CN108315338A

CN108315338A - 一种石榴苯丙氨酸解氨酶pal及其表达基因与应用

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Publication number: CN108315338A
Application number: CN201810347948.2A
Authority: CN
Inventors: 冯立娟; 尹燕雷; 杨雪梅; 唐海霞
Original assignee: Shandong Institute of Pomology
Current assignee: Shandong Institute of Pomology
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2018-07-24

Abstract

本发明涉及一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用。一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的石榴苯丙氨酸解氨酶PAL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用RT‑PCR和RACE技术，从石榴果实中克隆苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，进行生物信息学分析，并研究了其在不同品种果实发育中的表达特性，为揭示石榴果实外观品质和褐变形成的机理提供理论依据。

Description

一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用

技术领域

本发明涉及一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

苯丙烷途径是植物特有的次生代谢途径之一，能代谢成木质素、类黄酮、生物碱等生物活性物质。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C 4.3.1.5)是苯丙烷代谢第一步反应的限速酶，能催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)脱氨生成肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢的关键桥梁^[1-2]。PAL不仅与植物抗病抗逆有关^[3]，还参与花青苷和木质素的合成，影响果实外观品质和组织褐变^[4]。

石榴(Punica granatum L.)果实富含安石榴苷、类黄酮和生物碱等生物活性物质，具有诸多保健功能，极具发展前景^[5]。石榴果实呈色受PAL、查尔酮合成酶(Chalconesynthase， CHS)、查尔酮异构酶(Chalcone isomerase，CHI)、二氢黄酮醇还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase，DFR)和UDP-葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT)等的调控，石榴果实中花青苷调控酶CHS、CHI、DFR和 UFGT基因克隆与表达方面的研究^[6]已有相关报道，但石榴果实呈色与PAL基因表达关系方面的研究还未有研究。石榴果实采后极易发生褐变，影响其商品价值。研究表明，石榴果实褐变程度与PAL活性高低密切相关^[7]，但PAL基因表达与石榴果实褐变的关系尚不清楚。因此，研究PAL在石榴果实发育期的表达水平对阐明石榴外观品质形成和褐变发生的分子机理具有重要价值。

迄今，鸭梨、柑橘、芒果等多种果树作物上已有PAL基因克隆和序列分析等方面的报道。在大多数植物中，PAL是由一个基因家族控制的，不同组织有多种同工酶，不同成员间表达特性不同^[8]。PAL在甘蔗根中相对表达量最高，在茎和叶中较低^[9]。‘鸭梨’果实发育早期果心中PbPAL1和PbPAL2表达量显著高于果皮和果肉，受机械损伤后，果皮和果肉中PbPAL1 和PbPAL2表达上调的时间不同^[2]。目前，石榴果实中PAL基因克隆、生物信息学及表达分析方面的研究国内外还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用。石榴果皮RNA提取纯度低，易降解，存在基因全长克隆难等问题，本发明建立了一种石榴果皮PAL同源克隆方法，提供了一种石榴PAL核苷酸序列及其编码的蛋白序列，公开了PAL在不同石榴品种发育期的表达模式，为揭示石榴果实呈色和褐变机理提供了理论依据，具有一定的应用价值。

本发明技术方案如下：

一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述石榴苯丙氨酸解氨酶PAL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因。

一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达载体或表达上述石榴苯丙氨酸解氨酶 PAL。

上述石榴苯丙氨酸解氨酶PAL和/或上述石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因在改良石榴品种中的应用。

有益效果

本发明采用RT-PCR和RACE技术，从石榴果实中克隆苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，进行生物信息学分析，并研究了其在不同品种果实发育中的表达特性，为揭示石榴果实外观品质和褐变形成的机理提供理论依据。

附图说明

图1是石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因PCR扩增的电泳图；

图中：A:中间片段扩增产物；B:3′RACE扩增产物；C:5′RACE扩增产物；D:全长 PCR扩增产物；M:DL2000marker；

图2是石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因的核苷酸及推测的氨基酸序列图；

图中：方框内是起始密码子ATG和为终止密码子TGA，GTITASGDLVPLSYIAG为苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构；

图3是石榴与其他植物苯丙氨酸解氨酶PAL氨基酸序列的多重比对结果图；

图中：PgPAL：石榴；VvPAL：葡萄，XP_002268256.1；AkPAL：金合欢，AOX49212.1；BpPAL：白桦，AKN79308.1；JcPAL：麻疯树，XP_012082374.1；MdPAL：苹果，XP_008387584.1；PbPAL：梨，NP_001306736.1；PtPAL：毛白杨，AKE81098.1；RpPAL：刺槐，ACF94716.1； TcPAL：可可，XP_007027354.1；黑色方框表示苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构区域；

图4是石榴与其他植物苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白的系统进化树分析图；

图5是石榴和葡萄PAL基因在大肠杆菌中进行原核表达后，阳性菌液经IPTG诱导4h后取样进行SDS-PAGE电泳检测结果图；

图中：1、3、6、9为对照，2、4、5为石榴诱导后样本，7、10、11为葡萄诱导后样本，8为索莱宝彩虹180蛋白marker；

图6是石榴苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白的保守结构域；

图7是石榴苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白疏水性/亲水性分析结果；

图8是石榴苯丙氨酸解氨酶PAL氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰分析结果；

图9是石榴苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白二级结构分析结果；

图中：A：α-螺旋；B：延伸链；C：无规则卷曲；D：β-转角；

图10是不同石榴品种发育期果皮苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因的表达分析结果柱状图；

图中：**同一品种在不同发育期的表达在0.01水平差异极显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例

(1)总RNA提取

‘泰山红’石榴果皮RNA的提取按照RNA prep Pure Plant Kit试剂盒(DP441，北京天根生化有限公司)说明书进行。提取RNA完整性利用琼脂糖凝胶电泳检测，OD260/OD280值利用Nanodrop紫外分光光度计测定。

(2)保守序列的克隆

cDNA第一链的合成参照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa 公司)说明书进行。

根据GenBank登录的PAL基因的保守序列设计简并引物PAL-F：GAGCTNATYAGATTYTTGAAYGC和PAL-R：CAATYTGDCCRGGRTGGTGCTTC，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR反应体系如下,总体系为50μL：

上游引物PAL-F 1.5μL、下游引物PAL-R 1.5μL，2×Ex Taq buffer 25μL，浓度10mM的dNTP 1μL，cDNA 5μL，Ex Taq酶1μL，ddH2O 15μL。

反应程序为：

94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环； 72℃保温10min，4℃保存。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌后获得的阳性克隆送交上海生工生物公司测序。经检测，扩增获得525bp中间片段序列结果如图1-A所示；

(3)5'端克隆的克隆

根据获得的保守序列设计5'RACE特异引物：5'PAL-1：AGGGGGTGATGTTGTG，5'PAL-2： CAGGAGCTTCGTGATTGC和5'PAL-3：CTGGAGGAGGGTGTTGATC。

5'端克隆参照5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 (18374-058，Invitrogen公司)试剂盒说明进行。具体步骤如下：

(a)首先使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物5'PAL-1对提取的总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成；(b)使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理；(c)使用DNAPurification System:GLASSMAX DNA isolation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化；(d)使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C；(e)使用引物5'PAL-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增；(f)使用引物5'PAL-3和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增； (g)将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，纯化后的PCR产物与 pMD18T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序。

经检测，获得511bp的5'序列，结果附图1-C所示。

(4)3'端克隆的克隆

根据保守序列设计特异引物3'PAL-1：CTGGCGGTCCTGTCCGAGGTATTAT和3'PAL-2：GGAAGCCCGAGTTCACGGACCATCT，UPM：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT为通用引物。

3'端克隆按照SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit(634923，Clontech公司)试剂盒说明书进行。具体步骤如下：

(a)使用逆转录酶SMARTScribe^TM Reverse Transcriptase和引物3'CDS primer A对总RNA进行逆转录合成cDNA；(b)使用引物3'PAL-1和UPM，以上面合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增；(c)将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物3'PAL-2和UPM 进行第二轮PCR扩增；(d)将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接，转化后挑取阳性克隆测序。

经检测，获得1417bp的3'序列，结果附图1-B所示。

(5)全长的克隆

将所获得的两端序列和中间片段序列进行拼接，分别在5'端起始密码子的上游和3'端终止密码子的下游设计特异引物PAL-F1：TGCGGTTAGGTTTGGCTTCG和PAL-R1：AGCACCGGAACAGCATAGGA进行全长cDNA的扩增，然后将扩增的DNA片段连接到pMD18-T载体上进行测序。利用BLAST和DNAMAN软件进行序列比对，比较测序结果与拼接结果，测序正确的cDNA序列为PAL基因。

利用DNAMAN软件将5'和3'端序列与中间片段进行拼接，获得长为2453bp的cDNA序列。根据拼接后的全长cDNA序列设计包含完整ORF的PAL基因引物，扩增得到长2205bp的ORF序列，结果如图1-D所示，与拼接结果序列完全一致，共编码734个氨基酸，如SEQ IDNO.2所示。该基因氨基酸序列中含有苯丙氨酸和组氨酸解氨酶保守结构的标志性模式(216-232位)，序列为GTITASGDLVPLSYIAG，包埋在酶的活性中心，如图2所示。

利用NCBI网站BLAST进行序列比对，该基因核苷酸序列与龙血树(Dracaenacambodiana，ID：JN377585.1)、巨桉(Eucalyptus grandis，ID：XM_010069013.2)和大叶桉(Eucalyptus robusta，ID：AB696677.1)等植物的相似性分别为81％、79％、和78％。编码的氨基酸序列与金合欢(Acacia koa，ID：AOX49212.1)、葡萄(Vitis vinifera，ID： XP_002268256.1)和苹果(Malus domestica，ID：XP_008387584.1)等植物的相似性较高，分别为90％、89％和85％，这表明克隆得到的cDNA序列是石榴PAL基因，GenBank登录号为KY094504。

利用DNAMAN软件对石榴与其他物种PAL编码的氨基酸序列多重比较分析发现，如图3 所示，它们之间存在较高的同源性，均含有苯丙氨酸和组氨酸解氨酶的保守结构域，这说明，不同植物PAL蛋白存在高度保守序列，有长度差异性和组成上的变异性。

为研究石榴与其它物种PAL的进化关系，根据10个PAL基因的氨基酸序列构建系统进化树如图4所示，通过分析发现，石榴与葡萄、白桦、金合欢、刺槐PAL蛋白聚为一大类，但单独聚为一小类，这可能与其物种特异性有关。苹果和梨同属于蔷薇科(Rosaceae)聚在一起。

(6)原核表达分析

经以上分析可知，葡萄PAL基因与获得石榴PAL基因氨基酸的同源性较高，同属于果树作物。因此，为体现获得PAL基因的独特性，比较了石榴与葡萄(NCBI登录号： XM_002268220.4)PAL基因原核表达的差异。以两个物种PAL基因cDNA为模板分别设计合成引物,石榴：SL-F：CACCATGAACATGGAAGTCAGCACTAAG和SL-R：ACAAATAGGAATCGGGGCGC；葡萄：PT-F：CACCATGGATGCAACGAACTGCCAT和PT-R：GCAGATTGGGAGAGGAGCAC。使用高保真酶，以质粒为模板，扩增目的基因，胶回收目的产物。将回收产物与原核表达载体pBM30连接，转化DH5α，涂布LB平板(卡那霉素，50μg/mL)，菌液PCR筛选，测序验证阳性菌液。将阳性菌液活化培养，提取质粒，转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布LB平板(卡那，50μg/mL)，菌液PCR筛选阳性菌液。阳性菌液经IPTG诱导4h后取样进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果表明，石榴和葡萄PAL基因均能在大肠杆菌中进行原核表达，但石榴PAL基因表达能力强于葡萄，如图5所示。

(7)生物信息学分析

克隆获得的中间片段、3'RACE和5'RACE序列采用DNAMAN软件拼接，同时进行多序列比对和系统进化树分析；基因序列的开放阅读框和编码的蛋白质序列采用ORF finder预测；采用NCBI进行基因核苷酸和氨基酸序列相似性分析；蛋白保守结构域采用CDD软件分析；蛋白质的理化性质采用Expasy Protparam分析；蛋白质的疏水性/亲水性采用ProtScale分析；蛋白质的磷酸化位点采用NetPhos分析；蛋白质的二级结构采用SOPMA预测。

对PAL编码蛋白的保守结构域分析表明，石榴PAL蛋白具有PLN02457(Phenylalanine ammonia-lyase，苯丙氨酸解氨酶)结合位点和PLN02457超家族，如图6所示。

ProtParam分析表明，石榴PAL编码蛋白的预测分子质量为79693.87Da，等电点(pI) 为6.19，分子式为C3506H5601N987O1070S31，负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为80，正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为71，不稳定系数为33.80，是一类稳定蛋白，脂溶性指数为88.68，亲水性平均数为-0.173。

ProtScale分析表明，PAL蛋白存在明显的疏水区和亲水区，其中第300位最高，为2.422，第625位最低，为-3.100，为亲水性蛋白，如图7所示。

蛋白质磷酸化是一种最普遍、最重要的蛋白翻译后修饰方式。一般，多肽链中的氨基酸潜在的磷酸化位点越多，发挥更多功能的可能性也就越大。利用NetPhos分析表明，PAL存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3个磷酸化位点，结果如图8所示。各个磷酸化位点的数目不同，其中丝氨酸磷酸化位点32个，苏氨酸磷酸化位点22个，酪氨酸磷酸化位点7个。

对石榴PAL编码蛋白的二级结构分析表明，有349个氨基酸参与形成α-螺旋，占总氨基酸的47.55％；有224个氨基酸参与形成无规则卷曲，占总氨基酸的30.52％；有94个氨基酸参与形成延伸链，占总氨基酸的12.81％；有67个氨基酸参与形成β-转角，占总氨基酸的9.13％，如图9所示。这说明，石榴PAL编码蛋白二级结构中含有丰富的α-螺旋和无规则卷曲。

(8)PAL基因表达分析

选取‘泰山红’和‘泰山三白甜’石榴生长健壮，长势一致的8年生树10株，常规管理。7月15日开始采样，每个品种选10个大小均匀、着色一致、无病虫害、无挤压损伤的果实样品，每隔10d 1次，10月2日完全成熟时为止。提取两个品种各时期果皮总RNA，反转录为cDNA，实时荧光定量PCR检测PAL的相对表达量变化。同时分析两个品种发育期果皮中褐变度和花青苷含量的变化规律。每时期每次样品重复3次。

根据获得的PAL基因序列设计实时荧光定量PCR特异引物PAL-F：AACGGCGAGAACGAGAAGAA，PAL-R：CGAATCGGTACAATGGGTAGG，使用的仪器为美国伯乐BIO-RADIQ5实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)。根据Green PCR MasterMix说明书配制PCR反应体系，每个样品设3个重复。

反应体系为：SYBR Green Master I 10μL，浓度为5μmol·L^-1的上游引物PAL-F 1μL，浓度为5μmol·L^-1的下游引物PAL-R 1μL，模板1μL，加去离子水至20μL。

PCR反应程序为：

95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸15s，40个循环；最后退火至55℃，每隔7s上升0.5℃至95℃，共81个循环。

以石榴Actin(GU376750.1)为内参，每个基因扩增均有内参同时扩增，默认条件下读取Ct值，采用2-ΔΔCT方法进行数据分析。

两个石榴品种发育期果皮中PAL基因相对表达量随发育天数的增加呈先降低后升高的变化趋势，均在7月15日出现峰值，如图10所示。整个发育期，‘泰山红’果皮中PAL基因表达水平一直高于‘泰山三白甜’。在7月15日-8月14日，‘泰山红’果皮中PAL基因表达量与其它时期差异极显著(P<0.01)。在7月15日、7月25日和9月23日，‘泰山三白甜’果皮中PAL基因表达量与其它时期差异极显著(P<0.01)。

参考文献：

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SEQUENCE LISTING

<110> 山东省果树研究所

<120> 一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2205

<212> DNA

<213> Punica granatum L.

<400> 1

atgaacatgg aagtcagcac taaggatgcc atccatcaga acgggaacgg ggcactacac 60

gggccgatga acggtctgtg catcaagagt actgtggctg cccgccagta ccagcacggg 120

cacgaccccc tgaactgggg ggaggcggct gagtcgatga ctgggagcca ccttgacgag 180

gtgaagagga tggtgaccga gttccggaag ccagtggtac ggctaggggg tgagaccctg 240

acaatatccc aggtggcggc catcgctgca cgggacaccg agggcgtcag ggtggagctc 300

gcggagtctg ccagggccgg cgtgaaggcc agtagcgact gggtgatgga cagcatgaac 360

aaggggaccg acagctacgg ggtcaccacc gggtttggtg ccacctcgca caggaggacc 420

aagcagggcg gtgctcttca gaaggagctt attaggttct tgaacgctgg tatattcggg 480

aatggaacag agtcctgcca cactctgcct cactctgcca ccagagctgc catgctcgtc 540

aggatcaaca ccctcctcca gggctactcc ggaatcaggt tcgagatcct cgaagcaatc 600

acgaagctcc tgaaccacaa catcaccccc tgccttcccc tccggggaac catcaccgcc 660

tcgggcgacc ttgtccccct ttcatatatc gcgggtctcc tgactggcag gcccaatgcc 720

aaagccgttg ggcccgaagg gcagcctctc aatgcggagg aggccttcca ggttgcaggg 780

attgactcag ggttcttcga gttgcagccc aaggaagggt tggcgttggt gaatggcacg 840

gcagttggtt ccggccttgc atccatggtt ttgttcgagg ccaatatcct ggcggtcctg 900

tccgaggtat tatcggcaat atttgccgag gttatgcagg ggaagcccga gttcacggac 960

catcttaccc acaagttgaa gcaccacccg gggcagattg aggccgctgc cattatggaa 1020

cacatcttgg atgggagctc gtatgttaaa gccgccaaga aactgcacga catggacccc 1080

ttgcagaagc ctaagcagga ccgttacgcc ctccggacct caccccagtg gcttggcccc 1140

cagattgagg ttatccggtt ctccactaag tccatcgagc gggagatcaa ttccgtcaat 1200

gacaacccac tcattgatgt ttcacggaac aaggccctcc acggcgggaa cttccagggc 1260

accccaattg gtgtctcaat ggacaacact aggcttgcgc ttgcagcaat cgggaagctg 1320

atgtttgcac aattctccga gctcgtgaac gatttctaca acaatggttt gccctctaac 1380

ctcactgcga gcccgaaccc gagcttggac tatggcttca agggggctga aattgcaatg 1440

gcctcatact gctctgaact gcagttccta ggaaacccgg tgaccaacca tgtccagagt 1500

gccgagcagc ataatcagga cgtgaactcg ctgggcctga tctcttctag gaagacagcc 1560

gaagctgtgg aaatcctaaa gctcatgtca tcgactttcc tcgtcgcgct ctgccaagca 1620

atagacctca ggcacttgga ggagaacctc aggagcaccg tgaagaacac ggtgggccaa 1680

gtagcaaaga ggaccttaac catgggagtt aacggagagc tccacccttc cagattctgc 1740

gagaaggatc tcctcacggt ggtcgaccgg gaatacgtct ttgcctatgc agatgaccct 1800

tgcagcgcta cataccctct gatgcagaag ctcaggcagg tcctcgtcga ccatgccctc 1860

aggaacggcg agaacgagaa gaacccgagc tcctcggtgt tccagaggat cggagccttc 1920

gaggcagagc tcaaggcagt ccttccaaag gagatagagg ccgctagggc agcctacgag 1980

agcggaactg gggcgatccc gaacaggatc aaggagtgtc ggtcctaccc attgtaccga 2040

ttcgtgaggg aggagcttgg gactggaatc ttgacaggag agaaagtcct gtcccctgga 2100

gaggatttcg acaaggtctt cacggcaatg tgccagggta agatcataga cccgatgttg 2160

gagtgtctca gcagttggaa cggcgccccg attcctattt gttga 2205

<210> 2

<211> 734

<212> PRT

<213> Punica granatum L.

<400> 2

Met Asn Met Glu Val Ser Thr Lys Asp Ala Ile His Gln Asn Gly Asn

1 5 10 15

Gly Ala Leu His Gly Pro Met Asn Gly Leu Cys Ile Lys Ser Thr Val

20 25 30

Ala Ala Arg Gln Tyr Gln His Gly His Asp Pro Leu Asn Trp Gly Glu

35 40 45

Ala Ala Glu Ser Met Thr Gly Ser His Leu Asp Glu Val Lys Arg Met

50 55 60

Val Thr Glu Phe Arg Lys Pro Val Val Arg Leu Gly Gly Glu Thr Leu

65 70 75 80

Thr Ile Ser Gln Val Ala Ala Ile Ala Ala Arg Asp Thr Glu Gly Val

85 90 95

Arg Val Glu Leu Ala Glu Ser Ala Arg Ala Gly Val Lys Ala Ser Ser

100 105 110

Asp Trp Val Met Asp Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val

115 120 125

Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Gln Gly Gly

130 135 140

Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly

145 150 155 160

Asn Gly Thr Glu Ser Cys His Thr Leu Pro His Ser Ala Thr Arg Ala

165 170 175

Ala Met Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile

180 185 190

Arg Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Lys Leu Leu Asn His Asn Ile

195 200 205

Thr Pro Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu

210 215 220

Val Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ala

225 230 235 240

Lys Ala Val Gly Pro Glu Gly Gln Pro Leu Asn Ala Glu Glu Ala Phe

245 250 255

Gln Val Ala Gly Ile Asp Ser Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys Glu

260 265 270

Gly Leu Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Leu Ala Ser

275 280 285

Met Val Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Ala Val Leu Ser Glu Val Leu

290 295 300

Ser Ala Ile Phe Ala Glu Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp

305 310 315 320

His Leu Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala

325 330 335

Ala Ile Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Val Lys Ala Ala

340 345 350

Lys Lys Leu His Asp Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg

355 360 365

Tyr Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val

370 375 380

Ile Arg Phe Ser Thr Lys Ser Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn

385 390 395 400

Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Leu His Gly Gly

405 410 415

Asn Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu

420 425 430

Ala Leu Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu

435 440 445

Val Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Thr Ala Ser

450 455 460

Pro Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met

465 470 475 480

Ala Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Gly Asn Pro Val Thr Asn

485 490 495

His Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly

500 505 510

Leu Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ala Glu Ala Val Glu Ile Leu Lys Leu

515 520 525

Met Ser Ser Thr Phe Leu Val Ala Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu Arg

530 535 540

His Leu Glu Glu Asn Leu Arg Ser Thr Val Lys Asn Thr Val Gly Gln

545 550 555 560

Val Ala Lys Arg Thr Leu Thr Met Gly Val Asn Gly Glu Leu His Pro

565 570 575

Ser Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Thr Val Val Asp Arg Glu Tyr

580 585 590

Val Phe Ala Tyr Ala Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Met

595 600 605

Gln Lys Leu Arg Gln Val Leu Val Asp His Ala Leu Arg Asn Gly Glu

610 615 620

Asn Glu Lys Asn Pro Ser Ser Ser Val Phe Gln Arg Ile Gly Ala Phe

625 630 635 640

Glu Ala Glu Leu Lys Ala Val Leu Pro Lys Glu Ile Glu Ala Ala Arg

645 650 655

Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Thr Gly Ala Ile Pro Asn Arg Ile Lys Glu

660 665 670

Cys Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Arg Phe Val Arg Glu Glu Leu Gly Thr

675 680 685

Gly Ile Leu Thr Gly Glu Lys Val Leu Ser Pro Gly Glu Asp Phe Asp

690 695 700

Lys Val Phe Thr Ala Met Cys Gln Gly Lys Ile Ile Asp Pro Met Leu

705 710 715 720

Glu Cys Leu Ser Ser Trp Asn Gly Ala Pro Ile Pro Ile Cys

725 730

Claims

1.一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的石榴苯丙氨酸解氨酶PAL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，表达载体中插入如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因。

4.一种重组细胞，所述重组细胞包含有权利要求3所述重组表达载体或表达权利要求2所述石榴苯丙氨酸解氨酶PAL。

5.权利要求2所述石榴苯丙氨酸解氨酶PAL和/或权利要求1所述石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因在改良石榴品种中的应用。