CN115724936A - 一种甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3，核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明还提供上述甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3在提高植物在干旱和盐逆境胁迫抗性上的应用。本发明提供的ShERF3与高粱SbERF3、小麦TaERF3、柳枝稷PvERF3有较高的同源性，且含有一个AP2结构域，属于AP2/ERF家族的ERF亚家族。亚细胞定位结果显示ShERF3是细胞核定位的乙烯应答转录因子，主要在甘蔗成熟茎秆中表达，且在干旱胁迫条件下呈“先降后升”的表达趋势、在盐胁迫下的表达呈下降趋势，表明ShERF3在甘蔗茎秆发育、干旱以及盐胁迫应答方面发挥关键作用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3及其应用。
背景技术
甘蔗(Saccharum spp.)是世界以及我国最为重要的糖料作物，同时也是一种理想的能源作物。干旱、高盐等非生物胁迫很大程度上制约着甘蔗的品质和产量。乙烯是植物最为重要的内源激素之一，广泛存在于植物的各个器官与组织，在正常条件下，植物体内乙烯的含量都能够保持在比较平稳的水平，而当植物受到非生物胁迫时，植物体内乙烯的含量会发生变化，胁迫刺激后产生的乙烯通过其信号转导途径进行传递，能够对下游的胁迫相关基因进行调控，进而应答逆境胁迫。乙烯类转录因子AP2/ERF(APETALA2/EthyleneResponsive Factor)家族是响应乙烯的主要元件，具有一个或两个AP2/ERF结构域，是植物中最大的转录因子家族之一，乙烯响应因子(Ethylene Response Factors,ERFs)是乙烯转导途径的最下游调控因子，含有一个AP2结构域，属于AP2/ERF多基因家族，由58或59个氨基酸组成，这些氨基酸可以与乙烯响应基因启动子区域中发现的多种顺式作用元件结合，包括GCC box(核心序列为GCCGCC)和DRE/CRT(dehydration-responsive element/C-repeat，核心序列为CCGAC)。陈玉凤等(陈玉凤,应用与环境生物学报,2022,28(01):67-81.)利用生物信息学方法从甘蔗野生种割手密基因组挖掘获得121条SsAP2/ERF基因序列，对其进行聚类分析，但对其具体功能还没有进行深入地研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3及其应用，以解决上述技术问题之一。
本发明提供的技术方案为：一种甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3，核苷酸序列为SEQID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明还公开上述甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3在提高植物在干旱和盐逆境胁迫抗性上的应用。
本发明的有益效果在于：
AP2/ERF转录因子在调控植物的生长发育、抵抗生物和非生物胁迫方面均发挥重要作用。本发明从甘蔗品种新台糖22中克隆出ShERF3转录因子，编码350个氨基酸序列，对ShERF3蛋白结构、基因结构、亚细胞定位、表达进行了探究，结果表明，ShERF3与高粱SbERF3、小麦TaERF3、柳枝稷PvERF3有较高的同源性，且含有一个AP2结构域，属于AP2/ERF家族的ERF亚家族。亚细胞定位结果显示ShERF3是细胞核定位的乙烯应答转录因子，主要在甘蔗成熟茎秆中表达，且在干旱胁迫条件下呈“先降后升”的表达趋势、在盐胁迫下的表达呈下降趋势，表明ShERF3在甘蔗茎秆发育、干旱以及盐胁迫应答方面发挥关键作用。
附图说明
图1为ShERF3 cDNA序列PCR扩增电泳图；M:DSMT Marker 2000；1:PCR扩增结果；
图2为ShERF3蛋白保守结构；
图3为ShERF3氨基酸序列比对结果；高粱Sorghum bicolor；哈氏黍panicumhallii；柳枝稷Panicum virgatum；谷子/粟Setaria italica；
图4为ShERF3与其他AP2/ERF家族成员的系统进化树；高粱Sorghum bicolor；哈氏黍panicum hallii；柳枝稷Panicum virgatum；谷子/粟Setaria italica；小麦Triticumaestivum；水稻Oryza sativa；拟南芥Arabidopsis thaliana；陆地棉Gossypiumhirsutum；烟草Nicotiana tabacum；大豆Glycine max；本氏烟草Nicotiana benthamiana；番茄Lycopersicon esculentum Mill；野生二粒小麦Triticum dicoccoides；
图5为ShERF3蛋白质二级结构的预测；蓝色为α-螺旋；红色为延伸链；绿色为β-转角；紫色为无规卷曲；
图6为ShERF3磷酸化位点预测；
图7为ShERF3蛋白质信号肽预测；
图8为ShERF3亚细胞定位结果；pBWA(V)HS-ShERF3-GLosgfp融合表达载体和pBWA(V)HS-GLosgfp空载体在水稻叶肉细胞原生质体中的亚细胞定位，由左至右分别为荧光场、明场、荧光明场融合图像；
图9为ShERF3基因在ROC22不同部位表达分析；IL：未成熟叶；ML：成熟叶；S1：茎节1-2；S2：茎节4-5；S3：茎节7-8；S4：茎节10-11；S5：茎节12-13；S6：茎节14-15；RS：根；
图10为ShERF3基因在干旱、盐胁迫下的表达。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1植物材料
试验材料甘蔗品种新台糖22号(ROC22)种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所文昌实验基地，露出可见肥厚带的为成熟叶，向上未完全伸展的为未成熟叶；靠近甘蔗生长点的茎节为第一节，向下依次计数。胁迫处理材料为生长势一致的甘蔗组培苗。每组样品设置三次重复。
1.1.2试剂
大肠杆菌DH5a感受态购自上海唯地生物技术有限公司；
2×Phanta Max Master Mix酶购自Vazyme公司；
pMD-19T克隆载体、Real time PCR试剂购自上海吐露港生物科技有限公司(ToloBiotech.)；
质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、DNA酶均购自美国Omega生物技术公司；
T4连接酶购自New England Biolabs(NEB)；
cDNA第一链反转录试剂盒、快速限制性内切酶购自Thermo Scientific；
胶回收试剂盒(HiPure Gel Pure DNA Mini Kit)购自Magen公司。
1.2方法
1.2.1ROC22总RNA提取及cDNA第一链合成
称取0.1g试验材料甘蔗成熟叶片在液氮里充分研磨成粉末后，根据Omega公司RNA提取试剂盒具体步骤提取甘蔗总RNA，基因克隆和qRT-PCR的cDNA第一链均用RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)反转录，合成甘蔗成熟叶片cDNA，-20℃保存。
本试验所提取的ROC22总RNA均经过琼脂糖凝胶电泳的检验，28S、18S条带完整清晰可见、无明显降解，A260/A280在1.8-1.9之间，表明总RNA质量良好，可以用于后续实验。
1.2.2ShERF3基因全长克隆及测序验证
基于甘蔗转录组测序数据序列(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31655344/)，利用NCBI网站设计扩增ShERF3基因全长序列引物(表1)，使用合成的甘蔗成熟叶片cDNA做模板。ShERF3基因的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
表1引物序列及用途
PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 10μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，ddH2O7μL。
PCR反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性10s，57℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸7min。
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳验证后将体系扩大至50μL，用HiPure Gel PureDNA Mini Kit进行胶回收纯化，片段回收纯化产物于-20℃保存备用。给回收片段加A尾之后利用TA克隆将片段连接到pMD-19T载体上，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆扩大培养，通过菌液PCR进行初步验证，将有目的片段大小的阳性克隆送至上海生物工程生物公司进行测序验证。
图1为ShERF3 cDNA序列PCR扩增电泳图；M:DSMT Marker 2000；1:PCR扩增结果。
从图1可以看出：在1000-1500bp之间有一条清晰条带，随后将其产物回收纯化，与pMD-19T载体连接并转化到DH5α，经菌液PCR验证后送往上海生物工程生物公司进行测序获得1142bp的cDNA序列，将结果与转录组中的基因进行序列比对，以此确定ShERF3的最终序列。
1.2.3测序获得的序列进行生物信息学分析
表2 ShERF3基因生物信息预测软件及网站
| 生物信息 | 相关软件及网站 |
| 开放阅读框 | BioXM 2.6 |
| 蛋白序列比对 | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi和DNAMAN |
| 进化树构建 | MEGA 7.0 |
| 理化性质预测 | https://web.expasy.org/protparam |
| 二级结构预测 | NPSA-PRABI |
| 信号肽预测 | SignalP-6.0 |
| 蛋白结构域预测 | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi |
| 磷酸化位点预测 | NetPhos 3.1 Server |
利用软件BioMX2.6对ShERF3核酸序列进行分析发现，最大开放阅读框为1053bp，编码350个氨基酸。通过NCBI里的CDD(Conserved Domain Database)数据库对氨基酸序列进行结构域预测，发现ShERF3蛋白含有一个AP2结构域(图2)。图2为ShERF3蛋白保守结构。
图3为ShERF3氨基酸序列比对结果；高粱Sorghum bicolor；哈氏黍panicumhallii；柳枝稷Panicum virgatum；谷子/粟Setaria italica。从图3可以看出：ShERF3与高粱(Sorghum bicolor)ERF3、谷子(Setaria italica)ERF118、哈氏黍(panicum hallii)ERF118、柳枝稷(Panicum virgatum)ERF3等相似度较高。
进一步用MEGA7.0对ShERF3与其它同源基因的系统进化关系进行分析，发现ShERF3与高粱ERF3进化关系最近，与谷子ERF118、哈氏黍ERF118、柳枝稷ERF3、柳枝稷ERF118进化关系较近(图4)。图4为ShERF3与其他AP2/ERF家族成员的系统进化树；高粱Sorghum bicolor；哈氏黍panicum hallii；柳枝稷Panicum virgatum；谷子/粟Setariaitalica；小麦Triticum aestivum；水稻Oryza sativa；拟南芥Arabidopsis thaliana；陆地棉Gossypium hirsutum；烟草Nicotiana tabacum；大豆Glycine max；本氏烟草Nicotiana benthamiana；番茄Lycopersicon esculentum Mill；野生二粒小麦Triticumdicoccoides。
利用在线工具ExPASy-ProtParam对ShERF3蛋白理化性质进行分析发现其相对分子量为88.3kD，理论等电点为4.95，富含半胱氨酸(37.6％)、甘氨酸(29.5％)、丙氨酸(16.6％)、苏氨酸(16.2％)，是一种不稳定的疏水性蛋白(表3)。
表3ShERF3蛋白理化性质分析
利用NPSA-PRABI在线软件预测ShERF3蛋白的二级结构，发现其二级结构包含114个α-螺旋(alpha helix,Hh)，33个延伸链(extended strand,Ee)，16个β-转角(beta turn,Tt)和187个无规卷曲(random coil,Cc)(图5)。图5为ShERF3蛋白质二级结构的预测；蓝色为α-螺旋；红色为延伸链；绿色为β-转角；紫色为无规卷曲。
图6为ShERF3磷酸化位点预测。图6显示，ShERF3蛋白质中有25个Ser(丝氨酸)位点可发生磷酸化修饰，有20个Thr(苏氨酸)位点可发生磷酸化修饰，2个Tyr(酪氨酸)位点可发生磷酸化修饰，推测ShERF3翻译后可能进行磷酸化修饰发挥其功能。
图7为ShERF3蛋白质信号肽预测。图7显示：信号肽预测结果显示ShERF3蛋白无信号肽。
1.2.4ShERF3-GFP融合表达载体的构建
设计ShERF3开放阅读框载体构建引物ShERF3-G-F/R(表1)，引物两端引入BsaI酶切位点，下游引物去除终止密码子，以ShERF3-19T质粒为模板进行PCR扩增。
体系：PCR Mix 25μL，上下游引物各2μL，模板1μL，ddH2O 20μL；
反应程序为：95℃预变性5min、95℃变性30s、50℃退火45s、72℃延伸1min、30个循环、72℃再延伸10min。
将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收，BsaI同时酶切质粒pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp和胶回收片段，酶切体系：BsaI 1μL、10XBuffer 2μL、DNA 4μL、ddH2O 13μL；37℃酶切1h。将两个酶切产物分别进行回收纯化后用T4 DNA连接酶进行连接后转化DH5α感受态，涂于含有卡那霉素的LB平板，将经过菌液PCR鉴定的阳性菌落送上海生物工程生物公司进行测序验证。
将去除终止子的ShERF3基因阅读框序列连入pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp，形成ShERF3-GFP融融合表达载体，经菌液PCR鉴定插入片段大小符合预期，进一步测序验证插入序列没有突变或移码。
1.2.5ShERF3的亚细胞定位
取7-15d大小的水稻幼苗茎叶，利用Yoo等(Yoo SD,Nat Protoc,2007,2(7):1565-1572.)方法提取水稻叶片原生质体，并将pBWA(V)HS-ShERF3-GLosgfp融合质粒转入原生质体瞬时表达，最后通过激光共聚焦显微镜进行定位结果的观察及拍照。
将pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp空载体和pBWA(V)HS-ShERF3-GLosgfp融合表达载体分别在水稻叶肉细胞原生质体中进行瞬时表达，发现含有GFP的空载体在细胞核和细胞膜中均出现绿色荧光，而ShERF3-GFP融合蛋白仅在细胞核区域绿色荧光信号(图8)，结果表明ShERF3是一种细胞核定位蛋白。图8为ShERF3亚细胞定位结果；pBWA(V)HS-ShERF3-GLosgfp融合表达载体和pBWA(V)HS-GLosgfp空载体在水稻叶肉细胞原生质体中的亚细胞定位，由左至右分别为荧光场、明场、荧光明场融合图像。
1.2.6ShERF3表达分析
ShERF3在甘蔗中的组织表达分析选择田间生长健壮的新台糖22植株，分别取成熟叶片、未成熟叶片、茎节1-2、茎节4-5、茎节7-8、茎节10-11、茎节12-13、茎节14-15、根，3株为一个混样、3次重复。
非生物胁迫处理采用生长至6-7叶且长势一致的新台糖22号甘蔗组培苗，分组进行处理：第一组在含有20％ PEG6000的MS液中培养，第二组在含250mM NaCl的MS液中培养。然后分别于0、6、12、24、48、72和96h取样，每组处理均采取整株取样、迅速用液氮固定，每个处理设置三个生物学重复，利用Real time PCR进行表达分析。
图9为ShERF3基因在ROC22不同部位表达分析；IL：未成熟叶；ML：成熟叶；S1：茎节1-2；S2：茎节4-5；S3：茎节7-8；S4：茎节10-11；S5：茎节12-13；S6：茎节14-15；RS：根。
甘蔗栽培种新台糖22号不同组织中的ShERF3表达模式显示如图9所示，ShERF3主要在甘蔗茎秆中表达，尤其在成熟茎节中表达量最高。ShERF3基因在不同非生物胁迫下的表达模式如图10所示，在20％PEG6000模拟的干旱胁迫条件下，其表达量在胁迫初期呈下降趋势，在12h之后逐渐回升，在96h时高出对照(图10A)；在250mM NaCl的盐胁迫中，ShERF3表达量总体呈下降趋势(图10B)，表明ShERF3响应干旱和盐分胁迫。
综上，本发明从新台糖22中克隆了含有完整cDNA序列的ShERF3基因，对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析发现，ShERF3蛋白具有一个AP2结构域，符合ERF亚家族结构特征。转录因子一般在细胞核内发挥作用，具有一段核定位信号区域NLS，ShERF3的亚细胞定位结果也显示此蛋白定位在细胞核，但信号肽预测结果显示ShERF3蛋白无信号肽，推测ShERF3可能是依赖与其它含有NLS的转录因子的相互作用进入核内发挥作用。Casu等人的研究结果表明，与非生物胁迫耐受性相关的基因在甘蔗成熟的茎秆中表达量更高，本发明ShERF3的组织特异性表达结果也表现出相同的结果，其表达量在甘蔗茎秆中表达量最高，叶片和根中次之，且在成熟茎中的表达远远高于幼嫩茎，表明ShERF3很有可能在甘蔗茎秆发育和非生物胁迫应答中发挥一定作用。聚类分析发现，ShERF3与高粱SbERF3、小麦TaERF3、柳枝稷PvERF3等亲缘关系较近，同属于AP2/ERF家族的B3类，而TaERF3等B3类转录因子参与干旱和盐胁迫应答。本发明在PEG模拟的干旱胁迫条件下，ShERF3的表达呈现“先降后升”的趋势，这可能是前期的干旱条件诱导了其他抗旱基因的表达，通过反馈调节抑制了ShERF3的表达，后期待其他调节的途径减弱以后，ShERF3才参与响应干旱应答。在250mMNaCl的盐胁迫环境中，ShERF3的表达量总体呈下降趋势，说明ShERF3可能是甘蔗响应盐胁迫的一个负调控因子。由以上结果可以推测ShERF3可能参与甘蔗干旱和盐胁迫应答、可作为甘蔗抗逆性工程的候选基因。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2.根据权利要求1所述的甘蔗乙烯响应转录因子ShERF3在提高植物在干旱和盐逆境胁迫抗性上的应用。
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