CN101892212B

CN101892212B - 番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN101892212B
Application number: CN2010101989022A
Authority: CN
Inventors: 郭仰东; 温常龙; 刘莉莎; 杨鹏; 赵立群; 程琳; 王玉珏; 赵永钦
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-06-04
Also published as: CN101892212A

Abstract

本发明公开了一种番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明立足于提高番茄适应非生物胁迫的能力，结合基因工程辅助育种研究，过表达番茄的C₄代谢关键基因ppc，提高番茄对非生物胁迫的适应能力和提高番茄的光合效率，为创新番茄种质改良方法，加快番茄选择育种进程提供科学依据。本发明将为番茄等园艺作物高光效转基因育种提供重要的技术与理论支撑。

Description

番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因和应用。

背景技术

有研究表明在C₃植物中存在一个C₄代谢的微循环，这也合理地解释了C₄代谢的多源进化过程，也预示着利用转基因改良C₃植物是有价值的，利用C₄代谢关键酶基因转化C₃植物不仅能改善其光合特性，而且能提高其抵抗生物胁迫和非生物胁迫的能力。在C₃植物中过表达或者导入外源C₄代谢关键酶基因是提高光合效率的有效途径。在水稻上，PEPC酶活性可以作为水稻高光效育种的指标。

ppc基因是编码PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的基因，PEPC是植物细胞代谢中的一种重要羧化酶，在C₄和CAM植物中，它能富集CO₂，从而提高光合效率，该酶介导不可逆的β羧化反应，将磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸和磷酸。而在C₃植物中，该酶具有为Krebs循环补充四碳二羧酸水平的回补反应功能。C₄途径的PEPC对CO₂有很强的亲和能力，可将大气中低浓度CO₂固定下来，并运输到维管束鞘细胞的叶绿体中供C₃途径利用，因此C₄途径固定CO₂能力比C₃途径强，起到CO₂泵的作用，提高了C₄植物利用CO₂的能力。

转C₄代谢关键酶基因改良C₃植物最热门的研究是在水稻上，ku等1999年报道了获得转玉米ppc基因水稻的PEPC活性高达原种的44-81倍，是玉米PEPC活性的2-3倍，光抑制作用也下降了20％，种子产量比原种提高10％-12％，转玉米C₄型ppdk基因水稻产量增加35％，这些均展示了通过增强水稻的C₄光合特性增加光合效率以提高水稻产量的端倪。Jiao等(2001)研究了转玉米C₄光合多个酶PEPC、PPDK、NADP-ME基因水稻不仅外源C₄光合基因在水稻中正确而且高效的表达，转NADP-ME、ppdk基因水稻的ME、PPDK活性比原种高5倍，分别达到玉米的50％和70％；在高温(35℃)下，转PEPC基因水稻的净光合速率比原种高20.2％，羧化效率提高57％，CO₂补偿点降低32％。在高光强下，与原种相比转PEPC基因水稻中Rubissco羧化酶活性变化不明显，但碳酸酐酶(CA)诱导活性增加I.8倍，显示光合特性的显著改善(Jiao et al.，2002)。另外，陈绪清等(2004)发现转玉米C₄型PEPC基因的小麦植株部分转基因植株光合速率有所提高，气孔对水蒸气的导度以及蒸腾速率也显著提高，推测C₄光合基因的高效表达可引起气孔保卫细胞中苹果酸浓度的升高，促进气孔开放。

过表达ppc基因的烟草和马铃薯均能提高PEPC酶的活性，转玉米PEPC基因水稻的叶内具有初级的CO₂浓缩机制，为转基因的高光效育种技术提供了生理依据。转PEPC基因水稻中午Fv/Fm、qP和PS II降低较少，qN略为增加，光能转化为化学能的效率较高，热耗散较低，表现耐光抑制。这些材料的PEPC活性和净光合速率(Pn)提高，CO₂补偿点降低，且Pn和PEPC活性呈正相关。玉米C₄型pepc基因的高表达反过来也增强C₃植物内源逆境相关因子或基因的增强子等交叉因子诱导，从而诱导SOD和POD等抗氧化酶活性的提高，表现耐光氧化能力增强。

番茄生产中常出现35℃以上的亚高温现象和设施生产中常面临CO₂浓度不足的问题。由于番茄是C₃植物，对于高温和低CO₂浓度的适应性较差，导致落花落果，大大的影响了番茄的产量和质量。针对这种情况，目前主要是通过人工通风、遮光、喷水和化控技术来避免高温伤害和增施CO₂肥料来解决的，但不能从根本上改变番茄不适应高温和低CO₂浓度的问题，所以培育适应能力强的优良品种是关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白(PEPC蛋白)，是一种番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，来源于番茄micro-tom(Solanum lycopersicum L.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

为了便于PEPC蛋白的纯化，可在由序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的PEPC蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的PEPC蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因(ppc基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列3所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的蛋白的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码具有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为将所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将序列表的序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分子插入pBI121的Xba I和BamH I酶切识别位点之间得到的重组质粒。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

含有以上任一所述基因(ppc基因)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增上述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将以上任一所述基因导入目的植物中，得到如下(I)和/或(II)和/或(III)的转基因植物：

(I)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶含量高于所述目的植物的转基因植物；

(II)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活性高于所述目的植物的转基因植物；

(III)光合效率高于所述目的植物的转基因植物。

所述的基因具体可通过所述重组载体导入所述目的植物中。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，均可将编码所述蛋白的基因导入植物，获得转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

所述双子叶植物优选为番茄，最优选番茄micro-tom。

所述光合效率可体现为净光合速率。

所述基因可用于改良番茄种质。所述基因可用于番茄育种。

依据C₄代谢关键酶基因改良C₃植物在水稻上已取得的成就，本发明主要探讨过表达番茄ppc基因对番茄PEPC活性的影响，预期为提高PEPC活性，增加量子效率、Fv/Fm、qP和非光化学淬灭(qN)，降低CO₂补偿点，增加番茄抗氧化酶活性和抗氧化物质含量，使番茄具备耐高温和光抑制特性，从而提高光合效率，增加其光合能力。本发明立足于提高番茄适应非生物胁迫的能力，结合基因工程辅助育种研究，过表达番茄的C₄代谢关键基因ppc，提高番茄对非生物胁迫的适应能力和提高番茄的光合效率，为创新番茄种质改良方法，加快番茄选择育种进程提供科学依据。本发明将为番茄等园艺作物高光效转基因育种提供重要的技术与理论支撑。

附图说明

图1为过表达番茄ppc基因的转基因植株分子鉴定。

图2为过表达番茄ppc基因的转基因植株PEPC酶活性鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。限制性内切酶(Xba I和BamH I)购自MBI fermentas公司。其它试剂均为分析纯。

番茄micro-tom：中国农业大学保证向公众提供；参考文献：刘小花，张岚岚，朱长青，陈昆松，徐昌杰；Mechanisms for miniature dwarf characteristics ofMicro-Tom tomato and its application in plant functional genomicsstudies；HEREDITAS(Beijing)2008，10，30(10)：1257-1264；ISSN 0253-9772www.chinagene.cn.；很多园艺公司均有出售，如南京丰硕园艺有限公司。

实施例1、番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)及其编码基因(ppc)的发现

一、RNA提取和反转录

将番茄micro-tom种子用水浸泡30min，经无菌水冲洗一遍后，用75％(体积百分含量)酒精浸泡30s，用1％次氯酸钠消毒10min，再用无菌水连续冲洗5次后接种到基本培养基(MS培养基+3％蔗糖+0.25％Gerite)上，待无菌苗有3-4片真叶时，取叶片用博迈德公司EASY spin RNA提取试剂盒提取总RNA，用M-MLV反转录酶进行反转录，获得cDNA。

二、设计引物

根据NCBI已有的番茄ppc基因cDNA序列AJ243416.1(LYCes；Ppc)，使用primer5.0软件设计两对引物。第一对引物为lyppc1s和lyppc1as。第二对引物为lyppc2s和lyppc2as。

lyppc1s：5′-TAGGGATTGATGAACGAG-3′；lyppc1as：5′-TTCCATATTCCAGGTGAC-3′；

lyppc2s：5′-GTTGAGTGAGAAATGAC-3′；lyppc2as：5′-AATAGTACAAGTTAGCTG-3′。

三、PCR扩增

将步骤一的cDNA作为模板，利用步骤二设计的引物进行PCR扩增。反应体系为25μl。第一对引物反应条件：95℃预变性5min；94℃，1min；52℃，30s；72℃1min；35个循环；72℃延伸10min。第二对引物反应条件：95℃预变性5min；94℃，1min；52℃，30s；72℃2min；35个循环；72℃延伸10min。

第一对引物PCR扩增获得micro-tom的ppc基因前796个核苷酸，根据第二对引物PCR扩增获得micro-tom的ppc基因后2209个核苷酸；分别连接pMD-18T载体，转化大肠杆菌感受态DH5α，涂加有Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基平板筛选阳性克隆，并通过测序对PCR产物进行鉴定，经过测序比对；把得到的两段序列拼接，获得全长cDNA，由2895个核苷酸组成。

序列2所示的DNA由2895个核苷酸组成，编码序列1所示的蛋白质。将序列1所示的蛋白质命名为PEPC蛋白，由964个氨基酸残基组成。将PEPC蛋白的编码基因命名为ppc基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示，含有起始密码子前部分核苷酸的ppc基因如序列表的序列3所示。

实施例2、过表达番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因载体构建和遗传转化

一、基因的克隆

1、特异引物对的设计

根据序列3所示的ppc基因设计如下特异引物对：

上游引物：CTAGTCTAGAGTTGAGTGAGAAATGAC；引入Xba I酶切识别位点；

下游引物：CGGGATCCGGATTAGCTTAACCAGTA；引入BamH I酶切识别位点。

2、基因的克隆

提取番茄micro-tom的RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用步骤1设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(ppc基因)。

二、重组质粒(ppc基因过表达载体)的构建

1、把PCR扩增产物(ppc基因)连接到pMD-18T载体(TAKARA公司)上，得到重组质粒pMD-18T-ppc。

2、用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切重组质粒pMD-18T-ppc，进行1％琼脂糖凝胶电泳，用蓝罡生物科技公司的凝胶回收试剂盒切胶回收小片段(ppc基因)。

3、用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切pBI121质粒(购于北京拜尔迪生物技术有限公司；含有35s启动子的原始表达载体)，回收质粒骨架。

4、将步骤2回收的小片段和步骤3回收的质粒骨架连接(连接酶是TAKARA的T4连接酶)，连接产物进行测序，测序结果表明，得到了ppc基因过表达载体pBI-ppc(在pBI121质粒的Xba I和BamH I酶切识别位点之间插入了序列表的序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA)。

三、重组农杆菌的获得

用pBI-ppc转化大肠杆菌DH5α(购于天根生化科技有限公司)，涂板筛选培养基(含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基)筛选阳性克隆；用LB液体培养基扩增重组菌，提取质粒；然后侵染根癌农杆菌菌株EHA105(Invitron公司)感受态。获得重组农杆菌(含有pBI-ppc的农杆菌)。

四、过表达番茄ppc基因的转基因番茄植株的获得

1、培养无菌苗

将番茄micro-tom种子用水浸泡30min，经无菌水冲洗一遍后，用75％(体积百分含量)酒精水溶液浸泡30s，用1％次氯酸钠消毒10min，再用无菌水连续冲洗5次后接种到基本培养基(MS培养基+3％蔗糖+0.25％Gerite)上，待无菌苗子叶伸展至0.5-1cm时将子叶用剪刀横向剪开，一分为二。

2、预培养

见步骤1处理得到的无菌苗在预培养培养基(MS培养基+2.0mg/L玉米素+0.5mg/L吲哚-3-乙酸)上暗培养24-48h。

3、侵染

用步骤三制备的重组农杆菌的菌液(OD值0.3-0.6)侵染预培养后的植株子叶5min。

4、共培养

在共培养培养基(MS培养基+2.0mg/L玉米素+0.5mg/L吲哚-3-乙酸+100μM乙酰丁香酮)上暗培养24-48h；

5、恢复培养

在恢复培养基(MS培养基+2.0mg/L玉米素+0.5mg/L吲哚-3-乙酸+500mg/L羧苄青霉素)上培养7天左右；

6、筛选和生根

在筛选培养基(MS培养基+2.0mg/L玉米素+0.5mg/L吲哚-3-乙酸+500mg/L羧苄青霉素+100mg/L卡那霉素)上进行培养；待植株长到3-5cm高时，转入生根培养基(基本培养基+0.05mg/L萘乙酸+500mg/L羧苄青霉素)进行生根培养，得到候选的过表达植株(T₀代)。

7、分子鉴定

用天根公司的DNA提取试剂盒提取候选的过表达植株和番茄micro-tom(番茄micro-tom作为阴性对照)的RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，进行半定量PCR鉴定，内参基因为Ubiquitin，ppc基因所用的引物对为ppc s和ppc as，Ubiquitin基因所用的引物对为ubi s和ubi as。

ppc s：5′-GTCGGACCGCCATACT-3′；

ppc as：5′-CTAACTCGGCATTCAC-3′。

ubi s：5′-CAGATCTTCGTCAAAACCCT-3′；

ubi as：5′-GACTCCTTCTGGATGTTGTA-3′。

结果见图1。图1中，M：Marker；1：候选的过表达植株；CK：阴性对照。结果表明：Ubiquitin基因的表达量，候选的过表达植株和阴性对照中是一致的；ppc基因的表达量，候选的过表达植株明显高于阴性对照；所以候选的过表达植株确实为过表达植株。共得到24株过表达植株。

五、转空载体对照植物的获得

用pBI121代替pBI-ppc，制备转空载体对照植株，方法同步骤三和步骤四。

六、过表达番茄ppc基因的转基因植株鉴定

测量相同条件下培养均处于幼苗期的野生型植株(10株)、转空载体对照植物(随机选取10株)和过表达植株(从24株中随机选取10株)中C4代谢光合关键酶PEPC酶活性和净光合速率，鉴定过表达ppc基因的效果。

1、PEPC酶活性

PEPC酶活性鉴定方法如下：

(1)取番茄叶片0.5g(鲜重；FW)，加1ml提取液(由水和溶质组成：溶质含量：50mmol/L Tris-HCl、pH 7.5，1mmol/L EDTA，1mmol/L MgCl₂，5mmol/L DTT，每100mL提取液含有2g不溶性PVP)研磨，滤液于13000g离心10min，取上清液(提取液)测酶活性。

(2)缓冲液：含50mmol/L HEPES-KOH(pH 8.0)，10mmol/L NaHCO₃，5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，1.5 unit MDH(苹果酸脱氢酶)。

(3)PEPC酶活性测定：取0.1ml提取液，加入0.8ml缓冲液中，混匀，室温静止3min；加入0.1ml 2mmol/L PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)水溶液，启动反应，开始计时；记录340nm光密度在每分钟的变化(测试温度为30℃)，连续测定5min，每分钟的变化的绝对值依次为Δx1、Δx2、Δx3、Δx4和Δx5。

6.22为NADH的摩尔吸光系数，0.5为样品鲜重(g)，0.1为加样体积(ml)，60为每小时60分钟。

结果取10株的平均值，见图2。野生型植株的PEPC酶活性为1.96μmol·g^-1FW·h^-1，过表达植株的PEPC酶活性为5.49μmol·g^-1FW·h^-1。转基因植株的PEPC酶活性比非转化株均高2.8倍；转空载体对照植株与野生型植株的PEPC酶活性没有显著差异。

2、净光合速率

使用LI-6400便携式光合测定仪测定净光合速率(环境温度32℃)。

10株野生型植株的平均值为16.2 CO₂μmol·m^-2·s^-1；过表达植株的平均值为16.78 CO₂μmol·m^-2·s^-1；过表达植株比野生型植株的净光合速率高3.6％，其中1株植株的净光合速率比野生型植株的平均值高9.4％；转空载体对照植株与野生型植株的净光合速率没有显著差异。

序列表

<110>中国农业大学

<120>番茄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及其编码基因和应用

<130>CGGNARY102361

<160>3

<210>1

<211>964

<212>PRT

<213>番茄micro-tom(Solanumlycopersicum L.)

<400>1

Met Thr Thr Arg Asn Leu Asp Lys Leu Ala Ser Ile Asp Ala Gln Leu

1 5 10 15

Arg Gln Leu Val Pro Ala Lys Val Ser Glu Asp Asp Lys Leu Val Glu

20 25 30

Tyr Asp Ala Leu Leu Leu Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln Asp Leu

35 40 45

His Gly Glu Asp Leu Lys Gly Thr Val Gln Asp Cys Tyr Glu Leu Ser

50 55 60

Ala Glu Tyr Glu Ala Lys His Asp Pro Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gly

65 70 75 80

Asn Val Leu Thr Ser Leu Val Pro Gly Asp Ser Ile Val Ile Ala Lys

85 90 95

Ala Phe Ser His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Gln

100 105 110

Ile Ala Tyr Arg Arg Arg Gln Lys Leu Lys Lys Lys Gly Asp Phe Gly

115 120 125

Asp Glu Ser Asn Ala Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Phe Lys

130 135 140

Lys Leu Val Gly Asp Leu Lys Lys Ser Pro Gln Glu Val Phe Asp Ala

145 150 155 160

Ile Lys Asn Gln Thr Val Asp Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Gln

165 170 175

Ser Val Arg Arg Ser Leu Leu Gln Lys His Gly Arg Ile Arg Asp Cys

180 185 190

Leu Ala Gln Leu Tyr Ala Lys Asp Ile Thr Pro Asp Asp Lys Gln Glu

195 200 205

Leu Asp Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr Asp

210 215 220

Glu Ile Arg Arg Thr Pro Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Ala Gly

225 230 235 240

Met Ser Tyr Phe His Glu Thr Ile Trp Lys Gly Val Pro Lys Phe Leu

245 250 255

Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asp Glu Arg Val

260 265 270

Pro Tyr Asn Ala Pro Leu Ile Gln Phe Ser Ser Trp Met Gly Gly Asp

275 280 285

Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys

290 295 300

Leu Leu Ala Arg Met Met Ala Ala Asn Leu Tyr Tyr Ser Gln Ile Glu

305 310 315 320

Asp Leu Met Phe Glu Leu Ser Met Trp Arg Cys Ser Glu Glu Leu Arg

325 330 335

Val Arg Ala Asp Lys Leu Gln Arg Ser Ser Arg Arg Asp Glu Lys His

340 345 350

Tyr Ile Glu Phe Trp Lys Gln Val Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg Val

355 360 365

Ile Leu Gly Asp Val Arg Asp Lys Leu Tyr Gln Thr Arg Glu Arg Ala

370 375 380

Arg Gln Leu Leu Gly His Gly Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Glu Ala Thr

385 390 395 400

Tyr Thr Asn Ile Glu Gln Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr Arg

405 410 415

Ser Leu Cys Ala Cys Gly Asp Leu Ser Ile Ala Asp Gly Ser Leu Leu

420 425 430

Asp Phe Leu Arg Gln Val Ser Thr Phe Gly Leu Ser Leu Val Arg Leu

435 440 445

Asp Ile Arg Gln Glu Ser Asp Arg His Thr Asp Val Leu Asp Ala Ile

450 455 460

Thr Gln His Leu Glu Ile Gly Ser Tyr Arg Glu Trp Ser Glu Glu Arg

465 470 475 480

Arg Gln Glu Trp Leu Leu Ser Glu Pro Ser Gly Lys Arg Pro Leu Phe

485 490 495

Gly Arg Asp Leu Pro Lys Thr Glu Glu Ile Ala Asp Val Leu Asp Thr

500 505 510

Phe His Val Ile Ala Glu Leu Pro Ala Asp Cys Phe Gly Ala Tyr Ile

515 520 525

Ile Ser Met Ala Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu

530 535 540

Gln Arg Glu Cys Arg Val Arg Gln Pro Leu Arg Val Val Pro Leu Phe

545 550 555 560

Glu Lys Leu Ala Asp Leu Asp Ala Ala Pro Ala Ala Val Ala Arg Leu

565 570 575

Phe Ser Ile Glu Trp Tyr Arg Asn Arg Ile Asn Gly Lys Gln Glu Val

580 585 590

Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala

595 600 605

Ala Trp Gln Leu Tyr Lys Ala Gln Glu Glu Leu Ile Gln Val Ala Lys

610 615 620

Glu Phe Asp Val Lys Leu Thr Met Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val

625 630 635 640

Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ala His Leu Ala Ile Leu Ser Gln Pro Pro

645 650 655

Glu Thr Ile His Gly Ser Leu Arg Val Thr Val Gln Gly Glu Val Ile

660 665 670

Glu His Ser Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe Arg Thr Leu Gln Arg

675 680 685

Tyr Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Val Ser Pro

690 695 700

Lys Pro Glu Arg Arg Ala Leu Met Asp Glu Ile Ala Val Val Ala Thr

705 710 715 720

Glu Lys Tyr Arg Ser Ile Val Phe Lys Glu Pro Arg Phe Val Glu Tyr

725 730 735

Phe Arg Leu Ala Thr Pro Glu Leu Glu Tyr Gly Arg Met Asn Ile Gly

740 745 750

Ser Arg Pro Ser Lys Arg Lys Pro Ser Gly Gly Ile Glu Ser Leu Arg

755 760 765

Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala Trp Thr Gln Thr Arg Phe His Leu Pro

770 775 780

Val Trp Leu Gly Phe Gly Ala Ala Phe Lys Tyr Ala Ile Glu Lys Asp

785 790 795 800

Ile Lys Asn Leu Arg Met Leu Gln Glu Met Tyr Asn Ala Trp Pro Phe

805 810 815

Phe Arg Val Thr Ile Asp Leu Val Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp

820 825 830

Pro Gly Ile Ala Ala Leu Phe Asp Lys Leu Leu Val Ser Glu Asp Leu

835 840 845

Leu Ser Phe Gly Glu Leu Leu Arg Ser Asn Tyr Glu Glu Thr Lys Ser

850 855 860

Leu Leu Leu Gln Ile Ala Gly His Lys Asp Leu Leu Glu Gly Asp Thr

865 870 875 880

Tyr Leu Lys Gln Arg Leu Arg Leu Arg Asp Ser Tyr Ile Thr Thr Leu

885 890 895

Asn Val Cys Gln Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro Asp Tyr

900 905 910

Ser Val Thr Pro Arg Pro His Ile Ser Lys Glu Tyr Met Glu Ala Lys

915 920 925

Pro Ala Thr Glu Leu Val Asn Leu Asn Pro Thr Ser Glu Tyr Ala Pro

930 935 940

Gly Leu Glu Asp Thr Leu Ile Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala Ala Gly

945 950 955 960

Gln Asn Thr Gly

964

<210>2

<211>2895

<212>DNA

<213>番茄micro-tom(Solanum lycopersicum L.)

<400>2

atgactacta ggaatttgga caaacttgca tcgattgatg cacagttgag gcaactggtg 60

cctgctaaag tttctgaaga tgataaactt gttgagtatg atgctttgct tttggatagg 120

tttcttgata ttcttcaaga tttgcatgga gaggatctca aaggaacagt ccaagattgt 180

tatgagcttt ctgccgagta tgaagccaag catgatccga agaagctgga ggaacttggc 240

aatgtgttga caagtttggt accaggggat tcaattgtta ttgctaaagc tttctctcac 300

atgcttaact tggccaattt ggctgaggag gttcagattg cctaccgtag gcgccaaaaa 360

ttgaagaaaa agggagattt tggggatgag agtaatgcaa caactgagtc agatattgaa 420

gaaactttca agaaactggt gggggactta aagaagtccc ctcaagaagt ttttgatgct 480

atcaagaatc agactgtgga tttggtccta acagctcatc ctactcaatc tgtacgaaga 540

tcattgcttc aaaagcatgg aaggatccgt gactgcttgg ctcagttgta tgctaaagac 600

attacacccg atgataaaca agaacttgac gaagctttac agagggagat ccaagctgcg 660

ttccgaactg atgagatccg aagaactcct cctactccac aagatgaaat gagagctgga 720

atgagctatt tccatgaaac aatttggaag ggtgtgccaa agtttctgcg tcgtgttgat 780

acagctctta aaaacatagg gattgatgaa cgagttcctt ataatgctcc tcttattcaa 840

ttctcctctt ggatgggcgg tgatcgtgat ggtaatccaa gagtgactcc cgaggtcaca 900

agagatgttt gcttattggc aagaatgatg gcagctaact tgtactattc gcaaatagag 960

gacctcatgt ttgagttatc tatgtggcgc tgcagtgaag agcttcgtgt gcgagcagat 1020

aaactccaaa ggtcttcaag gagagatgaa aaacactaca tagaattttg gaagcaagtt 1080

cctccaaatg aaccctatcg tgtaattctt ggtgatgtga gagataagtt gtatcagaca 1140

cgcgagcgtg ctcgccaact gttaggccat ggatactctg aaattccaga ggaagcaact 1200

tatactaata ttgagcagtt cttggagcct cttgagctct gctacagatc tctttgtgct 1260

tgtggtgatc tctccatagc ggatggtagc cttctggatt tccttagaca agtttctacg 1320

tttggacttt cactagtgag acttgacata agacaagagt cggaccgcca tactgatgtg 1380

cttgatgcta ttacgcagca tttggaaatt ggttcatatc gagaatggtc tgaagaacgt 1440

agacaagagt ggcttctgtc tgaacccagt ggcaagagac ctttatttgg acgggatctt 1500

ccaaaaactg aagaaattgc tgatgttttg gatacgttcc atgtcatagc cgaactccca 1560

gcagactgct ttggggcata catcatctca atggccactg caccatctga tgtgcttgca 1620

gttgagcttc tacagcgtga atgccgagtt aggcaacctt tacgagttgt tccacttttt 1680

gagaagttgg ccgatctgga tgctgctcct gcagccgttg cacgtctttt ctcaattgag 1740

tggtacagaa accggattaa tggcaagcaa gaagtgatga ttggatactc cgactctggc 1800

aaggatgcag gtcggctctc agcagcctgg cagttatata aggctcaaga ggagcttata 1860

caagtcgcca aggagttcga cgtgaagcta accatgttcc atggtagagg tggtacagtg 1920

ggaagaggag gtggccccgc ccatcttgcc atattgtctc aaccacccga aacaattcac 1980

ggatctctcc gtgttacagt tcagggtgag gttattgagc actcttttgg ggaagaacac 2040

ttgtgtttta ggacactcca acgttatact gctgctacac ttgaacatgg gatgcatcca 2100

ccagtctctc caaaaccaga acggcgtgca cttatggacg aaattgcagt tgttgctaca 2160

gaaaagtatc gatcaatagt ttttaaggaa ccccgatttg tcgagtattt ccgcctggcc 2220

acacctgagt tagagtatgg tcgaatgaac attggcagcc gtccatcaaa gcgtaaaccc 2280

agcggaggca tagaatcact tagagctatt ccttggatct ttgcttggac tcaaactaga 2340

ttccatcttc cagtctggct cggctttgga gcagcattta agtatgccat cgaaaaggat 2400

atcaagaacc tccgcatgct gcaggaaatg tacaatgcat ggccattctt tagggtaact 2460

attgatttgg ttgagatggt gttcgccaaa ggagacccag gcattgctgc attgttcgac 2520

aagcttctgg tatctgaaga tttgttgtct ttcggtgaac ttttgaggtc aaactatgag 2580

gagacaaaga gcctcctcct gcagattgct ggacacaagg atcttctgga gggtgatacg 2640

tacttaaaac aacgactcag gctgcgtgac tcctacatca caacattgaa cgtgtgtcaa 2700

gcctacaccc taaagcgtat tcgtgaccca gactacagtg tcacaccaag gcctcacatt 2760

tccaaggaat acatggaagc aaaaccagct acagaacttg tgaacctgaa cccgactagc 2820

gaatatgcac ctggcttgga ggacacactc atcttgacca tgaaaggtat tgctgctgga 2880

cagaatactg gttaa 2895

<210>3

<211>2911

<212>DNA

<213>番茄micro-tom(Solanum lycopersicum L.)

<400>3

gactgttgag tgagaaatga ctactaggaa tttggacaaa cttgcatcga ttgatgcaca 60

gttgaggcaa ctggtgcctg ctaaagtttc tgaagatgat aaacttgttg agtatgatgc 120

tttgcttttg gataggtttc ttgatattct tcaagatttg catggagagg atctcaaagg 180

aacagtccaa gattgttatg agctttctgc cgagtatgaa gccaagcatg atccgaagaa 240

gctggaggaa cttggcaatg tgttgacaag tttggtacca ggggattcaa ttgttattgc 300

taaagctttc tctcacatgc ttaacttggc caatttggct gaggaggttc agattgccta 360

ccgtaggcgc caaaaattga agaaaaaggg agattttggg gatgagagta atgcaacaac 420

tgagtcagat attgaagaaa ctttcaagaa actggtgggg gacttaaaga agtcccctca 480

agaagttttt gatgctatca agaatcagac tgtggatttg gtcctaacag ctcatcctac 540

tcaatctgta cgaagatcat tgcttcaaaa gcatggaagg atccgtgact gcttggctca 600

gttgtatgct aaagacatta cacccgatga taaacaagaa cttgacgaag ctttacagag 660

ggagatccaa gctgcgttcc gaactgatga gatccgaaga actcctccta ctccacaaga 720

tgaaatgaga gctggaatga gctatttcca tgaaacaatt tggaagggtg tgccaaagtt 780

tctgcgtcgt gttgatacag ctcttaaaaa catagggatt gatgaacgag ttccttataa 840

tgctcctctt attcaattct cctcttggat gggcggtgat cgtgatggta atccaagagt 900

gactcccgag gtcacaagag atgtttgctt attggcaaga atgatggcag ctaacttgta 960

ctattcgcaa atagaggacc tcatgtttga gttatctatg tggcgctgca gtgaagagct 1020

tcgtgtgcga gcagataaac tccaaaggtc ttcaaggaga gatgaaaaac actacataga 1080

attttggaag caagttcctc caaatgaacc ctatcgtgta attcttggtg atgtgagaga 1140

taagttgtat cagacacgcg agcgtgctcg ccaactgtta ggccatggat actctgaaat 1200

tccagaggaa gcaacttata ctaatattga gcagttcttg gagcctcttg agctctgcta 1260

cagatctctt tgtgcttgtg gtgatctctc catagcggat ggtagccttc tggatttcct 1320

tagacaagtt tctacgtttg gactttcact agtgagactt gacataagac aagagtcgga 1380

ccgccatact gatgtgcttg atgctattac gcagcatttg gaaattggtt catatcgaga 1440

atggtctgaa gaacgtagac aagagtggct tctgtctgaa cccagtggca agagaccttt 1500

atttggacgg gatcttccaa aaactgaaga aattgctgat gttttggata cgttccatgt 1560

catagccgaa ctcccagcag actgctttgg ggcatacatc atctcaatgg ccactgcacc 1620

atctgatgtg cttgcagttg agcttctaca gcgtgaatgc cgagttaggc aacctttacg 1680

agttgttcca ctttttgaga agttggccga tctggatgct gctcctgcag ccgttgcacg 1740

tcttttctca attgagtggt acagaaaccg gattaatggc aagcaagaag tgatgattgg 1800

atactccgac tctggcaagg atgcaggtcg gctctcagca gcctggcagt tatataaggc 1860

tcaagaggag cttatacaag tcgccaagga gttcgacgtg aagctaacca tgttccatgg 1920

tagaggtggt acagtgggaa gaggaggtgg ccccgcccat cttgccatat tgtctcaacc 1980

acccgaaaca attcacggat ctctccgtgt tacagttcag ggtgaggtta ttgagcactc 2040

ttttggggaa gaacacttgt gttttaggac actccaacgt tatactgctg ctacacttga 2100

acatgggatg catccaccag tctctccaaa accagaacgg cgtgcactta tggacgaaat 2160

tgcagttgtt gctacagaaa agtatcgatc aatagttttt aaggaacccc gatttgtcga 2220

gtatttccgc ctggccacac ctgagttaga gtatggtcga atgaacattg gcagccgtcc 2280

atcaaagcgt aaacccagcg gaggcataga atcacttaga gctattcctt ggatctttgc 2340

ttggactcaa actagattcc atcttccagt ctggctcggc tttggagcag catttaagta 2400

tgccatcgaa aaggatatca agaacctccg catgctgcag gaaatgtaca atgcatggcc 2460

attctttagg gtaactattg atttggttga gatggtgttc gccaaaggag acccaggcat 2520

tgctgcattg ttcgacaagc ttctggtatc tgaagatttg ttgtctttcg gtgaactttt 2580

gaggtcaaac tatgaggaga caaagagcct cctcctgcag attgctggac acaaggatct 2640

tctggagggt gatacgtact taaaacaacg actcaggctg cgtgactcct acatcacaac 2700

attgaacgtg tgtcaagcct acaccctaaa gcgtattcgt gacccagact acagtgtcac 2760

accaaggcct cacatttcca aggaatacat ggaagcaaaa ccagctacag aacttgtgaa 2820

cctgaacccg actagcgaat atgcacctgg cttggaggac acactcatct tgaccatgaa 2880

aggtattgct gctggacaga atactggtta a 2911

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所示的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表中序列3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将序列表的序列3自5’末端第5-2911位核苷酸所示的DNA分子插入pBI121的Xba I和BamH I酶切位点之间得到的重组质粒。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到如下(I)和/或(II)和/或(III)的转基因植物：

(III)光合效率高于所述目的植物的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5或6所述重组表达载体导入所述目的植物中。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为番茄。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述光合效率体现为净光合速率。

11.权利要求2或3所述基因在改良番茄种质或番茄育种中的应用。