CN112410356B

CN112410356B - 来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因rs及其应用

Info

Publication number: CN112410356B
Application number: CN202011243898.7A
Authority: CN
Inventors: 夏鹏国; 张宇; 胡婉莹; 郑宇婕; 侯卓妮; 梁宗锁
Original assignee: Hangzhou Xinwangtu Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Xinwangtu Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2040-11-10
Also published as: CN112410356A

Abstract

本发明公开了一种来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用，该白藜芦醇合酶基因RS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了白藜芦醇合酶基因RS，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。

Description

来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，主要涉及一种来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用。

背景技术

随着近几年国家对中医药的高度重视，政府的大力扶持，带动了中药产业的快速发展，扩大了三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的市场需求。对三叶青抗肿瘤作用研究的不断深入，导致近年来三叶青市场价格突飞猛进，其市场需求也越来越大。

近年来，药用植物次生代谢产物合成的基因调控已成为分子生物学十分活跃的前沿研究领域，代谢产物的量和组成主要取决于生物合成关键酶以及在细胞中的表达水平。而目前三叶青的研究主要集中在种植栽培、种苗培育、化学成分的提取分离和药理药效作用等方面，对其分子水平上的研究比较少。

白藜芦醇作为因“法国悖论”而闻名的红酒中的天然成分，大量科学研究证明其具有靶向多靶点、发挥多种有益健康和治疗疾病的作用，具有极大的研究价值。白藜芦醇在植物中主要通过苯丙烷代谢途径产生，该途径以苯丙氨酸为底物，苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)催化生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)的作用下催化形成香豆酸，香豆酸又在4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)的作用下形成4-香豆酰辅酶A(4-coumarate-CoA ligase,4CA)，最后白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)催化1分子的4CA和3分子的丙二酰辅酶A(malonly-CoA，COA)合成白藜芦醇。

目前，三叶青的全基因组还未公布，有必要通过挖掘三叶青白藜芦醇生物合成的关键酶基因，试图揭示这些关键酶基因在其生物合成途径中的表达调控情况，并希冀以此为基础获得高产量白藜芦醇。

发明内容

本发明提供了一种来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用，该白藜芦醇合酶基因RS来源于三叶青，作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种白藜芦醇合酶基因RS，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种包含所述的白藜芦醇合酶基因RS的重组表达载体。

作为优选，表达载体为pMD19-T载体。

本发明还提供了一种包含所述白藜芦醇合酶基因RS的基因工程菌。

所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌DH5α。

本发明还提供了一种白藜芦醇合酶，所述白藜芦醇合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

作为优选，所述白藜芦醇合酶由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的白藜芦醇合酶基因RS编码获得。

本发明提供了所述的基因工程菌在生产白藜芦醇中的应用。

本发明提供了所述的白藜芦醇合酶在生产白藜芦醇中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了白藜芦醇合酶基因RS，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。

附图说明

图1为三叶青白藜芦醇合酶基因RS的PCR电泳图。

图2为白藜芦醇合酶RS的二级结构预测；

α-螺旋：最长的竖直线；延伸链：第二长竖直线；β-转角：第三长竖直线；无规则卷曲：最短竖直线。

图3为白藜芦醇合酶RS的三维结构预测。

图4为白藜芦醇合酶RS氨基酸序列的系统进化树分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1三叶青ThRS基因cDNA全长序列的获得

取三叶青新鲜植株的叶片，用锡箔纸包好，并用液氮迅速冷冻，提取总RNA，并反转录成cDNA。总RNA的提取按照TIANGEN RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书进行，经1.0％琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测仪检测其完整性及浓度。

总RNA的反转录按照Takara PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。

根据已有的转录组数据与NCBI中同科属的RS基因序列进行BLAST分析，选取相似度最高的序列为目的基因序列，以此序列的开放阅读框序列为模板设计了多对引物，其中两对扩增引物为(RS-F1：5’-ATGACTGAGTTGAAGAAG-3’，RS-R1：5’-TTAAGTTGAGATTGTAGG-3’；RS-F2：5’-ATGACTGAGTTGAAGAAGAAG-3’，RS-R2：5’-TTAAGTTGAGATTGTAGGAAC-3’)。

以三叶青cDNA为模板，利用Premix Taq(Ex Taq Version 2.0plus dye)进行PCR扩增，PCR基因扩增的总反应体系为50μL：25μL Premix Taq、2.5μL Template cDNA、1μLForward primer、1μL Reverse primer和22μL RNase Free dH₂O。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，结果表明RS-F1与RS-R1为可用引物，其退火温度为49℃，结果如图1所示。

将扩增产物用Tiangen TIANgel Midi Purification Kit(DP190123)试剂盒进行切胶回收，随后将回收产物连接到pMD19-T载体上并16℃孵育过夜，其连接体系为：0.5μLpMD19-T Vector、4.5μL回收产物和5.0μL SolutionⅠ。取5μL连接产物加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，42℃热激60s，迅速放入冰中冰浴2min，加入700μL LB培养基，于37℃摇床内200rpm震荡摇菌1h，在超净台中吸取200μL涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基板上，于37℃培养箱中培养12h，挑取单克隆于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)中，37℃震荡摇菌5h，进行菌液PCR验证，将验证正确的送去测序，进而得到三叶青ThRS的基因序列。

用DNAStar和DNAMAN软件对三叶青白藜芦醇生物合成途径中白藜芦醇合酶ThRS的氨基酸序列进行分析。RS基因的开放阅读框(ORF)序列有1035bp，编码344个氨基酸，其中强碱性氨基酸(K,R)37个，强酸性氨基酸(D,E)38个，疏水性氨基酸(Hydrophobic AminoAcids)(A,I,L,F,W,V)131个，极性氨基酸(Polar Amino Acids)(N,C,Q,S,T,Y)74个。使用ExPASy在线软件(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测其分子量为37518.60Daltons，等电点(pI)为6.76，表明该蛋白为酸性蛋白。

此外，通过SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测结果显示，该蛋白没有跨膜结构域(transmembrane domains)，但有两个低拷贝区域(lowcomplexity)，分别位于预测氨基酸序列的56～68aa和266～277aa，还含有Lipid DES(Sphingolipid Delta4-desaturase,鞘脂δ-4去饱和酶)和A2M(Alpha-2-macroglobulinfamily,α-2-巨球蛋白家族)结构域，分别位于预测氨基酸序列的3～45aa和133～221aa。

实施例2 ThRS的二级结构和三级结构预测以及进化树分析

利用在线软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)对白藜芦醇生物合成途径中ThRS蛋白的二级结构进行预测，结果如图2所示，该蛋白由45.93％的α-螺旋(Alpha helix)，15.99％的延伸链(Extendedstrand)，6.40％的β-转角(Beta turn)和31.69％的无规则卷曲(Random coil)构成，说明α-螺旋结构是蛋白RS二级结构的骨架。

利用在线软件SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)对白藜芦醇生物合成途径中ThRS蛋白的三维结构进行预测，使用方法为X-ray，分别率为结果如图3所示。使用的模板编号为3tsy.1.A，序列的一致性(Seq Identity)为92.73％，寡核苷酸的状态(Oligo-state)为Homo-dimer(同源二聚体)，序列与模板序列的相似度(Seqsimilarity)为0.59，覆盖范围(Coverage)为1.00，对所预测序列的描述为4-香豆酸辅酶A连接酶1和白藜芦醇合酶的融合蛋白，这与所克隆的基因相吻合。

白藜芦醇合酶在许多物种中被克隆和分析。通过软件Clustal X和MEGA6.0对ThRS的氨基酸序列和NCBI数据库中其他植物中该基因的氨基酸序列进行多序列比对并构建进化树，具体物种及蛋白序列号见表。根据进化树结果表明(图4)，三叶青与葡萄、圆叶葡萄同属于葡萄科的归为一组，说明三叶青与葡萄、圆叶葡萄在RS上具有很高的同源性。

表1构建基因RS进化树的核苷酸序列

实施例3 ThRS基因的功能验证

对ThRS基因的cDNA序列和质粒载体pCMBIA1301序列上酶切位点的分布情况进行分析，设计带有SmaⅠ、XbaⅠ酶切位点的PCR引物(上游引物：TCCCCCGGGATGACTGAGTTGAAGAAG；下游引物：GCTCTAGATTAAGTTGAGATTGTAGG)，用于构建过表达载体。

以三叶青cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系同上，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒对与目的基因一致的DNA片段进行纯化回收。将纯化回收产物与质粒pCMBIA1301在37℃下进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后再纯化回收。纯化回收后的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，16℃孵育过夜，其连接体系为：2μL质粒载体片段、6μL目的基因片段、1μL T4连接酶和1μL T4 ligase buffer。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，随后进行涂板和筛选。在含Kan的LB固体平板上挑取单菌落摇菌培养，菌液PCR进行酶切验证阳性克隆，验证成功后测序。然后将阳性重组质粒经LB(Kan抗性)液体培养基培养提取质粒，质粒提取按照质粒小提试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行。

用空载体与重组质粒分别转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞，菌液PCR鉴定及酶切鉴定筛选出阳性克隆。将筛选出的阳性克隆浸染三叶青幼苗，提取抗性植株的基因组DNA，基因组DNA的提取按照CTAB法进行。PCR鉴定过表达植株，PCR反应体系同上所述，其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，对克隆得到的条带纯化回收，测序验证。

取200μL阳性克隆的菌液于LB(Kan抗性)液体培养基中37℃振荡培养，当菌液达到对数增长期(OD₆₀₀＝0.5)时，加入IPTG对重组蛋白进行诱导表达，IPTG的浓度为0.4mmol/L，适宜的诱导时间为2h。利用高效液相色谱法测定继代培养2个月的基因转化和野生型三叶青幼苗中白藜芦醇的积累量，并通过Bradford法对白藜芦醇合酶进行体外酶活检测。

与野生型相比，过表达ThRS的转基因幼苗中ThRS的相对表达量升高了，白藜芦醇的含量也相对升高，这与预期的结果一致。

序列表

<110> 浙江理工大学

<120> 来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因RS及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)

<400> 1

atgactgagt tgaagaagaa gttcaatcgc atctgtgaaa aatcaatgat taagaagcgt 60

tacagtcatt tgaccgaaaa gatgcttgaa gagcatccaa atatcggtgc ttacatggcc 120

ccatctctta atattcgcca agagatcatc actgccgaga tacctaagct gggtaaggaa 180

gccgccttga aggcacttaa ggagtggaac caacccatgt ccaaaatcac ccatcttgta 240

ttttgtacaa cttcgggtgt agaaatgcct ggtgctgatt ataaacttgc taatctcttg 300

ggtcttgatc cttcggtcag aagagttatg ttgtatcatc aaggatgcca tgccggtgga 360

actgtccttc gaactgcaaa agatcttgca gagaataatg caggagcacg agttcttgtg 420

gtgtgctctg agatcactgt tgttacattc cgtggacctt ctgaagaagc attggactct 480

ttagttggcc aagccctttt tggtgatgga tctgcagcag tgatcattgg atcagatcct 540

gatatctcaa ttgaacgacc acttttccaa cttgtttcgg cagcccaaac atttatccct 600

aattcagcag gtgctattgc aggcaactta cgtgaggtgg gactcacctt tcatttgtgg 660

cctaaagtgc ctactttgat ttctgagaac attgagaaat gtttggttaa agcttttgaa 720

ccacttggta ttagcgattg gaactcgtta ttttggattg ctcatccagg tggtcctgca 780

attcttgatg cagttgaagc aaaactcaat ttagagaaaa agaaacttga accaacaagg 840

catgtgttaa gtgagtatgg taacatgtct agtgcatgtg tattatttat tttggatgag 900

atgagaaaga aatccctaaa gggggagaag accaccacgg gtgacggatt ggattggggt 960

gtgctatttg gctttgggcc aggcctgacc atcgaaactg ttgtgctaca cagcattcct 1020

acaatctcaa cttaa 1035

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> 三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)

<400> 2

Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Phe Asn Arg Ile Cys Glu Lys Ser Met

1 5 10 15

Ile Lys Lys Arg Tyr Ser His Leu Thr Glu Lys Met Leu Glu Glu His

20 25 30

Pro Asn Ile Gly Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asn Ile Arg Gln Glu

35 40 45

Ile Ile Thr Ala Glu Ile Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Leu Lys

50 55 60

Ala Leu Lys Glu Trp Asn Gln Pro Met Ser Lys Ile Thr His Leu Val

65 70 75 80

Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Glu Met Pro Gly Ala Asp Tyr Lys Leu

85 90 95

Ala Asn Leu Leu Gly Leu Asp Pro Ser Val Arg Arg Val Met Leu Tyr

100 105 110

His Gln Gly Cys His Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Thr Ala Lys Asp

115 120 125

Leu Ala Glu Asn Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu

130 135 140

Ile Thr Val Val Thr Phe Arg Gly Pro Ser Glu Glu Ala Leu Asp Ser

145 150 155 160

Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ser Ala Ala Val Ile Ile

165 170 175

Gly Ser Asp Pro Asp Ile Ser Ile Glu Arg Pro Leu Phe Gln Leu Val

180 185 190

Ser Ala Ala Gln Thr Phe Ile Pro Asn Ser Ala Gly Ala Ile Ala Gly

195 200 205

Asn Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Trp Pro Lys Val Pro

210 215 220

Thr Leu Ile Ser Glu Asn Ile Glu Lys Cys Leu Val Lys Ala Phe Glu

225 230 235 240

Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro

245 250 255

Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Ala Val Glu Ala Lys Leu Asn Leu Glu

260 265 270

Lys Lys Lys Leu Glu Pro Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn

275 280 285

Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys

290 295 300

Ser Leu Lys Gly Glu Lys Thr Thr Thr Gly Asp Gly Leu Asp Trp Gly

305 310 315 320

Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ile Glu Thr Val Val Leu

325 330 335

His Ser Ile Pro Thr Ile Ser Thr

340

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgactgagt tgaagaag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaagttgag attgtagg 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgactgagt tgaagaagaa g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttaagttgag attgtaggaa c 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcccccggga tgactgagtt gaagaag 27

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctctagatt aagttgagat tgtagg 26

Claims

1.一种白藜芦醇合酶基因RS，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种包含权利要求1所述的白藜芦醇合酶基因RS的重组表达载体。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，表达载体为pMD19-T载体。

4.一种包含权利要求1所述的白藜芦醇合酶基因RS的基因工程菌。

5.一种白藜芦醇合酶，其特征在于，所述白藜芦醇合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求5所述的白藜芦醇合酶，其特征在于，由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的白藜芦醇合酶基因RS编码获得。

7.如权利要求4所述的基因工程菌在生产白藜芦醇中的应用。

8.如权利要求5或6任一项所述的白藜芦醇合酶在生产白藜芦醇中的应用。