JP2021526804A - 遺伝子編集のための修飾されたガイドｒｎａ - Google Patents

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Abstract

本開示は、遺伝子編集方法における改善されたインビトロおよびインビボ活性を有する修飾ガイドＲＮＡに関する。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０１８年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８２，８３８号および２０１８年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／６８２，８２０号の利益を主張し、これらは各々、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、外因性遺伝子エレメントを認識して切断する原核免疫システムの一部であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した遺伝子編集の分野に関する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＤＮＡの部位特異的破壊を誘導する、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）と称される単一のヌクレアーゼに依る。Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される小ＲＮＡ分子によって特定のＤＮＡ配列に誘導される。完全なガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）およびｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。ガイド領域を含むｃｒＲＮＡは、完全なｇＲＮＡを形成するために、ｔｒＲＮＡと共有結合的または非共有結合的に会合する必要があるか、または会合するようになることを理解の下、ｇＲＮＡと称してもよい。ＴｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内に含まれるか、またはデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の２つの別々のＲＮＡ分子内に含まれ得る。ＴｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９は、Ｃａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と称される。
オリゴヌクレオチド、特にＲＮＡは、非酵素的切断、エンドヌクレアーゼ切断、またはエキソヌクレアーゼ切断によって細胞中および血清中で分解される場合がある。そのような分解を防止し、ｇＲＮＡの安定性を向上させ、遺伝子編集効率を向上させるための改善された方法および組成物は、特に治療用途に望ましい。
いくつかの実施形態では、修飾ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むゲノム編集ツールが提供される。本明細書に記載のｇＲＮＡの修飾は、ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の安定性を改善し、標的ＤＮＡを切断するＣａｓ９（例えば、ＳａＣａｓ９、ｓｐｙＣａｓ９、および等価物）の活性を改善し得る。
いくつかの実施形態では、修飾ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および／または修飾ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）が提供される。いくつかの実施形態では、修飾ｃｒＲＮＡおよび／または修飾ｔｒＲＮＡは、デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｃｒＲＮＡおよび／または修飾ｔｒＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。本明細書に記載のｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒＲＮＡの修飾は、ｇＲＮＡおよびｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の安定性を改善し、標的ＤＮＡを切断するＣａｓ９（例えば、ＳａｕＣａｓ９、ｓｐｙＣａｓ９、および等価物）の活性を改善し得る。いくつかの実施形態では、ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、標的化ドメインにおいて修飾されている。
いくつかの実施形態では、短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）を含むゲノム編集ツールが提供される。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは修飾されている。本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡは、短いｓｇＲＮＡおよび短いｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の安定性を改善し、標的ＤＮＡを切断するＣａｓ９（例えば、ＳａｕＣａｓ９、ｓｐｙＣａｓ９、および等価物）の活性を改善し得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、例えば以下の実施形態、表１、ならびに実施例および関連する図において記載されるような、１つ以上のＹＡ部位における修飾を含む。疑義を回避するために、ｓｇＲＮＡには、短いｓｇＲＮＡが含まれるが、これに限定されない。実施例の項目で考察されるように、ｇＲＮＡは、例えば非修飾ＹＡ部位における切断を含むＲＮａｓｅ Ａ様分解パターンに高感受性であり得ることが見出されている。さらに、ＹＡ部位修飾は、そのような切断を低減または排除することができ、多くのＹＡ部位修飾が、Ｃａｓ９等のヌクレアーゼによる切断を誘導する能力に悪影響を及ぼすことなく許容されるようであることが見出されている。ＹＡ部位を含むがこれらに限定されない特定のｇＲＮＡ位置は、それらがＣａｓ９によって接触され、活性を失うことの懸念から修飾するべきではないとの他者の記載にもかかわらず、修飾することができることも見出されている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：１１７９−１１８７（２０１７））。そのような修飾は、活性を損なうことなく、望ましくないｇＲＮＡ分解をさらに低減し得る。
以下の実施形態が包含される。
実施形態０１は、ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、ヘアピン領域は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠き、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾または３’末端修飾を含む。
実施形態０２は、短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾を含む、実施形態１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態０３は、短いｓｇＲＮＡが、３’末端修飾を含む、実施形態１〜２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態０４は、短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾および３’末端修飾を含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態０５は、短いｓｇＲＮＡが、３’テールを含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態０６は、３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む、実施形態５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態０７は、３’テールが、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜５、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０のヌクレオチドを含む、実施形態５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態０８は、短いｓｇＲＮＡが、３’テールを含まない、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態０９は、ヘアピン領域における修飾を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０は、３’末端修飾およびヘアピン領域における修飾を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１は、３’末端修飾、ヘアピン領域における修飾、および５’末端修飾を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２は、５’末端修飾およびヘアピン領域における修飾を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３は、少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドが連続する、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４は、少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドが、
ｉ．ヘアピン１内にある、
ｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」内にある、
ｉｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチド内にある、
ｉｖ．ヘアピン１の少なくとも一部を含む、
ｖ．ヘアピン２内にある、
ｖｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｖｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン２内にある、
ｖｉｉｉ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｉｘ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｘ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｘｉ．ヘアピン１またはヘアピン２内にあり、任意選択により、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｘｉｉ．連続し、
ｘｉｉｉ．連続し、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、
ｘｉｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン２の一部に及ぶ、
ｘｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」に及ぶ、または
ｘｖｉ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチドに及ぶ、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１５は、ガイド領域をさらに含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１６は、３’および／または５’末端修飾が、保護末端修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７は、ヘアピン領域における修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８は、３’および／または５’末端修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９は、３’および／または５’末端修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０は、３’および／または５’末端修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むかまたはさらに含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１は、３’および／または５’末端修飾が、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２は、ヘアピン領域における修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３は、ヘアピン領域における修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４は、３’末端修飾が、
ｉ．最後の７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾、
ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれかを含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、短いｓｇＲＮＡが、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２の修飾を含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
ｉ．５〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｉｉ．６〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｉｉｉ．５個のヌクレオチドからなる、
ｉｖ．６個のヌクレオチドからなる、
ｖ．７個のヌクレオチドからなる、
ｖｉ．８個のヌクレオチドからなる、
ｖｉｉ．９個のヌクレオチドからなる、
ｖｉｉｉ．１０個のヌクレオチドからなる、
ｉｘ．５〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘ．６〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉ．５個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉｉ．６個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉｉｉ．７個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉｖ．８個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｖ．９個の連続するヌクレオチドからなる、または
ｘｖｉ．１０個の連続するヌクレオチドからなる、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７は、３’末端修飾が、
ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
ｉｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および
ｖｉ．（ｉ．）〜（ｖ．）の１つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８は、短いｓｇＲＮＡが、
ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
ｉｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および
ｖｉ．（ｉ．）〜（ｖ．）の１つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む、３’テールを含む、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９は、短いｓｇＲＮＡが、
ｉ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
ｉｉ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、または１８個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
ｉｉｉ．約１〜３、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
ｉｖ．約１〜３、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１２、１〜１４、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個のヌクレオチド間ＰＳ結合、および
ｖ．各ヌクレオチド間のＰＳ結合のうちの１つ以上を含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０は、３’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、結合が最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間にある、
ｉｉ．最後の３個のヌクレオチド間に２個のＰＳ結合が存在する、
ｉｉｉ．最後の４個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間にＰＳ結合が存在する、
ｉｖ．最後の５個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間にＰＳ結合が存在する、
ｖ．最後の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間にＰＳ結合が存在するのうちの１つ以上である、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１は、３’末端修飾が、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態３１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２は、３’末端修飾が、
ｉ．最後の１〜７個のヌクレオチドのうちの１個以上の修飾であって、修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせである修飾、
ｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後のヌクレオチドの修飾、ならびに隣りのヌクレオチドおよび／もしくは３’テールの１番目のヌクレオチドへの任意選択による１もしくは２個のＰＳ結合、
ｉｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後および／もしくは最後から２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
ｉｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、および／もしくは最後から３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
ｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、および／もしくは最後から４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
ｖｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、最後から４番目、および／もしくは最後から５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３は、ｓｇＲＮＡが、３’テールを含み、３’テールが、３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４は、３’テールが、完全に修飾されている、実施形態３３に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、短いｓｇＲＮＡは、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２の修飾を含む、実施形態３３に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６は、短いｓｇＲＮＡが、
ｉ．配列番号１〜５４のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾、
ｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合、
ｉｉｉ．（ｉ）３’末端部の３’末端からの５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｉｖ．ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
ｖ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．（ｉ）３’末端部の３’末端からの１５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続する２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｖｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける交互する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｖｉｉｉ．（ｉ）２または３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｉｘ．最後のヌクレオチドと最後から隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合、ならびに
ｘ．１５または２０個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合のうちの１つ以上を含む、実施形態１〜３５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７は、５’末端修飾が、
ｉ．ガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１個以上の修飾、
ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれかを含む、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８は、５’末端修飾が、１〜７、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
ｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１を含む、
ｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０を含む、
ｉｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含む、
ｉｖ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１からなる、
ｖ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０からなる、または
ｖｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、実施形態１〜３８に記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０は、５’末端修飾が、
ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
ｉｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．デオキシリボヌクレオチド、
ｖｉｉ．イノシン、および
ｖｉｉｉ．（ｉ．）〜（ｖｉｉ．）の１個以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１は、５’末端修飾が、
ｉ．１、２、３、４、５、６、および／７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、または
ｉｉ．約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、または１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含む、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２は、５’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、結合が、ガイド領域のヌクレオチド１と２の間にある、
ｉｉ．２個のＰＳ結合が存在し、結合が、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、および２と３との間にある、
ｉｉｉ．クレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
ｉｖ．ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、および４と５との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
ｖ．ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
ｖｉ．ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、５と６との間、および６と７との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、または
ｖｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、５と６との間、６と７との間、および７と８との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３は、５’末端修飾が、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態４２に記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４は、短いｓｇＲＮＡが、
ｉ．可変領域のヌクレオチド１〜７のうちの１個以上の修飾であって、修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ（デオキシリボヌクレオチド）、イノシン、および／もしくはそれらの組み合わせである修飾、
ｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによるガイド領域の１番目のヌクレオチドの修飾、および隣りのヌクレオチドへの任意選択によるＰＳ結合、
ｉｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−Ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目および／もしくは２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
ｉｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、および／もしくは３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
ｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、および／もしくは４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
ｖｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、４番目、および／もしくは５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４５は、短いｓｇＲＮＡが、
ｉ．配列番号１〜５４のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾、
ｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、ならびに３と４との間のＰＳ結合、
ｉｖ．ガイド領域の１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｖ．ガイド領域の１、２、３、４、およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合、
ｖｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合、
ｖｉｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
ｉｘ．ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｘ．ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４６は、上部ステム領域が、少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４７は、上部ステム修飾が、
ｉ．上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾、
ｉｉ．上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾、および
ｉｉｉ．上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４８は、上部ステム修飾が、
ｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および
ｉｖ．（ｉ．）〜（ｉｉｉ．）の１つ以上の組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態４７に記載のｇＲＮＡである。
実施形態４９は、ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む短いｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、ヘアピン領域は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠き、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾、ならびに
ｉ．上部ステム領域、
ｉｉ．ヘアピン１領域、および
ｉｉｉ．ヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含み、
５’末端修飾は、５’保護末端修飾、例えば、最初の７個のヌクレオチド内の少なくとも２個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、ガイドＲＮＡである。
実施形態５０は、少なくとも１個の修飾が、２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態５１は、少なくとも１個の修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４９または実施形態５０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態５２は、少なくとも１個の修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態４９〜５１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態５３は、短いｓｇＲＮＡが、上部ステム領域における１つ以上の修飾を含む、ｇＲＮＡである、実施形態４９〜５２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態５４は、ＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つにおける修飾を含む、実施形態５３に記載のｇＲＮＡである。
実施形態５５は、短いｓｇＲＮＡが、ヘアピン１領域における１つ以上の修飾を含む、実施形態４９〜５４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態５６は、短いｓｇＲＮＡが、Ｈ１−１における修飾を含む、実施形態５５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態５７が、短いｓｇＲＮＡが、ヘアピン２領域における１つ以上の修飾を含む、実施形態４９〜５６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態５８は、短いｓｇＲＮＡが、Ｈ２−１における修飾を含む、実施形態５７に記載のｇＲＮＡである。
実施形態５９は、短いｓｇＲＮＡが、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における修飾を含む、実施形態４９〜５８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６０は、短いｓｇＲＮＡが、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における修飾を含む、実施形態４９〜５９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６１は、短いｓｇＲＮＡが、上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域の各々に１つ以上の修飾を含む、実施形態４９〜６０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６２は、短いｓｇＲＮＡが、ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４９〜６１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６３は、修飾を含む下部ステム領域をさらに含む、実施形態４９〜６２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６４は、３’末端修飾をさらに含む、実施形態４９〜６３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６５は、３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が修飾されている、実施形態６４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態６６は、３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、または２’−Ｏ−ｍｏｅにより修飾されている、実施形態６４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態６７は、３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの１個以上間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合をさらに含む、実施形態６４〜６６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６８は、修飾を含むバルジ領域をさらに含む、実施形態４９〜６７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態６９は、修飾を含むネクサス領域をさらに含む、実施形態４９〜６８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７０は、可変領域の５’末端における少なくとも最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部の３’末端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている、実施形態４９〜６９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７１は、可変領域の５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドが、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合されている、実施形態４９〜７０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７２は、末端修飾が、２’−ＯＭｅを含む、実施形態７０〜７１のうちのいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７３は、末端修飾が、２’−Ｆを含む、実施形態７０〜７１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７４は、可変領域の５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドが、ＰＳ結合で結合され、可変領域の５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部の３’末端における最後の３個のヌクレオチドが、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態４９〜７３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７５は、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の４個のヌクレオチドが、ＰＳ結合で結合され、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の３個のヌクレオチドが、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、および／または２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾を含む、実施形態４９〜７４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７６は、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、および／またはＬＳ１２が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、実施形態４９〜７５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７７は、バルジ領域におけるヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、実施形態４９〜７６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７８は、バルジ領域におけるヌクレオチドの少なくとも５０％が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、実施形態４９〜７７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態７９は、上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、実施形態４９〜７８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態８０は、ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、実施形態４９〜７９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態８１は、ネクサス領域におけるＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８が修飾されている、実施形態４９〜８０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態８２は、ネクサス領域における修飾が、２’−ＯＭｅおよび２’Ｆから選択される、実施形態８０または８１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態８３は、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が、ＰＳ結合で結合されている、実施形態８０〜８２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態８４は、ヘアピン１領域に残存するヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、実施形態４９〜８３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態８５は、ヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、実施形態４９〜８４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態８６は、ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む短いｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであり、ヘアピン領域は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠き、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾または３’末端修飾を含み、短いｓｇＲＮＡは、
ｉ．上部ステム領域における少なくとも１つの修飾、および
ｉｉ．３’テールのうちのいずれか１つ以上をさらに含む、ガイドＲＮＡである。
実施形態８７は、上部ステム修飾が、
ｉ．上部ステム領域における各ヌクレオチド（ＵＳ１〜ＵＳ１２）の修飾、
ｉｉ．上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾、
ｉｉｉ．上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個全てのヌクレオチドの修飾、および
ｉｖ．上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態８６に記載のｇＲＮＡである。
実施形態８８は、５’末端修飾が、
ｉ．可変領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１個以上の修飾、
ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態８６〜８７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態８９は、５’末端修飾が、
ｉ．配列番号１〜５４、４０１〜５３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、３３８８〜３４３０、または３５４９〜３５５２のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾、
ｉｉ．可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合、
ｉｖ．可変領域の１、２、３、４、およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｖ．可変領域の１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、ならびに５と６との間のＰＳ結合、
ｖｉ．可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間のＰＳ結合、
ｖｉｉｉ．可変領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
ｉｘ．可変領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｘ．可変領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態８６〜８８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態９０は、可変領域の少なくともヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む、実施形態８９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態９１は、可変領域の少なくとも１、２、３、およびヌクレオチド４における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む、実施形態８９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態９２は、
ｉ．最後の７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾、
ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、３’末端修飾を含む、実施形態８６〜９１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態９３は、短いｓｇＲＮＡが、
ｉ．配列番号１〜５４、４０１〜５３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、３３８８〜３４３０、または３５４９〜３５５２のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾、
ｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合、
ｉｉｉ．（ｉ）５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｉｖ．ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
ｖ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．（ｉ）１５個の連続した２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続する２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｖｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける交互する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｖｉｉｉ．（ｉ）２または３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｉｘ．最後のヌクレオチドと最後から隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合、ならびに
ｘ．１５または２０個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合のうちのいずれか１つを含む、実施形態８６〜９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態９４は、ｓｇＲＮＡが３’テールを含み、３’テールが３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む、実施形態８６〜９３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態９５は、３’テールが、完全に修飾されている、実施形態９４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態９６は、３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチドを含み、任意選択により、これらのヌクレオチドのうちのいずれか１個以上が修飾されている、実施形態９４のｇＲＮＡである。
実施形態９７は、表１の修飾を含む、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、および３０１〜３５４のうちのいずれかを含む短いｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡである。
実施形態９８は、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、および３０１〜３５４のうちのいずれか１つの核酸と少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含む短いｓｇＲＮＡであるガイドＲＮＡであり、表１の参照配列識別子のヌクレオチドに対応する短いｓｇＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾は、表１の参照配列識別子に示される修飾と同一または同等である。
実施形態９９は、少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜９８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１００は、５’末端修飾ではない少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含む、実施形態１〜９９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０１は、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含む、ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８にあるか、またはその後ろにある、実施形態１〜１００のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０２は、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含み、短いｓｇＲＮＡが、
ａ．Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾、
ｂ．１、２、３、４、または５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｃ．１、２、３、４、または５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ｓｇＲＮＡの任意の５’末端修飾と異なる、ＹＡ修飾、
ｄ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８にあるか、またはその後にある、ＹＡ修飾、
ｅ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端内にある、ＹＡ修飾、
ｆ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端部のヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある、ＹＡ修飾、
ｇ．５’末端修飾以外のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｈ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８にあるか、またはその後にある、ＹＡ修飾、
ｉ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、２つのガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端内にある、ＹＡ修飾、
ｊ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある、ＹＡ修飾、
ｋ．５’末端修飾以外の２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｌ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾のうちの１つ以上を含む、実施形態１〜１０１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０３は、ＹＡ修飾を含み、該修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−ＯＭｅ、ＥＮＡ、ＵＮＡ、イノシン、またはＰＳを含む、実施形態１〜１０２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０４は、ＹＡ修飾を含み、該修飾が、ジヌクレオチドモチーフの構造を変更して、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低下する、実施形態１〜１０３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０５は、ＹＡ修飾を含み、該修飾が、ＲＮａｓｅによるＹＡ部位の認識もしくは切断を妨げ、および／またはＲＮＡ構造を安定化させる、実施形態１〜１０４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０６は、ＹＡ修飾を含み、該修飾が、
ａ．２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ｍｏｅ、２’−Ｆアラビノース、および２’−Ｈ（デオキシリボース）から選択されるリボース修飾、
ｂ．ＬＮＡ、ＢＮＡ、およびＥＮＡ等の二環式リボース類似体、
ｃ．非ロックド核酸修飾、
ｄ．イノシン、シュードウリジン、および５’−メチルシトシン等の塩基修飾、ならびに
ｅ．ホスホロチオエート等のヌクレオシド間結合修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１〜１０５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０７は、１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１０６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０８は、保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１０９は、保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１０８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１０は、保存領域ＹＡ部位１のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１０９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１１は、保存領域ＹＡ部位２のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１２は、保存領域ＹＡ部位３のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１３は、保存領域ＹＡ部位４のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１４は、保存領域ＹＡ部位５のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１５は、保存領域ＹＡ部位６のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１６は、保存領域ＹＡ部位７のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１７は、保存領域ＹＡ部位８のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１８は、保存領域ＹＡ部位９のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１１９は、保存領域ＹＡ部位１０のＹＡ修飾を含む、実施形態１〜１１８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２０は、
ａ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、および４のＹＡ修飾、
ｃ．保存領域ＹＡ部位２、３、および１０のＹＡ修飾、
ｄ．保存領域ＹＡ部位２、４、および１０のＹＡ修飾、
ｅ．保存領域ＹＡ部位３、４、および１０のＹＡ修飾、
ｆ．保存領域ＹＡ部位２および１０のＹＡ修飾、
ｇ．保存領域ＹＡ部位２および４のＹＡ修飾、
ｈ．保存領域ＹＡ部位２および３のＹＡ修飾、
ｉ．保存領域ＹＡ部位３および４のＹＡ修飾、
ｊ．保存領域ＹＡ部位３および１０のＹＡ修飾、
ｋ．保存領域ＹＡ部位４および１０のＹＡ修飾、
ｌ．保存領域ＹＡ部位１および５のＹＡ修飾、
ｍ．保存領域ＹＡ部位１および６のＹＡ修飾、
ｎ．保存領域ＹＡ部位１および７のＹＡ修飾、
ｏ．保存領域ＹＡ部位１および８のＹＡ修飾、
ｐ．保存領域ＹＡ部位１および９のＹＡ修飾、
ｑ．保存領域ＹＡ部位８および５のＹＡ修飾、
ｒ．保存領域ＹＡ部位８および６のＹＡ修飾、
ｓ．保存領域ＹＡ部位８および７のＹＡ修飾、ならびに
ｔ．保存領域ＹＡ部位８および９のＹＡ修飾のうちの１つ以上を含み、
任意選択により、ｓｇＲＮＡが、保存領域ＹＡ部位２、３、４、および／または１０のＹＡ修飾をさらに含む、実施形態１〜１１９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２１は、少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１〜１２０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２２は、少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態１〜１２１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２３は、少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、ＰＳ修飾を含む、実施形態１〜１２２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２４は、ｇＲＮＡが、以下のヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個、または全てにおける修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、２’−Ｈ、イノシン、またはホスホロチオエート修飾である、実施形態１〜１２３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２５は、短いｓｇＲＮＡが、ヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８における修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、２’−Ｈ、イノシン、またはホスホロチオエート修飾である、実施形態１〜１２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２６は、２’−ＯＭｅ修飾が、ヌクレオチド６〜１１および１３末端におけるガイド領域に存在しない、実施形態１２４〜１２５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２７は、２’−フルオロ修飾が、ヌクレオチド１〜７、１５、１６、および１９末端におけるガイド領域に存在しない、実施形態１２４〜１２６に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２８は、ホスホロチオエート修飾が、ヌクレオチド４、５、１１〜１４、１７、および１８におけるガイド領域に存在しない、実施形態１２４〜１２７に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１２９は、ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド２０を含む、実施形態１２４〜１２８に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３０は、ガイド領域が、２０個のヌクレオチドからなる、実施形態１２４〜１２９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３１は、ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における修飾を含む、実施形態１２４〜１３０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３２は、ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１２における修飾を含む、実施形態１２４〜１３１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３３は、ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１５における修飾を含む、実施形態１２４〜１３２に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３４は、ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１６における修飾を含む、実施形態１２４〜１３３に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３５は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１９における修飾を含む、実施形態１２４〜１３４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３６は、ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６においてＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド５が、非修飾である、実施形態１２４〜１３０または１３２〜１３５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３７は、ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３においてＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１２が、非修飾である、実施形態１２４〜１３１または１３３〜１３６に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３８は、ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６においてＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１５が、非修飾である、実施形態１２４〜１３２または１３４〜１３７に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１３９は、ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７においてＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１６が、非修飾である、実施形態１２４〜１３３または１３５〜１３８に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４０は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０においてＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１９が、非修飾である、実施形態１２４〜１３４または１３６〜１３９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４１は、短いｓｇＲＮＡが、以下：
（ａ）ヌクレオチド１における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
（ｂ）ヌクレオチド２における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
（ｃ）ヌクレオチド３における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
（ｄ）ヌクレオチド４における２’−ＯＭｅ修飾、
（ｅ）ヌクレオチド６におけるホスホロチオエート修飾、
（ｆ）ヌクレオチド７におけるホスホロチオエート修飾、
（ｇ）ヌクレオチド８における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
（ｈ）ヌクレオチド９における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
（ｉ）ヌクレオチド１０における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
（ｊ）ヌクレオチド１１における２’−フルオロ修飾、
（ｋ）ヌクレオチド１３における２’−フルオロ修飾、
（ｌ）ヌクレオチド１４における２’−フルオロ修飾、
（ｍ）ヌクレオチド１７における２’−フルオロ修飾、および
（ｎ）ヌクレオチド１８における２’−フルオロ修飾のうちの１つ以上を含むガイド領域を含む、実施形態１２４〜１４０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４２は、ガイド領域が、前の実施形態に記載される修飾の各々を含む、実施形態１２４〜１４１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４３は、ガイド領域が、以下：
（ａ）ヌクレオチド５および６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾、
（ｂ）ヌクレオチド１２および１３がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾、
（ｃ）ヌクレオチド１５および１６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１５におけるホスホロチオエートまたは２’−Ｈ修飾、
（ｄ）ヌクレオチド１６および１７がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾、
（ｅ）ヌクレオチド１９および２０がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１９におけるホスホロチオエートまたは２’−フルオロ修飾のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む、実施形態１２４〜１４２のｇＲＮＡである。
実施形態１４４は、ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１２４〜１４３のｇＲＮＡである。
実施形態１４５は、ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１２４〜１４４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４６は、ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１２４〜１４５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４７は、ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１２４〜１４６に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４８は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１９におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１２４〜１４７に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１４９は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９における２’−フルオロ修飾を含む、実施形態１２４〜１４８に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１５０は、ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１５を含むか、またはヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、実施形態１２４〜１４９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１５１は、ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１６を含むか、またはヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、実施形態１２４〜１５０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１５２は、
ａ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｃ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１５３は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８またはその後にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに任意選択により、
ｃ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１５４は、
ａ．ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１３個のヌクレオチド内にある１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｃ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１５５は、
ａ．５’末端修飾および３’末端修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｃ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１５６は、
ａ．少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｃ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１５７は、
ａ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｂ．保存領域ＹＡ部位１および８におけるＹＡ修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１５８は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８またはその後にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｃ．Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１５９は、
ａ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、８、および９の１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｃ．Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡである。
実施形態１６０は、
ａ．５’末端部の５’末端から６個のヌクレオチドもしくはその後に位置する１個以上のヌクレオチドにおける修飾、例えばＹＡ修飾、
ｂ．１つ以上のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｃ．Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５のうちの１つ以上における修飾であって、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、もしくは２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、修飾、
ｄ．ＬＳ１０における修飾であって、ＬＳ１０が、２’−フルオロ以外の修飾を含む、修飾、および／または
ｅ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、もしくはＮ１１における修飾
のうちの１つ以上を含むｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、以下：
ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、もしくは１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｉｉｉ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｉｖ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、もしくはＮ１７のうちの少なくとも１つはが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖｉ．Ｈ１−１が、修飾を含む、
ｖｉｉ．Ｈ２−１が、修飾を含む、または
ｖｉｉｉ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まないのうちの少なくとも１つが当てはまる、ガイドＲＮＡである。
実施形態１６１は、
ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６もしくはその後に位置する１個以上のヌクレオチドにおける修飾、例えばＹＡ修飾、または
ｉｉ．１つ以上のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾
のうちのいずれか１つ以上を含む、ガイドＲＮＡであって、以下：
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、もしくは１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、または
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０うちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、
のうちの少なくとも１つが当てはまり、以下：
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７〜１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、または
ｅ．ガイドＲＮＡが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちのいずれか１つ以上における２’−フルオロ修飾を含み、５’末端部の５’末端からの１１、１２、１３、１４、１７、もしくはヌクレオチド１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まず、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２が、２’−フルオロ修飾を含まないのうちの少なくとも１つがまた、当てはまる、ガイドＲＮＡである。
実施形態１６２は、Ｎ１４におけるグアノシンおよび／または以下：
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位１、５、および６のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾であって、ＹＡ部位６が、ＬＳ１２において修飾され、ＬＳ９が、非修飾である場合、ＬＳ１２の修飾が、２’−ＯＭｅ以外である、ＹＡ修飾、
ｃ．ＬＳ９における修飾であって、ＬＳ９が修飾され、ＬＳ５、ＬＳ７、およびＬＳ１２が非修飾である場合、ＬＳ９の修飾が、２’−フルオロ以外である、修飾、
ｄ．ＬＳ１２における修飾であって、ＬＳ１２が修飾され、ＬＳ９が非修飾である場合、ＬＳ１２の修飾が、２’−ＯＭｅ以外である、修飾、
ｅ．ＬＳ８もしくはＬＳ１１における修飾であって、ＬＳ８およびＬＳ１１のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、修飾、ならびに／または
ｆ．Ｎ６、Ｎ１４、もしくはＮ１７における修飾であって、Ｎ１７が修飾され、Ｎ６およびＮ１４が非修飾である場合、Ｎ１７の修飾が、２’−フルオロ以外であり、２’−ＯＭｅ以外である、修飾
のうちの１つ以上を含むｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、以下：
ｉ．５’末端部の５’末端からの８〜１１、１３〜１４、１７、もしくはヌクレオチド１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｉｉｉ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｉｖ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、もしくはＮ１７のうちの少なくとも１つはが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖｉ．Ｈ１−１が、修飾を含む、
ｖｉｉ．Ｈ２−１が、修飾を含む、または
ｖｉｉｉ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まないのうちの少なくとも１つが当てはまる、ガイドＲＮＡである。
実施形態１６３は、
ａ．１、２、３、４、もしくは５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．１、２、３、４、もしくは５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ｓｇＲＮＡの任意の５’末端修飾と異なる、ＹＡ修飾、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、もしくは１０末端内にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｅ．ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、もしくは９個のヌクレオチド内にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｆ．５’末端修飾以外のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、または
ｇ．ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾を含む、実施形態１６１または１６２に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１６４は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、もしくは１０末端内にある、２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｃ．ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、もしくは９個のヌクレオチド内にある、２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｄ．５’末端修飾以外の２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、または
ｅ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾を含む、実施形態１６３に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１６５は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、もしくは１０末端内にある、３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｃ．ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、もしくは９個のヌクレオチド内にある３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｄ．５’末端修飾以外の３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、または
ｅ．３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾を含む、実施形態１６３に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１６６は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１６５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１６７は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１６６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１６８は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１６７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１６９は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１６８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７０は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１６９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７１は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１１における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７２は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７３は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１３における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７４は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１４における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７５は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１５における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７６は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１６における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７７は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７８は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１８における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１７９は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１９における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８０は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド２０における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１７９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８１は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドが、ＹＡ修飾を含み、任意選択により、修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−ＯＭｅ、またはＰＳを含む、実施形態１６１〜１８０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８２は、修飾が、２’−フルオロである、実施形態１８１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８３は、修飾が、２’−ＯＭｅまたは２’−Ｈである、実施形態１８１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８４は、修飾が、ＰＳである、実施形態１８１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８５は、５’末端からのヌクレオチド６〜１０うちの少なくとも１、２、３、４、または５つが、ＹＡ修飾を含み、任意選択により、修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−ＯＭｅ、イノシン、またはＰＳを含む、実施形態１６１〜１８４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８６は、修飾が、ＰＳである、実施形態１８５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８７は、修飾が、２’−フルオロまたは２’−Ｈである、実施形態１８５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８８は、修飾が、２’−ＯＭｅである、実施形態１８５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態１８９は、以下：
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちの１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの１つ以上における、２’−フルオロ以外の修飾である、ＹＡ修飾、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちの１つ以上における、ＰＳ以外のＹＡ修飾、ならびに５’末端部の５’末端の５’末端からのヌクレオチド６〜１０における１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、任意選択により、修飾がＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８における１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０における、２’−フルオロ以外の修飾
ｄ．５’末端部の５’末端の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８の各々における、ＰＳ以外のＹＡ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０における１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、修飾が、任意選択によりＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、
ｅ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８における１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちのいずれか１つにおける１つ以上のＰＳ修飾、
ｆ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちのいずれか１つにおける少なくとも１つの２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、修飾が、任意選択によりＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、
ｇ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８の１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０の各々におけるＰＳ修飾、
ｈ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８の各々における２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、修飾が、任意選択によりＰＳ修飾である、修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１６１〜１８８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９０は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位および２’−フルオロ修飾もしくはＰＳ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−フルオロ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位および２’−ＯＭｅ修飾もしくはＰＳ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、ＰＳ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位および２’−ＯＭｅ修飾もしくは２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、ＹＡ修飾を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
ｅ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位、およびＰＳ修飾を含む第３の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも３つもしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
ｆ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第３の修飾ＹＡ部位、およびＰＳ修飾を含む第４の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも３つもしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
ｇ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、ＹＡ修飾を含む、少なくとも３つもしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
ｈ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位、ＰＳ修飾を含む第３の修飾ＹＡ部位、およびＰＳ修飾を含む第４の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも４つの修飾ＹＡ部位を含む、または
ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜４０が、ＹＡ修飾を含む少なくとも４つの修飾ＹＡ部位を含む、実施形態１６１〜１８９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９１は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、少なくとも５つの修飾ＹＡ部位を含む、実施形態１６１〜１９０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９２は、少なくとも５つの修飾ＹＡ部位が、ＰＳ修飾を含む第５の修飾ＹＡ部位を含み、任意選択により、第３の修飾ＹＡ部位が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態１６１〜１９１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９３は、少なくとも５つの修飾ＹＡ部位の第１、第２、および（該当する場合）第３、第４、および第５が、５’から３’の方向に配置されている、実施形態１６１〜１９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９４は、少なくとも５つの修飾ＹＡ部位の第１、第２、および（該当する場合）第３、第４、および第５が、５’から３’方向に配置されていない、実施形態１６１〜１９３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９５は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、デオキシリボヌクレオチドを含む少なくとも２、３、４、もしくは５つの修飾ＹＡ部位を含み、任意選択により、デオキシリボヌクレオチドは、ＹＡ部位のピリミジンである、実施形態１６１〜１９４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９６は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１のうちの少なくとも１、２、３、もしくは４つが、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含む、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つが、ＹＡ修飾を含む、任意選択により、ＹＡ修飾は、ヌクレオチド８〜１１に存在する場合には２’−ＯＭｅであり、ヌクレオチド１３、１４、１７、もしくは１８に存在する場合には２’−フルオロであり、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７および１８のうちの少なくとも一方もしくは両方が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含む、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７および１８のうちの少なくとも一方もしくは両方が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含む、または
ｅ．５’末端部の５’末端から４〜１４、１７、およびヌクレオチド１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１３個が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１９５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９７は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜１０の少なくとも１、２、３、４、５、または６つが、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１９６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９８は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜１０が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜１９７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態１９９は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも１個が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、５’保護末端修飾を含む、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも２つが、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、５’保護末端修飾を含む、または
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３の各々が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、５’保護末端修飾を含む、実施形態１６１〜１９８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２００は、５’末端部の５’末端から１１、１３、１４、１７、およびヌクレオチド１８のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つが、任意選択により２’−フルオロ修飾である、５’末端修飾を含む、実施形態１６１〜１９９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０１は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１５が、非修飾であるか、またはホスホロチオエートのみにより修飾されている、実施形態１６１〜２００のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０２は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１６が、非修飾であるか、またはホスホロチオエートのみにより修飾されている、実施形態１６１〜２００のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０３は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド３が、非修飾であるか、またはホスホロチオエートのみにより修飾されている、実施形態１〜２０２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０４は、ｃｒＲＮＡまたはｄｇＲＮＡである、実施形態１６１〜２０３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０５は、ｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜２０３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０６は、短いｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜２０３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０７は、保存領域ＹＡ部位１のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５または２０６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０８は、保存領域ＹＡ部位２のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２０７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２０９は、保存領域ＹＡ部位３のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２０８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１０は、保存領域ＹＡ部位４のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２０９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１１は、保存領域ＹＡ部位５のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２１０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１２は、保存領域ＹＡ部位６のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２１１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１３は、保存領域ＹＡ部位７のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２１２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１４は、保存領域ＹＡ部位８のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２１３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１５は、保存領域ＹＡ部位９のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２１４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１６は、保存領域ＹＡ部位１０のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２１５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１７は、
ａ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位２、３、および４のＹＡ修飾、
ｃ．保存領域ＹＡ部位２、３、および１０のＹＡ修飾、
ｄ．保存領域ＹＡ部位２、４、および１０のＹＡ修飾、
ｅ．保存領域ＹＡ部位３、４、および１０のＹＡ修飾、
ｆ．保存領域ＹＡ部位２および１０のＹＡ修飾、
ｇ．保存領域ＹＡ部位２および４のＹＡ修飾、
ｈ．保存領域ＹＡ部位２および３のＹＡ修飾、
ｉ．保存領域ＹＡ部位３および４のＹＡ修飾、
ｊ．保存領域ＹＡ部位３および１０のＹＡ修飾、または
ｋ．保存領域ＹＡ部位４および１０のＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２１６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１８は、
ａ．保存領域ＹＡ部位１および５のＹＡ修飾、
ｂ．保存領域ＹＡ部位１および６のＹＡ修飾、
ｃ．保存領域ＹＡ部位１および７のＹＡ修飾、
ｄ．保存領域ＹＡ部位１および８のＹＡ修飾、
ｅ．保存領域ＹＡ部位１および９のＹＡ修飾、
ｆ．保存領域ＹＡ部位８および５のＹＡ修飾、
ｇ．保存領域ＹＡ部位８および６のＹＡ修飾、
ｈ．保存領域ＹＡ部位８および７のＹＡ修飾、または
ｉ．保存領域ＹＡ部位８および９のＹＡ修飾を含み、
任意選択により、ｓｇＲＮＡが、保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のＹＡ修飾をさらに含む、実施形態２０５〜２１７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２１９は、少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態２０５〜２１８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２０は、少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２０５〜２１９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２１は、少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、ＰＳ修飾を含む、実施形態２０５〜２２０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２２は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態２０５〜２２１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２３は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２０５〜２２２のうちのいずれか１つのｇＲＮＡである。
実施形態２２４は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、ＰＳ修飾を含む、実施形態２０５〜２２３のうちのいずれか１つのｇＲＮＡである。
実施形態２２５は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、２’位置における、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、リボース修飾を含み、任意選択により、２’−Ｏアルキル、２’−Ｈ、および２’−フルオロ修飾から選択される、実施形態２０５〜２２４のうちのいずれか１つのｇＲＮＡである。
実施形態２２６は、
ａ．保存領域ＹＡ部位１および８が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、
ｂ．保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
ｃ．保存領域ＹＡ部位１が、２’−フルオロ修飾を含む、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
ｄ．保存領域ＹＡ部位８が、２’−フルオロ修飾を含む、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
ｅ．保存領域ＹＡ部位１が、ＹＡ部位のピリミジンにおける２’−フルオロ修飾を含む、ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９；もしくは５、６、７、および９が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
ｆ．保存領域ＹＡ部位８が、ＹＡ部位のピリミジンにおける２’−フルオロ修飾を含み、ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
ｇ．保存領域ＹＡ部位１および８が、２’−フルオロ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、または
ｈ．保存領域ＹＡ部位１および８が、ＹＡ部位のピリミジンにおける２’−フルオロ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択によりＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態２０５〜２２５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２７は、保存領域ＹＡ部位７および９が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２２６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２８は、保存領域ＹＡ部位５、６、７、および９が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２２７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２２９は、保存領域ＹＡ部位８が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２０５〜２２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３０は、保存領域ＹＡ部位８が、デオキシリボヌクレオチド修飾を含む、実施形態２０５〜２２９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３１は、保存領域ＹＡ部位８が、塩基置換によって排除され、任意選択により、塩基置換が、ＹＡ部位８のウラシルを排除し、さらに任意選択により、塩基置換が、ウラシルのグアニンへの置換である実施形態２０５〜２３０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３２は、保存領域ＹＡ部位１が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２０５〜２３１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３３は、保存領域ＹＡ部位１が、ＰＳ修飾を含む、実施形態２０５〜２３２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３４は、ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ９、ＬＳ１０、ＬＳ１１、およびＬＳ１２のうちの１、２、３、４、５、６、または７つが、修飾を含み、任意選択により、修飾が、２’−フルオロおよび／または２’−ＯＭｅ修飾である、実施形態２０５〜２３３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３５は、ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における修飾が、存在する場合、２’−フルオロ修飾を含み、任意選択により、ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１の各々が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２０５〜２３４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３６は、ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における修飾が、存在する場合、２’−ＯＭｅ修飾を含み、ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２の各々が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態２０５〜２３５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３７は、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、およびＮ１７のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、修飾を含む、実施形態２０５〜２３６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３８は、Ｈ２−２が修飾を含み、任意選択により、Ｈ２が、さもなくば非修飾である、実施形態２０５〜２３７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２３９は、Ｈ２−２が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態２０５〜２３８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４０は、ＵＳ３、ＵＳ９、およびＵＳ１２が、修飾を含み、任意選択により、ＵＳが、さもなくば非修飾である、実施形態２０５〜２３９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４１は、ＵＳ３、ＵＳ９、およびＵＳ１２が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態２０５〜２４０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４２は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０が、ＰＳ修飾を含み、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２０５〜２４１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４３は、各ガイド領域ＹＡ部位が、２’−フルオロ修飾を含み、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１５および／または１６を除く、実施形態２０５〜２４２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４４は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４、８、および１１が、ＹＡ修飾を含み、任意選択により、ヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含み、ヌクレオチド８および１１が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２０５〜２４３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４５は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上の修飾ＹＡ部位が、ＹＡ部位のピリミジン位置におけるＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４６は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾保存領域ＹＡ部位が、ＹＡ部位のピリミジン位置におけるＹＡ修飾を含む、実施形態２４５に記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４７は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上の修飾ＹＡ部位が、ＹＡ部位のアデニン位置におけるＹＡ修飾を含む、実施形態２０５〜２４６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾保存領域ＹＡ部位が、ＹＡ部位のアデニン位置におけるＹＡ部位修飾を含む、実施形態２４７に記載のｇＲＮＡである。
実施形態２４９は、
ａ．Ｈ１−１の修飾、
ｂ．Ｈ２−１の修飾、または
ｃ．Ｈ１−１およびＨ２−１の修飾を含む、実施形態２０５〜２４８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５０は、Ｈ１−１および／またはＨ２−１が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態２４９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５１は、Ｈ１−１および／またはＨ２−１が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２５０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５２は、Ｈ１−１および／またはＨ２−１が、ＰＳ修飾を含む、実施形態２５１に記載のｇＲＮＡ。
実施形態２５３は、Ｂ３における修飾を含み、任意選択により、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、または２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、実施形態２０５〜２５２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５４は、Ｂ４における修飾を含み、任意選択により、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、または２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、実施形態２０５〜２５３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５５は、Ｂ５における修飾を含み、任意選択により、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、または２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、実施形態２０５〜２５４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５６は、ＬＳ１０における修飾を含み、任意選択により、ＬＳ１０が、２’−フルオロ以外の修飾を含む、実施形態２０５〜２５５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５７は、Ｎ２における修飾を含む、実施形態２０５〜２５６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５８は、Ｎ３における修飾を含む、実施形態２０５〜２５７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２５９は、Ｎ４における修飾を含む、実施形態２０５〜２５８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６０は、Ｎ５における修飾を含む、実施形態２０５〜２５９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６１は、Ｎ６における修飾を含む、実施形態２０５〜２６０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６２は、Ｎ７における修飾を含む、実施形態２０５〜２６１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６３は、Ｎ１０における修飾を含む、実施形態２０５〜２６２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６４は、Ｎ１１における修飾を含む、実施形態２０５〜２６３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６５は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１１が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｅ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１３が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｆ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１４が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｇ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７が、２’−フルオロ修飾を含まない、および／または
ｈ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１８が、２’−フルオロ修飾を含まない、実施形態２０５〜２６４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６６は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、２’−フルオロ修飾を含まない、および／または
ｅ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、２’−フルオロ修飾を含まない、実施形態２０５〜２６５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６７は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、ホスホロチオエート結合を含まない、および／または
ｅ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、ホスホロチオエート結合を含まない、実施形態２０５〜２６６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６８は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、実施形態２０５〜２６７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２６９は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、実施形態２０５〜２６８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７０は、ガイドＲＮＡが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜１１および１３〜２０のうちのいずれか１つ以上における２’−フルオロ修飾を含み、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２が、２’−フルオロ修飾を含まない、実施形態２０５〜２６９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７１は、ガイドＲＮＡが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちのいずれか１つ以上における２’−フルオロ修飾を含み、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１１が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１３が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１４が、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｅ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７が、２’−フルオロ修飾を含まない、および／または
ｆ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１８が、２’−フルオロ修飾を含まない、実施形態２０５〜２７０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７２は、
ａ．Ｂ２が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｂ．Ｂ３が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｃ．Ｂ４が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
ｄ．Ｂ５が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、実施形態２０５〜２７１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７３は、
ａ．ＬＳ１が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｂ．ＬＳ８が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
ｃ．ＬＳ１０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、実施形態２０５〜２７２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７４は、
ａ．Ｎ２が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｂ．Ｎ３が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｃ．Ｎ４が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｄ．Ｎ５が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｅ．Ｎ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｆ．Ｎ７が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｇ．Ｎ１０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｈ．Ｎ１１が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｉ．Ｎ１６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
ｊ．Ｎ１７が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、実施形態２０５〜２７３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７５は、
ａ．Ｈ１−２が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｂ．Ｈ１−３が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｃ．Ｈ１−４が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｄ．Ｈ１−５が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｅ．Ｈ１−６が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｆ．Ｈ１−７が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｇ．Ｈ１−８が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｈ．Ｈ１−９が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｉ．Ｈ１−１０が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｊ．Ｈ２−１が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｋ．Ｈ２−２が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｌ．Ｈ２−３が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｍ．Ｈ２−４が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｎ．Ｈ２−５が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｏ．Ｈ２−６が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｐ．Ｈ２−７が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｑ．Ｈ２−８が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｒ．Ｈ２−９が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｓ．Ｈ２−１０が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｔ．Ｈ２−１１が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｕ．Ｈ２−１２が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｖ．Ｈ２−１３が、ホスホロチオエート結合を含まない、
ｗ．Ｈ２−１４が、ホスホロチオエート結合を含まない、および／または
ｘ．Ｈ２−１５が、ホスホロチオエート結合を含まない、実施形態２０５〜２７４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２７６は、
ａ．任意選択によりＰＳ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０、
ｂ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８、ならびに
ｃ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾、または保存領域ＹＡ部位１もしくは８である、Ｈ１−１およびＨ２−１における修飾を含むｓｇＲＮＡである、ｇＲＮＡである。
実施形態２７７は、
ａ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、および９、ならびに
ｂ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、保存領域ＹＡ部位８におけるＹＡ修飾を含むｓｇＲＮＡである、ｇＲＮＡである。
実施形態２７８は、４つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含むｇＲＮＡであって、ＹＡ部位のうちの少なくとも１つが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８またはその後にあり、
ａ．第１のＹＡ部位が、２’−ＯＭｅ修飾を含み、
ｂ．第２のＹＡ部位が、２’−フルオロ修飾を含み、
ｃ．第３のＹＡ部位が、２’−フルオロまたはＰＳ修飾を含み、
ｄ．第４のＹＡ部位が、ＰＳ修飾を含み、
任意選択により、第１、第２、第３、および第４のＹＡ部位が、５’から３’の方向に配置される、ｇＲＮＡである。
実施形態２７９は、第３のＹＡ部位が、ＰＳ修飾を含む、実施形態２７８のｇＲＮＡである。
実施形態２８０が、第３のＹＡ部位が、２’−フルオロ修飾を含む、実施形態２７８または２７９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８１は、任意選択により第４のＹＡ部位の３’側にある、ＰＳ修飾を含む第５のＹＡ部位をさらに含む、実施形態２７８〜２８０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８２は、保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、および９が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾であるＹＡ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位８が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、修飾を含む、実施形態２０５〜２８１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８３は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４であって、ＹＡ修飾が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ヌクレオチド４、
ｂ．任意選択によりＰＳ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０、
ｃ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８、
ｄ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１、
ｅ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２、
ｆ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、およびＮ１７、ならびに
ｇ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、Ｎ１４におけるＹＡ修飾を含むｓｇＲＮＡである、ｇＲＮＡである。
実施形態２８４は、
ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０が、ＰＳ修飾を含む、
ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８が、２’−フルオロ修飾を含む、
ｄ．ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１が、２’−フルオロ修飾を含む、
ｅ．ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
ｆ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、およびＮ１７が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、ならびに
ｇ．Ｎ１４が、２’−フルオロ修飾を含むのうちの１つ以上が当てはまる実施形態１６１〜のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８５は、少なくとも１つのＹＡ修飾が、ＹＡ部位のピリミジン位置の修飾を含む、実施形態１６１〜２８４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８６は、少なくとも１つのＹＡ修飾が、ＹＡ部位のアデニン位置の修飾を含む、実施形態１６１〜２８５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８７は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位が、ＹＡ部位のピリミジン位置におけるＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜２８６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８８は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位が、ＹＡ部位のアデニン位置におけるＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜２８７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２８９は、少なくとも１つのＹＡ修飾が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１６１〜２８８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９０は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１６１〜２８９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９１は、各修飾保存領域ＹＡ部位が、ＹＡ部位のピリミジン位置における修飾を含む、実施形態１６１〜２９０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９２は、各修飾ガイド領域ＹＡ部位、または各修飾保存領域およびガイド領域ＹＡ部位が、ＹＡ部位のピリミジン位置における修飾を含む、実施形態１６１〜２９１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９３は、各修飾保存領域ＹＡ部位が、ＹＡ部位のアデニン位置における修飾を含む、実施形態１６１〜２９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９４は、各修飾ガイド領域ＹＡ部位、または各修飾保存領域およびガイド領域ＹＡ部位が、ＹＡ部位のアデニン位置における修飾を含む、実施形態１６１〜２９３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９５は、ＬＳ５における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜２９４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９６は、ＬＳ７における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜２９５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９７は、ＬＳ９における修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、ＬＳ９が修飾され、ＬＳ５、ＬＳ７、およびＬＳ１２が非修飾である場合、ＬＳ９の修飾が２’−フルオロ以外である、実施形態１６１〜２９６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９８は、ＬＳ１２における修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、ＬＳ１２が修飾され、ＬＳ９が非修飾である場合、ＬＳ１２の修飾が２’−ＯＭｅ以外である、実施形態１６１〜２９７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態２９９は、二次構造を安定化させる少なくとも１つのＹＡ修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、二次構造が下部ステムである、実施形態１６１〜２９８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３００は、ＬＳ８および／またはＬＳ１１のうちの少なくとも１つの修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、ＬＳ８および／またはＬＳ１１の修飾が、二次構造を安定化させる、実施形態１６１〜２９９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０１は、
ａ．ＥＮＡ、
ｂ．ＬＮＡ、または
ｃ．二環式リボース修飾から選択される二次構造を安定化させるＹＡ修飾を含む、実施形態１６１〜３００のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０２は、Ｎ６における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３０１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０３は、Ｎ１４における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３０２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０４は、Ｎ１７における修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、Ｎ１７が修飾され、Ｎ６およびＮ１４が非修飾である場合、Ｎ１７の修飾が、２’−フルオロ以外であり、２’−ＯＭｅ以外である、実施形態１６１〜３０３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０５は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３の少なくとも１、２、または３つが、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３が、ＰＳ修飾を含む、実施形態１６１〜３０４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０６は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド１〜３の少なくとも１、２、または３つが、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜３が、ＰＳ修飾を含む、実施形態１６１〜３０５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０７は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、ＰＳ修飾を含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１６１〜３０６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０８は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、ヘアピン２が、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、ヘアピン１およびヘアピン２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドである、実施形態１６１〜３０７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３０９は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、ヘアピン１およびヘアピン２が、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、ヘアピン１およびヘアピン２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチドの全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドである、実施形態１６１〜３０８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１０は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、ヘアピン１の開始からｓｇＲＮＡの３’末端までの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチドの全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドであり、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド１〜３が、デオキシリボヌクレオチドである、実施形態１６１〜３０９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１１は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、上部ステムが、デオキシリボヌクレオチドを含む、実施形態１６１〜３１０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１２は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の上部ステムのヌクレオチド全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドである、実施形態１６１〜３１１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１３は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３の少なくとも１、２、または３つが、ＥＮＡを含み、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３が、ＰＳ修飾を含む、実施形態１６１〜３１２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１４は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜４の少なくとも１、２、または３つが、ＥＮＡを含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜３が、ＰＳ修飾を含む、実施形態１６１〜３１３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１５は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３の少なくとも１、２、または３つが、ＵＮＡを含み、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３が、ＰＳ修飾を含む、実施形態１６１〜３１４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１６は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜４の少なくとも１、２、または３つが、ＵＮＡを含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜３が、ＰＳ修飾を含む、実施形態１６１〜３１５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１７は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、ＰＳ修飾を含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１６１〜３１６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１８は、ｇＲＮＡが、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３１７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３１９は、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡであり、３’末端修飾が、保護３’末端修飾である、実施形態１６１〜３１８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２０は、ｇＲＮＡが、３’テールを含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３１９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２１は、３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む、実施形態３２０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２２は、３’テールが、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜５、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む、実施形態３２０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２３は、ヘアピン領域における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３２２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２４は、３’末端修飾、およびヘアピン領域における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３２３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２５は、ヘアピン領域における修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、実施形態３２３または３２４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２６は、ヘアピン領域における修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態３２３〜３２５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２７は、ヘアピン領域における修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態３２３〜３２６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２８は、３’および／または５’保護末端修飾（複数可）を含む、実施形態１６１〜３２７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３２９は、３’および／または５’末端修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、実施形態３２８に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３０は、３’および／または５’末端修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態３２８または３２９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３１は、３’および／または５’末端修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態３２８または３２９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３２は、３’および／または５’末端修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むかまたはさらに含む、実施形態３２８または３２９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３３は、３’および／または５’末端修飾が、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、実施形態３２８または３２９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３４は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、ｓｇＲＮＡが、３’末端修飾を含む場合、３’末端修飾が、以下：
ｉ．最後の７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾、
ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１６１〜３３３のいずれか１ついずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３５は、３’末端修飾が、１〜７個、１〜５個、１〜４個、または２〜４個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態３３４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３６は、ｇＲＮＡが、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡであり、３’末端修飾が、以下：
ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド
ｖｉ．ＥＮＡ、ＵＮＡ、および／もしくはＤＮＡ、ならびに
ｖｉｉ．またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１６１〜３３５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３７は、ｇＲＮＡが、３’テールを含むｓｇＲＮＡであり、３’テールが、
ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド
ｖｉ．ＥＮＡ、ＵＮＡ、および／もしくはＤＮＡ、ならびに
ｖｉｉ．またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１６１〜３３６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３８は、３’末端修飾が、
ｉ．１、２、３、４、５、６、もしくは７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
ｉｉ．約１〜３、１〜５、１〜６、もしくは１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、または
ｉｉｉ．各ヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、実施形態３３６に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３３９は、３’末端修飾が、少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態３２６〜３２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４０は、３’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、結合が最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間にある、
ｉｉ．最後の３個のヌクレオチド間に２個のＰＳ結合が存在する、
ｉｉｉ．最後の４個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間にＰＳ結合が存在する、
ｉｖ．最後の５個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間にＰＳ結合が存在する、または
ｖ．最後の２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合が存在する、実施形態３２６〜３２９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４１は、３’末端修飾が、
ｉ．最後の１〜７個のヌクレオチドのうちの１個以上の修飾であって、修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせである修飾、
ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後のヌクレオチドの修飾、ならびに隣りのヌクレオチドおよび／もしくは３’テールの１番目のヌクレオチドへの任意選択による１もしくは２個のＰＳ結合、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後および／もしくは最後から２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
ｉｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、および／もしくは最後から３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合
ｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、および／もしくは最後から４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
ｖｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、最後から４番目、および／もしくは最後から５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、実施形態３３６〜３４０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４２は、ｇＲＮＡが、３’テールを含むｓｇＲＮＡであり、３’テールが、３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む、実施形態１６１〜３４１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４３は、３’テールが、完全に修飾されている、実施形態３４２に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４４は、３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチドを含み、任意選択により、これらのヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上が修飾されている、実施形態３４２に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４５は、３’末端修飾が、以下：
ｉ．配列番号４０１〜５３２のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾、
ｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合、
ｉｉｉ．（ｉ）３’末端部の３’末端からの５個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｉｖ．ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
ｖ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．（ｉ）３’末端部の３’末端からの１５個の連続した２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続する２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｖｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける交互する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｖｉｉｉ．（ｉ）２または３個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
ｉｘ．最後のヌクレオチドと最後から隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合、ならびに
ｘ．１５または２０個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態３３６〜３４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４６は、以下：
ｉ．ガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１個以上の修飾、
ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１個以上を含む５’末端修飾を含む、実施形態１６１〜３４５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４７は、５’末端修飾を含み、５’末端修飾が、保護５’末端修飾である、実施形態１６１〜３４６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４８は、５’末端修飾を含み、５’末端修飾が、１〜７、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のヌクレオチドの修飾を含む、実施形態１６１〜３４７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３４９は、５’末端修飾を含み、５’末端修飾が、以下：
ｉ．最初の７個のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７個の修飾、
ｉｉ．最初の７個のヌクレオチドのうちの約１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜６個、または１〜７個の修飾、および
ｉｉｉ．５’末端における１番目、２番目、第３、４番目、５番目、６番目、および／または７番目のヌクレオチドにおける修飾であって、任意選択により、修飾が連続している、修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１６１〜３４８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５０は、５’末端修飾を含み、５’末端修飾が、
ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド
ｖｉ．ＥＮＡ、ＵＮＡ、および／もしくはＤＮＡ、ならびに
ｖｉｉ．それらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１６１〜３４９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５１は、５’末端修飾を含み、５’末端修飾が、
ｉ．１、２、３、４、５、６、および／もしくは７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、または
ｉｉ．約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、もしくは１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含む、実施形態１６１〜３５０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５２は、ｓｇＲＮＡが、５’末端修飾を含み、５’末端修飾が、少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、２’−Ｈ、イノシン、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１６１〜３５１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５３は、５’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、結合が、ガイド領域のヌクレオチド１にある、
ｉｉ．２個のＰＳ結合が存在し、結合が、ガイド領域のヌクレオチド１および２にある、
ｉｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
ｉｖ．ガイド領域の１、２、３、およびヌクレオチド４のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
ｖ．ガイド領域の１、２、３、４、およびヌクレオチド５のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
ｖｉ．ガイド領域の１、２、３、４、５、およびヌクレオチド６のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、または
ｖｉｉ．ガイド領域の１、２、３、４、５、６、およびヌクレオチド７のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、実施形態３５２に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５４は、５’末端修飾が、
ｉ．可変領域のヌクレオチド１〜７のうちの１つ以上の修飾であって、修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、および／またはそれらの組み合わせである修飾、
ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、またはそれらの組み合わせによるガイド領域の１番目のヌクレオチド、および隣りのヌクレオチドへの任意選択によるＰＳ結合、
ｉｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目および／もしくは２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
ｉｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、および／もしくは３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
ｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、および／もしくはヌクレオチド４の修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
ｖｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、４番目、および／もしくは５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、実施形態３５２または３５３に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５５は、５’末端修飾を含み、５’末端修飾が、以下：
ｉ．配列番号１〜５４、４０１〜５３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、３３８８〜３４３０、または３５４９〜３５５２のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾、
ｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、ならびに３と４との間のＰＳ結合、
ｉｖ．ガイド領域の１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｖ．ガイド領域の１、２、３、４、およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合、
ｖｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
ｖｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合、
ｖｉｉｉ．ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
ｉｘ．ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
ｘ．ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態１６１〜３５４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５６は、ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、上部ステム領域が、少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１６１〜３５５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５７は、上部ステム修飾が、以下：
ｉ．上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾、
ｉｉ．上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾、および
ｉｉｉ．上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、
実施形態３４６に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５８が、上部ステム修飾が、
ｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｉｉ．２’−Ｈ修飾ヌクレオチド、
ｉｉｉ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および
ｉｖ．それらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む、
実施形態３５６または３５７に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３５９は、ｇＲＮＡが、ヘアピン１領域における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３５８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６０は、ｓｇＲＮＡが、Ｈ１−１における修飾を含む、実施形態３５９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６１は、ｇＲＮＡが、ヘアピン２領域における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３６０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６２は、ｓｇＲＮＡが、Ｈ２−１における修飾を含む、実施形態３６１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６３は、ｇＲＮＡが、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３６２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６４は、ｇＲＮＡが、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３６３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６５は、ｇＲＮＡが、上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域の各々における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３６４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６６は、ｇＲＮＡが、ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の修飾ヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３６５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６７は、修飾を含む下部ステム領域をさらに含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３６６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６８は、３’末端修飾をさらに含む、実施形態１６１〜３６７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３６９は、３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が修飾されている、実施形態３６８に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７０は、３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、または２’−Ｏ−ｍｏｅにより修飾されている、実施形態３６９に記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７１は、３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの１個以上の間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合をさらに含む、実施形態３６８〜３７０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７２は、修飾を含むバルジ領域をさらに含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３７１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７３は、修飾を含むネクサス領域をさらに含むｓｇＲＮＡである、実施形態１６１〜３７２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７４は、表１の修飾を含む、配列番号４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、または１００７〜１１３２のいずれかを含むｓｇＲＮＡである。
実施形態３７５は、配列番号４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つの核酸と少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含むｓｇＲＮＡであって、表１の参照配列識別子のヌクレオチドに対応するｓｇＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾が、表１の参照配列識別子に示される修飾と同一または同等である、ｓｇＲＮＡである。
実施形態３７６は、修飾が、標的核酸を切断するガイドの能力を著しく変化させることなくｇＲＮＡの分解を低減する、実施形態１６１〜３７５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７７は、ＹＡ修飾を含み、修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−Ｏ−Ｍｅ、ＥＮＡ、ＵＮＡ、またはＰＳを含む、実施形態１６１〜３７６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７８は、ＹＡ修飾を含み、修飾が、ジヌクレオチドモチーフの構造を変化させてＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減する、実施形態１６１〜３７７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３７９は、ＹＡ修飾を含み、修飾が、ＲＮａｓｅによるＹＡ部位の認識もしくは切断を妨げ、および／またはＲＮＡ構造を安定化させる、実施形態１６１〜３７８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８０は、ＹＡ修飾を含み、修飾が、
ａ．２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ｍｏｅ、２’−Ｆアラビノース、および２’−Ｈ（デオキシリボース）から選択されるリボース修飾、
ｂ．ＬＮＡ、ＢＮＡ、およびＥＮＡ等の二環式リボース類似体、
ｃ．非ロックド核酸修飾、
ｄ．イノシン、シュードウリジン、および５’−メチルシトシン等の塩基修飾、ならびに
ｅ．ホスホロチオエート等のヌクレオシド間結合修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、
実施形態１６１〜３７９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８１は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド５における修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８２は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド１２における修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８３は、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド５および／またはヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８４は、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド５および／またはヌクレオチド１２における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８５は、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド５および／またはヌクレオチド１２における２’−Ｈ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８６は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド５および／または１２番目におけるヌクレオチドにホスホロチオエート修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／または８〜１１、１３、１４、１７、および１８番目におけるヌクレオチドに２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８７は、ｇＲＮＡが、
ｉ．ヌクレオチド８〜１０、
ｉｉ．ヌクレオチド８および９、
ｉｉｉ．ヌクレオチド８および１０、または
ｉｖ．ヌクレオチド９および１０における修飾を含む、ガイド領域を含み、
任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８８は、ｇＲＮＡが、
ｉ．ヌクレオチド８〜１０、
ｉｉ．ヌクレオチド８および９、
ｉｉｉ．ヌクレオチド８および１０、
ｉｖ．ヌクレオチド９および１０、または
ｖ．ヌクレオチド８における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、
任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３８９は、ｇＲＮＡが、
ｉ．ヌクレオチド８〜１０、
ｉｉ．ヌクレオチド８および９、
ｉｉｉ．ヌクレオチド８および１０、
ｉｖ．ヌクレオチド９および１０、または
ｖ．ヌクレオチド８における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、
ヌクレオチド８〜１０が、ホスホロチオエート修飾を含まず、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９０は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド８〜１０における２’−Ｆ修飾、ならびに
ｉ．ヌクレオチド８〜１０の１、２、または３におけるホスホロチオエート修飾、
ｉｉ．ヌクレオチド８におけるホスホロチオエート修飾、
ｉｉｉ．ヌクレオチド９におけるホスホロチオエート修飾、
ｉｖ．ヌクレオチド１０におけるホスホロチオエート修飾、
ｖ．ヌクレオチド８および９におけるホスホロチオエート修飾、
ｖｉ．ヌクレオチド８および１０におけるホスホロチオエート修飾、
ｖｉｉ．ヌクレオチド９および１０におけるホスホロチオエート修飾、または
ｖｉｉ．ヌクレオチド８〜１０のホスホロチオエート修飾を含み、
任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３８９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９１は、ｇＲＮＡが、
ｉ．ヌクレオチド５および６における２’−Ｆもしくはホスホロチオエート修飾、
ｉｉ．ヌクレオチド５および６における２’−Ｆ修飾、
ｉｉｉ．ヌクレオチド５および６におけるホスホロチオエート修飾、
ｉｖ．ヌクレオチド５における２’−Ｆ修飾およびヌクレオチド６におけるホスホロチオエート修飾、または
ｖ．ヌクレオチド６における２’−Ｆ修飾およびヌクレオチド５におけるホスホロチオエート修飾を含むガイド領域を含み、
任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、１〜３および７〜ヌクレオチド１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３９０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９２は、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド６〜１１の少なくとも１、２、３、４、５、または６つの２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３９１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９３は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド１〜４および６〜１１のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３９２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９４は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド６〜１１における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、および／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３９３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９５は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド１〜４における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド６〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３９４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９６は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド９における２’−Ｆ修飾を含み、ヌクレオチド９におけるホスホロチオエート修飾を含まないガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、１〜３および６〜ヌクレオチド８ならびに１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８、１０、１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜３９５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９７は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８つの２’−Ｆ修飾を含まないガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１〜３９６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９８は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含まないガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、および／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１〜３９７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態３９９は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド９、１１、１３、および１４の少なくとも１、２、３、または４つの２’−ＯＭｅ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１〜３９８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４００は、ｇＲＮＡが、ヌクレオチド９、１１、１３、および１４における２’−ＯＭｅ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１〜３９９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０１は、ｇＲＮＡが、８およびヌクレオチド１０の一方または両方におけるホスホロチオエート修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、実施形態１〜４００のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０２は、以下のヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個、または全てにおける修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、またはホスホロチオエート修飾である、実施形態１〜４０１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０３は、ｇＲＮＡが、１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８番目のヌクレオチにおける修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、またはホスホロチオエート修飾である、実施形態１〜４０２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０４は、２’−ＯＭｅ修飾が、ヌクレオチド６〜１１および１３末端におけるガイド領域に存在しない、実施形態１〜４０３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０５は、２’−フルオロ修飾が、ヌクレオチド１〜７、１５、１６、および１９末端におけるガイド領域に存在しない、実施形態１〜４０４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０６は、ホスホロチオエート修飾が、ヌクレオチド４、５、１１〜１４、１７、および１８におけるガイド領域に存在しない、実施形態１〜４０５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０７は、ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド２０を含む、実施形態１〜４０６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０８は、ガイド領域が、２０個のヌクレオチドからなる、実施形態１〜４０７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４０９は、ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における修飾を含む、実施形態１〜４０８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１０は、ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１２の修飾を含む、実施形態１〜４０９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１１は、ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１５の修飾を含む、実施形態１〜４１０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１２は、ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１６の修飾を含む、実施形態１〜４１１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１３は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１９の修飾を含む、実施形態１〜４１２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１４は、ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６にＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド５が、非修飾である、実施形態１〜４１３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１５は、ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３にＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１２が、非修飾である、実施形態１〜４１４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１６は、ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６にＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１５が、非修飾である、実施形態１〜４１５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１７は、ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７にＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１６が、非修飾である、実施形態１〜４１６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１８は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０にＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１９が、非修飾である、実施形態１〜４１７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４１９は、ｇＲＮＡが、以下：
ａ．ヌクレオチド１における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
ｂ．ヌクレオチド２における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
ｃ．ヌクレオチド３における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
ｄ．ヌクレオチド４における２’−ＯＭｅ修飾、
ｅ．ヌクレオチド６におけるホスホロチオエート修飾、
ｆ．ヌクレオチド７におけるホスホロチオエート修飾、
ｇ．ヌクレオチド８における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
ｈ．ヌクレオチド９における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
ｉ．ヌクレオチド１０における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
ｊ．ヌクレオチド１１における２’−フルオロ修飾、
ｋ．ヌクレオチド１３における２’−フルオロ修飾、
ｌ．ヌクレオチド１４における２’−フルオロ修飾、
ｍ．ヌクレオチド１７における２’−フルオロ修飾、および
ｎ．ヌクレオチド１８における２’−フルオロ修飾のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または全てを含むガイド領域を含む、実施形態１〜４１８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２０は、ガイド領域が、前の実施形態に記載される修飾の各々を含む、実施形態１〜４１９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２１は、ガイド領域が、以下：
ｉ．ヌクレオチド５および６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾、
ｉｉ．ヌクレオチド１２および１３がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾、
ｉｉｉ．ヌクレオチド１５および１６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾、
ｉｖ．ヌクレオチド１６および１７がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾、および
ｖ．ヌクレオチド１９および２０がＹＡ部位を形成する場合、ホスホロチオエートまたはヌクレオチド１９における２’−フルオロ修飾のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む、実施形態１〜４２０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２２は、ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１〜４２１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２３は、ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾を含む、実施形態１〜４２２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２４は、ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位、およびヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１〜４２３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２５は、ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位、およびヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１〜４２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２６は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位、およびヌクレオチド１９におけるホスホロチオエート修飾を含む、実施形態１〜４２５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２７は、ガイド領域が、ヌクレオチド１９における２’−フルオロ修飾を含む、実施形態１〜４２６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２８は、ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１５を含むか、またはヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、実施形態１〜４２７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４２９は、ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１６を含むか、またはヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、実施形態１〜４２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３０は、ｇＲＮＡが、ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含むｓｇＲＮＡであり、ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠いている、実施形態１〜４２９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３１は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが連続している、実施形態４３０に記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３２は、少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドが、
ｉ．ヘアピン１内にある、
ｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」内にある、
ｉｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチド内にある、
ｉｖ．ヘアピン１の少なくとも一部を含む、
ｖ．ヘアピン２内にある、
ｖｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｖｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン２内にある、
ｖｉｉｉ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｉｘ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｘ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｘｉ．ヘアピン１またはヘアピン２内にあり、任意選択により、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｘｉｉ．連続し、
ｘｉｉｉ．連続し、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、
ｘｉｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン２の一部に及ぶ、
ｘｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」に及ぶ、または
ｘｖｉ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチドに及ぶ、実施形態４３０または４３１に記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３３は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、ｓｇＲＮＡが、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２における修飾を含む、実施形態４３０〜４３２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３４は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
ｉ．５〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｉｉ．６〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｉｉｉ．５個のヌクレオチドからなる、
ｉｖ．６個のヌクレオチドからなる、
ｖ．７個のヌクレオチドからなる、
ｖｉ．８個のヌクレオチドからなる、
ｖｉｉ．９個のヌクレオチドからなる、
ｖｉｉｉ．１０個のヌクレオチドからなる、
ｉｘ．５〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘ．６〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉ．５個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉｉ．６個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉｉｉ．７個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｉｖ．８個の連続するヌクレオチドからなる、
ｘｖ．９個の連続するヌクレオチドからなる、または
ｘｖｉ．１０個の連続するヌクレオチドからなる、実施形態４３０〜４３３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３５は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、ｓｇＲＮＡが、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２における修飾を含む、実施形態４３４に記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３６は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
ｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１を含む、
ｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０を含む、
ｉｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含む、
ｉｖ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１からなる、
ｖ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０からなる、または
ｖｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、実施形態４３０〜４３５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３７は、ｇＲＮＡは、配列番号１−５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１５個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１〜４３６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３８は、ｇＲＮＡは、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１６個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１〜４３７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４３９は、ｇＲＮＡが、ｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１７個の修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含み、ｇＲＮＡは、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のうちのいずれか１つである、実施形態１〜４３８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４０は、ｇＲＮＡは、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１８個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１〜４３９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４１は、ｇＲＮＡは、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１９個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１〜４４０のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４２は、ｇＲＮＡは、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０にける修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１〜４４１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４３は、ｇＲＮＡは、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つの修飾パターンの少なくとも７５％と一致する修飾パターンを含む、実施形態１〜４４２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４４は、ｇＲＮＡは、表１のｇＲＮＡのうちのいずれか１つの修飾パターンを含み、修飾パターンは、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つと同じである、実施形態１〜４４３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４５は、ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列をさらに含む、実施形態４３７〜４４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４６は、ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列をさらに含む、実施形態４３７〜４４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４７は、ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列をさらに含む、実施形態４３７〜４４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４８は、ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列をさらに含む、実施形態４３７〜４４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４４９は、ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列をさらに含む、実施形態４３７〜４４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４５０は、ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも９８％の同一性を有する配列をさらに含む、実施形態４３７〜４４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４５１は、ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と１００％同一性を有する配列をさらに含む、実施形態４３７〜４４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡである。
実施形態４５２は、先行実施形態のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物である。
実施形態４５３は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合した、実施形態１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む組成物である。
実施形態４５４は、ヌクレアーゼまたが、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１〜４５１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡまたは実施形態４５２〜４５３のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４５５は、ヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質である、実施形態４５４に記載の組成物である。
実施形態４５６は、Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態４５５に記載の組成物である。
実施形態４５７は、Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９またはＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である、実施形態４５６に記載の組成物である。
実施形態４５８は、ヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはｄＣａｓである、実施形態４５３〜４５７のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４５９は、ヌクレアーゼが修飾されている、実施形態４５３〜４５８のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４６０は、修飾ヌクレアーゼが、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、実施形態４５９に記載の組成物。
実施形態４６１は、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、実施形態４５２〜４６０のいずれか１つに記載の組成物である。
実施形態４６２は、ｍＲＮＡが、配列番号３４９９〜３５２７または３５２９〜３５４６のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態４６１に記載の組成物である。
実施形態４６３は、実施形態１〜４５１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡまたは実施形態４５２〜４６２のいずれか１つに記載の組成物、および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬製剤である。
実施形態４６４は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、および以下：
ｉ．実施形態１〜４５１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ、
ｉｉ．実施形態４５２〜４６２のいずれか１つに記載の組成物、および
ｉｉｉ．実施形態４６３の医薬製剤のうちのいずれか１つ以上を細胞に送達することを含む、標的ＤＮＡを修飾する方法である。
実施形態４６５は、方法が、遺伝子の挿入または欠失をもたらす、実施形態４６４に記載の方法である。
実施形態４６６は、鋳型を細胞に送達することをさらに含み、鋳型の少なくとも一部が、Ｃａｓタンパク質によって誘導される二本鎖切断部位においてまたはその付近に標的ＤＮＡに組み込まれる、実施形態４６４または実施形態４６５に記載の方法である。
実施形態４６７は、疾患または障害を治療するための医薬の調製に使用するための実施形態１〜４５１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ、実施形態４５２〜４６２の組成物、または実施形態４６３の医薬製剤である。
実施形態４６８は、疾患または障害を治療するための医薬の製造における、実施形態１〜４５１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ、実施形態４５２〜４６２の組成物、または実施形態４６３の医薬製剤の使用である。
示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 ラットにおける示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 ラットにおける示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 インビトロでのｎｅｕｒｏ２Ａ細胞での編集％を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドについて、ＰＨＨ（９Ａ）細胞における濃度による編集％を示す。 示されるガイドについて、ＰＣＨ（９Ｂ）細胞における濃度による編集％を示す。 示されるガイドについて、ＨｅｐＧ２（９Ｃ）細胞における濃度による編集％を示す。 下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス（そのヌクレオチドは、５’から３’方向で、それぞれＮ１〜Ｎ１８と称することができる）、ならびにヘアピン１およびヘアピン２領域を含むヘアピン領域を含む、ｓｇＲＮＡの保存領域の個々のヌクレオチドを示す標識を有する可能な二次構造における例示的なｓｇＲＮＡ（配列番号８０１、メチル化は図示せず）を示す。ヘアピン１とヘアピン２との間のヌクレオチドは、ｎで標識される。ガイド領域は、ｓｇＲＮＡ上に存在し得、この図ではｓｇＲＮＡの保存領域の前に「（Ｎ）ｘ」として示されている。 例示的なｓｇＲＮＡ配列（配列番号８０１、メチル化は図示せず）における１０個の保存領域ＹＡ部位を１〜１０で標識する。数字２５、４５、５０、５６、６４、６７、および８３は、（Ｎ）ｘとして示されるガイド領域を有するｓｇＲＮＡ中のＹＡ部位１、５、６、７、８、９、および１０のピリミジンの位置を示し、例えば、ｘは、任意選択により２０である。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。ＦＬＰは、全長産物からのシグナルを示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。ＦＬＰは、全長産物からのシグナルを示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。ＦＬＰは、全長産物からのシグナルを示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。ＦＬＰは、全長産物からのシグナルを示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。ＦＬＰは、全長産物からのシグナルを示す。 例示的なガイド配列上にマッピングされた図１１Ａ〜Ｅで観察される切断部位の位置および配列番号４０１の可能な二次構造を例示する（全ての修飾が示されていない）。空白の三角形は、ガイド領域におけるＹＡ切断部位を示す。黒塗りの三角形は、保存領域におけるＹＡ切断部位を示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 示されるガイドを０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートし、切断部位を決定した、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 Ｇ０１００３９を０．０１ｍｇ／ｍＬ（Ａ）のヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートした、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 Ｇ０１００３９を８．５ｍｇ／ｍＬ（Ｂ）のヒト肝臓サイトゾル（ＨＬＣ）とともにインキュベートした、ヌクレアーゼ安定性アッセイの結果を示す。 示されるガイドを含むリポプレックスを一次マウス肝細胞（ＰＭＨ）にトランスフェクトした実験の編集％の結果を示す。 示されるガイドを含むリポプレックスをＰＭＨにトランスフェクトした実験の編集％の結果を示す。 示されるガイドを含むリポプレックスを一次カニクイザルマカク肝細胞（ＰＣＨ）にトランスフェクトした実験の編集％の結果を示す。 示されるガイドを含むリポプレックスを一次ヒト肝細胞（ＰＨＨ）にトランスフェクトした実験の編集％の結果を示す。 ｓｇＲＮＡをインビボでマウスに投与したか、またはｓｇＲＮＡのリポプレックストランスフェクションによってＰＭＨに送達した実験の編集の％結果での散乱プロットおよび相関値を示す。 インビトロの結果をＬＮＰ中のｓｇＲＮＡをＰＨＨに送達することによって得た、インビトロおよびインビボの編集％の結果の相関を示す。 インビトロの結果をＬＮＰ中のｓｇＲＮＡをＰＨＨに送達することによって得た、インビトロおよびインビボの編集％の結果の相関を示す。 インビトロの結果をＬＮＰ中のｓｇＲＮＡをＰＨＨに送達することによって得た、インビトロおよびインビボの編集％の結果の相関を示す。 インビトロの結果をＬＮＰ中のｓｇＲＮＡをＰＨＨに送達することによって得た、インビトロおよびインビボの編集％の結果の相関を示す。 インビトロの結果をＬＮＰ中のｓｇＲＮＡをＰＨＨに送達することによって得た、インビトロおよびインビボの編集％の結果の相関を示す。 リポプレックストランスフェクションによってＰＭＨに（左ボックスのデータ）、ＬＮＰ中のＰＭＨに（中央ボックスのデータ）、またはインビボでマウスに（右ボックスのデータ）送達された、示されるガイドを用いた編集％の比較を示す。 ＬＮＰ中でＰＭＨに（１ｎｇ、３ｎｇ、１０ｎｇ）またはインビボでマウスに（０．１ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ）送達された、示されるガイドを用いた編集％の比較を示す。 Ｇ０００２８２とＧ０００２１１との間の編集の差を示すように再プロットされた図１６Ｇの結果を示す。棒状プロット値は、Ｇ０００２８２値の編集％をＧ０００２１１値の編集％で除して、編集の倍数差を示すことによって作成した。示されたガイドを、リポプレックストランスフェクションによってＰＭＨに（左ボックスのデータ）、ＬＮＰ中でＰＭＨに（中央ボックスのデータ）、またはインビボでマウスに（右ボックスのデータ）送達した。 Ｇ０００２８３とＧ０００２６９との間の編集の差を示すように再プロットされた図１６Ｈからの結果を示す。棒状プロット値は、Ｇ０００２８３値の編集％をＧ０００２６９値の編集％で除して、編集の倍数差を示すことによって作成した。示されたガイドを、ＬＮＰ中でＰＭＨに（左のボックス上のデータ）またはインビボでマウスに（右のボックス上のデータ）送達した。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示される濃度でのガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示される濃度でのガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示される濃度での示されたガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示される濃度での示されたガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示される濃度での示されたガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示される濃度での示されたガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドの編集頻度を示す。 示されるガイドの編集頻度を示す。 示されるガイドのインビボ編集％の結果を示す。 示されるガイドの血清ＴＴＲの結果を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるガイドのインデル頻度対ガイド濃度を示す。 示されるジヌクレオチド修飾を有するガイドの編集頻度を示す（所与の５’修飾位置について、直後の位置も同様に修飾した）。 示されるジヌクレオチド修飾を有するガイドの編集頻度を示す（所与の５’修飾位置について、直後の位置も同様に修飾した）。 個々のヌクレオチドにおいて示される修飾を有するガイドの編集頻度を示す。 個々のヌクレオチドにおいて示される修飾を有するガイドの編集頻度を示す。 個々のヌクレオチドにおいて示される修飾を有するガイドの編集頻度を示す。 示されるジヌクレオチド修飾を有するガイドの編集頻度を示す（所与の５’修飾位置について、直後の位置も同様に修飾した）。 ガイド位置１〜２０における示される修飾の影響スコアを示す。 ガイド位置１〜２０における示される修飾の影響スコアを示す。 ガイド位置１〜２０における示される修飾の影響スコアを示す。 示されるガイドの編集頻度を示す。ガイドは、同様の保存領域修飾パターンを有することに基づいてボックスにグループ化される。 示されるガイドの編集頻度を示す。ガイドは、同様の保存領域修飾パターンを有することに基づいてボックスにグループ化される。 示されるガイドの編集頻度を示す。ガイドは、同様の保存領域修飾パターンを有することに基づいてボックスにグループ化される。
遺伝子編集方法で使用するための修飾ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が本明細書に提供される。操作および試験したｇＲＮＡの配列を表１に示す。
本明細書で提供されるｇＲＮＡのうちの特定のものは、遺伝子編集方法で使用するための修飾されたデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。操作および試験したｄｇＲＮＡの配列を表１に示す。ｄｇＲＮＡのうちの特定のものは、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒＲＮＡ中の修飾を含む、ｄｇＲＮＡ中のＹＡ部位における特定の修飾を有する。
本明細書で提供されるｇＲＮＡのうちの特定のものは、遺伝子編集方法で使用するための修飾シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。操作および試験したｓｇＲＮＡの配列を表１に示す。ｓｇＲＮＡのうちの特定のものは、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分および／またはｓｇＲＮＡのｔｒＲＮＡ部分における修飾を含む、ｓｇＲＮＡ中のＹＡ部位における特定の修飾を有する。
遺伝子編集方法での使用のための、任意選択により修飾された短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）がまた、本明細書で提供される。操作および試験した短いｓｇＲＮＡの配列を表１に示す。短いｓｇＲＮＡのうちの特定のものは、短いｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分および／または短いｓｇＲＮＡのｔｒＲＮＡ部分における修飾を含む、短いｓｇＲＮＡ中のＹＡ部位における特定の修飾を有する。
本開示は、インビトロで（例えば、エクスビボ療法または遺伝子編集細胞の他の使用で使用するためにインビトロで培養された細胞）またはヒト等の対象における細胞（例えば、インビボ療法で使用するため）において標的核酸のゲノムを変化させるための、これらのｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の使用をさらに提供する。本開示はまた、疾患に関連する標的遺伝子を修飾することによって、対象における疾患を予防または治療するための方法を提供する。開示されるｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集技術に適した任意の細胞種および任意の遺伝子座で使用することができる。

表１（配列表）：
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表１において、（Ｎ）ｘは、ｘ個の連続するヌクレオチドを表し、ｘは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５である。
ヌクレオチド修飾は、以下のように表１に示される：ｍ：２’−ＯＭｅ；＊：ＰＳ結合；ｆ：２’−フルオロ；（ｉｎｖｄ）：反転した脱塩基；ｍｏｅ：２’−ｍｏｅ；ｅ：ＥＮＡ；ｄ：デオキシリボヌクレオチド（Ｔは、常に、デオキシリボヌクレオチドであることにも留意されたい）；ｘ：ＵＮＡ。したがって、例えば、ｍＡは、２’−Ｏ−メチルアデノシンを表し、ｘＡは、アデニン核酸塩基を有するＵＮＡヌクレオチドを表し、ｅＡは、アデニン核酸塩基を有するＥＮＡヌクレオチドを表し、ｄＡは、アデノシンデオキシリボヌクレオチドを表す。
ｓｇＲＮＡの指定は、Ｇの直後に１つ以上の先行するゼロを用いて提供される場合がある。これは、指定の意味に影響を与えない。したがって、例えば、Ｇ０００２８２、Ｇ０２８２、Ｇ００２８２、およびＧ２８２は、同じｓｇＲＮＡを指す。同様に、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒＲＮＡの指定は、それぞれ、ＣＲまたはＴＲの直後に１つ以上の先行するゼロを用いて提供される場合があり、これは、指定の意味に影響を与えない。したがって、例えば、ＣＲ０００１００、ＣＲ００１００、ＣＲ０１００、およびＣＲ１００は、同じｃｒＲＮＡを指し、ＴＲ０００２００、ＴＲ００２００、ＴＲ０２００、およびＴＲ２００は、同じｔｒＲＮＡを指す。
配列番号４０１〜５３５、１００１、および１００７〜１０３２に関して、位置は、以下のｓｇＲＮＡ領域に対応する：１〜２０、ガイド領域；２１〜２６および４５〜５０、下部ステム；２７〜２８および４１〜４４、バルジ；２９〜４０、上部ステム（そのうち３３〜３６は、テトラループ（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ）である）；５１〜６８、ネクサス；６９〜８０、ヘアピン１；８２〜９６、ヘアピン２（８１位は、ヘアピン１とヘアピン２との間のヌクレオチドである）；９７〜１００、３’末端部領域。
配列番号６０１および６０７〜７３２に関して、ガイド領域は示されず、残りの領域に対応する位置は、それぞれ、配列番号４０１〜５３２に関して与えられる位置と比較して２０個減少する。配列番号８０１および８０７〜９３２に関して、スペーサーは、ｘの長さであり、残りの領域に対応する位置は、それぞれ、配列番号４０１〜５３２に関して与えられるものと比較して２０個減少し、ｘ個増加する。
定義
本明細書で使用される「編集効率」または「編集パーセンテージ」または「編集パーセント」は、Ｃａｓ ＲＮＰによる切断後における配列読み取りの総数に対する、目的の標的領域へのヌクレオチドの挿入または欠失を有する配列読み取りの総数である。
本明細書で使用される「領域」は、核酸の保存された基を説明する。領域は、「モジュール」または「ドメイン」とも称され得る。ｓｇＲＮＡの領域は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ＡＥ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３−３３９（２０１４）に記載されるように、ＲＮＰのエンドヌクレアーゼ活性を誘導する等の特定の機能を行い得る。ＳｇＲＮＡの例示的な領域を表３に記載する。
本明細書で使用する「ヘアピン」は、核酸鎖が折り畳まれ、同じ鎖の別の切片と塩基対を形成するときに生成される核酸の二本鎖を説明する。ヘアピンは、ループまたはＵ字型を含む構造を形成し得る。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、ＲＮＡループから構成され得る。ヘアピンは、分子の折り畳みまたは縮み（ｗｒｉｎｋｌｉｎｇ）を伴った単一核酸分子結合中の２つの相補的な配列によって形成することができる。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、ステムまたはステムループ構造を含む。本明細書で使用する場合、「ヘアピン領域」とは、ヘアピン１およびヘアピン２、ならびにｓｇＲＮＡの保存部分のヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」を指す。
本明細書で使用される「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、例えばＣａｓタンパク質等のヌクレアーゼを伴って、ｓｇＲＮＡを説明する。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）を含む。
本明細書で使用する「ステムループ」は、対形成していない核酸のループで終了する、塩基対形成された（ｂａｓｅ−ｐａｉｒｅｄ）「ステム」を形成するヌクレオチドの二次構造を説明する。同じ核酸鎖の２つの領域が、反対方向に読み取られるときに配列中で少なくとも部分的に相補的である場合、ステムが形成され得る。本明細書で使用する「ループ」は、ステムをキャッピングし得る塩基対を含まない（すなわち、相補的ではない）ヌクレオチドの領域を説明する。「テトラループ」は、４個のヌクレオチドのループを説明する。本明細書で使用する場合、ｓｇＲＮＡの上部ステムは、テトラループを含み得る。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、および「ガイド」は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても既知である）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても既知である）のいずれかを指すために、本明細書で互換的に使用される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））として会合し得るか、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ））において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾もしくは変異を有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるような修飾ＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）は、例えば、ｓｇＲＮＡに関する（しかし、本明細書において、全てのガイドＲＮＡに適用可能である）Ｂｒｉｎｅｒ ＡＥ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３−３３９（２０１４）におけるように、「スペーサー」または「スペーサー領域」と称される場合がある「ガイド領域」を含む。ガイド領域またはスペーサー領域はまた、「可変領域」、「ガイドドメイン」、または「標的化ドメイン」とも称される場合がある。いくつかの実施形態では、「ガイド領域」は、その５’末端で「ｓｇＲＮＡの保存部分」の直前に存在し、いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、短いｓｇＲＮＡである。例示的な「ｓｇＲＮＡの保存部分」を表２が示されている。いくつかの実施形態では、「ガイド領域」は、ｃｒＲＮＡの５’末端における一連のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、１つ以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」）を含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、５’末端からガイド領域の末端に対する所与のヌクレオチドの位置に位置する１つ以上のＹＡ部位を含む。そのような位置の範囲は、例えば、「５’末端部の５’末端からの５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端」と称され、「５末端」における「末端」等は、ガイド領域中のほとんどの３’ヌクレオチドを指す。（同様に、「ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端」等の表現は、ｇＲＮＡの５’末端部の５’末端から２１番目のヌクレオチドからｇＲＮＡの３’末端における最後のヌクレオチドまでの範囲を指す。）さらに、例えば、特定のｓｇＲＮＡセグメントの５’末端から６個のヌクレオチドであるヌクレオチドは、そのセグメントの６番目のヌクレオチド、または５’末端からの「ヌクレオチド６」、例えば、ＸＸＸＸＸＮであり、Ｎは、５’末端から６番目のヌクレオチドである。５’末端から６個のヌクレオチドの「前または後」に位置するヌクレオチドの範囲は、６番目のヌクレオチドで始まり、３’末端に向かって鎖を下り続ける。同様に、例えば、鎖の３’末端から５個のヌクレオチドであるヌクレオチドは、鎖の３’末端から数えたときに５番目のヌクレオチド、例えば、ＮＸＸＸＸである。ガイド領域中の数による位置または範囲は、別の基準点が指定されていない限り、５’末端から決定される位置を指し、例えば、ガイド領域中の「ヌクレオチド５」は、５’末端からの５番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書に記載のｇＲＮＡの対応するまたは指定されたヌクレオチドにおける「修飾パターンと一致する」ヌクレオチドを含む。このことは、修飾パターンと一致するヌクレオチドが、それらの位置における核酸塩基が一致するかどうかにかかわらず、本明細書に記載のｇＲＮＡの対応する位置におけるヌクレオチドと同じ修飾（例えば、ホスホロチオエート、２’−フルオロ、２’−ＯＭｅ等）を有することを意味する。例えば、第１のｇＲＮＡにおいて、ヌクレオチド５および６がそれぞれ２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾を有する場合、このｇＲＮＡは、５位および６位の核酸塩基が第１および第２のｇＲＮＡにおいて同一であるかまたは異なるかにかかわらず、それぞれヌクレオチド５および６における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾をまた有する第２のｇＲＮＡと同じ修飾パターンをヌクレオチド５および６において有する。しかしながら、ヌクレオチド６におけるが、ヌクレオチド７ではない２’−ＯＭｅ修飾は、ヌクレオチド７におけるが、ヌクレオチド６ではない２’−ＯＭｅ修飾のように、ヌクレオチド６および７における同じ修飾パターンではない。同様に、本明細書に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンの少なくとも７５％と一致する修飾パターンは、ヌクレオチドの少なくとも７５％が本明細書に記載のｇＲＮＡの対応する位置と同じ修飾を有することを意味する。対応する位置は、ペアワイズまたは構造アライメントによって決定され得る。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」（「ｓｐＣａｓ９」とも称される））の「保存領域」が表２に示されている。１行目は、ヌクレオチドの番号付けを示し、２行目は、配列（例えば、配列番号４００）を示し、３行目は、領域を示す。
本明細書で使用する場合、「短いシングルガイドＲＮＡ」（「短いｓｇＲＮＡ」）は、ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含むｓｇＲＮＡであり、ヘアピン領域は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドまたは６〜１０個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、表２に示されるように、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」）ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）を欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、例えばペアワイズまたは構造アラインメントによって決定されるｓｐｙＣａｓ９の保存部分のヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）に対応するヌクレオチドを欠いている、非ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４〜６１（ＡＡＡＡＡＧＵＧ）を欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５３〜６０（ＧＡＡＡＡＡＧＵ）を欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分のヌクレオチド５３〜６０（ＧＡＡＡＡＡＧＵ）もしくはヌクレオチド５４〜６１（ＡＡＡＡＡＧＵＧ）のうちの４、５、６、７、または８個のヌクレオチド、または例えばペアワイズまたは構造アラインメントによって決定される非ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分の対応するヌクレオチドを欠いている。
本明細書で使用する「ＹＡ部位」は、５’−ピリミジン−アデニン−３’ジヌクレオチドを指す。明確化のために、塩基を修飾することによって修飾される元の配列中の「ＹＡ部位」は、文字通りのＹＡジヌクレオチドの非存在にかかわらず、依然として、得られる配列中の（修飾された）ＹＡ部位とみなされる。「保存領域ＹＡ部位」は、ｓｇＲＮＡの保存領域に存在する。「ガイド領域ＹＡ部位」は、ｓｇＲＮＡのガイド領域に存在する。ｓｇＲＮＡにおける非修飾ＹＡ部位は、ＲＮａｓｅ−Ａ様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅ Ａによる切断を受けやすいものであり得る。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、その保存領域中に約１０のＹＡ部位を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、その保存領域中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位を含む。例示的な保存領域ＹＡ部位を図１０Ｂに示す。ガイド領域は、任意の数のＹＡ部位を含む任意の配列であり得るため、例示的なガイド領域ＹＡ部位は図１０Ｂに示されていない。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、図１０Ｂに示されるＹＡ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、以下の位置またはそのサブセットにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位を含む：ＬＳ５−ＬＳ６、ＵＳ３−ＵＳ４、ＵＳ９−ＵＳ１０、ＵＳ１２−Ｂ３、ＬＳ７−ＬＳ８、ＬＳ１２−Ｎ１、Ｎ６−Ｎ７、Ｎ１４−Ｎ１５、Ｎ１７−Ｎ１８、およびＨ２−２〜Ｈ２−３。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位は修飾を含み、これは、ＹＡ部位のうちの少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されていることを意味する。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン（ピリミジン位置とも称される）は、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニン（アデニン位置とも称される）は、修飾（アデニンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン位置およびアデニン位置は、修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡガイド領域または短いｓｇＲＮＡ保存領域は、１つ以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」または「保存領域ＹＡ部位」）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｃｒＲＮＡまたはｔｒＲＮＡは、１つ以上のＹＡ部位を含む。
本明細書で考察するように、ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡに関して記載されるヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置は、ペアワイズまたは構造アラインメントにより、配列および／または構造類似性を有する別のｇＲＮＡにおいて同定され得る。構造アライメントは、大きな配列変動にもかかわらず、分子が類似の構造を共有する場合に有用である。例えば、ｓｐｙＣａｓ９およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（「ＳａＣａｓ９」）は、異なる配列を有するが、有意な構造アラインメントを有する。例えば、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６２（５）：１１１３−１１２６（２０１５）の図２（Ｆ）を参照のこと。構造アライメントは、ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分のヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）等の特定の位置に対応する、ｓａＣａｓ９または他のｓｇＲＮＡ内のヌクレオチドを同定するために使用することができる。
構造アライメントは、（ｉ）第２の配列の既知の構造を使用して第１の配列の構造をモデル化すること、または（ｉｉ）両方が既知である第１および第２の配列の構造を比較することによって、２つ（またはそれ以上）の配列にわたる対応する残基を同定すること、ならびに第２の配列中の目的の残基と最も類似した位置にある第１の配列中の残基を同定することを伴う。対応する残基は、重ねた構造における所与の位置（例えば、ポリヌクレオチドでは核酸塩基１位もしくはペントース環の１’炭素、またはポリペプチドではα炭素）の距離の最小化（例えば、どの組の対位置が、アライメントのための最小平均二乗偏差を提供するか）に基づいて、いくつかのアルゴリズムにおいて同定される。ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡに関して記載される位置に対応する非ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡ中の位置を同定する場合、ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡは、「第２の」配列であり得る。目的の非ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡが利用可能な既知の構造を有さないが、既知の構造を有する別の非ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡとより密接に関連する場合、密接に関連する非ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡの既知の構造を使用して目的の非ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡをモデル化し、次いで、そのモデルをｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡ構造と比較して、目的の非ｓｐｙＣａｓ９ ｇＲＮＡにおける所望の対応する残基を同定することが最も有効であり得る。タンパク質の構造モデリングおよびアラインメントに関する広範な文献が存在し、代表的な開示には、ＵＳ６８５９７３６、ＵＳ８７３８３４３、ならびにＡｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（２０１６）９−１３において引用されるものが含まれる。既知の関連構造に基づく構造のモデリングの考察については、例えばＢｏｒｄｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ４（２００９）１−１３、およびその中で引用される参照文献を参照のこと。核酸のアラインメントについて、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６２（５）：１１１３−１１２６（２０１５）の図２（Ｆ）も参照のこと。
本明細書で使用する場合、「標的配列」は、ガイド領域が切断のためにヌクレアーゼを誘導する核酸の配列を指す。いくつかの実施形態では、ｓｐｙＣａｓ９タンパク質は、ガイド領域に存在するヌクレオチドにより、標的配列に、ガイド領域によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、スペーサー領域を含まない。
本明細書で使用する場合、「５’末端」は、ｇＲＮＡの１番目のヌクレオチド（ｄｇＲＮＡ（典型的には、ｄｇＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端）、ｓｇＲＮＡ、または短いｓｇＲＮＡを含む）を指し、５’位置は、別のヌクレオチドに結合されていない。
本明細書で使用する場合、「５’末端修飾」とは、その５’末端における約７個のヌクレオチドのうちの１個以上における修飾を有するガイド領域を含むｇＲＮＡであって、任意選択により、ｇＲＮＡの（５’末端から）１番目のヌクレオチドが修飾されている、ｇＲＮＡを指す。
本明細書で使用する場合、「３’末端」は、３’位置が別のヌクレオチドに結合されていない、ｇＲＮＡの末端または末端部ヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、３’末端は、３’テールにある。いくつかの実施形態では、３’末端は、ｇＲＮＡの保存部分にある。
本明細書で使用する場合、「３’末端修飾」とは、３’末端における約７個のヌクレオチドのうちの１個以上における修飾を有するｇＲＮＡであって、任意選択により、ｇＲＮＡの最後のヌクレオチド（すなわち、最も３’側のヌクレオチド）が修飾されている、ｇＲＮＡを指す。３’テールが存在する場合、１〜約７個のヌクレオチドが３’テール内にあり得る。３’テールが存在しない場合、１〜約７個のヌクレオチドがｓｇＲＮＡの保存部分内にあり得る。
「最後」、「最後から２番目」、「最後から３番目」等は、所与の配列においてそれぞれ、最も３’側、最も３’側から２番目、最も３’側から３番目等のヌクレオチドを指す。例えば、配列５’−ＡＡＡＣＴＧ−３’では、最後、最後から２番目、および最後から３番目のヌクレオチドは、それぞれ、Ｇ、Ｔ、およびＣである。「最後の３個のヌクレオチド」という語句は、最後、最後から２番目、および最後から３番目のヌクレオチドを指し、より一般的には、「最後のＮ個のヌクレオチド」は、最後〜最後からＮ番目まで（これを含む）のヌクレオチドを指す。「３’末端部の３’末端から３番目のヌクレオチド」は、「最後の３番目のヌクレオチド」に等しい。同様に、「５’末端部の５’末端から３番目のヌクレオチド」は、「５’末端における３番目のヌクレオチド」に等しい。
本明細書で使用する場合、「保護末端修飾」（保護５’末端修飾または保護３’末端修飾等）は、ｓｇＲＮＡの分解、例えば、エキソヌクレアーゼ分解を低減するｓｇＲＮＡの末端の７個のヌクレオチド内の１個以上のヌクレオチドの修飾を指す。いくつかの実施形態では、保護末端修飾は、ｓｇＲＮＡの末端の７個のヌクレオチド内の少なくとも２つまたは少なくとも３つのヌクレオチドの修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ホスホロチオエート結合、２’修飾、例えば、２’−ＯＭｅもしくは２’−フルオロ、２’−Ｈ（ＤＮＡ）、ＥＮＡ、ＵＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ホスホロチオエート結合および２’−ＯＭｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３個の末端部ヌクレオチドが、例えば、ホスホロチオエート結合またはホスホロチオエート結合と２’−ＯＭＥ修飾との組み合わせにより修飾されている。当業者に既知であるエキソヌクレアーゼ分解を低減する修飾が包含される。
いくつかの実施形態では、１〜約２０個のヌクレオチドを含む「３’テール」は、その３’末端におけるｓｇＲＮＡの保存部分に続く。
本明細書で使用される「ＲＮＡ誘導（ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ）ＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓ切断／ニッカーゼおよびその不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が含まれる。本明細書で使用される「Ｃａｓタンパク質」とも称される「Ｃａｓヌクレアーゼ」には、Ｃａｓ切断剤、Ｃａｓニッカーゼ、およびｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が包含される。Ｃａｓ ｃｌｅａｖａｓｅｓ／ｎｉｃｋａｓｅｓ ａｎｄ ｄＣａｓ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ａ Ｃｓｍ ｏｒ Ｃｍｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ Ｃａｓ１０，Ｃｓｍ１，ｏｒ Ｃｍｒ２ ｓｕｂｕｎｉｔ ｔｈｅｒｅｏｆ，ａ Ｃａｓｃａｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ Ｉ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅ Ｃａｓ３ ｓｕｂｕｎｉｔ ｔｈｅｒｅｏｆ，ａｎｄ Ｃｌａｓｓ ２ Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．本明細書で使用する場合、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼ等の、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断またはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２Ｃａｓ切断およびクラス２Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、ならびに切断／ニッカーゼ活性が不活性化されるクラス２ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が含まれる。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、およびｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質，Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１−１３（２０１５）は、Ｃａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１およびＳ３を参照のこと。「Ｃａｓ９」は、Ｓｐｙ Ｃａｓ９、本明細書に列挙されるＣａｓ９のバリアント、およびそれらの等価物を包含する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２−３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５−３９７（２０１５）を参照のこと。
本明細書で使用する場合、第２の配列に対する第１の配列のアライメントにより、第２の配列の位置の全体でのＸ％以上が第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列と「少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧと１００％同一性を有する配列を含むが、その理由は、アラインメントは、第２の配列の３つの全ての位置において一致があるという点で１００％同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、および修飾ウリジン等のヌクレオシド類似体の存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジン等）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン；別の例は、シトシンおよび５−メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Ｘがいずれかの修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、または５−メトキシウリジンである配列５’−ＡＸＧは、両方とも同じ配列（５’−ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアライメントアルゴリズムは、当該技術分野において周知である、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎおよびＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アライメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズムおよびパラメータ設定の選択が適切であることを理解するであろう。一般的に類似する長さおよび予想される同一性がアミノ酸については５０％超の配列、またはヌクレオチドについては７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。
「ｍＲＮＡ」は、ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡであり、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソームおよびアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能することができる）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体、例えば２’−メトキシリボース残基を含む、リン酸糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸リン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’−メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。一般に、ｍＲＮＡは、実質的な量のチミジン残基（例えば、０個の残基または３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２個未満のチミジン残基；または１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、もしくは０．１％未満のチミジン含有量）を含まない。ｍＲＮＡは、そのウリジン位置のいくつかまたは全てに修飾ウリジンを含むことができる。
本明細書で使用する場合、所与のＯＲＦの「最小ウリジン含有量」は、（ａ）全ての位置で最小ウリジンコドンを使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦのウリジン含有量である。所与のアミノ酸についての最小ウリジンコドン（複数可）は、最も少ないウリジンを有するコドン（複数可）である（フェニルアラニンについてのコドンを除いて、通常、０または１であり、最小ウリジンコドンは２個のウリジンを有する）。修飾ウリジン残基は、最小ウリジン含有量を評価する目的でウリジンと同等とみなされる。
本明細書で使用する場合、所与のＯＲＦの「最小ウリジンジヌクレオチド含有量」は、（ａ）全ての位置において（上述の通り）最小ウリジンコドンを使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦの可能な最小ウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含有量である。ウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含有量は、ＯＲＦ中のＵＵジヌクレオチドの列挙として、またはウリジンジヌクレオチドのウリジンによって占有される位置の割合として速度ベースで、絶対用語で表すことができる（例えば、ＡＵＵＡＵは、５つの位置のうちの２つがウリジンジヌクレオチドのウリジンによって占有されるため、４０％のウリジンジヌクレオチド含有量を有する）。修飾ウリジン残基は、最小ウリジンジヌクレオチド含有量を評価する目的でウリジンと同等であるとみなされる。
本明細書で使用する場合、所与のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の「最小アデニン含有量」は、（ａ）全ての位置で最小アデニンコドンを使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦのアデニン含有量である。所与のアミノ酸の最小アデニンコドン（複数可）は、最も少ないアデニンを有するコドン（複数可）である（リジンおよびアスパラギンについてのコドンを除いて、通常０または１であり、最小アデニンコドンは２個のアデニンを有する）。修飾アデニン残基は、最小アデニン含有量を評価する目的でアデニンと同等であるとみなされる。
本明細書で使用する場合、所与のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の「最小アデニンジヌクレオチド含有量」は、（ａ）全ての位置で最小のアデニンコドン（上述の通り）を使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする、ＯＲＦの可能な最小アデニンジヌクレオチド（ＡＡ）含有量である。アデニンジヌクレオチド（ＡＡ）含有量は、またはＯＲＦ中のＡＡジヌクレオチドの列挙として、またはアデニンジヌクレオチドのアデニンによって占有される位置の割合としての速度ベースで、絶対用語で表すことができる（例えば、ＵＡＡＵＡは、５つの位置のうち２つがアデニンジヌクレオチドのアデニンによって占有されるため、４０％のアデニンジヌクレオチド含有量を有する）。修飾アデニン残基は、最小アデニンジヌクレオチド含有量を評価する目的でアデニンと同等であるとみなされる。
本明細書で使用する場合、「対象」は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「対象」は、ヒトを指す。いくつかの実施形態では、「対象」は、非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、「対象」は、霊長類を指す。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または蠕虫を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、非ヒト対象は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、対象は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであってもよい。本発明のある特定の実施形態では、対象は、成人、青年期、または乳児である。いくつかの実施形態では、用語「個体」または「患者」が使用され、「対象」と交換可能であることが意図される。
本明細書に記載される修飾の種類
様々な位置における修飾を含むガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、およびｃｒＲＮＡ）が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、修飾を含むｇＲＮＡの位置は、以下の種類の修飾のうちのいずれか１つ以上により修飾されている。
２’−Ｏ−メチル修飾
修飾糖は、相補鎖に対するオリゴヌクレオチド結合親和性、二本鎖形成、およびヌクレアーゼとの相互作用に影響を及ぼす物理的特性である、ヌクレオチド糖環のパッカリング（ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を制御すると考えられている。したがって、糖環上の置換は、これらの糖の立体構造およびパッカリングを変化させ得る。例えば、２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）修飾は、オリゴヌクレオチドの結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増加させることができるが、実施例に示されるように、オリゴヌクレオチド中の所与の位置における任意の修飾の効果を経験的に決定する必要がある。
用語「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」は、２’−ＯＭｅにより修飾されたヌクレオチドを表すために使用され得る。
リボヌクレオチドおよび修飾２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、以下のように記述され得る。
Figure 2021526804
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾
いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）であり得る。修飾２’−Ｏ−ｍｏｅリボヌクレオチドは、以下のように記述され得る。
Figure 2021526804
用語「ｍｏｅＡ」、「ｍｏｅＣ」、「ｍｏｅＵ」、または「ｍｏｅＧ」という用語は、２’−Ｏ−ｍｏｅにより修飾したヌクレオチドを表すために使用され得る。
２’−フルオロ修飾
ヌクレオチド糖環に影響を及ぼすことが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。
本出願において、用語「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」は、２’−Ｆで置換されたヌクレオチドを表すために使用され得る。
２’−Ｆ置換を有さないリボヌクレオチド、および２’−Ｆ置換有するリボヌクレオチドは、以下のように記述され得る。
Figure 2021526804
ホスホチオエート修飾
ホスホロチオエート（ＰＳ）結合（ｌｉｎｋａｇｅ）または結合（ｂｏｎｄ）とは、硫黄が、例えばヌクレオチド間のホスホジエステル結合中の１つの非架橋リン酸酸素に置き変えられる結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ−オリゴとも称され得る。
ＰＳ修飾を示すために、「＊」を使用し得る。本出願では、用語Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊を使用して、ＰＳ結合で隣りの（例えば３’）ヌクレオチドに結合されているヌクレオチドを示すことができる。本出願全体を通して、ＰＳ修飾は、３’炭素がホスホロチオエートに結合しているヌクレオチドでグループ化され、したがって、ＰＳ修飾が１位にあることは、ホスホロチオエートが、ヌクレオチド１の３’炭素および２番目のヌクレオチドの５’炭素に結合していることを意味することを示している。したがって、ＹＡ部位が「ＰＳ修飾されている」等と示される場合、ＰＳ結合は、ＹとＡとの間またはＡと隣りのヌクレオチドとの間にある。
本出願では、用語「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」は、２’−ＯＭｅで置換され、かつ、「ＰＳ結合（ｂｏｎｄ）」と称される場合もあり得るＰＳ結合（ｌｉｎｋａｇｅ）で隣りの（例えば３’）ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドを示すために使用し得る。本出願では、用語「ｆＡ＊」、「ｆＣ＊」、「ｆＵ＊」、または「ｆＧ＊」、２’−Ｆで置換され、かつ、ＰＳ結合で隣りの（例えば３’）ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドを示すために使用し得る。ＰＳ結合（ｌｉｎｋａｇｅ）または結合（ｂｏｎｄ）の等価物は、本明細書に記載される実施形態によって包含される。
下の図は、非架橋リン酸酸素対するＳ−の置換を示し、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生じる：
Figure 2021526804
反転した脱塩基修飾
脱塩基ヌクレオチドは、窒素塩基を欠いているものを指す。以下の図は、塩基を欠いている部位を脱塩基（この場合、脱プリンとして示される。脱塩基部位はまた、脱ピリミジン部位であり得、脱塩基部位の記載は、典型的には、ワトソン−クリック塩基対を参照し、脱プリン部位は、窒素塩基を欠いている部位を指し、典型的には、ピリミジン部位と塩基対を形成するであろう）部位を有するオリゴヌクレオチドを記述し、塩基は、フラン環の１’位において別の部位（例えば、リボースもしくは脱オキシリボース部位を形成し得るために以下に示されるヒドロキシル基、または水素）により置換され得る。
Figure 2021526804
反転した塩基は、通常の５’から３’への結合とは反転した結合を有するものを指す（すなわち、５’から５’への結合または３’から３’への結合のいずれか）。例えば、
Figure 2021526804
脱塩基ヌクレオチドは、反転した結合と結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’結合を介して末端５’ヌクレオチドに結合してもよいし、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’結合を介して末端３’ヌクレオチドに結合してもよい。末端５’または３’ヌクレオチドのいずれかにおける反転した脱塩基ヌクレオチドはまた、反転した脱塩基末端キャップと称され得る。本出願において、用語「ｉｎｖｄ」は、反転した脱塩基ヌクレオチド結合を示す。
デオキシリボヌクレオチド
デオキシリボヌクレオチド（糖が２’−デオキシ位を含む）は、ヌクレオチドが２’位のヒドロキシルに対するプロトンの置換によって標準ＲＮＡに対して修飾されているという点で、ｇＲＮＡの文脈において修飾とみなされる。別段指示されない限り、非修飾ＲＮＡ中のＵである位置でのデオキシリボヌクレオチド修飾はまた、Ｕ核酸塩基をＴで置き換えることを含むことができる。
二環式リボース類似体
例示的な二環式リボース類似体は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＥＮＡ、架橋核酸（ＢＮＡ）、または別のＬＮＡ様修飾を含む。いくつかの例では、二環式リボース類似体は、リンカーを介して接続された２’位および４’位を有する。リンカーは、式−Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−であってもよく、式中、ｎは、１または２であり、Ｘは、Ｏ、ＮＲ、またはＳであり、Ｒは、ＨまたはＣ１−３アルキル、例えば、メチルである。二環式リボース類似体の例としては、２’−Ｏ−ＣＨ２−４’（オキシ−ＬＮＡ）を含むＬＮＡが含まれる（ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６を参照）、２’−ＮＨ−ＣＨ２−４’、または２’−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−４’（アミノ−ＬＮＡ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：１００３５−１００３９（１９９８）；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：６０７８−６０７９（１９９８））；および２’−Ｓ−ＣＨ２−４’（ｔｈｉｏ−ＬＮＡ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：６０７８−６０７９（１９９８）；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：２２１９−２２２２（１９９８））。
ＥＮＡ
ＥＮＡ修飾は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン修飾を含むヌクレオチドを指す。ＥＮＡヌクレオチドの例示的な構造を以下に示し、波線は、隣接するヌクレオチドへの接続（または場合によっては、３’末端ヌクレオチドがＥＮＡヌクレオチドである場合、３’位置は、リン酸ではなく、ヒドロキシルを含み得るとの理解の下、末端位置）を示す。ＥＮＡヌクレオチドのさらなる考察については、例えば、Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：３２６７−３２７３（２００３）を参照のこと。
Figure 2021526804
ＵＮＡ
ＵＮＡまたは非ロックド核酸修飾は、２’，３’−ｓｅｃｏ−ＲＮＡ修飾を含むヌクレオチドを指し、２’および３’炭素は互いに直接結合していない。ＵＮＡヌクレオチドの例示的な構造を以下に示す。波線は、隣接するリン酸塩への接続またはリン酸塩の置き換え（または場合によっては末端位置）を示す。ＵＮＡヌクレオチドのさらなる考察については、例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：ｅ１０３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１３．３６（２０１３）を参照のこと。
Figure 2021526804
塩基修飾
塩基修飾は、（シュードウリジンのように）異性化を含む、核酸塩基の構造またはその骨格への結合を変化させる任意の修飾である。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、イノシンを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、例えば、ＲＮａｓｅによる切断部位の認識を妨げることによって、および／またはＲＮａｓｅによる切断部位のアクセス可能性を低下させるＲＮＡ構造（例えば、二次構造）を安定化させることによって、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減する塩基修飾を含む。ＲＮＡ構造を安定化させることができる例示的な塩基修飾は、シュードウリジンおよび５−メチルシトシンである。Ｐｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．７６：７２９５−７３００（２０１１）を参照のこと。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、例えば、ワトソン−クリック塩基対における水素結合の増加、非カノニカル塩基対の形成、またはミスマッチ塩基対の作成によって、核酸の融解温度（Ｔｍ）を増加または減少させることができる。
上記修飾およびそれらの等価物は、本明細書に記載される実施形態の範囲内に含まれる。
ＹＡ修飾
ＹＡ部位における修飾（ＹＡ修飾とも称される）は、ヌクレオシド間結合の修飾、塩基（ピリミジンまたはアデニン）の修飾、例えば、化学修飾、置換、または他の方法による修飾、および／または糖の修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ｍｏｅ、２’−Ｆアラビノース、２’−Ｈ（デオキシリボース）等の２’位におけるもの）であり得る。いくつかの実施形態では、「ＹＡ修飾」は、例えば、ＲＮａｓｅによるＹＡ部位の認識もしくは切断を妨げることによって、および／またはＲＮａｓｅへの切断部位のアクセスを低減するＲＮＡ構造（例えば、二次構造）を安定化させることによって、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減するためにジヌクレオチドモチーフの構造を変化させる任意の修飾である。Ｐｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．７６：７２９５−７３００（２０１１）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：３０５−３２０（２００８）；Ｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０４：１６−２８（２０１６）；Ｇｈｉｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３，４９，９０３６を参照のこと。Ｐｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｌｈｋｅ，Ｋｕ，ａｎｄ Ｇｈｉｄｉｎｉは、ＹＡ修飾として好適な例示的な修飾を提供する。エンドヌクレオチド分解を低減するための当業者に既知の修飾が包含される。ＲＮａｓｅ切断に関与する２’ヒドロキシル基に影響を与える例示的な２’リボース修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅを含む２’−Ｈおよび２’−Ｏ−アルキルである。ＹＡ部位における残基の二環式リボース類似体、ＵＮＡ、および修飾ヌクレオシド間結合等の修飾は、ＹＡ修飾であり得る。ＲＮＡ構造を安定化させることができる例示的な塩基修飾は、シュードウリジンおよび５−メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のうちの少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン（「ピリミジン位置」とも称される）は、修飾（例えば２’位の、ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾、ピリミジン塩基の修飾、およびリボースの修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニン（「アデニン位置」とも称される）は、修飾（例えば２’位の、ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾、ピリミジン塩基の修飾、およびリボースの修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンおよびアデニンは修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減する。
上記修飾およびそれらの等価物は、本明細書に記載される実施形態の範囲内に含まれる。
ｓｇＲＮＡのドメイン／領域
Ｂｒｉｎｅｒ ＡＥ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３−３３９（２０１４）は、標的化を担う「スペーサー」ドメイン、「下部ステム」、「バルジ」、「上部ステム」（テトラループを含み得る）、「ネクサス」、ならびに「ヘアピン１」および「ヘアピン２」ドメインを含む、本明細書において「ドメイン」と称されるｓｇＲＮＡの機能ドメインを説明する。Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．の３３４頁，図１Ａを参照のこと。
表３は、本明細書で使用されるｓｇＲＮＡのドメインの概略図を提供する。表３において、領域間の「ｎ」は、例えば、０〜１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の可変数のヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態では、ｎは０に等しい。いくつかの実施形態では、ｎは１に等しい。
５’末端部領域
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、表３に示されるように、５’末端におけるヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの５’末端は、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質を標的ヌクレオチド配列に誘導するように機能するスペーサーまたはガイド領域を含む。いくつかの実施形態では、５’末端はガイド領域を含まない。いくつかの実施形態では、５’末端はスペーサー、およびＣａｓタンパク質を標的ヌクレオチド領域に誘導するように機能しない追加のヌクレオチドを含む。
下部ステム
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、直線的に見たときにバルジ領域および上部ステム領域によって分離される、下部ステム（ＬＳ）領域を含む。表３を参照のこと。
いくつかの実施形態では、下部ステム領域は、１〜１２個のヌクレオチドを含み、例えば一実施形態では、下部ステム領域は、ＬＳ１〜ＬＳ１２を含む。いくつかの実施形態では、下部ステム領域は、表３に示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、下部ステム領域は、表３に示されるよりも多いヌクレオチドを含む。下部ステム領域が、表３の概略図に示されるよりも少ないかまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかであるように、修飾パターンを維持する必要がある。
いくつかの実施形態では、下部ステム領域は、反対方向で読み取るときに核酸配列において相補的であるヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、下部ステムの核酸配列における相補性は、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡにおけるステムの二次構造をもたらす（例えば、領域は、互いに塩基対を形成し得る）。いくつかの実施形態では、下部ステム領域は、反対方向に読み取るときに互いに完全に補完的ではなくてもよい。
バルジ
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、６個のヌクレオチドＢ１〜Ｂ６を含むバルジ領域を含む。直線的に見るときに、バルジ領域は２つの領域に分離される。表３を参照のこと。いくつかの実施形態では、バルジ領域は、６個のヌクレオチドを含み、最初の２個のヌクレオチド、続いて上部ステム領域、続いてバルジの最後の４個のヌクレオチドが続く。いくつかの実施形態では、バルジ領域は、表３に示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、バルジ領域は、表３に示されるよりも多いヌクレオチドを含む。バルジ領域が、表３の概略図に示されるよりも少ないかまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかであるように、修飾パターンを維持する必要がある。
いくつかの実施形態では、バルジの存在は、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡにおける上部ステムモジュールと下部ステムモジュールとの間の方向性縮れをもたらす。
上部ステム
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、１２個のヌクレオチドを含む上部ステム領域を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム領域はループ配列を含む。いくつかの例では、ループは、テトラループ（４個のヌクレオチドからなるループ）である。
いくつかの実施形態では、上部ステム領域は、表３に示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上部ステム領域は、表３に示されるよりも多いヌクレオチドを含む。上部ステム領域が、表３の概略図に示されるよりも少ないまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかであるように、修飾パターンを維持する必要がある。
いくつかの実施形態では、上部ステム領域は、反対方向に読み取るときに核酸配列において相補的なヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、上部ステムの核酸配列における相補性は、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡにおけるステムの二次構造をもたらす（例えば、領域は、互いに塩基対を形成し得る）。いくつかの実施形態では、上部ステム領域は、反対方向に読み取るときに互いに完全に補完的ではなくてもよい。
ネクサス
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、下部ステム領域とヘアピン１領域との間に位置するネクサス領域を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、１８個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ネクサス領域は、表３に示されるヌクレオチドＮ１〜Ｎ１８を含む。
いくつかの実施形態では、ネクサス領域は、表３に示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ネクサス領域は表３に示されるよりも多いヌクレオチドを含む。ネクサス領域が、表３の概略図に示されるよりも少ないかまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかであるように、修飾パターンを維持する必要がある。
いくつかの実施形態では、ネクサス領域は、反対方向に読み取るときに核酸配列において相補的なヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、核酸配列における相補性は、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡにおけるステムおよび／またはステムループの二次構造をもたらす（例えば、ネクサス領域における特定のヌクレオチドは、互いに塩基対を形成し得る）。いくつかの実施形態では、ネクサス領域は、反対方向に読み取るときに互いに完全に補完的ではなくてもよい。
ヘアピン
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、１つ以上のヘアピン領域を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、ネクサス領域の下流（例えば３’側）にある。いくつかの実施形態では、ネクサス領域のすぐ下流のヌクレオチドの領域は、「ヘアピン１」または「Ｈ１」と称される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド３’からヘアピン１の領域は、「ヘアピン２」または「Ｈ２」と称される。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、ヘアピン１およびヘアピン２の両方を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、ヘアピン１またはヘアピン２を含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、ネクサス領域のすぐ下流に１２個の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、表３に示すように、ヌクレオチドＨ１−１〜Ｈ１−１２を含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピン２領域はヘアピン１領域の下流に１５個の核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン２領域は、表３に示すように、ヌクレオチドＨ２−１〜Ｈ２−１５を含む。
いくつかの実施形態では、１個以上のヌクレオチドは、ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間に存在する。ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の１つ以上のヌクレオチドは、修飾または非修飾であり得る。いくつかの実施形態では、ヘアピン１およびヘアピン２は、１個のヌクレオチドによって分離される。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、表３に示されるよりも少ないヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、表３に示されるよりも多いヌクレオチドを含む。ヘアピン領域が、表３の概略図に示されるよりも少ないかまたは多いヌクレオチドを含む場合、当業者に明らかであるように、修飾パターンを維持する必要がある。
いくつかの実施形態では、反対方向に読み取られるときに核酸配列において相補的なヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、反対方向に読み取るときに互いに完全に相補的ではなくもよい（例えば、ヘアピンの上部またはループは、対形成していないヌクレオチドを含む）。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、ヘアピン１をヌクレオチド「ｎ」で置き換えることを含み、「ｎ」は、１〜５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、および２の整数である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡのヘアピン１領域は、２個のヌクレオチドで置き換えられる。
３’末端
ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの最後のヌクレオチドである３’末端を有する。３’末端部領域は、３’末端からの最後の１〜７個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’末端は、ヘアピン２の末端である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域（複数可）後にヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端部領域を含み、この場合、３’末端の最後のヌクレオチドは、３’末端である。いくつかの実施形態では、３’テールは、例えばヘアピンの二次構造と会合しない、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テール領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない１、２、３、または４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テール領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テール領域は、ヘアピンの二次構造と会合しない１、２、または３個のヌクレオチドを含む。

Figure 2021526804
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ＹＡ部位の修飾を含む、修飾を含むｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個またはそれ以上のＹＡ部位（例えば、保存領域および／またはガイド領域中）における修飾、ならびに／または５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６またはその後に位置する１つ以上のヌクレオチドにおけるＹＡ修飾等の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンは、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニンは修飾（アデニンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンおよびアデニンは、糖、塩基、またはヌクレオシド間結合修飾等の修飾を含む。ＹＡ修飾は、本明細書に記載される修飾の種類のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、または２’−フルオロのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、または２’−フルオロの１つ以上を含むピリミジン修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、１つ以上のＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボース類似体（例えばＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボース類似体（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含み、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
上述の実施形態のいずれも、以下と組み合わせ得る：（ｉ）５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、または１８のうちの少なくとも１つは、２’−フルオロ修飾を含まない、および／または（ｉｉ）５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０うちの少なくとも１つは、ホスホロチオエート結合を含まない、ならびに（ｉ）５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７〜１０のうちの少なくとも１つは、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、（ｉｉ）５’末端部の５’末端からのヌクレオチド２０は、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または（ｉｉｉ）またはガイドＲＮＡは、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちのいずれか１つ以上における２’−フルオロ修飾を含み、５’末端部の５’末端から１１、１２、１３、１４、１７、またはヌクレオチド１８のうちの少なくとも１つは、２’−フルオロ修飾を含まず、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２は、２’−フルオロ修飾を含まない。そのような実施形態は、さらにまたはあるいは、実現可能な範囲で、本明細書に記載される任意の他の１つ以上の実施形態と組み合わされ得る。
ＹＡ部位の修飾を含む、ガイド領域の修飾
いくつかの実施形態では、ガイド領域は、１つ以上の修飾を含み、任意選択により、ＹＡ部位修飾を含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、ＹＡ修飾を含み得る、１、２、３、４、５個またはそれ以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」）を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する１つ以上のＹＡ部位（「５末端」等は、ガイド領域の３’末端、すなわち、ガイド領域中の最も３’側のヌクレオチドに対して５位を指す）は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する２つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する３つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する４つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する５つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある。例えば、修飾ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１０個のヌクレオチド内にあり、ガイド領域が、２０個のヌクレオチド長である場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位の修飾ヌクレオチドは、１１〜２０位のいずれかに位置する。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドからＹＡ部位内に２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端ヌクレオチドから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドに位置する。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４、５、６、７、８、９、１０、または１１である。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端修飾以外である。例えば、ｇＲＮＡは、本明細書に記載の５’末端修飾を含み、修飾ガイド領域ＹＡ部位をさらに含むことができる。あるいは、ｇＲＮＡは、非修飾５’末端および修飾ガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。あるいは、ｇＲＮＡは、修飾５’末端および非修飾ガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む。例えば、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４が２’−ＯＭｅ修飾のみを含み、ヌクレオチド５がＹＡ部位のピリミジンであり、ホスホロチオエートを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位（ヌクレオチド４）の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾（ホスホロチオエート）を含む。別の例では、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４がＹＡ部位のピリミジンであり、２’−ＯＭｅを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチド（ヌクレオチド１〜３のいずれか）が含まない修飾（２’−ＯＭｅ）を含む。この条件はまた、非修飾ヌクレオチドが修飾ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する場合、常に満たされる。
いくつかの実施形態では、ガイド領域は、ガイド領域のヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８のうちの１〜１４つの修飾を含む。そのような修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはホスホロチオエート修飾、またはそれらの組み合わせであり得る。例えば、２’−ＯＭｅ修飾は、ヌクレオチド１〜４および１２のいずれかまたは全てに含まれてもよく、ホスホロチオエート修飾は、ヌクレオチド１〜３および６〜１０のいずれかまたは全てに含まれ得、および／または２’−フルオロ修飾は、ヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８のいずれかまたは全てに含まれ得る。否定的用語では、２’−ＯＭｅ修飾は、ヌクレオチド６〜１１および１３末端から除外され得、２’−フルオロ修飾は、ヌクレオチド１〜７、１５、１６、および２０（存在する場合）から除外され得、および／またはホスホロチオエート修飾は、ヌクレオチド４、５、１１〜１４、１７、および１８から除外され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ＹＡ部位に依存する様式で修飾され、例えば、ＹＡ部位が、ヌクレオチド５〜６、１２〜１３、１５〜１６、１６〜１７、または１９〜２０のうちのいずれかに存在する場合、ＹＡ部位のうちの少なくとも１個のヌクレオチドが修飾され、例えば、ＹＡ部位の少なくともピリミジンが修飾され、任意選択により、５、１２、１５、１６、および１９位のヌクレオチドは、それらがＹＡ部位のピリミジンでない場合、非修飾である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド５における修飾は、該修飾がＹＡ部位のピリミジンである場合、２’−ＯＭｅであり、ヌクレオチド１２における修飾は、該修飾がＹＡ部位のピリミジンである場合、２’−ＯＭｅであり、ヌクレオチド１５における修飾は、該修飾がＹＡ部位のピリミジンである場合、ホスホロチオエートであり、ヌクレオチド１６における修飾は、該修飾がＹＡ部位のピリミジンである場合、ホスホロチオエートであり、および／またはヌクレオチド１９における修飾は、該修飾がＹＡ部位のピリミジンである場合、ホスホロチオエートである。したがって、ＹＡ部位が１５〜１６位および１６〜１７位の両方に存在することができないことを認識して、ＹＡ部位の存在を条件として、最大４つの修飾が存在することが可能である。代替の実施形態では、ヌクレオチド１９における修飾は、代わりに２’−フルオロであり得る。これは、ＹＡ部位に依存する様式で存在することができ、または１９〜２０位にＹＡ部位があるかどうかにかかわらず存在することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド１５および１６は、非修飾であるか、またはホスホロチオエートのみにより、例えば、ヌクレオチド１５〜１６または１６〜１７に位置するＹＡ部位のピリミジンであるヌクレオチドのみにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド１５および１６は、非修飾リボースおよび／または非修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド５は非修飾であるか、またはＹＡ部位のピリミジンである場合に２’−ＯＭｅのみにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド１２は非修飾であるか、またはＹＡ部位のピリミジンである場合に２’−ＯＭｅのみにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド２０（またはガイド領域の３’末端部ヌクレオチド）は非修飾である。先行実施形態のいずれかにおいて、ガイド領域は、２０個のヌクレオチドからなり得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド５および／または１２のうちの１つ以上において修飾を含むガイド領域を含む。ヌクレオチド５および／または１２における修飾は、独立して、本明細書に記載の修飾、例えば、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、ホスホロチオエート、および２’−Ｈ（デオキシリボヌクレオチド）から選択され得る。そのような修飾は、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡにおいて示されるように、本明細書に記載される別の修飾パターンまたはヌクレオチド修飾と組み合わせ得る。そのような実施形態の特定の例は、例えば、上記に記載される特定の番号の実施形態において、および配列表中の配列によって表される修飾パターンにおいて、本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾のうちの１つ以上または全てと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド８〜１０のうちのいずれか１つ、２つ、または全てにおいて修飾を含むガイド領域を含む。そのような修飾は、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡにおいて示されるように、本明細書に記載される別の修飾パターンまたはヌクレオチド修飾と組み合わせ得る。修飾は、独立して、本明細書に記載の修飾、例えば、２’−Ｆ修飾およびホスホロチオエート修飾、またはそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド８〜１０のうちのいずれか１つ、２つ、または全ては、２’−Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド８〜１０のうちのいずれか１つ、２つ、または全ては、２’−Ｆ修飾を含むが、ホスホロチオエート修飾は含まない。いくつかの実施形態では、任意の１つ、２つ、または全てのヌクレオチド８〜１０は、２’−Ｆ修飾およびホスホロチオエート修飾を含む。そのような実施形態の特定の例は、例えば、上記に記載される特定の番号の実施形態において、および配列表中の配列によって表される修飾パターンにおいて、本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またははヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾のうちの１つ以上または全てと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド５および６のうちのいずれか一方または両方に修飾を含むガイド領域を含む。修飾は、独立して、本明細書に記載の修飾、例えば、２’−Ｆ修飾およびホスホロチオエート修飾、またはそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド５および６のうちのいずれか一方または両方は、２’−Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド５および６のうちのいずれか一方または両方は、２’−Ｆ修飾を含むが、ホスホロチオエート修飾を含まない。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド５および６のうちのいずれか一方または両方は、２’−Ｆ修飾およびホスホロチオエート修飾を含む。そのような実施形態の特定の例は、例えば、上記に記載される特定の番号の実施形態において、および配列表中の配列によって表される修飾パターンにおいて、本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、１〜３および７〜ヌクレオチド１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾のうちの１つ以上または全てと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド６〜１１のうちの少なくとも１、２、３、４、５、または６個における修飾を含むガイド領域を含む。修飾は、独立して、本明細書に記載の修飾、例えば、２’−Ｆ修飾から選択され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド６〜１１のうちの１、２、３、４、５、または６個における２’−Ｆ修飾は、２’−Ｆ修飾を含む１つ以上の位置において、ホスホロチオエート修飾等の別の適合する修飾と組み合わせられる。そのような実施形態の特定の例は、例えば、上記に記載される特定の番号の実施形態において、および配列表中の配列によって表される修飾パターンにおいて、本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、および／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾のうちの１つ以上または全てと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド１〜４および６〜１１のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における修飾を含むガイド領域を含む。修飾は、独立して、本明細書に記載の修飾、例えば、２’−Ｆ修飾から選択され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド１〜４および６〜１１のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における２’−Ｆ修飾は、２’−Ｆ修飾を含む位置の１つ以上において、ホスホロチオエート修飾等の別の適合する修飾と組み合わせられる。そのような実施形態の特定の例は、例えば、上記に記載される特定の番号の実施形態において、および配列表中の配列によって表される修飾パターンにおいて、本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、および／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾のうちの１つ以上もしくは全てと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド９、１１、１３、および１４のうちの少なくとも１、２、３、または４個における２’−ＯＭｅ修飾を含むガイド領域を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド９、１１、１３、および１４のうちの少なくとも１、２、３、または４個における２’−ＯＭｅ修飾が、２’−ＯＭｅ修飾を含む位置の１つ以上において、ホスホロチオエート修飾等の別の適合する修飾と組み合わせられる。そのような実施形態の特定の例は、例えば、上記に記載される特定の番号の実施形態において、および配列表中の配列によって表される修飾パターンにおいて、本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、そのような修飾は、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、および／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾のうちの１つ以上または全てと組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、上記ＹＡ部位について記載される修飾を含む。
ガイド領域ＹＡ部位修飾の追加の実施形態は、上記の概要に示される。本開示の他の箇所に記載される任意の実施形態は、実現可能な範囲で、先行実施形態のいずれかと組み合わせ得る。
保存領域ＹＡ部位の修飾
保存領域ＹＡ部位１〜１０を図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存領域ＹＡ部位は、修飾を含む。
いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、８、または１および８は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、２、３、４、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位２、３、４、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、２、３、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位２、３、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位１、２、３、４、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８つの追加の保存領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、１、２、３、または４つの保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８つの追加の保存領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾保存領域ＹＡ部位は、上記ＹＡ部位について記載される修飾を含む。
保存領域ＹＡ部位修飾のさらなる実施形態は、上記の概要に示される。本開示の他の箇所に記載される任意の実施形態は、実現可能な範囲で、先行実施形態のいずれかと組み合わせ得る。
末端部ヌクレオチドの修飾
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’および／または３’末端部領域は、修飾されている。
３’末端部領域修飾
いくつかの実施形態では、３’末端部領域における１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドが修飾されている。全体を通して、この修飾は「３’末端修飾」と称され得る。いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個が修飾されている。いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が修飾されている。いくつかの実施形態では、３’’末端部領域における末端（すなわち、最後の）の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも３個が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾はＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、３’末端部領域の修飾は、３’保護末端修飾である。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、３’保護末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ＥＮＡ、ＵＮＡ、２’−Ｈ（ＤＮＡ）、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ＥＮＡを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ＵＮＡを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｈ（ＤＮＡ）を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、３個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、４個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、５個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、６個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、７個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１〜７個または１〜５個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ｇＲＮＡの３’末端部において１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ｇＲＮＡの３’末端部において約１〜３、１〜５、１〜６、または１〜７個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ＥＮＡ、ＵＮＡ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含み、結合は、最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間にある。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の３個のヌクレオチド間の２個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の４個のヌクレオチド間の４個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の４個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の５個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の１〜７個のヌクレオチドのうちの１個以上の修飾を含むかまたはさらに含み、修飾は、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせを有する最後のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、３’テールの隣りのヌクレオチドおよび／または１番目のヌクレオチドへの１つまたは２個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる、最後および／または最後から２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる、最後のヌクレオチド、最後から２番目のヌクレオチド、および／または最後から３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる、最後、最後から２番目、最後から３番目、および／または最後から４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる、最後、最後から２番目、最後から３番目、最後から４番目、および／または最後から５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、３’テールを含むかまたはさらに含み、３’テールは、３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’テールは完全に修飾されている。いくつかの実施形態では、３’テールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチドを含み、任意選択により、これらのヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上が修飾されている。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、配列番号１〜１３２のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’保護末端修飾を含むｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドからの５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転塩基修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドからの１５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続する２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける交互する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）２または３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、最後のヌクレオチドと最後の隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾および３’末端修飾を含む。
３’テール
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの保存部分の３’末端に続く、３’テールを含む３’末端部を含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１〜約２０個のヌクレオチド、１〜約１５個のヌクレオチド、１〜約１０個のヌクレオチド、１〜約５個のヌクレオチド、１〜約４個のヌクレオチド、１〜約３個のヌクレオチド、および１〜約２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、３個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜５、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’テールは、１〜２０個のヌクレオチドを含み、ｓｇＲＮＡの保存部分の３’末端に続く。
いくつかの実施形態では、３’テールは、保護末端修飾、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上のヌクレオチド間結ホスホロチオエート（ＰＳ）合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上の２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上の反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上の保護末端修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および反転した脱塩基修飾ヌクレオチドのうちの１個以上の組み合わせを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’テールを含まない。
５’末端部領域修飾
いくつかの実施形態では、５’末端部領域が修飾され、例えば、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドが修飾されている。全体を通して、この修飾は「５’末端修飾」と称され得る。いくつかの実施形態では、５’末端部領域の最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド（すなわち、５’末端部の５’末端から１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド）は、２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端の末端（すなわち、最初の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端からの１、２、３、４、５、６、または７個の末端部ヌクレオチドのうちの少なくとも２個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端からの１、２、３、４、５、６、または７個の末端部ヌクレオチドのうちの少なくとも３個が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾はＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部領域の修飾は、５’保護末端修飾である。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５’保護末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの５’末端部領域および３’末端部領域の両方が修飾されている（例えば、ｇＲＮＡの最初のヌクレオチドおよび最後のヌクレオチドを含む）。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの５’末端部領域のみが修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存部分の３’末端部領域のみ（プラスまたはマイナス３’テール）が修飾されている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、ｇＲＮＡの５’末端部の５’末端からの最初の７個のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、３’末端部の３’末端からの７個の末端部のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端からの最初の４個のヌクレオチドの２、３、もしくは４個、および／または３’末端部の３’末端からの末端部の４個のヌクレオチドのうちの２、３、もしくは４個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端からの最初の４個のヌクレオチドのうちの２、３、または４個が、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合されている。
いくつかの実施形態では、５’末端および／または３’末端の修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）または２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチドへの２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、保護末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、保護末端修飾、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’−Ｈ（ＤＮＡ）、ＥＮＡ、ＵＮＡ、および反転した脱塩基ヌクレオチドから選択される２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、等価な修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、５’末端部における最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間の１個以上のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端部における最後の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間の１個以上のＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、３’末端部における最後の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間、および５’末端部の５’末端からの最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間の両方の１個以上のＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳ結合に加えて、５’および３’末端部ヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端修飾を含み、例えば、ガイド領域の最初のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端修飾を含み、ガイド領域の１番目のヌクレオチドは、５’保護末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ＥＮＡ、ＵＮＡ、２’Ｈ（ＤＮＡ）、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ＥＮＡを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ＵＮＡを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｈ（ＤＮＡ）を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）のガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１つ以上の修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、１個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、３個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、４個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、６個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、７個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、１〜７、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５’末端からの１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５’末端からの約１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、または１〜７個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’末端から１番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’末端から１番目および２番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’末端における１番目、２番目、およびヌクレオチド３からの修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’末端から１番目、２番目、３番目、およびヌクレオチド４における修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’末端から１番目、２番目、３番目、４番目、およびヌクレオチド５における修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’末端から１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、およびヌクレオチド６における修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の５’末端における１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、およびヌクレオチド７からの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および／もしくは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および／もしくは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および／もしくは２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および／もしくは反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびに／またはそれらの組み合わせを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１、２、３、４、５、６、および／または７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、または１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含み、１個のＰＳ結合が存在する場合、結合は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間にある。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも２個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含み、結合は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、および２と３との間にある。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、クレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、および４と５との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５、および５と６との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、５と６との間、および７と８との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちの１個以上の修飾を含むかまたはさらに含み、修飾は、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、および／またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによるガイド領域の最初のヌクレオチドの修飾、および隣りのヌクレオチドへの任意選択によるＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによるガイド領域の第１番目および／または第２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間および／または２番目と３番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、および／または３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間、２番目と３番目のヌクレオチドの間、および／または３番目と４番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、および／または４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間、２番目と３番目のヌクレオチドの間、３番目と４番目のヌクレオチドの間、および／または４番目と５番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、４番目、および／または５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間、２番目と３番目のヌクレオチドの間、３番目と４番目のヌクレオチドの間、４番目と５番目のヌクレオチドの間、および／または５番目と６番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、配列番号４０１〜５３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、配列番号４０１〜５３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜３に示される５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、配列番号４０１〜５３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜４に示される５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、配列番号４０１〜５３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜５に示される５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、配列番号４０１〜５３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜６に示される５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、配列番号４０１〜５３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜７に示される５’末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、５’保護末端修飾を含む５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域の１、２、３、４、およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域の１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域の１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むａｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含むａｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）が提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾および３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供される。上記および／またはその他では本明細書に開示される５’末端修飾のいずれかは、配列表に表されるおよび／または下記で考察する３’末端修飾等の３’末端修飾と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、５’末端部および３’末端部における修飾ヌクレオチド、ならびに表３に記載される１つ以上の他の領域における修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端にない修飾ヌクレオチドを含む。修飾の例示的パターンを以下および表１に記載する。
二次構造を安定化させるための修飾
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、二次構造、例えば二本鎖領域を安定化させる修飾を含む。二次構造の安定性の増加は、例えば溶融温度分析により、経験的に決定することができる。分析を簡素化するために、安定化を意図する二次構造要素を、ｓｇＲＮＡ構造の残りの部分から単離して試験することができる。二次構造の安定性の増加はまた、エンドヌクレアーゼによる切断部位（例えば、ＹＡ部位）の近づきやすさの低下よって決定することができ、該修飾は、エンドヌクレアーゼによる切断部位の一次構造を変化させないが、エンドヌクレアーゼによる切断部位を含む二次構造において生じるか、またはその二次構造に影響を及ぼさない。これは、エンドヌクレアーゼによる切断部位に遠位効果を有すると称される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼによる切断部位は、下部ステムにある。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼによる切断部位は、保存領域ＹＡ部位１である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼによる切断部位は、保存領域ＹＡ部位２である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼによる切断部位は、保存領域ＹＡ部位３である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼによる切断部位は、保存領域ＹＡ部位１０である。いくつかの実施形態では、修飾は、二環式リボースアナログ修飾、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはＬＮＡ様修飾である。いくつかの実施形態では、修飾は、ＥＮＡ修飾である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドＬＳ８は、二次構造を安定化させる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドＬＳ１１は、二次構造を安定化させる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドＬＳ８およびＬＳ１１の一方または両方は、二次構造を安定化させる、ＥＮＡ修飾等の１つ以上の修飾（例えば２つの修飾）をまとめて含む。実施例におけるＧ１０００８およびＧ１００３８の考察を参照のこと。
追加の修飾
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１５個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１６個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１７個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１８個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１９個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）は、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンの少なくとも７５％と一致する修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンの少なくとも８０％と一致する修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンの少なくとも８５％と一致する修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンの少なくとも９０％と一致する修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンの少なくとも９５％と一致する修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンの少なくとも９８％と一致する修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書、例えば、表１に記載されるｇＲＮＡの修飾パターンと一致する修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、表１に修飾されているとして示される領域のいずれか１つ以上における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、表１に修飾されているとして示される位置のいずれかにおける修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、表１に示される修飾のいずれかを含む。追加の修飾は、上記の概要の項目に示され、これは、実現可能な範囲で、本明細書の他の箇所に開示される修飾、例えばＹＡ部位修飾と組み合わされ得る。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、ＹＡ部位に１、２、３、４、または５つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、少なくとも１、２、３、４、または５つのＹＡ修飾を含む、いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、１つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾は、３つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位にある。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および／またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、表１の配列のうちのいずれか１つに示される上部ステム修飾を含む。いくつかの実施形態では、そのような上部ステム修飾は、例えば表１中の対応する配列について示される、５’保護末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのような上部ステム修飾は、例えば表１中の対応する配列について示される３’保護末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのような上部ステム修飾は、表１中の対応する配列について示される５’末端修飾および３’末端修飾と組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾および上部ステム修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、３’末端修飾および上部ステム修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾、３’末端修飾、および上部ステム修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、ヘアピン１にある。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、ヘアピン２にある。いくつかの実施形態では、修飾は、ヘアピン１および２にあり、任意選択により、ヘアピン１と２との間の「ｎ」も修飾されている。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、２’Ｈ修飾ヌクレオチド（ＤＮＡ）、ＰＳ修飾ヌクレオチド、ＹＡ修飾、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、および／またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、ＹＡ部位における１、２、または３つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、１つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、２つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾は、３つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位にある。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、３’末端修飾およびヘアピン領域における修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾およびヘアピン領域における修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、上部ステム修飾およびヘアピン領域における修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、表１の配列のうちのいずれか１つに示されるヘアピン修飾を含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘアピン修飾は、表１中の対応する配列について示される５’末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのようなヘアピン修飾は、表１中の対応する配列について示される３’末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのようなヘアピン修飾は、表１中の対応する配列について示される５’末端修飾および３’末端修飾と組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、３’末端修飾、ヘアピン領域における修飾、上部ステム修飾、および５’末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＹＡ部位の１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡは、例えば、本明細書に定義される、または表２に示されるヘアピン領域に対して、少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドヘアピン領域を含む、本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡである。そのようなｓｇＲＮＡは、例えば、上記の短いｓｇＲＮＡに関する概要および詳細な説明の項目における、ｓｇＲＮＡに関して本明細書に記載される特徴のいずれかを有し得る。
例示的な修飾ｓｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓｇＲＮＡは、表１に示される配列のいずれかを含むかまたはそれからなる。さらに、表１に示され、かつ、表１で配列番号によって同定される配列のうちのいずれかの修飾を含むｓｇＲＮＡが包含される。すなわち、ヌクレオチドは、同一であってもよいし、または異なっていてもよいが、示される修飾パターンは、表１のガイド配列の修飾パターンと同一であってもよいし、または類似していてもよい。修飾パターンは、ｓｇＲＮＡの修飾の相対的位置および同一性（例えば、５’末端部領域、下部ステム領域、バルジ領域、上部ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、３’テール領域）を含む。
いくつかの実施形態では、修飾パターンは、表１の配列の縦列に示される配列のうちのいずれか１つの修飾の、または配列の少なくとも１つ以上の領域にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％を含む。いくつかの実施形態では、修飾パターンは、表１の配列の縦列に示される配列のうちのいずれか１つの修飾パターンと少なくとも５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、および約９９％同一である。いくつかの実施形態では、修飾パターンは、表１に示される配列の１、２、３、４、５、６、７、または８つの領域、例えば、５’末端部領域、下部ステム領域、バルジ領域、上部ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、および／または３’末端部領域にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。
例えば、いくつかの実施形態では、修飾パターンが、５’末端部領域にわたる配列の修飾パターンと少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンが、下部ステムにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンが、バルジにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンが、上部ステムにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンが、ネクサスにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンが、ヘアピン１にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンが、ヘアピン２にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンが、３’末端にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である、ｓｇＲＮＡが包含される。いくつかの実施形態では、修飾パターンは、０、１、２、３、４、５、または６つのヌクレオチドにおける、表１の配列またはそのような配列の領域（例えば、５’末端、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端）の修飾パターンとは異なる。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、または６つのヌクレオチドにおける、表１の配列の修飾とは異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、または６つのヌクレオチドにおける、表１の配列の領域（例えば、５’末端、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端）の修飾とは異なる修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端修飾、３’末端修飾、または５’末端修飾および３’末端修飾を含み、ＹＡ修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、保護末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合、ならびに２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドのうちの１個以上を含む。末端修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾を含み得る。等価末端修飾はまた、本明細書に記載される実施形態によって包含される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの１つ以上の領域の修飾と組み合わせて末端修飾を含む。
上記の５’末端修飾、３’末端修飾、上部ステム修飾、ヘアピン修飾、および３’末端修飾の組み合わせを含む修飾ｓｇＲＮＡが包含される。例示的な修飾ｓｇＲＮＡを以下に記載する。
いくつかの実施形態では、配列番号４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、または１００７〜１１３２に記載される配列のいずれか１つを含むかまたはそれからなる、ｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号６０１または６０７〜７３２の修飾配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡが提供され、ｓｇＲＮＡは、標的配列に相補的なガイド領域をさらに含み、切断のためにＣａｓ９をその標的に誘導する。いくつかの場合では、配列番号４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つの核酸と少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含むｓｇＲＮＡが提供され、修飾パターンは、表１の参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３または４個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３または４個のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合されている。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｆを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−ｍｏｅを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、言及されるヌクレオチドがｓｇＲＮＡに存在する場合、５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端（ｓｇＲＮＡの３’テールまたは保存部分）における最後の４個のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ＰＳ結合で結合され、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ＰＳ結合で結合され、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、言及されるヌクレオチドがｓｇＲＮＡに存在する場合、ｓｇＲＮＡが提供され、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡのバルジ領域におけるヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡの上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡのネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡのヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡのヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、以下のヌクレオチド：５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２、バルジ領域におけるＢ１およびＢ２、ｓｇＲＮＡの上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々、ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８、ヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々、ヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸、および３’末端部における最後の４つのヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＳ９およびＬＳ１０は、２’−Ｆにより修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は、２’−Ｆにより修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、ＨＳ−１４、およびＨ２−１５は、２’−Ｆにより修飾されている。いくつかの実施形態では、３’末端における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドは、２’−Ｆにより修飾されている。
いくつかの実施形態では、以下のヌクレオチド：下部ステム領域におけるＬＳ９およびＬＳ１０、ネクサス領域におけるＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８、ならびにヘアピン２領域におけるＨ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、ＨＳ−１４、およびＨ２−１５における、２’−Ｆ修飾核酸を含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端部における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドのうちの３個における２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾核酸をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ１〜ＬＳ６における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ２〜ＬＳ５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間の「ｎ」における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における２’−Ｏ−Ｆ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１〜Ｈ２−８における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−９〜Ｈ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、３’末端部における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、およびＨ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、およびＨ１−１１における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、３’末端部における最後から２番目および最後から４番目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端部における最後から３番目および最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾、ならびにＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾を含むｓｇＲＮＡが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端部における最後および最後から３番目のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに３’末端における最後から２番目および最後から３番目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’末端部の最初の７個のヌクレオチド内の少なくとも２個のホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’末端における１つ以上のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のホスホロチオエート結合は、５’末端部ヌクレオチドを結合する。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’末端部の最初の７個のヌクレオチド内の１個以上のホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号６０１または６０７〜７３２の修飾配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡが提供され、ｓｇＲＮＡは、標的配列に少なくとも部分的に相補的な５’ガイド領域をさらに含み、任意選択により、切断のためにＣａｓ９をその標的に誘導する。
いくつかの実施形態では、配列番号４０１〜５３２、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１個のヌクレオチドと少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有するヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡが提供され、修飾パターンは、参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である。すなわち、ヌクレオチドＡ、Ｕ（および／またはデオキシリボヌクレオチド修飾の場合はＴ）、Ｃ、およびＧは、配列に示されるものと比較して、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％異なり得るが、修飾は変わらないままである。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、下部ステムにおけるＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２、バルジ領域におけるＢ１およびＢ２、上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々、ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８、ヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々、ヘアピン１とヘアピン２との間の１個のヌクレオチド、ヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、下部ステムにおけるＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２、バルジ領域におけるＢ１〜Ｂ６、上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々、ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８、ヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々、ヘアピン１とヘアピン２との間の１個のヌクレオチド、ヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、および３’末端部領域における最後の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、下部ステムにおけるＬＳ９およびＬＳ１０、ネクサス領域における１５−Ｎ１８、ヘアピン２領域におけるＨ２−９−ＨＳ−１５、ならびに３’末端部領域における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、下部ステムにおける各ヌクレオチド、ネクサス領域における１５〜Ｎ１８、ヘアピン２領域におけるＨ２−９〜ＨＳ−１５、ならびに３’末端部領域における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、ＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、Ｈ２−１５、ならびに３’末端部領域における最後および最後から３番目のヌクレオチドにおける、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびにＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、Ｈ２−１４、ならびに３’末端部領域における最後から２番目および最後から４番目のヌクレオチドにおける、２’−Ｆ修飾を含む、ｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、５’末端修飾、ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含み、５’末端修飾は、５’末端部の５’末端における最初の７個のヌクレオチド内の少なくとも２個のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾もしくは保存領域ＹＡ修飾、ＵＳ１〜ＵＳ１２における修飾、および／もしくはＨ１−１における修飾、ならびに／またはＨ２−１における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾またはＨ１−１〜Ｈ１−１２および／もしくはＨ２−１〜Ｈ２−１５における保存領域ＹＡ修飾および修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域の各々における１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、およびヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、および下部ステム領域における修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、およびバルジ領域における修飾を含む。いくつかの実施形態では、バルジ領域におけるヌクレオチドの５０％が修飾され、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、およびネクサス領域における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ネクサス領域におけるＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８における修飾を含み、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。いくつかの場合では、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は、ＰＳ結合で結合されている。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部の５’末端における最初の４個のヌクレオチドにおける１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、および３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける修飾を含む。いくつかの例では、これらの修飾は、ＰＳ結合（すなわち、最初の４つおよび最後の４個のヌクレオチドを結合するＰＳ結合）を結合している。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部の５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部の３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおける、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、およびＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における修飾を含み、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、およびバルジ領域におけるヌクレオチドの各々における修飾を含み、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、および上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々における修飾を含み、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、およびヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々における修飾を含み、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、２つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、およびヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々における修飾を含み、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆである。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、以下の位置における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含むことを包含する：
ａ．下部ステム領域におけるＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、および／またはＬＳ１２、
ｂ．バルジ領域におけるＢ１および／またはＢ２、
ｃ．上部ステム領域における各ヌクレオチド、
ｄ．ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８、
ｅ．ヘアピン１領域における各ヌクレオチド、ならびに
ｆ．ヘアピン２領域における各ヌクレオチド。
いくつかの実施形態では、Ｂ３−Ｂ６は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡは、５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８における２’Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５における２’Ｆ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端部の３’末端における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける２’Ｆ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、ならびに以下の位置：
ａ．下部ステム領域におけるＬＳ９およびＬＳ１０、
ｂ．ネクサス領域におけるＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８、ならびに
ｃ．ヘアピン２領域におけるＨ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、およびＨ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むことが包含する
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端部における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドの３つにおける２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＬＳ１および／またはＬＳ６における任意選択による２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の任意選択による２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｇ．３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および任意選択により、
５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾、ならびに
ａ．５’末端部の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＬＳ１〜ＬＳ６における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｇ．３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択により、
５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方を含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＬＳ２〜ＬＳ５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＬＳ１およびＬＳ６における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｈ．３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択により
５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｇ．３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ならびに任意選択により、５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｈ．３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ならびに任意選択により、５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における２’−Ｏ−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｈ．３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択により
５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｇ．３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択により
５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．ＬＳ９およびＬＳ１０における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｄ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｅ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｇ．Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｈ．３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択により
５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｅ．Ｈ２−１〜Ｈ２−８における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｆ．Ｈ２−９〜Ｈ２−１５における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｇ．３’末端部における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｈ．３’末端部における最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択により
５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．５’末端部の５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｂ．ＵＳ１〜ＵＳ１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｃ．Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、およびＨ１−１２における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｄ．Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、およびＨ１−１１における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｅ．ヘアピン１とヘアピン２との間の２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｆ．Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
ｇ．Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ｈ．３’末端部における最後から２番目および最後から４番目における２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｉ．３’末端部の３’末端における最後から３番目および最後のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
ならびに任意選択により、５’保護末端修飾、３’保護末端修飾、または３’および５’保護末端修飾の両方をさらに含むことを包含する。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位修飾または保存領域ＹＡ修飾を含み、
ａ．ＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、およびＨ２−１５における２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
ｂ．ＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、およびＨ２−１４における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含み、任意選択により、
５’末端部の５’末端における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含み、任意選択により、
ｃ．３’末端部の３’末端における最後および最後から３番目のヌクレオチドにおける２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、ならびに／または
ｄ．３’末端部の３’末端における最後から２番目、最後から４番目、および／または最後のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
前述の修飾パターンのうちのいずれかは、上記の実施形態に示される修飾パターン、例えば、概要の項目または表１に示される修飾パターンと、それらが重複しない範囲で、組み合わせることができる。前述の修飾パターンを概要の項目または表１に示される修飾パターンと組み合わせることによって、概要の項目または表１の対照に示される修飾である、不適合な修飾がもたらされる（例えば、同じ位置が、２’−ＯＭｅおよび２’−フルオロの両方である）。
短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するｓｇＲＮＡは、例えばヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む、短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）であり、ヘアピン領域は、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドまたは６〜１０個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」）またはｓｐｙＣａｓ９等価物由来である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（「非ｓｐｙＣａｓ９」）由来ではない。いくつかの実施形態では、５〜１０個のヌクレオチドまたは６〜１０個のヌクレオチドが連続している。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、表２に示されるように、ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）を欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、例えばペアワイズまたは構造アラインメントによって決定されるように、ｓｐｙＣａｓ９の保存部分の５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）に対応するヌクレオチドを欠いている非ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、非ｓｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（「ｓａＣａｓ９」）ｓｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ヘアピン２領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の保存ヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ヘアピン１領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の保存ヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、ヘアピン２領域は、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の保存ヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは、ヘアピン１内にある。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは、ヘアピン２内にある。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは、ヘアピン１およびヘアピン２内にある。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは、ヘアピン１またはヘアピン２内にある。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは連続し、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは連続し、ヘアピン１の少なくとも一部に及ぶ。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは連続し、ヘアピン２の少なくとも一部に及ぶ。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン２の一部に及ぶ。いくつかの実施形態では、５〜１０個または６〜１０個の欠いているヌクレオチドは連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」に及ぶ。いくつかの実施形態では、５〜１０個の欠いているヌクレオチドは、配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８、５４〜６１、または５３〜６０を含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡは、ネクサス領域をさらに含み、ネクサス領域は、少なくとも１個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ネクサス領域における少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ネクサス領域における少なくとも１〜２、１〜３、１〜４個のヌクレオチド、１〜５個のヌクレオチド、１〜６個のヌクレオチド、１〜１０個のヌクレオチド、または１〜１５個のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ネクサス領域における各ヌクレオチドを欠いている。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ガイド領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、短いｓｇＲＮＡの５’末端における最初の１〜１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、少なくとも５、６、７、８，９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、１７個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、１８個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、１９個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ガイド領域の選択は、編集のための目的の遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。例えば、いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、目的の遺伝子の標的配列に相補的であるガイド領域を含む。
いくつかの実施形態では、目的の遺伝子における標的配列は、短いｓｇＲＮＡのガイド領域に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのガイド領域とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのガイド領域および目的の遺伝子の標的配列は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、短いｓｇＲＮＡのガイド領域および目的の遺伝子の標的領域は、少なくとも１ミスマッチを含み得る。例えば、短いｓｇＲＮＡのガイド領域および目的の遺伝子の標的配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを含み得、標的配列の全長は、少なくとも約１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのガイド領域および目的の遺伝子の標的領域は、１〜６つのミスマッチを含み得、ガイド配列は、少なくとも約１７、１８、１９、２０個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのガイド領域および目的の遺伝子の標的領域は、１、２、３、４、５、または６つのミスマッチを含み得、ガイド配列は、約２０個のヌクレオチドを含む。５’末端部は、ガイド領域とみなされない（すなわち、Ｃａｓ９タンパク質を標的核酸に誘導するように機能しない）ヌクレオチドを含み得る。
修飾された短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは修飾されている。本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡの文脈における「修飾された」または「修飾」という用語は、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’または３’保護末端修飾を含む、５’末端修飾または３’末端修飾、（ｂ）塩基の置換または除去を含む、核酸塩基（または「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’、および／または４’位における修飾を含む、糖修飾、（ｄ）ヌクレオシド間結合修飾、ならびに（ｅ）ホスホジエステル結合および／またはリボース糖の修飾または置換を含むことができる、骨格修飾を含む、上記の修飾を含む。所与の位置におけるヌクレオチドの修飾は、ヌクレオチドの糖の直ぐ３’側のホスホジエステル結合の修飾または置換を含む。したがって、例えば、５’末端から１番目と２番目の糖の間にホスホロチオエートを含む核酸は、１位に修飾を含むとみなされる。「修飾された短いｓｇＲＮＡ」という用語は、一般に、本明細書に詳細に記載されかつ例示される、ヌクレオチドホスフェートを含む、塩基、糖、およびホスホジエステル結合または骨格部分のうちの１つ以上の化学構造の修飾を有する、短いｓｇＲＮＡを指す。
修飾の例示的パターンを表１に示す。追加の例示的パターンを以下に考察する。
ガイド領域および／またはＹＡ部位の修飾
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８，９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のＹＡ部位を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンは、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニンは修飾（アデニンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間結合を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンおよびアデニンは、糖、塩基、またはヌクレオシド間結合修飾等の修飾を含む。ＹＡ修飾は、本明細書に記載される修飾の種類のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、または２’−フルオロのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、２’−Ｈ、イノシン、または２’−フルオロのうちの１つ以上を含むピリミジン修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、１つ以上のＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボース類似体（例えばＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボース類似体（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含み、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
ＹＡ部位の修飾を含む、ガイド領域の修飾
いくつかの実施形態では、ガイド領域は、ＹＡ修飾を含み得る、１、２、３、４、５個またはそれ以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」）を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する１つ以上のＹＡ部位（「５末端」等は、ガイド領域の５位〜３’末端、すなわち、ガイド領域中の最も３’のヌクレオチドを指す）は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する２つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する３つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する４つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する５つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある。例えば、修飾ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１０個のヌクレオチド内にあり、ガイド領域が、２０個のヌクレオチド長である場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位の修飾ヌクレオチドは、１１〜２０位のいずれかに位置する。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドからＹＡ部位２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１のヌクレオチド内に位置する。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端ヌクレオチドから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドに位置する。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４、５、６、７、８、９、１０、または１１である。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端修飾以外である。例えば、短いｓｇＲＮＡは、本明細書に記載の５’末端修飾を含み得、修飾ガイド領域ＹＡ部位をさらに含むことができる。あるいは、短いｓｇＲＮＡは、非修飾５’末端および修飾ガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。あるいは、短いｓｇＲＮＡは、修飾５’末端および非修飾ガイド領域ＹＡ部位を含むことができる。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む。例えば、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４が２’−ＯＭｅ修飾のみを含み、ヌクレオチド５がＹＡ部位のピリミジンであり、ホスホロチオエートを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位（ヌクレオチド４）の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾（ホスホロチオエート）を含む。別の例では、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４がＹＡ部位のピリミジンであり、２’−ＯＭｅを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチド（ヌクレオチド１〜３のいずれか）が含まない修飾（２’−ＯＭｅ）を含む。この条件はまた、非修飾ヌクレオチドが修飾ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する場合、常に満たされる。
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、上記ＹＡ部位について記載される修飾を含む。
ガイド領域ＹＡ部位修飾を含むガイド領域修飾の追加の実施形態は、上記の概要、および上記のＹＡ部位における修飾を含む修飾を含むｇＲＮＡの考察、ならびに本明細書の他の箇所を含む、本明細書の他の箇所に記載される。短いｓｇＲＮＡのガイド領域は、本明細書に記載の修飾ガイド領域を含む任意の実施形態に従って修飾され得る。本開示の他の箇所に記載される任意の実施形態は、実現可能な範囲で、先行実施形態のいずれかと組み合わせ得る。
保存領域ＹＡ部位の修飾
保存領域ＹＡ部位１〜１０を図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存領域ＹＡ部位は、修飾を含む。
いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、８、または１および８は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、２、３、４、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位２、３、４、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、２、３、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位２、３、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位１、２、３、４、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８つの追加の保存領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、１、２、３、または４つの保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８つの追加の保存領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾保存領域ＹＡ部位は、上記ＹＡ部位について記載される修飾を含む。
保存領域ＹＡ部位修飾のさらなる実施形態は、上記の概要に示される。本開示の他の箇所に記載される任意の実施形態は、実現可能な範囲で、先行実施形態のいずれかと組み合わせ得る。
末端部ヌクレオチドの修飾
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡの５’および／または３’末端部領域が修飾されている。
３’末端部領域修飾
いくつかの実施形態では、３’末端部領域における１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドが修飾されている。全体を通して、この修飾は「３’末端修飾」と称され得る。いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個が修飾されている。いくつかの実施形態では、３’末端部領域における末端（すなわち、最後の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が修飾されている。いくつかの実施形態では、３’’末端部領域における末端（すなわち、最後の）の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも３個が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾はＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、３’末端部領域の修飾は、３’保護末端修飾である。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、３’保護末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される、修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、３個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、４個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、５個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、６個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、７個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１〜７個または１〜５個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ｇＲＮＡの３’末端における１、２、３、４、５、６、または７つのヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ｇＲＮＡの３’末端における約１〜３、１〜５、１〜６、または１〜７つのヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、１個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含み、結合は、最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間にある。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の３個のヌクレオチド間の２個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の４個のヌクレオチド間の４個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の４個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の５個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の間のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、最後の１〜７個のヌクレオチドのうちの１個以上の修飾を含むかまたはさらに含み、修飾は、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる最後のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、３’テールの隣りのヌクレオチドおよび／または最初のヌクレオチドへの１つまたは２個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる最後および／または最後から２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、および／または最後から３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、および／または最後から４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾は、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせにより最後、最後から２番目、最後から３番目、最後から４番目、および／または最後から５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｇＲＮＡは、３’テールを含むかまたはさらに含み、３’テールは、３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’テールは完全に修飾されている。いくつかの実施形態では、３’テールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチドを含み、任意選択により、これらのヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上が修飾されている。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、配列番号１〜５４のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、３’保護末端修飾を含むｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むａｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｓｇＲＮＡの保存領域または短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドからの５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、ｓｇＲＮＡの保存領域または短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含むｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後のヌクレオチド由来の１５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続する２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含むｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける、交互する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む、短いｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、（ｉ）２または３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、３’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、３’末端修飾は、最後のヌクレオチドと最後の隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）１５または２０個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合を含む、短いｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾および３’末端修飾を含む。
３’テール
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、短いｓｇＲＮＡの保存部分が続き、かつ、該保存部分の３’側にある、３’テールを含む３’末端部を含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１〜約２０個のヌクレオチド、１〜約１５個のヌクレオチド、１〜約１０個のヌクレオチド、１〜約５個のヌクレオチド、１〜約４個のヌクレオチド、１〜約３個のヌクレオチド、および１〜約２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、２個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、３個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、４個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜５、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、３’テールは、１〜２０個のヌクレオチドを含み、短いｓｇＲＮＡの保存部分の３’末端に続く。
いくつかの実施形態では、３’テールは、保護末端修飾、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、３’テールは、１つ以上のヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上の２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１つ以上の２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１つ以上の２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１つ以上の反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、１個以上の保護末端修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、３’テールは、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および反転した脱塩基修飾ヌクレオチドのうちの１個以上の組み合わせを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’テールを含まない。
５’末端部領域修飾
いくつかの実施形態では、５’末端部領域が修飾され、例えば、短いｓｇＲＮＡの最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドが修飾されている。全体を通して、この修飾は「５’末端修飾」と称され得る。いくつかの実施形態では、５’末端部領域の最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドは、２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端の末端における、末端部の（すなわち、最初の）１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドのうちの少なくとも１個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部領域における１、２、３、４、５、６、または７個の末端部ヌクレオチドのうちの少なくとも２個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部領域における１、２、３、４、５、６、または７個の末端部ヌクレオチドのうちの少なくとも３個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５’保護末端修飾である。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡの５’および３’末端部領域（例えば、末端）の両方が修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡの５’末端部領域のみが修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡの保存部分の３’末端部領域（プラスまたはマイナス３’テール）のみが修飾されている。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、短いｓｇＲＮＡの５’末端部領域における最初の７個のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’末端部領域における７個の末端部のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部領域における最初の４個のヌクレオチドのうちの２、３、もしくは４個、および／または３’末端部領域における末端部の４個のヌクレオチドのうちの２、３、もしくは４個が修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部領域における最初の４個のヌクレオチドのうちの２、３、または４個は、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合されている。
いくつかの実施形態では、５’末端および／または３’末端の修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）または２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチドへの２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、保護末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、保護末端修飾、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および反転した脱塩基ヌクレオチドから選択される２つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、等価な修飾が含まれる。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間の１個以上のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’末端部における最後の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間の１個以上のＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’末端部における最後の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間、および５’末端部の５’末端からの最初の１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチド間両方の１個以上のＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、ＰＳ結合に加えて、５’および３’末端部ヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾を含み、例えば、ガイド領域の１番目のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾を含み、ガイド領域の１番目のヌクレオチドは、５’保護末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される、修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡのガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１個以上の修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、１個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、３個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、４個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、６個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、７個の修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、１〜７、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５’末端からの１、２、３、４、５、６、または７個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、５’末端からの約１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、または１〜７個のヌクレオチドの修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡの５’末端における１番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡの５’末端から１番目および２番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡの５’末端から１番目、２番目、および３番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡの５’末端から１番目、２番目、３番目、および４番目ヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡの５’末端から１番目、２番目、３番目、４番目、および５番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡの５’末端からの１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、および６番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、短いｓｇＲＮＡの５’末端からの１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、および７番目のヌクレオチドにおける修飾を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および／もしくは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および／もしくは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および／もしくは２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および／もしくは反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびに／またはそれらの組み合わせを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１、２、３、４、５、６、および／または７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、または１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含み、１個のＰＳ結合が存在する場合、結合は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間にある。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも２個のＰＳ結合を含むかまたはさらに含み、結合は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、および２と３との間にある。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、クレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、および４と５との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５、および５と６との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、５と６との間、および７と８との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちの１個以上の修飾を含むかまたはさらに含み、修飾は、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、および／またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによるガイド領域の最初のヌクレオチドの修飾、および隣りのヌクレオチドへの任意選択によるＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによるガイド領域の第１番目および／または第２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間および／または２番目と３番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、および／または３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間、２番目と３番目のヌクレオチドの間、および／または３番目と４番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、および／または４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間、２番目と３番目のヌクレオチドの間、３番目と４番目のヌクレオチドの間、および／または４番目と５番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせによる可変領域の１番目、２番目、３番目、４番目、および／または５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１番目と２番目のヌクレオチドの間、２番目と３番目のヌクレオチドの間、３番目と４番目のヌクレオチドの間、４番目と５番目のヌクレオチドの間、および／または５番目と６番目のヌクレオチドの間に１個以上のＰＳ結合を含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、配列番号１〜５４のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’保護末端修飾を含む５’末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域の１、２、３、４、およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域の１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域の１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４および５、および５と６との間のＰＳ結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾および３’末端修飾を含む、短いｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’および３’末端部における修飾ヌクレオチド、ならびに表３に記載される１つ以上の他の領域における修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’または３’末端におけるものではない修飾ヌクレオチドを含む。修飾の例示的パターンを以下および表１に記載する。
上部ステム修飾
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、ＹＡ部位における１、２、３、４、または５つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、少なくとも１、２、３、４、または５つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、１つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含むｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾は、３つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位にある。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、上部ステム修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、上部ステム修飾は、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および／またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、表１の配列のうちのいずれか１つに示される上部ステム修飾を含む。いくつかの実施形態では、そのような上部ステム修飾は、例えば表１中の対応する配列について示される５’保護末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのような上部ステム修飾は、例えば表１中の対応する配列について示される３’保護末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのような上部ステム修飾は、表１中の対応する配列について示される５’末端修飾および３’末端修飾と組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾および上部ステム修飾を含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’末端修飾および上部ステム修飾を含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾、３’末端修飾、および上部ステム修飾を含む。
ヘアピン修飾
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ヘアピン領域における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、および／またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、ヘアピン１領域内にある。いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、ヘアピン２領域内にある。いくつかの実施形態では、修飾は、ヘアピン１およびヘアピン２領域内にあり、任意選択により、ヘアピン１と２との間の「ｎ」も修飾されている。
いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、ＹＡ部位における１、２、または３つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、１つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾を含む短いｓｇＲＮＡが提供され、ヘアピン修飾は、２つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾は、３つのＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位にある。いくつかの実施形態では、１つ以上のＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピン修飾は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む。
いくつかの実施形態では、ヘアピン領域修飾は、２’Ｈ修飾ヌクレオチド（ＤＮＡ）、ＰＳ修飾ヌクレオチド、ＹＡ修飾、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、および／またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’末端修飾、およびヘアピン領域における修飾を含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾、およびヘアピン領域における修飾を含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、上部ステム修飾、およびヘアピン領域における修飾を含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、表１の配列のうちのいずれか１つに示されるヘアピン修飾を含む。いくつかの実施形態では、そのようなヘアピン修飾は、表１中の対応する配列について示される５’末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのようなヘアピン修飾は、表１中の対応する配列について示される３’末端修飾と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、そのようなヘアピン修飾は、表１中の対応する配列について示される５’末端修飾および３’末端修飾と組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’末端修飾、ヘアピン領域における修飾、上部ステム修飾、および５’末端修飾を含む。
例示的な修飾された短いｓｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の短いｓｇＲＮＡは、表１に示される配列のいずれかを含むかまたはそれからなる。さらに、表１に示される配列のうちの任意の修飾を含み、表１で配列番号によって識別される短いｓｇＲＮＡが包含される。すなわち、ヌクレオチドは、同一であってもまたは異なっていてもよいが、示される修飾パターンは、表１のガイド配列の修飾パターンと同一であってもまたは類似していてもよい。修飾パターンは、短いｓｇＲＮＡ（例えば５’末端部領域、下部ステム領域、バルジ領域、上部ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、３’テール領域）の修飾の相対的位置および同一性を含む。
いくつかの実施形態では、修飾パターンは、表１の配列の縦列に示される配列のうちのいずれか１つの修飾の、または配列の少なくとも１つ以上の領域にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％を含む。いくつかの実施形態では、修飾パターンは、表１の配列の縦列に示される配列のうちのいずれか１つの修飾パターンと少なくとも５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、および約９９％同一である。いくつかの実施形態では、修飾パターンは、表１に示される配列の１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８）の領域、例えば、５’末端部領域、下部ステム領域、バルジ領域、上部ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、および／または３’末端部領域にわたって、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。
例えば、いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、５’末端部領域にわたる配列の修飾パターンと少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、下部ステムにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、バルジにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、上部ステムにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、ネクサスにわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、ヘアピン１にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、ヘアピン２にわたって少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡが包含され、修飾パターンは、３’末端にわたって少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、修飾パターンは、０、１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドにおける、表１の配列またはそのような配列の領域（例えば、５’末端、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端）の修飾パターンとは異なる。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドにおける、表１の配列の修飾とは異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドにおける、表１の配列の領域（例えば、５’末端部、下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端部）の修飾とは異なる修飾を含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＹＡ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端修飾、３’末端修飾、または５’末端修飾および３’末端修飾、例えば、保護末端修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合、ならびに２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含む。末端修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）、および／または２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾を含み得る。等価末端修飾はまた、本明細書に記載される実施形態によって包含される。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、短いｓｇＲＮＡの１つ以上の領域の修飾と組み合わせて、末端修飾を含む。
上記の５’末端修飾、３’末端修飾、上部ステム修飾、ヘアピン修飾、および３’末端修飾の組み合わせを含む修飾された短いｓｇＲＮＡが包含される。例示的な修飾された短いｓｇＲＮＡを以下に記載する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、および３０１〜３５４に記載される配列のうちのいずれか１つを含むかまたはそれからなる、短いｓｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２０１〜２５４、および３０１〜３５４の修飾配列のうちのいずれか１つを含む短いｓｇＲＮＡが提供され、短いｓｇＲＮＡは、標的配列に相補的なガイド領域をさらに含み、切断のためにＣａｓ９をその標的に誘導する。いくつかの例では、本発明は、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、および３０１〜３５４のうちのいずれか１つの核酸と少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含む短いｓｇＲＮＡを含み、修飾パターンは、表１の参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドを結合する３個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドを結合する３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、５’末端における最初の４個のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３または４個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３または４個のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合されている。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｆを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−ｍｏｅを含む。
いくつかの実施形態では、言及されるヌクレオチドが短いｓｇＲＮＡに存在する場合、短いｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、３’末端（ｓｇＲＮＡの３’テールまたは保存部分）における最後の４個のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個における修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ＰＳ結合で結合され、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ＰＳ結合で結合され、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、言及されるヌクレオチドが短いｓｇＲＮＡに存在する場合、短いｓｇＲＮＡが提供され、ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２が、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのバルジ領域におけるヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡの上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのヘアピン１領域に残存するクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡのヘアピン２領域に残存するクレオチドの各々は、２’−Ｏ−Ｍｅにより修飾されている。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾、ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含む、短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’末端の最初の７個のヌクレオチド内に少なくとも２個のホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾、ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含む、短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’末端における１個以上のホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、１個以上のホルホチオエート結合は、５’末端部ヌクレオチドを結合する。
いくつかの実施形態では、５’末端修飾、ならびに上部ステム領域、ヘアピン１領域、およびヘアピン２領域の１つ以上における１つ以上の修飾を含む、短いｓｇＲＮＡが提供され、５’末端修飾は、５’末端の最初の７個のヌクレオチド内に１個以上のホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２０１〜２５４、および３０１〜３５４の修飾配列のうちのいずれか１つを含む短いｓｇＲＮＡを含み、短いｓｇＲＮＡは、標的配列に少なくとも部分的に相補的な５’ガイド領域をさらに含み、任意選択により、切断のためにＣａｓ９をその標的に誘導する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、および３０１〜３５４のうちのいずれか１個のヌクレオチドと少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有するヌクレオチドを含む短いｓｇＲＮＡを含み、修飾パターンは、参照配列識別子に示される修飾パターンと同一である。すなわち、ヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｃ、およびＧは、配列に示されるものと比較して、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％異なり得るが、修飾は、変化しないままである。
いくつかの実施形態では、言及されるヌクレオチドが短いガイドに存在する場合、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、下部ステムにおけるＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２、バルジ領域におけるＢ１およびＢ２、上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々、ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８、ヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々、ヘアピン１とヘアピン２との間の１個のヌクレオチド、ヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む短いｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、言及されるヌクレオチドが短いガイドに存在する場合、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、下部ステムにおけるＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、およびＬＳ１２、バルジ領域におけるＢ１〜Ｂ６、上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々、ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、およびＮ１８、ヘアピン１領域におけるヌクレオチドの各々、ヘアピン１とヘアピン２との間の１個のヌクレオチド、ヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々、ならびに３’末端部における最後の４個のヌクレオチドにおける、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む短いｓｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、下部ステムにおけるＬＳ９およびＬＳ１０、ネクサス領域における１５−Ｎ１８、ヘアピン２領域におけるＨ２−９〜ＨＳ−１５、ならびに３’末端部領域における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、ｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、下部ステムにおける各ヌクレオチド、ネクサス領域における１５〜Ｎ１８、ヘアピン２領域におけるＨ２−９〜ＨＳ−１５、ならびに３’末端部領域における最後から２番目、最後から３番目、および最後から４番目のヌクレオチドにおける、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、短いｓｇＲＮＡが提供される。
いくつかの実施形態では、言及されるヌクレオチドが短いガイドに存在する場合、ＬＳ８、ＬＳ１０、ＬＳ１２、Ｈ１−２、Ｈ１−４、Ｈ１−６、Ｈ１−８、Ｈ１−１０、Ｈ１−１２、Ｈ２−１、Ｈ２−３、Ｈ２−５、Ｈ２−７、Ｈ２−９、Ｈ２−１１、Ｈ２−１３、Ｈ２−１５、および３’末端における最後および最後から３番目のヌクレオチドにおける２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびにＬＳ７、ＬＳ９、ＬＳ１１、Ｈ１−１、Ｈ１−３、Ｈ１−５、Ｈ１−７、Ｈ１−９、Ｈ１−１１、Ｈ１−１３、Ｈ２−２、Ｈ２−４、Ｈ２−６、Ｈ２−８、Ｈ２−１０、Ｈ２−１２、Ｈ２−１４、および３’末端における最後から２番目および最後から４番目のヌクレオチドにおける２’−Ｆ修飾を含む、短いｓｇＲＮＡが提供される。
前述の修飾パターンのうちのいずれかは、上記の実施形態に示される修飾パターン、例えば、概要の項目または表１に示される修飾パターンと、それらが重複しない範囲で、組み合わせることができる。前述の修飾パターンを概要の項目または表１に示される修飾パターンと組み合わせることによって、不適合な修飾をもたらす場合（例えば、同じ位置が、２’−ＯＭｅおよび２’−フルオロの両方である）、概要の項目または表１に示される修飾は対照である。
組成物およびキット
本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）のうちのいずれか、および担体、賦形剤、または希釈剤等を含む組成物が包含される。いくつかの例では、賦形剤または希釈剤は不活性である。いくつかの例では、賦形剤または希釈剤は不活性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）のいずれかおよび薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤等とを含む医薬製剤が提供される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、ＬＮＰをさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、ＬＮＰ、およびＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含む。
本明細書に記載の１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、組成物、または医薬製剤を含むキットも提供される。いくつかの実施形態では、キットは、それぞれが組成物または医薬製剤、説明書、または乾燥剤とは別個である、溶媒、溶液、緩衝液の１つ以上をさらに含む。
ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤またはＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含む組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）およびヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、組成物または医薬製剤が提供される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤、例えばＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）とともに、短いｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと称される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤を標的核酸配列に誘導するように、短いｓｇＲＮＡとともに機能するものである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質、例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｙｐＣａｓ９）由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの短いｓｇＲＮＡおよびヌクレアーゼまたはｓｐｙＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来ではなく、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に特異的であるｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡが、非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をその標的部位に誘導するように、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と同様に機能する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質、例えばＳａＣａｓ９に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの短いｓｇＲＮＡおよびヌクレアーゼまたはｓａＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二重鎖切断を誘発する。ｓｐｙＣａｓ９およびｓａＣａｓ９タンパク質の等価物は、本明細書に記載される実施形態により包含される。
Ｃａｓ９を含むＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、修飾およびそのバリアントを包含する。不活性な１個の触媒ドメインであるＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれかを有する修飾バージョンは、「ニッカーゼ」と称される。ニッカーゼは、標的ＤＮＡ上の１つの鎖のみを切断し、したがって一本鎖切断を生じる。一本鎖切断はまた、「ニック」としても知られ得る。いくつかの実施形態では、組成物および方法はニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、組成物および方法は、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断ではなくニック（ｎｉｃｋ）を誘導する、ニッカーゼＣａｓ９等のＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤を含む。
いくつかの実施形態ではＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、１個の機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、核酸切断活性を低減するために、ヌクレアーゼドメインの１つが変異するか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態では、不活性ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態では、不活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤のヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または変化させるために置換されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に基づく）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換は、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、およびＤ９８６Ａ（ｓｐｙＣａｓ９タンパク質に基づく）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＰ複合体は、それぞれ、ニッカーゼまたはニッカーゼをコードするｍＲＮＡ、ならびにそれぞれ標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖に相補的な一対のｇＲＮＡ（その一方または両方は、ｓｇＲＮＡおよび／または短いｓｇＲＮＡであり得る）を含む。この実施形態では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡおよび／または短いｓｇＲＮＡ）は、ニッカーゼを標的配列に誘導し、標的配列の反対側の鎖にニックを生じさせること（すなわち二重ニッキング（ｄｏｕｂｌｅ ｎｉｃｋｉｎｇ））によって二重鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。いくつかの実施形態では、二重ニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、標的ＤＮＡにおいて二重ニックを生成するために、ＤＮＡの反対側の鎖を標的化する２つの別個の短いｓｇＲＮＡとともに使用される。いくつかの実施形態では、ニッカーゼＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤は、標的ＤＮＡに二重ニックを生成するために、近接した位置にあるよう選択された２つの別個のｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡおよび／または短いｓｇＲＮＡ）とともに使用される。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓタンパク質が使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は修飾されたヌクレアーゼであってもよい。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、異種機能ドメインに結合した触媒不活性Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）を含む融合タンパク質を含む（例えば、ＷＯ２０１４１５２４３２を参照のこと）。いくつかの実施形態では、触媒不活性Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である。いくつかの実施形態では、触媒不活性Ｃａｓは、Ｃａｓを不活性化する変異を含む。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、遺伝子発現、ヒストン、またはＤＮＡを修飾するドメインである。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインである。
いくつかの実施形態では、標的配列は、ＰＡＭに隣接し得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端に隣接するか、またはその１、２、３、または４個のヌクレオチド内にあり得る。ＰＡＭの長さおよび配列は、使用されるＣａｓタンパク質に依存し得る。例えば、ＰＡＭは、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２０：１８６−１９１（２０１５）の図１に開示されるものを含む、コンセンサス配列または特定のＣａｓ９タンパク質もしくはＣａｓ９オーソログに対する特定のＰＡＭ配列から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド長を含み得る。非限定的な例示的なＰＡＭ配列は、ＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＴＴＮ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧ、ＮＡＡＡＡＮ、ＮＮＡＡＡＡＷ、ＮＮＮＮＡＣＡ、ＧＮＮＮＣＮＮＡ、およびＮＮＮＮＧＡＴＴを含む（Ｎは、いずれかのヌクレオチドとして定義され、Ｗは、ＡまたはＴのいずれかとして定義され、ＲはＡまたはＧのいずれかとして定義される）。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧＮＧであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＮＡＡＡＡＷであり得る。
いくつかの実施形態では、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９等のＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、その最小アデニン含有量〜その最小アデニン含有量の約１５０％の範囲のアデニン含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのアデニン含有量は、その最小アデニン含有量の約１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％以下である。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量に等しいアデニン含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１５０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１４５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１４０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１３５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１３０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１２５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１２０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１１５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１１０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１０５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１０４％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１０３％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１０２％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニン含有量の約１０１％以下を有する。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量〜その最小アデニンジヌクレオチド含有量の２００％の範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのアデニンジヌクレオチド含有量は、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１９５％、１９０％、１８５％、１８０％、１７５％、１７０％、１６５％、１６０％、１５５％、１５０％、１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％以下である。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量に等しいアデニンジヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約２００％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１９５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１９０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１８５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１８０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１７５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１７０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１６５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１６０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１５５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量に等しいアデニンジヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１５０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１４５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１４０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１３５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１３０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１２５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１２０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１１５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１１０％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０５％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０４％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０３％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０２％以下を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量の約１０１％以下を有する。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から、懸案のｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニンジヌクレオチド含有量の９０％以下であるアデニンジヌクレオチド含有量までの範囲の、アデニンジヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのアデニンジヌクレオチド含有量は、懸案のｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニンジヌクレオチド含有量の約８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下である。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０個のアデニントリヌクレオチド〜１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０個のアデニントリヌクレオチドの範囲のアデニントリヌクレオチド含有量を有する（より長いアデニンは、その中の特有の３個のアデニンセグメントの数として計数する、例えば、アデニンテトラヌクレオチドは、２個のアデニントリヌクレオチドを含み、アデニンペンタヌクレオチドは、３個のアデニントリヌクレオチドを含む等）を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０％のアデニントリヌクレオチド〜０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、または２％のアデニントリヌクレオチドの範囲のアデニントリヌクレオチド含有量を有し、アデニントリヌクレオチド含有量は、アデニントリヌクレオチドの一部を形成するアデニン（またはより長いアデニン）によって占有される配列における位置の割合として計算され、その結果、配列ＵＵＵＡＡＡおよびＵＵＵＵＡＡＡＡはそれぞれ、５０％のアデニントリヌクレオチド含有量を有することになる。例えば、いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、２％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。例えば、いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、１．５％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、１％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．９％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．８％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．７％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．６％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．５％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．４％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．３％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．２％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、０．１％以下のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、アデニントリヌクレオチドを含まないＯＲＦを含むＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードする核酸が提供される。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、その最小アデニントリヌクレオチド含有量〜懸案のｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニントリヌクレオチド含有量の９０％以下であるアデニントリヌクレオチド含有量の範囲のアデニントリヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのアデニントリヌクレオチド含有量は、懸案のｍＲＮＡと同じタンパク質をコードする参照配列の最大アデニントリヌクレオチド含有量の約８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下である。
例えば、ＯＲＦの十分な分画で最小アデニンコドンを使用することによって、所与のＯＲＦはアデニン含有量またはアデニンジヌクレオチド含有量またはアデニントリヌクレオチド含有量について低減され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤のアミノ酸配列は、アミノ酸をコドンに変換することによってＯＲＦ配列に逆翻訳することができ、ＯＲＦの一部または全ては、以下に示される例示的な最小アデニンコドンを使用する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％が、表４に列挙されるコドンである。
Figure 2021526804
いくつかの実施形態では、コドンの少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、または約１００％が表４に列挙されるコドンであるコドンのセットからなるＯＲＦを含む、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９等のＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、最小ヌクレオチドホモポリマー、例えば、同じヌクレオチドの反復ストリングを有する。例えば、いくつかの実施形態では、表４に列挙されるコドンから最小ウリジンコドンを選択するとき、核酸は、ヌクレオチドホモポリマーの数および長さを減少させる最小アデニンコドンを選択すること、例えば、アラニンについてはＧＣＣの代わりにＧＣＧを選択すること、またはグリシンについてはＧＧＧの代わりにＧＧＣを選択することによって構築される。
先行実施形態のいずれにおいても、核酸はｍＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示されるコドンセット（例えば、低Ｕ、低Ａ、または低Ａ／Ｕコドンセット）由来のコドンである。低Ｕ、低Ａ、および低Ａ／Ｕセット中のコドンは、２つ以上の選択肢が利用可能である高発現ｔＲＮＡに対応するコドンも使用しつつ、示されるヌクレオチドを最小限にする。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示される低Ｕコドンセット由来のコドンである。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示される低Ａコドンセット由来のコドンである。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ中のコドンの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％は、表５に示される低Ａ／Ｕコドンセット由来のコドンである。
Figure 2021526804
例示的な配列
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦは、配列番号３５０２〜３５２２、３５２５、３５２６、または３５２９〜３５４６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有する配列を含み、および／またはＯＲＦは、少なくとも最初の５０、２００、２５０、または３００個のヌクレオチドにわたって、配列番号３５０２〜３５２２、３５２５、３５２６、または３５２９〜３５４６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有し、または少なくとも最初の３０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、または３００個のヌクレオチドにわたって配列番号３５０２〜３５２２、３５２５、３５２６、または３５２９〜３５４６のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有し、および／またはＯＲＦは、コドンの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％のコドンが表４または表５に列挙されるコドンであるコドンのセットからなり、および／またはＯＲＦは、その最小アデニン含有量からその最小アデニン含有量の１２３％の範囲のアデニン含有量を有し、ならびに／あるいはＯＲＦは、その最小アデニンジヌクレオチド含有量から最小アデニンジヌクレオチド含有量の１５０％までの範囲のアデニンジヌクレオチド含有量を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３５０２〜３５２２、３５２５、３５２６、または３５２９〜３５４６のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３５０１、３５２３、３５２４、または３５２７のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、配列は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３５０１、３５２３、３５２４、または３５２７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、配列は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含み、配列番号３５０１、３５２３、３５２４、または３５２７の最初の３個のヌクレオチドが省かれる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３５０１、３５２３、３５２４、または３５２７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、配列は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合剤をコードするＯＲＦを含み、配列番号３５０１、３５２３、３５２４、または３５２７の最初の３個のヌクレオチドが省略され、および／あるいは配列番号３５０１、３５２３、３５２４、または３５２７内に含まれるＯＲＦコード配列が、配列番号３５０２〜３５２２、３５２５、３５２６、または３５２９〜３５４６のうちのいずれか１つのコード配列で置換されている。いくつかの実施形態では、前述の同一性レベルのいずれかは、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％である。
遺伝子調節方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、組成物、または医薬製剤のうちのいずれか１つ以上は、対象における疾患または障害を治療または予防するための医薬の調製において使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、組成物、または医薬製剤のうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、対象における疾患または障害を治療または予防する方法を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、組成物、または医薬製剤のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、標的ＤＮＡを修飾する方法または使用を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、組成物、または医薬製剤のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、標的遺伝子の調節のための方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、調節は、標的遺伝子の編集である。いくつかの実施形態では、調節は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化である。
いくつかの実施形態では、方法または使用は、遺伝子編集をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、標的遺伝子内の二本鎖切断をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、ＤＳＢの非相同性末端結合中にインデル変異の形成をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、標的遺伝子におけるヌクレオチドの挿入または欠失をもたらす。いくつかの実施形態では、標的遺伝子におけるヌクレオチドの挿入または欠失は、非機能性タンパク質をもたらすフレームシフト変異または未成熟終止コドンをもたらす。いくつかの実施形態では、標的遺伝子におけるヌクレオチドの挿入または欠失は、標的遺伝子発現のノックダウンまたは除去をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、ＤＳＢの相同性誘導修復を含む。いくつかの実施形態では、方法または使用は、鋳型を細胞に送達することをさらに含み、鋳型の少なくとも一部は、ヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断部位においてまたはその付近で標的ＤＮＡに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、方法または使用は、遺伝子調節をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子調節は、遺伝子発現の増加または減少、ＤＮＡのメチル化状態の変化、またはヒストンサブユニットの修飾である。いくつかの実施形態では、方法または使用は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の増加または減少をもたらす。
ｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）の有効性をインビトロおよびインビボで試験することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、組成物、または医薬製剤の１つ以上を含み、短いｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡとともに細胞に提供されるときに、遺伝子調節をもたらす。いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡの有効性は、インビトロまたはインビボで測定することができすることができる。
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡを含むＣａｓ ＲＮＰの活性は、非修飾ｓｇＲＮＡ、またはＹＡ部位修飾等のｓｇＲＮＡもしくは短いｓｇＲＮＡに存在する修飾を欠いている参照ｓｇＲＮＡを含むＣａｓ ＲＮＰの活性と比較される。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質発現の増加または減少におけるｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの効率は、標的タンパク質の量を測定することによって決定される。
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡによる編集効率は、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの送達後のゲノム中の標的位置に存在する編集によって決定される。いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡによる編集効率は、次世代シーケンシングによって測定される。いくつかの実施形態では、目的の標的領域の編集の割合が決定される。いくつかの実施形態では、配列読み取りの総数に対する、目的の標的領域へのヌクレオチドの挿入または欠失を有する読み取りの総数は、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の送達後に測定される。
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡによる編集効率は、成功した遺伝子編集によって導入されたヌクレオチドの挿入または欠失の存在によって測定される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの活性は、生化学アッセイで試験される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの活性は、無細胞切断アッセイで試験される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの活性は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞で試験される。
いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡの活性は、修飾ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰのインビボ投与後に測定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるｇＲＮＡまたは組成物のインビボ有効性は、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の投与後に組織（例えば、肝臓組織）から抽出されたＤＮＡにおいて測定される編集の有効性によって決定される。
いくつかの実施形態では、対象の免疫応答の活性化は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはタンパク質とともにｓｇＲＮＡ（例えば、ＬＮＰ中に製剤化）のインビボ投与後におけるサイトカイン（複数可）の血清濃度によって測定される。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、および／または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ ＲＮＰまたはＣａｓ９ ｍＲＮＡを修飾ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、またはｄｇＲＮＡ）とともに投与することにより、非修飾ｓｇＲＮＡの投与と比較して、免疫サイトカインの血清濃度（複数可）が低くなる。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを投与することを含む、免疫サイトカインの対象の血清濃度を低下させる方法を含み、ｇＲＮＡは、同様に非修飾である対照ｇＲＮＡと比較して、対象の血清中でより低い濃度の免疫サイトカインを産生する。
ｇＲＮＡのＬＮＰ送達
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチドおよびタンパク質カーゴ（ｃａｒｇｏ）の送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）、組成物、または医薬製剤の送達に使用され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質とともに送達する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短いｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ）のうちのいずれか１つを対象に送達する方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰと会合する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと会合する。
いくつかの実施形態では、本発明は、開示されるｇＲＮＡおよびＬＮＰのうちのいずれか１つを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、陽イオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、別には３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９、１２−ジエノエート）とも称される、を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４．５のカチオン性脂質アミン対ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡと会合するＬＮＰは、疾患または障害を治療するための医薬の調製において使用するためのものである。
エレクトロポレーションは、カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つの送達のために、任意のエレクトロポレーション方法論が使用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよびＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡのうちのいずれか１つを送達するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つをエクスビボ細胞に送達する方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰと会合するか、またはＬＮＰと会合しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰまたはｇＲＮＡはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと会合する。
＊＊＊
この説明および例示的な実施形態は、限定として解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において、特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される量、パーセンテージ、または割合、および他の数値を表す全ての数字は、どの場合においても用語「約」によって、まだそれほど非修飾である範囲により修飾されていると理解されるべきである。「約」は、例えば１０％、５％、２％、または１％以内の、記載された主題の特性に実質的に影響を与えない変動の程度を示す。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、および均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、および任意の単語の単数形の使用は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含めることに留意されたい。本明細書で使用される「含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法上の変形は、リスト内のアイテムの列挙が、リストされたアイテムに置換または追加できる他の同様のアイテムを除外しないように、非限定的であることを意図している。
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１−材料および方法
合成ｓｇＲＮＡおよび短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）
シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）および短いシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）を、商用ベンダーにより、または表１に提供される修飾ヌクレオチドを用いた標準的なインビトロ合成技術を使用して、化学的に合成した。
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１−メチルシュードウリジンを含むキャップされたポリアデニル化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、線状プラスミドＤＮＡ鋳型およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって生成した。Ｔ７プロモーターおよび転写配列（本明細書に記載のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡを産生するため（例示的な転写物については配列番号３４９９、３５００、３５０１、３５２３、３５２４、および３５２７、ならびに例示的なＯＲＦについては配列番号３５０２〜３５２２、３５２５、３５２６、および３５２９〜３５４６を参照のこと））を含むプラスミドＤＮＡを、３７℃でインキュベートすることによって線状化して、以下の条件でＸｂａＩによる消化を完了させた。ＸｂａＩは、熱不活性化され得る。線状化プラスミドを酵素および緩衝塩から精製し、アガロースゲルにより分析して線状化を確認した。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、３７℃で２〜４時間、以下の条件下でインキュベートした：５０ｎｇ／μＬの線状プラスミド、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＮ１−メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各々、２ｍＭ、１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１ｘ反応緩衝液。４時間のインキュベーション後、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加して最終濃度０．０１Ｕ／μＬとし、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ転写クリーンアップキットを使用し、製造者のプロトコール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを酵素およびヌクレオチドから精製した。あるいは、ｍＲＮＡを沈殿プロトコールにより精製し、いくつかの場合では、これに続いてＨＰＬＣベースの精製を行った。簡潔に述べると、ＤＮａｓｅ消化後、０．２１倍体積の７．５Ｍ ＬｉＣｌ溶液を添加して混合することによりｍＲＮＡを沈殿させ、沈殿したｍＲＮＡを遠心分離によりペレット化した。上清を除去し、ｍＲＮＡを水中で再構成した。酢酸アンモニウムおよびエタノールを使用して、ＭＲＮＡを再び沈殿させた。５Ｍ酢酸アンモニウムを、２倍体積の１００％ＥｔＯＨとともにｍＲＮＡ溶液に添加して、最終濃度２Ｍとした。溶液を混合し、−２０℃で１５分間インキュベートした。沈殿したｍＲＮＡを遠心分離により再びペレット化し、上清を除去し、ｍＲＮＡを水中で再構成した。最終工程として、酢酸ナトリウムおよびエタノールを使用してｍＲＮＡを沈殿させた。１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を、２倍体積の１００％ ＥｔＯＨとともに溶液に添加した。溶液を混合し、−２０℃で１５分間培養した。沈殿したｍＲＮＡを遠心分離によって再びペレット化し、上清を除去し、ペレットを７０％冷エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。ｍＲＮＡを水中で再構成した。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡについて、ＬｉＣｌ沈殿および再構成後、ｍＲＮＡをＲＰ−ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照のこと）。プールのために選択された画分を合わせ、上記の酢酸ナトリウム／エタノール沈殿によって脱塩した。転写物濃度は、２６０ｎｍでの光吸光度を測定することによって決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡトランスフェクション
マウス細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａを１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地中で培養し、トランスフェクションの２４時間前に９６ウェルプレート中で１５，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。トランスフェクション日に、培地を細胞から吸引し、新鮮な培地に置き換えた。リポフェクタミン−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１：５０（ｖ／ｖ）希釈した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で別々に希釈した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの両方を、希釈リポフェクタミン−２０００を用いて、１：１（ｖ／ｖ）で別々に混合し、２つのリポプレックスを生成した。５分間のインキュベーション後、リポプレックスを細胞に連続して添加して、１ウェル当たり１００ｎｇのＣａｓ９ｍＲＮＡおよび０．４μＬの総リポフェクション試薬の最終濃度とした。ガイドを、３ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０３ｎＭ、および０．００３ｎＭを含む４つの用量レベルで試験した。細胞をトランスフェクションの２４時間後に溶解し、溶解物を、ＮＧＳによる編集のために分析したＰＣＲ反応において直接使用した。
初代肝細胞
初代ヒト肝臓肝細胞（ＰＨＨ）、初代カニクイザル肝臓肝細胞（ＰＣＨ）、または初代マウス肝臓肝細胞（ＰＭＨ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造者のプロトコールに従って培養した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，プロトコール１１．２８．２０１２）。簡単に述べると、細胞を解凍し、肝細胞解凍培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログＣＭ７０００）に再懸濁し、続いてＰＨＨについては１００ｇで１０分間、ＰＭＨについては１００ｇで４分間、またはＰＣＨについては８０ｇで４分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化細胞を肝細胞プレーティング培地およびサプリメントパック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＡ１２１７６０１およびＣＭ３０００）に再懸濁した。細胞を計数し、バイオコートコラーゲンＩ（Ｂｉｏ−ｃｏａｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ）をコーティングした９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，カタログ８７７２７２）上で、ＰＨＨについては３０，０００〜３５，０００細胞／ウェル、ＰＣＨについては５０，０００〜６０，０００細胞／ウェル、またはＰＭＨについては１５，０００〜２０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティングした細胞を、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気での組織培養インキュベーター中で４〜６時間放置および接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成について確認した。次いで、細胞を、無血清サプリメントパック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＡ１２１７６０１およびＣＭ４０００）を含む肝細胞維持培地／培養培地で洗浄し、次いで、新鮮な肝細胞維持培地を細胞に添加した。
リポプレックストランスフェクション実験のために、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ１３７７８１５０）ベースのトランスフェクションを製造者のプロトコールに従って行った。細胞を、Ｓｐｙ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（ＰＭＨについては１００ｎｇ、ＰＨＨについては５０ｎｇ、ＰＣＨについては２５ｎｇ）、およびＯｐｔｉＭｅｍ ｓｇＲＮＡ（ＰＭＨについては２５ｎＭ、ＰＨＨについては１２．５ｎＭ、ＰＣＨについては０．１２５ｎＭ）、ならびにＯｐｔｉＭｅｍおよびリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（ＰＨＨおよびＰＣＨについては１μＬ／ウェル、ならびにＰＭＨについては２ｕＬ／ウェル）を含む単一のリポプレックスでトランスフェクトした。
ＬＮＰ処理を伴う実験では、４〜６時間後、プレーティング培地を除去し、次いで、細胞を、無血清サプリメントパック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＡ１２１７６０１およびＣＭ４０００）を含む肝細胞維持培地／培養培地で洗浄し、ＬＮＰ製剤化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ＋３％血清を含む、補充肝細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＡ１２１７６０１およびＣＭ４０００）で置き換えた。ＬＮＰを１ウェル当たり１００ｎｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび約３０ｎＭガイドＲＮＡの開始用量レベルから希釈し、１ウェル当たり０．１ｎｇのｍＲＮＡおよび０．０３ｎＭガイドへと連続希釈した。細胞を、本明細書に記載されるように、約７２時間、３７℃、および５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした後、細胞溶解し、ＮＧＳ分析を行った。
ＨｅｐＧ２
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログＨＢ−８０６５）を、１０％のウシ胎仔血清を補充したｐｅｎｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞を計数し、バイオコートコラーゲンＩをコーティングした９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ８７７２７２）上で、１０，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート中、２４時間プレーティングした後、トランスフェクションを行った。
４〜６時間後、プレーティング培地を除去し、次いで、細胞を、無血清サプリメントパック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＡ１２１７６０１およびＣＭ４０００）を含む肝細胞維持培地／培養培地で洗浄し、ＬＮＰ製剤化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ＋３％血清を含む、補充肝細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＡ１２１７６０１およびＣＭ４０００）で置き換えた。ＬＮＰを１ウェル当たり１００ｎｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび約３０ｎＭガイドＲＮＡの開始用量レベルから希釈し、１ウェル当たり０．１ｎｇのｍＲＮＡおよび０．０３ｎＭガイドへと連続希釈した。細胞を、本明細書に記載されるように、約７２時間、３７℃、および５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした後、細胞溶解し、ＮＧＳ分析を行った。
脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤
ＬＮＰ手順Ａ：約４．５のカチオン性脂質アミン対ＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）モル比で、ＬＮＰを製剤化した。脂質ナノ粒子成分を、以下のモル比で、１００％エタノール中で希釈した：４５ｍｏｌ−％（１２．７ｍＭ）カチオン性脂質（例えば、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）−カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、別には３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）−ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）とも称される、４４ｍｏｌ−％（１２．４ｍＭ）ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、９ｍｏｌ−％（２．５３ｍＭ）中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、および２ｍｏｌ−％（０．５６３ｍＭ）ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）。
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用し、製造者のプロトコールに従って、脂質およびＲＮＡ溶液をマイクロ流体混合することによって、ＬＮＰを形成した。差動流量を使用して、混合中、水性溶媒対有機溶媒の２：１の比を維持した。
ＲＮＡカーゴを２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で調製して、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴの濃度を得て、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡの比は１：１（ｗｔ／ｗｔ）であった。混合後、ＬＮＰを収集し、ｐＨ７．５の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ中で希釈し（約１：１）、次いで、ＬＮＰを、１０ｋＤａ Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩、ｐＨ７．５の５０ｍＭ Ｔｒｉｓに交換した（試料体積の１００倍過剰）。ＬＮＰを、１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎスピンフィルター（４℃、４０００ｇでの遠心分離）を使用して濃縮し、所望の濃度の２倍を達成した。これらの濃縮ＬＮＰを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、９０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のスクロース（ｐＨ７．５）（２ＸＴＳＳ）と１：１で混合した。次いで、得られた混合物を０．２μＭ滅菌フィルターを使用して濾過した。得られた濾液を２〜８℃で保存した。
ＬＮＰ手順Ｂ：約４．５のカチオン性脂質アミン対ＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）モル比で、ＬＮＰを製剤化した。脂質ナノ粒子成分を、１００％エタノール中で以下のモル比で希釈した：４５ｍｏｌ−％（１２．７ｍＭ）カチオン性脂質（例えば、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）−カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、別には３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）−ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）とも称される、４４ｍｏｌ−％（１２．４ｍＭ）ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、９ｍｏｌ−％（２．５３ｍＭ）中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、および２ｍｏｌ−％（０．５６３ｍＭ）ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）。
ＬＮＰを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用し、製造者のプロトコールに従って、脂質およびＲＮＡ溶液をマイクロ流体混合することによって形成した。差動流量を使用して、混合中、水性溶媒対有機溶媒の２：１の比を維持した。
ＲＮＡカーゴを、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５）中で調製し、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。混合後、ＬＮＰを水中で３：１の比で収集した。ＬＮＰを室温で１時間インキュベートし、水と１：１で混合した。次いで、それらを、製造者のプロトコールを使用し、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、１ＸＴＳＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４５ｍＭ ＮａＣｌ、５％スクロース（ｐＨ７．５））に緩衝液交換した。ＬＮＰを１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎスピンフィルター（４℃、４０００ｇでの遠心分離）を使用して濃縮し、所望の濃度を達成した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。得られた濾液を−８０℃で保存した。
ＬＮＰ手順Ｃ：約６のカチオン性脂質アミン対ＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）モル比で、ＬＮＰを製剤化した。脂質ナノ粒子成分を、以下のモル比で、１００％エタノール中で希釈した：５０ｍｏｌ−％（１２．７ｍＭ）カチオン性脂質（例えば、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）−カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、別には３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）−ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）とも称される、３８ｍｏｌ−％（１２．４ｍＭ）ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、９ｍｏｌ−％（２．５３ｍＭ）中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、および３ｍｏｌ−％（０．５６３ｍＭ）ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）。
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用し、製造者のプロトコールに従って、脂質およびＲＮＡ溶液をマイクロ流体混合することによって、ＬＮＰを形成した。差動流量を使用して、混合中、水性溶媒対有機溶媒の２：１の比を維持した。
ＲＮＡカーゴを２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５）中で調製し、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。エタノール中の１つの脂質ストリームを０．２５ｍｍ ＩＤクロスピースを通したクエン酸緩衝液中の２つのＲＮＡストリームと混合する、衝突噴流混合方法によって、ＬＮＰを形成した。２つのＲＮＡストリームをエタノールストリームに対して垂直に混合する。第４の注入用の水ストリーム（ＷＦＩ）は、０．５ｍｍ ＩＤ Ｔｅｅピースを通るインライン希釈で得られた粒子に合致する。４つの全てのストリームを、シリンジポンプを使用して１０ｍＬ／分で送達する。これらのＬＮＰを室温で１時間インキュベートし、次いで、製造者のプロトコールを使用して、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、１ＸＴＳＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４５ｍＭ ＮａＣｌ、５％スクロース（ｐＨ７．５））に緩衝液交換した。ＬＮＰを１０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎスピンフィルター（４℃、４０００ｇでの遠心分離）を使用して濃縮し、所望の濃度を達成した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。得られた濾液を−８０℃で保存した。
ＬＮＰ手順Ｄ：約４．５のカチオン性脂質アミン対ＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）モル比で、ＬＮＰを製剤化した。脂質ナノ粒子成分を、以下のモル比で、１００％エタノール中で希釈した：４５ｍｏｌ−％（１２．７ｍＭ）カチオン性脂質（例えば、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、別名３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）；４４ｍｏｌ−％（１２．４ｍＭ）ヘルパー脂質（例えば、コレステロール）；９ｍｏｌ−％（２．５３ｍＭ）中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）；および２ｍｏｌ−％（０．５６３ｍＭ）のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）。ＲＮＡカーゴを２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で調製して、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得て、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡの比は１：１（ｗｔ／ｗｔ）であった。
クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を２体積のＲＮＡ溶液および１体積の水と衝突噴流混合することによって、ＬＮＰを調製した。エタノール中の脂質を、混合クロス（ｍｉｘｉｎｇ ｃｒｏｓｓ）により、２体積のＲＮＡ溶液と混合する。第４の水のストリームを、インラインｔｅｅを通るクロスの出力ストリームと混合する。（ＷＯ２０１６０１０８４０図２を参照のこと）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上でタンジェント流濾過を使用して濃縮し、次いで、透析濾過により、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）へと緩衝液交換した。あるいは、ＴＳＳへの最終緩衝液交換をＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて完了した。必要に応じて、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離することによって、製剤を濃縮した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または−８０℃で保存した。
次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）およびオンターゲット切断効率の分析
ゲノム中の標的位置における編集効率を定量的に決定するために、ディープシーケンシングを使用して、遺伝子編集によって導入された挿入および欠失（「インデル」）の存在を同定した。
標的部位（例えば、目的の標的遺伝子（例えばＴＴＲ）内）周辺でのＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。
シーケンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置上でシーケンシングした。低品質スコアを有する読み取りを除去した後に、読み取りをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）とアラインした。読み取りを含む生じたファイルを参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、対象の標的領域にオーバーラップする読み取りを選択し、野生型の読み取りの数対挿入、置換、または欠失を含む読み取りの数が計算した。
編集パーセンテージ（例えば「編集効率」または「編集パーセント」）は、野生型を含む配列読み取りの総数に対する、挿入または欠失を有する入れる読み取りの総数として定義される。
インビボでのＬＮＰ送達
マウスを伴う各研究において、６〜１０週齢の範囲のＣＤ−１雌マウスを使用した。ラットを伴う各研究において、６〜１０週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌ラットを使用した。動物を体重測定し、体重に従ってグループ化し、グループ平均体重に基づいて投与溶液を調製した。ＬＮＰを、１匹当たり０．２ｍＬの体積（体重１キログラム当たり約１０ｍＬ）で、側尾静脈を介して投与した。投与から約６時間後、動物を有害作用について観察した。投与から２４時間後に体重を測定し、イソフロウラン麻酔下での心臓穿刺による失血によって様々な時点で動物を安楽死させた。血液を血清分離チューブまたは本明細書に記載される血漿用の緩衝クエン酸ナトリウムを含むチューブに収集した。インビボ編集を伴う研究のために、各動物由来の中葉から、肝臓組織をＤＮＡ抽出および分析のために収集した。
ゲノムＤＮＡ単離
インビボ研究のために、溶解緩衝液（約４００μＬ／１０ｍｇの組織）中で組織を均質化することを含む製造者のプロトコールに従って、ビーズベースの抽出キット、ＭａｇＭＡＸ−９６ＤＮＡマルチサンプルキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号４４１３０２０）を使用して、１０ｍｇの組織からゲノムＤＮＡを抽出した。全てのＤＮＡ試料を、本明細書に記載されるように、ＰＣＲおよびその後のＮＧＳ分析のために１００ｎｇ／μＬ濃度に正規化した。
動物研究で使用されるトランスサイレチン（ＴＴＲ）ＥＬＩＳＡ分析
血液を採取し、示されるようにして血清を単離した。ＴＴＲ血清レベルは、Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ（トランスサイレチン）ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ、カタログＯＫＩＡ００１１１）を使用して決定し、ラットＴＴＲ血清レベルは、ラット特異的ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙカタログ番号ＯＫＩＡ００１５９）を使用して測定した。製造元のプロトコールに従って、キット試薬および標準物を調製した。マウス血清を、１倍のアッセイ希釈剤で１０，０００倍の最終希釈に希釈した。これは、２回の連続５０倍希釈を行って２５００倍希釈を得ることによって行われた。１０，０００倍の総試料希釈のために、最終的な４倍希釈工程を行った。捕捉抗体で事前にコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、標準曲線希釈液（それぞれ１００μＬ）および希釈血清試料の両方を加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした後、洗浄した。酵素−抗体コンジュゲート（１ウェル当たり１００μＬ）を２０分のインキュベーションのために添加した。未結合の抗体コンジュゲートを除去し、プレートを再び洗浄した後、発色基質溶液を添加した。プレートを１０分間インキュベートした後、１００μＬの停止溶液、例えば硫酸（約０．３Ｍ）を添加した。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度で読み取った。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアバージョン６．４．２により、標準曲線から適合する４パラメータ・ロジスティック曲線を使用して、血清ＴＴＲレベルを計算した。アッセイ希釈のために最終血清値を調整した。別段で示されない限り、ノックダウン率（％ＫＤ）値は、一般的にビヒクル（輸送および保存溶液またはＴＳＳ）で偽処置した動物である対照と比較して決定した。
ヌクレアーゼ感受性アッセイ
肝細胞サイトゾルに曝露した際にｓｇＲＮＡ切断がどこで発生するかを決定および定量化し、安定性に対するｓｇＲＮＡ修飾の効果を評価するためのアッセイを以下のように行った。１５μＭのｓｇＲＮＡを、ヒト肝臓サイトゾル（ＸｅｎｏＴｅｃｈ製品Ｈ０６１０．Ｃ）（別段示されない限り、ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水を使用して、０．０１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に調整）とともに、以下に示す期間インキュベートした。３．２３０ｍＬの水、２．１２５ｍＬの組織および細胞溶解液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品ＭＴＣ０９６Ｈ）、ならびに３４０μＬのプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ製品ＭＰＲＫ０９２から５０ｍｇ／ｍＬ）からなる６７μＬのプロテイナーゼＫ細胞溶解緩衝液を添加し、６５℃で７５０ＲＰＭで振盪するサーモミキサー中で３０分間インキュベートすることによって、反応を停止した。次いで、８μＬの３Ｍ ＫＣｌを添加し、混合物を０℃で１０分間インキュベートした。次いで、混合物を１５００ｇで１５分間遠心分離して洗浄剤を沈殿させた。上清を除去し、０．９５ｍＬの希釈緩衝液（水中０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０からなる）で希釈し、１ｍＬのｐＨ４．３充填／希釈緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０％アセトニトリル、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＴＣＥＰからなる）と混合し、混合物をＣｌａｒｉｔｙ（登録商標）ＯＴＸ（商標）ＳＰＥオリゴヌクレオチド精製カートリッジ上に充填した。ｐＨ４．３、５．５、および約７で洗浄を行い、続いて、ｐＨ９．０で溶出した。溶出液を真空下で乾燥させ、１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡｃ）中に再懸濁した。
次いで、ＬＣ／ＭＳによって試料を分析した。
実施例２−ＨＥＫ２９３細胞での修飾デュアルガイド調査
編集有効性に対する特定の位置における化学修飾の負の影響を特定するために、ｃｒＲＮＡ内の化学修飾の調査を行った。この調査における各ｃｒＲＮＡは、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子内の同一配列を標的とした。試験ガイドは、表６に記載されるのと同じ化学修飾を有する単一修飾塩基または２つの隣接する塩基のいずれかに限定される、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域（５’末端から１〜２０位）内の修飾を含有した。ホスホチオエート結合（ＰＳ）、イノシン置換、ＤＮＡ塩基、２’ＯＭｅ修飾、およびアンロックド核酸（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＵＮＡ）をアッセイした。
Ｓｐｙ Ｃａｓ９を構成的に発現するヒト胚性腎臓腺癌細胞株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９」）を、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの２０時間前に、細胞を９６ウェルプレート中で、１５，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした（トランスフェクション時に約７０％のコンフルエント）。細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ１３７７８１５０）によって、製造者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。個々のｃｒＲＮＡ（３．１ｎＭ）、ｔｒＲＮＡＴＲ０００００２（３．１ｎＭ）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（０．４５μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを含むリポプレックスによって、細胞をトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの４８時間後に溶解し、溶解物を、ＮＧＳによる編集のために分析したＰＣＲ反応において直接使用した。
編集結果を表６および図２９Ａ〜図２９Ｆに示す。編集効率は、位置１５および１６における２’ＯＭｅ修飾によってほぼバックグラウンドレベルに低下した（図２９Ａ）。ホスホロチオエートジヌクレオチドは、スペーサー領域の１９位および２０位に配置したときに編集を約２０％低減した（図２９Ｂ）。シード領域におけるイノシン置換は、編集に対して中程度の負の影響をもたらし、例えば、１４位に修飾されているときには約３０％の減少、または１８位では約６０％の減少をもたらした（図２９Ｃ）。１１位から２０位までの任意の単一の位置におけるＵＮＡ塩基置換は、編集有効性を著しく低下させた（図２９Ｄ）。位置１５におけるＤＮＡ塩基置換は、編集効率を約３分の１低下させた（図２９Ｅ）。１５位および１６位の両方におけるＤＮＡ塩基置換は、編集を約３分の２減少させた（図２９Ｆ）。
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実施例３−代表的なデュアルガイドスクリーニング
修飾ｃｒＲＮＡの編集スクリーニングにおいて、化学修飾の種類および位置の影響を評価した。スクリーニングにより、２’Ｆ、２’ＯＭｅ、およびＰＳにより修飾したガイドをアッセイした。完全なパターンセットを、ＴＴＲ遺伝子中の６つの異なる部位を標的とするガイドに適用した。最終データセットは、１７０４つの異なるガイドおよび２８４つの特有の修飾パターンを含んだ。
可能な修飾パターンの大きなコンビナトリアル空間を探索するために必要な修飾組み合わせの数を最小にするために、ガイド修飾パターンをコンピューターにより選択した。特定の位置または位置の組み合わせが最終セットにおいて過度に表されないように、各個々の位置および各対の位置における修飾の均一な分布を作成するためにパターンを選択した。このバイアス最小化アプローチにより、個々の位置効果の試験、および位置間の高次相互作用効果の検出が可能となった。ガイドドメイン配列、トランスフェクション効率、および他の実験変動値等の妨害効果を制御するために、適切な対照をセットに追加した。
このセットにおける各パターンは、４〜２０位に１種類の修飾のみを含み、修飾の種類はパターン内では混合されなかった。パターンの最終セットは、０〜４つの２’Ｆ修飾、０〜４つの２’Ｏｍｅ修飾、または０〜１５個のＰＳ修飾を有する、４〜２０位におけ９６パターンの３つのグループから構成された。以前の観察結果が、ＰＳ修飾が２’Ｆｌｕまたは２’Ｏｍｅよりも良好な耐容性であり、したがって、少ない数で存在するときに検出可能な効果を示す可能性が低いことを示したため、ＰＳ修飾をより重く適用した。
Ｓｐｙ Ｃａｓ９を構成的に発現するヒト胚性腎臓腺癌細胞株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９」）を、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの約２４時間前に、細胞を９６ウェルプレート中で１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした（トランスフェクション時に約７０％のコンフルエント）。細胞を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ１３７７８１５０）によって、製造者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。個々のｃｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、ｔｒＲＮＡ ＴＲ００９８８０（２５ｎＭ）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを含むリポプレックスによって、細胞をトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの４８時間後に溶解し、溶解物を、ＮＧＳによる編集のために分析したＰＣＲ反応において直接使用した。
編集結果を表８に記載する。各行番号は、単一の修飾パターンを表す。表の最初の２行は対照を示している。
修飾の種類、標的化位置、およびガイドドメイン配列の全影響を修飾ガイドにおいて評価した。データは、０に近い編集から９０％近い編集まで、修飾オリゴヌクレオチド内の幅広い活性を示している。一般に、２’Ｆ修飾は、２’ＯＭｅまたはＰＳ修飾ガイドよりも良好な耐容性であったが、ＰＳガイドを他の修飾よりも平均的により重く修飾した。修飾への応答に対するガイドドメインの核酸塩基配列の明確な影響が観察された。Ｇ４８０およびＧ４９０バリアントは、２’ＯＭｅ修飾によって強く損なわれたが、２’ＦおよびＰＳ修飾に耐性があった一方、Ｇ４９４、Ｇ４９９、およびＧ５０２バリアントは、ＰＳ修飾によって最も強い影響を受け、２’ＯＭｅによってより少ない影響を受け、Ｇ４８８は、３つ全ての修飾に同様に応答した。
回帰に基づく分析を行い、ガイド活動に顕著な影響を及ぼす修飾の種類を特定した。モデリングの前に、ガイド配列およびプレート効果について、編集データを最初に修正した。次いで、位置修飾の影響を、標準回帰技術を使用して、独立した線形相加因子としてモデル化した。別の分析では、位置間の相互作用および非線形関係の証拠があるかどうかを検討した。有意な高次効果は観察されなかった。以下に報告された結果は、最初の線形回帰分析から得られた。全ての修飾ガイドについての編集データをガイドシーケンス効果について修正し、次いで、修飾の影響についてモデル化した。
表７および図３０Ａ〜図３０Ｃに示されるように、多くの位置における２’修飾が編集に対する負の影響を示した。例えば、１５位または１６位の２’Ｆまたは２’ＯＭｅ修飾は、編集活性の統計的に有意な阻害をもたらし、１５位および１６位のリボースを有するｇＲＮＡが好ましいことが示唆された。対照的に、１９位の２’Ｆ修飾は、編集を有意に増加させた。この修飾により、ベースラインよりもさらに平均して１３％の編集が加えられたことが、回帰モデルにより見出された。２’ＯＭｅは逆の効果を有し、編集を強く阻害した。他の位置は一貫して有意な影響を受けなかったが、個々の配列は多くの場合に影響を受けた。ＰＳ修飾は、１９位を含むいくつかの位置において小さな負の影響の可能性があった。高度に修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡよりも働きが良好でなく、ＰＳ修飾の量が関連し得ることを示している。
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実施例４
ガイドドメイン内の化学修飾の種類および位置の影響を、修飾ｓｇＲＮＡの編集スクリーニングにおいて評価した。スクリーニングにより、２’Ｆ、２’ＯＭｅ、およびＰＳにより修飾したガイドをアッセイした。完全なパターンセットを、３つのガイドの核酸塩基配列に適用した。この実施例における試験修飾パターンを、３つのガイドドメイン核酸塩基配列、具体的には、Ｇ０００４８６、Ｇ０００５０２、またはＧ０００４１５について表１に記載されるものに適用した。ガイドドメイン修飾パターンを、配列番号６９５に記載される保存領域で、または配列番号２５３に記載される保存領域を使用した短いｓｇＲＮＡ形式でのいずれかでアッセイした。最終データセットは、ガイドドメイン中に２７０個の異なるガイドおよび４５個の特有の修飾パターンを含んだ。
表９〜表１２の１〜１２行は、５、１２、および１５位における２’ＯＭｅ、２’Ｆ、ＰＳ、および２’Ｈ修飾での編集有効性について評価された試験ガイドを示している。表９〜表１２の１３〜１９行は、８〜１０位において２’Ｆ＋ＰＳ修飾を２’Ｆ単一修飾に置き換えたバリアントの編集データを示している。表９〜表１２の２０〜２７行は、４〜２０位においてＰＳを２’Ｆに置き換えたバリアントの編集データを示している。
以下の修飾を用いて、実施例１に記載のＰＣＨおよびＰＨＨ細胞において、編集をアッセイした。細胞を計数し、ＰＨＨでは３０，０００〜３５，０００細胞／ウェル、およびＰＣＨトランスフェクションでは４０，０００〜６０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、脂質成分を、５０％脂質Ａ、９％ＤＳＰＣ、３８％コレステロール、および３％ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧのモル比で、１００％エタノール中で再構成した、予め混合した脂質製剤を使用した。次いで、脂質混合物を、約６．０の脂質アミン対ＲＮＡリン酸塩（Ｎ：Ｐ）モル比で、ＲＮＡカーゴ（例えばＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）と混合した。１ウェル当たり１００ｎＭのｇＲＮＡ、３％のカニクイザル血清、および５０ｎｇのＣａｓ９ ｍＲＮＡの最終濃度で、トランスフェクションを行った。細胞を約４８時間インキュベートしてた後、細胞溶解およびＮＧＳ分析を行った。実験を二重で行った。編集結果を表９〜表１２に記載する。各行は、同じ保存領域での単一の修飾パターン設計を表す。４６〜４８行目は対照である。
可能であれば、ガイドが短いｓｇＲＮＡであったか否か、可変領域修飾パターン、および個々の修飾位置を含む、いくつかの変数の影響を推定するために、データを分析した。短いｓｇＲＮＡガイドは、ＰＣＨ（全ての部位）およびＰＨＨ（Ｇ５０２バリアント）において、非短いｓｇＲＮＡガイド（ｎｏｎ−ｓｈｏｒｔ−ｓｇＲＮＡ ｇｕｉｄｅ）よりも有意に活性であった。ＰＣＨにおいて、短いｓｇＲＮＡガイドは、等価な非短いｓｇＲＮＡよりもさらに１４％添加した。
本研究における修飾パターンの多くは、良好な耐容性のある修飾を高度に修飾されたｇＲＮＡ分子に組み込み、さらに試験するために設計された。概して、これは成功した。ほぼ全てのパターンは、対照全体と同様の活性を示した。本研究では、多くの個々の位置も試験した。５、１２、および１５位を個々に修飾した。５位は、修飾に対して非常に耐容性であった。１２位は、ＰＳ、２’−Ｆおよび２’−ＯＭｅに対して耐容性であったが、２’−Ｈ修飾に対して有意に感受性であった（７．５の編集パーセンテージの減少、ｐ＜０．００００２）。１５位は、２’−Ｈ修飾に対して耐容性であったが、提示される他の作業と同様に、２’Ｆおよび２’ＯＭｅに対して非常に感受性であった（ｐ＜１０−１３）。
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実施例５−初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）、およびＨｅｐＧ２におけるインビトロ編集
ヒトＴＴＲ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを表１に示すように設計し、図に示されるような濃度でインビトロで初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）、およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトし、編集効率（例えば、編集パーセント）を実施例１に記載のようにＮＧＳによって測定した。これらのトランスフェクションで使用したＬＮＰを、実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｃに従って作製した。
濃度による編集効率の用量応答曲線を図９Ａ（ＰＨＨ）、図９Ｂ（ＰＣＨ）、および図９Ｃ（ＨｅｐＧ２）に示す。表１３Ａ（ＰＨＨ）、表１３Ｂ（ＰＣＨ）、および表１３Ｃ（ＨｅｐＧ２）は、図９Ａ〜図９Ｃの結果を要約する。
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実施例６−ｓｇＲＮＡのヌクレアーゼ感受性および安定性
Ｇ２８２、Ｇ４８０、Ｇ４８１、Ｇ５０２、およびＧ５０４の５’および３’末端標識バージョンを、実施例１（Ｋ）に記載されるようにアッセイした。断片長をＧ２８２配列上にマッピングし（図１１Ａ）、ＣｐＡおよびＵｐＡ部位（すなわち、ピリミジン−アデニンまたは「ＹＡ」）において主に切断が認められ（図１０Ｂに示す）、ＲＮａｓｅＡ様エンドヌクレオチド分解パターンと一致した。Ｌｅｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８：７３００−０９（２００３）（ＣｐＡおよびＵｐＡ部位におけるＲＮａｓｅ Ａ切断を報告）を参照のこと。Ｇ２８２について観察される切断部位が、この分子の可能な二次構造について図１０Ｂに概略的に例示されている。
切断は、Ｇ２８２、Ｇ４８０、Ｇ４８１、Ｇ５０２、およびＧ５０４におけるヌクレオチド２５、４５、５０、６４、および６７の後で一貫して観察された（Ｇ４８１を除いて、２５位での切断はほとんどなかったか、または全くなかった）（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。これらの位置は全て、ＹＡ部位である（図１０Ｂ中の標識されたＹＡ部位１、５、６、７、８、および９）。さらに、スペーサー領域において、例えばＧ４８０の１６位、Ｇ４８１の１５位および１８位、ならびにＧ５０２の４位、８位、１１位、および１６位の後に、概してＹＡ依存的な様式で、切断が観察された（図１１Ｂ〜図１１Ｄ）。特に、ＹＡ位置における修飾は、切断の低減をもたらした（例えば、２位、３１位、３７位、４０位、および８３位の後）。Ｙが少なくとも２’−ＯＭｅヌクレオチドであるＹＡ位は、有意な切断を示さず、ＲＮＡｓｅ Ａによる切断から隣接する３’結合を保護する２’−Ｏ−メチル化と一致した。
Ｇ５０２を、ガイドドメインにおいて追加の修飾を有するｓｇＲＮＡと比較した（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。特に、Ｇ９５７１は、配列表に示される、８〜１１を含む特定の位置における２’−フルオロ修飾、および８〜１０を含む定の位置におけるＰＳ修飾を含む。Ｇ１００１５は、位置４における２’−ＯＭｅ修飾、位置８および１１における２’−フルオロ修飾、ならびに位置１６におけるＰＳ修飾を含む。
Ｇ９５７１において、８位および１１位後の切断は低減または排除され、これらの位置の２’−フルオロ修飾によるヌクレアーゼ保護と一致した（図１２Ｂ）。
Ｇ１００１５において、４位、８位、および１１位後の切断は低減または排除され、４位の２’−ＯＭｅ修飾、ならびに８位および１１位の２’−フルオロ修飾によるヌクレアーゼ保護と一致した（図１２Ｃ）。１６位後の切断はまた、Ｇ５０２と比較して幾分低下したレベルで生じ、その位置におけるホスホロチオエート修飾による部分的な保護が示唆された。
Ｃａｓ９を用いてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）に組み立てられたＧ２８２、Ｇ４８０、Ｇ４８１、Ｇ５０２、Ｇ５０４、およびＧ５０９上のアッセイはまた、８．５ｍｇ／ｍｌのより高いＨＬＣ濃度を使用して行ったが、そうでない場合には上記の手順に従った。ＲＮＰは、より高いＨＬＣ濃度にもかかわらず、ｓｇＲＮＡ単独を使用する実験と比較して感受性の低下を示し、これは、ＲＮＰ内のｓｇＲＮＡが、ヌクレアーゼにアクセスしにくいが、切断パターンは定性的には類似したままであり、ほとんどの切断はＹＡ部位で生じること（データは示されない）を示している。
全てのＹＡ部位における修飾を含むＧ１００３９を、０．０１ｍｇ／ｍｌのＨＬＣを用いてアッセイし、１６位でごく僅かな量の切断のみを示すことが見出され、その位置におけるホスホロチオエート修飾による保護と一致した（図１３Ａ）。最小量の切断は、特定の追加の（非ＹＡ）部位で検出可能であったが、出発物質のほぼ全てがインキュベーション全体を通して無傷のままであった。
Ｇ１００３９（遊離ｓｇＲＮＡとして）を８．５ｍｇ／ｍｌのＨＬＣでも処理した。分解は１６位で増加し、いくつかの他の位置でも観察され、そのうちのいくつかはＹＡ部位ではなかった（図１３Ｂ）。
実施例７−ＹＡ部位における修飾を有するｓｇＲＮＡによるトランスフェクション後の編集
Ｇ２８２において非修飾であった保存領域中の個々のＹＡ部位において２’−ＯＭｅ修飾を体系的に導入することによって、一連のｓｇＲＮＡを設計した。したがって、Ｇ９９８９〜Ｇ９９９４で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、図１０Ａに示される位置ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ１２、Ｎ６、Ｎ１４、およびＮ１７である、位置２５、４５、５０、５６、６４、および６７にそれぞれ２’−ＯＭｅ修飾を有する。これらは、図１０Ｂに示されるＹＡ部位１、５、６、７、８、および９のピリミジンである。Ｇ１００１９〜Ｇ１００２４で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、それぞれＧ９９８９〜Ｇ９９９４と同じ２’−ＯＭｅ修飾を有するが、核酸塩基配列は、Ｇ２８２ではなく、Ｇ５０２のものと同一である。
同様に、Ｇ２８２において非修飾であった保存領域中の個々のＹＡ部位において２’−フルオロ修飾を体系的に導入することによって、一連のｓｇＲＮＡを設計した。したがって、Ｇ９９９５〜Ｇ１００００で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、それぞれ２５、４５、５０、５６、６４、および６７位に２’−フルオロ修飾を有する。Ｇ１００２５〜Ｇ１００３０で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、それぞれＧ９９９５〜Ｇ１００００と同じ２’−フルオロ修飾を有するが、核酸塩基配列は、Ｇ２８２ではなく、Ｇ５０２のものと同一である。
Ｇ２８２において非修飾であって保存領域中の個々のＹＡ部位においてホスホロチオエート修飾を系統的に導入することによって、さらなる一連のｓｇＲＮＡを設計した。したがって、Ｇ１０００１〜Ｇ１０００６で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、２５、４５、５０、５６、６４、および６７位で２’−フルオロ修飾を有する。Ｇ１００３１〜Ｇ１００３６で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、それぞれＧ１０００１〜Ｇ１０００６と同じホスホロチオエート修飾を有するが、核酸塩基配列は、Ｇ２８２ではなく、Ｇ５０２のものと同一である。
ＥＮＡにより修飾したガイドも試験した（Ｇ９８７８、Ｇ１０００７、およびＧ１０００８は、Ｇ２８２配列を有し、Ｇ１００３７およびＧ１００３８は、Ｇ５０２配列を有していた）。Ｇ１０００７およびＧ１００３７における修飾は、４５番目および５０番目のヌクレオチド（図１０Ａに示されるＬＳ７およびＬＳ１２位）にあった。Ｇ９８７８中のＥＮＡは、３個の５’末端部ヌクレオチド、および３’末端から４番目〜２番目のヌクレオチドにあった。Ｇ１０００８およびＧ１００３８におけるＥＮＡは、４６位および４９位のヌクレオチド（図１０Ａに示されるＬＳ８およびＬＳ１１位）であった。
デオキシリボヌクレオチド（Ｇ９４２３〜Ｇ９４２７）およびＵＮＡ（Ｇ９８７９）により修飾されたガイドも試験し、これらは全てＧ２８２配列を有した。これらのガイドにおける修飾の位置を配列表に示す。
上述のガイドをリポプレックスに組み込み、上述のようにＰＭＨにトランスフェクトし、編集パーセントを決定した（Ｇ２８２の配列と一致するガイドについては図１４、およびＧ５０２の配列と一致するガイドについては図１５Ａ）。Ｇ５０２の配列を有するガイドをまた、上述のようにＰＣＨおよびＰＨＨにトランスフェクトし、編集パーセントを決定した（ＰＣＨについては図１５Ｂ、およびＰＨＨについては図１５Ｃ）。ベースライン参照（点線で示される編集レベルに対応する）は、図１４中のＧ２８２、図１５Ａ中のＧ５０２とした。Ｇ９９８９〜Ｇ１０００６およびＧ１００１９〜Ｇ１００３６に導入された２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、およびホスホロチオエート修飾の全てが、編集活性が大きく減少しなかった点で認容的であった。さらに、他の修飾も一般的に認容的であった。Ｇ１０００７およびＧ１００３７における４５〜５０位のＥＮＡ修飾は、より低い編集活性パーセントを示した。
実施例８−ｓｇＲＮＡによるトランスフェクション後の初代細胞編集
いくつかのシリーズの修飾ｓｇＲＮＡは、Ｇ０００２８２およびＧ０００５０２の核酸塩基配列に基づいて設計された。具体的な修飾を表１に記載する。Ｇ００２８２バリアントを、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）においてインビトロで、（別段で注記しない限り）二重で編集についてアッセイした。Ｇ０００５０２バリアントを、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）およびＰＭＨ細胞においてインビトロで、（別段で注記しない限り）同様に二重にアッセイした。全てのデータを以下の表１４および表１５に報告する。
配列番号２０１に記載の修飾保存領域と組み合わせたガイドドメイン中の修飾をアッセイする一連のｓｇＲＮＡを設計した。Ｇ０１２４２１〜Ｇ０１２４２５、Ｇ０１２６８９、Ｇ０１２６９０、Ｇ０１２４２６〜Ｇ０１２４３１で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、それぞれＧ０１２６９３〜Ｇ０１２７０５と同じ修飾を有するが、核酸塩基配列は、Ｇ０００２８２ではなく、Ｇ０００５０２のものと同一である。これらのガイドのデータを表１４に示す。
同様に、Ｇ００００５０２バリアントであるＧ０１２４０２の修飾ガイドドメイン、またはＧ０００２８２バリアントであるＧ００９５３３の修飾ガイドドメインのいずれかと組み合わせた保存領域における修飾をアッセイする一連のｓｇＲＮＡを設計した。Ｇ０１２４３２〜Ｇ０１２４３８、Ｇ０１２６９１、Ｇ０１２４３９〜Ｇ０１２４４０、Ｇ０１２６９２で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、それぞれＧ０１２７０６〜Ｇ１２７１６と同じ修飾を有するが、核酸塩基配列は、Ｇ０００２８２ではなく、Ｇ０００５０２のものと同一である。これらのガイドのデータを表１４に示す。
様々なガイドドメインおよび保存領域修飾パターンを組み合わせたさらなる一連のｓｇＲＮＡを設計した。Ｇ０１２４４１〜Ｇ０１２４５１で順次番号付けされたｓｇＲＮＡは、それぞれＧ０１２７１７〜Ｇ０１２７２７と同じ修飾を有するが、核酸塩基配列は、Ｇ０００２８２ではなく、Ｇ０００５０２のものと同一である。これらのガイドのデータを表１４および図３１Ａ〜図３１Ｃに示す。
同様に、Ｇ０００２８２およびＧ０００５０２の短いシングルガイドバリアントの文脈において修飾をアッセイする一連のｓｇＲＮＡを設計した。Ｇ０１２４５２〜Ｇ０１２４６１から順次番号付けされるｓｇＲＮＡは、Ｇ０００５０２、具体的にはＧ０１２４０１の短いガイドバリアントに基づく。これらの修飾バリアントは、それぞれＧ０１２７２８〜Ｇ１２７３７と同じ修飾を有するが、Ｇ０１２７２８〜Ｇ１２７３７の核酸塩基配列は、Ｇ０００２８２の短いガイドバリアントであるＧ０００６３９のものと同一である。この一連のガイドのデータを表１４に示す。
最後に、Ｇ０００５０２の核酸塩基配列における修飾をアッセイする、表１５に示される一連のｓｇＲＮＡを設計した（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。この一連のガイドのデータを表１５および図２３Ａ〜図２３Ｂに示す。
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実施例９−ＨＡＯ１およびＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とする修飾ガイドのインビトロ編集
ヒト遺伝子ＨＡＯ１またはＬＤＨＡを標的とするガイドを用いた用量応答アッセイにおいて、初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞において修飾ｓｇＲＮＡ標的化の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を試験した。別段で注記しない限り、全ての方法は実施例１に記載の通りである。ＬＮＰで処理する前に、両方の細胞株を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＬＮＰを、３％カニクイザル血清を含む培地で３７℃で１０分間インキュベートし、本明細書でさらに提供される量で細胞に投与した。インキュベーション後、ＬＮＰを、３００ｎｇ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡで始まる８点の３倍用量応答曲線において、ヒトまたはカニクイザル肝細胞に添加した。細胞を、実施例１に記載されるようにＮＧＳ分析のために処理後９６時間溶解させた。
表１６は、Ｓｐｙ Ｃａｓ９がＰＨＨおよびＰＣＨにＬＮＰにより送達される１０．７５ｎＭの試験対照ｓｇＲＮＡの平均編集および標準偏差を示す。これらの試料を３重で生成した。
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表１７は、ｓｐｙＣａｓ９がＰＨＨまたはＰＣＨにＬＮＰにより送達されるＨＡＯ１を標的とするｓｇＲＮＡの平均編集および標準偏差を示す。これらの試料は少なくとも二重で作製した。これらのデータの用量応答曲線プロットを図２７Ａ〜図２７Ｄおよび２８Ａ〜図２８Ｄに示す。
表１８は、ｓｐｙＣａｓ９がＬＮＰを介してＰＨＨに送達されるＳｅｒｐｉｎＡ１を標的とするｓｇＲＮＡの平均編集および標準偏差を示す。Ｇ０００４８０およびＧ０００５０２は、ＴＴＲを標的とする対照である。これらの試料を少なくとも二重で作製した。これらのデータの用量応答曲線プロットを図２５Ａ〜図２５Ｅに示す。
表１９は、ｓｐｙＣａｓ９がＬＮＰを介してＰＣＨに送達されるＳｅｒｐｉｎＡ１を標的とするｓｇＲＮＡの平均編集および標準偏差を示す。Ｇ０００４８０およびＧ０００５０２は、ＴＴＲを標的とする対照である。これらの試料は少なくとも二重で作製した。これらのデータの用量応答曲線プロットを図２６Ａ〜図２６Ｅに示す。
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実施例１０−短いｓｇＲＮＡのインビボ研究
マウスＴＴＲ遺伝子およびＩＶＴ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを標的とする化学合成ｓｇＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡを含む）を１：１の重量比で含む、実施例１（Ｆ）で上述したように調製したＬＮＰを、実施例１（Ｈ）で上述したＣＤ−１雌マウス（Ｎは以下に示す）またはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌ラットに投与した。投与から８日後の剖検時に、実施例１で上述したように、編集効率および血清ＴＴＲ分析のＮＧＳ測定のために、それぞれ肝臓および血液を収集した。総合ウェルネス評価のために、投与から２４時間後の動物の体重を測定した。
図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表２０Ａおよび表２０Ｂに示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。Ｇ０００２１１およびＧ０００２８２は、参照比較物として用いた。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｂに従って、ＬＮＰを作製した。図１Ａおよび図１Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）または０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスのものであり、表２０Ａおよび表２０Ｂに要約される。
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図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表２１Ａおよび表２１Ｂに示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。Ｇ０００２６９およびＧ０００２８３は、参照比較物として機能した。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｂに従ってＬＮＰを作製した。図２Ａおよび図２Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）または０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表２１Ａおよび２１Ｂに要約される。
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図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表２２Ａおよび表２２Ｂに示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。Ｇ０００５０２は、参照比較物として機能した。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｃに従ってＬＮＰを作製した。図３Ａおよび図３Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）または０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表２２Ａおよび表２２Ｂに要約される。
Figure 2021526804
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図４Ａおよび図４Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表２３Ａおよび表２３Ｂに示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。Ｇ０００２１１およびＧ０００２８２は、参照比較物として機能した。ＬＮＰは、配列番号５０１に対応するＩＶＴ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを使用して、実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ａに従って作製した。図４Ａおよび図４Ｂに示されるデータは、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）または１．０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表２３Ａおよび表２３Ｂに要約される。
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実施例１（Ｃ）に従って、表２３Ａおよび表２３Ｂ（表１）に列挙される同じｓｇＲＮＡを、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞へのトランスフェクションによってインビトロで試験した。結果を図５に示す。
図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表２４Ａおよび表２４Ｂに示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。Ｇ０００２１１およびＧ０００２８２は、参照比較物として機能した。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｂに従ってＬＮＰを作製した。図６Ａおよび図６Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表２４Ａおよび表２４Ｂに要約される。
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図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表２５Ａおよび表２５Ｂに示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。Ｇ０００５３４は、参照比較物として機能した。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｃに従ってＬＮＰを作製した。図７Ａおよび図７Ｂに示されるデータは、０．３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＬＮＰを投与したラット由来であり、表２５Ａおよび表２５Ｂに要約される。
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図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表２６Ａおよび表２６Ｂに示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については、表１を参照のこと）。Ｇ０００５３４は、参照比較物として機能した。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｃに従ってＬＮＰを作製した。図８Ａおよび図８Ｂに示されるデータは、０．３ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）および１．０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したラット由来であり、表２６Ａおよび表２６Ｂに要約される。
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実施例１１−ｓｇＲＮＡのインビボ研究
マウスＴＴＲ遺伝子およびＩＶＴ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを標的とする化学合成ｓｇＲＮＡを１：１の重量比で含む、実施例１（Ｆ）（ＬＮＰ手順Ｄ）で上述したように調製したＬＮＰを、実施例１（Ｅ）で上述したように、ＣＤ−１雌マウス（以下に示すＮ）に投与した。剖検時の投与から８日後、実施例１で上述したように、編集効率および血清ＴＴＲ分析のＮＧＳ測定のために、それぞれ、肝臓および血液を収集した。総合ウェルネス評価のために、投与後２４時間の動物の体重を測定した。
図１７Ａおよび図１７Ｂは、Ｇ２８２、Ｇ９９８１〜Ｇ９９８６、およびＧ１０００９を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示しており、これらは全てＧ２８２と同じヌクレオチド配列を有する。図１７Ａおよび図１７Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表２７Ａおよび表２７Ｂに要約される。
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図１８Ａおよび図１８Ｂは、Ｇ５０２およびＧ１００１１〜Ｇ１００１６を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示しており、これらは全てＧ５０２と同じヌクレオチド配列を有する。図１８Ａおよび図１８Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表２８Ａおよび表２８Ｂに要約される。
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図１９Ａおよび図１９Ｂは、Ｇ５０２およびＧ９９６５〜Ｇ９９７６を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示しており、これらは全てＧ５０２と同じヌクレオチド配列を有する。図１９Ａおよび図１９Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表２９Ａおよび表２９Ｂに要約される。
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図１９Ｃおよび図１９Ｄは、Ｇ２８２およびＧ９５５３〜Ｇ９５６４を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示しており、これらは全てＧ２８２と同じヌクレオチド配列を有する。図１９Ｃおよび図１９Ｄに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表３０Ａおよび表３０Ｂに要約される。
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図２０Ａおよび図２０Ｂは、Ｇ５０２、Ｇ９５６７、Ｇ９５６９、およびＧ９５７０を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示し、これらは全てＧ５０２と同じヌクレオチド配列を有する。図２０Ａおよび図２０Ｂに示されるデータは、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表３１Ａおよび表３１Ｂに要約される。
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図２０Ｃおよび図２０Ｄは、Ｇ５０２、Ｇ９５７１、およびＧ１００３９を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示しており、これらは全てＧ５０２と同じヌクレオチド配列を有する。図２０Ｃおよび図２０Ｄに示されるデータは、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表３２Ａおよび表３２Ｂに要約される。
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図２０Ｅおよび図２０Ｆは、Ｇ５０２、Ｇ９５７１、およびＧ１００１５を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示しており、これらは全てＧ５０２と同じヌクレオチド配列を有する。図２０Ｅおよび図２０Ｆに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰを投与したマウスから得られたものであり、表３３Ａおよび表３３Ｂに要約される。
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実施例１２−インビボ研究
図８Ｃおよび図８Ｄは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表３４に示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照のこと）についての編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す。Ｇ０００２８２は、参照比較物としての役割を果たした。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。図８Ｃおよび図８Ｄに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＣＤ−１マウスから得られたものであり、表３４に要約される。
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図２１Ａおよび図２１Ｂは、それぞれ、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表３５に示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照のこと）についての編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルを示す。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。図２１Ａおよび図２１Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＣＤ−１雌マウス（Ｎ＝５）由来であり、表３５に要約される。
Figure 2021526804
図１８Ｃ〜図Ｄは、ＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を全て標的とする、表３６に示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照のこと）の編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示す。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。図１８Ｃ〜図１８Ｄに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）および０．３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＣＤ−１雌マウスから得られたものであり、表３６に要約される。
Figure 2021526804
Figure 2021526804
図１８Ｅ〜図１８Ｆは、表３７に示されるｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照）を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示し、これらは全てＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。図１８Ｅ〜図１８Ｆに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）および０．３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＣＤ−１雌マウス（Ｎ＝５）由来であり、表３７に要約される。
Figure 2021526804
図３Ｃ〜図３Ｄは、表３８に示されるｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照）を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示し、これらは全てＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。図３Ｃ〜図３Ｄに示すデータは、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）および０．３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＣＤ−１雌マウス（Ｎ＝５）由来であり、表３８に要約される。
Figure 2021526804
図２２Ａ〜図２２Ｂは、表３９に示されるｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照）を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示し、これらは全てＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｐ４．３に従ってＬＮＰを作製した。図２２Ａ〜図２２Ｂに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット由来であり、表３９に要約される。
Figure 2021526804
表４０は、全てがＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、示されるｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照のこと）を含むＬＮＰの編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示す。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。表４０に示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＣＤ−１雌マウス由来である。
Figure 2021526804
図２４Ａ〜図２４Ｂは、全てがＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表４１に示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照のこと）の編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示す。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。図２４Ａ〜図２４Ｂに示すデータは、０．１ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＣＤ−１雌マウスから得られたものであり、表４１に要約される。
Figure 2021526804
Figure 2021526804
図３Ｅ〜図３Ｆは、全てがＴＴＲ遺伝子中の同じ配列を標的とする、表４２に示されるｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ（ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列については表１を参照のこと）の編集効率およびＴＴＲタンパク質レベルをそれぞれ示す。実施例１（Ｆ）のＬＮＰ手順Ｄに従ってＬＮＰを作製した。図３Ｅ〜図３Ｆに示されるデータは、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡを投与したＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ雌ラット（Ｎ＝５）由来であり、表４２に要約される。
Figure 2021526804
実施例１３−ｓｇＲＮＡによるインビトロおよびインボビ間の相関
化学的に合成されたｓｇＲＮＡ（Ｇ５０２およびＧ９５６５〜Ｇ９５７６）およびＩＶＴ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、それぞれ、実施例１（Ｄ）および１（Ｆ）（ＬＮＰ手順Ｄ）に記載のリポプレックストランスフェクションまたはＬＮＰトランスフェクションとして、初代肝細胞に投与した。上述の実施例１（Ｇ）に記載のＮＧＳにより、ＴＴＲ遺伝子の編集を決定した。実施例５、特に図１９Ａおよび図１９Ｂに示すデータを記載する項目に記載されているように、同じｓｇＲＮＡをＣＤ−１雌マウスにも投与した。
インビボ編集と比較したＰＭＨのインビトロリポプレックストランスフェクションの編集％を図１６Ａに示す。図１６Ａに示されるように、ＰＭＨのインビトロリポプレックストランスフェクションとインビボ編集との間の相関は、統計学的に有意ではない。相関関係は予測的ではない。
インビボ編集と比較したＰＭＨのインビトロＬＮＰトランスフェクション（０．３ｎｇ、１ｎｇ、３ｎｇ、１０ｎｇ、および３０ｎｇ）の編集％を図１６Ｂ〜図１６Ｆに示す。図１６Ｂ〜図１６Ｆに示すように、ＰＭＨのインビトロＬＮＰトランスフェクションとインビボ編集との間の相関は、統計学的に有意であった。相関関係は予測的である。
図１６Ｇは、リポプレックストランスフェクションによってＰＭＨに（左ボックス上のデータ）、ＬＮＰ中でＰＭＨに（中央ボックス上のデータ）、またはインビボでマウスに（右ボックス上のデータ）送達された、示されるガイドを用いた編集％の比較を示す。図１６Ｈは、ＬＮＰ中でＰＭＨに（１ｎｇ、３ｎｇ、１０ｎｇ）またはインビボでのマウス（０．１ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ）送達された、示されるガイドを用いた編集％の比較を示す。示されたガイドの順位は、一般的に各セットのデータにおいて同じであると考え得るが、インビボでの編集は、編集結果のより大きな差を示している。
図１６Ｉは、Ｇ０００２８２とＧ０００２１１との間の編集の差を示すように再プロットした図１６Ｇから得られる結果を示す。棒状プロット値は、Ｇ０００２８２値の編集％をＧ０００２１１値の編集％で除して、編集の倍数差を示すことによって作成した。示されたガイドを、リポプレックストランスフェクションによってＰＭＨに（左ボックスのデータ）、ＬＮＰ中でＰＭＨに（中央ボックスのデータ）、またはインビボでマウスに（右ボックスのデータ）送達した。
図１６Ｊは、Ｇ０００２８３とＧ０００２６９との間の編集の差を示すように再プロットした図１６Ｈから得られる結果を示す。棒状プロット値は、Ｇ０００２８３値の編集％をＧ０００２６９値の編集％で除して、編集の倍数差を示すことによって作成した。示されたガイドを、ＬＮＰ中でＰＭＨに（左のボックス上のデータ）またはインビボでマウスに（右のボックス上のデータ）送達した。

Claims (468)

  1. ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であって、前記ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠き、前記短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾または３’末端修飾を含む、ガイドＲＮＡ。
  2. 前記短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
  3. 前記短いｓｇＲＮＡが、３’末端修飾を含む、請求項１または２に記載のｇＲＮＡ。
  4. 前記短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾および３’末端修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  5. 前記短いｓｇＲＮＡが、３’テールを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  6. 前記３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
  7. 前記３’テールが、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜５、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項５に記載のｇＲＮＡ。
  8. 前記短いｓｇＲＮＡが、３’テールを含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  9. 前記ヘアピン領域における修飾を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  10. ３’末端修飾および前記ヘアピン領域における修飾を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  11. ３’末端修飾、前記ヘアピン領域における修飾、および５’末端修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  12. ５’末端修飾および前記ヘアピン領域における修飾を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  13. 前記少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドが連続している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  14. 前記少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドが、
    ｉ．ヘアピン１内にある、
    ｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」内にある、
    ｉｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチド内にある、
    ｉｖ．ヘアピン１の少なくとも一部を含む、
    ｖ．ヘアピン２内にある、
    ｖｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
    ｖｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン２内にある、
    ｖｉｉｉ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
    ｉｘ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
    ｘ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
    ｘｉ．ヘアピン１またはヘアピン２内にあり、任意選択により、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
    ｘｉｉ．連続している、
    ｘｉｉｉ．連続し、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
    ｘｉｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン２の一部に及ぶ、
    ｘｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」に及ぶ、または
    ｘｖｉ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチドに及ぶ、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  15. ガイド領域をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  16. 前記３’および／または５’末端修飾が、保護末端修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  17. 前記ヘアピン領域における前記修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  18. 前記３’および／または５’末端修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  19. 前記３’および／または５’末端修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  20. 前記３’および／または５’末端修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むかまたはさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  21. 前記３’および／または５’末端修飾が、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  22. 前記ヘアピン領域における前記修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  23. 前記ヘアピン領域における前記修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  24. 前記３’末端修飾が、
    ｉ．最後の７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の修飾、
    ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
    ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれかを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  25. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、前記短いｓｇＲＮＡが、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２の修飾を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  26. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
    ｉ．５〜１０個のヌクレオチドからなる、
    ｉｉ．６〜１０個のヌクレオチドからなる、
    ｉｉｉ．５個のヌクレオチドからなる、
    ｉｖ．６個のヌクレオチドからなる、
    ｖ．７個のヌクレオチドからなる、
    ｖｉ．８個のヌクレオチドからなる、
    ｖｉｉ．９個のヌクレオチドからなる、
    ｖｉｉｉ．１０個のヌクレオチドからなる、
    ｉｘ．５〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘ．６〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉ．５個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉｉ．６個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉｉｉ．７個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉｖ．８個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｖ．９個の連続するヌクレオチドからなる、または
    ｘｖｉ．１０個の連続するヌクレオチドからなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  27. 前記３’末端修飾が、
    ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
    ｉｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉ．（ｉ．）〜（ｖ．）のうちの１つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  28. 前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
    ｉｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉ．（ｉ．）〜（ｖ．）のうちの１つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む３’テールを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  29. 前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
    ｉｉ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、または１８個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
    ｉｉｉ．約１〜３、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
    ｉｖ．約１〜３、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１２、１〜１４、１〜１６、１〜１８、または１〜２０個のヌクレオチド間ＰＳ結合、および
    ｖ．各ヌクレオチド間のＰＳ結合のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  30. 前記３’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
    ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、前記結合が最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間にある、
    ｉｉ．最後の３個のヌクレオチド間に２個のＰＳ結合が存在する、
    ｉｉｉ．最後の４個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合が存在する、
    ｉｖ．最後の５個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合が存在する、および
    ｖ．最後の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合が存在するのうちの１つ以上である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  31. 前記３’末端修飾が、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項３０に記載のｇＲＮＡ。
  32. 前記３’末端修飾が、
    ｉ．最後の１〜７個のヌクレオチドのうちの１個以上の修飾であって、前記修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、またはそれらの組み合わせである、修飾、
    ｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後のヌクレオチドの修飾、ならびに隣りのヌクレオチドおよび／もしくは前記３’テールの１番目のヌクレオチドへの任意選択による１個もしくは２個のＰＳ結合、
    ｉｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後および／もしくは最後から２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
    ｉｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、および／もしくは最後から３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
    ｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、および／もしくは最後から４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
    ｖｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、最後から４番目、および／もしくは最後から５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  33. 前記ｓｇＲＮＡが、３’テールを含み、前記３’テールが、前記３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  34. 前記３’テールが、完全に修飾されている、請求項３３に記載のｇＲＮＡ。
  35. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、前記短いｓｇＲＮＡが、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２の修飾を含む、請求項３３に記載のｇＲＮＡ。
  36. 前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．配列番号１〜５４のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾、
    ｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）前記２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合、
    ｉｉｉ．（ｉ）３’末端部の３’末端からの５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｉｖ．ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
    ｖ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．（ｉ）３’末端部の３’末端からの１５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）前記２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続する２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｖｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける交互する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｖｉｉｉ．（ｉ）２または３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｉｘ．最後のヌクレオチドと最後の隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合、ならびに
    ｘ．１５または２０個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  37. 前記５’末端修飾が、
    ｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１個以上の修飾、
    ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
    ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  38. 前記５’末端修飾が、１〜７、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のヌクレオチドの修飾を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  39. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
    ｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１を含む、
    ｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０を含む、
    ｉｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含む、
    ｉｖ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１からなる、
    ｖ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０からなる、または
    ｖｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  40. 前記５’末端修飾が、
    ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
    ｉｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．デオキシリボヌクレオチド、
    ｖｉｉ．イノシン、および
    ｖｉｉｉ．（ｉ．）〜（ｖｉｉ．）の１つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  41. 前記５’末端修飾が、
    ｉ．１、２、３、４、５、６、および／もしくは７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、または
    ｉｉ．約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、または１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  42. 前記５’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
    ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、前記結合が、前記ガイド領域のヌクレオチド１と２の間にある、
    ｉｉ．２個のＰＳ結合が存在し、前記結合が、前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、および２と３との間にある、
    ｉｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
    ｉｖ．前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、および４と５との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
    ｖ．前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
    ｖｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、５と６との間、および６と７との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、または
    ｖｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、５と６との間、６と７との間、および７と８との間のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  43. 前記５’末端修飾が、少なくとも１つの２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項４２に記載のｇＲＮＡ。
  44. 前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．可変領域のヌクレオチド１〜７のうちの１つ以上の修飾であって、前記修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ（デオキシリボヌクレオチド）、イノシン、および／もしくはそれらの組み合わせである修飾、
    ｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記ガイド領域の１番目のヌクレオチドの修飾、および隣りのヌクレオチドへの任意選択によるＰＳ結合、
    ｉｉｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−Ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目および／もしくは２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
    ｉｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目、２番目、および／もしくは３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
    ｖ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目、２番目、３番目、および／もしくは４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
    ｖｉ．２’−ＯＭｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目、２番目、３番目、４番目、および／もしくは５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  45. 前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．配列番号１〜５４のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾、
    ｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、ならびに３と４との間のＰＳ結合、
    ｉｖ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合、
    ｖｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合、
    ｖｉｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
    ｉｘ．前記ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｘ．前記ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  46. 上部ステム領域が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  47. 前記上部ステム修飾が、
    ｉ．前記上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾、
    ｉｉ．前記上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾、および
    ｉｉｉ．前記上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  48. 前記上部ステム修飾が、
    ｉ．２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および
    ｉｖ．（ｉ．）〜（ｉｉｉ．）の１つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載のｇＲＮＡ。
  49. ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む短いｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、前記ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠き、前記短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾、ならびに
    ｉ．上部ステム領域、
    ｉｉ．ヘアピン１領域、および
    ｉｉｉ．ヘアピン２領域のうちの１つ以上における１つ以上の修飾を含み、
    前記５’末端修飾が、５’保護末端修飾、例えば、最初の７個のヌクレオチド内の少なくとも２個のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、ガイドＲＮＡ。
  50. 少なくとも１つの修飾が、２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項４９に記載のｇＲＮＡ。
  51. 少なくとも１つの修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項４９または５０に記載のｇＲＮＡ。
  52. 少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  53. 前記短いｓｇＲＮＡが、前記上部ステム領域における１つ以上の修飾を含む、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  54. ＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つにおける修飾を含む、請求項５３に記載のｇＲＮＡ。
  55. 前記短いｓｇＲＮＡが、前記ヘアピン１領域における１つ以上の修飾を含む、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  56. 前記短いｓｇＲＮＡが、Ｈ１−１における修飾を含む、請求項５５に記載のｇＲＮＡ。
  57. 前記短いｓｇＲＮＡが、前記ヘアピン２領域における１つ以上の修飾を含む、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  58. 前記短いｓｇＲＮＡが、Ｈ２−１における修飾を含む、請求項５７に記載のｇＲＮＡ。
  59. 前記短いｓｇＲＮＡが、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における修飾を含む、請求項４９〜５８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  60. 前記短いｓｇＲＮＡが、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における修飾を含む、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  61. 前記短いｓｇＲＮＡが、前記上部ステム領域、前記ヘアピン１領域、および前記ヘアピン２領域の各々における１つ以上の修飾を含む、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  62. 前記短いｓｇＲＮＡが、ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４９〜６１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  63. 修飾を含む下部ステム領域をさらに含む、請求項４９〜６２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  64. ３’末端修飾をさらに含む、請求項４９〜６３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  65. ３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つが修飾されている、請求項６４に記載のｇＲＮＡ。
  66. ３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、または２’−Ｏ−ｍｏｅにより修飾されている、請求項６４に記載のｇＲＮＡ。
  67. ３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの１個以上の間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合をさらに含む、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  68. 修飾を含むバルジ領域をさらに含む、請求項４９〜６７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  69. 修飾を含むネクサス領域をさらに含む、請求項４９〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  70. 前記可変領域の５’末端における少なくとも最初の３個のヌクレオチド、および３’末端部の３’末端における最後の３個のヌクレオチドが修飾されている、請求項４９〜６９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  71. 前記可変領域の５’末端における最初の４個のヌクレオチド、および３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドが、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合で結合されている、請求項４９〜７０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  72. 前記末端修飾が、２’−ＯＭｅを含む、請求項７０または７１に記載のｇＲＮＡ。
  73. 前記末端修飾が、２’−Ｆを含む、請求項７０または７１に記載のｇＲＮＡ。
  74. 前記可変領域の５’末端における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドが、ＰＳ結合で結合され、前記可変領域の５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部の３’末端における最後の３個のヌクレオチドが、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項４９〜７３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  75. ５’末端部における最初の４個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の４個のヌクレオチドが、ＰＳ結合で結合され、５’末端部における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端部における最後の３個のヌクレオチドが、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、および／または２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾を含む、請求項４９〜７４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  76. ＬＳ１、ＬＳ６、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ１１、および／またはＬＳ１２が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、請求項４９〜７５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  77. 前記バルジ領域におけるヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、請求項４９〜７６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  78. 前記バルジ領域におけるヌクレオチドの少なくとも５０％が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、請求項４９〜７７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  79. 前記上部ステム領域におけるヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、請求項４９〜７８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  80. 前記ネクサス領域におけるＮ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、請求項４９〜７９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  81. 前記ネクサス領域におけるＮ１５、Ｎ１６、Ｎ１７、および／またはＮ１８が修飾されている、請求項４９〜８０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  82. 前記ネクサス領域における前記修飾が、２’−ＯＭｅおよび２’Ｆから選択される、請求項８０または８１に記載のｇＲＮＡ。
  83. Ｎ１６、Ｎ１７、およびＮ１８が、ＰＳ結合で結合されている、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  84. 前記ヘアピン１領域に残存するヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、請求項４９〜８３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  85. 前記ヘアピン２領域におけるヌクレオチドの各々が、２’−ＯＭｅにより修飾されている、請求項４９〜８４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  86. ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含む短いｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、前記ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠き、前記短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾および３’末端修飾を含み、前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．上部ステム領域における少なくとも１つの修飾、および
    ｉｉ．３’テールのうちのいずれか１つ以上をさらに含む、ガイドＲＮＡ。
  87. 前記上部ステム修飾が、
    ｉ．前記上部ステム領域における各ヌクレオチド（ＵＳ１〜ＵＳ１２）の修飾、
    ｉｉ．前記上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾、
    ｉｉｉ．前記上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾、および
    ｉｖ．前記上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項８６に記載のｇＲＮＡ。
  88. 前記５’末端修飾が、
    ｉ．前記可変領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１個以上の修飾、
    ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
    ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項８６または８７に記載のｇＲＮＡ。
  89. 前記５’末端修飾が、
    ｉ．配列番号１〜５４、４０１〜５３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、３３８８〜３４３０、または３５４９〜３５５２のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾、
    ｉｉ．前記可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．前記可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合、
    ｉｖ．前記可変領域のヌクレオチド１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．前記可変領域のヌクレオチド１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、ならびに５と６との間のＰＳ結合、
    ｖｉ．前記可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．前記可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間のＰＳ結合、
    ｖｉｉｉ．前記可変領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
    ｉｘ．前記可変領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに
    ｘ．前記可変領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、前記可変領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  90. 前記可変領域の少なくともヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む、請求項８９に記載のｇＲＮＡ。
  91. 前記可変領域の少なくともヌクレオチド１、２、３、および４における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合を含む、請求項８９に記載のｇＲＮＡ。
  92. ３’末端修飾が、
    ｉ．最後の７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の修飾、
    ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
    ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項８６〜９１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  93. 前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．配列番号１〜５４、４０１〜５３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、３３８８〜３４３０、または３５４９〜３５５２のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾、
    ｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）前記２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合、
    ｉｉｉ．（ｉ）５個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｉｖ．ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
    ｖ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．（ｉ）１５個の連続した２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）前記２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続する２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｖｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける交互する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｖｉｉｉ．（ｉ）２または３個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｉｘ．最後のヌクレオチドと最後の隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合、ならびに
    ｘ．１５または２０個の連続する２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  94. 前記ｓｇＲＮＡが、３’テールを含み、前記３’テールが、前記３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む、請求項８６〜９３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  95. 前記３’テールが、完全に修飾されている、請求項９４に記載のｇＲＮＡ。
  96. 前記３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチドを含み、任意選択により、これらのヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上が修飾されている、請求項９４に記載のｇＲＮＡ。
  97. 表１の修飾を含む、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、および３０１〜３５４のいずれかを含む短いｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡ。
  98. 配列番号１〜５４、２０１〜２５４、および３０１〜３５４のうちのいずれか１つの核酸と少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含む短いｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、表１の参照配列識別子のヌクレオチドに対応する短いｓｇＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾が、表１の参照配列識別子に示される修飾と同一または同等である、ガイドＲＮＡ。
  99. 少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含む、請求項１〜９８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  100. ５’末端修飾ではない少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含む、請求項１〜９９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  101. １つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含み、前記ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、請求項１〜１００のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  102. １つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含み、前記短いｓｇＲＮＡが、
    ｉ．Ｈ１−１およびＨ２−１の１つ以上における修飾、
    ｉｉ．１、２、３、４、または５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．１、２、３、４、または５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ｓｇＲＮＡの任意の５’末端修飾と異なる、ＹＡ修飾、
    ｉｖ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８またはその後にある、ＹＡ修飾、
    ｖ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端内にある、ＹＡ修飾、
    ｖｉ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位が、前記ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある、ＹＡ修飾、
    ｖｉｉ．５’末端修飾以外のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｖｉｉｉ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８またはその後にある、ＹＡ修飾、
    ｉｘ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記２つのガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端内にある、ＹＡ修飾、
    ｘ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位が、前記ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある、ＹＡ修飾、
    ｘｉ．５’末端修飾以外の２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、および
    ｘｉｉ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾のうちの１つ以上を含み、前記ガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  103. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−ＯＭｅ、ＥＮＡ、ＵＮＡ、イノシン、またはＰＳを含む、請求項１〜１０２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  104. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、ジヌクレオチドモチーフの構造を変化させて、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減する、請求項１〜１０３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  105. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、ＲＮａｓｅによるＹＡ部位の認識もしくは切断を妨げ、かつ／またはＲＮＡ構造を安定化させる、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  106. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、
    ｉ．２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ｍｏｅ、２’−Ｆアラビノース、および２’−Ｈ（デオキシリボース）から選択されるリボース修飾、
    ｉｉ．ＬＮＡ、ＢＮＡ、およびＥＮＡ等の二環式リボース類似体、
    ｉｉｉ．非ロックド核酸修飾、
    ｉｖ．イノシン、シュードウリジン、および５’−メチルシトシン等の塩基修飾、ならびに
    ｖ．ホスホロチオエート等のヌクレオシド間結合修飾のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１０５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  107. １つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含む、請求項１〜１０６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  108. 保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、請求項１〜１０７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  109. 保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  110. 保存領域ＹＡ部位１のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  111. 保存領域ＹＡ部位２のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  112. 保存領域ＹＡ部位３のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  113. 保存領域ＹＡ部位４のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  114. 保存領域ＹＡ部位５のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  115. 保存領域ＹＡ部位６のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  116. 保存領域ＹＡ部位７のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  117. 保存領域ＹＡ部位８のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  118. 保存領域ＹＡ部位９のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  119. 保存領域ＹＡ部位１０のＹＡ修飾を含む、請求項１〜１１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  120. ｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、および４のＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、および１０のＹＡ修飾、
    ｉｖ．保存領域ＹＡ部位２、４、および１０のＹＡ修飾、
    ｖ．保存領域ＹＡ部位３、４、および１０のＹＡ修飾、
    ｖｉ．保存領域ＹＡ部位２および１０のＹＡ修飾、
    ｖｉｉ．保存領域ＹＡ部位２および４のＹＡ修飾、
    ｖｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位２および３のＹＡ修飾、
    ｉｘ．保存領域ＹＡ部位３および４のＹＡ修飾、
    ｘ．保存領域ＹＡ部位３および１０のＹＡ修飾、
    ｘｉ．保存領域ＹＡ部位４および１０のＹＡ修飾、
    ｘｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および５のＹＡ修飾、
    ｘｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および６のＹＡ修飾、
    ｘｉｖ．保存領域ＹＡ部位１および７のＹＡ修飾、
    ｘｖ．保存領域ＹＡ部位１および８のＹＡ修飾、
    ｘｖｉ．保存領域ＹＡ部位１および９のＹＡ修飾、
    ｘｖｉｉ．保存領域ＹＡ部位８および５のＹＡ修飾、
    ｘｖｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位８および６のＹＡ修飾、
    ｘｉｘ．保存領域ＹＡ部位８および７のＹＡ修飾、ならびに
    ｘｘ．保存領域ＹＡ部位８および９のＹＡ修飾のうちの１つ以上を含み、
    ｘｘｉ．任意選択により、前記ｓｇＲＮＡが、保存領域ＹＡ部位２、３、４、および／または１０のＹＡ修飾をさらに含む、請求項１〜１１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  121. 少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１〜１２０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  122. 少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、請求項１〜１２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  123. 少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、ＰＳ修飾を含む、請求項１〜１２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  124. 前記ｇＲＮＡが、以下のヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個、または全てにおける修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、２’−Ｈ、イノシン、またはホスホロチオエート修飾である、請求項１〜１２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  125. 前記短いｓｇＲＮＡが、ヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８における修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、２’−Ｈ、イノシン、またはホスホロチオエート修飾である、請求項１〜１２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  126. ２’−ＯＭｅ修飾が、ヌクレオチド６〜１１および１３末端における前記ガイド領域に存在しない、請求項１２４または１２５に記載のｇＲＮＡ。
  127. ２’−フルオロ修飾が、ヌクレオチド１〜７、１５、１６、および１９末端における前記ガイド領域に存在しない、請求項１２４〜１２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  128. ホスホロチオエート修飾が、ヌクレオチド４、５、１１〜１４、１７、および１８における前記ガイド領域内に存在しない、請求項１２４〜１２７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  129. 前記ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド２０を含む、請求項１２４〜１２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  130. 前記ガイド領域が、２０個のヌクレオチドからなる、請求項１２４〜１２９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  131. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における修飾を含む、請求項１２４〜１３０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  132. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１２における修飾を含む、請求項１２４〜１３１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  133. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１５における修飾を含む、請求項１２４〜１３２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  134. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１６における修飾を含む、請求項１２４〜１３３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  135. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１９における修飾を含む、請求項１２４〜１３４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  136. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド５が、非修飾である、請求項１２４〜１３０または１３２〜１３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  137. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１２が、非修飾である、請求項１２４〜１３１または１３３〜１３６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  138. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１５が、非修飾である、請求項１２４〜１３２または１３４〜１３７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  139. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１６が、非修飾である、請求項１２４〜１３３または１３５〜１３８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  140. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１９が、非修飾である、請求項１２４〜１３４または１３６〜１３９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  141. 前記短いｓｇＲＮＡが、以下：
    ｉ．ヌクレオチド１における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｉ．ヌクレオチド２における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド３における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｖ．ヌクレオチド４における２’−ＯＭｅ修飾、
    ｖ．ヌクレオチド６におけるホスホロチオエート修飾、
    ｖｉ．ヌクレオチド７におけるホスホロチオエート修飾、
    ｖｉｉ．ヌクレオチド８における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
    ｖｉｉｉ．ヌクレオチド９における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｘ．ヌクレオチド１０における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
    ｘ．ヌクレオチド１１における２’−フルオロ修飾、
    ｘｉ．ヌクレオチド１３における２’−フルオロ修飾、
    ｘｉｉ．ヌクレオチド１４における２’−フルオロ修飾、
    ｘｉｉｉ．ヌクレオチド１７における２’−フルオロ修飾、ならびに
    ｘｉｖ．ヌクレオチド１８における２’−フルオロ修飾のうちの１つ以上を含むガイド領域を含む、請求項１２４〜１４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  142. 前記ガイド領域が、請求項１〜１４１のいずれか一項に記載の修飾の各々を含む、請求項１２４〜１４１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  143. 前記ガイド領域が、以下：
    ｉ．ヌクレオチド５および６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾、
    ｉｉ．ヌクレオチド１２および１３がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド１５および１６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾、
    ｉｖ．ヌクレオチド１６および１７がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾、ならびに
    ｖ．ヌクレオチド１９および２０がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１９におけるホスホロチオエートまたは２’−フルオロ修飾のうち少なくとも１、２、３、または４つを含む、請求項１２４〜１４２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  144. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１２４〜１４３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  145. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１２４〜１４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  146. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１２４〜１４５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  147. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１２４〜１４６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  148. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１９におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１２４〜１４７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  149. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９における２’−フルオロ修飾を含む、請求項１２４〜１４８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  150. 前記ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１５を含むか、またはヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、請求項１２４〜１４９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  151. 前記ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１６を含むか、またはヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、請求項１２４〜１５０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  152. ｉ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  153. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに任意選択により、
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  154. ｉ．ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１３個のヌクレオチド内にある１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、およびを含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  155. ｉ．５’末端修飾および３’末端修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  156. ｉ．少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  157. ｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および８におけるＹＡ修飾を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  158. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
    ｉｉｉ．Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  159. ｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、８、および９の１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
    ｉｉｉ．Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾を含む、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、ガイドＲＮＡ。
  160. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６もしくはその後に位置する１つ以上のヌクレオチドにおける修飾、例えばＹＡ修飾、
    ｉｉ．１つ以上のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５のうちの１つ以上における修飾であって、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、もしくは２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、修飾、
    ｉｖ．ＬＳ１０における修飾であって、ＬＳ１０が、２’−フルオロ以外の修飾を含む、修飾、および／または
    ｖ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、もしくはＮ１１における修飾、
    のうちのいずれか１つ以上を含むｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、
    以下：
    ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、もしくは１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０うちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｃ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｄ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｅ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、もしくはＮ１７のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｆ．Ｈ１−１が、修飾を含む、
    ｇ．Ｈ２−１が、修飾を含む、または
    ｈ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まないのうちの少なくとも１つが当てはまる、ガイドＲＮＡ。
  161. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６もしくはその後に位置する１つ以上のヌクレオチドにおける修飾、例えばＹＡ修飾、または
    ｉｉ．１つ以上のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    のうちのいずれか１つ以上を含む、ガイドＲＮＡであって、以下：
    ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、もしくは１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、または
    ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、
    のうちの少なくとも１つが当てはまり、以下：
    ｃ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７〜１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｄ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、または
    ｅ．前記ガイドＲＮＡが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちのいずれか１つ以上における２’−フルオロ修飾を含み、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１１、１２、１３、１４、１７、もしくは１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まず、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２が、２’−フルオロ修飾を含まないのうちの少なくとも１つもまた当てはまる、ガイドＲＮＡ。
  162. Ｎ１４におけるグアノシンおよび／あるいは以下：
    ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある、１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位１、５、および６のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾であって、ＹＡ部位６がＬＳ１２において修飾され、ＬＳ９が非修飾である場合、ＬＳ１２の修飾が２’−ＯＭｅ以外である、ＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．ＬＳ９における修飾であって、ＬＳ９が修飾され、ＬＳ５、ＬＳ７、およびＬＳ１２が非修飾である場合、ＬＳ９の修飾が２’−フルオロ以外である、修飾、
    ｉｖ．ＬＳ１２における修飾であって、ＬＳ１２が修飾され、ＬＳ９が非修飾である場合、ＬＳ１２の修飾が２’−ＯＭｅ以外である、修飾、
    ｖ．ＬＳ８もしくはＬＳ１１における修飾であって、ＬＳ８およびＬＳ１１の少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、修飾、ならびに／または
    ｖｉ．Ｎ６、Ｎ１４、もしくはＮ１７における修飾であって、Ｎ１７が修飾され、Ｎ６およびＮ１４が非修飾である場合、Ｎ１７の修飾が、２’−フルオロ以外であり、２’−ＯＭｅ以外である、修飾、
    のうちの１つ以上を含むｓｇＲＮＡである、ガイドＲＮＡであって、以下：
    ａ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、１７、もしくは１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｂ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｃ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｄ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｅ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、もしくはＮ１７のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｆ．Ｈ１−１が、修飾を含む、
    ｇ．Ｈ２−１が、修飾を含む、または
    ｈ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート結合を含まないのうちの少なくとも１つが当てはまる、ガイドＲＮＡ。
  163. ｉ．１、２、３、４、もしくは５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．１、２、３、４、もしくは５つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、少なくとも１つのガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ｓｇＲＮＡの任意の５’末端修飾と異なる、ＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、もしくは１０末端内にある１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｖ．前記ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、もしくは９個のヌクレオチド内にある１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｖｉ．５’末端修飾以外のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、または
    ｖｉｉ．ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾、を含む、請求項１６１または１６２に記載のｇＲＮＡ。
  164. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、もしくは１０末端内にある２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．前記ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、もしくは９個のヌクレオチド内にある２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｖ．５’末端修飾以外の２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、または
    ｖ．２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾、を含む、
    請求項１６３に記載のｇＲＮＡ。
  165. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８もしくはその後にある３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、もしくは１０末端内にある３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．前記ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、もしくは９個のヌクレオチド内にある３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
    ｉｖ．５’末端修飾以外の３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、または
    ｖ．３つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ガイド領域ＹＡ部位の５’側に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾、を含む、
    請求項１６３に記載のｇＲＮＡ。
  166. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１６５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  167. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１６６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  168. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１６７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  169. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  170. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１６９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  171. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１１における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  172. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  173. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１３における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  174. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１４における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  175. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１５における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  176. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１６における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  177. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  178. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１８における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  179. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１９における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  180. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド２０における少なくとも１つのＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１７９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  181. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８つが、ＹＡ修飾を含み、任意選択により、前記修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−ＯＭｅ、またはＰＳを含む、請求項１６１〜１８０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  182. 前記修飾が、２’−フルオロである、請求項１８１に記載のｇＲＮＡ。
  183. 前記修飾が、２’−ＯＭｅまたは２’−Ｈである、請求項１８１に記載のｇＲＮＡ。
  184. 前記修飾が、ＰＳである、請求項１８１に記載のｇＲＮＡ。
  185. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つが、ＹＡ修飾を含み、任意選択により、前記修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−ＯＭｅ、イノシン、またはＰＳを含む、請求項１６１〜１８４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  186. 前記修飾が、ＰＳである、請求項１８５に記載のｇＲＮＡ。
  187. 前記修飾が、２’−フルオロまたは２’−Ｈである、請求項１８５に記載のｇＲＮＡ。
  188. 前記修飾が、２’−ＯＭｅである、請求項１８５に記載のｇＲＮＡ。
  189. 以下：
    ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちの１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、前記ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの１つ以上における２’−フルオロ以外の修飾である、ＹＡ修飾、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちの１つ以上におけるＰＳ以外のＹＡ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０における１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、任意選択により、前記修飾がＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８における１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０における２’−フルオロ以外の修飾である、ＹＡ修飾、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８の各々におけるＰＳ以外のＹＡ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０における１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、前記修飾が、任意選択によりＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、
    ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８における１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、前記ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちのいずれか１つにおける１つ以上のＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、
    ｖｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちのいずれか１つにおける少なくとも１つの２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、前記修飾が、任意選択によりＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、
    ｖｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８のうちの１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つのＹＡ修飾であって、前記ＹＡ修飾が、任意選択により２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０の各々におけるＰＳ修飾である、ＹＡ修飾、または
    ｖｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３〜１４、および１７〜１８の各々における２’−フルオロ修飾、ならびに５’末端の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの１、２、３、４、もしくは５つのＹＡ修飾であって、前記修飾が、任意選択によりＰＳ修飾である、ＹＡ修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１６１〜１８８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  190. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位および２’−フルオロ修飾もしくはＰＳ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−フルオロ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位および２’−ＯＭｅ修飾もしくはＰＳ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、ＰＳ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位および２’−ＯＭｅ修飾もしくは２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、ＹＡ修飾を含む、少なくとも２、３、もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
    ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位、およびＰＳ修飾を含む第３の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも３もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
    ｖｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第３の修飾ＹＡ部位、およびＰＳ修飾を含む第４の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも３もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
    ｖｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、ＹＡ修飾を含む、少なくとも３もしくは４つの修飾ＹＡ部位を含む、
    ｖｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含む第１の修飾ＹＡ部位、２’−フルオロ修飾を含む第２の修飾ＹＡ部位、ＰＳ修飾を含む第３の修飾ＹＡ部位、およびＰＳ修飾を含む第４の修飾ＹＡ部位を含む、少なくとも４つの修飾ＹＡ部位を含むか、または
    ｉｘ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜４０が、ＹＡ修飾を含む、少なくとも４つの修飾ＹＡ部位を含む、請求項１６１〜１８９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  191. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、少なくとも５つの修飾ＹＡ部位を含む、請求項１６１〜１９０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  192. 前記少なくとも５つの修飾ＹＡ部位が、ＰＳ修飾を含む第５の修飾ＹＡ部位を含み、任意選択により、前記第３の修飾ＹＡ部位が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項１６１〜１９１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  193. 前記少なくとも５つの修飾ＹＡ部位のうちの前記第１、第２、ならびに（該当する場合には）第３、第４、および第５が、５’から３’方向に配置されている、請求項１６１〜１９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  194. 前記少なくとも５つの修飾ＹＡ部位の前記第１、第２、ならびに（該当する場合には）第３、第４、および第５が、５’から３’方向に配置されていない、請求項１６１〜１９３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  195. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜２０が、デオキシリボヌクレオチドを含む少なくとも２、３、４、または５つの修飾ＹＡ部位を含み、任意選択により、前記デオキシリボヌクレオチドが、前記ＹＡ部位のピリミジンである、請求項１６１〜１９４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  196. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１のうちの少なくとも１、２、３、もしくは４つが、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含み、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つが、ＹＡ修飾を含み、任意選択により、前記ＹＡ修飾が、ヌクレオチド８〜１１に存在する場合には２’−ＯＭｅであり、ヌクレオチド１３、１４、１７、もしくは１８に存在する場合には２’−フルオロであり、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７および１８のうちの少なくとも一方もしくは両方が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含む、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７および１８のうちの少なくとも一方もしくは両方が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含むか、または
    ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、もしくは１３個が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１９５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  197. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜１０の少なくとも１、２、３、４、５、または６つが、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１９６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  198. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４〜１０が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜１９７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  199. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも１つが、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、５’保護末端修飾を含む、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも２つが、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、５’保護末端修飾を含むか、または
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３の各々が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、５’保護末端修飾を含む、請求項１６１〜１９８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  200. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチドヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、または５つが、任意選択により２’−フルオロ修飾である、５’末端修飾を含む、請求項１６１〜１９９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  201. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１５が、非修飾であるか、またはホスホロチオエートのみにより修飾されている、請求項１６１〜２００のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  202. ５’末端部からのヌクレオチド１６が、非修飾であるか、またはホスホロチオエートのみにより修飾されている、請求項１６１〜２００のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  203. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド３が、非修飾であるか、またはホスホロチオエートのみにより修飾されている、請求項１〜２０２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  204. ＣｒＲＮＡまたはｄｇＲＮＡである、請求項１６１〜２０３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  205. ｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜２０３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  206. 短いｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜２０３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  207. 保存領域ＹＡ部位１のＹＡ修飾を含む、請求項２０５または２０６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  208. 保存領域ＹＡ部位２のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２０７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  209. 保存領域ＹＡ部位３のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２０８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  210. 保存領域ＹＡ部位４のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２０９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  211. 保存領域ＹＡ部位５のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  212. 保存領域ＹＡ部位６のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２１１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  213. 保存領域ＹＡ部位７のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  214. 保存領域ＹＡ部位８のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  215. 保存領域ＹＡ部位９のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２１４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  216. 保存領域ＹＡ部位１０のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２１５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  217. ｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、および４のＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位２、３、および１０のＹＡ修飾、
    ｉｖ．保存領域ＹＡ部位２、４、および１０のＹＡ修飾、
    ｖ．保存領域ＹＡ部位３、４、および１０のＹＡ修飾、
    ｖｉ．保存領域ＹＡ部位２および１０のＹＡ修飾、
    ｖｉｉ．保存領域ＹＡ部位２および４のＹＡ修飾、
    ｖｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位２および３のＹＡ修飾、
    ｉｘ．保存領域ＹＡ部位３および４のＹＡ修飾、
    ｘ．保存領域ＹＡ部位３および１０のＹＡ修飾、または
    ｘｉ．保存領域ＹＡ部位４および１０のＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  218. ｉ．保存領域ＹＡ部位１および５のＹＡ修飾、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および６のＹＡ修飾、
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および７のＹＡ修飾、
    ｉｖ．保存領域ＹＡ部位１および８のＹＡ修飾、
    ｖ．保存領域ＹＡ部位１および９のＹＡ修飾、
    ｖｉ．保存領域ＹＡ部位８および５のＹＡ修飾、
    ｖｉｉ．保存領域ＹＡ部位８および６のＹＡ修飾、
    ｖｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位８および７のＹＡ修飾、または
    ｉｘ．保存領域ＹＡ部位８および９のＹＡ修飾、を含み、
    任意選択により、前記ｓｇＲＮＡが、保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のＹＡ修飾をさらに含む、請求項２０５〜２１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  219. 少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項２０５〜２１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  220. 少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  221. 少なくとも１つの修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、ＰＳ修飾を含む、請求項２０５〜２２０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  222. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項２０５〜２２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  223. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  224. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、ＰＳ修飾を含む、請求項２０５〜２２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  225. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ＹＡ部位が、２’位置における、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、リボース修飾を含み、任意選択により、２’−Ｏアルキル、２’−Ｈ、および２’−フルオロ修飾から選択される、請求項２０５〜２２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  226. ｉ．保存領域ＹＡ部位１および８が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−フルオロ修飾を含む、
    ｉｉ．保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
    ｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１が、２’−フルオロ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
    ｉｖ．保存領域ＹＡ部位８が、２’−フルオロ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
    ｖ．保存領域ＹＡ部位１が、前記ＹＡ部位のピリミジンにおける２’−フルオロ修飾を含み、前記ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
    ｖｉ．保存領域ＹＡ部位８が、前記ＹＡ部位のピリミジンにおける２’−フルオロ修飾を含み、前記ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
    ｖｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および８が、２’−フルオロ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、または
    ｖｉｉｉ．保存領域ＹＡ部位１および８が、前記ＹＡ部位のピリミジンにおける２’−フルオロ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位５および６、５および７、５および９、６および７、６および９、５、６、および７、５、６、および９、６、７、および９、もしくは５、６、７、および９が、任意選択により前記ＹＡ部位のピリミジンにおける、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項２０５〜２２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  227. 保存領域ＹＡ部位７および９が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  228. 保存領域ＹＡ部位５、６、７、および９が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２２７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  229. 保存領域ＹＡ部位８が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  230. 保存領域ＹＡ部位８が、デオキシリボヌクレオチド修飾を含む、請求項２０５〜２２９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  231. 保存領域ＹＡ部位８が、塩基置換によって排除され、任意選択により、前記塩基置換が、ＹＡ部位８のウラシルを排除し、さらに任意選択により、前記塩基置換が、ウラシルのグアニンへの置換である、請求項２０５〜２３０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  232. 保存領域ＹＡ部位１が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２３１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  233. 保存領域ＹＡ部位１が、ＰＳ修飾を含む、請求項２０５〜２３２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  234. ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ８、ＬＳ９、ＬＳ１０、ＬＳ１１、およびＬＳ１２のうちの１、２、３、４、５、６、または７つが、修飾を含み、任意選択により、前記修飾が、２’−フルオロおよび／または２’−ＯＭｅ修飾である、請求項２０５〜２３３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  235. ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１における修飾が、存在する場合、２’−フルオロ修飾を含み、任意選択により、ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１の各々が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２３４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  236. ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２における修飾が、存在する場合、２’−ＯＭｅ修飾を含み、任意選択により、ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２の各々が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項２０５〜２３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  237. Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、およびＮ１７のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、修飾を含む、請求項２０５〜２３６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  238. Ｈ２−２が、修飾を含み、任意選択により、Ｈ２が、さもなくば非修飾である、請求項２０５〜２３７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  239. Ｈ２−２が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項２０５〜２３８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  240. ＵＳ３、ＵＳ９、およびＵＳ１２が、修飾を含み、任意選択により、前記ＵＳが、さもなくば非修飾である、請求項２０５〜２３９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  241. ＵＳ３、ＵＳ９、およびＵＳ１２が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項２０５〜２４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  242. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０が、ＰＳ修飾を含み、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２４１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  243. 各ガイド領域ＹＡ部位が、任意選択により５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１５および／または１６を除き、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２４２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  244. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４、８、および１１が、ＹＡ修飾を含み、任意選択により、ヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含み、ヌクレオチド８および１１が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２０５〜２４３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  245. １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上の修飾ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のピリミジン位置におけるＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  246. １、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾保存領域ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のピリミジン位置におけるＹＡ修飾を含む、請求項２４５に記載のｇＲＮＡ。
  247. １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれ以上の修飾ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のアデニン位置におけるＹＡ修飾を含む、請求項２０５〜２４６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  248. １、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾保存領域ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のアデニン位置におけるＹＡ部位修飾を含む、請求項２４７に記載のｇＲＮＡ。
  249. ｉ．Ｈ１−１の修飾、
    ｉｉ．Ｈ２−１の修飾、または
    ｉｉｉ．Ｈ１−１およびＨ２−１の修飾を含む、請求項２０５〜２４８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  250. Ｈ１−１および／またはＨ２−１が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項２４９に記載のｇＲＮＡ。
  251. Ｈ１−１および／またはＨ２−１が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２５０に記載のｇＲＮＡ。
  252. Ｈ１−１および／またはＨ２−１が、ＰＳ修飾を含む、請求項２５１に記載のｇＲＮＡ。
  253. Ｂ３における修飾を含み、任意選択により、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、または２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、請求項２０５〜２５２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  254. Ｂ４における修飾を含み、任意選択により、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、または２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、請求項２０５〜２５３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  255. Ｂ５における修飾を含み、任意選択により、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、または２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、請求項２０５〜２５４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  256. ＬＳ１０における修飾を含み、任意選択により、ＬＳ１０が、２’−フルオロ以外の修飾を含む、請求項２０５〜２５５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  257. Ｎ２における修飾を含む、請求項２０５〜２５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  258. Ｎ３における修飾を含む、請求項２０５〜２５７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  259. Ｎ４における修飾を含む、請求項２０５〜２５８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  260. Ｎ５における修飾を含む、請求項２０５〜２５９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  261. Ｎ６における修飾を含む、請求項２０５〜２６０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  262. Ｎ７における修飾を含む、請求項２０５〜２６１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  263. Ｎ１０における修飾を含む、請求項２０５〜２６２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  264. Ｎ１１における修飾を含む、請求項２０５〜２６３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  265. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１１が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１３が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｖｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１４が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｖｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７が、２’−フルオロ修飾を含まない、および／または
    ｖｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１８が、２’−フルオロ修飾を含まない、請求項２０５〜２６４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  266. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、２’−フルオロ修飾を含まない、および／または
    ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、２’−フルオロ修飾を含まない、請求項２０５〜２６５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  267. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、ホスホロチオエート結合を含まない、および／または
    ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、ホスホロチオエート結合を含まない、請求項２０５〜２６６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  268. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド７が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド９が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、請求項２０５〜２６７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  269. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド２０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、請求項２０５〜２６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  270. 前記ガイドＲＮＡが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜１１および１３〜２０のうちのいずれか１つ以上における２’−フルオロ修飾を含み、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２が、２’−フルオロ修飾を含まない、請求項２０５〜２６９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  271. 前記ガイドＲＮＡが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちのいずれか１つ以上における２’−フルオロ修飾を含み、
    ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１１が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１２が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１３が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１４が、２’−フルオロ修飾を含まない、
    ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１７が、２’−フルオロ修飾を含まない、および／または
    ｖｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１８が、２’−フルオロ修飾を含まない、請求項２０５〜２７０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  272. ｉ．Ｂ２が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｉ．Ｂ３が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｉｉ．Ｂ４が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
    ｉｖ．Ｂ５が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、請求項２０５〜２７１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  273. ｉ．ＬＳ１が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｉ．ＬＳ８が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
    ｉｉｉ．ＬＳ１０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、請求項２０５〜２７２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  274. ｉ．Ｎ２が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｉ．Ｎ３が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｉｉ．Ｎ４が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｖ．Ｎ５が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｖ．Ｎ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｖｉ．Ｎ７が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｖｉｉ．Ｎ１０が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｖｉｉｉ．Ｎ１１が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
    ｉｘ．Ｎ１６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、および／または
    ｘ．Ｎ１７が、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、請求項２０５〜２７３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  275. ｉ．Ｈ１−２が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｉｉ．Ｈ１−３が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｉｉｉ．Ｈ１−４が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｉｖ．Ｈ１−５が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｖ．Ｈ１−６が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｖｉ．Ｈ１−７が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｖｉｉ．Ｈ１−８が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｖｉｉｉ．Ｈ１−９が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｉｘ．Ｈ１−１０が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘ．Ｈ２−１が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｉ．Ｈ２−２が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｉｉ．Ｈ２−３が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｉｉｉ．Ｈ２−４が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｉｖ．Ｈ２−５が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｖ．Ｈ２−６が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｖｉ．Ｈ２−７が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｖｉｉ．Ｈ２−８が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｖｉｉｉ．Ｈ２−９が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｉｘ．Ｈ２−１０が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｘ．Ｈ２−１１が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｘｉ．Ｈ２−１２が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｘｉｉ．Ｈ２−１３が、ホスホロチオエート結合を含まない、
    ｘｘｉｉｉ．Ｈ２−１４が、ホスホロチオエート結合を含まない、および／または
    ｘｘｉｖ．Ｈ２−１５が、ホスホロチオエート結合を含まない、請求項２０５〜２７４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  276. ｉ．任意選択によりＰＳ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０、
    ｉｉ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８、ならびに
    ｉｉｉ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾であるか、または保存領域ＹＡ部位１もしくは８である、Ｈ１−１およびＨ２−１、における修飾を含むｓｇＲＮＡである、ｇＲＮＡ。
  277. ｉ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、および９、ならびに
    ｉｉ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、保存領域ＹＡ部位８、におけるＹＡ修飾を含むｓｇＲＮＡである、ｇＲＮＡ。
  278. ４つのガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾を含むｇＲＮＡであって、前記ＹＡ部位の少なくとも１つが、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８またはその後にあり、
    ｉ．前記第１のＹＡ部位が、２’−ＯＭｅ修飾を含み、
    ｉｉ．前記第２のＹＡ部位が、２’−フルオロ修飾を含み、
    ｉｉｉ．前記第３のＹＡ部位が、２’−フルオロまたはＰＳ修飾を含み、および
    ｉｖ．前記第４のＹＡ部位が、ＰＳ修飾を含み、
    任意選択により、前記第１、第２、第３、および第４のＹＡ部位が、５’から３’の方向に配置されている、ｇＲＮＡ。
  279. 前記第３のＹＡ部位が、ＰＳ修飾を含む、請求項２７８に記載のｇＲＮＡ。
  280. 前記第３のＹＡ部位が、２’−フルオロ修飾を含む、請求項２７８または２７９に記載のｇＲＮＡ。
  281. 任意選択により前記第４のＹＡ部位の３’である、ＰＳ修飾を含む第５のＹＡ部位をさらに含む、請求項２７８〜２８０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  282. 保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、および９が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＹＡ修飾を含み、保存領域ＹＡ部位８が、任意選択により２’−フルオロ修飾である、修飾を含む、請求項２０５〜２８１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  283. ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４であって、前記ＹＡ修飾が、任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ヌクレオチド４、
    ｉｉ．任意選択によりＰＳ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０、
    ｉｉｉ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８、
    ｉｖ．任意選択により２’−フルオロ修飾である、ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１、
    ｖ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２、
    ｖｉ．任意選択により２’−ＯＭｅ修飾である、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、およびＮ１７、ならびに
    ｖｉｉ．任意選択により２’−フルオロ修飾であるＮ１４、におけるＹＡ修飾を含むｓｇＲＮＡである、ｇＲＮＡ。
  284. 以下：
    ｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
    ｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０が、ＰＳ修飾を含む、
    ｉｉｉ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８が、２’−フルオロ修飾を含む、
    ｉｖ．ＬＳ５、ＬＳ７、ＬＳ９、およびＬＳ１１が、２’−フルオロ修飾を含む、
    ｖ．ＬＳ８、ＬＳ１０、およびＬＳ１２が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、
    ｖｉ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、およびＮ１７が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、および
    ｖｉｉ．Ｎ１４が、２’−フルオロ修飾を含むのうちの１つ以上が当てはまる、請求項１６１〜のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  285. 少なくとも１つのＹＡ修飾が、前記ＹＡ部位のピリミジン位置の修飾を含む、請求項１６１〜２８４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  286. 少なくとも１つのＹＡ修飾が、前記ＹＡ部位のアデニン位置の修飾を含む、請求項１６１〜２８５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  287. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のピリミジン位置におけるＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜２８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  288. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のアデニン位置におけるＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜２８７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  289. 少なくとも１つのＹＡ修飾が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１６１〜２８８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  290. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１６１〜２８９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  291. 各修飾保存領域ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のピリミジン位置における修飾を含む、請求項１６１〜２９０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  292. 各修飾ガイド領域ＹＡ部位、または各修飾保存領域およびガイド領域ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のピリミジン位置における修飾を含む、請求項１６１〜２９１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  293. 各修飾保存領域ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のアデニン位置における修飾を含む、請求項１６１〜２９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  294. 各修飾ガイド領域ＹＡ部位、または各修飾保存領域およびガイド領域ＹＡ部位が、前記ＹＡ部位のアデニン位置における修飾を含む、請求項１６１〜２９３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  295. ＬＳ５における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜２９４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  296. ＬＳ７における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜２９５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  297. ＬＳ９における修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、ＬＳ９が修飾され、ＬＳ５、ＬＳ７、およびＬＳ１２が非修飾である場合、ＬＳ９の修飾が２’−フルオロ以外である、請求項１６１〜２９６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  298. ＬＳ１２における修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、ＬＳ１２が修飾され、ＬＳ９が非修飾である場合、ＬＳ１２の修飾が２’−ＯＭｅ以外である、請求項１６１〜２９７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  299. 二次構造を安定化させる少なくとも１つのＹＡ修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、前記二次構造が、前記下部ステムである、請求項１６１〜２９８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  300. ＬＳ８および／またはＬＳ１１の少なくとも１つの修飾を含むｓｇＲＮＡであり、ＬＳ８および／またはＬＳ１１の前記修飾が二次構造を安定化させる、請求項１６１〜２９９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  301. ｉ．ＥＮＡ、
    ｉｉ．ＬＮＡ、または
    ｉｉｉ．二環式リボース修飾から選択される二次構造を安定化させるＹＡ修飾を含む、請求項１６１〜３００のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  302. Ｎ６における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３０１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  303. Ｎ１４における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３０２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  304. Ｎ１７における修飾を含むｓｇＲＮＡであり、任意選択により、Ｎ１７が修飾され、Ｎ６およびＮ１４が非修飾である場合、Ｎ１７の修飾が、２’−フルオロ以外および２’−ＯＭｅ以外である、請求項１６１〜３０３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  305. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも１、２、または３つが、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３が、ＰＳ修飾を含む、請求項１６１〜３０４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  306. 前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも１、２、または３つが、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜３が、ＰＳ修飾を含む、請求項１６１〜３０５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  307. 前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、ＰＳ修飾を含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１６１〜３０６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  308. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、ヘアピン２が、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、ヘアピン１およびヘアピン２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１６１〜３０７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  309. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、ヘアピン１およびヘアピン２が、デオキシリボヌクレオチドを含み、任意選択により、ヘアピン１およびヘアピン２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチドの全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１６１〜３０８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  310. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、ヘアピン１の開始から前記ｓｇＲＮＡの３’末端までの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチドの全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドであり、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド１〜３が、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１６１〜３０９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  311. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記上部ステムが、デオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１６１〜３１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  312. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記上部ステムの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの全てまたはほぼ全てが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１６１〜３１１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  313. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも１、２、または３つが、ＥＮＡを含み、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３が、ＰＳ修飾を含む、請求項１６１〜３１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  314. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜４のうちの少なくとも１、２、または３つが、ＥＮＡを含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜３が、ＰＳ修飾を含む、請求項１６１〜３１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  315. ５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３のうちの少なくとも１、２、または３つが、ＵＮＡを含み、任意選択により、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜３が、ＰＳ修飾を含む、請求項１６１〜３１４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  316. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜４のうちの少なくとも１、２、または３つが、ＵＮＡを含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド２〜３が、ＰＳ修飾を含む、請求項１６１〜３１５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  317. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、ＰＳ修飾を含み、任意選択により、３’末端部の３’末端からのヌクレオチド４が、２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１６１〜３１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  318. 前記ｇＲＮＡが、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  319. ３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡであり、前記３’末端修飾が、保護３’末端修飾である、請求項１６１〜３１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  320. 前記ｇＲＮＡが、３’テールを含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  321. 前記３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む、請求項３２０に記載のｇＲＮＡ。
  322. 前記３’テールが、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜５、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項３２０に記載のｇＲＮＡ。
  323. 前記ヘアピン領域における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  324. ３’末端修飾および前記ヘアピン領域における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  325. 前記ヘアピン領域における前記修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項３２３または３２４に記載のｇＲＮＡ。
  326. 前記ヘアピン領域における前記修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項３２３〜３２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  327. 前記ヘアピン領域における前記修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項３２３〜３２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  328. ３’および／または５’保護末端修飾（複数可）を含む、請求項１６１〜３２７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  329. 前記３’および／または５’末端修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ｍｏｅ）修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせから選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項３２８に記載のｇＲＮＡ。
  330. 前記３’および／または５’末端修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項３２８または３２９に記載のｇＲＮＡ。
  331. 前記３’および／または５’末端修飾が、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項３２８または３２９に記載のｇＲＮＡ。
  332. 前記３’および／または５’末端修飾が、ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むかまたはさらに含む、請求項３２８または３２９に記載のｇＲＮＡ。
  333. 前記３’および／または５’末端修飾が、反転した脱塩基修飾ヌクレオチドを含むかまたはさらに含む、請求項３２８または３２９に記載のｇＲＮＡ。
  334. 前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、前記ｓｇＲＮＡが、３’末端修飾を含む場合、前記３’末端修飾が、
    ｉ．最後の７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の修飾、
    ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
    ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１６１〜３３３のいずれか一項いずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  335. 前記３’末端修飾が、１〜７、１〜５、１〜４、または２〜４個のヌクレオチドの修飾を含む、請求項３３４に記載のｇＲＮＡ。
  336. 前記ｇＲＮＡが、３’末端修飾を含むｓｇＲＮＡであり、前記３’末端修飾が、
    ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
    ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド
    ｖｉ．ＥＮＡ、ＵＮＡ、および／またはＤＮＡ、ならびに
    ｖｉｉ．またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１６１〜３３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  337. 前記ｇＲＮＡが、３’テールを含むｓｇＲＮＡであり、前記３’テールが、
    ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
    ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド
    ｖｉ．ＥＮＡ、ＵＮＡ、および／またはＤＮＡ、ならびに
    ｖｉｉ．またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１６１〜３３６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  338. 前記３’末端修飾が、
    ｉ．１、２、３、４、５、６、もしくは７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、
    ｉｉ．約１〜３、１〜５、１〜６、もしくは１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、または
    ｉｉｉ．各ヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、請求項３３６に記載のｇＲＮＡ。
  339. 前記３’末端修飾が、少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項３２６〜３２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  340. 前記３’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
    ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、前記結合が最後のヌクレオチドと最後から２番目のヌクレオチドとの間にある、
    ｉｉ．最後の３個のヌクレオチド間に２個のＰＳ結合が存在する、
    ｉｉｉ．最後の４個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合が存在する、
    ｉｖ．最後の５個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合が存在する、または
    ｖ．最後の２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上の間にＰＳ結合が存在する、請求項３２６〜３２９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  341. 前記３’末端修飾が、
    ｉ．最後の１〜７個のヌクレオチドのうちの１個以上の修飾であって、前記修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせである修飾、
    ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後のヌクレオチドの修飾、ならびに隣りのヌクレオチドおよび／もしくは前記３’テールの１番目のヌクレオチドへの任意選択による１個もしくは２個のＰＳ結合、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後および／もしくは最後から２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
    ｉｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、および／もしくは最後から３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合
    ｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、および／もしくは最後から４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
    ｖｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、もしくはそれらの組み合わせによる最後、最後から２番目、最後から３番目、最後から４番目、および／もしくは最後から５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、請求項３３６〜３４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  342. 前記ｇＲＮＡが、３’テールを含むｓｇＲＮＡであり、前記３’テールが、前記３’テールに存在するヌクレオチドのうちのいずれか１個以上の修飾を含む、請求項１６１〜３４１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  343. 前記３’テールが、完全に修飾されている、請求項３４２に記載のｇＲＮＡ。
  344. 前記３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、または１〜１０個のヌクレオチドを含み、任意選択により、これらのヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上が修飾されている、請求項３４２に記載のｇＲＮＡ。
  345. 前記３’末端修飾が、以下：
    ｉ．配列番号４０１〜５３２のうちのいずれか１つに示される３’末端修飾、
    ｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）前記２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の３個の連続する２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個の連続するＰＳ結合、
    ｉｉｉ．（ｉ）３’末端部からの５個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｉｖ．ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
    ｖ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後のヌクレオチドにおける反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後の３個のヌクレオチドにおける３個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．（ｉ）３’末端部からの１５個の連続した２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、（ｉｉ）前記２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドの直ぐ５’側の５個の連続した２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｖｉｉ．（ｉ）ｓｇＲＮＡまたは短いｓｇＲＮＡの前記保存領域の最後の２０個のヌクレオチドにおける交互する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドおよび２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、ならびに（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｖｉｉｉ．（ｉ）２または３個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合、
    ｉｘ．最後のヌクレオチドと最後の隣りのヌクレオチドとの間の１個のＰＳ結合、ならびに
    ｘ．１５または２０個の連続する２’Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および（ｉｉ）最後の３個のヌクレオチド間の３個のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項３３６〜３４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  346. ５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、
    ｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１〜７のうちのいずれか１個以上の修飾、
    ｉｉ．１個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２個の修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．３個の修飾ヌクレオチド、
    ｖ．４個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉ．５個の修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．６個の修飾ヌクレオチド、および
    ｖｉｉｉ．７個の修飾ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１６１〜３４５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  347. ５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、保護５’末端修飾である、請求項１６１〜３４６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  348. ５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、１〜７、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２個のヌクレオチドの修飾を含む、請求項１６１〜３４７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  349. ５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、
    ｉ．最初の７個のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、または７個の修飾、
    ｉｉ．最初の７個のヌクレオチドのうちの約１〜３個、１〜４つ、１〜５個、１〜６個、または１〜７個の修飾、および
    ｉｉｉ．５’末端における１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、および／または７番目のヌクレオチドにおける修飾であって、任意選択により、前記修飾が連続している、修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１６１〜３４８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  350. ５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、
    ｉ．ヌクレオチド間ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
    ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｖ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．反転した脱塩基修飾ヌクレオチド
    ｖｉ．ＥＮＡ、ＵＮＡ、および／もしくはＤＮＡ、ならびに
    ｖｉｉ．それらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１６１〜３４９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  351. ５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、
    ｉ．１、２、３、４、５、６、および／もしくは７個のヌクレオチド間ＰＳ結合、または
    ｉｉ．約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、もしくは１〜７個のヌクレオチド間ＰＳ結合を含む、請求項１６１〜３５０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  352. 前記ｓｇＲＮＡが、５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、反転した脱塩基、２’−Ｈ、イノシン、または２’−Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、請求項１６１〜３５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  353. 前記５’末端修飾が、少なくとも１個のＰＳ結合を含み、
    ｉ．１個のＰＳ結合が存在し、前記結合が、前記ガイド領域のヌクレオチド１にある、
    ｉｉ．２個のＰＳ結合が存在し、前記結合が、前記ガイド領域のヌクレオチド１および２にある、
    ｉｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
    ｉｖ．前記ガイド領域の１、２、３、およびヌクレオチド４のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
    ｖ．前記ガイド領域の１、２、３、４、およびヌクレオチド５のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、
    ｖｉ．前記ガイド領域の１、２、３、４、５、およびヌクレオチド６のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、または
    ｖｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、３、４、５、６、および７のうちのいずれか１つ以上にＰＳ結合が存在する、請求項３５２に記載のｇＲＮＡ。
  354. 前記５’末端修飾が、
    ｉ．前記可変領域のヌクレオチド１〜７のうちの１つ以上の修飾であって、前記修飾が、ＰＳ結合、反転した脱塩基ヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、および／もしくはそれらの組み合わせである、修飾、
    ｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記ガイド領域の１番目のヌクレオチドの修飾、および隣りのヌクレオチドへの任意選択によるＰＳ結合、
    ｉｉｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目および／もしくは２番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
    ｉｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目、２番目、および／もしくは３番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、
    ｖ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目、２番目、３番目、および／もしくは４番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合、または
    ｖｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−ｍｏｅ、２’−Ｆ、２’−Ｈ、イノシン、もしくはそれらの組み合わせによる前記可変領域の１番目、２番目、３番目、４番目、および／もしくは５番目のヌクレオチドの修飾、ならびに任意選択により、１個以上のＰＳ結合を含む、請求項３５２または３５３に記載のｇＲＮＡ。
  355. ５’末端修飾を含み、前記５’末端修飾が、
    ｉ．配列番号１〜５４、４０１〜５３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、３３８８〜３４３０、または３５４９〜３５５２のうちのいずれか１つに示される５’末端修飾、
    ｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、ならびに３と４との間のＰＳ結合、
    ｉｖ．前記ガイド領域の１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、３、４、および５における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合、
    ｖｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、
    ｖｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’Ｏ−ｍｏｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、および３と４との間のＰＳ結合、
    ｖｉｉｉ．前記ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、
    ｉｘ．前記ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、ならびに前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、
    ｘ．前記ガイド領域のヌクレオチド１における反転した脱塩基修飾ヌクレオチド、前記ガイド領域のヌクレオチド１、２、および３における２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチド、ならびに前記可変領域のヌクレオチド１と２との間、２と３との間、３と４との間、４と５との間、および５と６との間のＰＳ結合のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１６１〜３５４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  356. 前記ｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡであり、前記上部ステム領域が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１６１〜３５５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  357. 前記上部ステム修飾が、
    ｉ．前記上部ステム領域におけるＵＳ１〜ＵＳ１２のうちのいずれか１つ以上の修飾、
    ｉｉ．前記上部ステム領域における少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または１２個全てのヌクレオチドの修飾、および
    ｉｉｉ．前記上部ステム領域における約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、または１〜１２個のヌクレオチドの修飾のうちのいずれか１つ以上を含む、請求項３４６に記載のｇＲＮＡ。
  358. 前記上部ステム修飾が、
    ｉ．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉ．２’−Ｈ修飾ヌクレオチド、
    ｉｉｉ．２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、および
    ｉｖ．それらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項３５６または３５７に記載のｇＲＮＡ。
  359. 前記ｇＲＮＡが、前記ヘアピン１領域における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３５８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  360. 前記ｓｇＲＮＡが、Ｈ１−１における修飾を含む、請求項３５９に記載のｇＲＮＡ。
  361. 前記ｇＲＮＡが、前記ヘアピン２領域における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３６０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  362. 前記ｓｇＲＮＡが、Ｈ２−１における修飾を含む、請求項３６１に記載のｇＲＮＡ。
  363. 前記ｇＲＮＡが、Ｈ１−１〜Ｈ１−１２における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３６２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  364. 前記ｇＲＮＡが、Ｈ２−１〜Ｈ２−１５における修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３６３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  365. 前記ｇＲＮＡが、前記上部ステム領域、前記ヘアピン１領域、および前記ヘアピン２領域の各々における１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３６４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  366. 前記ｇＲＮＡが、ヘアピン１領域とヘアピン２領域との間の修飾ヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３６５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  367. 修飾を含む下部ステム領域をさらに含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３６６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  368. ３’末端修飾をさらに含む、請求項１６１〜３６７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  369. ３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が修飾されている、請求項３６８に記載のｇＲＮＡ。
  370. ３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの少なくとも２個が、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、または２’−Ｏ−ｍｏｅにより修飾されている、請求項３６９に記載のｇＲＮＡ。
  371. ３’末端部の３’末端における最後の４個のヌクレオチドのうちの１個以上の間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合をさらに含む、請求項３６８〜３７０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  372. 修飾を含むバルジ領域をさらに含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３７１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  373. 修飾を含むネクサス領域をさらに含むｓｇＲＮＡである、請求項１６１〜３７２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  374. 表１の修飾を含む、配列番号４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、または１００７〜１１３２のいずれかを含むｓｇＲＮＡ。
  375. 配列番号４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、または１００７〜１１３２のうちのいずれか１つの核酸と少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８５、８０、７５、または７０％の同一性を有する核酸を含むｓｇＲＮＡであって、表１の参照配列識別子のヌクレオチドに対応するｓｇＲＮＡの各ヌクレオチドにおける修飾が、表１の参照配列識別子に示される修飾と同一または同等である、ｓｇＲＮＡ。
  376. 前記修飾が、前記ガイドの標的核酸を切断する能力を著しく変化させることなくｇＲＮＡの分解を低減する、請求項１６１〜３７５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  377. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、２’−フルオロ、２’−Ｈ、２’−Ｏ−Ｍｅ、ＥＮＡ、ＵＮＡ、またはＰＳを含む、請求項１６１〜３７６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  378. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、ジヌクレオチドモチーフの構造を変化させてＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減する、請求項１６１〜３７７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  379. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、ＲＮａｓｅによるＹＡ部位の認識もしくは切断を妨げ、かつ／またはＲＮＡ構造を安定化させる、請求項１６１〜３７８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  380. ＹＡ修飾を含み、前記修飾が、
    ｉ．２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ｍｏｅ、２’−Ｆアラビノース、および２’−Ｈ（デオキシリボース）から選択されるリボース修飾、
    ｉｉ．ＬＮＡ、ＢＮＡ、およびＥＮＡ等の二環式リボース類似体、
    ｉｉｉ．非ロックド核酸修飾、
    ｉｖ．イノシン、シュードウリジン、および５’−メチルシトシン等の塩基修飾、ならびに
    ｖ．ホスホロチオエート等のヌクレオシド間結合修飾のうちの１つ以上を含む、
    請求項１６１〜３７９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  381. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド５における修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  382. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド１２における修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  383. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド５および／またはヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  384. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド５および／またはヌクレオチド１２における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  385. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド５および／またはヌクレオチド１２における２’−Ｈ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  386. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド５および／またはヌクレオチド１２におけるホスホロチオエート修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  387. 前記ｇＲＮＡが、
    ｉ．ヌクレオチド８〜１０、
    ｉｉ．ヌクレオチド８および９、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド８および１０、または
    ｉｖ．ヌクレオチド９および１０、における修飾を含む、ガイド領域を含み、
    任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  388. 前記ｇＲＮＡが、
    ｉ．ヌクレオチド８〜１０、
    ｉｉ．ヌクレオチド８および９、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド８および１０、
    ｉｖ．ヌクレオチド９および１０、または
    ｖ．ヌクレオチド８、における２’−Ｆ修飾を含む、ガイド領域を含み、
    任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  389. 前記ｇＲＮＡが、
    ｉ．ヌクレオチド８〜１０、
    ｉｉ．ヌクレオチド８および９、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド８および１０、
    ｉｖ．ヌクレオチド９および１０、または
    ｖ．ヌクレオチド８、における２’−Ｆ修飾を含む、ガイド領域を含み、
    ヌクレオチド８〜１０が、ホスホロチオエート修飾を含まず、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  390. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド８〜１０における２’−Ｆ修飾、ならびに
    ｉ．ヌクレオチド８〜１０の１、２、もしくは３個におけるホスホロチオエート修飾、
    ｉｉ．ヌクレオチド８におけるホスホロチオエート修飾、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド９におけるホスホロチオエート修飾、
    ｉｖ．ヌクレオチド１０におけるホスホロチオエート修飾、
    ｖ．ヌクレオチド８および９におけるホスホロチオエート修飾、
    ｖｉ．ヌクレオチド８および１０におけるホスホロチオエート修飾、
    ｖｉｉ．ヌクレオチド９および１０におけるホスホロチオエート修飾、または
    ｖｉｉｉ．ヌクレオチド８〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、ガイド領域を含み、
    任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３８９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  391. 前記ｇＲＮＡが、
    ｉ．ヌクレオチド５および６における２’−Ｆもしくはホスホロチオエート修飾、
    ｉｉ．ヌクレオチド５および６における２’−Ｆ修飾、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド５および６におけるホスホロチオエート修飾、
    ｉｖ．ヌクレオチド５における２’−Ｆ修飾およびヌクレオチド６におけるホスホロチオエート修飾、または
    ｖ．ヌクレオチド６における２’−Ｆ修飾およびヌクレオチド５におけるホスホロチオエート修飾を含む、ガイド領域を含み、
    任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および７〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３９０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  392. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド６〜１１のうちの少なくとも１、２、３、４、５、または６個における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３９１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  393. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド１〜４および６〜１１のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３９２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  394. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド６〜１１における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３におけるホスホロチオエート修飾、および／またはヌクレオチド１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３９３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  395. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド１〜４における２’−Ｆ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド６〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３９４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  396. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド９における２’−Ｆ修飾を含み、ヌクレオチド９におけるホスホロチオエート修飾を含まない、ガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜８および１０におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８、１０、１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜３９５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  397. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８個における２’−Ｆ修飾を含まないガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜３９６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  398. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含まないガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜３９７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  399. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド９、１１、１３、および１４のうちの少なくとも１、２、３、または４個における２’−ＯＭｅ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜３９８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  400. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド９、１１、１３、および１４における２’−ＯＭｅ修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに／またはヌクレオチド１〜３および６〜１０におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜３９９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  401. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド８および１０の一方または両方にホスホロチオエート修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記ガイド領域が、ヌクレオチド１〜４における２’−ＯＭｅ修飾、ヌクレオチド１〜３および６〜７におけるホスホロチオエート修飾、ならびに／またはヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、および１８における２’−Ｆ修飾を含む、請求項１〜４００のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  402. 前記ｇＲＮＡが、以下のヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個、または全てにおける修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、またはホスホロチオエート修飾である、請求項１〜４０１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  403. 前記ｇＲＮＡが、ヌクレオチド１、２、３、４、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７、および１８における修飾を含むガイド領域を含み、任意選択により、前記修飾が、２’−ＯＭｅ、２’−フルオロ、またはホスホロチオエート修飾である、請求項１〜４０２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  404. ２’−ＯＭｅ修飾が、ヌクレオチド６〜１１および１３末端における前記ガイド領域に存在しない、請求項１〜４０３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  405. ２’−フルオロ修飾が、ヌクレオチド１〜７、１５、１６、および１９末端における前記ガイド領域に存在しない、請求項１〜４０４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  406. ホスホロチオエート修飾が、ヌクレオチド４、５、１１〜１４、１７、および１８における前記ガイド領域に存在しない、請求項１〜４０５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  407. 前記ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド２０を含む、請求項１〜４０６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  408. 前記ガイド領域が、２０個のヌクレオチドからなる、請求項１〜４０７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  409. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における修飾を含む、請求項１〜４０８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  410. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１２における修飾を含む、請求項１〜４０９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  411. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１５における修飾を含む、請求項１〜４１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  412. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１６における修飾を含む、請求項１〜４１１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  413. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１９における修飾を含む、請求項１〜４１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  414. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド５が非修飾である、請求項１〜４１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  415. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１２が非修飾である、請求項１〜４１４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  416. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１５が非修飾である、請求項１〜４１５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  417. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１６が非修飾である、請求項１〜４１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  418. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位を含まず、ヌクレオチド１９が非修飾である、請求項１〜４１７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  419. 前記ｇＲＮＡが、以下：
    ｉ．ヌクレオチド１における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｉ．ヌクレオチド２における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド３における２’−ＯＭｅおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｖ．ヌクレオチド４における２’−ＯＭｅ修飾、
    ｖ．ヌクレオチド６におけるホスホロチオエート修飾、
    ｖｉ．ヌクレオチド７におけるホスホロチオエート修飾、
    ｖｉｉ．ヌクレオチド８における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
    ｖｉｉｉ．ヌクレオチド９における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
    ｉｘ．ヌクレオチド１０における２’−フルオロおよびホスホロチオエート修飾、
    ｘ．ヌクレオチド１１における２’−フルオロ修飾、
    ｘｉ．ヌクレオチド１３における２’−フルオロ修飾、
    ｘｉｉ．ヌクレオチド１４における２’−フルオロ修飾、
    ｘｉｉｉ．ヌクレオチド１７における２’−フルオロ修飾、および
    ｘｉｖ．ヌクレオチド１８における２’−フルオロ修飾のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個、または全てを含むガイド領域を含む、請求項１〜４１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  420. 前記ガイド領域が、前の請求項に記載の修飾の各々を含む、請求項１〜４１９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  421. 前記ガイド領域が、以下：
    ｉ．ヌクレオチド５および６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾、
    ｉｉ．ヌクレオチド１２および１３がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾、
    ｉｉｉ．ヌクレオチド１５および１６がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１５におけるホスホロチオエートまたは２’−Ｈ修飾、
    ｉｖ．ヌクレオチド１６および１７がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾、ならびに
    ｖ．ヌクレオチド１９および２０がＹＡ部位を形成する場合、ヌクレオチド１９におけるホスホロチオエートまたは２’−フルオロ修飾のうちの少なくとも１、２、３、または４つを含む、請求項１〜４２０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  422. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド５〜６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド５における２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１〜４２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  423. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１２〜１３におけるＹＡ部位、およびヌクレオチド１２における２’−ＯＭｅ修飾を含む、請求項１〜４２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  424. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１５〜１６におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜４２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  425. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１６〜１７におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜４２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  426. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９〜２０におけるＹＡ部位およびヌクレオチド１９におけるホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜４２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  427. 前記ガイド領域が、ヌクレオチド１９における２’−フルオロ修飾を含む、請求項１〜４２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  428. 前記ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１５を含むか、またはヌクレオチド１５におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、請求項１〜４２７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  429. 前記ガイド領域が、非修飾ヌクレオチド１６を含むか、またはヌクレオチド１６におけるホスホロチオエート修飾のみを含む、請求項１〜４２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  430. 前記ｇＲＮＡが、ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含むｓｇＲＮＡであり、前記ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠いている、請求項１〜４２９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  431. 前記少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドが連続している、請求項４３０に記載のｇＲＮＡ。
  432. 前記少なくとも５〜１０個の欠いているヌクレオチドが、
    ｉ．ヘアピン１内にある、
    ｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」内にある、
    ｉｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチド内にある、
    ｉｖ．ヘアピン１の少なくとも一部を含む、
    ｖ．ヘアピン２内にある、
    ｖｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
    ｖｉｉ．ヘアピン１およびヘアピン２内にある、
    ｖｉｉｉ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
    ｉｘ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
    ｘ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
    ｘｉ．ヘアピン１もしくはヘアピン２内にあり、任意選択により、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
    ｘｉｉ．連続し、
    ｘｉｉｉ．連続し、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、
    ｘｉｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン２の一部に及ぶ、
    ｘｖ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」に及ぶ、または
    ｘｖｉ．連続し、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチドに及ぶ、請求項４３０または４３１に記載のｇＲＮＡ。
  433. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、前記ｓｇＲＮＡが、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２における修飾を含む、請求項４３０〜４３２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  434. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
    ｉ．５〜１０個のヌクレオチドからなる、
    ｉｉ．６〜１０個のヌクレオチドからなる、
    ｉｉｉ．５個のヌクレオチドからなる、
    ｉｖ．６個のヌクレオチドからなる、
    ｖ．７個のヌクレオチドからなる、
    ｖｉ．８個のヌクレオチドからなる、
    ｖｉｉ．９個のヌクレオチドからなる、
    ｖｉｉｉ．１０個のヌクレオチドからなる、
    ｉｘ．５〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘ．６〜１０個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉ．５個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉｉ．６個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉｉｉ．７個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｉｖ．８個の連続するヌクレオチドからなる、
    ｘｖ．９個の連続するヌクレオチドからなる、または
    ｘｖｉ．１０個の連続するヌクレオチドからなる、請求項４３０〜４３３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  435. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１、配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０、または配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含み、任意選択により、前記ｓｇＲＮＡが、少なくともＨ１−１〜Ｈ１−５およびＨ２−１〜Ｈ２−１２における修飾を含む、請求項４３４に記載のｇＲＮＡ。
  436. 前記少なくとも５〜１０個のヌクレオチドが、
    ｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１を含む、
    ｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０を含む、
    ｉｉｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８を含む、
    ｉｖ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜６１からなる、
    ｖ．配列番号４００のヌクレオチド５３〜６０からなる、または
    ｖｉ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、請求項４３０〜４３５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  437. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１５個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４３６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  438. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１６個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４３７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  439. 前記ｇＲＮＡが、ｇＲＮＡのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１７個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含み、前記ｇＲＮＡが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のうちのいずれか１つである、請求項１〜４３８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  440. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１８個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４３９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  441. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０の修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０のうちの少なくとも１９個における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  442. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのヌクレオチド１〜２０における修飾パターンと一致する、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド１〜２０における修飾および／または非修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４４１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  443. 前記ｇＲＮＡが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つの修飾パターンの少なくとも７５％と一致する修飾パターンを含む、請求項１〜４４２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  444. 前記ｇＲＮＡが、表１のｇＲＮＡのうちのいずれか１つの修飾パターンを含み、前記修飾パターンが、配列番号１〜５４、２０１〜２５４、３０１〜３５４、４０１〜５３５、６０１、６０７〜７３２、８０１、８０７〜９３２、１００１、１００７〜１１３２、１２０５〜１２１２、１３２２〜１４０６、１４１７〜１５０１、１５１１〜１５９６、３０１８〜３０５９、３０６３〜３１０４、３１０８〜３１４９、３１５３〜３１９４、３１９８〜３２３９、３２４３〜３２８４、３２９５〜３３４１、３３４３〜３３８５、または３３８８〜３４３０のｇＲＮＡのうちのいずれか１つと同じである、請求項１〜４４３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  445. 前記ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも７５％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項４３７〜４４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  446. 前記ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項４３７〜４４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  447. 前記ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項４３７〜４４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  448. 前記ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項４３７〜４４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  449. 前記ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項４３７〜４４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  450. 前記ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と少なくとも９８％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項４３７〜４４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  451. 前記ｇＲＮＡのヌクレオチド２１末端の配列と１００％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項４３７〜４４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  452. 請求項１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物。
  453. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合した、請求項１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む組成物。
  454. ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡまたは請求項４５２または４５３に記載の組成物を含む組成物。
  455. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質である、請求項４５４に記載の組成物。
  456. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項４５５に記載の組成物。
  457. 前記Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９またはＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９である、請求項４５６に記載の組成物。
  458. 前記ヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはｄＣａｓである、請求項４５３〜４５７のいずれか一項に記載の組成物。
  459. 前記ヌクレアーゼが、修飾されている、請求項４５３〜４５８のいずれか一項に記載の組成物。
  460. 前記修飾ヌクレアーゼが、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項４５９に記載の組成物。
  461. 前記ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項４５２〜４６０のいずれか一項に記載の組成物。
  462. 前記ｍＲＮＡが、配列番号３４９９〜３５２７または３５２９〜３５４６のうちのいずれか１つの配列を含む、請求項４６１に記載の組成物。
  463. 請求項１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡまたは請求項４５２〜４６２のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬製剤。
  464. 標的ＤＮＡを修飾する方法であって、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ならびに
    ｉ．請求項１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、
    ｉｉ．請求項４５２〜４６２のいずれか一項に記載の組成物、および
    ｉｉｉ．請求項４６３に記載の医薬製剤のうちのいずれか１つ以上を細胞に送達することを含む、方法。
  465. 前記方法が、遺伝子における挿入または欠失をもたらす、請求項４６４に記載の方法。
  466. 鋳型を前記細胞に送達することをさらに含み、前記鋳型の少なくとも一部が、前記Ｃａｓタンパク質によって誘導される二本鎖切断部位におけるまたはその付近の標的ＤＮＡに組み込まれる、請求項４６４または請求項４６５に記載の方法。
  467. 疾患または障害を治療するための医薬の調製に使用するための、請求項１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、請求項４５２〜４６２に記載の組成物、または請求項４６３に記載の医薬製剤。
  468. 疾患または障害を治療するための医薬の製造における、請求項１〜４５１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、請求項４５２〜４６２に記載の組成物、または請求項４６３に記載の医薬製剤の使用。
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