CN115851854A - 一种酶法合成假尿苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酶法合成假尿苷的方法，首先采用ppnN水解起始底物尿苷一磷酸，获得核糖‑5’‑磷酸和尿嘧啶，再通过假尿苷‑5’‑磷酸糖苷酶催化得到假尿苷‑5’‑单磷酸，最后利用酶去磷酸化获得假尿苷。本发明的假尿苷合成方法具有低成本、高效、温和环境污染小等优点。
Description
发明领域
本发明涉及假尿苷的生物合成技术领域，特别是涉及一种酶法合成假尿苷的方法。
发明背景
假尿苷(Pseudouridine，PU，Ψ)是RNA上的修饰核苷，又被称为RNA的“第五种核苷”。假尿苷是尿苷(Uridine)的一种异构体(式1)，和尿苷不同的是，它具有典型的C5-C1糖苷键，常见于tRNAs和rRNAs中。在自然界中，假尿苷是由假尿苷合酶对尿苷的N1-C1糖苷键进行切割，尿嘧啶碱基沿N3-C6轴旋转180°，重新连接到C5位置的核糖基部分形成(YuYT,Meier U T.RNA-guided isomerization of uridine to pseudouridine—pseudouridylation[J].RNAbiology,2014,11(12):1483-1494.)。
2005年，Karikó等人发现将假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低[Karikó K,Buckstein M,Ni H,etal.Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors:the impact ofnucleoside modification and the evolutionary origin of RNA[J].Immunity,2005,23(2):165-175.]。2008年，Karikó等人还发现用假尿苷完全替代尿苷的mRNA不仅能极大地降低mRNA的免疫原性，还能提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力[Karikó K,Muramatsu H,Welsh FA,et al.Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superiornonimmunogenic vector with increased translational capacity and biologicalstability[J].Molecular therapy,2008,16(11):1833-1840.]。尤其近年来，mRNA疫苗的研发和兴起更是加大了人们对假尿苷的关注。
目前，假尿苷的制备主要依赖于化学合成法，但化学合成法存在合成步骤繁杂、收率低且对环境污染较大等缺点，生物合成假尿苷则在一定程度上弥补了上述制备方法的不足。中国的专利申请文件CN114196715A中公开了一种化学酶法合成假尿苷的方法，但其中使用了高浓度盐酸加热水解一磷酸腺苷(AMP)来获得核糖-5’-磷酸，该过程中具有潜在的危险和环境不友好等特点，同时产生了废弃物腺苷。微生物菌株发酵方面，有研究者利用大肠杆菌异源表达假尿苷合成基因，得到可产假尿苷的工程菌(CN112592880B)，但又引入了培养周期长和纯化复杂的问题。
鉴于上述问题，需要对假尿苷的生产方式进行持续的改进。
发明概述
针对目前假尿苷合成过程中，化学合成步骤繁杂、收率低、污染大、危险系数高和微生物发酵周期长、纯化复杂等问题，寻找一种通过酶法催化生成假尿苷的方法，通过简单、温和、低成本的方式实现假尿苷的生产。
发明详述
为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供一种酶法合成假尿苷的方法，所述方法包括：(1)核糖-5’-磷酸和尿嘧啶在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶(PUG)存在的条件下反应，生成假尿苷-5’-磷酸；(2)假尿苷-5’-磷酸(PsiMP)在酶存在的条件下反应，生成假尿苷。在一些实施方式中，核糖-5’-磷酸和尿嘧啶可由糖苷水解酶水解尿苷一磷酸(UMP)获得。
另一方面，本发明提供一种酶法合成假尿苷的方法，所述方法包括：(1)UMP在糖苷水解酶存在的条件下反应，得到核糖-5’-磷酸和尿嘧啶；(2)核糖-5’-磷酸和尿嘧啶在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶存在的条件下反应，生成PsiMP；(3)PsiMP在酶存在的条件下反应，生成假尿苷。
在一些实施方式中，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶(PUG)来源于Deinococcus属细菌、Streptomyces属细菌、Legionella属细菌或Escherichia属细菌；优选来源于Deinococcusradiodurans、Streptomyces himastatinicus、Legionella pneumophila或EscherichiacoliK12。在一些实施方式中，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶(PUG)来源于Legionellapneumophila，其氨基酸序列如WP_010947645.1(NCBI登录号)所示。在一些实施方式中，PUG的氨基酸序列可选自如WP_010888939.1(NCBI登录号)、WP_009720488.1(NCBI登录号)、WP_010947645.1(NCBI登录号)、或WP_001292480.1(NCBI登录号)所示的序列。
在一些实施方式中，所述核糖-5’-磷酸、尿嘧啶和假尿苷-5’-磷酸糖苷酶反应的温度为37℃。在一些实施方式中，所述反应时间为2～10h，优选为4h、5h、6h、7h、8h。在一些实施方式中，所述反应在CoCl2存在的条件下发生。在一些实施方式中，核糖-5’-磷酸、尿嘧啶和假尿苷-5’-磷酸糖苷酶反应在MgCl2存在的条件下，37℃，进行2～10h。
在一些实施方式中，假尿苷-5’-磷酸和酶的反应中，所述的酶为磷酸酶，优选为碱性磷酸酶。在一些实施方式中，所述磷酸酶来源于Escherichia属细菌，优选为Escherichiacoli K12。在一些实施方式中，所述磷酸酶的氨基酸序列如CAF2498152.1(NCBI登录号)所示。
在一些实施方式中，假尿苷-5’-磷酸和酶的反应温度为37℃。在一些实施方式中，所述反应时间为2～10h，优选4h、5h、6h、7h、8h。在一些实施方式中，假尿苷-5’-磷酸和酶的反应在37℃的条件下，进行2～10h。
在一些实施方式中，所述核糖-5’-磷酸和尿嘧啶可由糖苷水解酶水解尿苷一磷酸获得，所述糖苷水解酶是ppnN。在一些实施方式中，糖苷水解酶来源于Escherichia coliK12。在一些实施方式中，糖苷水解酶的氨基酸序列如WP_000627995.1(NCBI登录号)所示。
在一些实施方式中，所述核糖-5’-磷酸、尿嘧啶和糖苷水解酶的反应温度为37℃。在一些实施方式中，所述反应时间为2～10h，优选4h、5h、6h、7h、8h。在一些实施方式中，所述反应在MgCl2存在的条件下发生。在一些实施方式中，核糖-5’-磷酸、尿嘧啶和糖苷水解酶的反应在MgCl2存在的条件下，37℃，进行2～10h。
在一些实施方式中，所述酶法合成假尿苷的方法，包括以下步骤：(1)核糖-5’-磷酸和尿嘧啶在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶存在的条件下反应，生成假尿苷-5’-磷酸；(2)假尿苷-5’-磷酸在磷酸酶存在的条件下反应，生成假尿苷；其中所述的假尿苷-5’-磷酸糖苷酶来源于Legionella pneumophila，其氨基酸序列如WP_010947645.1(NCBI登录号)所示；所述的磷酸酶为碱性磷酸酶，来源于Escherichia coliK12，其氨基酸序列如CAF2498152.1(NCBI登录号)所示。在一些实施方式中，核糖-5’-磷酸和尿嘧啶可由糖苷水解酶ppnN水解尿苷一磷酸获得；其中，所述的ppnN来源于Escherichia coli K12，其氨基酸序列如WP_000627995.1(NCBI登录号)所示。
在一些实施方式中，所述酶法合成假尿苷的方法，包括以下步骤：(1)尿苷一磷酸在糖苷水解酶存在的条件下反应，生成核糖-5’-磷酸和尿嘧啶；(2)核糖-5’-磷酸和尿嘧啶在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶存在的条件下反应，生成假尿苷-5’-磷酸；(3)假尿苷-5’-磷酸在磷酸酶存在的条件下反应，生成假尿苷；其中所述糖苷水解酶为ppnN，来源于Escherichiacoli K12，其氨基酸序列如WP_000627995.1(NCBI登录号)所示；所述的假尿苷-5’-磷酸糖苷酶来源于Legionella pneumophila，其氨基酸序列如WP_010947645.1(NCBI登录号)所示；所述的磷酸酶碱性磷酸酶，来源于Escherichia coli K12，其氨基酸序列如CAF2498152.1(NCBI登录号)所示。
在一些实施方式中，所述酶法合成假尿苷方法按照如下路线进行，
其中所述的ppnN来源于Escherichia coli K12，其氨基酸序列如WP_000627995.1(NCBI登录号)所示；所述的PUG来源于Legionella pneumophila，其氨基酸序列如WP_010947645.1(NCBI登录号)所示；所述的PhoA为碱性磷酸酶，来源于Escherichia coliK12，其氨基酸序列如CAF2498152.1(NCBI登录号)所示。
附图简述
图1为实施例2中尿苷一磷酸水解后生成尿嘧啶和核糖-5’-磷酸的HPLC检测结果；
图2至图6为实施例3中5种假尿苷-5’-磷酸糖苷酶催化生成假尿苷-5’-单磷酸的HPLC检测结果；
图7为实施例4中假尿苷-5’-单磷酸去磷酸后生成假尿苷的HPLC检测结果；
图8为尿苷一磷酸标准品HPLC结果；
图9为尿嘧啶标准品HPLC结果；
图10为假尿苷标准品HPLC结果。
有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明采用的酶法合成假尿苷，合成过程中转化效率高、纯化简单、反应条件温和、对环境友好，适用于工业化合成推广。
实施例
以下实施例对本发明作进一步说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制，本发明保护范围以权利要求为准。
若无特殊说明，本发明中所使用的实验材料均为常规生化试剂，所使用的实验方法均为常规方法。
实施例1酶的制备
(1)糖苷水解酶ppnN的制备
ppnN的基因序列见SEQ ID No.1，Escherichia coli K12基因组为模板，根据Genbank数据库中DNA序列设计引物，添加BamHI和NotI酶切位点与保护碱基，使用2×Phanta Max Master Mix(由南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产，Vazyme，货号P515)扩增得到ppnN的基因片段；以pET28a质粒为模板，PCR获得线性化载体片段。使用ClonExpressUltra One Step Cloning Kit(由南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产，Vazyme，货号C115)将片段ppnN和载体pET28a同源重组，获得重组质粒pET28a-ppnN，重组质粒经测序验证。
将重组质粒pET28a-ppnN转化于大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，挑单菌落至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD600在0.4-0.6之间，培养基降温至16℃，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行蛋白的诱导表达，200rpm培养16小时后离心收集发酵菌体，使用细胞超声破碎仪破碎菌体，通过镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白ppnN。
(2)碱性磷酸水解酶PhoA的制备
碱性磷酸水解酶PhoA的基因序列见SEQ ID NO.2，以Escherichia coli K12基因组为模板，根据DNA序列数据库序列设计引物，添加BamHI和NotI酶切位点与保护碱基，通过PCR扩增得到phoA的基因片段；所用质粒载体、扩增体系和试剂同(1)，测序结果如SEQ IDNO.2所示，得到重组质粒pET28a-phoA。
碱性磷酸水解酶PhoA的表达与纯化同(1)。
(3)假尿苷-5’-磷酸糖苷酶的制备
假尿苷-5’-磷酸糖苷酶的基因信息如表1所示，由擎科生物全基因合成DrPUG、ShPUG、LpPUG、EcPUG和DfPUG，其中ShPUG表达载体为pBADhisA，酶切位点BglII、KpnI；DrPUG、LpPUG、DfPUG表达载体为pET28a，酶切位点BamHI和NotI，同时在N端添加SUMO标签；EcPUG以Escherichia coliK12基因组为模板，根据DNA序列数据库序列设计引物，添加BamHI和NotI酶切位点与保护碱基，通过PCR扩增得到EcPUG基因片段；所用质粒载体、扩增体系和试剂同(1)。重组质粒经测序验证。
表1假尿苷-5’-磷酸糖苷酶
假尿苷-5’-磷酸糖苷酶的表达与纯化步骤同(1)，当使用pBADhisA载体时诱导剂和抗生素更换为0.02g/L的L-阿拉伯糖和50μg/mL的氨苄青霉素。
实施例2尿嘧啶和核糖-5’-磷酸的制备
配置如下反应体系：25mM HEPES pH7.5、2.5mM MgCl2、50mM尿苷一磷酸，加入终浓度为0.15mg/mL的实施例1(1)制备的糖苷水解酶ppnN，总体积1L。37℃、100rpm温育4小时后取样200μL，加入等体积的无水甲醇混匀，离心去除蛋白沉淀，上清经HPLC检测，以市售的尿苷一磷酸标准品为对照。样品中尿嘧啶被检出，而尿苷一磷酸被完全水解(见附图1和附图8)，说明反应体系中的尿苷一磷酸100％被转化为尿嘧啶和核糖-5’-磷酸。
尿嘧啶检测方法如下：
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18，2.1x 100mm,3.5um；
检测波长：254nm；
柱温：30℃；
流速：0.5mL/min；
流动相A：100mM三乙基铵醋酸盐(称取16.1g三乙基铵醋酸盐溶于1L水中)；
流动相B：100mM三乙基铵醋酸盐：乙腈(v/v)＝9:1；
洗脱梯度：流动相B起始浓度为5％，15min内升至20％；
进样量：5μL。
实施例3假尿苷-5’-单磷酸的制备
取实施例2中反应液2mL，分别加入终浓度为0.05mg/mL的实施例1(3)制备的假尿苷-5’-磷酸糖苷酶和0.5mM CoCl2，37℃、100rpm反应4小时后取样200μL，加入等体积的无水甲醇混匀，离心去除蛋白沉淀，上清经HPLC检测，以市售的尿嘧啶标准品为对照，检测方法同实施例2。
检测结果如表3所示，部分样品中假尿苷-5’-单磷酸被检出，其中加入LpPUG后转化率最高，为85.2％(见附图2、附图3、附图4、附图5、附图6与附图9)。
表3假尿苷-5’-磷酸糖苷酶制备假尿苷-5’-单磷酸
实施例4假尿苷的制备
(1)向实施例2剩余的反应液中加入终浓度为0.05mg/mL假尿苷-5’-磷酸糖苷酶LpPUG和0.5mM CoCl2，37℃、100rpm反应4小时。
(2)然后反应体系经80℃水浴10min，冷却至室温后用5M NaOH调至pH＝10.0，后向反应体系中补加终浓度为0.065mg/mL的实施例1(2)制备的碱性磷酸酶PhoA；37℃、100rpm反应4小时后取样200μL，加入等体积的无水甲醇混匀，离心去除蛋白沉淀；上清经HPLC检测，以市售的假尿苷标准品作为对照，检测方法同实施例2(结果见附图7和附图10)。样品中假尿苷被检出，假尿苷-5’-单磷酸的水解转化率为88.7％，收集反应液进行假尿苷的分离纯化。
通过本实施例获得假尿苷产量为12.2g/L，综合转化率为75.5％，纯度为98.9％。
Claims (9)
1.一种酶法合成假尿苷的方法，包括如下步骤：
(1)核糖-5’-磷酸和尿嘧啶在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶存在的条件下反应，生成假尿苷-5’-磷酸；
(2)假尿苷-5’-磷酸在磷酸酶存在的条件下反应，生成假尿苷；
其中，所述假尿苷-5’-磷酸糖苷酶来源于Deinococcus radiodurans、Streptomyceshimastatinicus、Legionella pneumophila或Escherichia coli K12。
2.一种酶法合成假尿苷的方法，包括如下步骤：
(1)尿苷一磷酸在糖苷水解酶存在的条件下反应，生成核糖-5’-磷酸和尿嘧啶；
(2)核糖-5’-磷酸和尿嘧啶在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶存在的条件下反应，生成假尿苷-5’-磷酸；
(3)假尿苷-5’-磷酸在磷酸酶存在的条件下反应，生成假尿苷；
其中，所述假尿苷-5’-磷酸糖苷酶来源于Deinococcus radiodurans、Streptomyceshimastatinicus、Legionella pneumophila或Escherichia coli K12。
3.根据权利要求1中所述的方法，核糖-5’-磷酸和尿嘧啶可由糖苷水解酶水解尿苷一磷酸获得。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶的氨基酸序列选自如WP_010888939.1(NCBI登录号)、WP_009720488.1(NCBI登录号)、WP_010947645.1(NCBI登录号)或WP_001292480.1(NCBI登录号)所示的序列。
5.根据权利要求2或3所述的方法，所述糖苷水解酶为ppnN，优选的，其氨基酸序列如WP_000627995.1(NCBI登录号)所示。
6.根据权利要求1或2所述的方法，所述磷酸酶为碱性磷酸酶，优选的，其氨基酸序列如CAF2498152.1(NCBI登录号)所示。
7.根据权利要求2或3所述的方法，尿苷一磷酸和糖苷水解酶反应温度为37℃，反应时间为2～10h，该反应中加入MgCl2。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，核糖-5’-磷酸、尿嘧啶和假尿苷-5’-磷酸糖苷酶反应的温度为37℃，反应时间为2～10h，该反应中加入CoCl2。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，假尿苷-5’-磷酸和磷酸酶反应的温度为37℃，反应时间为2～10h。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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