JP2021519071A - シュードウリジン化のための核酸分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年3月27日出願の米国仮特許出願第62/648648号明細書の優先権および利益を主張し、当該明細書はその全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、全体を参照により本明細書に組み込む配列リストを含有する。2019年3月21日に創出された前記ASCII複製は、PQR_021WO_SL25.txtと命名され、32,768バイトのサイズである。
「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」および「ヒポキサンチン」(イノシンの核酸塩基)という用語は、本明細書で使用されるとき、その語の通りの核酸塩基を指す。
ACA19標的RNAの特定のウリジンのψへの変換のための、核小体低分子RNA(snoRNA)の構造に由来するシュードウリジン化ガイドオリゴヌクレオチドの設計
本発明の発明者らは、短鎖化box H/ACA snoRNAを使用してシュードウリジン化を誘導することが可能であり得るかどうかを知ろうとした。このために、全長ACA19 snoRNAの5’ヘアピン、およびH boxのほとんどが除去されたシュードウリジン化ガイドRNAを設計した(図4)。T7 RNAポリメラーゼを使用するin vitro転写によって、短鎖化ガイドRNAおよび全長snoRNAを産生した。細胞溶解物における試験のために、T7 RNAポリメラーゼを使用するin vitro転写([α−32P]UTPの存在下で)によって、または2ピースライゲーションによって、これらのガイドについての短鎖基質RNAを産生した。後者については、最初に、5’末端においてシュードウリジン化されるべきウリジンで終結する合成RNAオリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して[γ−32P]リン酸により5’ヒドロキシル基で放射性標識した。その後、放射性標識RNAオリゴヌクレオチドを、その5’末端で別のRNAオリゴヌクレオチドの3’ヒドロキシル基にライゲートして、基質RNAを形成した。架橋DNAオリゴの5’半分(15nt)が3’RNA断片と塩基対形成し、架橋DNAオリゴの3’半分(15nt)が5’RNA断片と塩基対形成するように、RNAオリゴヌクレオチドを30ntの架橋DNAオリゴヌクレオチドとアニーリングし、その後、それらにT4 DNAリガーゼを提供してRNAオリゴヌクレオチドを共有連結することによって、これを行った。その後、ライゲートした放射性標識RNA基質は、5’−AGGGGAACCCCACAGUCGAACCAAAACAAA−3’(配列番号1)の配列を有し、ここで、標的ウリジン(その5’側に放射性リン酸を含有する)に下線を引いた。その後、この基質RNAを分離し、変性ポリアクリルアミドゲルからそれを切除し、ゲルからそれを溶離し、最後にエタノール沈殿によってそれを濃縮することによって、この基質RNAを他の核酸から精製した。
ヒトCFTRの中途終止コドンの特定のウリジンの変換のためのpsEONの設計
ヒトCFTR遺伝子の中途終止コドン(PTC)のウリジンがψに変換され得るかどうかを調査した。例として、CFTR−G542X変異を選択した。これを試験する手技は、実施例1で説明される通りであった。
マウスIdua RNAの中途終止コドンの特定のウリジンの変換のためのsnoRNAの設計
マウスIdua RNAのPTCのウリジンがψに変換され得るかどうかを調査した。例として、ハーラー症候群を引き起こすことが公知のヒトIDUA W402X変異に対応する、マウスRNAのIdua−W392X変異を選択した。このために、基質RNAを実施例1と同様に構築し(2ピースライゲーション)、最終配列は、5’−GAUGGAGAACAACUCUAGGCAGAGGUCUCA−3’(標識した標的ウリジンに下線;配列番号3)であった。
イントロンに埋め込まれたガイドRNAを使用した、中途終止コドン含有ベクターのターゲティングされたシュードウリジン化
エクソン1/イントロン−ガイドRNA−イントロン/エクソン2構築物「pugIntron−IDUA」および「pugIntronOpt−IDUA」のクローニング:
pugIntron−IDUAプラスミド構築物を、元の骨格pdRLuc−Glに基づき(Woeller et al. 2008. EMBO Reports 9(5):446-451)、AgilentのPfuUltra II融合HS DNAポリメラーゼを使用して、PCR増幅および部位特異的変異誘発によって生成した。最初に、制限酵素部位SalIおよびPstIを親pdRLuc−Glベクターのヒトβ−グロビンの第1のイントロンに挿入することによって、pugIntronプラスミドを生成した。以下のプライマー:SDM1−GLintron1−Sal−Pst:5’−GTAAGTCGACGAATTCTGCAGGCTGCTGGTGG−3’(配列番号13)およびSDM2−GLintron1−Sal−Pst:5’−GCCTGCAGAATTCGTCGACTTACCTGCCCAGG−3’(配列番号14)を使用した。その後、ガイドRNAを、以下のSalI/PstI含有プライマー(スプライシングのための余分のPyリッチ配列もまた含まれた):pug−intron−FwdSalI:5’−GTTGTCGACGTGGGAGATTCT−3’(配列番号15)およびpug−intron−RevExPstI:5’−AATCTGCAGGGGAAAAGAGAGAGTCAACCTGTCTGCCTCGT−3’(配列番号16)を使用してPCRによって生成した。最初に、PstI制限酵素部位の下流であるが、それでもイントロン領域内に位置するHindIII部位を使用して、親ベクターのSalI−HindIII断片を中間ベクター(pEGFP−C3)に貼り付けた。その後、SalI−PstIで消化したガイドRNA PCR産物を、この中間ベクターに挿入した。最後に、SalI−HindIII断片をpugIntron発現親ベクターにクローニングし戻した。図12Aは、上流CMVプロモーター、エクソン1(E1)およびエクソン2(E2)ならびにイントロン部分にpugIntron−IDUAインサートを有する構築物を示し、SalIおよびPstI部位を示す。図13は、全pugIntron−IDUAプラスミドの配列(配列番号11)を示す。フォワードプライマーとしてpug−intron−FwdSalI(上記を参照のこと)およびリバースプライマーとして以下のプライマー(3’スプライス部位において追加の5’−AC−3’配列を創出する、pug−intron−RevExPstIリバースプライマーと比較して追加の2つのヌクレオチド(上記を参照のこと)に下線を引いた):pug−intronOPT−RevExPstI:5’−AATCTGCAGGGGAAAAGAGAGAGTCAGTACCTGTCTGCCTC−3’(配列番号21)を使用するPCRを行うことによって、この構築物のさらなる最適化型(より好適な3’スプライス部位配列を創出する)を作出した。上記に示されるクローニングステップを反復して、最適化プラスミドpugIntronOpt−IDUAを生成し、その全配列を配列番号22(配列番号11と比較して、イントロンのすぐ下流の追加の5’−AC−3’を含む)に示す。陰性対照pugCFTRは、pugIntronのPCR鋳型に使用したガイドRNAの原型であった。この構築物を、骨格がpugU2−34/44に由来する3つの重複DNAオリゴ(CFTRについて:pug−NBD1−F1HindIII 5’−ATTAAGCTTGT GTGGGAGATTCTTCTTCGGACAGAGAGAAACTCTGCTGTG−3’(配列番号27)、pug−NBD1−R1 5’−CTGCTGTGTCTGAAAGAAGATCTCCCTATAGTGACCCTGCCTTACCTTCTCCGGGACGAA−3’(配列番号28)およびpug−NBD1−R2BamHI 5’−ATGGATCCACCTGTCTGCCTCGTATTCTTCCGTTACGATTTCTCTCATTTCGTCCCGG−3’(配列番号29)、およびIDUAについて:pug−mmidua−F1HindIII 5’−ATTAAGCTTGTGTGGGAGATTCTGCCTCGGACAGAGAGAAACTCT GCTGTG−3’(配列番号30)、pug−mmidua−R1 5’−TTCGTCCCGGGGCAGAGAAGGCAGGGTCACTATAGGGAGATCAACTCTCAGACACAGCAG−3’(配列番号31)およびpug−mmidua−R2BamHI 5’−ATGGATCCACCTGTCTGCCTCgtaAACTCCCGTTACGATTTCTCTCATTTC GTCCCGG−3’(配列番号32)から作出した。その後、3ピースPCR産物を、HindIIIおよびBamHIで消化し、pcDNA3.1/Zeo(+)にクローニングした。
シュードウリジン化の標的配列として、ヒトβ−グロビン遺伝子を発現する構築物を使用した(WTおよびTER;Woeller et al. 2008)。グロビンコドン39においてPTCを含有するプラスミドのTER型において、標的配列(ガイドRNAの基質である)を、PfuUltra II融合HS DNAポリメラーゼを使用する部位特異的変異誘発によって製造業者(Agilent technologies)のプロトコールに従って、CFTR−G542X変異(陰性対照標的プラスミドとして働く)およびmmIDUA−W392X変異(pugIntron−IDUAプラスミドの標的)により交換した。元のpFLAG2CMV2−HBB構築物の33ntナンセンス領域(位置−15〜PTC(3nt)〜位置+15)を33nt mmIDUA−W392X標的配列(図14において太字で示される)と交換するために、以下のプライマー:SDM−GL39−SWAPto−mmidua−1:5’−TGGTGGATGGAGAACAACTCTAGGCAGAGGTCTCAAAGTT TGGGGATCTGTCCACTCC−3’(配列番号17)およびSDM−GL39−SWAPto−mmidua−2:5’−CCAAACTTTGAGACCTCTGCCTAGAGTTGTT CTCCATCCACCAGCAGCCTAAGGGTGG−3’(配列番号18)を増幅に使用した。CFTR−G542X変異を含有する交換したプラスミド(GL−CFTRスワップ)の生成のために、以下のプライマー:SDM−GL39−SWAPto−NBD1−1 5’−TGGTGGACAATATAGTTCTTTGAGAAGGTGGAATCACATTTGGGGATCTGTCCACTCC−3’(配列番号33)およびSDM−GL39−SWAPto−NBD1−2 5’−CCAAATGTGATTCCACCTTCTC AAAGAACTATATTGTCCACCAGCAGCCTAAGGGTGG−3’(配列番号34)を使用した。
HEK293TおよびHeLa細胞を、DMEM+10%FBS中で培養した。1mg/mLのストック溶液(pH7)としてのポリエチレンイミンHCl PEI MAX 40000(PolySciences)を使用して一過性トランスフェクションを行った。6ウェル皿で細胞を高コンフルエント(90〜100%)まで増殖させた。トランスフェクション溶液を調製するために、150μLのOpti−MEM(血清非含有)を、9μLのPEIストック溶液と混合し、得られた混合物を室温で5分間インキュベートした。この後、100ngの基質プラスミドDNA(野生型またはPTC含有)および2μgのガイドRNA発現プラスミドDNAを、上記に挙げたPEI/培地混合物に添加した。得られた溶液を室温で15分間インキュベートし、その後、混合物を各ウェルに直接添加した。
HEK293T細胞にGL39−IDUAスワップ基質プラスミドを、上記に示されるpugIntronOpt−IDUAガイド発現プラスミドを伴って、または伴わずにトランスフェクトした。TRIzol(商標)試薬(Invitrogen)を使用してトータルRNAを単離した。AMV逆転写酵素(Promega)により逆転写を行い、その後、RT産物を、GoTaq(登録商標)Green Master Mix(Promega)によるPCRによって15〜23サイクルを使用して増幅した。シュードウリジン化の標的mRNAを、以下のプライマー対:フォワードプライマー:RLuc−Gl ex1 S4:5’−TCTGCCGTTACTGCCCTGTG−3’(配列番号19)およびリバースプライマー:PE−mmiduaPTC+16:5’−CTTTGAGACCTCTGCC−3’(配列番号20)によるRT−PCRを使用して検出した。5S rRNAを以下のプライマー対:5SFwd:5’−GCCATACCACCCTGAACG−3’(配列番号23)および5SRev:5’−AGCTTCCGAGAT CAGACGAG−3’(配列番号24)により正規化目的のために検出した。ゲル電気泳動によってRT−PCR産物を分離し、Image Studio Lite(LI−COR)によって定量した。結果を図15に示し、HEK293T細胞にpugIntronOpt−IDUAプラスミド(ここではpugIntOptIDUA)を、標的プラスミドGL39−IDUAスワップ(ここではGL39IDUA)と共にトランスフェクトした場合、上記に示されるプライマーを使用したRT−PCR産物は、18サイクル後に検出することができた(矢印GL39により示される)が、15サイクル後ではまだ検出することができなかったことを示す。GL39−IDUAスワッププラスミドを、イントロン内保有ガイドRNA発現プラスミドを伴わずにトランスフェクトした場合、産物はほとんど検出することができなかった。このことは、GL39−IDUAスワッププラスミドからのmRNAの量は、ガイドRNAが導入されなかった場合よりもこれらの細胞において高かったことを示す。実際に、ガイド誘導RNAシュードウリジン化はNMDを抑制し、インタクトなmRNAレベルを37倍アップレギュレートした(レーン2で0.00437;レーン4で0.1617、5S対照によって正規化)。それゆえ、ガイドRNA(pugIntronOpt−IDUAプラスミドからの)は、リードスルーを与え、それによって、NMDを抑制することができること、およびシュードウリジン化が起こったことが結論付けられる。20〜23PCRサイクルを行った後に、および基質としてCFTR−G542X変異を有するプラスミドを使用し、ガイドRNA発現送達ベクターとしてpugIntCFTRを使用した場合、同様の結果が得られた(図19を参照のこと)。ここで、以下のプライマー:NBD1PSU−202Fwd:5’−CTGGAGCCTTCAGAGG−3’(配列番号35)およびNBD1PSU+40(491〜509)Rev:5’−GCTCTTGCTAAAGAAATTC−3’(配列番号36)を使用した。
NMD抑制を決定するためのRNA抽出および次のRT−PCR(上記に示される)に使用したものと同じトランスフェクトしたHEK293T細胞を使用して、細胞全体溶解物を生成した。これらを、0.02%SDSを補充した500μL NET2緩衝液(50mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl、0.05%Nonidet(商標)P40)中に調製した。細胞溶解物を超音波処理(レベル2で10秒間)に供し、続いて遠心分離(17,000xg、4℃で20分間)して、細胞片を除去した。上清をトータルタンパク質として使用し、タンパク質分析に供した。抗DYKDDDDK磁気アガロース(Thermo Scientific)を使用して、異所的に発現したFLAGタグ付きタンパク質を、トータルタンパク質から免疫沈降した。プルダウンし、免疫沈降したタンパク質を15%SDS−PAGEで分離し、免疫ブロットし、抗体をSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Scientific)によって検出した。一次抗体としてのモノクローナル抗FLAG M2、クローンM2(F1804、SIGMA)および二次抗体としてのヤギ抗マウスIgG(H&L)[HRP]、pAb(A10093、Genscript)により、FLAGタグ付きタンパク質を検出した。正規化目的のためにチューブリンハウスキーピング遺伝子を検出した(一次抗体:チューブリン−ベータ、ウサギポリクローナル抗体#RB−9249−P0(Thermo Scientific);二次抗体:抗ウサギIgG、HRP連結抗体#7074S(Cell Signaling))。
NMD抑制(RT−PCRを通して検出される、上記および図15を参照のこと)および全長FLAGタグ付きタンパク質の出現(ウェスタンブロットによって検出される、上記および図16を参照のこと)が、中途終止コドンを含有する標的プラスミドおよびシュードウリジン化のためのイントロン内保有ガイドRNAを使用することにより得られた実際のシュードウリジン化の結果であったことを確認するために、Adachi et al. (2019, Methods Mol Biol 1870:219-235)によって初期に説明されたCMC修飾プライマー伸長法を使用した。この多ステップ法は、シュードウリジン塩基を優先的に修飾する試薬、CMC(またはCMCT:N−シクロヘキシル−N’−(2−モルフォリノエチル)カルボジイミドメチル−p−トルエンスルホネート)を使用するシュードウリジン特異的アシル化に基づく。ウリジン、イノシンおよびグアノシン残基等の塩基もまた初期に誘導体化されるが、これらの誘導体化された塩基は、弱アルカリ処理ステップ後にそれらの天然の化学形態に加水分解し戻される一方で、シュードウリジンのみがアセチル化されたまま残るので、シュードウリジンを検出することが可能である。シュードウリジンの位置をマッピングする方法は、プライマー伸長反応を通してなされ、この反応では、シュードウリジン残基におけるCMCの嵩高さは、逆転写を封鎖し、CMC−シュードウリジン部位の1ヌクレオチド前にプライマー伸長についての終止を生成し得る。天然RT終止は、強い二次構造によって生成された人為的結果としても起こるので、これらを特定するために並行して陰性対照(CMC誘導体化を伴わない)を調べる。この試薬を、ヒト細胞のトランスクリプトームの全ての公知のシュードウリジン残基の位置をマッピングするために使用した(Carlile et al, 2014. Nature 515(7525):143-146)。このために、HEK293T細胞に、基質FLAG−GL39−IDUAスワッププラスミドを、pugIntron−IDUAプラスミドを伴って、またはpug−CFTR(CFTR特異的ガイドRNAは終止コドンのIDUA標的Uをシュードウリジン化することができないはずであるので陰性対照として働く)を伴って、トランスフェクトした。上記に説明される通りに、トータルRNAを抽出した。20μgのトータルRNAを、CMC処理、およびグロビン特異的プライマー:hGl193−209AS:5’−CCGAGCACTTTCTTGCC−3’(配列番号25)による後続のプライマー伸長に使用した。10μgのトータルRNAを、U6特異的プライマー:hU6−86−105AS:5’−AATATGGAACGCTTCACGAA−3’(配列番号26)によるU6 snRNA対照のプライマー伸長に使用した。結果を図17に示す。矢印は、ψ−CMC残基の存在のためにプライマー伸長が終止した産物の位置を示す。CMCで処理し、GL39−IDUAスワップ基質プラスミドおよびpugIntron−IDUAガイドRNA発現プラスミドをトランスフェクトした細胞のみで、これが起こった(パネルで拡大される)。GL−IDUAスワップを、陰性対照ガイドRNA発現pug−CFTRプラスミドと共にトランスフェクトした細胞からの試料では、バンドを検出することができなかった。プライマー伸長に使用したプライマーに関連するψ残基の位置は、正確に分かっている(92塩基)。これらの結果は、IDUA関連の中途終止コドンを有する標的プラスミドをトランスフェクトし、かつイントロン内に、イントロン配列からスプライスアウトされると基質配列をターゲティングすることができ、かつUAG終止コドンのUを特異的にシュードウリジン化することができるsnoRNAを有するプラスミドをコトランスフェクトしたHEK293T細胞において、シュードウリジン化が起こったことを明らかに実証する。
イントロンに埋め込まれたガイドRNAおよびpsEONによる処理に際してのmRNAレベルの増大
実施例4で示されたことにさらに付け加えて、その後、本明細書で詳細に概略されるpsEONもまた、基質GL−IDUAスワッププラスミドを使用して細胞へのトランスフェクション後にシュードウリジン化を産出し得るかどうかを試験した。このために、HEK293T細胞に、6ウェル皿でPEIを使用して、90〜100%コンフルエントにて、500ngのGL−IDUAスワップ基質プラスミドおよび2.5μgのpugIntron−IDUAガイドRNA発現プラスミドをトランスフェクトするか、または100pmol Cy3−IDUA−A psEONオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクションの4日後、細胞を洗浄し、24時間インキュベートした。トータルRNAを説明される通りに単離し、RT−PCRを、全ての試料について21サイクル行ったことを除いては上記に概略される通りに行った。RT−PCR産物をゲル電気泳動によって分離した。結果を図18に示す。これらは、DNAをトランスフェクトしなかった場合(トランスフェクトされた基質プラスミドに加えての、プラスミドまたはpsEONなしを意味する)、5S対照は豊富であったが、GL39 RT−PCR産物は検出可能でなかったことを示す。しかしながら、pugIntron−IDUAガイドRNA発現プラスミドのコトランスフェクション後、およびまたCy3−iDUA−A psEONのコトランスフェクション後、産物は検出可能であり、mRNAのリードスルーが起こったこと、およびNMDが阻害されたことを示した。これは、本発明の発明者らが、イントロンに埋め込まれたガイドRNAを使用することによってのみならず、本発明の短鎖psEONによってもシュードウリジン化を得ることができたことを示す。
本明細書で参照される特許および科学文献の各々の全開示は、全ての目的について参照により組み込む。
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実現され得る。それゆえ、上記実施形態は、本明細書で説明される本発明に対する限定ではなく、全ての点において例示であると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記の説明によってではなく、附属の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等の意味および範囲内に入る全ての変化は、本発明の範囲に包含されると意図される。
Claims (26)
- 哺乳動物細胞における標的RNAの標的ウリジンのシュードウリジン化のための核酸分子であって、前記核酸分子が、前記標的ウリジンを含む前記標的RNAと部分的二本鎖核酸複合体を形成することができるガイド領域を含み、前記部分的二本鎖核酸複合体が、哺乳動物シュードウリジン化酵素をエンゲージすることができ、前記ガイド領域が、前記部分的二本鎖核酸複合体において前記標的ウリジンを、それが前記哺乳動物シュードウリジン化酵素によってシュードウリジンに変換されるように位置させる補助となる、核酸分子。
- 前記シュードウリジン化酵素が、H/ACA−snoRNAに作用することができるリボ核タンパク質(RNP)複合体の一部である、請求項1に記載の核酸分子。
- 野生型H/ACA snoRNAよりも短く、前記野生型H/ACA snoRNAと比較して非天然修飾された1つまたは複数のヌクレオシドおよび/またはヌクレオシド間連結を含む、請求項1または2に記載の核酸分子。
- 前記野生型H/ACA snoRNAの2つのヘアピン構造のうちの1つ、好ましくは前記野生型H/ACA snoRNAの3’末端部分のヘアピン構造に対応する単一のガイド領域を含み、より好ましくは、5’末端ヌクレオチドが、前記野生型H/ACA snoRNAの前記2つのヘアピン構造間の領域からのヌクレオチドに対応する、請求項3に記載の核酸分子。
- 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79または80ヌクレオチドからなる、請求項3または4に記載の核酸分子。
- 前記非天然修飾が、リボース部分の修飾を含み、好ましくは、糖部分の2’−OHが、置換されている、請求項3〜5のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記置換が、2’−OMeまたは2’−MOEである、請求項6に記載の核酸分子。
- 1つまたは複数の非天然ヌクレオシド間連結、例としてホスホロチオエート連結を含む、請求項3〜7のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子がそこから発現されるイントロン配列に前記核酸分子が位置させられており、前記イントロン配列が、上流エクソンA配列と下流エクソンB配列との間に位置する、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記エクソンA/イントロン/エクソンB配列が、ベクター、好ましくはプラスミドまたはウイルスベクターに存在する、請求項9に記載の核酸分子。
- 前記エクソンA配列が、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン1であり、前記エクソンB配列が、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン2である、請求項9または10に記載の核酸分子。
- 実質的全長pugU2−34/44 snoRNAである、請求項9〜11のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ベクター、例としてプラスミドに存在し、CMVまたはpol−IIIプロモーター、好ましくはU6またはH1プロモーターから転写される、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記ガイド領域が、遺伝性障害と関連付けられる変異を含む標的RNAと部分的二本鎖複合体を形成することができる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記変異が、中途終止コドン(PTC)をもたらし、前記PTCが、前記遺伝性障害の原因であり、前記標的ウリジンが、前記PTCに存在する、請求項14に記載の核酸分子。
- 嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ−1−抗トリプシン(A1AT)欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−地中海貧血症、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、遠位型脊髄性筋萎縮症(DSMA)、デュシェンヌ/ベッカー筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーIおよびII型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病A、BおよびC型、NY−eso1関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビンG20210A変異等のプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症(常染色体優性の)、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、伴性免疫不全、スタージ・ウェーバー症候群またはがんの処置、予防、遅延または改善における使用のための請求項1〜15のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 標的RNA分子のウリジンをシュードウリジンに変換するための方法であって、標的ウリジンを含む標的RNAをシュードウリジン化酵素またはRNP複合体の存在下で請求項1〜16のいずれか一項に記載の核酸分子と接触させるステップと、それによって、前記ウリジンの変換を可能にするステップとを含み、好ましくは、前記シュードウリジン化酵素またはRNP複合体が、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に存在する、方法。
- 前記シュードウリジン化酵素またはRNP複合体が、前記哺乳動物細胞に天然に存在する、請求項17に記載の方法。
- 上流エクソンA配列と下流エクソンB配列との間に位置するイントロン配列を含むベクターであって、前記エクソンA配列および前記エクソンB配列が、前記イントロン配列にとって天然遺伝子ではない遺伝子のエクソン配列であり、前記イントロン配列が、標的ウリジンを含む標的RNAと部分的二本鎖核酸複合体を形成することができるガイド領域を含む核酸分子をコードするsnoRNA配列を含み、前記部分的二本鎖核酸複合体が、細胞において、哺乳動物シュードウリジン化酵素をエンゲージして、機能的RNP複合体を形成することができ、前記ガイド領域が、前記標的ウリジンを、それが前記RNP複合体によって変換されるように正確に位置させ、前記標的ウリジンが、前記RNP複合体によってシュードウリジンに変換される、ベクター。
- 前記snoRNAが、実質的全長pugU2−34/44 snoRNAである、請求項19に記載のベクター。
- 前記エクソンA配列が、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン1であり、前記エクソンB配列が、ヒトβ−グロビン遺伝子のエクソン2である、請求項19または20に記載のベクター。
- プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項19〜21のいずれか一項に記載のベクター。
- 嚢胞性線維症、ハーラー症候群、アルファ−1−抗トリプシン(A1AT)欠損症、パーキンソン病、アルツハイマー病、白皮症、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β−地中海貧血症、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、遠位型脊髄性筋萎縮症(DSMA)、デュシェンヌ/ベッカー筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝性多凝集症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーIおよびII型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病A、BおよびC型、NY−eso1関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛疾患、プロトロンビンG20210A変異等のプロトロンビン変異関連障害、肺高血圧症、網膜色素変性症(常染色体優性の)、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、伴性免疫不全、スタージ・ウェーバー症候群またはがんの処置、予防または改善における使用のための請求項19〜22のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項19〜23のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容される担体、安定剤または溶媒のうちの1つまたは複数を含む医薬組成物。
- 細胞、好ましくはヒト細胞において、標的RNA分子のウリジンをシュードウリジンに変換するための方法であって、
− 請求項19〜23のいずれか一項に記載のベクターを前記細胞に投与するステップと;
− エクソンA/イントロン/エクソンB配列の転写を可能にするステップと;
− 前記イントロンに位置させたsnoRNAのスプライシングおよび形成を可能にするステップと;
− 前記snoRNAが前記標的RNA分子と部分的二本鎖核酸複合体を形成することを可能にするステップと
を含み、前記部分的二本鎖核酸複合体が、哺乳動物シュードウリジン化酵素をエンゲージして機能的RNP複合体を形成することができ、前記snoRNAが、標的ウリジンを、それが前記RNP複合体によって変換されるように正確に位置させ、前記標的ウリジンが、前記RNP複合体によってシュードウリジンに変換される、方法。 - 請求項1〜16のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項19〜23のいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳動物細胞。
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