CN108624578B - 花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因AhPEPC5片段在提高微生物对渗透和盐胁迫中的应用。本发明通过首次构建含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶重要功能结构域的AhPEPC5基因片段的原核表达载体，转化大肠杆菌进行重组表达，结果表明，AhPEPC5蛋白片段在大肠杆菌中有明显的表达，且表达了AhPEPC5蛋白片段的原核生物大肠杆菌对高渗胁迫和盐胁迫的具有更强的耐受性，说明花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因AhPEPC5片段在通过基因转化促进微生物抵抗高渗和盐胁迫方面以及微生物工业方面具有广泛的应用前景。

Description

花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐 受能力中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的应用。

背景技术

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC4.1.1.31）是一种重要的变构调节酶，在Mg²⁺（或Mn²⁺）和HCO₃ ^﹣的存在下，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）的β-C羧基化，生成草酰乙酸（Oxaloacetate，OAA）和无机磷酸（inorganic phosphate，Pi）（Svensson P et al., Arch Biolchem Biophys,2003, 414:180-188; O'Leary B et al., Biochem J, 2011, 436:15-34）。PEPC广泛存在于维管植物，藻类，蓝藻，光合细菌和原生动物中，与光合作用和碳同化等代谢途径密切相关，同时研究发现PEPC参与了植物对胁迫的响应过程。但在动物和真菌中尚未发现PEPC的存在（Izui K et al., Annu Rev Plant Biol, 2004, 55:69-84）。

花生（Arachis hypogaea L.）是广泛栽培的的重要油料作物，全球种植面积约5900万亩。花生种子不仅含丰富的脂肪酸（占种子的50 %），而且能为人体提供氨基酸以及维他命和矿物质等，营养价值甚高。花生种子是食用油和食用植物蛋白的重要来源可以直接加工成农副产品产生经济效益。花生的产地包括气候炎热的热带和亚热带地区，其中不少品种对高温和干旱等环境胁迫具有非常好的适应性。目前发现花生PEPC家族有5个基因，可分为AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3和AhPEPC4基因编码植物型PEPC及AhPEPC5基因编码细菌型PEPC。

目前，关于花生PEPC基因尤其是AhPEPC5基因在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的研究目前还未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的应用。

本发明在花生品种汕油523（Arachis hypogaea L. Shanyou 523）中克隆得到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AhPEPC5基因序列片段，该基因完整序列在GenBank中的登录号为FJ222828。所述AhPEPC5基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列长度为549 bp，编码183个氨基酸残基的蛋白片段，所述蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述AhPEPC5蛋白片段氨基酸序列中包含与PEPC酶催化活性密切相关的草酰乙酸结合位点功能结构域。

同时，本发明还请求保护用于扩增AhPEPC5基因片段的引物对，包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO:3～4所示。

正向引物：SEQ ID NO：3：

5’- GGAATTCATGGTGGACATGGCTGAGAT-3’

反向引物：SEQ ID NO：4：

5’- CCCAAGCTTCAAGGCATTGCTAACTC-3’

本发明首次通过克隆花生中包含重要功能结构域编码区的AhPEPC5基因片段，在大肠杆菌中进行原核表达，发现AhPEPC5蛋白片段在大肠杆菌（Escherichia coli）中有明显的表达。对表达这个蛋白片段的大肠杆菌菌株进行PEG6000及NaCl处理，结果表明，表达AhPEPC5蛋白片段提高了宿主大肠杆菌对20 %的PEG6000和200 mM NaCl胁迫的耐受性。

因此，SEQ ID NO：1所示AhPEPC5基因基因片段和SEQ ID NO：2所示AhPEPC5蛋白片段的下列应用均在本发明保护范围内。

SEQ ID NO：1所示的花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫和/或盐胁迫耐受能力中的应用。

SEQ ID NO：2所示的花生AhPEPC5蛋白片段在提高微生物对渗透胁迫和/或盐胁迫耐受能力中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从花生中分离到AhPEPC5基因片段，通过转化大肠杆菌首次证明AhPEPC5蛋白片段经诱导可在宿主菌中大量表达。通过转化原核生物大肠杆菌表，证明表达AhPEPC5蛋白片段可提高微生物对PEG6000造成的渗透胁迫，以及对盐胁迫的的耐受能力。同时表明AhPEPC5基因是功能较为广泛的基因之一，可通过参与细胞内物质的代谢并参与渗透调节和离子平衡，以减少细胞所受到的逆境胁迫伤害，将其应用于微生物工业，具有重要的经济效益和应用前景。

附图说明

图1为花生AhPEPC5基因片段的扩增图。M：DL10000 marker；1：AhPEPC5 基因片段。

图2为大肠杆菌表达载体pET28a-AhPEPC5构建示意图。

图3为转化大肠杆菌DH5α中AhPEPC5基因片段的PCR检测。M：DL2000 marker；1～4为转化菌株。

图4为转化大肠杆菌Rossetta（DE3）中AhPEPC5 基因片段的PCR检测。M：DL2000marker；1～4为转化菌株。

图5为AhPEPC5蛋白片段在重组大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达的SDS-PAGE检测。图中所示为IPTG诱导不同时间的蛋白表达情况。

图6为AhPEPC5蛋白片段在重组大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达的Western-blot检测，+ 号和 ̶ 号分别表示添加和未添加IPTG诱导。

图7为转化AhPEPC5基因片段大肠杆菌Rosetta（DE3）生长曲线。其中A为正常培养；B为IPTG诱导；C为PEG6000处理；D为盐胁迫处理。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 花生种子cDNA的合成与AhPEPC5基因片段的克隆

1、花生成熟种子总RNA的提取及反转录

总RNA的提取方法参照天根生化科技（北京）有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）使用说明书；反转录方法参照TAKARA公司的PrimeScript™1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒使用说明书。

2、花生AhPEPC5基因片段的克隆

根据NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已经公布花生的AhPEPC5基的cDNA序列（GenBank登录号FJ222828）为设计引物，并且在5’端增加酶切位点保护碱基、EcoRI（GGAATTC）和起始密码子ATG，3’端增加酶切位点Hind III（CCCAAGCTT）和保护碱基。用反转录得到的第一链cDNA作为模板进行PCR扩增，获得AhPEPC5基因的编码片段。

（1）AhPEPC5基因克隆所用引物（下划线部分为酶切位点）：

正向引物：SEQ ID NO：3：

5’- GGAATTCATGGTGGACATGGCTGAGAT-3’

反向引物：SEQ ID NO：4：

5’- CCCAAGCTTCAAGGCATTGCTAACTC-3’

（2）PCR体系及反应程序

以合成的cDNA为模板，以TOYOBO公司的KOD-Plus扩增AhPEPC5片段，具体的PCR体系：1 μL cDNA文库模板，1 μL正向引物（10 μM），1 μL反向引物（10 μM），2 μL MgSO₄（25mM），5 μL dNTP（2 mM），5 μL 10×Buffer for KOD-Plus，1 mL KOD-Plus酶（TaKaRa公司产品），最后补充去离子水，使总体积为33 mL。Touchdown PCR程序：94 ℃ 2分钟；然后进入如下循环：94 ℃ 15秒，44 ℃ 30秒 6个循环，48 ℃ 30秒 4个循环，52 ℃ 30秒 4个循环，58℃ 30秒20个循环，60 ℃ 3秒10个循环，68 ℃1分钟，共44个循环；最后68 ℃延伸10分钟。扩增得到符合预期大小的目的片段，结果如图1所示；

（3）反应结束后，利用天根生化科技（北京）有限公司的DNA纯化产物试剂盒对PCR产物进行割胶回收，具体步骤参照胶回收试剂盒说明书。纯化产物于-20 ℃保存。

3、测序载体的构建

因KOD-Plus酶扩增产物DNA为平端，与测序载体连接前需先进行PCR产物末端加A反应。将PCR产物回收，在PCR管中配制以下反应体系：24 μL 回收产物，3 μL 10×PCRBuffer，1.8 μL dATP（2 mM），1.2 μL Taq DNA polymerase。反应体系混合后72 ℃保温30分钟，反应结束后进行琼脂糖电泳并割胶回收，取5.3 μL回收产物，与0.7 μL pMD20-T载体（TaKaRa公司产品）连接，按产品说明书操作；

4、大肠杆菌转化

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司，转化后的细胞在含氨苄青素（100 mg/L）的LB培养基上涂板，倒置于37 ℃过夜培养，挑取单菌落在含氨苄青素（100 mg/L）的LB液体培养基中培养，取少量菌液进行PCR鉴定，结果如图2所示；

5、细菌质粒DNA的制备

选取PCR检测阳性的菌落与上述LB液体培养基中培养，收集菌体，采用天根生化科技（北京）有限公司的质粒小提试剂盒制备细菌质粒DNA。测序由上海英潍捷基（Invitrogen）公司完成。

实施例2 原核表达载体的构建与大肠杆菌转化

（1）将DH5α：pET-28a菌种接种于10 mL LB液体培养基中，37 ℃，180 rpm摇菌过夜，利用天根生化科技（北京）有限公司的快速质粒小提试剂盒提取质粒保存于-20 ℃以备下一步的双酶切反应。

（2）用TaKaRa公司的限制性内切酶EcoR I，Hind III，酶切通过实施例1获得的测序正确的含有AhPEPC5基因片段的质粒，酶切体系：3 μL 1×M buffer，1μL EcoRI 1 μLHind III，20 μL质粒，补充去离子水5 μL使总体积达到30 μL。

（3）用EcoR I，Hind III酶切pET-28a质粒，酶切体系：3 μL 1×M buffer，1 μLEcoR I 1 μL Hind III，20 μL质粒，补充去离子水5 μL使总体积达到30 μL。

（4）将双酶切后的质粒DNA和AhPEPC5基因片段进行凝胶电泳，使用天根生化科技（北京）有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，具体步骤参见说明书；将回收后的质粒DNA与PCR产物连接（16 ℃连接过夜），构建原核表达载体pET28a-AhPEPC5。连接反应体系为：7 μL 目的基因片段，1 μL pET-28a双酶切片段，1 μL 10×T4 DNA Lingase Buffer，1μL T4 DNA连接酶。

（5）过夜连接的产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的大肠杆菌恢复培养后涂布于含有卡那霉素（50 mg/L）的LB固体平板上，37 ℃过夜培养。

（6）挑取数个白色单菌落于含有卡那霉素（50 mg/L）的LB液体培养基中，37 ℃，200 rpm振荡培养；

（7）菌落PCR扩增体系：7.5 μL 2×Taq Master Mix（Dye plus），1 μL Primer-F（10 μM）， 1 μL Primer-R（10 μM），1 μL菌液，最后补充去离子水，使总体积为15 mL。菌落PCR程序：94 ℃ 3 分钟；然后进入如下循环：94 ℃ 30 秒，58 ℃ 30 秒，72 ℃ 1 分钟，共30个循环；最后72 ℃延伸10 分钟。阳性菌株的菌液提取质粒进行测序。

（8）挑取含测序正确的质粒DNA的白色单菌落小摇过夜，用天根生化科技（北京）有限公司的快速质粒小提试剂盒进行质粒提取并测序。取测序正确的质粒，通过热激法转化大肠杆菌表达菌株Rossetta（DE3），菌液涂布于含卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）的LB固体培养基，37 ℃过夜培养。

（9）挑取菌落进行PCR鉴定（图3），阳性菌株于含卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34mg/L）的5 mL LB液体培养基中，37℃，220 rpm振荡培养过夜，添加甘油浓度为25 %混匀，菌种保存于-80℃。

实施例3 AhPEPC5蛋白片段的原核表达检测

1、融合蛋白的诱导表达

（1）取转化有正确构建的原核表达质粒的大肠杆菌Rossetta（DE3）重组菌株划线于含卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）的LB固体培养板上，取空载质粒pET28a转化的原核表达菌株做为对照参考，37 ℃过夜培养。

（2）菌落PCR鉴定阳性菌落，挑取阳性菌株于5 mL含卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）LB中37 ℃、200 rpm过夜培养，次日以1:100的比例接种于20 mL含卡那霉素（50mg/L） LB液体培养基中，37 ℃、200 rpm培养2.5 小时后，加入0.4 mM IPTG诱导表达6 小时，每隔2 小时取1 mL菌液用于后续的蛋白实验。

2、菌体总蛋白的提取

（1）将上述诱导表达的菌液于14000 rpm离心1分钟收集菌体细胞，倒去上清液，加入45 μL PBS缓冲液洗一次后，再次加入45 μL PBS缓冲液，加入5×蛋白Loading buffer 5μL，混匀后煮沸10 分钟，14000 rpm离心5 分钟，取5 μL在SDS-PAGE蛋白胶上进行电泳。

（2）SDS-PAGE电泳与Western blot参照Serrano-Maldonado（Serrano- Maldonadoet al., J Mol Microbiol Biotechnol, 2018, 28:14-27）等的方法。 Western blot中所用到的一抗为鼠抗组氨酸单克隆抗体（mouse anti-His monoclonal antibody），购自武汉三鹰生物技术有限公司；二抗为艾博抗(上海)贸易有限公司的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG （Goat pAb to Ms IgG (AP)）。NBT/BCIP (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) 作为显影剂用以显示目标条带。

SDS-PAGE结果显示，作为对照的pET28a空载体转化菌株在加入IPTG诱导前后均没有目的蛋白片段的表达；IPTG诱导前pET28a-AhPEPC5载体转化的重组菌中没有目的蛋白表达，诱导后目的蛋白大量表达，至第4小时诱导量达到最大，诱导蛋白质条带位于约26 KDa处，AhPEPC5蛋白片段加上与组氨酸标签重组的融合蛋白理论分子量为25.63 KDa，与电泳检测结果相符合（图5）。由于重组表达载体保留了组氨酸标签，因此可以通过Western-Blot检测组氨酸标签的方法来推测表达的蛋白是否为目的蛋白。Western blot结果显示在26KDa处检测到信号极强的蛋白信号，说明花生AhPEPC5蛋白片段在大肠杆菌中表达成功（图6）。

实施例4 原核表达菌株生长曲线的测量

1、非诱导生长曲线的测量

（1）取-80 ℃保存的大肠杆菌Rossetta（DE3）对照菌株和AhPEPC5转化菌株的菌种，在含有卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）的LB培养基平板上划线，37 ℃倒置过夜培养。

（2）分别挑取空载菌和重组菌株各3个单菌落，于5 mL含有卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）的LB培养基中37 ℃，180 rpm过夜培养。

（3）小摇菌液稀释至OD600达到0.8，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37 ℃，180 rpm扩大培养。

（4）当OD600达到0.8时，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的LB液体培养基中继续培养，每隔2小时测一次OD600。

2、诱导生长曲线的测量

（1）取-80 ℃保存的菌种划线，37 ℃倒置过夜培养。

（2）分别挑取空载菌和重组菌株各3个单菌落，于5 mL含有卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）的LB培养基中37 ℃，180 rpm过夜培养。

（3）小摇菌液稀释至OD600达到0.8，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，添加IPTG至终浓度为0.1 mM，37 ℃，180 rpm扩大培养。

（4）当OD600达到0.8时，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的LB液体培养基中继续培养，每隔2小时测一次OD600。

为了探究诱导前后重组菌株的生长情况的差异，分别重复测量了3个AhPEPC5转化菌株及空载体转化对照菌株在诱导及正常条件下的生长曲线。转化菌株均为Western-Blot验证的AhPEPC5蛋白片段表达菌株。图7A为在LB培养基中正常培养的生长曲线，转化菌株与对照菌株生长情况基本一致。图7B为添加蛋白表达诱导剂IPTG后的生长曲线，AhPEPC5蛋白片段表达菌株与空载体转化菌株相比，生长受到一定程度的抑制。

实施例5 原核表达菌株PEG6000处理实验

（1）配制含20 % PEG6000的液体LB培养基，另配一瓶不加PEG6000的LB作为对照，加入卡那霉素（50 mg/L）和氯霉素（34 mg/L）。

（2）分别挑取大肠杆菌Rossetta（DE3）对照菌株和AhPEPC5转化菌株各3个单菌落，接种于5 mL对照LB培养基和含有20 % PEG6000 的LB培养基（卡那霉素50 mg/L，氯霉素34mg/L）中，37 ℃，180 rpm过夜培养。

（3）小摇菌液稀释至OD600达到0.8，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，添加IPTG至终浓度为0.1 mM，37 ℃，180 rpm扩大培养。

（4）当OD600达到0.8时，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的添加或不添加20% PEG6000的LB液体培养基中，37 ℃，180 rpm振荡培养，每隔2 小时测量一次OD600值测量生长曲线。

生长曲线的测定结果表明（图7C），对于表达AhPEPC5基因片段的转化菌株来说，在20% PEG6000处理条件下，特别是在培养时间达到10 小时和12 小时，重组菌株的生长状况显著优于只转化空载体的对照菌株。

实施例6 原核表达菌株盐胁迫处理实验

（1）配制添加200 mM NaCl的LB液体培养基，另配一瓶正常的LB作为对照，加入相应抗生素。

（2）分别挑取大肠杆菌Rossetta（DE3）对照菌株和AhPEPC5转化菌株各3个单菌落，接种于5 mL对照LB培养基和添加200 mM NaCl的LB培养基（卡那霉素50 mg/L，氯霉素34mg/L）中，37 ℃，180 rpm过夜培养。

（3）小摇菌液稀释至OD600达到0.8，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，添加IPTG至终浓度为0.1 mM，37 ℃，180 rpm扩大培养。

（4）当OD600达到0.8时，以1：100的比例接种于20 mL含相应抗生素的添加或不添加200 mM NaCl的LB液体培养基中，37 ℃，180 rpm振荡培养，每隔2 小时测量一次OD600值测量生长曲线。

生长曲线测定的结果表明（图7D），在添加了200 mM NaCl的LB培养基中，转化空载体的对照菌株和转化了AhPEPC5基因片段的菌株生长均受到抑制，但与对照菌株相比，表达了AhPEPC5蛋白片段的转化菌株对盐胁迫的耐受能力更高。

序列表

<110> 中山大学

<120> 花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的应用

<130> YG18104866AA042

<141> 2018-06-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 花生(Arachis hypogaea L.)

<400> 1

gtggacatgg ctgagatgct tgagaagcag ttggcttccg agctatcaaa gatgacactc 60

gaagaagctc ttaccctagc tcgcgccttc agccactatc ttactctcat gggaatagct 120

gaaactcatc atagggttcg gaaaagaggg aataatatag cacaaactgc aaaatcatgt 180

gatgatatct ttaaccagct tgtgcagggt ggagtttccc ctgatgaact ttatgacaca 240

gtctgcaagc aggaggttga aattgttctt acagctcatc ctactcaaat taatcgccgt 300

accttacaat acaaacacat tagaattgct catcttttgg attataatga tcgacctgat 360

cttaccattg aagatcgaga aatggtgatt gaggacctgg tgagagagat aacttcaata 420

tggcagaccg atgagcttag gcgtcagaaa cccactccag ttgatgaagc tagagctggt 480

ttgaatattg tggagcagtc actctggaaa gctgttcctc attatttaca tcgagttagc 540

aatgccttg 549

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 花生(Arachis hypogaea L.)

<400> 2

Val Asp Met Ala Glu Met Leu Glu Lys Gln Leu Ala Ser Glu Leu Ser

1 5 10 15

Lys Met Thr Leu Glu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Arg Ala Phe Ser His

20 25 30

Tyr Leu Thr Leu Met Gly Ile Ala Glu Thr His His Arg Val Arg Lys

35 40 45

Arg Gly Asn Asn Ile Ala Gln Thr Ala Lys Ser Cys Asp Asp Ile Phe

50 55 60

Asn Gln Leu Val Gln Gly Gly Val Ser Pro Asp Glu Leu Tyr Asp Thr

65 70 75 80

Val Cys Lys Gln Glu Val Glu Ile Val Leu Thr Ala His Pro Thr Gln

85 90 95

Ile Asn Arg Arg Thr Leu Gln Tyr Lys His Ile Arg Ile Ala His Leu

100 105 110

Leu Asp Tyr Asn Asp Arg Pro Asp Leu Thr Ile Glu Asp Arg Glu Met

115 120 125

Val Ile Glu Asp Leu Val Arg Glu Ile Thr Ser Ile Trp Gln Thr Asp

130 135 140

Glu Leu Arg Arg Gln Lys Pro Thr Pro Val Asp Glu Ala Arg Ala Gly

145 150 155 160

Leu Asn Ile Val Glu Gln Ser Leu Trp Lys Ala Val Pro His Tyr Leu

165 170 175

His Arg Val Ser Asn Ala Leu

180

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 花生(Arachis hypogaea L.)

<400> 3

ggaattcatg gtggacatgg ctgagat 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 花生(Arachis hypogaea L.)

<400> 4

cccaagcttc aaggcattgc taactc 26

Claims (6)

1.SEQ ID NO：1所示花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因AhPEPC5片段在提高微生物对渗透胁迫耐受能力中的应用，所述微生物为大肠杆菌（Escherichia coli）。

2.SEQ ID NO：1所示花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因AhPEPC5片段在提高微生物对盐胁迫耐受能力中的应用，所述微生物为大肠杆菌。

3.SEQ ID NO：2所示花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AhPEPC5功能片段在提高微生物对渗透胁迫耐受能力中的应用，所述微生物为大肠杆菌。

4.SEQ ID NO：2所示花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶AhPEPC5功能片段在提高微生物对盐胁迫耐受能力中的应用，所述微生物为大肠杆菌。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为构建花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因AhPEPC5片段的原核表达载体，转化到微生物中。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述原核表达载体为pET28a-AhPEPC5。

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