CN113846085B

CN113846085B - 一种具有双酶活性的蛋白质及其用途

Info

Publication number: CN113846085B
Application number: CN202111260564.5A
Authority: CN
Inventors: 孙立方; 柯甫志; 聂振朋; 徐建国; 黄秀; 孙建华; 王平
Original assignee: Zhejiang Citrus Research Institute
Current assignee: Zhejiang Citrus Research Institute
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN113846085A

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种具有双酶活性的蛋白质及其用途。本发明要解决的技术问题是提供一种乙烯合成路径的酶。本发明的技术方案是一种具有双酶活性的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。其中，所述的双酶活性为ACS和C‑S裂解酶活性。本发明公开的蛋白质可用于合成乙烯，裂解具有C‑S键的化合物。

Description

一种具有双酶活性的蛋白质及其用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种具有双酶活性的蛋白质及其用途。

背景技术

柑橘作为目前南方种植面价最广且具有重要经济价值的水果(邓秀新等,2013)，被归类为非呼吸跃变型果实。虽然一些前期研究已证实乙烯也参与其果实的成熟调控(Wong et al., 1999；Katz et al.,2004；丁毓端,2015；Li et al.,2019)，但ACS基因的鉴定及功能研究相对较少。乙烯参与植物生长发育的许多过程，而乙烯如何参与调控柑橘的生长发育和果实成熟过程尚不完全清楚。因此，鉴定柑橘中乙烯合成路径的关键基因，对以后调控其内源乙烯合成具有重要意义。

我国是一个以农业为基础的国家，但是随着人口的逐年增长、耕地面积的不断减少和农业可利用资源的日趋紧张，粮食供给面临着巨大挑战。提高和稳定粮食产量已成为我国当前国家重大战略发展的需求(周建军等，2014)。植物基因工程技术是利用重组DNA技术，有计划地在体外对生物基因进行改造和重新组合，然后再插入、整合到事先准备好的受体植物基因组中，使重组基因在受体细胞中表达，从而使受体植物获得新的性状，培育出高产、多抗和优质的新品种(候文邦等，2005)。植物基因工程技术可以为创造新种质资源和培育植物新品种提供了新的路径。与常规育种相比，基因工程育种能高效地对植物进行定向改良，缩短育种周期，逐渐成为柑橘定向育种和研究工作的重要手段。近10余年来，以转基因技术为主的基因工程育种在柑橘抗病育种、抗非生物逆境胁迫以及改良柑橘果实性状等方面的研究已成功取得了一系列进展(姚利晓等，2013；Sun等，2019)。

ACS(1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶1-aminocyclopropane-1-carboxylatesynthase)、C-S(碳- 硫)裂解酶和氨基转移酶同属于依赖PLP的AAT-like蛋白超家族，这些亚族所有成员都由共同的祖先进化而来。所以，这些成员间序列存在较高的相似度，活性位点和催化产物也很类似，这样就很难直接从序列和二级结构区分这些成员。比如植物中的一些C-S裂解酶由于序列和结构上的相似性最初被认为是氨基转移酶(Seo等，1998；Jones等，2003)；蒲公英属的一个C-S裂解酶被发现具有C-S裂解酶和氨基转移酶两种酶活性(Munt等，2013)；还有一些氨基转移酶也具有C-S裂解酶活性，如海豹心脏中的氨基转移酶AlaAT、AspAT和人类脑中的氨基转移酶GTK(谷氨酰胺氨基转移酶K)分别具有胱氨酸和半胱氨酸的衍生物为底物的C-S裂解酶的功能(Adcock等，1996；Cooper等，2004)。由此可见，这些成员相互之间应该存在着密切的进化关系。除了序列和结构上与氨基转移酶相近，有人还发现苹果ACS 的纯化蛋白表现出较低的氨基转移酶活性(Feng等，2000)。最近又有研究通过对107个植物ACS基因、动物的8个ACS-like基因和6个天冬氨酸氨基转移酶的系统进化、基序的鉴定和适应性选择进化分析发现，植物中的ACS基因可能起源于由天门冬氨酸氨基转移酶基因 AATase进化而来的plant-ACS-like基因(Zhang等，2012)。可以看出ACS基因家族的起源进化关系尚不完全明确，而具有ACS和C-S裂解酶双酶活性的ACS更是未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种乙烯合成路径的酶。

本发明的技术方案是一种具有双酶活性的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，所述的双酶活性为ACS和C-S裂解酶活性。

进一步的，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述蛋白质在催化SAM(腺苷蛋氨酸合酶)生成乙烯中的用途。

本发明还提供了所述蛋白质在催化L-胱氨酸(L-cystine)裂解生成丙酮酸中的用途。

本发明还提供了所述蛋白质的制备方法，包括如下步骤：

a)载体构建：构建所述蛋白质的编码基因CsACS5的原核表达载体；

b)转化：将构建好的载体转化大肠杆菌，并诱导表达；

c)蛋白纯化：纯化诱导表达的蛋白。

具体的，步骤a)中，所述原核表达载体中，构建N端带有His标签的CsACS5原核表达载体。

其中，步骤b)中，所述大肠杆菌为Rosetta(DE3)pLysS。

进一步的，步骤c)中，采用亲和层析柱来纯化诱导表达的蛋白。

本发明的积极效果：

本发明从柑橘中克隆了一个编码基因CsACS5，其编码蛋白具有ACS和C-S裂解酶双酶活性。对研究植物(柑橘)乙烯合成调控及其合成路径的起源进化具有重要应用价值；为调控植物乙烯合成提供了研究基础。本发明公开的蛋白质可用于合成乙烯，裂解具有C-S键的化合物。

附图说明

图1、CsACS5基因的克隆和PCR鉴定。A.CsACS5基因片段的克隆，泳道M：Marker，泳道1和2：包含CsACS5基因片段的PCR克隆产物；B.泳道M：Marker，泳道1-4：包含 His-CsACS5融合载体的PCR阳性克隆；C.泳道M：Marker，泳道1-4：包含35S:CsACS5 融合载体的拟南芥PCR阳性转基因株系。

图2、CsACS5表达蛋白的C-S裂解酶和ACS活性检测。可以看出，CsACS5蛋白同时具有C-S裂解酶和ACS双酶活性。A.CsACS5具有催化胱氨酸(L-cystine)生成丙酮酸的C-S裂解酶活性，图中显示的为2，4-二硝基苯肼与反应生成的丙酮酸发生的显色反应，以 C-S裂解酶PpACL1作为正对照；B.CsACS5的ACS活性检测分析，其中以ACS蛋白AtACS7 作为正对照。C.CsACS5以胱氨酸(L-cystine)为底物的C-S裂解酶酶活分析结果；D.CsACS5 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售。材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

实施例1原核表达载体的构建

所述应用中的融合基因“His-CsACS5”的构建方法，包括如下步骤：

1 CsACS5基因的克隆

以甜橙黄化苗为材料提取的RNA反转录的cDNA为模板，利用PCR方法扩增CsACS5基因，并引入EcoR I和Hind III酶切位点，上游引物： 5′-caaatgggtcgcggatccgaattcatggctatagagattgagc-3′(SEQ ID No.3)，下游引物： 5′-tggtgctcgagtgcggccgcttaatttctgcgtctctctc-3′(SEQ ID No.4)。PCR反应体系：2×KOD-FX Buffer 25μL，2mM dNTPs 10μL，模板2μL，正向引物(10μM)1.5μL，反向引物(10μM)1.5μL， KOD-FX DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 9μL，共计50μL。PCR反应程序：95℃5min；95℃ 20s，60℃10s，72℃30s，40循环；72℃7min。高保真酶为:KOD-FX,Toyobo。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，再扩增3个50μL体系的PCR，进行PCR产物回收。将产物进行测序，序列如下：

SEQ ID No.1CsACS5核苷酸序列

1 atggctatag agattgagca accatctgta tctgttggtc tttcaaaagt tgctgtttct

61 gaaacccatg gtgaagactc tccatatttt gctggctgga aagcatatga tgaaaaccct

121 tatgaggaat caactaaccc atcgggagtc attcaaatgg gattagcaga gaatcaagtt

181 tcatttgatt tgcttgaaga gtacttggaa cagcaaccag aagcctcaac ttggggcaaa

241 ggggctccag gcttcagaga aaatgctttg tttcaagatt accatggact caaatcgttc

301 agacaggcaa tggcaagctt catggaacaa ataagaggag gaagagctaa atttgatctt

361 aatagaattg tcgtaacggc aggcgccact gcagccaatg agcttttaac cttcattctt

421 gcggatcctg gtgatgcttt gttggtccct actccatact acccaggatt tgacagagat

481 ttaagatgga gaactggaat caaaattgtt ccaatccatt gcgacagctc aaacaatttc

541 caaattaccc ctcaagcatt ggaagctgca tacaaagaag cagaatccaa ggacatgaga

601 gtcagaggag tcctgataac caacccttca aacccgttag gcgcaacaat ccaacggtca

661 gttctagaag agcttctaga tttcgctaca cgcaaaaaca tccatttagt ctctgatgaa

721 atctactccg gctcagcttt ctcatcgtcc gaattcgtta gcattgctga aatcctagag

781 gcccgtcagt ataaagattc tgaaagagtt cacatagttt acagtctctc taaagatctt

841 ggtctcccag gatttagagt tgggactatt tactcgtata acgacaaagt tgttaccact

901 gccaggagaa tgtccagctt cactctcatt tcttcccaaa cacaatatct cttagcttcc

961 atgttgtcaa ataagaaatt tactgagaat tacatcaaga caaatagaga gaggcttcag

1021 aaaagatatc agatgatcat tgaaggcttg agaagcgccg ggatcgagtgtttgaaaggg

1081 aatgccgggc tgttttgctg gatgaatcta agcccgttgt tggaggaacaaacgagagaa

1141 ggagaattgg ctctttggga ttctatgttg catgaagtga agcttaacatttcacccggt

1201 tcatcttgcc attgttctga acccggttgg ttcagggtgt gttttgctaacatgagtgag

1261 caaacactag aagttgcatt gaaaagaata cataatttca tgcaaaaaagagagagacgc

1321 agaaattaa

SEQ ID No.2CsACS5编码蛋白的序列，442Aa，MW＝49782；

MAIEIEQPSVSVGLSKVAVSETHGEDSPYFAGWKAYDENPYEESTNPSGVIQMGLAENQVSFDLLEEYLEQQPEASTWGK GAPGFRENALFQDYHGLKSFRQAMASFMEQIRGGRAKFDLNRIVVTAGATAANELLTFILADPGDALLVPTPYYPGFDRD LRWRTGIKIVPIHCDSSNNFQITPQALEAAYKEAESKDMRVRGVLITNPSNPLGATIQRSVLEELLDFATRKNIHLVSDE IYSGSAFSSSEFVSIAEILEARQYKDSERVHIVYSLSKDLGLPGFRVGTIYSYNDKVVTTARRMSSFTLISSQTQYLLAS MLSNKKFTENYIKTNRERLQKRYQMIIEGLRSAGIECLKGNAGLFCWMNLSPLLEEQTREGELALWDSMLHEVKLNISPG SSCHCSEPGWFRVCFANMSEQTLEVALKRIHNFMQKRERRRN*

2PCR扩增产物的回收和连接

PCR产物的回收：

1)加入4倍体积(800μL)的Buffer CP到1.5mL离心管(含有PCR反应体积200μL)；

2)剧烈震荡，短暂离心；

3)把吸附柱放在收集管里；

4)把步骤3的混合物转入吸附柱(每次750μL，一次转不完，等离心后，倒掉废液，再把剩余混合物转入吸附柱离心)；

5)13000g离心1min，弃滤液；

6)加入700μL洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；

7)加入500μL洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；

8)13000g离心2min，甩吸附柱上的乙醇；

9)把吸附柱转到一个新的1.5mL离心管，在吸附柱中心加入30μL ddH₂O，室温放置1min；13000g离心2min，滤液即是回收的DNA；

10)PCR产物连接表达载体pUC57-T，获得pUC57-CsACS5载体。

载体双酶切和连接:

利用EcoR I/Hind III分别双酶切原核表达载体pET-28A和pUC57-CsACS5载体，上述同样方法回收片段，然后利用同源重组技术(无缝连接)在连接酶催化下进行连接反应，完成重组载体pET28A-CsACS5的构建。酶切体系：ddH₂O 6μL，10×FastDigest GreenBuffer 2μL， Vector10μL，FastDigestHindIII 1μL，FastDigest EcoRI 1μL，共20μL。将酶切后的CsACS5 片段和pET-28A载体回收并连接，连接体系如下：5×LIC Buffer 4μL，Target(gene)10μL，Vector 5μL，ddH₂O 1μL，共20。连接体系轻轻摇匀，短暂离心；4℃放置30min。

PCR产物回收试剂盒：D6492，Omega；

连接酶：EL0011，Thermo Fermentas；

内切酶：HindIII，EcoRI FastDigest ThermoFermentas；

无缝连接试剂盒：L0111，SinoGene Scientific。

连接产物转化大肠杆菌：

1)连接产物直接转化。

2)取出DH5α感受态细胞(TaKaRa)放于冰水混合物中解冻。

3)加入连接产物，冰上放置30min。

4)将管放于42℃水浴恰好90s，不可摇动。

5)快速将管移到冰浴上2min，室温放置5min。

6)每管加800μL没有抗生素的LB液体培养基，37℃振荡45min复苏。

7)8000rpm离心1min，将上清液去掉800μL，重悬后均匀涂布到抗性平板上。

8)平板放置于室温吹干，倒置于37℃培养箱，培养12-16h长出菌落。

9)进行菌落PCR鉴定和测序鉴定。

10)利用测序正确的阳性克隆提取质粒(AxyPrep质粒提取试剂盒)，最后转化大肠杆菌表达菌Rosetta(DE3)pLysS(TaKaRa)。

实施例2蛋白纯化和酶活检测

蛋白纯化：诱导大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中His-CsACS5蛋白的表达，然后利用HisTrapTMFF(GE Healthcare)亲和层析柱来纯化诱导表达的蛋白，具体流程参考文献(孟涛，2011)

在体外模拟的反应体系中加入纯化蛋白来检测其酶活，具体如下：

ACS活性反应体系：将10～20μg的His-CsACS5纯化蛋白加入475μL的ACS反应Buffer 中(50mM EPPS，pH 8.5，10μM PLP，2mM DTT，均购自Sigma)，同时再加入20μL的10mMSAM，反应总体积约0.5mL。将反应混合物置于16mL的试管中，30℃孵育30min(水浴振荡)。反应完成后加10μL 100mM HgCl₂终止反应，并密封试管。然后用10mL注射器往密封式管中加入10滴新鲜配置冰上保存的ACC assay solution(体积比为2︰1的饱和NaOH和次氯酸钠溶液配制)将生成的ACC转化为乙烯，拔出注射器后立即再次封口。冰上静置5min用1mL注射器后取500μL气体用气相色谱仪(Agilent 7890A)分析计算乙烯生成量。反应中以空载体pET28a转化表达的纯化蛋白作为负对照。

C-S裂解酶活性反应体系：总体积300μL的反应体系包括以试剂：0.1M磷酸钾缓冲液， pH 7.8；4mM的L-胱氨酸(L-cystine，Sigma)作为底物；10mM PLP和2mM DTT。然后分别加入50-100μg的纯化蛋白，空载体的纯化蛋白作为负对照，等体积的ddH₂O作为Control。反应混合物置于5mL的离心管中，30℃孵育30min(水浴振荡)。反应完成后将反应液取出并加入200μL的氯仿抽提蛋白(4℃，12000rpm，10min)。离心后取200μL上清并补加 200μLddH2O。混匀后再加入等体积的2，4-二硝基苯肼(0.1％(w/v)in 2M HCl，400μL)，混匀后置于常温10min。最后分别加入2mL，1.5M NaOH，然后混匀置于常温10min。先拍照，再用分光光度计测定波长在520nm处的OD值(空白对照调零)。反应中最终丙酮酸的生成量用丙酮酸的标准曲线去校正计算。每组实验均三次重复，并做差异显著性分析。

参考文献

邓秀新,彭抒昂.柑橘学.北京:中国农业出版社,2013.

丁毓端.柑橘采后衰老的转录和代谢网络研究.武汉:华中农业大学,2015.

黄培堂,王嘉玺,朱厚础.分子克隆实验指南.北京:科学出版社,2002.

侯文邦,朱文文,马占强.植物基因工程在作物育种中的应用与展望.中国农学通讯,2005,21(1):128～132.

孟涛.AtSARK和GmSARK的体外表达与活性分析.天津:南幵大学,2011.

姚利晓，何永睿，邹修平，等.柑橘基因工程育种研究策略及其进展.果树学报，2013，30(6)：1056-1064.

周建军,刘倩.我国农业生产现状问题研究.北京农业,2014,(15).

Sambrook J,Russell D W.磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞.分子克隆实验指南,北京:科学出版社, 2001.

Adcock H J,Gaskin P J,Shaw P N,Teesdale-Spittle P H,Buckberry LD.Novel Sources of Mammalian C-S Lyase Activity.Journal of Pharmacy andPharmacology,1996,48(2):150-153.

Cooper A J L.The role of glutamine transaminase K(GTK)in sulfur andα-keto acid metabolism in the brain,and in the possible bioactivation ofneurotoxicants.Neurochemistry International,2004,44(8):557-577.

Feng L,Geck M K,Eliot A C,et al.Aminotransferase activity andbioinformatic analysis of 1-aminocyclopropane-1-carboxylatesynthase.Biochemistry,2000,39(49):15242-15249.

Jones P R,Manabe T,Awazuhara M,Saito K.A new member of plant CS-lyases a cystine lyase from Arabidopsis thaliana.Journal of BiologicalChemistry,2003,278(12):10291-10296.

Katz E,Lagunes P M,Riov J,Weiss D,Goldschmidt EE.Molecular andphysiological evidence suggests the existence of a system II-like pathway ofethylene production in non-climacteric Citrus fruit.Planta,2004, 219(2):243-252.

Li S J,Xie X L,Liu S C,Chen K S,Yin X R.Auto-and mutual-regulationbetween two CitERFs contribute to ethylene-induced citrus fruitdegreening.Food Chemistry,2019,299:125-163.

Munt O,Prüfer D,Gronover C S.A novel C–S lyase from the latex-producing plant Taraxacum brevicorniculatum displays alanine aminotransferaseand l-cystine lyase activity.Journal of Plant Physiology,2013,170(1):33-40.

Seo M,Akaba S,Oritani T,Delarue M,Bellini C,Caboche M,KoshibaT.Higher Activity of an Aldehyde Oxidase in the Auxin-Overproducingsuperroot1 Mutant of Arabidopsis thaliana.Plant Physiology,1998,116(2):687-693.

Sun L,Nasrullah,Ke F,Nie Z,Wang P,Xu J.Citrus genetic engineering fordisease resistance:past,present and future.International Journal of MolecularSciences,2019,20(21):5256.

Wong W S,Ning W,Xu P L,Kung S D,Yang S F,Li N.Identification of twochilling-regulated 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase genes fromcitrus(Citrus sinensis Osbeck)fruit.Plant Molecular Biology,1999,41(5):587-600.

Zhang T C,Qiao Q,Zhong Y.Detecting adaptive evolution and functionaldivergence in aminocyclopropane-1-carboxylate synthase(ACS)genefamily.Computational Biology and Chemistry,2012,38: 10-16.

序列表

<110> 浙江省柑橘研究所

<120> 一种具有双酶活性的蛋白质及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA

<213> artificial

<400> 1

atggctatag agattgagca accatctgta tctgttggtc tttcaaaagt tgctgtttct 60

gaaacccatg gtgaagactc tccatatttt gctggctgga aagcatatga tgaaaaccct 120

tatgaggaat caactaaccc atcgggagtc attcaaatgg gattagcaga gaatcaagtt 180

tcatttgatt tgcttgaaga gtacttggaa cagcaaccag aagcctcaac ttggggcaaa 240

ggggctccag gcttcagaga aaatgctttg tttcaagatt accatggact caaatcgttc 300

agacaggcaa tggcaagctt catggaacaa ataagaggag gaagagctaa atttgatctt 360

aatagaattg tcgtaacggc aggcgccact gcagccaatg agcttttaac cttcattctt 420

gcggatcctg gtgatgcttt gttggtccct actccatact acccaggatt tgacagagat 480

ttaagatgga gaactggaat caaaattgtt ccaatccatt gcgacagctc aaacaatttc 540

caaattaccc ctcaagcatt ggaagctgca tacaaagaag cagaatccaa ggacatgaga 600

gtcagaggag tcctgataac caacccttca aacccgttag gcgcaacaat ccaacggtca 660

gttctagaag agcttctaga tttcgctaca cgcaaaaaca tccatttagt ctctgatgaa 720

atctactccg gctcagcttt ctcatcgtcc gaattcgtta gcattgctga aatcctagag 780

gcccgtcagt ataaagattc tgaaagagtt cacatagttt acagtctctc taaagatctt 840

ggtctcccag gatttagagt tgggactatt tactcgtata acgacaaagt tgttaccact 900

gccaggagaa tgtccagctt cactctcatt tcttcccaaa cacaatatct cttagcttcc 960

atgttgtcaa ataagaaatt tactgagaat tacatcaaga caaatagaga gaggcttcag 1020

aaaagatatc agatgatcat tgaaggcttg agaagcgccg ggatcgagtg tttgaaaggg 1080

aatgccgggc tgttttgctg gatgaatcta agcccgttgt tggaggaaca aacgagagaa 1140

ggagaattgg ctctttggga ttctatgttg catgaagtga agcttaacat ttcacccggt 1200

tcatcttgcc attgttctga acccggttgg ttcagggtgt gttttgctaa catgagtgag 1260

caaacactag aagttgcatt gaaaagaata cataatttca tgcaaaaaag agagagacgc 1320

agaaattaa 1329

<210> 2

<211> 442

<212> PRT

<213> artificial

<400> 2

Met Ala Ile Glu Ile Glu Gln Pro Ser Val Ser Val Gly Leu Ser Lys

1 5 10 15

Val Ala Val Ser Glu Thr His Gly Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Ala Gly

20 25 30

Trp Lys Ala Tyr Asp Glu Asn Pro Tyr Glu Glu Ser Thr Asn Pro Ser

35 40 45

Gly Val Ile Gln Met Gly Leu Ala Glu Asn Gln Val Ser Phe Asp Leu

50 55 60

Leu Glu Glu Tyr Leu Glu Gln Gln Pro Glu Ala Ser Thr Trp Gly Lys

65 70 75 80

Gly Ala Pro Gly Phe Arg Glu Asn Ala Leu Phe Gln Asp Tyr His Gly

85 90 95

Leu Lys Ser Phe Arg Gln Ala Met Ala Ser Phe Met Glu Gln Ile Arg

100 105 110

Gly Gly Arg Ala Lys Phe Asp Leu Asn Arg Ile Val Val Thr Ala Gly

115 120 125

Ala Thr Ala Ala Asn Glu Leu Leu Thr Phe Ile Leu Ala Asp Pro Gly

130 135 140

Asp Ala Leu Leu Val Pro Thr Pro Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp Arg Asp

145 150 155 160

Leu Arg Trp Arg Thr Gly Ile Lys Ile Val Pro Ile His Cys Asp Ser

165 170 175

Ser Asn Asn Phe Gln Ile Thr Pro Gln Ala Leu Glu Ala Ala Tyr Lys

180 185 190

Glu Ala Glu Ser Lys Asp Met Arg Val Arg Gly Val Leu Ile Thr Asn

195 200 205

Pro Ser Asn Pro Leu Gly Ala Thr Ile Gln Arg Ser Val Leu Glu Glu

210 215 220

Leu Leu Asp Phe Ala Thr Arg Lys Asn Ile His Leu Val Ser Asp Glu

225 230 235 240

Ile Tyr Ser Gly Ser Ala Phe Ser Ser Ser Glu Phe Val Ser Ile Ala

245 250 255

Glu Ile Leu Glu Ala Arg Gln Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Val His Ile

260 265 270

Val Tyr Ser Leu Ser Lys Asp Leu Gly Leu Pro Gly Phe Arg Val Gly

275 280 285

Thr Ile Tyr Ser Tyr Asn Asp Lys Val Val Thr Thr Ala Arg Arg Met

290 295 300

Ser Ser Phe Thr Leu Ile Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Leu Leu Ala Ser

305 310 315 320

Met Leu Ser Asn Lys Lys Phe Thr Glu Asn Tyr Ile Lys Thr Asn Arg

325 330 335

Glu Arg Leu Gln Lys Arg Tyr Gln Met Ile Ile Glu Gly Leu Arg Ser

340 345 350

Ala Gly Ile Glu Cys Leu Lys Gly Asn Ala Gly Leu Phe Cys Trp Met

355 360 365

Asn Leu Ser Pro Leu Leu Glu Glu Gln Thr Arg Glu Gly Glu Leu Ala

370 375 380

Leu Trp Asp Ser Met Leu His Glu Val Lys Leu Asn Ile Ser Pro Gly

385 390 395 400

Ser Ser Cys His Cys Ser Glu Pro Gly Trp Phe Arg Val Cys Phe Ala

405 410 415

Asn Met Ser Glu Gln Thr Leu Glu Val Ala Leu Lys Arg Ile His Asn

420 425 430

Phe Met Gln Lys Arg Glu Arg Arg Arg Asn

435 440

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<400> 3

caaatgggtc gcggatccga attcatggct atagagattg agc 43

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<400> 4

tggtgctcga gtgcggccgc ttaatttctg cgtctctctc 40

Claims

1.一种具有双酶活性的蛋白质在催化L-胱氨酸(L-cystine)裂解生成丙酮酸中的用途，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；蛋白质的编码基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示；所述的双酶活性为1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸合酶和碳 - 硫裂解酶活性。