡＶのより単純かつ低コストの産生を可能にする。いくつかの実施形態では、産生細胞は、下流処理中にＡＡＶと同時精製され得るアデノウイルス構造タンパク質（例えば、線維）を産生せず、したがって、アデノウイルス構造タンパク質を患者に不注意に導入するリスクがより低いことを提示するので、遺伝子及び／または遺伝子の一部分を除去することは、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドをより安全にする。
いくつかの実施形態では、より小さいアデノウイルスヘルパープラスミドを生じるアデノウイルスヘルパー遺伝子の除去は、補完的遺伝子の追加を可能にして、ＡＡＶの質及び収率を更に改善する。これらの補完的遺伝子は、最小のバージョンと比較してプラスミドのサイズを増加させるが、それらは、同等またはより高いＡＡＶ産生性を可能にし、したがって、産生するための追加のコストに見合う価値がある。重要なことに、これらのプラスミドは、例えば、ｐＡＬＤ－Ｘ８０などの市販のヘルパープラスミドよりも依然として小さい。
アデノウイルスヘルパープラスミド
ヘルパー遺伝子及び耐性遺伝子
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ４、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ１ｂ１９Ｋ、Ｅ１ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＶＡ ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。
ヘルパー遺伝子及び耐性遺伝子
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ４、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ１ｂ１９Ｋ、Ｅ１ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＶＡ ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａタンパク質、Ｅ４領域、及びＶＡ ＲＮＡ領域をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ４領域は、Ｅ４ｏｒｆ１、Ｅ４ｏｒｆ２、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ４ｏｒｆ４、Ｅ４ｏｒｆ５、Ｅ４ｏｒｆ６、及びＥ４ｏｒｆ７のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ１は、配列番号７０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ１は、配列番号７１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ２は、配列番号７２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ２は、配列番号７３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ３は、配列番号７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ３は、配列番号７５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ４は、配列番号７６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ４は、配列番号７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ６は、配列番号７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ６は、配列番号７９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ７は、配列番号８０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ７は、配列番号８１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ４ｏｒｆ１を含むヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ４ｏｒｆ２を含むヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ４ｏｒｆ１を含むヌクレオチド配列を含まず、Ｅ４ｏｒｆ２を含むヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、Ｅ４領域の発現は、Ｅ４ミニプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ４領域は、Ｅ４ミニプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｅ４ミニプロモータは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｅ４領域は、ＳＶ４０プロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｅ４領域の発現は、ＳＶ４０プロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０プロモータは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子（例えば、アンピシリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子（例えば、カナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含まない。
線維遺伝子
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、完全長アデノウイルス線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス線維タンパク質の一部分または断片をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列を除いて、ｐＸＸ６－８０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、完全長アデノウイルス線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス線維タンパク質の一部分または断片をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、アデノウイルス線維タンパク質をコードするヌクレオチド配列を除いて、ｐＸＸ６－８０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含まない。
Ｌ４領域
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（ヘキソンアセンブリ）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（ヘキソンアセンブリ）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４カプシド化タンパク質遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、完全なＬ４カプシド化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４カプシド化タンパク質遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子を含まず、Ｌ４カプシド化タンパク質遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４カプシド化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）をコードするヌクレオチド配列を含まず、Ｌ４カプシド化タンパク質遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４ ３３ ｋＤａ Ｅｘ２の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４ ３３ ｋＤａ Ｅｘ２の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ４ ３３ ｋＤａ Ｅｘ２の断片をコードするヌクレオチド配列は、Ｅ２ａプロモータ領域を含む（例えば、Ｃａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ２ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９．１（２００５）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａプロモータ領域は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｌ４ ３３ ｋＤａ Ｅｘ２の断片をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａプロモータ領域を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ヘキソン関連前駆体（Ｌ４ ｐＶＩＩＩ）の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ヘキソン関連前駆体（Ｌ４ ｐＶＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、部分的なヘキソン関連前駆体（Ｌ４ ｐＶＩＩＩ）の断片をコードするヌクレオチド配列を含まない。
ＶＡ ＲＮＡ領域
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するＶＡ ＲＮＡ領域を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するＶＡ ＲＮＡ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩＩ遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するＶＡ ＲＮＡ領域を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するＶＡ ＲＮＡ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩＩ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ領域は、配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有するＶＡ ＲＮＡＩＩ遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ＤＮＡ末端タンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ末端タンパク質の断片をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ末端タンパク質の断片は、配列番号２１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＤＮＡ末端タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、２３ｋＤａエンドプロテアーゼの断片をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号２２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ領域の断片は、配列番号２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ領域をコードするヌクレオチド配列を含まない。
補完的特徴をコードする遺伝子の導入
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号２５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現はプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、プロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモータは、例えば、ＣＭＶプロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＥＦ－１αプロモータ、Ｕｂｃプロモータ、ＣＡＧプロモータ、またはβ－アクチンプロモータである。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、転写エンハンサに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、転写エンハンサは、例えば、ＣＭＶエンハンサである。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、調節イントロンに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現は、チキンβ－アクチンプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、チキンβ－アクチンプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータは、配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列の上流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現は、Ｅ２ａプロモータ及びチキンβ－アクチンプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ２ａプロモータ及びチキンβ－アクチンプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータは、Ｅ２ａプロモータの上流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現は、チキンβ－アクチンプロモータ及びＣＭＶエンハンサの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、チキンβ－アクチンプロモータ及びＣＭＶエンハンサに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータ及びＣＭＶエンハンサは、Ｅ２ａプロモータの上流に位置する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルは、配列番号２７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルの下流に位置する。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、配列番号２８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有する。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号２５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現はプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、プロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモータは、例えば、ＣＭＶプロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＥＦ－１αプロモータ、Ｕｂｃプロモータ、ＣＡＧプロモータ、またはβ－アクチンプロモータである。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、転写エンハンサに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、転写エンハンサは、例えば、ＣＭＶエンハンサである。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、調節イントロンに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現は、チキンβ－アクチンプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、チキンβ－アクチンプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータは、配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列の上流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現は、Ｅ２ａプロモータ及びチキンβ－アクチンプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ２ａプロモータ及びチキンβ－アクチンプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータは、Ｅ２ａプロモータの上流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａの発現は、チキンβ－アクチンプロモータ及びＣＭＶエンハンサの制御下にある。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列は、チキンβ－アクチンプロモータ及びＣＭＶエンハンサに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、チキンβ－アクチンプロモータ及びＣＭＶエンハンサは、Ｅ２ａプロモータの上流に位置する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルは、配列番号２７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、Ｅ２ａをコードするヌクレオチド配列の下流に位置する。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、Ｅ２ａポリアデニル化シグナルの下流に位置する。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、配列番号２８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有する。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＨＳＶ－１に由来するＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列ＵＬ３０は、配列番号３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＨＳＶ－１に由来するＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ＵＬ４２のアミノ酸配列は、配列番号３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＨＳＶ－１に由来するＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列、及びＨＳＶ－１に由来するＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列及びＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列は、Ｐ２ａ切断部位によって分離されている。いくつかの実施形態では、Ｐ２ａ切断部位は、配列番号３３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｐ２ａ切断部位は、配列番号３４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０及び／またはＵＬ４２遺伝子の発現は、ＥＦ－１αプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、プロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＥＦ－１αプロモータ、Ｕｂｃプロモータ、ＣＡＧプロモータ、またはβ－アクチンプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、転写エンハンサに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、転写エンハンサは、例えば、ＣＭＶエンハンサである。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、調節イントロンに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列及び／またはＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、ＥＦ－１αプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＥＦ－１αプロモータは、配列番号３５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０及び／またはＵＬ４２の発現は、ＳＶ４０プロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列及び／またはＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０プロモータは、配列番号６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、β－グロビンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列の下流にポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列の下流にβ－グロビンポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、β－グロビンポリアデニル化シグナルは、配列番号３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有する。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列の下流にウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化シグナルは、配列番号６９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有する。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＨＳＶ－１に由来するＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＵＬ２９のアミノ酸配列は、配列番号３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列は、プロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＵＬ３０をコードするヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＥＦ－１αプロモータ、Ｕｂｃプロモータ、ＣＡＧプロモータ、またはβ－アクチンプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列は、転写エンハンサに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、転写エンハンサは、例えば、ＣＭＶエンハンサである。いくつかの実施形態では、ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列は、調節イントロンに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＵＬ２９の発現は、ＨＳＶ ＴＫプロモータの制御下にある。いくつかの実施形態では、ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列は、ＨＳＶ ＴＫプロモータに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ ＴＫプロモータは、配列番号３９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列の下流にポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、β－グロビンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列の下流にＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルは、配列番号４０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一である配列を有する。
例示的なアデノウイルスヘルパープラスミド
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）（配列番号３；配列番号４）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号５；配列番号６）、Ｌ４カプシド化タンパク質（２２ｋＤａ）（配列番号７；配列番号８）、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体（配列番号１２；配列番号１３）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１～５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、及びペントン周辺ヘキソン関連遺伝子を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）（配列番号３；配列番号４）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号５；配列番号６）、Ｌ４カプシド化タンパク質（２２ｋＤａ）（配列番号７；配列番号８）、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体（配列番号１２；配列番号１３）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１～５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、及びペントン周辺ヘキソン関連遺伝子を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、及びＥ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、及びＥ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、及びＥ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＥ４領域の上流のＥ４ミニプロモータを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、及びＥ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＥ４領域の上流のＥ４ミニプロモータを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号４９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体を含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＥ４領域の上流のＥ４ミニプロモータを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、及びＥ４領域の上流のＥ４ミニプロモータを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、Ｅ４領域の上流のＥ４ミニプロモータ、Ｅ４ｏｒｆ１をコードする遺伝子、Ｅ４ｏｒｆ２をコードする遺伝子、及びＥ４ｏｒｆ３をコードする遺伝子を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＥＦ－１αプロモータ（配列番号３５）、及びＵＬ４２の下流のβ－グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号３６）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号６８）、及びＵＬ４２の下流のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号６９）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号６８）、及びＵＬ４２の下流のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号６９）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端プロテアーゼ、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号６８）、及びＵＬ４２の下流のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号６９）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号６８）、及びＵＬ４２の下流のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号６９）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号６８）、及びＵＬ４２の下流のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号６９）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端プロテアーゼ、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、及びＥ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、及びＥ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号６８）、及びＵＬ４２の下流のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号６９）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＥ４領域の上流のＥ４ミニプロモータを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ３０遺伝子（配列番号２９；配列番号３０）、ＨＳＶ－１由来のＵＬ４２遺伝子（配列番号３１；配列番号３２）、ＵＬ３０の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号６８）、及びＵＬ４２の下流のウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号６９）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、ＤＮＡ末端プロテアーゼ、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、及びＥ４領域の上流のＥ４ミニプロモータを含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４ミニプロモータ（配列番号１）、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）（配列番号９；配列番号１０）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ａ（配列番号１４）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ａ（配列番号１６）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ａ（配列番号１８）、部分的なＤＮＡ末端タンパク質（配列番号２０；配列番号２１）、２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域（配列番号２２；配列番号２３）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータ、ＨＳＶ－１由来のＵＬ２９遺伝子（配列番号３７；配列番号３８）、ＵＬ２９の上流のＨＳＶ ＴＫプロモータ（配列番号３９）、及びＵＬ２９の下流のＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナル（配列番号４０）を含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、及びＬ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体を含まないかまたはコードしない。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、配列番号６６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有する以下の構成要素：Ｅ４領域の上流のＳＶ４０プロモータ（配列番号２）、ＶＡ ＲＮＡ領域Ｂ（配列番号１５）、ＶＡ ＲＮＡＩ－Ｂ（配列番号１７）、ＶＡ ＲＮＡＩＩ－Ｂ（配列番号１９）、Ｅ２ａ（配列番号２４；配列番号２５）、Ｅ２ａの下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号２８）、Ｅ４ｏｒｆ６の下流のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号６７）、及びＥ２ａの上流のチキンβ－アクチンプロモータを含み、以下の構成要素：線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、ペントン周辺ヘキソン関連遺伝子、完全長Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子、Ｌ４カプシド化タンパク質、Ｌ４ ｐＶＩＩＩヘキソン関連前駆体、Ｌ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２）、ＤＮＡ末端タンパク質、及び２３ｋＤａエンドプロテアーゼ断片領域、Ｅ４領域の上流のＥ４ミニプロモータ、Ｅ４ｏｒｆ１をコードする遺伝子、Ｅ４ｏｒｆ２をコードする遺伝子、及びＥ４ｏｒｆ３をコードする遺伝子を含まないかまたはコードしない。
産生方法
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ｒＡＡＶを産生する方法で有用である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、産生細胞のトランスフェクションによって産生される。いくつかの実施形態では、産生細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、形質転換された哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはそれらの誘導体である。
いくつかの実施形態では、本開示のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ｒＡＡＶを産生する方法で有用である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、産生細胞のトランスフェクションによって産生される。いくつかの実施形態では、産生細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、形質転換された哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはそれらの誘導体である。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、ＡＡＶベクタープラスミド、ＡＡＶＲｅｐ－Ｃａｐ発現プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドで産生細胞をトランスフェクションすることを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び目的の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、本明細書に記載の任意のアデノウイルスヘルパープラスミドである。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、安定的にＲｅｐ－Ｃａｐを発現する産生細胞のトランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶを産生する方法は、ＡＡＶベクタープラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミドで安定的にＲｅｐ－Ｃａｐを発現する産生細胞のトランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び目的の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスヘルパープラスミドは、本明細書に記載の任意のアデノウイルスヘルパープラスミドである。
本開示に記載の作業の主な目的は、より小さく、不必要なアデノウイルス遺伝子をほとんど含有せず、最も一般的に使用されるアデノウイルスヘルパープラスミドと同様に、またはより良好に機能する、ｒＡＡＶ産生のための新規のアデノウイルスヘルパープラスミドを開発することである。
本開示で提供されるプラスミドを新規に合成し、配列を検証し、大規模ｒＡＡＶ製造で使用するためにスケールアップした。ｒＡＡＶ産生の研究を行って、提供されたプラスミドを使用した場合のベクター収率を、他の市販のアデノウイルスヘルパープラスミドに対して比較した。また、異なるアデノウイルスヘルパープラスミドを用いて産生されたｒＡＡＶから、ベクターの質及び活性を評価して、提供されたプラスミドを用いて産生されたｒＡＡＶが、質において優れていない場合、少なくとも同等であることを確認した。まとめると、これらの以下の実施例は、潜在的により安全かつ費用対効果のより高い設計で提供されたアデノウイルスヘルパープラスミドが、高収率及び高品質のｒＡＡＶを生成することを実証する。
実施例１：本明細書に記載のアデノウイルスヘルパープラスミドを使用したｒＡＡＶの産生のための例示的な方法
対照アデノウイルスヘルパープラスミド（例えば、ｐＡＬＤ－Ｘ８０などの市販のプラスミド）または本明細書に記載のアデノウイルスヘルパープラスミドで、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ＡＡＶ９／ｓｓＣＭＶ－ＧＦＰを生成するために、ＰＥＩトランスフェクションを使用して、ｐＡＡＶｒｅｐ２ｃａｐ９及びｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰプラスミドとともに、アデノウイルスヘルパープラスミドを共トランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００溶解及びヌクレアーゼ添加（ＲＮＡ、細胞ゲノムＤＮＡ、及び残留するプラスミドＤＮＡを分解するため）を介して、ＨＥＫ２９３細胞を採取した。３時間の溶解／ヌクレアーゼ処理後、細胞溶解物を試料採取し、ｑＰＣＲ力価分析のために提出した。試料を別のヌクレアーゼ、次いでＥＤＴＡで処理し、熱処理して、続いて希釈した試料のｑＰＣＲによって、試料当たりのベクターゲノムコピー数を決定した。蛍光顕微鏡を使用して、トランスフェクション効率の測定基準としてＧＦＰ陽性細胞を定量化した。
対照アデノウイルスヘルパープラスミド（例えば、ｐＡＬＤ－Ｘ８０などの市販のプラスミド）または本明細書に記載のアデノウイルスヘルパープラスミドで、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。ＡＡＶ９／ｓｓＣＭＶ－ＧＦＰを生成するために、ＰＥＩトランスフェクションを使用して、ｐＡＡＶｒｅｐ２ｃａｐ９及びｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰプラスミドとともに、アデノウイルスヘルパープラスミドを共トランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００溶解及びヌクレアーゼ添加（ＲＮＡ、細胞ゲノムＤＮＡ、及び残留するプラスミドＤＮＡを分解するため）を介して、ＨＥＫ２９３細胞を採取した。３時間の溶解／ヌクレアーゼ処理後、細胞溶解物を試料採取し、ｑＰＣＲ力価分析のために提出した。試料を別のヌクレアーゼ、次いでＥＤＴＡで処理し、熱処理して、続いて希釈した試料のｑＰＣＲによって、試料当たりのベクターゲノムコピー数を決定した。蛍光顕微鏡を使用して、トランスフェクション効率の測定基準としてＧＦＰ陽性細胞を定量化した。
実施例２：線維、Ｌ１－５２／５５Ｋ、及びペントン周辺ヘキソン関連遺伝子を欠き、部分的なＬ４ヘキソン関連前駆体を有するアデノウイルスヘルパープラスミド
アデノウイルスヘルパープラスミドのサイズを低減するために、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＥＭＢＲ－１．２：配列番号４１）を、線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、及びヘキソン関連前駆体の大部分、ならびにペントン周辺ヘキソン関連タンパク質を欠くように設計した。ｐＸＸ６－８０などの市販のヘルパープラスミドと比較して、これらの欠失を作製した。アデノウイルスヘルパー遺伝子を合成し、カナマイシン耐性プラスミド骨格に組み立てた。生じたプラスミドは、ｐＸＸ６－８０よりもおよそ６．７ｋｂ小さい。
アデノウイルスヘルパープラスミドのサイズを低減するために、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＥＭＢＲ－１．２：配列番号４１）を、線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、及びヘキソン関連前駆体の大部分、ならびにペントン周辺ヘキソン関連タンパク質を欠くように設計した。ｐＸＸ６－８０などの市販のヘルパープラスミドと比較して、これらの欠失を作製した。アデノウイルスヘルパー遺伝子を合成し、カナマイシン耐性プラスミド骨格に組み立てた。生じたプラスミドは、ｐＸＸ６－８０よりもおよそ６．７ｋｂ小さい。
上記のアデノウイルスヘルパープラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶの産生を可能にした。ｑＰＣＲによって測定して、ｐＡＬＤ－Ｘ８０でトランスフェクトした細胞とｐＥＭＢＲ－１．２でトランスフェクトした細胞との間では、ＡＡＶベクター収率に大きな差は観察されなかった（図２を参照されたい）。ｐＥＭＢＲ－１．２で産生されたｒＡＡＶベクターは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってベクターカプシド純度を評価すると観察されるように、ＶＰタンパク質の正しい比で正常なベクターを産生し（図３を参照されたい）、アルカリゲル電気泳動によってベクター導入遺伝子純度を評価すると観察されるように、パッケージ化された正しいサイズの導入遺伝子を産生する（図３を参照されたい）。更に、ｐＥＭＢＲ－１．２は、細胞をトランスフェクトすることが可能な完全に機能的なベクターの産生を可能にした。ｐＡＬＤ－Ｘ８０またはｐＥＭＢＲ－１．２で産生されたＡＡＶＲＨ．１０／ｓｓＣＭＶ－ＧＦＰを生成するためのＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにおいて、差は観察されなかった（図４を参照されたい）。
実施例３：線維遺伝子及びＬ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子の大部分を欠くアデノウイルスヘルパープラスミド
アデノウイルスヘルパープラスミドのサイズを更に低減するために、線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、及びヘキソン関連前駆体の大部分、ならびにペントン周辺ヘキソン関連タンパク質（ｐＥＭＢＲ－１．２におけるように－実施例２を参照されたい）を欠き、完全なＬ４（ヘキソンアセンブリ）領域（ｐＥＭＢＲ－１．３：配列番号４２；図５を参照されたい）を更に欠く、アデノウイルスヘルパープラスミドを設計した。Ｅ２Ａプロモータを含有するＬ４領域の小さい断片、または部分的なＬ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２、配列番号９）は、保持されている。
アデノウイルスヘルパープラスミドのサイズを更に低減するために、線維遺伝子、Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）遺伝子、及びヘキソン関連前駆体の大部分、ならびにペントン周辺ヘキソン関連タンパク質（ｐＥＭＢＲ－１．２におけるように－実施例２を参照されたい）を欠き、完全なＬ４（ヘキソンアセンブリ）領域（ｐＥＭＢＲ－１．３：配列番号４２；図５を参照されたい）を更に欠く、アデノウイルスヘルパープラスミドを設計した。Ｅ２Ａプロモータを含有するＬ４領域の小さい断片、または部分的なＬ４（３３ｋＤａ Ｅｘ２、配列番号９）は、保持されている。
ｐＥＭＢＲ－１．３を更に最適化するために、ｐＥＭＢＲ－１．３のＶＡ ＲＮＡ領域を、ＡＡＶ－２に由来するＶＡ ＲＮＡ領域（ＶＡ ＲＮＡ－Ｂ：配列番号１５）で置き換えた。このバージョンを、ｐＥＭＢＲ－１．３Ｂ（配列番号４３；図５を参照されたい）と名付ける。このバージョンでは、（ＤＮＡ末端タンパク質またはエンドプロテアーゼ遺伝子配列に隣接せず）ＳｔｕＩ及びＢｓｒＧＩ部位に隣接して、ＡＡＶ－２ ＶＡ ＲＮＡＩ（配列番号１７）及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩ（配列番号１９）配列を合成し、この挿入物をｐＥＭＢＲ－１．３にクローニングした。
実施例４：線維遺伝子及びＬ４（ヘキソンアセンブリ）遺伝子を欠き、チキンβ－アクチンプロモータを含有してＥ２ａ発現を駆動するアデノウイルスヘルパープラスミド
ｐＥＭＢＲ－１．３プラスミドのウイルス産生性を向上するために、ｐＥＭＢＲ－１．３の特徴を含有し、Ｅ２ａタンパク質の発現を向上するためにＥ２ａ遺伝子の上流にチキンβ－アクチンプロモータ（配列番号２６）を更に含むアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＥＭＢＲ－１．４：配列番号４９；図６を参照されたい）を設計した。Ｌ４領域の大部分を除去することを通じて欠失された可能性のあるＬ４領域の他の部分におけるエンハンサ因子を考慮するために、チキンβ－アクチンプロモータを付加した。更に、Ｅ２Ａは、外因性プロモータによって駆動され得ることが以前示されている（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９８．５，９３８－９４５）及び（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７．Ｖｏｌ．８１．Ｎｏ．２１．１１９０８－１１９１６）。
ｐＥＭＢＲ－１．３プラスミドのウイルス産生性を向上するために、ｐＥＭＢＲ－１．３の特徴を含有し、Ｅ２ａタンパク質の発現を向上するためにＥ２ａ遺伝子の上流にチキンβ－アクチンプロモータ（配列番号２６）を更に含むアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＥＭＢＲ－１．４：配列番号４９；図６を参照されたい）を設計した。Ｌ４領域の大部分を除去することを通じて欠失された可能性のあるＬ４領域の他の部分におけるエンハンサ因子を考慮するために、チキンβ－アクチンプロモータを付加した。更に、Ｅ２Ａは、外因性プロモータによって駆動され得ることが以前示されている（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９８．５，９３８－９４５）及び（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７．Ｖｏｌ．８１．Ｎｏ．２１．１１９０８－１１９１６）。
ｐＥＭＢＲ－１．４の別のバージョンを、ｐＥＭＢＲ－１．３Ｂにおけるように、ＡＡＶ－２由来のＶＡ ＲＮＡ領域を含むように構築した。このバージョンを、ｐＥＭＢＲ－１．４Ｂ（配列番号５０；図６を参照されたい）と名付ける。
Ｅ２Ａの発現を更に向上するために、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むように、ｐＥＭＢＲ－１．４の別のバージョンを構築した。このバージョンを、ｐＥＭＢＲ－１．４Ｂ２（配列番号５１）と名付ける。
実施例５：修飾アデノウイルスヘルパープラスミドへの補完的アクセサリー遺伝子の導入
開示のアデノウイルスヘルパープラスミドを使用してＡＡＶ産生を更に促進するために、プラスミドのサイズが現在市販のアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡＬＤ－Ｘ８０など）のサイズを超えないことを確実にしながら、いくつかの補完的アクセサリー遺伝子を最小化されたプラスミドに付加した。
開示のアデノウイルスヘルパープラスミドを使用してＡＡＶ産生を更に促進するために、プラスミドのサイズが現在市販のアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡＬＤ－Ｘ８０など）のサイズを超えないことを確実にしながら、いくつかの補完的アクセサリー遺伝子を最小化されたプラスミドに付加した。
細胞がＳ期にない場合でさえもＡＡＶ導入遺伝子の複製を向上するために、ＨＳＶ－１ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＵＬ３０及びＵＬ４２）を付加して、ｐＥＭＢＲ－１．４に記載の特徴を含むように、ｐＥＭＢＲ－１．５（配列番号５７；図７を参照されたい）アデノウイルスヘルパープラスミドを設計した。Ｐ２Ａ切断部位を使用して２つのＨＳＶ－１ポリメラーゼタンパク質を分離して、（ＥＦ－１αコアプロモータによって駆動され、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナルによって終端する）単一の転写産物として作製されるように、ＵＬ３０及びＵＬ４２遺伝子を設計した。ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＰＧＫなどを含む任意の数のプロモータを使用してもよく、任意の数のポリＡ部位を使用してもよい。ｐＥＭＢＲ－１．５の追加のバージョン（例えば、ｐＥＭＢＲ－１．５Ａ：配列番号５８）を設計し、これは、ＵＬ３０及びＵＬ４２遺伝子が、ＥＦ－１αコアプロモータの代わりにＳＶ４０プロモータによって駆動される。
他の「Ｂ」設計と同様に、ＤＮＡ末端タンパク質またはエンドプロテアーゼ遺伝子配列に隣接しない、より小さいＡＡＶ－２由来のＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＩＩを含むように、ｐＥＭＢＲ－１．５Ｂの追加のバージョン（ｐＥＭＢＲ－１．５Ｂ：配列番号５９）を構築した。
他の「Ｂ２」設計と同様に、より高いＥ２Ａ発現のためにＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むように、ｐＥＭＢＲ－１．５Ｂ２の追加のバージョン（ｐＥＭＢＲ－１．５Ｂ２：配列番号６０）を構築した。
実施例６：修飾アデノウイルスヘルパープラスミドへの補完的アクセサリー遺伝子の追加導入
この実施例は、より小さいアデノウイルスヘルパープラスミドを生じるアデノウイルスヘルパー遺伝子の除去が、補完的遺伝子の付加を可能にして、ＡＡＶの質及び収率を更に改善することを更に確認する。具体的には、ｐＥＭＢＲ－１．２及びｐＥＭＢＲ－１．５ａ骨格プラスミドから、様々なサイズの様々な補完的遺伝子（例えば、ＵＬ３０、ＵＬ４２など）を含む様々なｐＥＭＢＲプラスミドを設計し、ＡＡＶの産生について試験した。
この実施例は、より小さいアデノウイルスヘルパープラスミドを生じるアデノウイルスヘルパー遺伝子の除去が、補完的遺伝子の付加を可能にして、ＡＡＶの質及び収率を更に改善することを更に確認する。具体的には、ｐＥＭＢＲ－１．２及びｐＥＭＢＲ－１．５ａ骨格プラスミドから、様々なサイズの様々な補完的遺伝子（例えば、ＵＬ３０、ＵＬ４２など）を含む様々なｐＥＭＢＲプラスミドを設計し、ＡＡＶの産生について試験した。
Ｅ２Ａの発現を潜在的に増加させるＳＶ４０ポリＡ部位と、隣接するＡｄ末端タンパク質またはエンドプロテアーゼ遺伝子配列を含有しないより小さいＶＡ領域の合成配列（Ａｄ２ ＶＡ ＲＮＡ Ｉ及びＶＡ ＲＮＡ ＩＩを含有する）と、を含む、「Ｂ２」設計を含むように、ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２（配列番号９４）アデノウイルスヘルパープラスミドを設計した。ＳｔｕＩ及びＢｓｒＧＩ部位に隣接してこの領域を合成し、挿入物をｐＥＭＢＲ－１．２にクローニングして、ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２を作製した。
上記の「Ｂ２」設計、及びＥ４遺伝子の発現を増加させるためにＥ４領域でＥ４ ＯＲＦ６の後に付加したＳＶ４０ポリ（Ａ）テールを含む「Ｃ」設計を含むように、ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｃ（配列番号９５）アデノウイルスヘルパープラスミド（図８を参照されたい）を設計した。ｐＥＭＢＲ－１．２ベクターと比較して、骨格配列の量を減少させ、プラスミドのサイズを更に減少させるように、この領域を合成した。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２にクローニングするために、ＰａｃＩ部位及びＮｏｔＩ部位に隣接して、このＥ４領域を合成した。
上記の「Ｂ２」設計、及びＥ４遺伝子の発現を増加させるためにＥ４領域でＥ４ ＯＲＦ６及び付加したＳＶ４０プロモータの後に付加したＳＶ４０ポリ（Ａ）テールを含む「Ｄ」設計を含むように、ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｄ（配列番号９６）アデノウイルスヘルパープラスミド（図９を参照されたい）を設計した。ｐＥＭＢＲ－１．２ベクターと比較して、骨格配列の量を減少させ、プラスミドのサイズを更に減少させるように、この領域を合成した。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２にクローニングするために、ＰａｃＩ部位及びＮｏｔＩ部位に隣接して、このＥ４領域を合成した。
ｑＰＣＲによって測定して、明確化された溶解物中のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）のベクター収率を、ｐＥＭＢＲ－１．２骨格から設計した様々なｐＥＭＢＲプラスミドを用いて図１７Ｂ及び１８に示す。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２、ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｃ、及びｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｄアデノウイルスヘルパープラスミドは、ｐＥＭＢＲ－１．２プラスミドと比較して、同等なＡＡＶ産生を生じた。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２、ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｃ、及びｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｄアデノウイルスヘルパープラスミドは、市販のプラスミド（例えば、ｐＨｅｌｐｅｒ）と比較して、同等以上のＡＡＶ産生を生じた。
ｐＥＭＢＲ－１．２Ｃ（配列番号９７）アデノウイルスヘルパープラスミドを、上記の他の「Ｃ」設計と同様に、「Ｃ」設計を含むように設計した。更に、ｐＥＭＢＲ－１．２Ｄ（配列番号９８）アデノウイルスヘルパープラスミドを、上記の他の「Ｄ」設計と同様に、「Ｄ」設計を含むように設計した。
ｑＰＣＲによって測定して、明確化された溶解物中のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）のベクター収率を、ｐＥＭＢＲ－１．２骨格から設計した様々なｐＥＭＢＲプラスミドを用いて図１７Ａ及び１８に示す。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｃ及びｐＥＭＢＲ－１．２Ｄアデノウイルスヘルパープラスミドは、ｐＥＭＢＲ－１．２プラスミドと比較して、同等なＡＡＶ産生を生じた。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｃ及びｐＥＭＢＲ－１．２Ｄアデノウイルスヘルパープラスミドは、市販のプラスミド（例えば、ｐＨｅｌｐｅｒ）と比較して、同等以上のＡＡＶ産生を生じた。
ｐＥＭＢＲ－１．５Ａ（配列番号５８）アデノウイルスヘルパープラスミド（図１０を参照されたい）を、実施例５に記載されるように設計した。ｐＥＭＢＲ－１．５Ａは、ｐＥＭＢＲ－１．４プラスミドに付加したＨＳＶ－１ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＵＬ３０及びＵＬ４２）を含む（ヘキソンアセンブリなし、Ｅ２ａに対する外因性プロモータ＋Ｅ２ａプロモータ領域を含むＬ４ ３３ ｋＤａ Ｅｘ２の断片をコードするヌクレオチド配列）。ＨＳＶ－１ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ＵＬ３０及びＵＬ４２）をｐＥＭＢＲ－１．５Ａプラスミドに戻して付加して、細胞がＳ期にない場合でさえも、ＡＡＶ導入遺伝子の複製を支援した。Ｐ２Ａ切断部位を使用して２つのＨＳＶ－１ポリメラーゼタンパク質を分離して、（ＳＶ４０プロモータによって駆動され、ウシ成長ホルモンポリＡによって終端する）単一の転写産物として作製されるように、ＵＬ３０及びＵＬ４０遺伝子を設計した。ＣＢＡ、ＣＭＶ、ＰＧＫなどを含む任意の数のプロモータを使用してもよく、任意の数のポリＡ部位を使用してもよい。
ｐＥＭＢＲ－１．５Ａ及びｐＥＭＢＲ－１．４の両方が、ｐＥＭＢＲ－１．２と比較して、実質的に低い力価でＡＡＶを産生したこと（図１７Ａ及びＢを参照されたい）を考慮して、ｐＥＭＢＲ－１．５Ａ（本質的にＵＬ３０及びＵＬ４２発現カセットを付加したｐＥＭＢＲ－１．４）は、プラスミド骨格がｐＥＭＢＲ－１．４に由来するので、実質的に低い力価でＡＡＶを産生したと推論した。したがって、ＵＬ３０及びＵＬ４２の付加がＡＡＶ力価にどのように影響するかを試験するために、ＵＬ３０及びＵＬ４２構築物を、比較的高い力価でＡＡＶを産生する他のプラスミドバージョンにクローニングした。
ＵＬ３０及びＵＬ４２発現カセットをｐＥＭＢＲ－１．５ＡプラスミドからｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２骨格にクローニングすることによって、ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２（配列番号９９）アデノウイルスヘルパープラスミド（図１１を参照されたい）を生成した。ＵＬ３０及びＵＬ４２領域をｐＥＭＢＲ－１．５Ａからのｂｌｕｎｔ切断ＸｍｎＩ及びＰｍｅＩで消化させ、切れ味を鈍くさせたＮｄｅＩ制限部位でｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２にクローニングした。Ｐ２Ａ切断部位を使用して２つのＨＳＶ－１ポリメラーゼタンパク質を分離して、（ＳＶ４０プロモータによって駆動され、ウシ成長ホルモンポリＡによって終端する）単一の転写産物として作製されるように、ＵＬ３０及びＵＬ４２遺伝子を設計した。この領域は、プラスミドの残りから独立して、ＵＬ３０及びＵＬ４２の発現を誘導するプロモータ及びポリＡシグナルの両方を含有するので、構築物をプラスミドにクローニングする方向は、理論上は発現に影響を及ぼさないはずであるが、反対方向のバージョンを設計した。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２骨格は、他のＢ２バージョンのプラスミドと同様に、上記の「Ｂ２」設計を含む。
ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２ ＯＯ（配列番号１００）アデノウイルスヘルパープラスミド（図１２を参照されたい）は、１．５５Ｂ２プラスミドと本質的に同じプラスミドであるが、ＵＬ３０及びＵＬ４２構築物を反対方向（ＯＯ）でｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２－ＯＯにクローニングした。
ＵＬ３０及びＵＬ４２発現カセットをｐＥＭＢＲ－１．５ＡプラスミドからｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２骨格にクローニングすることによって、ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｃ（配列番号１０１）アデノウイルスヘルパープラスミド（図１３を参照されたい）を生成した。ＵＬ３０及びＵＬ４２領域をｐＥＭＢＲ－１．５Ａからのｂｌｕｎｔ切断ＸｍｎＩ及びＰｍｅＩで消化させ、切れ味を鈍くさせたＮｄｅＩ制限部位でｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｃにクローニングした。Ｐ２Ａ切断部位を使用して２つのＨＳＶ－１ポリメラーゼタンパク質を分離して、（ＳＶ４０プロモータによって駆動され、ウシ成長ホルモンポリＡによって終端する）単一の転写産物として作製されるように、ＵＬ３０及びＵＬ４２遺伝子を設計した。この領域は、プラスミドの残りから独立して、ＵＬ３０及びＵＬ４２の発現を誘導するプロモータ及びポリＡシグナルの両方を含有するので、構築物をプラスミドにクローニングする方向は、理論上は発現に影響を及ぼさないはずであるが、反対方向のバージョンを設計した。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｃ骨格は、他のＢ２Ｃバージョンのプラスミドと同様に、上記の「Ｂ２」及び「Ｃ」設計を含む。
ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｃ ＯＯ（配列番号１０２）アデノウイルスヘルパープラスミド（図１４を参照されたい）は、１．５５Ｂ２Ｃプラスミドと本質的に同じプラスミドであるが、ＵＬ３０及びＵＬ４２構築物を反対方向（ＯＯ）でｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｃ－ＯＯにクローニングした。
ＵＬ３０及びＵＬ４２発現カセットをｐＥＭＢＲ－１．５ＡプラスミドからｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２骨格にクローニングすることによって、ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｄ（配列番号１０３）アデノウイルスヘルパープラスミド（図１５を参照されたい）を生成した。ＵＬ３０及びＵＬ４２領域をｐＥＭＢＲ－１．５Ａからのｂｌｕｎｔ切断ＸｍｎＩ及びＰｍｅＩで消化させ、切れ味を鈍くさせたＮｄｅＩ制限部位でｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２にクローニングした。Ｐ２Ａ切断部位を使用して２つのＨＳＶ－１ポリメラーゼタンパク質を分離して、（ＳＶ４０プロモータによって駆動され、ウシ成長ホルモンポリＡによって終端する）単一の転写産物として作製されるように、ＵＬ３０及びＵＬ４２遺伝子を設計した。この領域は、プラスミドの残りから独立して、ＵＬ３０及びＵＬ４２の発現を誘導するプロモータ及びポリＡシグナルの両方を含有するので、構築物をプラスミドにクローニングする方向は、理論上は発現に影響を及ぼさないはずであるが、反対方向のバージョンを設計した。ｐＥＭＢＲ－１．２Ｂ２Ｄ骨格は、他のＢ２Ｄバージョンのプラスミドと同様に、上記の「Ｂ２」及び「Ｄ」設計を含む。
ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｄ ＯＯ（配列番号１０４）アデノウイルスヘルパープラスミド（図１６を参照されたい）は、１．５５Ｂ２Ｄプラスミドと本質的に同じプラスミドであるが、ＵＬ３０及びＵＬ４２構築物を反対方向（ＯＯ）でｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｄ－ＯＯにクローニングした。
ｑＰＣＲによって測定して、明確化された溶解物中のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）のベクター収率を、ｐＥＭＢＲ－１．５Ａ ＵＬ３０及びＵＬ４２発現カセットを用いて設計した様々なｐＥＭＢＲプラスミドを用いて図１７Ｃに示す。ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２、ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｃ、及びｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｄアデノウイルスヘルパープラスミドは、ｐＥＭＢＲ－１．５Ａプラスミドと比較して、高いＡＡＶ産生を生じた。ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２、ｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｃ、及びｐＥＭＢＲ－１．５５Ｂ２Ｄアデノウイルスヘルパープラスミドは、ｐＥＭＢＲ－１．２プラスミドと比較して、同等以上のＡＡＶ産生を生じた。
実施例７：配列表
以下の配列表は、本明細書で考察される様々な配列を列挙し、記載している。別段の記載がない限り、プラスミドの正鎖の５’から３’の方向性で全ての配列を列挙する。この方向性は、配列と関連付けられると記載される遺伝子または因子の方向にかかわらず、保持される。本明細書で使用されるアスタリスクは、終止コドンを示す。
以下の配列表は、本明細書で考察される様々な配列を列挙し、記載している。別段の記載がない限り、プラスミドの正鎖の５’から３’の方向性で全ての配列を列挙する。この方向性は、配列と関連付けられると記載される遺伝子または因子の方向にかかわらず、保持される。本明細書で使用されるアスタリスクは、終止コドンを示す。
均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上の記載に限定されることを意図せず、以下の特許請求の範囲に記述される。
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上の記載に限定されることを意図せず、以下の特許請求の範囲に記述される。
Claims (47)
- （ａ）Ｅ２ａタンパク質、
（ｂ）Ｅ４領域、
（ｃ）ＶＡ ＲＮＡ領域、及び
（ｄ）Ｌ４領域、をコードするヌクレオチド配列を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドであって、
前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、
線維タンパク質またはその一部分、
Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）、及び
ペントン周辺ヘキソン関連タンパク質、のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含まない、前記アデノウイルスヘルパープラスミド。 - 前記ＶＡ ＲＮＡ領域が、配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＶＡ ＲＮＡ領域が、
（ａ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるＶＡ ＲＮＡＩヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号１８と少なくとも８０％同一であるＶＡ ＲＮＡＩＩヌクレオチド配列と、を含む、請求項２に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。 - 前記ＶＡ ＲＮＡ領域が、配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＶＡ ＲＮＡ領域が、
（ａ）配列番号１７と少なくとも８０％同一であるＶＡ ＲＮＡＩヌクレオチド配列と、
（ｂ）配列番号１９と少なくとも８０％同一であるＶＡ ＲＮＡＩＩヌクレオチド配列と、を含む、請求項４に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。 - 前記Ｌ４領域が、配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＬ４（ヘキソンアセンブリ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｌ４領域が、配列番号６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する部分的なＬ４（ヘキソンアセンブリ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｌ４領域が、配列番号１３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する部分的なヘキソン関連前駆体（Ｌ４ ｐＶＩＩＩ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記部分的なＬ４（ヘキソンアセンブリ）タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、Ｅ２ａプロモータ領域を含む、請求項７に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、配列番号２１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する部分的なＤＮＡ末端タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、ＤＮＡ末端タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、配列番号２３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する部分的な２３ｋＤａエンドプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、２３ｋＤａエンドプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｅ２ａタンパク質の発現が、Ｅ２ａプロモータの制御下にある、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｅ２ａタンパク質の発現が、Ｅ２ａプロモータ及びチキンβ－アクチンプロモータの制御下にあり、前記チキンβ－アクチンプロモータが、前記Ｅ２ａプロモータの上流にある、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｅ２ａタンパク質の発現が、前記チキンβ－アクチンプロモータの制御下にある、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記チキンβ－アクチンプロモータが、配列番号２６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１５または１６に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、前記Ｅ２ａの下流にＥ２ａポリアデニル化シグナルを含む、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、前記Ｅ２ａの下流にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが、前記Ｅ２ａポリアデニル化シグナルの下流にある、請求項１８に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが、配列番号２８と少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１９または２０に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- ＨＳＶ－１ ＵＬ３０及びＨＳＶ－１ ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列を更に含み、
前記ＵＬ３０が、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、
前記ＵＬ４２が、配列番号３２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、
前記ＵＬ３０及び前記ＵＬ４２が、配列番号３４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＰ２Ａ切断部位によって分離される、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。 - 前記ＵＬ３０及び前記ＵＬ４２の発現が、前記プラスミドのＥＦ－１αプロモータの制御下にある、請求項２２に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＥＦ－１αプロモータが、配列番号３５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項２３に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＵＬ４２の下流にβ－グロビンポリアデニル化シグナルを更に含み、前記β－グロビンポリアデニル化シグナルが、配列番号３６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項２２に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- ＨＳＶ－１ ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列を更に含み、
前記ＵＬ２９が、配列番号３８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。 - 前記ＵＬ２９の発現が、前記プラスミドのＨＳＶ ＴＫプロモータの制御下にある、請求項２６に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＨＳＶ－ＴＫプロモータが、配列番号３９と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項２７に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記ＵＬ２９の下流にＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルを更に含み、前記ＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルが、配列番号４０と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項２６に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｅ４領域が、Ｅ４ｏｒｆ１を含まず、前記Ｅ４領域が、Ｅ４ｏｒｆ２を含まない、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｅ４領域が、前記Ｅ４ミニプロモータに操作可能に連結され、前記Ｅ４ミニプロモータが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｅ４領域が、前記ＳＶ４０プロモータに操作可能に連結され、前記ＳＶ４０プロモータが、配列番号２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 以下のアデノウイルスＤＮＡ配列または領域：
（ａ）Ｅ２ａ、
（ｂ）Ｅ４領域、及び
（ｃ）ＶＡ ＲＮＡ領域、を含む、アデノウイルスヘルパープラスミドであって、
前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、以下の構成要素：
線維またはその一部分、
Ｌ１－５２／５５Ｋ（パッケージングタンパク質３）、
ペントン周辺ヘキソン関連タンパク質、及び
Ｌ４領域、のうちの１つ以上を含まない、前記アデノウイルスヘルパープラスミド。 - 配列番号４１～６６のうちのいずれか１つと８０％の配列同一性を有する、アデノウイルスヘルパープラスミド。
- 組換えアデノウイルス関連ウイルスベクターを産生する方法であって、
ＡＡＶベクタープラスミド、ＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐ発現プラスミド、及び請求項１～３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスヘルパープラスミドで産生細胞をトランスフェクトすることを含む、前記方法。 - 前記ＡＡＶベクタープラスミドが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び目的の導入遺伝子を含む、請求項３５に記載の方法。
- 組換えアデノウイルス関連ウイルスベクターを産生する方法であって、
ＡＡＶベクタープラスミド及び請求項１～３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスヘルパープラスミドで産生細胞をトランスフェクトすることを含み、
前記産生細胞が、安定的にＲｅｐ－Ｃａｐを発現する、前記方法。 - 前記ＡＡＶベクタープラスミドが、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）及び目的の導入遺伝子を含む、請求項３７に記載の方法。
- 前記Ｌ４領域が、配列番号３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、Ｌ４（ヘキソンアセンブリ）タンパク質をコードする、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｌ４領域が、配列番号５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、部分的なＬ４（ヘキソンアセンブリ）タンパク質をコードする、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記Ｌ４領域が、配列番号１２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、部分的なヘキソン関連前駆体（Ｌ４ ｐＶＩＩＩ）タンパク質をコードする、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、配列番号２０と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、部分的なＤＮＡ末端タンパク質をコードする、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、配列番号２２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、部分的な２３ｋＤａエンドプロテアーゼをコードする、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、ＨＳＶ－１ ＵＬ３０及びＨＳＶ－１ ＵＬ４２をコードするヌクレオチド配列を更に含み、
前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、配列番号２９と少なくとも８０％同一であり、
前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、配列番号３１と少なくとも８０％同一であり、
前記ＵＬ３０及び前記ＵＬ４２が、配列番号３３と少なくとも８０％同一である核酸配列によってコードされるＰ２Ａ切断部位によって分離される、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。 - 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、ＨＳＶ－１ ＵＬ２９をコードするヌクレオチド配列を更に含み、
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３７と少なくとも８０％同一である、請求項１に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。 - 前記アデノウイルスヘルパープラスミドが、耐性遺伝子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
- 前記耐性カセットが、カナマイシン耐性遺伝子である、請求項４６に記載のアデノウイルスヘルパープラスミド。
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