CN112359051B - 一种来源于三叶青的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL及其应用 - Google Patents

一种来源于三叶青的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于三叶青的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL及其应用，该苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。

Description

一种来源于三叶青的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，主要涉及一种来源于三叶青的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL及其应用。
背景技术
随着近几年国家对中医药的高度重视，政府的大力扶持，带动了中药产业的快速发展，扩大了三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的市场需求。对三叶青抗肿瘤作用研究的不断深入，导致近年来三叶青市场价格突飞猛进，其市场需求也越来越大。
近年来，药用植物次生代谢产物合成的基因调控已成为分子生物学十分活跃的前沿研究领域，代谢产物的量和组成主要取决于生物合成关键酶以及在细胞中的表达水平。而目前三叶青的研究主要集中在种植栽培、种苗培育、化学成分的提取分离和药理药效作用等方面，对其分子水平上的研究比较少。
白藜芦醇作为因“法国悖论”而闻名的红酒中的天然成分，大量科学研究证明其具有靶向多靶点、发挥多种有益健康和治疗疾病的作用，具有极大的研究价值。白藜芦醇在植物中主要通过苯丙烷代谢途径产生，该途径以苯丙氨酸为底物，苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)催化生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)的作用下催化形成香豆酸，香豆酸又在4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)的作用下形成4-香豆酰辅酶A(4-coumarate-CoA ligase,4CA)，最后白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)催化1分子的4CA和3分子的丙二酰辅酶A(malonly-CoA，COA)合成白藜芦醇。
目前，三叶青的全基因组还未公布，有必要通过挖掘三叶青白藜芦醇生物合成的关键酶基因，试图揭示这些关键酶基因在其生物合成途径中的表达调控情况，并希冀以此为基础获得高产量白藜芦醇。
发明内容
本发明提供了一种来源于三叶青的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL及其应用，该苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL来源于三叶青，作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明提供了一种包含所述的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL的重组表达载体。
作为优选，表达载体为pMD19-T载体。
本发明还提供了一种包含所述苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL的基因工程菌。
所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌DH5α。
本发明还提供了一种苯丙氨酸解氨酶，所述苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
作为优选，所述苯丙氨酸解氨酶由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL编码获得。
本发明提供了所述的基因工程菌在生产白藜芦醇中的应用。
本发明提供了所述的苯丙氨酸解氨酶在生产白藜芦醇中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。
附图说明
图1为三叶青苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL的PCR电泳图。
图2为ThPAL的二级结构预测；
α-螺旋：最长的竖直线；延伸链：第二长竖直线；β-转角：第三长竖直线；无规则卷曲：最短竖直线。
图3为ThPAL的三维结构预测。
图4为ThPAL氨基酸序列的系统进化树分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1三叶青ThPAL基因cDNA全长序列的获得
取三叶青新鲜植株的叶片，用锡箔纸包好，并用液氮迅速冷冻，提取总RNA，并反转录成cDNA。总RNA的提取按照TIANGEN RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书进行，经1.0％琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测仪检测其完整性及浓度。
总RNA的反转录按照Takara PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。
根据已有的转录组数据与NCBI中同科属的PAL基因序列进行BLAST分析，选取相似度最高的序列为目的基因序列，以此序列的开放阅读框序列为模板设计了多对引物，其中三对扩增引物为(PAL-F1：5’-ATGGAAGCAAAGAACTGC-3’，PAL-R1：5’-TTAGCAGATCGGGAGTGG-3’；PAL-F2：5’-ATGGAAGCAAAGAACTGCAA-3’，PAL-R2：5’-TTAGCAGATCGGGAGTGGAG-3’；PAL-F3：5’-ATGGAAGCAAAGAACTGCAATGG-3’，PAL-R3：5’-TTAGCAGATCGGGAGTGGAGCA-3’)。
以三叶青cDNA为模板，利用Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)进行PCR扩增，PCR基因扩增的总反应体系为50μL：25μL Premix Taq、2.5μL Template cDNA、1μLForward primer、1μL Reverse primer和22μL RNase Free dH2O。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，结果表明PAL-F3与PAL-R3为可用引物，其退火温度为59℃，结果如图1所示。
将扩增产物用Tiangen TIANgel Midi Purification Kit(DP190123)试剂盒进行切胶回收，随后将回收产物连接到pMD19-T载体上并16℃孵育过夜，其连接体系为：0.5μLpMD19-T Vector、4.5μL回收产物和5.0μL SolutionⅠ。取5μL连接产物加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，42℃热激60s，迅速放入冰中冰浴2min，加入700μL LB培养基，于37℃摇床内200rpm震荡摇菌1h，在超净台中吸取200μL涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基板上，于37℃培养箱中培养12h，挑取单克隆于LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)中，37℃震荡摇菌5h，进行菌液PCR验证，将验证正确的送去测序，进而得到三叶青ThPAL的基因序列。
用DNAStar和DNAMAN软件对三叶青白藜芦醇生物合成途径中的苯丙氨酸解氨酶ThPAL的碱基和氨基酸序列进行分析。PAL基因的开放阅读框(ORF)序列有2139bp，编码712个氨基酸，其中强碱性氨基酸(K,R)76个，强酸性氨基酸(D,E)84个，疏水性氨基酸(Hydrophobic Amino Acids)(A,I,L,F,W,V)254个，极性氨基酸(Polar Amino Acids)(N,C,Q,S,T,Y)182个。使用ExPASy在线软件(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测其分子量为77693.64Daltons，等电点(pI)为6.05，表明该蛋白为酸性蛋白。
此外，通过SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测结果显示，该蛋白没有跨膜结构域(transmembrane domains)，但有一个低拷贝区域(lowcomplexity)，位于预测氨基酸序列的69～84aa，还含有Cpl-7(Cpl-7 lysozyme C-terminal domain,Cpl-7溶菌酶C端结构域)和KNOX2结构域，分别位于预测氨基酸序列的127～165aa和437～494aa。
实施例2 ThPAL的二级结构和三级结构预测以及进化树分析
利用在线软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)对白藜芦醇生物合成途径中ThPAL蛋白的二级结构进行预测，结果如图2所示，该蛋白由54.07％的α-螺旋(Alpha helix)，8.43％的延伸链(Extendedstrand)，5.34％的β-转角(Beta turn)和32.16％的无规则卷曲(Random coil)构成，说明α-螺旋结构是蛋白PAL二级结构的骨架。
利用在线软件SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)对白藜芦醇生物合成途径中ThPAL蛋白的三维结构进行预测，使用方法为X-ray，分别率为结果如图3所示。使用的模板编号为1w27.1.A，序列的一致性(Seq Identity)为85.19％，寡核苷酸的状态(Oligo-state)为Homo-tetramer(同源四聚体)，序列与模板序列的相似度(Seqsimilarity)为0.56，覆盖范围(Coverage)为0.99，对所预测序列的描述为苯丙氨酸解氨酶，这与所克隆的基因相吻合。
苯丙氨酸解氨酶在许多物种中被克隆和分析。通过软件Clustal X和MEGA6.0对ThPAL的氨基酸序列和NCBI数据库中其他植物中该基因的氨基酸序列进行多序列比对并构建进化树，具体物种及蛋白序列号见表1。根据进化树结果表明(图4)，三叶青与葡萄、河岸葡萄同属于葡萄科的归为一组，说明三叶青与葡萄、河岸葡萄在蛋白PAL上具有很高的同源性。
表1构建基因PAL进化树的核苷酸序列
实施例3 ThPAL基因的功能验证
对ThPAL基因的cDNA序列和质粒载体pCMBIA1301序列上酶切位点的分布情况进行分析，设计带有SmaⅠ、XbaⅠ酶切位点的PCR引物(上游引物：TCCCCCGGGATGGAAGCAAAGAACTGCAATGG；下游引物：GCTCTAGATTAGCAGATCGGGAGTGGAGCA)，用于构建过表达载体。
以三叶青cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系同上，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒对与目的基因一致的DNA片段进行纯化回收。将纯化回收产物与质粒pCMBIA1301在37℃下进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后再纯化回收。纯化回收后的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，16℃孵育过夜，其连接体系为：2μL质粒载体片段、6μL目的基因片段、1μL T4连接酶和1μL T4 ligase buffer。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，随后进行涂板和筛选。在含Kan的LB固体平板上挑取单菌落摇菌培养，菌液PCR进行酶切验证阳性克隆，验证成功后测序。然后将阳性重组质粒经LB(Kan抗性)液体培养基培养提取质粒，质粒提取按照质粒小提试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行。
用空载体与重组质粒分别转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞，菌液PCR鉴定及酶切鉴定筛选出阳性克隆。将筛选出的阳性克隆浸染三叶青幼苗，提取抗性植株的基因组DNA，基因组DNA的提取按照CTAB法进行。PCR鉴定过表达植株，PCR反应体系同上所述，其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，对克隆得到的条带纯化回收，测序验证。
取200μL阳性克隆的菌液于LB(Kan抗性)液体培养基中37℃振荡培养，当菌液达到对数增长期(OD600＝0.5)时，加入IPTG对重组蛋白进行诱导表达，IPTG的浓度为0.4mmol/L，适宜的诱导时间为2h。利用高效液相色谱法测定继代培养2个月的基因转化和野生型三叶青幼苗中白藜芦醇的积累量，并通过Bradford法对苯丙氨酸解氨酶进行体外酶活检测。
与野生型相比，过表达ThPAL的转基因幼苗中ThPAL的相对表达量升高了，白藜芦醇的含量也相对升高。
序列表
<110> 浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司
<120> 一种来源于三叶青的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2139
<212> DNA
<213> 三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)
<400> 1
atggaagcaa agaactgcaa tggaagcaac aaggttaaga atcagagttt ctgcgttagt 60
gatcccctga actggggagt ggcggcggag gcgctgaagg ggagccactt ggatgaagtg 120
aagcgcatgg tggcggagta ccggaaaccg gtggttcgcc tcggcggtga gacgcttacg 180
atatcccaag tggcggctat cgcccggcgg gcggaggagg tgagtgtcga gttgtcggaa 240
gcggcaagag ccggcgtgaa ggccagcagt gactgggtta tggacagcat gaacaatggt 300
accgacagct atggtgttac tactggtttt ggcgccactt cgcatagaag aaccaaacaa 360
ggtggtgctc ttcagacgga gctcattaga ttcttgaatg ctgggatatt tgggaatgga 420
acagaatcat gccacacgct tcctcgttct gcatcaagag ccgccatgct tgtgaggatc 480
aacaccctcc tccaaggata ctccggcatt agattcgagg ttctggaagc cataaccaag 540
cttctcaatc acaacgtcac tccatgcttg cctctgcgtg gaaccatcac tgcctctgga 600
gatcttgttc ctctctccta cattgctggt cttctcactg ggaggcccaa ttcaaaagct 660
gtaggacctt ctggtgaagt tgtcaatgct gaggaggcct tcaaaatggc tgggattgag 720
tctgggtttt tcgagttgca gcctaaggaa ggcctagctc ttgttaatgg cactgcggtt 780
ggatctgcca tggcttctat ggtgcttttt gaggccaatg ttctggcggt tttgtctgaa 840
gttctatctg ctattttcgc tgaagtgatg caggggaagc ctgaattcac tgactacttg 900
acccacaaat tgaagcacca ccctggtcag atcgaggctg cagccattat ggagcatatt 960
cttgatggaa gcgcttatgt gaaagaagct aagaaggtac atgagatgga tccgttacag 1020
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gctcagttct cagagcttgt caatgacttc tacaacaatg ggttgccatc aaatctctcc 1320
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tactgctcgg agctccagtt cttggccaat ccggtcacca accatgtcca aagtgctgag 1440
cagcacaacc aagatgtgaa ctccttgggc ttgatctcct cccggaagac agctgaagct 1500
gtggatatct tgaagcccat gtcttccaca taccttgtgg cgctctgcca ggccattgat 1560
ttgaggcatt tggaggagaa tttgaagagc tcagtgagga agactgtaag ctacgtagct 1620
aagaaaactc taaccactgg agccaatgga gaactccacc catcaagatt ctgcgagaag 1680
gagttgctaa aagtggtgga cagggaatat gtatttgcct acattgatga ccccagcagc 1740
gccacctatc cattgatgca gaaggtaagg caagttctgg tggatagcgc attgaaaaat 1800
ggtgaaaatg agaagaatgt caacacctca attttccaaa agatagtggc attcgaggag 1860
gagttgaaga cccttttgcc caaagaggtt gaaaacgcaa gagttgaggt ggagagtgga 1920
aatccatcga ttccgaacag aatcaaggag tgcaggtcat atccattgta caaattcgtg 1980
agggaggagc tgggaactgg gctgctgact ggtgagaagg tgaggtcacc aggggaggag 2040
tttgacaagg tgtttactgc aatgtgtgag gggaagatca tcgaccctct tttcgattgt 2100
ctcagtgctt ggaatggtgc tccactcccg atctgctaa 2139
<210> 2
<211> 712
<212> PRT
<213> 三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)
<400> 2
Met Glu Ala Lys Asn Cys Asn Gly Ser Asn Lys Val Lys Asn Gln Ser
1 5 10 15
Phe Cys Val Ser Asp Pro Leu Asn Trp Gly Val Ala Ala Glu Ala Leu
20 25 30
Lys Gly Ser His Leu Asp Glu Val Lys Arg Met Val Ala Glu Tyr Arg
35 40 45
Lys Pro Val Val Arg Leu Gly Gly Glu Thr Leu Thr Ile Ser Gln Val
50 55 60
Ala Ala Ile Ala Arg Arg Ala Glu Glu Val Ser Val Glu Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ala Ala Arg Ala Gly Val Lys Ala Ser Ser Asp Trp Val Met Asp Ser
85 90 95
Met Asn Asn Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Ala
100 105 110
Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Gln Gly Gly Ala Leu Gln Thr Glu Leu
115 120 125
Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly Asn Gly Thr Glu Ser Cys
130 135 140
His Thr Leu Pro Arg Ser Ala Ser Arg Ala Ala Met Leu Val Arg Ile
145 150 155 160
Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile Arg Phe Glu Val Leu Glu
165 170 175
Ala Ile Thr Lys Leu Leu Asn His Asn Val Thr Pro Cys Leu Pro Leu
180 185 190
Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr Ile
195 200 205
Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ser Lys Ala Val Gly Pro Ser
210 215 220
Gly Glu Val Val Asn Ala Glu Glu Ala Phe Lys Met Ala Gly Ile Glu
225 230 235 240
Ser Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Leu Val Asn
245 250 255
Gly Thr Ala Val Gly Ser Ala Met Ala Ser Met Val Leu Phe Glu Ala
260 265 270
Asn Val Leu Ala Val Leu Ser Glu Val Leu Ser Ala Ile Phe Ala Glu
275 280 285
Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp Tyr Leu Thr His Lys Leu
290 295 300
Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile Met Glu His Ile
305 310 315 320
Leu Asp Gly Ser Ala Tyr Val Lys Glu Ala Lys Lys Val His Glu Met
325 330 335
Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr Ala Leu Arg Thr Ser
340 345 350
Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile Arg Ser Ser Thr Lys
355 360 365
Phe Ile Glu Arg Glu Ile Asp Ser Val Asn Asp Asn Pro Leu Ile Asp
370 375 380
Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly Gly Asn Phe Gln Gly Thr Pro
385 390 395 400
Ile Gly Val Pro Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile Ala Ala Ile Gly
405 410 415
Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val Asn Asp Phe Tyr Asn
420 425 430
Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly Ser Arg Asp Pro Ser Leu Asp
435 440 445
Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala Ser Tyr Cys Ser Glu
450 455 460
Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr Asn His Val Gln Ser Ala Glu
465 470 475 480
Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile Ser Ser Arg Lys
485 490 495
Thr Ala Glu Ala Val Asp Ile Leu Lys Pro Met Ser Ser Thr Tyr Leu
500 505 510
Val Ala Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu Arg His Leu Glu Glu Asn Leu
515 520 525
Lys Ser Ser Val Arg Lys Thr Val Ser Tyr Val Ala Lys Lys Thr Leu
530 535 540
Thr Thr Gly Ala Asn Gly Glu Leu His Pro Ser Arg Phe Cys Glu Lys
545 550 555 560
Glu Leu Leu Lys Val Val Asp Arg Glu Tyr Val Phe Ala Tyr Ile Asp
565 570 575
Asp Pro Ser Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Met Gln Lys Val Arg Gln Val
580 585 590
Leu Val Asp Ser Ala Leu Lys Asn Gly Glu Asn Glu Lys Asn Val Asn
595 600 605
Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Val Ala Phe Glu Glu Glu Leu Lys Thr
610 615 620
Leu Leu Pro Lys Glu Val Glu Asn Ala Arg Val Glu Val Glu Ser Gly
625 630 635 640
Asn Pro Ser Ile Pro Asn Arg Ile Lys Glu Cys Arg Ser Tyr Pro Leu
645 650 655
Tyr Lys Phe Val Arg Glu Glu Leu Gly Thr Gly Leu Leu Thr Gly Glu
660 665 670
Lys Val Arg Ser Pro Gly Glu Glu Phe Asp Lys Val Phe Thr Ala Met
675 680 685
Cys Glu Gly Lys Ile Ile Asp Pro Leu Phe Asp Cys Leu Ser Ala Trp
690 695 700
Asn Gly Ala Pro Leu Pro Ile Cys
705 710
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaagcaa agaactgc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttagcagatc gggagtgg 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggaagcaa agaactgcaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagcagatc gggagtggag 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggaagcaa agaactgcaa tgg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttagcagatc gggagtggag ca 22
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcccccggga tggaagcaaa gaactgcaat gg 32
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctctagatt agcagatcgg gagtggagca 30

Claims (8)

1.一种苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种包含权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL的重组表达载体。
3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，表达载体为pMD19-T载体。
4.一种包含权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL的基因工程菌。
5.一种苯丙氨酸解氨酶，其特征在于，所述苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
6.如权利要求5所述的苯丙氨酸解氨酶，其特征在于，由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的苯丙氨酸解氨酶基因ThPAL编码获得。
7.如权利要求4所述的基因工程菌在生产白藜芦醇中的应用。
8.如权利要求5或6任一项所述的苯丙氨酸解氨酶在生产白藜芦醇中的应用。
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