CN106191020B - 一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其核苷酸序列及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷‑5’‑二磷酸木糖合成酶，其原始氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；还提供了编码截短型尿苷‑5’‑二磷酸木糖合成酶基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示，以及含有该编码核苷酸序列的载体和宿主细胞。本发明还提供了截短型尿苷‑5’‑二磷酸木糖合成酶或含有截短型尿苷‑5’‑二磷酸木糖合成酶的细胞在催化底物尿苷‑5’‑二磷酸葡萄糖醛酸反应中的应用。

Description

一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成 酶，其核苷酸序列及应用
技术领域
本发明属于基因工程领域。涉及虎眼万年青中的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其编码基因及其在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸为尿苷-5’-二磷酸木糖反应中的应用。
背景技术
尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶(UXS)是生物体内生成尿苷-5’-二磷酸木糖(UDP-木糖)的关键酶。UXS能将尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-葡萄糖醛酸)脱去羧基而形成UDP-木糖(图1)。UDP-木糖是一个在糖蛋白、多糖和各种经过糖基修饰的次生代谢产物，如黄酮苷、三萜皂苷、甾体皂苷等生物合成中重要的糖基供体，它广泛存在于动物、植物、真菌、细菌中。许多糖基化的化合物与其苷元相比具有更好的水溶性，可以使化合物的成药性增加。但UDP-木糖含量低，合成困难，导致价格昂贵，不利于木糖苷的合成，给创新药物的研制带来了很大的困难。通过UXS对UDP-葡萄糖醛酸的催化，一步反应就能将UDP-葡萄糖醛酸转化为UDP-木糖，从而可以给天然产物的糖苷化提供稳定而廉价的糖基供体，这可以带来很大的经济利益。因此，克隆UXS基因并对其进行功能鉴定对于酶催化合成UDP-木糖这一化合物或者通过合成生物学技术规模化制备木糖苷天然产物，减少由于化学合成以及植物提取木糖苷类天然产物等传统方法对环境和物种造成的压力，从而促进社会可持续发展具有很重要的意义。
UXS在植物中以多基因家族存在，在UXS基因家族中存在膜结合型和细胞质溶型两种类别。细胞质溶型的UXS在原核系统中容易以可溶性蛋白表达，而膜结合型的UXS在原核系统中难以可溶性表达，通常不表达或表达成包涵体的形式。所以本发明，采取截短蛋白质N末端氨基酸序列的方法去除膜结合型UXS的跨膜区，使得原核细胞能产生可溶性UXS，获得具备功能的截短型UXS。
迄今为止，已在植物如十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，禾本科植物大麦(Hordeum vulgare)，细菌如草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中发现并克隆得到UDP-木糖合成酶基因，而尚没有从天门冬科科植物虎眼万年青(Ornithogalumcaudatum)中分离得到该蛋白的报道。通过提取虎眼万年青RNA，利用RT-PCR，从虎眼万年青无菌鳞茎中克隆得到OsaUXS2基因，并对其进行了功能鉴定，这是首次从虎眼万年青植物中克隆得到这个基因。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶、编码该酶的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的表达载体、含有该核苷酸序列或表达载体的宿主细胞，以及其在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸反应中的应用。
为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面提供了一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其特征在于：
a)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换，缺失或添加1-37个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
以上所述的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其特征在于，在截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶上可进行常规修饰；或者在截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶上还连接有用于检测或纯化的标签。
其中，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。
本发明还技术方案的第二方面提供了一种编码第一方面所述截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明技术方案的第三方面提供了一种含有第二方面所述核酸分子的表达载体。
本发明技术方案的第四方面提供了一种含有第三方面所述表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞优选大肠杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母，链霉菌和植物细胞，更优选的宿主细胞选自大肠杆菌。
本发明技术方案的第五方面提供了第一方面所述的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶或第二方面所述核酸分子或第三方面所述表达载体或第四方面所述宿主细胞在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸反应中的应用，其中的催化底物为尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸，产物为尿苷-5’-二磷酸木糖。
有益技术效果
UDP-木糖在生物体中含量低，合成困难，导致价格昂贵，不利于木糖苷的合成，给创新药物的研制带来了很大的困难。通过UXS2对UDP-葡萄糖醛酸的催化，一步反应就能将UDP-葡萄糖醛酸转化为UDP-木糖，从而可以给天然产物的糖苷化提供稳定而廉价的糖基供体，这可以带来很大的经济利益。对于膜结合型的UXS2，在经过对核苷酸序列截短处理之后，更容易表达形成可溶性的酶，有利于UDP-木糖的生物合成。
附图说明
图1：尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶所参与的催化反应。
图2：OsaUXS2基因的PCR分析结果，其中M是DNA分子量标准；1是OsaUXS2基因PCR结果。
图3：OsaUXS2蛋白的多序列比对结果。
图4：OsaUXS2蛋白的跨膜结构区预测结果。
图5：重组质粒pET28a-OsaUXS2示意图。
图6：截短型OsaUXS2重组蛋白SDS-PAGE分析银染结果，其中M为蛋白分子标准；1为空载体对照；2为截短型OsaUXS2重组蛋白SDS-PAGE分析银染结果。
图7：截短型OsaUXS2重组蛋白免疫印迹结果，其中CK为对照；1为截短型OsaUXS2。
图8：截短型OsaUXS2重组酶催化UDP-葡萄糖醛酸HPLC-UV检测结果，其中A为实验组；B为对照组(灭活的酶)；C不加NAD+的实验组；D为不加NAD+的对照组。
图9：截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸产物1H NMR图。
图10：温度对截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸活性的影响。
图11：pH对截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸活性的影响。
图12：截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸酶活曲线图。
图13：截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸Lineweaver-Burk双倒数图。
具体实施方式
本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
实施例1 虎眼万年青转录组测序及序列分析
提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA后，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly(A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。
测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或rawreads。对raw reads进行数据过滤，去掉带接头的，重复的，测序质量很低的reads，得到clean reads。使用短reads组装软件Trinity将具有一定长度overlap的clean reads连成更长的片段，即Contig。然后，将clean reads比对回Contig，通过paired-end reads能确定来自同一转录本的不同Contig 以及这些Contig之间的距离，Trinity将这些Contig连在一起，得到两端不能再延长的序列，这些序列称之为Unigene。通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(E value<0.00001)，并通过blastn将Unigene比对到核酸数据库nt(E value<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。
通过功能注释，从虎眼万年青转录组序列中发现一个长为1804bp的，具有UDP-木糖合成酶基因保守序列的Unigene，即Unigene25851(SEQ ID NO.3)。
实施例2 OsaUXS2基因克隆
取100mg虎眼万年青无菌鳞茎于液氮中速冻，研钵研成细粉状，Trizol提取法，提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA。使用RT-PCR Kit(ReverTra-Plus-，TOYOBO公司)将虎眼万年青无菌鳞茎总RNA反转录成cDNA。反转录体系和程序如下：在20μL体系中加入总RNA 1μg，RNase Free H2O 4μL，Oligo(dT)20 1μL，65℃保温5min后，立刻置于冰上冷却，然后在上述管中再依次加入5×RT buffer 4μL，RNase Inhibitor(10U/μL)1μL，dNTP Mixture(10mM)和ReverTra Ace 1μL，30℃保温10min，42℃温育60min，85℃变性5min，冰上5min，完成cDNA的合成。cDNA置于-20℃备用。
以虎眼万年青无菌鳞茎cDNA为模板，设计两对OsaUXS2特异引物，通过巢式PCR的方法扩增OsaUXS2基因。
第一轮PCR，50μL体系中含10×PCR buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM的引物F25851-1(5’-GCAAAACTTTGCAAAAAGAACC-3’，SEQ ID NO.4)和R25851-1(5’-AGTCTCTATATTGTGATCTGT-3’，SEQ ID NO.5)各1.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，cDNA2μL，ddH2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；98℃变性30s，53℃复性45s，每一个循环递减1℃，68℃延伸120s，共15循环；98℃变性30s，38℃复性45s，68℃延伸120s，共15循环；68℃延伸7min，4℃保温。第二轮PCR，50μL体系中含10×PCR buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM的引物F25851-2(5’-ATGGGCTCGTCCGAGCTCATC-3’，SEQ ID NO.6)和R25851-2(5’-TTACGCGGCCGTGGCTGTGT-3’，SEQ ID NO.7)各1.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，第一轮PCR产物2μL，ddH2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；98℃变性30s，45℃复性45s，68℃延伸120s，共30个循环；68℃延伸7min，4℃保温。0.8％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果表明，扩增得到了一条长约为1.3kb的条带(图2)。
PCR产物与pEASYTM-T1Simple(Transgen公司)载体连接，转化到Trans1-T1(Transgen公司)菌株，在含有100μg/mL羧苄青霉素的LB平板上培养，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选阳性克隆送样测序。结果表明，扩增得到的PCR产物与转录组测序结果完全一样，长为1302bp(SEQ ID NO.8)，含有该基因的载体命名为pEASY-OsaUXS2。
实施例3 OsaUXS2表达载体的构建
多序列比对结果表明，OsaUXS2(SEQ ID NO.9)与细胞质溶型UXS的蛋白序列相比，在氮末端多出100个左右的氨基酸序列(图3)。用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)预测OsaUXS2蛋白的跨膜区，结果表明OsaUXS2存在一个明显的跨膜区，预测OsaUXS2蛋白为一种二型膜蛋白(图4)。所以为使该蛋白在原核系统中表达为可溶性蛋白，需要在设计In-Fusion引物时将其跨膜区去除。
根据In-Fusion(Clontech公司)同源重组的原理，以测序正确的质粒pEASY-OsaUXS2为模板，FET28aUXS2(5’-tcgcggatccgaattcatgtccccctccgccgctcct-3’，SEQ IDNO.10)和RET28aUXS2(5’-gtgcggccgcaagcttttacgcggccgtggctgtgtc-3’，SEQ ID NO.11)为引物，通过如下程序和体系进行PCR，50μL体系中含10×PCR buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO4 3μL，10μM的引物FET28aUXS2和RET28aUXS2各1.5μL，KOD-Plus-Neo 1μL，质粒1μL，ddH2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；98℃变性30s，63℃复性45s，68℃延伸120s，共30个循环；68℃延伸7min，4℃保温。扩增得到长为1.1kb的截短型OsaUXS2基因(SEQ IDNO.2)。将该基因通过In-Fusion的方法连接到EcoRⅠ和HindⅢ双酶切处理的pET-28a(+)中，重组产物转化到Trans1-T1菌株，在含有50μg/mL的卡那霉素LB平板上培养，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选阳性克隆进行测序。结果表明载体构建正确，命名为pET28a-OsaUXS2(图5)。
实施例4 重组OsaUXS2蛋白的诱导表达和检测
将构建好的质粒pET28a-OsaUXS2用热激法转化表达宿主菌Transetta(DE3)，转化产物涂布于含卡那霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB固体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，加入15g琼脂粉，而后调节pH为7.0)上，37℃倒置培养过夜，直至长出单克隆。挑取单克隆转接于20mL含卡那霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，而后调节pH为7.0)，37℃，200rpm培养至OD600为1.0左右，按1:50比例转接入50mL含卡那霉素(50μg/mL)及氯霉素(35μg/mL)的LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，而后调节pH为7.0)，至OD600为0.6时，加入IPTG(终浓度为0.5mM)，在25℃，160rpm条件下，诱导培养12小时。取1mL菌液，12000rpm，离心2min收集菌体。加入1mL预冷裂解缓冲液(25mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液)，重悬菌体，菌体采用超声破碎法破碎(超声5s，停10s，总共超声破碎6min)。破碎液通过12000rpm，离心20min，吸取上清。取10μL上清进行SDS-PAGE分析。结果如图6所示，从图中可以看出，和对照相比，实验菌的诱导产物中出现了一条长约为40kDa的特异性条带，与理论大小一致，表明截短型OsaUXS2在大肠杆菌中成功表达。
为进一步确证截短型OsaUXS2基因的表达，进行了免疫印迹分析。离心收集E.coli[pET28a-OsaUXS2]的菌体，用超声破碎液进行SDS-PAGE电泳，采用Western blot进行检测。所用一抗为抗His-Tag的小鼠单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG(1：5000)。结果表明，与对照相比，E.coli[pET28a-OsaUXS2]经免疫印迹后，在相应的位置上出现了一条相应的杂交带(图7)。因此，确认重组的截短型OsaUXS2蛋白具有特异的免疫活性，表明截短型OsaUXS2基因在E.coli中得到了表达。
实施例5 截短型OsaUXS2蛋白功能鉴定
本实验以UDP-葡萄糖醛酸为底物，探讨截短型OsaUXS2对该底物的脱羧基作用，结果表明，截短型OsaUXS2能催化UDP-葡萄糖醛酸形成UDP-木糖。
截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸形成的产物鉴定
以纯化的截短型OsaUXS2蛋白作为催化剂，建立200μL反应体系(200mM磷酸缓冲液50μL，加入20μL浓度为10mM的底物UDP-葡萄糖醛酸，20μL粗酶液(1.5ml菌液的菌体加150μL缓冲液破碎取其上清液)，110μL灭菌水)。20℃反应30min后，用200μL氯仿终止反应。利用0.22μM尼龙膜过滤反应液，进样20μL进行HPLC分析。色谱柱为Shodex公司的WA-pak阴离子交换柱。HPLC条件表1所示，其中A相为H2O；B相为700mM的醋酸铵-醋酸缓冲液，pH为5.2。检测波长为261nm。
表1
时间 A相％ B相％ 流速ml/min
0 98 2 1
20 50 50 1
32 0 100 1
33 98 2 1
40 98 2 1
HPLC结果(图8)表明，截短型OsaUXS2能催化UDP-葡萄糖醛酸，实验组底物峰消耗较多，同时在底物峰之前出现了一个新的产物峰，该产物的最大吸收波长为261nm，为尿嘧啶的特征吸收峰。
为进一步确证新产物的结构，通过液相制备样品，样品冷干后用氘代水溶解，用1HNMR(600M)进行结构解析(图9)。归属各氢信号，结果如下：
Xylosyl：H1” 5.44(1H,dd) H2” 3.40(1H,dt) H3” 3.59(1H,t) H4” 3.53(1H,dt) H5a”/H5b” 3.64(2H,m)
Rib：H1’ 5.88(1H,d) H2’ 4.27(2H,m) H4’ 4.18(1H,m) H5a’(1H,m) H5b’(1H,m) Uridine：H5 5.87(1H,d) H6 7.85(1H,d)
综合以上分析，可以确证截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸所形成的新产物为UDP-木糖。从而表明，截短型OsaUXS2具有UDP-木糖合成酶的功能。
同时实验结果还表明，截短型OsaUXS2在没有外加NAD+的情况下活性明显降低。
实施例6 截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸酶学性质测定
截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸最适温度确定
取1.5mLEP管，加入200mM磷酸缓冲液50μL，20μL纯化的酶，110μL灭菌水，置于不同温度下孵育10min后，快速加入20μL浓度为10mM的UDP-葡萄糖醛酸。反应30min后加入200μL氯仿终止反应，利用0.22μM尼龙膜过滤反应液，进样20μL进行HPLC分析。色谱柱为Shodex公司的WA-pak阴离子交换柱。HPLC条件表1所示，其中A相为H2O；B相为700mM的醋酸铵-醋酸缓冲液，pH为5.2。检测波长为261nm。以产物峰面积最大者为100％，其余取对应的相对值。
结果表明(图10)，截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸的最适温度为20℃，在4-40℃范围内均能达到大于50％的活性，温度过高不利于反应进行，在60℃下酶失活。
截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸最适pH值确定
配置pH4-6的100mM的醋酸钠-醋酸缓冲液，pH6-9的10mM的磷酸盐缓冲液，pH7.5-9.2的100mM的Tris-HCl缓冲液。取100μL不同pH的缓冲液，20μL粗酶液，60μL灭菌水，30℃孵育10min，加入20μL浓度为10mM的UDP-葡萄糖醛酸。30℃反应30min后，加入200μL氯仿终止反应，12000rpm离心5min，吸取水相用0.22μM尼龙膜过滤，取滤液20μL用HPLC分析，HPLC条件如表1，检测波长261nm，各自进样量相同。通过比较HPLC检测产物峰面积并比较不同pH下催化效率，以产物峰面积最大者为100％，其余取相对值。
通过HPLC分析结果(图11)表明，催化UDP-葡萄糖醛酸的最适pH为6.0，随着pH升高或降低，其活性下降。
截短型OsaUXS2催化UDP-葡萄糖醛酸动力学参数测定
利用反应缓冲液配置(pH6.0，50mM磷酸盐)不同浓度UDP-木糖标准品，并通过HPLC进行检测，检测波长261nm，得到峰面积。通过线性回归得出峰面积同UDP-木糖浓度的关系，得到一拟合方程Y＝111.9X+1.428(0.1≤X≤1)，X为UDP-木糖浓度(mM)，Y为峰面积变化值。
建立100μL反应体系，pH为5.0,50mM磷酸盐缓冲液，OsaUXS2粗酶液20μL，改变底物UDP-葡萄糖醛酸浓度，在最适温度20℃下反应10min，立即用氯仿终止各个反应，利用HPLC分析UDP-木糖的生成量，利用峰面积求得UDP-木糖的浓度，进而求出反应初速度(μM/s)。根据实验结果做酶活曲线(图12)。使用GraphPad Prism 5中相关程序自动计算出Km和Vmax(图13)。
截短型OsaUXS2酶学性质数据如表2
表2
Figure BDA0000999379830000071
Figure IDA0000999379880000011
Figure IDA0000999379880000021
Figure IDA0000999379880000031
Figure IDA0000999379880000041

Claims (8)

1.一种来源于虎眼万年青的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其特征在于,其氨基酸序列为：
SEQ ID NO .1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶，其特征在于，在截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶上进行常规修饰；或者在截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶上还连接有用于检测或纯化的标签；所述的常规修饰选自乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG 修饰、固定化修饰；所述的标签选自His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、 Profinity eXact。
3.一种编码权利要求1所述截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO .2所示。
5.一种含有权利要求3-4任一所述核酸分子的表达载体。
6.一种含有权利要求3所述核酸分子或权利要求5所述表达载体的宿主细胞；所述宿主细胞选自大肠杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母，链霉菌。
7.权利要求1所述的截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶或权利要求3-4任一所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的宿主细胞在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸反应中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述截短型尿苷-5’-二磷酸木糖合成酶在催化底物尿苷-5’-二磷酸葡萄糖醛酸后，形成的产物为尿苷-5’-二磷酸木糖。
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