CN107746847A - 一种油菜ccch类转录因子的应用 - Google Patents

一种油菜ccch类转录因子的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，一种油菜CCCH类转录因子的应用。本发明通过实验证明BnaA07g26050D在酵母细胞中具有转录激活活性，并通过BnaA07g26050D基因对盐胁迫和干旱胁迫的响应分析，发现该基因在盐和旱胁迫下均能诱导表达，证明BnaA07g26050D具有调控植物抗盐、抗旱的功能；这为研究油菜CCCH锌指蛋白转录因子调控抗逆性的机理研究奠定了基础。本发明通过将BnaA07g26050D基因转入拟南芥中进行耐盐性分析，发现BnaA07g26050D能够显著提高拟南芥的耐盐性。

Description

一种油菜CCCH类转录因子的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一个油菜CCCH类转录因子的应用。
背景技术
油菜(Brassica napus)是中国重要的油料作物，其种植面积和产量都居世界首位。虽然我国油菜主要分布在长江流域，雨量充沛，但是全年降雨分布不均，季节性干旱频发，部分地区土壤盐渍化严重。因此，鉴定油菜耐旱、盐基因，对于利用基因工程改良油菜具有重要意义。
CCCH锌指蛋白含有三个串联的半胱氨酸(Cys)和一个组氨酸(His)组成的保守结构域，在动、植物中广泛存在。这类蛋白家族成员在不同物种中依次被鉴定出来，如拟南芥包含68个成员，水稻67个，玉米68个，苜蓿34个，杨树 91个。拟南芥CCCH蛋白依据CCCH结构域数目和类型，分为11个亚家族，目前已有超过20种蛋白的功能被解析出来，这些蛋白参与了植物生长发育和逆境胁迫等诸多过程。例如，在应对逆境方面，ATC3H49/AtTZF3通过ABA信号参与抵抗盐胁迫。ATC3H66/AtTZF9能够被MPK3和MPK6磷酸化，参与PTI 免疫反应。拟南芥AtC3H14和AtC3H15高度同源，包含CX8CX5CX3H结构域，是典型的CCCH锌指蛋白。它们具有转录激活活性，能够结合DNA和RNA，是AtMYB46的直接靶标，冗余调控茎秆细胞壁增厚、花粉发育和细胞伸长。而且，AtC3H14在杨树中的同源基因PdC3H17和PdC3H18参与木材细胞分化和细胞壁增厚。
发明内容
本发明的目的是提供一种油菜CCCH类转录因子的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
本发明第一方面，提供一种油菜CCCH类转录因子编码基因，所述油菜 CCCH类转录因子编码基因BnaA07g26050D的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明第二方面，提供一种油菜CCCH类转录因子，由编码该转录因子的核苷酸序列编码得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明第三方面，提供一种油菜CCCH类转录因子表达载体，所述表达载体包括微生物表达载体和植物表达载体。
本发明第四方面，提供一种油菜CCCH类转录因子在细胞调控中的应用。
本发明第五方面，提供一种油菜CCCH类转录因子在抗盐性方面的应用。
本发明第六方面，提供一种油菜CCCH类转录因子在抗旱方面的应用。
本发明从油菜中筛选分离出CCCH类转录因子BnaA07g26050D，经过结果分析，BnaA07g26050DC端包含两个串联的CX8CX5CX3H结构域，是典型的 CCCH锌指蛋白；与拟南芥CCCH蛋白的全长序列比对分析发现BnaA07g26050D 和拟南芥C3H14同源性最高，高达73％。
本发明通过实验证明BnaA07g26050D在酵母细胞中具有转录激活活性，并通过BnaA07g26050D基因对盐胁迫和干旱胁迫的响应分析，发现该基因在在盐和旱胁迫下均能诱导表达，证明BnaA07g26050D具有调控植物抗逆的功能；这为研究油菜CCCH锌指蛋白转录因子调控抗逆性的机理研究奠定了基础。
本发明通过将BnaA07g26050D基因转入拟南芥中进行耐盐性分析，发现BnaA07g26050D能够显著提高拟南芥的耐盐性；因而，本发明有助于耐逆作物新品质的培育。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为拟南芥CCCH家族成员与BnaA07g26050D的进化关系图。
图2为BnaA07g26050D的转录活性分析图。
图3为qRT-PCR检测BnaA07g26050D在盐、干旱胁迫中表达图。
图4为鉴定BnaA07g26050D转拟南芥阳性植株。
图5为BnaA07g26050D转化拟南芥后耐盐性分析图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
为推动基因工程在改良油菜等作物的抗盐、抗旱等抗逆性能方面的研究和应用，本发明第一方面，提供一种油菜CCCH类转录因子编码基因，所述油菜CCCH 类转录因子编码基因BnaA07g26050D的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明优选的技术方案中，扩增所述油菜CCCH类转录因子编码基因BnaA07g26050D基因包括以下步骤：
(1)以拟南芥C3H14基因为模板，设计引物；
(2)提取油菜幼苗的总RNA，然后反转录成cDNA；
(3)以上述步骤(2)所得cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，回收纯化产物，即得。
在本发明进一步优选的技术方案中，扩增所用上游引物序列为：5’ -ATGGAGAAAGTGGCGTCCGCCGTAAC-3’，如SEQ ID NO.2所示；下游引物序列为：5’-TCAGTGAGTGAGAAGCATCCTCTCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示。
本发明第二方面，提供一种油菜CCCH类转录因子，由编码该转录因子的核苷酸序列编码得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明第三方面，提供一种油菜CCCH类转录因子表达载体，所述表达载体包括微生物表达载体和植物表达载体。
本发明第四方面，提供一种油菜CCCH类转录因子在细胞调控中的应用。
在本发明优选技术方案中，BnaA07g26050D的转录激活活性分析方法为：利用无缝克隆将BnaA07g26050D构建到pGBKT7载体上，和pGADT7载体共同转化酵母AH109感受态，在SD/-Leu/-Trp培养基上生长2天后，挑取单克隆在含有X-gal的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上生长3天后进行观察并拍照。
本发明第五方面，提供一种油菜CCCH类转录因子在抗盐性方面的应用。
在本发明优选的技术方案中，所述抗盐性表达载体的构建方法为：以油菜 cDNA为模板扩增BnaA07g26050D基因，并将其正向插入pK2GW7植物表达载体。
本发明第六方面，提供一种油菜CCCH类转录因子在抗旱方面的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1油菜BnaA07g26050D编码基因的筛选及其cDNA的克隆
(1)以拟南芥C3H14基因的核苷酸序列和油菜全基因组序列进行BLAST 检索，发现BnaA07g26050D和拟南芥C3H14的同源性最高，根据序列设计引物：上游引物为5’-ATGGAGAAAGTGGCGTCCGCCGTAAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；下游引物为：5’-TCAGTGAGTGAGAAGCATCCTCTCTTG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。
(2)用艾德莱RNA提取试剂盒提取油菜幼苗的总RNA，然后用Takara反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。
(3)以cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，回收纯化产物并将其连接到PMD19-T载体上进行测序，测序结果所示如(SEQ ID NO.1)所示。
实施例2BnaA07g26050D与拟南芥中CCCH锌指蛋白的比较
在TAIR网站(http://www.arabidopsis.org/)下载68个拟南芥CCCH蛋白的全长序列，使用ClustalX程序将这些序列和BnaA07g26050D蛋白全长序列(如 SEQ ID NO.2所示)进行比对。使用MEGA6.0程序构建系统进化树，使用 Neighbor-Joining算法的CompleteDeletion模式，Bootstrap校验参数为1000，结果图1所示。对BnaA07g26050D结构进行解析，发现BnaA07g26050DC端包含两个串联的CX8CX5CX3H结构域，是典型的CCCH锌指蛋白。将BnaA07g26050D、AtC3H14和AtC3H15的氨基酸序列进行比对分析发现和拟南芥C3H14同源性最高，高达73％。
实施例3BnaA07g26050D的转录激活活性分析
利用无缝克隆将BnaA07g26050D构建到pGBKT7载体上，和pGADT7载体共同转化酵母AH109感受态，在SD/-Leu/-Trp培养基上生长2天后，挑取单克隆在含有X-gal的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上生长3天后进行观察并拍照。结果如图2所示，空BD和AD作为阴性对照，在SD/-Leu/-Trp上都可以正常生长，而在添加X-gal的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上只有BnaA07g26050D+AD 能够生长并且显蓝，表明BnaA07g26050D能激活HIS3和MEL1报告基因表达，也就是说，BnaA07g26050D在酵母中具有转录激活活性。
实施例4BnaA07g26050D基因对盐胁迫和干旱胁迫的响应分析
将油菜种子消毒后在1/2MS培养基培养上培养1周后分别转移到含有 100mmol/LNaCl和20％PEG 4000的培养基中处理12h和24h后取材提取RNA，然后进行反转录，qRT-PCR检测BnaA07g26050D表达量的变化。如图3所示，该基因在盐和旱胁迫下均能诱导表达。
实施例5BnaA07g26050D转基因拟南芥的耐盐性分析
从油菜cDNA中扩增BnaA07g26050D基因，并将其正向插入pK2GW7植物表达载体。将构建的含有的过表达载体转化拟南芥。结果获得7个转化植株，利用半定量PCR检测发现其中两个转化植株中BnaA07g26050D基因表达量较高，如图4所示。选取3#转基因植株进行耐盐性分析，将野生型Col-0和 BnaA07g26050D OE-3分别在0mmol/L NaCl和100mmol/LNaCl的1/2MS培养基生长1周后观察生长情况，结果如图5所示，BnaA07g26050D OE-3幼苗的耐盐性明显高于野生型。由此可知，BnaA07g26050D能够提高拟南芥的耐盐性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种油菜CCCH类转录因子的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 945
<212> DNA
<213> Brassica napus
<400> 1
atggagaaag tggcgtccgc cgtaacggat ctggcctgcg tgacggcgct aaactcgccg 60
ccgcctccgc tatcgcctca gtctgacaaa agcgtcacca aacagcacca ggaagatttc 120
gccgccagct tcgcctcgct ctacaactcg atcttctcgc cggaatctca gttccccgac 180
tcgctatccc tctctccgtc tcctccgtac tcctcctcct ctcctcccgc tcgcgtcgac 240
accgccaccg agcaccgcct ccgccaagcg agcctcatcc tcgagtacga cgagctcaac 300
gagcactacg aggtttgcct ctcccgcctc cagtccctga tgacggagct cgactcgctc 360
caccgcgaaa acgacgcgct ccgccaggaa aacgtcgatc tcctcaagct tatccacatc 420
tccacttcgt cttcctcctc ctccgtctct ccgccgcacg tccgtaaccg ccaacagatc 480
tccgatttcg gtagccaagc gaggaggagg agcgatccgg aaaggaactc gttgcctaag 540
agcatctccg tccgctcgcc gggatatctc aagatgatga accagggaag ccatggatac 600
ggcggtgcga atcgtcaaac gagtcaactc ggttccgact cggtaactca aaaggtgtgt 660
gtgccgacga aaggagagag agatgcgttg gagcttgagg tataccgtca agggatgacg 720
aagacggagc tttgcaacaa atggcaacag accggagctt gtccttacgc cgataactgc 780
cagttcgctc acggaatcga cgagctccgt ccggtgataa ggcaccctcg ctacaaaacc 840
gaagtgtgcc gtatgatcgt caccggagcc acctgtcctt atggtcaccg ttgccatttc 900
cgtcactcac tcaccgagca agagaggatg cttctcactc actga 945
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
atggagaaag tggcgtccgc cgtaac 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工
<400> 3
tcagtgagtg agaagcatcc tctcttg 27
<210> 4
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工
<400> 4
Met Glu Lys Val Ala Ser Ala Val Thr Asp Leu Ala Cys Val Thr Ala
1 5 10 15
Leu Asn Ser Pro Pro Pro Pro Leu Ser Pro Gln Ser Asp Lys Ser Val
20 25 30
Thr Lys Gln His Gln Glu Asp Phe Ala Ala Ser Phe Ala Ser Leu Tyr
35 40 45
Asn Ser Ile Phe Ser Pro Glu Ser Gln Phe Pro Asp Ser Leu Ser Leu
50 55 60
Ser Pro Ser Pro Pro Tyr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Ala Arg Val Asp
65 70 75 80
Thr Ala Thr Glu His Arg Leu Arg Gln Ala Ser Leu Ile Leu Glu Tyr
85 90 95
Asp Glu Leu Asn Glu His Tyr Glu Val Cys Leu Ser Arg Leu Gln Ser
100 105 110
Leu Met Thr Glu Leu Asp Ser Leu His Arg Glu Asn Asp Ala Leu Arg
115 120 125
Gln Glu Asn Val Asp Leu Leu Lys Leu Ile His Ile Ser Thr Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Ser Ser Val Ser Pro Pro His Val Arg Asn Arg Gln Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp Phe Gly Ser Gln Ala Arg Arg Arg Ser Asp Pro Glu Arg Asn
165 170 175
Ser Leu Pro Lys Ser Ile Ser Val Arg Ser Pro Gly Tyr Leu Lys Met
180 185 190
Met Asn Gln Gly Ser His Gly Tyr Gly Gly Ala Asn Arg Gln Thr Ser
195 200 205
Gln Leu Gly Ser Asp Ser Val Thr Gln Lys Val Cys Val Pro Thr Lys
210 215 220
Gly Glu Arg Asp Ala Leu Glu Leu Glu Val Tyr Arg Gln Gly Met Thr
225 230 235 240
Lys Thr Glu Leu Cys Asn Lys Trp Gln Gln Thr Gly Ala Cys Pro Tyr
245 250 255
Ala Asp Asn Cys Gln Phe Ala His Gly Ile Asp Glu Leu Arg Pro Val
260 265 270
Ile Arg His Pro Arg Tyr Lys Thr Glu Val Cys Arg Met Ile Val Thr
275 280 285
Gly Ala Thr Cys Pro Tyr Gly His Arg Cys His Phe Arg His Ser Leu
290 295 300
Thr Glu Gln Glu Arg Met Leu Leu Thr His
305 310

Claims (10)

1.一种油菜CCCH类转录因子编码基因，其特征在于，所述油菜CCCH类转录因子编码基因BnaA07g26050D的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述油菜CCCH类转录因子编码基因，其特征在于，扩增所述油菜CCCH类转录因子编码基因BnaA07g26050D基因包括以下步骤：
(1)以拟南芥C3H14基因为模板，设计引物；
(2)提取油菜幼苗的总RNA，然后反转录成cDNA；
(3)以上述步骤(2)所得cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR扩增，回收纯化产物，即得。
3.根据权利要求2所述油菜CCCH类转录因子编码基因，其特征在于，扩增所用上游引物序列为：5’-ATGGAGAAAGTGGCGTCCGCCGTAAC-3’，如SEQ ID NO.2所示；下游引物序列为：5’-TCAGTGAGTGAGAAGCATCCTCTCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示。
4.一种油菜CCCH类转录因子，其特征在于，由编码该转录因子的核苷酸序列编码得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种油菜CCCH类转录因子表达载体，其特征在于，所述表达载体包括微生物表达载体和植物表达载体。
6.根据权利要求4所述油菜CCCH类转录因子在细胞调控中的应用。
7.根据权利要求6所述油菜CCCH类转录因子在细胞调控中的应用，其特征在于，BnaA07g26050D的转录激活活性分析方法为：利用无缝克隆将BnaA07g26050D构建到pGBKT7载体上，和pGADT7载体共同转化酵母AH109感受态，在SD/-Leu/-Trp培养基上生长2天后，挑取单克隆在含有X-gal的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上生长3天后进行观察并拍照。
8.根据权利要求4所述油菜CCCH类转录因子在抗盐性方面的应用。
9.根据权利要求8所述油菜CCCH类转录因子在抗盐性方面的应用，其特征在于，所述抗盐性表达载体的构建方法为：以油菜cDNA为模板扩增BnaA07g26050D基因，并将其正向插入pK2GW7植物表达载体。
10.根据权利要求4所述油菜CCCH类转录因子在抗旱方面的应用。
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