CN101955948A

CN101955948A - 拟南芥srpr1在植物逆境胁迫中的应用

Info

Publication number: CN101955948A
Application number: CN 201010292194
Authority: CN
Inventors: 李文学; 潘晓英
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-09-26
Filing date: 2010-09-26
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2030-09-26
Also published as: CN101955948B

Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆境胁迫密切相关的基因SPRP1(C3-H-C4型锌指蛋白)及其应用。与野生型比较，SPRP1在拟南芥中过量表达显著增加拟南芥抗旱的能力，表明SPRP1可进一步用于抗逆胁迫作物品种的培育。

Description

拟南芥SRPR1在植物逆境胁迫中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及拟南芥SRPR1在植物逆境胁迫中的应用。

背景技术

植物经常遭受到各种逆境胁迫的危害，譬如冻害、冷害、涝害。在诸多胁迫中，干旱胁迫与盐害是农业生产中最主要的限制因子。据不完全统计，全世界盐碱和干旱地约占陆地总面积的1/3，且随着人为活动的影响，有逐年增加的趋势。以干旱胁迫为例，我国水资源总量为29124立方米，人均占有量仅为2400立方米，不足世界人均占有量的1/4，而且分布极不均匀(李飞等，1996，科技导报，5：37-40)。2004年，全国农作物受旱面积1725.3万hm²，成灾848.2万hm2，绝收16219万hm²，仅因旱灾造成的粮食减产达到1535万吨，造成农业直接经济损失285亿元(冯长根，2005，安全与环境学报，5：1-11)。在土地、水等资源十分有限的情况下，要解决16亿人口的粮食问题，如何有效的提高资源的利用效率是亟待解决的重要问题。因此通过基因工程手段培育抗逆境胁迫品种具有重要的意义与应用价值。

植物在长期的进化过程中可通过改变形态及生理生化特征以适应环境，其中大部分的过程取决于相应基因表达、尤其是转录因子的的变化(Singh et al.，2002，Curr.Opin.Plant Biol.5：430-436)。有研究证实改变CBFs/DREBs，NACs，RING-H2锌指蛋白等转录因子的表达可以显著增加植物抗逆境胁迫的能力(Jaglo-Ottosen et al.，1998，Science 280：104-106；Kasuga et al.，1999，Nat Biotechnol.17：287-291；Hu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：12987-12992；Ko et al.，Plant J.47：343-355)。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟南芥SRPR1基因在植物逆境胁迫中的应用。

拟南芥SRPR1基因在植物逆境胁迫中的应用主要通过在植物中过量表达SRPR1基因，提高植物抵御逆境胁迫的能力。

所述的逆境胁迫为干旱。

本发明利用PCR扩增分别扩增拟南芥野生型的SRPR1(C3-H-C4型锌指蛋白)(At1g54150)cDNA全长及其启动子。将SRPR1的启动子构建到载体pMDC164，GUS组织化学染色法结果表明SRPR1基因特异地在叶片的气孔中进行表达。将SRPR1基因构建植物过量表达载体，转入到拟南芥中，获得过量表达SRPR1的植株。结果表明：过量表达SRPR1显著增加拟南芥的抗旱能力，表明SRPR1与植物抗逆密切相关，能应用于通过基因工程手段进行抗逆境胁迫植物新品种的培育。

所述的植物优选为玉米、水稻和小麦等作物。

本发明克隆了拟南芥SRPR1基因，并发现其在叶片的气孔中特异表达，表明其可能与控制气孔开闭有关，而气孔的开闭与水分散失有关。过量表达SRPR1(C3-H-C4型锌指蛋白)显著增加拟南芥抗旱能力，表明可以通过改建该基因的过量表达载体，培育抗旱转基因植物，减少水等自然资源的投入，在节约成本获得经济效益的同时，达到良好的社会效益，有广阔的应用前景。

附图说明

图1为RT-PCR验证SRPR1的表达部位。

图2为GUS染色证实SRPR1在气孔中表达。

图3为转SRPR1基因的拟南芥植株的Q-PCR验证。其中，15、17、20、21、24为不同的独立转化株系。

图4为转SRPR1基因的拟南芥植株的抗旱表型。

图5为转SRPR1基因的拟南芥植株与野生型失水率的比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1试剂准备

1、菌株与工具质粒

本发明实施例中所用到的大肠杆菌DH10B、DB3.1和根癌农杆菌GV3101为本实验保存；pENTR^TM/D-TOPO载体购自Invitrogen公司；pMDC164、pMDC32购自TAIR。

2、工具酶及生化试剂

普通Taq酶由本实验制备；高保真Taq酶、SYBR购自Takara公司；dNTPs混合物购自上海生工；Trizol、LR Clonase购自Invitrogen公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、壮观霉素(Spe)、利福平(Rif)购自欣经科公司。

实施例2

1、总RNA提取

DEPC处理过的Eppendorf管中加入1ml Trizol；在液氮中将0.15g拟南芥哥伦比亚野生型拟南芥的根、茎、叶、花样品研成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末用小药勺转移到上述离心管中，颠倒混匀；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30秒；4℃、13000rpm离心5min；取上清，加入400μl异丙醇，-20℃放置1h；4℃、13000rpm离心15min；沉淀用1ml 70％酒精洗涤沉淀两次，4℃、7500rpm离心5min；放于超净工作台上吹干沉淀；沉淀用15μl DEPC水溶解，置于-75℃保存。

2、总RNA纯化

纯化体积为50μl体系，包括30μg总RNA、5μl 10×DNase IBuffer、10个单位DNase I、0.5μl RNA酶抑制剂，加DEPC水至50μl；37℃反应30min；加入50μl DEPC水；加入100μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；4℃、13000rpm离心15min；取上清；加入100μl的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀；4℃、13000rpm离心10min；取上清，加入10μl 3M NaAC(pH5.2)，250μl预冷的无水乙醇，-20℃放置1h；离心回收沉淀，用冷的70％乙醇清洗沉淀，真空干燥；用适量的DEPC水溶解后，进行琼脂糖电泳确认是否除去基因组DNA同时用分光光度计测定RNA浓度。

3、cDNA第一链的合成

(1)将2μg总RNA，2μl Oligo(dT)18nt，1μl 10mM dNTPs加入一个PCR管中，混匀；

(2)65℃保温5min，冰上急冷；

(3)在冰上按顺序加入下列组分：

5×M-MLV缓冲液 4μl

0.1×DTT 2μl

RNase inhibitor(40U/μl) 1μl

DEPC水总体积20μl

M-MLV反转录酶 1μl

(4)轻轻混匀，37℃保温50min；

(5)70℃保温15min以终止反应，冰上冷却。

4、RT-PCR分析拟南芥SPRP1基因的表达部位

以上述拟南芥的根、茎、叶和花的cDNA为模板，以SRPR1QF：5′-ATGCTGCTGTCAGGACCTGGAA-3′，SRPR1QR：5′-GTTTAACTCTCGTTCCACGGTT-3′为引物对进行RT-PCR分析，以拟南芥的Tub4基因为内参，其引物为TUB4F：5′-AGAGGTTGACGAGCAGATGA-3′，TUB4R ：5′-CCTCTTCTTCCTCCTCGTAC-3′。

PCR反应条件：94℃，3min；(94，30s；55℃，40s；72℃，1min)×30个循环；72℃，10min。将PCR产物电泳检测。

结果如图1所示，结果表明，SPRP1基因在拟南芥的叶片中的表达量较根、茎和花中都高。

实施例3

根据TAIR(www.arabidopsis.org)公布拟南芥野生型Col-0基因组序列设计合成PCR所需引物(启动子F：5′-CACCGGGTCGTCTAGAGAGTGGGAAAGA-3′；启动子R：5′-CGTCGTAGACACGGTCACACGGACA-3′)，以拟南芥基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃，3min；(94，30s；58℃，40s；72℃，1min30sec)×35个循环；72℃，10min。将PCR产物电泳检测。

电泳回收上述片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，通过CACC位点交换到pENTR^TM/D-TOPO载体(Invitrogen公司)。转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，提取质粒并测序，测序表明所扩增的片段确实为SRPR1启动子，且与所公布的序列一致。用Pvu I酶切pENTR-pSRPR质粒，回收酶切产物，通过LR反应(Invitrogen公司)克隆到pMDC164，得到重组表达载体pMDC164-pSRPR1。载体携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。

分别取100μl农杆菌感受态GV3301，加入100ngpMDC32-pSRPR1，充分混匀后加入电转杯中，1800V电击转化，300μl LB培养液悬浮细胞；28℃，200rpm振摇复苏2h；涂布抗性于含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平、25mg/L庆大霉素的培养基，置于28℃培养箱培养48小时。

挑取平板上长出的单菌落，接种于50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平、25mg/L庆大霉素的液体培养液中，28℃培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

取已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和25mg/L庆大霉素的LB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600到0.5，4℃、4000rpm离心10分钟，除去上清液。用100ml的渗入缓冲液(1/2×MS，5％蔗糖)重悬菌体，加silwet L-77(GE公司，货号：S5505)至终浓度0.2‰。将抽苔后刚刚开花的拟南芥的花浸于重悬液中侵染，1分钟左右，取出。用保鲜膜包裹拟南芥植株，避光横置过夜，将保鲜膜揭开透气，置于正常条件下生长。

3、GUS组织染色

取按上述方法培育的阳性转基因植物的叶片浸入90％丙酮中20min(整体置冰上)，冰水冲洗5min；取出叶片，浸入GUS染液(50mmol/L磷酸缓冲液，10mmol/L EDTA-Na，0.5mmol/L亚铁氰化钾，1mg/ml X-Gluc，)，37℃培养箱中避光反应过夜；弃去管内液体，加入75％乙醇脱色24h，显微镜观察并拍照。

结果如图2所示，结果表明，只在叶片的气孔中出现了蓝色斑点，表明SRPR1特异地在叶片的气孔中表达。

实施例4

根据TAIR(www.arabidopsis.org)公布拟南芥野生型Col-0中SRPR1[at1g54150]]的序列设计合成PCR所需引物，

SRPR1-F：5′-CACCATGTCCTCGCCGGAGCGTGCTCT-3′

SRPR1-R：5′-TAGTTCGATCTCACCGAGCTCCA-3′。

以上引物由Invitrogen公司合成。

以拟南芥叶片总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增(方法同实施例2)。PCR反应条件：94℃，3min；(94，30s；55℃，40s；72℃，1min)×35个循环；72℃，10min。将PCR产物电泳检测。5、SRPR1表达载体的构建

电泳回收上述片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，通过CACC位点交换到pENTRTM/D-TOPO载体(Invitrogen公司)。转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，提取质粒并测序，测序表明所扩增的片段确实为SRPR1，且与所公布的序列一致。用Pvu I酶切pENTR-SRPR质粒，回收酶切产物，通过LR反应(Invitrogen公司)克隆到pMDC32，得到重组表达载体。载体携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。

实施例5

重组表达载体pMDC32-SRPR1转化拟南芥同实施例4。

由于转入pMDC32-SRPR1载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入基因的野生型种子不能正常生长并死亡。转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。将收获的T0代转基因种子播种在含35μg/L潮霉素的MS培养基上，春化后于暗光下培养。生长一周后，可根据下胚轴长短区分转化植株与未转化植株。将阳性克隆植株转入土培，收获种子，经过重复筛选，可获得所有个体均能正常生长的35S::SRPR1纯合系。

提取35S::SRPR1纯合植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以SRPR1QF(5′-ATGCTGCTGTCAGGACCTGGAA-3′)，SRPR1QR(5′-GTTTAACTCTCGTTCCACGGTT-3′)为引物进行定量PCR检测在转基因拟南芥中SRPR1基因的表达水平。

转基因拟南芥叶片cDNA的制备同实施例2。

Real-time PCR试剂选用SYBR Premix Ex TaqTM(perfect real time)kit(TaKaRa Biomedicals)，定量PCR仪器型号ABI7500。

反应体系：

试剂用量

SYBR Mix 12.5μl

cDNA模板 3μl

上游引物(10μM)： 1μl

下游引物(10μM)： 1μl

无菌水 7.5μl

PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环(95℃15秒，58℃30秒，72℃1分钟)；融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；以Tub4为内参，采用相对定量算法计算不同转基因拟南芥中SRPR1的相对表达量。

结果如图3所示，结果表明，SRPR1转基因拟南芥中SRPR1的表达量与野生型相比得到明显了提升，但不同株系的表达量不同。其中20、21和24号株系的表达量较高。

实施例6

为了鉴定转SRPR1基因拟南芥植株的抗旱能力，选取不同表达丰度转基因系(15、17、20、21和24号株系)进行抗旱能力的分析。土培拟南芥，生长4周后进行失水处理，失水10天后，野生型拟南芥叶片萎蔫严重，但是转基因植株生长正常，表现出较强的抗旱能力，其中20、21和24号株系的表现要好于15和17号株系(图4)，考虑到20、21和24号株系中SRPR1基因的丰度远高于15和17号株系，说明了SRPR1基因的表达与抗旱能力的之间的直接关系。选取表达量最高的24号株系进一步分析失水率(图5)，进一步说明了SRPR1基因的过量表达能显著提高植物抗水分胁迫的能力。

序列说明

SEQ ID No.1和2所示序列为SRPR1Real-time的引物对；SEQ ID No.3和4所示序列为Tub4Real-time的引物对；SEQ ID No.5和6所示序列为扩增SRPR1启动子的引物对；SEQ ID No.7和8所示序列为扩增SRPR1全长的引物对。

Claims

1.拟南芥SRPR1基因在植物逆境胁迫中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在植物中过表达SPRP1基因，提高对逆境胁迫的抗性。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的逆境胁迫为干旱。

4.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述的植物选自水稻、玉米或小麦。