CN117897167A - 腺病毒辅助质粒 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于生产重组腺相关病毒的改进的腺病毒辅助质粒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年5月13日提交的美国临时申请号63/188,294的权益，其内容据此全文以引用方式并入本文。
背景技术
腺相关病毒(AAV)技术已经迅速成为遗传疾病基因治疗的主要形式。AAV可以在多种宿主细胞系统，包括哺乳动物细胞，诸如HEK293细胞中大规模生产。传统上，哺乳动物细胞中的AAV生产涉及将多个质粒引入宿主细胞，这些质粒编码例如一个或多个所关注的人类基因，以及对病毒复制和包装至关重要的各种病毒基因。由于正确复制所需的基因数量，这些基因传统上在两个或三个单独的质粒上递送。
一种此类质粒，称为“腺病毒辅助”质粒，含有对宿主细胞产生AAV至关重要的基因。含有E2a、VA RNA和E4基因的腺病毒辅助质粒已被证明对促进哺乳动物宿主细胞系统中AAV的产生至关重要。
尽管在过去的二十年里取得了很大进步，但对AAV生产的成本和安全性的担忧继续限制了AAV技术的治疗潜力。这些担忧部分是由于许多辅助质粒的大尺寸，这是由于在单个辅助质粒上提供大量基因来支持AAV的产生。安全性问题部分是由于AAV复制所不需要的潜在细胞毒性和/或炎性病毒蛋白的产生，尽管水平较低。
发明内容
在一些实施方案中，本公开尤其提供了腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，本公开提供了相对于本领域已知的那些具有减小的尺寸的腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，本公开提供了包含编码E2a、VA RNA、E4；和L4区域的核苷酸序列的腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，如本文所述的腺病毒辅助质粒包含编码来自其他病毒的蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的腺病毒辅助质粒包含编码来自其他病毒(包括HSV-1UL30、HSV-1UL42和/或HSV-1UL29)的蛋白质的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其不包含编码以下项中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列：纤毛(fiber)蛋白；L1-52/55K(包装蛋白3)、外周六邻体相关蛋白和L4区域。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含E2a蛋白、VA RNA、E4、L1-52/55K(包装蛋白3)、外周六邻体相关蛋白和L4区域的片段、部分或部分形式。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其不包含编码六邻体相关前体(L4 pVIII)蛋白、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其不包含编码E4orf1和E4orf2中的一者或多者的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，本文提供的腺病毒辅助质粒包含卡那霉素抗性基因。
在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其中E2a蛋白的表达在E2a启动子、鸡β-肌动蛋白启动子和SV40启动子中的一者或多者的控制下。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其中E4开放阅读框(orf)的表达在鸡β-肌动蛋白启动子和SV40启动子中的一者或多者的控制下。
在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含与SEQ ID NO:1-3、5、7、9、11-12、14-20、22、24、26-29、31、33、35-37、39-70、72、74、76、78或80具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含编码与SEQ ID NO:4、6、8、10、13、21、23、25、30、32、34、38、71、73、75、77、79或81具有至少80％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含与SEQ ID NO:41-66中的任一者具有至少80％同一性的核苷酸序列。
附图说明
图1示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.2的质粒图谱。
图2示出了使用pEMBR-1.2和市售pX80作为腺病毒辅助质粒获得的载体产量。
图3示出了使用pEMBR-1.2或市售pX80作为腺病毒辅助质粒获得的载体转基因纯度和载体衣壳纯度。
图4示出了用重组AAV RH.10、ssCMV-GFP转基因和pX80或pEMBR辅助质粒转化HEK293细胞后获得的GFP表达水平之间的比较。
图5示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.3和pEMBR-1.3B的质粒图谱。
图6示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.4和pEMBR-1.4B的质粒图谱。
图7示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.5的质粒图谱。
图8示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.2B2C的质粒图谱。
图9示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.2B2D的质粒图谱。
图10示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.5A的质粒图谱。
图11示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.55B2的质粒图谱。
图12示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.55B2 OO的质粒图谱。
图13示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.55B2C的质粒图谱。
图14示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.55B2C OO的质粒图谱。
图15示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.55B2D的质粒图谱。
图16示出了说明腺病毒辅助质粒pEMBR-1.55B2D OO的质粒图谱。
图17示出了通过qPCR测量的使用各种pEMBR质粒作为腺病毒辅助质粒获得的载体产量(VG/mL)。
图18示出了通过qPCR测量的使用各种pEMBR质粒和pHelper作为腺病毒辅助质粒获得的载体产量(VG/mL)。
定义
药剂：通常，如本文所用，术语“药剂”用于指实体(例如，脂质、金属、核酸、多肽、多糖、小分子等，或其复合物、组合、混合物或系统[例如，细胞、组织、生物体])，或现象(例如，热、电流或电场、磁力或磁场等)。在适当的情况下，如本领域技术人员从上下文中将清楚，该术语可用于指是或包含细胞或生物体或者它们的级分、提取物或组分的实体。另选地或另外地，如上下文将清楚，该术语可用于指在自然中发现和/或从自然中获得的天然产物。在一些情况下，同样如将从上下文清楚的，该术语可用于指一个或多个人造实体，因为它是通过人的手的动作来设计、工程化和/或产生的，并且/或者在自然界中找不到。在一些实施方案中，剂可以以分离的或纯的形式使用；在一些实施方案中，剂可以以粗制的形式使用。在一些实施方案中，潜在剂可作为集合或库提供，例如可对这些集合或库进行筛选以鉴定或表征其中的活性剂。在一些情况下，术语“剂”可指是或包含聚合物的化合物或实体；在一些情况下，该术语可指包含一个或多个聚合物部分的化合物或实体。在一些实施方案中，术语“剂”可指不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物和/或一种或多种特定聚合物部分的化合物或实体。在一些实施方案中，该术语可指缺少或基本上不含任何聚合物部分的化合物或实体。
大约/约：如本文所用，术语“大约”或“约”当应用于一个或多个所关注的值时，是指与所陈述的参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或另外由本文显而易见(除了此类数字将超过可能的值的100％的情况)，否则术语“大约”或“约”是指属于所陈述的参考值在任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低内的值的范围。
可比较的：如本文所用，术语“可比较的”是指两种或更多种剂、实体、情况、条件集合等，它们可能彼此不相同，但足够相似以允许它们之间进行比较，使得本领域技术人员将理解，可以基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，可比较的条件集合、环境、个体或群体的特征在于多个基本上相同的特征和一个或少量的不同特征。本领域普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定情况下，对于两种或更多种此类剂、实体、情况、条件集合等需要何种相同程度才被认为是可比较的。例如，本领域普通技术人员将理解，当以足够数量和类型的基本相同的特征为特征时，环境、个体或群体组彼此可比，以保证合理结论，即在不同的环境、个体或群体组的情况下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起或指示的。
对应于：如本文所用，术语“对应于”可以用于通过与适当的参考化合物或组合物进行比较来指定化合物或组合物中的结构要素的位置/身份。例如，在一些实施方案中，聚合物中的单体残基(例如，多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)可以被鉴定为“对应于”适当的参考聚合物中的残基。例如，本领域普通技术人员将理解，出于简单的目的，通常使用基于参考相关多肽的标准编号系统来指定多肽中的残基，使得“对应于”位置190处残基的氨基酸，例如，实际上不必是特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于参考多肽中第190位处的残基；本领域普通技术人员容易理解如何鉴定“相应的”氨基酸。例如，本领域技术人员将意识到各种序列比对策略，包括可以用于例如鉴定根据本公开的多肽和/或核酸中的“对应的”残基的软件程序，例如BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FAST A、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PS I-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE。
下游：如本文所用，术语“下游”是指核酸序列相对于参考核酸序列的定位或位置，特别是在RNA转录期间，更靠近由参考序列编码的转录RNA分子的3'端的位置。例如，对于两个序列A和B，使得序列A在序列B的下游，序列B的转录朝着序列A进行。
核酸：如本文所用，在其最广泛的意义上，术语“核酸”是指被掺入或可以被掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键被掺入或可以被掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文中将清楚，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包括RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包括DNA。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基、包括一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核酸类似物，包含所述类似物，或由所述类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个“肽核酸”，包含所述肽核酸，或由所述肽核酸组成，所述肽核酸是本领域已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本发明的范围内。可替代地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包括一个或多个天然核苷或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入型碱基以及它们的组合)，包括一个或多个核苷类似物或者由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的糖相比，核酸包含一个或多个经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物(诸如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸通过以下方式中的一者或多者来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶促合成、在重组细胞或系统中的复制以及化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、20个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是部分或全部单链的；在一些实施方案中，核酸是部分或全部双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或与编码多肽的序列互补。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。
可操作地连接：如本文所用，术语“可操作地连接”是指并置，其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。与功能性元件“可操作地连接”的控制元件以这样的方式缔合，即在与控制元件相容的条件下实现功能性元件的表达和/或活性。在一些实施方案中，“可操作地连接的”控制元件与目标编码元件邻接(例如，共价连接)；在一些实施方案中，控制元件反作用于目标功能性元件或以其他方式在距目标功能元件一定距离处进行作用。
生产细胞：如本文所用，术语“生产细胞”是指用于生产重组AAV(rAAV)的任何细胞。在一些实施方案中，生产细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，生产细胞是转化的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，生产细胞是Vero、HeLa、HEK293、HEK293T细胞或其衍生物。
转化：如本文所用，术语“转化”是指将外源DNA引入到宿主细胞中的任何过程。可以使用本领域内熟知的各种方法在自然或人工条件下进行转化。转化可依赖于将外源核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。在一些实施方案中，特定的转化方法基于被转化的宿主细胞来选择，并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、交配、脂转染。在一些实施方案中，“转化的”细胞被稳定转化，因为插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。在一些实施方案中，转化的细胞在有限的时间段内瞬时表达引入的核酸。
上游：如本文所用，术语“上游”是指核酸序列相对于参考核酸序列的定位或位置，特别是在RNA转录期间，更靠近由参考序列编码的转录RNA分子的5'端的位置。例如，对于两个序列A和B，使得序列A在序列B的上游，序列B的转录远离序列A进行。
载体：如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述来进行。前述技术和程序通常可根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其出于任何目的以引用的方式并入本文。
具体实施方式
先前已经描述了腺病毒为AAV复制提供的辅助功能。不希望被任何特定的假设所束缚，已经描述了腺病毒E1A蛋白通过结合并激活AAV P5 rep启动子来激活AAV基因表达。类似地，另一种腺病毒蛋白E2A已被描述为激活AAV P5启动子转录。E2A还已被描述为与病毒相关RNA I(VA RNAI)协作以增强AAV RNA的翻译。腺病毒E4orf4已被证明在G2/M边界诱导细胞周期停滞，以及有助于AAV的产生。腺病毒E4orf6已被描述为增强单链重组AAV基因组向双链基因组的转化，这是病毒DNA复制在体外和体内的限速步骤。VA RNAI还已被描述为支持AAV复制。据描述，VA RNAI与双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)发生物理相互作用，否则会引发阻断病毒蛋白产生的抗病毒免疫反应。
先前的研究表明，在提供El基因的HEK293细胞中，用于有效重组AAV产生的反式最小基因组是E2a、E4orf6和VA RNAI基因。含有该基因组的名为pXX6的辅助质粒用于生产无腺病毒的重组AAV。
开发和优化用于临床应用的AAV载体的一个主要挑战是增加产生的病毒量。由于它们的非增殖性质，它们的产生仅取决于细小病毒基因组组分进入包装细胞系(例如人胚胎肾细胞、HEK293或HEK293T，或昆虫细胞，例如Sf9)的转染效率。因此，开发增加重组AAV(rAAV)产量的方法仍然非常重要。
与生产用于临床应用的rAAV相关的其他主要挑战是与大量生产此类rAAV的成本以及最终产品本身的安全性相关的挑战。例如，市售辅助质粒，诸如pXX6-80，似乎转录低水平的Ad纤毛蛋白。重要的是，纤毛蛋白不是AAV生产所必需的，并且可能对人类具有免疫原性。此外，pXX6-80的尺寸相当大，超过18kb。这种大的质粒尺寸增加了其制造的难度和成本，这在采购用于制造临床级AAV的GMP质粒时可能会产生很大影响。
其他人已经衍生出不同版本的腺病毒辅助质粒，包括例如pFAdDeltaF6(在University of Pennsylvania衍生)和pHelper(Agilent)。pFAdDeltaF6质粒比pXX6-80小约3kb，但保留了纤毛基因序列。可从Agilent获得的pHelper质粒比pXX6-80小，为约11.6kb。然而，其含有氨苄西林抗性基因，通常不鼓励将该基因用于AAV生产中使用的质粒。
本公开通过提供本文所述的组合物和方法来解决上述技术挑战。
在一些实施方案中，本公开涉及腺病毒衍生的辅助质粒(腺病毒辅助质粒)，其包含编码病毒辅助蛋白的腺病毒DNA序列。在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒用于生产重组腺相关病毒(rAAV)的方法中。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒增加rAAV的产生。
在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含编码来源于非腺病毒来源的蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其包含编码来源于除腺病毒以外的病毒的蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码腺病毒蛋白E2a和E4的腺病毒核苷酸序列的全部或一部分，以及非编码RNA VA RNA。在一些实施方案中，本公开描述了改进的腺病毒辅助质粒，其比主要的市售腺病毒辅助质粒小，并且允许在生产细胞表达系统中更安全且成本更低地生产rAAV。
在一些实施方案中，本公开提供了一种腺病毒辅助质粒，其相对于目前可获得的腺病毒辅助质粒(例如，18.932kbp的pXX6-80；18.876kbp的pALD-X80；11.635kbp的pHelper；15.420kbp的pFAdDeltaF6)具有减小的总尺寸。
在一些实施方案中，本公开提供了具有较小尺寸的腺病毒辅助质粒。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒大约在6.5kb与15.5kb之间。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有大约6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或16kb的尺寸。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有大约6-7kb；6.5-7.5kb；7-8kb；7.5-8.5kb；8-9kb；8.5-9.5kb；9-10kb；9.5-10.5kb；10-11kb；10.5-11.5kb；11-12kb；11.5-12.5kb；12-13kb；12.5-13.5kb；13-14kb；13.5-14.5kb；14-15kb；14.5-15.5kb；15-16kb的尺寸。本公开的腺病毒辅助质粒的较小尺寸使得能够以大规模制造AAV所需的量更简单且成本更低地生产AAV。在一些实施方案中，去除基因和/或部分基因使本公开的腺病毒辅助质粒更安全，因为生产细胞不会产生腺病毒结构蛋白(例如，纤毛)，该结构蛋白可以在下游加工期间与AAV共纯化，并且因此会降低无意中向患者引入腺病毒结构蛋白的风险。
在一些实施方案中，去除腺病毒辅助基因导致更小的腺病毒辅助质粒使得能够添加补充基因以进一步提高AAV质量和产量。尽管这些补充基因相对于最小版本增加了质粒的尺寸，但它们能够实现相当或更高的AAV生产力，并且因此值得额外的生产成本。重要的是，这些质粒仍然小于市售辅助质粒，例如pALD-X80。
腺病毒辅助质粒
辅助基因和抗性基因
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码选自由E2b、E2a、E4orf4、E1B55K、E1b19K、E1a、E4orf6、VA RNA及其组合组成的组的蛋白质的一个或多个核苷酸序列。
在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码E2a蛋白、E4区域和VA RNA区域的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4区域包含E4orf1、E4orf2、E4orf3、E4orf4、E4orf5、E4orf6和E4orf7中的一者或多者。在一些实施方案中，E4orf1具有与SEQ ID NO:70具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4orf1具有与SEQID NO:71具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，E4orf2具有与SEQ ID NO:72具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4orf2具有与SEQ ID NO:73具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，E4orf3具有与SEQ ID NO:74具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4orf3具有与SEQ ID NO:75具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，E4orf4具有与SEQ ID NO:76具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4orf4具有与SEQ ID NO:77具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，E4orf6具有与SEQ ID NO:78具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4orf6具有与SEQ ID NO:79具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，E4orf7具有与SEQ ID NO:80具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4orf7具有与SEQ ID NO:81具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含含有E4orf1的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含含有E4orf2的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含含有E4orf1的核苷酸序列并且不包含含有E4orf2的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4区域的表达在E4迷你启动子的控制下。在一些实施方案中，E4区域可操作地连接到E4迷你启动子。在一些实施方案中，E4迷你启动子具有与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，E4区域可操作地连接到SV40启动子。在一些实施方案中，E4区域的表达在SV40启动子的控制下。在一些实施方案中，SV40启动子具有与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒包含抗性基因。在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒包含氨苄西林抗性基因(例如，编码赋予氨苄西林抗性的蛋白质的核苷酸序列)。在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒不包含氨苄西林抗性基因。在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒包含卡那霉素抗性基因(例如，编码赋予卡那霉素抗性的蛋白质的核苷酸序列)。在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒不包含卡那霉素抗性基因。
纤毛基因
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒不包含编码腺病毒纤毛蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码全长腺病毒纤毛蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码腺病毒纤毛蛋白的一部分或片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含与pXX6-80的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列，不包括编码腺病毒纤毛蛋白的核苷酸序列。
L1-52/55K(包装蛋白3)基因
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒不包含编码L1-52/55K(包装蛋白3)蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒不包含编码外周六邻体相关基因的核苷酸序列。
L4区域
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含完整的L4(六邻体装配)基因。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码完整的L4(六邻体装配)的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的腺病毒辅助质粒包含完整的L4(33kDa Ex2)基因。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码完整的L4(33kDa Ex2)的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含完整的L4衣壳化蛋白基因。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码完整的L4衣壳化蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒不包含L4(六邻体装配)基因。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含L4衣壳化蛋白基因。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含L4(六邻体装配)基因并且不包含L4衣壳化蛋白基因。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒不包含编码L4(六邻体装配)的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码L4衣壳化蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码L4(六邻体装配)的核苷酸序列并且不包含编码L4衣壳化蛋白基因的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码L4 33kDa Ex2片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码L4 33kDa Ex2片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码L4 33kDa Ex2片段的核苷酸序列包含E2a启动子区域(参见，例如，Casper等人，"Identification of an adeno-associated virus Rep protein binding site inthe adenovirus E2a promoter."Journal of virology 79.1(2005))。在一些实施方案中，E2a启动子区域具有与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码L4 33kDa Ex2片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含E2a启动子区域。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码六邻体相关前体(L4pVIII)片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:13具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码六邻体相关前体(L4 pVIII)的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码部分六邻体相关前体(L4pVIII)片段的核苷酸序列。
VA RNA区域
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与SEQ ID NO:14具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的VA RNA区域。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含具有与SEQ ID NO:15具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的VARNA区域。在一些实施方案中，VA RNA区域包含具有与SEQID NO:16具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列的VARNAI基因。在一些实施方案中，VA RNA区域包含具有与SEQ ID NO:17具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列的VA RNAI基因。在一些实施方案中，VA RNA区域包含具有与SEQ IDNO:18具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列的VA RNAII基因。在一些实施方案中，VA RNA区域包含具有与SEQ ID NO:19具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列的VA RNAII基因。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码DNA末端蛋白片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码DNA末端蛋白片段的核苷酸序列与SEQ ID NO:20具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，DNA末端蛋白片段具有与SEQ ID NO:21具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码DNA末端蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码23kDa内切蛋白酶片段的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:22具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，23kDa内切蛋白酶区域片段具有与SEQ ID NO:23具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒不包含编码23kDa内切蛋白酶区域的核苷酸序列。
引入编码补充特征部的基因
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含E2a基因。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含编码E2a的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:24具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，E2a的表达在启动子的控制下。在一些实施方案中，编码E2a的核苷酸序列可操作地连接到启动子。在一些实施方案中，启动子是例如CMV启动子、PGK启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、Ubc启动子、CAG启动子或β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，编码E2a的核苷酸序列可操作地连接到转录增强子。在一些实施方案中，转录增强子是例如CMV增强子。在一些实施方案中，编码E2a的核苷酸序列可操作地连接到调节内含子。在一些实施方案中，E2a的表达在鸡β-肌动蛋白启动子的控制下。在一些实施方案中，编码E2a的核苷酸序列可操作地连接到鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白启动子具有与SEQ ID NO:26具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白启动子位于编码E2a的核苷酸序列的上游。在一些实施方案中，E2a的表达在E2a启动子和鸡β-肌动蛋白启动子的控制下。在一些实施方案中，编码E2a的核苷酸序列可操作地连接到E2a启动子和鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白启动子位于E2a启动子的上游。在一些实施方案中，E2a的表达在鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子的控制下。在一些实施方案中，编码E2a的核苷酸序列可操作地连接到鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子。在一些实施方案中，鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子位于E2a启动子的上游。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含E2a聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，E2a聚腺苷酸化信号位于编码E2a的核苷酸序列的下游。在一些实施方案中，E2a聚腺苷酸化信号具有与SEQ IDNO:27具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含SV40聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，SV40聚腺苷酸化信号位于编码E2a的核苷酸序列的下游。在一些实施方案中，SV40聚腺苷酸化信号位于E2a聚腺苷酸化信号的下游。在一些实施方案中，SV40聚腺苷酸化信号具有与SEQ ID NO:28具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码来源于HSV-1的UL30的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码UL30的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:29具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列UL30与SEQID NO:30具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码来源于HSV-1的UL42的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码UL42的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:31具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，UL42的氨基酸序列与SEQ ID NO:32具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码来源于HSV-1的UL30的核苷酸序列和编码来源于HSV-1的UL42的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码UL30的核苷酸序列和编码UL42的核苷酸序列被P2a切割位点分开。在一些实施方案中，P2a切割位点具有与SEQ ID NO:33具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，P2a切割位点具有与SEQ ID NO:34具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，UL30和/或UL42基因的表达在EF-1α启动子的控制下。在一些实施方案中，编码UL30的核苷酸序列可操作地连接到启动子。在一些实施方案中，编码UL30的核苷酸序列可操作地连接到CMV启动子、PGK启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、Ubc启动子、CAG启动子或β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，编码UL30的核苷酸序列可操作地连接到转录增强子。在一些实施方案中，转录增强子是例如CMV增强子。在一些实施方案中，编码UL30的核苷酸序列可操作地连接到调节内含子。在一些实施方案中，编码UL42的核苷酸序列和/或编码UL30的核苷酸序列可操作地连接到EF-1α启动子。在一些实施方案中，EF-1α启动子具有与SEQ ID NO:35具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，UL30和/或UL42的表达在SV40启动子的控制下。在一些实施方案中，编码UL42的核苷酸序列和/或编码UL30的核苷酸序列可操作地连接到SV40启动子。在一些实施方案中，SV40启动子具有与SEQ ID NO:68具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号或牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码UL42的核苷酸序列下游的聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码UL42的核苷酸序列下游的β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，β-珠蛋白聚腺苷酸化信号具有与SEQ ID NO:36具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码UL42的核苷酸序列下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，bGH聚腺苷酸化信号具有与SEQ ID NO:69具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码来源于HSV-1的UL29的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码UL29的核苷酸序列与SEQ ID NO:37具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，UL29的氨基酸序列与SEQ ID NO:38具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，编码UL29的核苷酸序列可操作地连接到启动子。在一些实施方案中，编码UL30的核苷酸序列可操作地连接到CMV启动子、PGK启动子、SV40启动子、EF-1α启动子、Ubc启动子、CAG启动子或β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，编码UL29的核苷酸序列可操作地连接到转录增强子。在一些实施方案中，转录增强子是例如CMV增强子。在一些实施方案中，编码UL29的核苷酸序列可操作地连接到调节内含子。在一些实施方案中，UL29的表达在HSV TK启动子的控制下。在一些实施方案中，编码UL29的核苷酸序列可操作地连接到HSV TK启动子。在一些实施方案中，HSV TK启动子具有与SEQ ID NO:39具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码UL29的核苷酸序列下游的聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号或牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒包含编码UL29的核苷酸序列下游的HSV TK聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，HSV TK聚腺苷酸化信号具有与SEQ ID NO:40具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。
示例性腺病毒辅助质粒
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:41具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(六邻体装配)(SEQ ID NO:3；SEQID NO:4)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6)、L4衣壳化蛋白(22kDa)(SEQ IDNO:7；SEQ ID NO:8)、L4 pVIII六邻体相关前体(SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:13)、VA RNA区域A (SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ ID NO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQ ID NO:22；SEQ IDNO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)，并且不包含以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因和外周六邻体相关基因。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:42具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:43具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VA RNAII-B(SEQ IDNO:19)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:44具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VA RNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)和E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:45具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)和E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体和E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:46具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VA RNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)和E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ IDNO:67)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域以及E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:47具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、L4(33kDa Ex2)(SEQ IDNO:9；SEQ ID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VARNAII-A(SEQ ID NO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)和E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)，并且不包含以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号和E4区域上游的E4迷你启动子。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:48具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、L4(33kDa Ex2)(SEQ IDNO:9；SEQ ID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ ID NO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)和E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域，和E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号，以及E4区域上游的E4迷你启动子。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:49具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:50具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:51具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VARNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:52具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体和E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:53具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VA RNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ IDNO:67)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域，以及E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:54具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、L4(33kDa Ex2)(SEQ IDNO:9；SEQ ID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VARNAII-A(SEQ ID NO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号和E4区域上游的E4迷你启动子。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:55具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、L4(33kDa Ex2)(SEQ IDNO:9；SEQ ID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ ID NO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域和E4区域上游的E4迷你启动子。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:56具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、L4(33kDa Ex2)(SEQ IDNO:9；SEQ ID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ ID NO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域、E4区域上游的E4迷你启动子、编码E4orf1的基因、编码E4orf2的基因和编码E4orf3的基因。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:57具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQID NO:31；SEQ ID NO:32)、UL30上游的EF-1α启动子(SEQ ID NO:35)和UL42下游的β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:36)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4pVIII六邻体相关前体。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:58具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQID NO:31；SEQ ID NO:32)、UL30上游的SV40启动子(SEQ ID NO:68)和UL42下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:69)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4pVIII六邻体相关前体。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:59具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VARNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQ ID NO:31；SEQ IDNO:32)、UL30上游的SV40启动子(SEQ ID NO:68)和UL42下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:69)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:60具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VARNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)、UL30上游的SV40启动子(SEQID NO:68)和UL42下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:69)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:61具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ IDNO:29；SEQ ID NO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)、UL30上游的SV40启动子(SEQ ID NO:68)和UL42下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:69)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体，以及E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:62具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ IDNO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ IDNO:67)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ ID NO:29；SEQ IDNO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)、UL30上游的SV40启动子(SEQ ID NO:68)和UL42下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:69)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域，以及E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:63具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、L4(33kDa Ex2)(SEQ IDNO:9；SEQ ID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VARNAII-A(SEQ ID NO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23)和E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)、UL30上游的SV40启动子(SEQ ID NO:68)和UL42下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:69)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号，以及E4区域上游的E4迷你启动子。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:64具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、L4(33kDa Ex2)(SEQ IDNO:9；SEQ ID NO:10)、VA RNA区域B(SEQ ID NO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VARNAII-B(SEQ ID NO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL30基因(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)、HSV-1衍生的UL42基因(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)、UL30上游的SV40启动子(SEQ ID NO:68)和UL42下游的牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:69)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域，以及E4区域上游的E4迷你启动子。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:65具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4迷你启动子(SEQ ID NO:1)、L4(33kDa Ex2)(SEQ ID NO:9；SEQID NO:10)、VA RNA区域A(SEQ ID NO:14)、VA RNAI-A(SEQ ID NO:16)、VA RNAII-A(SEQ IDNO:18)、部分DNA末端蛋白(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21)、23kDa内切蛋白酶片段区域(SEQID NO:22；SEQ ID NO:23)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25)、E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子、HSV-1衍生的UL29基因(SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38)、UL29上游的HSV TK启动子(SEQ ID NO:39)和UL29下游的HSV TK聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:40)，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白和L4 pVIII六邻体相关前体。
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒具有与SEQ ID NO:66具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒包含具有与所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的以下组分：E4区域上游的SV40启动子(SEQ ID NO:2)、VA RNA区域B(SEQ IDNO:15)、VA RNAI-B(SEQ ID NO:17)、VA RNAII-B(SEQ ID NO:19)、E2a(SEQ ID NO:24；SEQID NO:25)、E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)、E4orf6下游的SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:67)和E2a上游的鸡β-肌动蛋白启动子，并且不包含或编码以下组分：纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因、外周六邻体相关基因、全长L4(六邻体装配)基因、L4衣壳化蛋白、L4 pVIII六邻体相关前体、L4(33kDa Ex2)、DNA末端蛋白和23kDa内切蛋白酶片段区域、E4区域上游的E4迷你启动子、编码E4orf1的基因、编码E4orf2的基因和编码E4orf3的基因。
生产方法
在一些实施方案中，本公开的腺病毒辅助质粒可用于生产rAAV的方法。在一些实施方案中，rAAV通过转染生产细胞产生。在一些实施方案中，生产细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，生产细胞是转化的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，生产细胞是Vero、HeLa、HEK293、HEK293T细胞或其衍生物。
在一些实施方案中，生产rAAV的方法包括用AAV载体质粒、AAV Rep-Cap表达质粒和腺病毒辅助质粒转染生产细胞。在一些实施方案中，AAV载体质粒包含AAV反向末端重复序列(ITR)和所关注的转基因。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒是本文所述的任何腺病毒辅助质粒。
在一些实施方案中，生产rAAV的方法包括转染稳定表达Rep-Cap的生产细胞。在一些实施方案中，生产rAAV的方法包括用AAV载体质粒和腺病毒辅助质粒转染稳定表达Rep-Cap的生产细胞。在一些实施方案中，AAV载体质粒包含AAV反向末端重复序列(ITR)和所关注的转基因。在一些实施方案中，腺病毒辅助质粒是本文所述的任何腺病毒辅助质粒。
范例
本公开中描述的工作的主要目的是开发用于rAAV生产的新型腺病毒辅助质粒，其更小，含有更少的非必需腺病毒基因，并且其功能与最常用的腺病毒辅助质粒一样好或更好。
本公开中提供的质粒是从头合成的，经过序列验证，并被放大用于大规模rAAV制造。当使用所提供的质粒与其他市售腺病毒辅助质粒时，进行rAAV的生产研究以比较载体产量。还从用不同腺病毒辅助质粒产生的rAAV中评估载体质量和活性，以证实用所提供的质粒产生的rAAV即使在质量上不是优越的，也至少是等效的。总之，以下这些实施例表明，所提供的腺病毒辅助质粒以潜在的更安全和更节省成本的设计产生高产量和高质量的rAAV。
实施例1：使用本文所述的腺病毒辅助质粒生产rAAV的示例性方法
HEK293细胞用对照腺病毒辅助质粒(例如，市售质粒，诸如pALD-X80，或本文中所述的腺病毒辅助质粒)转染。使用PEI转染将腺病毒辅助质粒与pAAVrep2cap9和pAAV-CMV-GFP质粒共转染，以产生AAV9/ssCMV-GFP。转染后四天，经由0.5％ Triton X-100裂解和核酸酶添加(以降解RNA、细胞基因组DNA和剩余的质粒DNA)来收获HEK293细胞。在3小时的裂解/核酸酶处理之后，对细胞裂解物进行取样并提交用于qPCR滴度分析。将样品用另一种核酸酶处理，然后用EDTA处理并热处理，随后对稀释的样品进行qPCR以确定每个样品的载体基因组拷贝数。作为转染效率的度量，使用荧光显微镜对GFP阳性的细胞进行定量。
实施例2：缺少纤毛、L1-52/55K和外周六邻体相关基因并具有部分L4六邻体相关
前体的腺病毒辅助质粒
为了减小腺病毒辅助质粒的尺寸，设计了一种腺病毒辅助质粒(pEMBR-1.2：SEQID NO:41)，其缺少纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因和大部分六邻体相关前体以及外周六邻体相关蛋白。这些缺失是相对于市售辅助质粒，诸如pXX6-80进行的。腺病毒辅助基因被合成并组装到卡那霉素抗性质粒骨架中。所得质粒比pXX6-80小大约6.7kb。
上述腺病毒辅助质粒能够在HEK293细胞中产生AAV。如通过qPCR所测量，在用pALD-X80转染的细胞和用pEMBR-1.2转染的细胞之间没有观察到AAV载体产量的主要差异(参见图2)。用pEMBR-1.2产生的rAAV载体产生具有正确比率的VP蛋白的正常载体，如通过SDS-PAGE评估载体衣壳纯度时所观察到的(参见图3)，以及具有正确尺寸的包装的转基因的正常载体，如通过碱性凝胶电泳评估载体转基因纯度时所观察到的(参见图3)。此外，pEMBR-1.2能够产生能够转染细胞的全功能载体。在转染HEK293细胞以产生用pALD-X80或pEMBR-1.2产生的AAVRH.10/ssCMV-GFP中没有观察到差异(参见图4)。
实施例3：缺少纤毛基因和大部分L4(六邻体装配)基因的腺病毒辅助质粒
为了进一步减小腺病毒辅助质粒的尺寸，设计了一种腺病毒辅助质粒，其缺少纤毛基因、L1-52/55K(包装蛋白3)基因和大部分六邻体相关前体以及外周六邻体相关蛋白(如在pEMBR-1.2中-参见实施例2)，并且还缺少完整的L4(六邻体装配)区域(pEMBR-1.3：SEQ ID NO:42；参见图5)。保留含有E2A启动子或部分L4(33kDa Ex2；SEQ ID NO:9)的L4区域的小片段。
为了进一步优化pEMBR-1.3，用来源于AAV-2的VA RNA区域(VA RNA-B：SEQ ID NO:15)替代pEMBR-1.3的VA RNA区域。该版本命名为pEMBR-1.3B(SEQ ID NO:43；参见图5)。在该版本中，用侧接StuI和BsrGI位点合成AAV-2VA RNA I(SEQ ID NO:17)和VARNA II(SEQID NO:19)序列(没有侧接DNA末端蛋白或内切蛋白酶基因序列)，并且将该插入物克隆到pEMBR-1.3中。
实施例4：缺少纤毛基因和L4(六邻体装配)基因并含有驱动E2a表达的鸡β-肌动蛋
白启动子的腺病毒辅助质粒
为了增强pEMBR-1.3质粒的病毒生产力，设计了腺病毒辅助质粒，其含有pEMBR-1.3的特征部，并且还包括E2a基因上游的鸡β-肌动蛋白启动子(SEQ ID NO:26)以增强E2a蛋白(pEMBR-1.4：SEQ ID NO:49；参见图6)的表达。添加鸡β-肌动蛋白启动子是为了解释L4区域的其他部分中的增强子元件，这些元件可能已经通过去除大部分L4区域而丢失。此外，先前已经表明E2A可以由外源启动子驱动(Gene Therapy.1998.5,938-945)和(Journal ofVirology.2007.第81卷第21号，11908-11916)。
构建pEMBR-1.4的另一个版本以包括AAV-2衍生的VARNA区域，如在pEMBR-1.3B中。该版本命名为pEMBR-1.4B(SEQ ID NO:50；参见图6)。
构建pEMBR-1.4的另一个版本以包括SV40聚腺苷酸化信号，以便进一步增强E2A的表达。该版本命名为pEMBR-1.4B2(SEQ ID NO:51)。
实施例5：向修饰的腺病毒辅助质粒中引入补充附加基因
为了使用所公开的腺病毒辅助质粒进一步促进AAV的产生，将几个补充附加基因添加到最小化的质粒中，同时确保质粒的尺寸不超过目前市售的腺病毒辅助质粒(诸如pALD-X80)的尺寸。
pEMBR-1.5(SEQ ID NO:57；参见图7)腺病毒辅助质粒被设计成包括pEMBR-1.4中所述的特征部，添加HSV-1DNA聚合酶基因(UL30和UL42)以增强AAV转基因的复制，即使当细胞不在S期时也是如此。UL30和UL42基因被设计成制成为单个转录物(由EF-1α核心启动子驱动并由兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号终止)，使用P2A切割位点分离两种HSV-1聚合酶蛋白。可以使用任何数量的启动子，包括CBA、CMV、PGK等。并且可以使用任何数量的聚A位点。设计了pEMBR-1.5的附加版本(例如，pEMBR-1.5A：SEQ ID NO:58)，其中UL30和UL42基因由SV40启动子而不是EF-1α核心启动子驱动。
类似于其他“B”设计，构建pEMBR-1.5B的附加版本以包括较小的AAV-2衍生的VARNA I和II，而没有侧接DNA末端蛋白或内切蛋白酶基因序列(pEMBR-1.5B：SEQ ID NO:59)。
类似于其他“B2”设计，构建pEMBR-1.5B2的附加版本以包括用于更高E2A表达的SV40聚腺苷酸化信号(pEMBR-1.5B2：SEQ ID NO:60)。
实施例6：向修饰的腺病毒辅助质粒中额外引入补充附加基因
该实施例进一步证实，去除腺病毒辅助基因导致更小的腺病毒辅助质粒使得能够添加补充基因以进一步提高AAV质量和产量。具体地，各种尺寸并包含各种补充基因(例如，UL30、UL42等)的各种pEMBR质粒由pEMBR-1.2和pEMBR-1.5a骨架质粒设计，并测试AAV的产生。
pEMBR-1.2B2(SEQ ID NO:94)腺病毒辅助质粒被设计成包括“B2”设计，该设计包含潜在地增加E2A表达的SV40聚A位点和不含有侧接Ad末端蛋白或内切蛋白酶基因序列的较小VA区域(含有Ad2 VA RNA I和VA RNA II)的合成序列。该区域用侧接StuI和BsrGI位点合成，并且将插入物克隆到pEMBR-1.2中以制备pEMBR-1.2B2。
pEMBR-1.2B2C(SEQ ID NO:95)腺病毒辅助质粒(参见图8)被设计成包括如上所述的“B2”设计和包含在E4区域中的E4 ORF6之后添加的SV40聚(A)尾以增加E4基因的表达的“C”设计。与pEMBR-1.2载体相比，合成该区域以减少骨架序列的量，从而进一步减小质粒的尺寸。该E4区域用侧接PacI和NotI位点合成以用于克隆到pEMBR-1.2B2中。
pEMBR-1.2B2D(SEQ ID NO:96)腺病毒辅助质粒(参见图9)被设计成包括如上所述的“B2”设计以及包含在E4 ORF6之后添加的SV40聚(A)尾和在E4区域中添加的SV40启动子以增加E4基因的表达的“D”设计。与pEMBR-1.2载体相比，合成该区域以减少骨架序列的量，从而进一步减小质粒的尺寸。该E4区域用侧接PacI和NotI位点合成以用于克隆到pEMBR-1.2B2中。
用从pEMBR-1.2骨架设计的各种pEMBR质粒，如通过qPCR测量的澄清裂解物中AAV(例如，AAV9)的载体产量在图17B和图18中示出。相对于pEMBR-1.2质粒，pEMBR-1.2B2、pEMBR-1.2B2C和pEMBR-1.2B2D腺病毒辅助质粒导致相当的AAV产量。相对于市售质粒(例如，pHelper)，pEMBR-1.2B2、pEMBR-1.2B2C和pEMBR-1.2B2D腺病毒辅助质粒导致相当的或更高的AAV产量。
pEMBR-1.2C(SEQ ID:NO.97)腺病毒辅助质粒被设计成包括“C”设计，类似于如上所述的其他“C”设计。此外，pEMBR-1.2D(SEQ ID:NO.98)腺病毒辅助质粒被设计成包括“D”设计，类似于如上所述的其他“D”设计。
用从pEMBR-1.2骨架设计的各种pEMBR质粒，如通过qPCR测量的澄清裂解物中AAV(例如，AAV9)的载体产量在图17A和图18中示出。相对于pEMBR-1.2质粒，pEMBR-1.2C和pEMBR-1.2D腺病毒辅助质粒导致相当的AAV产量。相对于市售质粒(例如，pHelper)，pEMBR-1.2C和pEMBR-1.2D腺病毒辅助质粒导致相当的或更高的AAV产量。
如实施例5中所述，设计pEMBR-1.5A(SEQ ID NO:58)腺病毒辅助质粒(参见图10)。pEMBR-1.5A包含添加到pEMBR-1.4质粒中的HSV-1DNA聚合酶基因(UL30和UL42)(无六邻体装配，E2a的外源启动子+包含E2a启动子区域的编码L4 33kDa Ex2片段的核苷酸序列。将HSV-1DNA聚合酶基因(UL30和UL42)添加回pEMBR-1.5A质粒中，以帮助复制AAV转基因，即使当细胞不在S期时也是如此。UL30和UL40基因被设计成制成为单个转录物(由SV40启动子驱动并由牛生长激素聚A终止)，使用P2A切割位点分离两种HSV-1聚合酶蛋白。可以使用任何数量的启动子，包括CBA、CMV、PGK等。并且可以使用任何数量的聚A位点。
鉴于pEMBR-1.5A和pEMBR-1.4均以相对于pEMBR-1.2显著更低的滴度产生AAV(参见图17A和B)，推断出，pEMBR-1.5A (基本上是添加了UL30和UL42表达盒的pEMBR-1.4)以显著更低的滴度产生AAV，因为质粒骨架来源于pEMBR-1.4。因此，将UL30和UL42构建体克隆到以相对较高滴度产生AAV的其他质粒版本中，以测试UL30和UL42的添加如何影响AAV滴度。
通过将来自pEMBR-1.5A质粒的UL30和UL42表达盒克隆到pEMBR-1.2B2骨架中来产生pEMBR-1.55B2(SEQ ID NO:99)腺病毒辅助质粒(参见图11)。UL30和UL42区域用来自pEMBR-1.5A的平端限制酶XmnI和PmeI消化，并在平端NdeI限制位点处克隆到pEMBR-1.2B2中。UL30和UL42基因被设计成制成为单个转录物(由SV40启动子驱动并由牛生长激素聚A终止)，使用P2A切割位点分离两种HSV-1聚合酶蛋白。尽管将构建体克隆到质粒中的方向理论上不应影响表达，因为该区域含有启动子和独立于质粒的其余部分诱导UL30和UL42的表达的聚A信号，但设计了相反方向的版本。pEMBR-1.2B2骨架，像其他B2版本质粒一样，包括如上所述的“B2”设计。
pEMBR-1.55B2 OO(SEQ ID NO:100)腺病毒辅助质粒(参见图12)基本上是与1.55B2质粒相同的质粒，但UL30和UL42构建体以相反的方向(OO)克隆到pEMBR-1.55B2-OO中。
通过将来自pEMBR-1.5A质粒的UL30和UL42表达盒克隆到pEMBR-1.2B2骨架中来产生pEMBR-1.55B2C(SEQ ID NO:101)腺病毒辅助质粒(参见图13)。UL30和UL42区域用来自pEMBR-1.5A的平端限制酶XmnI和PmeI消化，并在平端NdeI限制位点处克隆到pEMBR-1.2B2C中。UL30和UL42基因被设计成制成为单个转录物(由SV40启动子驱动并由牛生长激素聚A终止)，使用P2A切割位点分离两种HSV-1聚合酶蛋白。尽管将构建体克隆到质粒中的方向理论上不应影响表达，因为该区域含有启动子和独立于质粒的其余部分诱导UL30和UL42的表达的聚A信号，但设计了相反方向的版本。pEMBR-1.2B2C骨架，像其他B2C版本质粒一样，包括如上所述的“B2”和“C”设计。
pEMBR-1.55B2C OO(SEQ ID NO:102)腺病毒辅助质粒(参见图14)基本上是与1.55B2C质粒相同的质粒，但UL30和UL42构建体以相反的方向(OO)克隆到pEMBR-1.55B2C-OO中。
通过将来自pEMBR-1.5A质粒的UL30和UL42表达盒克隆到pEMBR-1.2B2骨架中来产生pEMBR-1.55B2D(SEQ ID NO:103)腺病毒辅助质粒(参见图15)。UL30和UL42区域用来自pEMBR-1.5A的平端限制酶XmnI和PmeI消化，并在平端NdeI限制位点处克隆到pEMBR-1.2B2中。UL30和UL42基因被设计成制成为单个转录物(由SV40启动子驱动并由牛生长激素聚A终止)，使用P2A切割位点分离两种HSV-1聚合酶蛋白。尽管将构建体克隆到质粒中的方向理论上不应影响表达，因为该区域含有启动子和独立于质粒的其余部分诱导UL30和UL42的表达的聚A信号，但设计了相反方向的版本。pEMBR-1.2B2D骨架，像其他B2D版本质粒一样，包括如上所述的“B2”和“D”设计。
pEMBR-1.55B2D OO(SEQ ID NO:104)腺病毒辅助质粒(参见图16)基本上是与1.55B2D质粒相同的质粒，但UL30和UL42构建体以相反的方向(OO)克隆到pEMBR-1.55B2D-OO中。
如通过qPCR测量的澄清裂解物中AAV(例如，AAV9)的载体产量在图17C中示出，其中各种pEMBR质粒用pEMBR-1.5A UL30和UL42表达盒设计。相对于pEMBR-1.5A质粒，pEMBR-1.55B2、pE MBR-1.55B2C和pEMBR-1.55B2D腺病毒辅助质粒导致更高的AAV产量。相对于pEMBR-1.2质粒，pEMBR-1.55B2、pEMBR-1.55B2C和pEMBR-1.55B2D腺病毒辅助质粒导致相当的或更高的AAV产量。
实施例7：序列表
下面的序列表列出并描述了本文讨论的各种序列。除非另有说明，否则所有序列均以质粒正链的5'至3'方向叙述。无论被描述为与序列相关的基因或元件的方向如何，这种方向性都得以保留。如本文所用的星号表示终止密码子。
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等效方案
本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效方案。本发明的范围不意图限于以上说明书，而是如在以下权利要求中所陈述的。
Claims (47)
1.一种腺病毒辅助质粒，其包含编码以下项的核苷酸序列：
(a)E2a蛋白；
(b)E4区域；
(c)VA RNA区域；和
(d)L4区域；
其中所述腺病毒辅助质粒不包含编码以下项中的一者或多者的核苷酸序列：
纤毛蛋白或其部分；
L1-52/55K(包装蛋白3)；和
外周六邻体相关蛋白。
2.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述VA RNA区域包含与SEQ ID NO:14具有至少80％同一性的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的腺病毒辅助质粒，其中所述VA RNA区域包含：
(a)与SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的VA RNAI核苷酸序列；和
(b)与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的VA RNAII核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述VA RNA区域包含与SEQ ID NO:15具有至少80％同一性的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的腺病毒辅助质粒，其中所述VA RNA区域包含：
(a)与SEQ ID NO:17具有至少80％同一性的VA RNAI核苷酸序列；和
(b)与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的VA RNAII核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述L4区域包含编码L4(六邻体装配)蛋白的核苷酸序列，所述L4蛋白具有与SEQ ID:NO.4具有至少80％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述L4区域包含编码部分L4(六邻体装配)蛋白的核苷酸序列，所述部分L4蛋白具有与SEQ ID:NO.6具有至少80％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述L4区域包含编码部分六邻体相关前体(L4 pVIII)蛋白的核苷酸序列，所述部分六邻体相关前体蛋白具有与SEQ ID NO:13具有至少80％同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求7所述的腺病毒辅助质粒，其中所述编码部分L4(六邻体装配)蛋白的核苷酸序列包含E2a启动子区域。
10.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含编码部分DNA末端蛋白的核苷酸序列，所述部分DNA末端蛋白具有与SEQ ID:No 21具有至少80％同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒不包含编码DNA末端蛋白的核苷酸序列。
12.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含编码部分23kDa内切蛋白酶的核苷酸序列，所述部分23kDa内切蛋白酶具有与SEQ ID NO:23具有至少80％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒不包含编码23kDa内切蛋白酶的核苷酸序列。
14.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中E2a蛋白的表达在E2a启动子的控制下。
15.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中E2a蛋白的表达在E2a启动子和鸡β-肌动蛋白启动子的控制下，其中所述鸡β-肌动蛋白启动子在所述E2a启动子的上游。
16.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中E2a蛋白的表达在所述鸡β-肌动蛋白启动子的控制下。
17.如权利要求15或16所述的腺病毒辅助质粒，其中所述鸡β-肌动蛋白启动子具有与SEQ ID.No:26具有至少80％同一性的核苷酸序列。
18.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含E2a下游的E2a聚腺苷酸化信号。
19.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒含有E2a下游的SV40聚腺苷酸化信号。
20.如权利要求18所述的腺病毒辅助质粒，其中所述SV40聚腺苷酸化信号在E2a聚腺苷酸化信号的下游。
21.如权利要求19或20所述的腺病毒辅助质粒，其中所述SV40聚腺苷酸化信号具有与SEQ ID.No:28具有至少80％同一性的序列。
22.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其还包含编码HSV-1UL30和HSV-1UL42的核苷酸序列，
其中UL30具有与SEQ ID NO:30具有至少80％同一性的氨基酸序列；
其中UL42具有与SEQ ID NO:32具有至少80％同一性的氨基酸序列；并且
其中UL30和UL42被具有与SEQ ID NO:34具有至少80％同一性的氨基酸序列的P2A切割位点分开。
23.如权利要求22所述的腺病毒辅助质粒，其中UL30和UL42的表达在所述质粒的EF-1α启动子的控制下。
24.如权利要求23所述的腺病毒辅助质粒，其中所述EF-1α启动子具有与SEQ ID NO:35具有至少80％同一性的核苷酸序列。
25.如权利要求22所述的腺病毒辅助质粒，其还包含UL42下游的β-珠蛋白聚腺苷酸化信号，其中所述β-珠蛋白聚腺苷酸化信号具有与SEQ ID NO:36具有至少80％同一性的核苷酸序列。
26.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其还包含编码HSV-1UL29的核苷酸序列，
其中UL29具有与SEQ ID:No 38具有至少80％同一性的氨基酸序列。
27.如权利要求26所述的腺病毒辅助质粒，其中UL29的表达在所述质粒的HSV TK启动子的控制下。
28.如权利要求27所述的腺病毒辅助质粒，其中所述HSV TK启动子具有与SEQ ID NO:39具有至少80％同一性的核苷酸序列。
29.如权利要求26所述的腺病毒辅助质粒，其还包含UL29下游的HSV TK聚腺苷酸化信号，其中所述HSV TK聚腺苷酸化信号具有与SEQ ID NO:40具有至少80％同一性的核苷酸序列。
30.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述E4区域不包含E4orf1，并且其中所述E4区域不包含E4orf2。
31.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述E4区域可操作地连接到E4迷你启动子，其中所述E4迷你启动子具有与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的核苷酸序列。
32.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述E4区域可操作地连接到SV40启动子，其中所述SV40启动子具有与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的核苷酸序列。
33.一种腺病毒辅助质粒，其包含以下腺病毒DNA序列或区域：
(a)E2a；
(b)E4区域；和
(c)VA RNA区域；
其中所述腺病毒辅助质粒不包含以下组分中的一者或多者：
纤毛或其部分；
L1-52/55K(包装蛋白3)；
外周六邻体相关蛋白；和
L4区域。
34.一种腺病毒辅助质粒，其与SEQ ID NO:41-66中的任一者具有80％序列同一性。
35.一种生产重组腺病毒相关病毒载体的方法，其包括：
用AAV载体质粒、AAV Rep-Cap表达质粒和如权利要求1至34中任一项所述的腺病毒辅助质粒转染生产细胞。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述AAV载体质粒包含AAV反向末端重复序列(ITR)和所关注的转基因。
37.一种生产重组腺病毒相关病毒载体的方法，其包括：
用AAV载体质粒和如权利要求1至34中任一项所述的腺病毒辅助质粒转染生产细胞，
其中所述生产细胞稳定表达Rep-Cap。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述AAV载体质粒包含AAV反向末端重复序列(ITR)和所关注的转基因。
39.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述L4区域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码L4(六邻体装配)蛋白。
40.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述L4区域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分L4(六邻体装配)蛋白。
41.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述L4区域包含与SEQ ID NO:12具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分六邻体相关前体(L4 pVIII)蛋白。
42.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分DNA末端蛋白。
43.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含与SEQ ID NO:22具有至少80％同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码部分23kDa内切蛋白酶。
44.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒还包含编码HSV-1UL30和HSV-1UL42的核苷酸序列，
其中所述核苷酸序列中的至少一个与SEQ ID NO:29具有至少80％同一性；
其中所述核苷酸序列中的至少一个与SEQ ID NO:31具有至少80％同一性；并且
其中UL30和UL42被由与SEQ ID NO:33具有至少80％同一性的核酸序列编码的P2A切割位点分开。
45.如权利要求1所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒还包含编码HSV-1UL29的核苷酸序列，
其中所述核苷酸序列与SEQ ID:No 37具有至少80％同一性。
46.如前述权利要求中任一项所述的腺病毒辅助质粒，其中所述腺病毒辅助质粒包含抗性基因。
47.如权利要求46所述的腺病毒辅助质粒，其中抗性盒是卡那霉素抗性基因。
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