CN101955970B

CN101955970B - miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用

Info

Publication number: CN101955970B
Application number: CN 201010276128
Authority: CN
Inventors: 李文学; 赵勐; 丁红; 张福锁
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-09-07
Filing date: 2010-09-07
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2030-09-07
Also published as: CN101955970A

Abstract

本发明公开了一种与氮代谢相关的小RNA miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用。将miR169在拟南芥中过量表达，增加了拟南芥对于缺氮胁迫的敏感性，相应的过量表达miR169的靶基因NFYA5，降低了拟南芥对于缺氮胁迫的敏感性，增强了拟南芥耐低氮胁迫的能力。通过对这种复杂的调控网络的分析与深入了解，可进一步应用于氮高效农作物的培育。

Description

miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及拟南芥miR169及其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用。

背景技术

作为植物需求量最大的元素——氮素，与植物的产量和品质关系密切。我国农业生产中每年要消耗掉2621万吨合成氮肥，但是我国目前的氮肥利用率仅有30％左右，远低于45％的世界平均水平，一方面增加了农业生产成本，另一方面极易造成地下水及其地表水的污染(Ju et al.，2009，Proc Natl Acad Sci USA 96：3041-3046)。为保证粮食安全，不可能简单的采用某些发达国家通过降低产量来减少氮肥使用量、进而提高肥料利用率的方法，因此我们必须在保证高产的前提下，充分挖掘作物本身吸收、利用氮素的生物学潜力，实现氮肥的高效利用。然而控制作物氮素养分高效性质的遗传基础非常复杂，科研工作者得到的关键氮高效基因和相应的调控元件还非常少。仅有的几个调控元件主要包括ANR1(Zhang and Forde，1998，Science 279：407-409)、GNC(Bi et al.，2005，Plant J 44：680-692)与DOF1(Yanagisawa et al.，2004，Proc Natl Acad Sci USA 101：7833-7838)。

21到24nt的小RNA的发现，使研究者意识到小RNA在转录后水平调控基因表达的重要作用(Carrington and Ambros，2003，Science 320：1185-1190)。这些小RNA基本上是由miRNA和siRNA组成。许多研究证实miRNA对于植物的正常生长发育起到重要的作用，包括开花，叶片和根发育，胚发育以及生长素信号(Carringtonand Ambros，2003，Science 320：1185-1190；Bartel，2004，Cell 116：281-297；Jones-Rhoades et al.，2006，Mol Cell 14：787-799)。

miR169是在植物中首批被发现的小RNA，在进化上具有高度的保守性，拟南芥中miR169为最大的miRNA家族，由14个成员组成，靶基因为核因子YA(nuclear factor YA)家族成员，人们对核因子Y家族成员的生物学功能了解的很少。Lee等发现AtNFYB9(LEC1)对于拟南芥胚的建成是必须的(Lee et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2152-2156)；而将AtNFYB1在拟南芥和玉米中过量表达后可以显著增强其抗旱能力(Nelson et al.，2007，Proc NatlAcad Sci U S A.104：16450-16455)。

在拟南芥基因组中，由10条基因编码NF-YAs。靶基因功能的多样性加大了对于miR169生物学功能的研究难度，直到近几年才有关于miR169功能的报道。Combier等发现miR169参与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)根瘤的发育(Combier et al.，2006，Gene Dev20：3084-3088)；以前的研究结果显示AtNFYA5(miR169的一个靶基因)在拟南芥抗水分胁迫过程中起到重要作用，其表达受到转录和转录后水平的双重调控，转录后水平的调控主要是通过miR169来实现，进一步的研究结果表明尽管miR169是一个比较大的家族，但是仅有miR169a在其中起到重要的作用，过量表达miR169a后，突变株变得对干旱敏感(Li et al.，2008，Plant Cell 20：2238-2251)。到目前为止，还没有研究表明miR169及其靶基因与氮素胁迫相关。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物适应胁迫相关的miR169及其靶基因在改变植物耐受氮胁迫中的应用。

本发明首先通过改良的小RNA提取法提取小RNA，并通过小RNA Northern杂交证实miR169的表达受缺氮胁迫抑制，进一步的Q-PCR的结果表明miR169a对于miR169的表达降低起到决定性作用，其靶基因NFYA5在氮胁迫条件下表达量显著上升。这一结果表明，miR169及其靶基因NFYA5与植物适应氮胁迫相关。

其次，从拟南芥哥伦比亚生态型中分离出miR169的前体miR169a和其靶基因NFYA5，构建了上述两个基因的双元表达载体，通过农杆菌介导法转化拟南芥。在3mM外源N条件下，转基因植株与野生型相比生长并无明显差异，但在低氮条件下(0.15mM)，35S::miR169a对于氮胁迫表现出明显的敏感性，叶子发黄，生长受到抑制，绿叶率含量降低。而35S::NFYA5表现出更强的耐受低氮胁迫的能力，其生物量在低氮条件下要显著高于野生型植株。因此，可以通过调控miR169的表达量，就可以实现调控miR169靶基因的表达，或者单独调控miR169靶基因NFYA5的表达量来改变植物适应氮胁迫的能力。

所述调控miR169或其靶基因的表达量，可以是过量表达或者抑制表达。

由于miRNA在进化上的保守性，这种调控机制可以借鉴到其它植物，能应用于玉米、小麦、水稻等大田作物。

本发明首次鉴定了一个与植物适应低氮胁迫相关的小RNA——miR169，其在地上部与根系均有表达，其表达量受到氮的调控，其功能是通过对靶基因的调控实现的，将miR169a在植物中过量表达，增加了植物对于低氮胁迫的敏感性，相应地将其靶基因NFYA5在植物中表达，增强了植物耐受低氮胁迫的能力。

附图说明

图1小RNANorthern分析拟南芥根系(A)与地上部(B)miR169对于缺氮胁迫的反应。miR171与5S/tRNA作为表征上样量的正对照。图下方的数字表示相对表达量。

图2荧光实时定量PCR分析拟南芥根系(A)与地上部(B)中NFYA5基因在供氮和缺氮处理下的表达变化情况。

图3荧光实时定量PCR分析拟南芥根系(A)与地上部(B)中miR169前体在供氮和缺氮处理下的表达变化情况。

图4为miR169a多拷贝表达载体pMDC32-miR169a。

图5为NFYA5基因多拷贝表达载体PMDC32-NFYA5的质粒图谱。

图6转miR169a拟南芥改变植物对低氮耐受能力。A为转基因植株的小RNANorthem验证；B琼脂培养体系中的植物表型图；C是相应的绿叶率的统计结果。

图7转NFYA5拟南芥改变植物对低氮耐受能力。A为转基因植株的Q-PCR验证；B琼脂培养体系中的植物表型图；C是相应的生物量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1材料试剂的准备

1、菌株与工具质粒

本发明实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌DH10B、DB3.1和根癌农杆菌GV3101、pGEM T-Easy克隆载体购自Promega公司；pENTR^TM/D-TOPO载体购自Invitrogen公司；植物表达载体pMDC32购自TAIR。

2、工具酶及生化试剂

普通Taq酶由本实验制备；高保真Taq酶、SYBR购自Takara公司；dNTPs混合物购自上海生工；Trizol、LR Clonase购自Invitrogen公司；T4DNA激酶购自New England Biolab公司；乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺购自Promega公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、壮观霉素(Spe)、利福平(Rif)购自欣经科公司。

实施例2小RNA Northern分析miR169对氮胁迫的反应

1、总RNA提取

拟南芥采用水培，营养液成分如下：1mM NH₄NO₃，1mMNaH₂PO₄，1.5mM MgSO₄，1.5mM CaCl₂，100μM Fe-EDTA，50μMH₃BO₃，12μM MnCl₂，2μM ZnSO₄，1μM CuSO₄，and 0.2μMNa₂MoO₄。每2天换一次营养液。萌发后28天，移入不含氮的营养液中进行缺氮0、1、2、3、4天处理，分别提取相应氮处理根系、地上部总RNA。

DEPC处理过的Eppendorf管中加入1ml Trizol；在液氮中将0.15g样品研成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末用小药勺转移到上述离心管中，颠倒混匀；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30秒；4℃、13000rpm离心5min；取上清，加入400μl异丙醇，-20℃放置1h；4℃、13000rpm离心15min；沉淀用1ml 70％酒精洗涤沉淀两次，4℃、7500rpm离心5min；放于超净工作台上吹干沉淀；沉淀用15μl DEPC水溶解，置于-75℃保存。

2、总RNA纯化

纯化体积为50μl体系，包括30μg总RNA、5μl 10×DNase IBuffer、10个单位DNase I、0.5μl RNA酶抑制剂，加DEPC水至50μl；37℃反应30min；加入50μlDEPC水；加入100μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；4℃、13000rpm离心15min；取上清；加入100μl的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀；4℃、13000rpm离心10min；取上清，加入10μl 3M NaAC(pH5.2)，250μl预冷的无水乙醇，-20℃放置1h；离心回收沉淀，用冷的70％乙醇清洗沉淀，真空干燥；用适量的DEPC水溶解后，进行琼脂糖电泳确认是否除去基因组DNA同时用分光光度计测定RNA浓度。

3、小RNA提取

总RNA溶于1ml无RNA酶的水中，加入等体积的20％PEG8000/1M NaCl，至于冰上1h；4℃、8000rpm离心15min；取上清，加入200μl 3M NaAC(pH5.2)，2ml异丙醇，-20℃放置过夜；离心回收沉淀，用冷的70％乙醇清洗沉淀，真空干燥；用适量的DEPC水溶解。

4、小RNA分离

制备聚丙烯酰胺变性胶：10*TBE 4ml，40％聚丙烯酰胺17ml，65℃加热溶解，冷却至室温，用无RNA酶水补齐至40ml，加入200μl10％APS、20μl TEMED，倒胶，凝固1h。180v预跑30min；30ug小RNA65℃变性10min，至于冰上冷却，180v跑胶6h。

5、转膜及其固定

利用湿法转膜：100v 1h，膜为Hybond N(Amersham)；将膜至于123mM乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(Sigma)、240mM碳化二亚胺(Sigma)pH8.0预先浸润的Watman滤纸上，RNA面朝上，60℃1.5h。

6、探针标记

10μM Oligo 2μl

10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液 5μl

T4多聚核苷酸激酶(NEB) 2μl

γ-³²P-ATP 5μl

水 36μl

37℃孵育1h。

7、杂交

将膜移至杂交管，加5ml 1*perfect Hyb plus hybridization buffer(Sigma)，38℃预杂交1h；标记好的探针沸水浴中变性5min，迅速至于冰上冷却，加入杂交管，38℃杂交过夜，用2*SSC/0.1％SDS在38℃分两次洗膜，每次10min；压片。

结果如图1所示，无论是根系(图1A)还是地上部(图1B)，随着氮胁迫时间的延长，miR169的表达量显著降低。

实施例3Real-Time PCR分析miR169前体、NFYA5对于氮胁迫的反应

用实施例2提取的总RNA为模板，oligo(dT)为引物反转录获cDNA第一链，方法如下所述：

(1)将2μg总RNA，2μl Oligo(dT)18nt，1μl 10mmol L^-1dNTPs加入一个PCR管中，混匀；

(2)65℃保温5min，冰上急冷；

(3)在冰上按顺序加入下列组分：

5×M-MLV缓冲液 4μl

0.1×DTT 2μl

RNA酶抑制剂(40U/μl) 1μl

M-MLV反转录酶 1μl

DEPC水补足至20μl

(4)轻轻混匀，37℃保温50min；

(5)70℃保温15min以终止反应，冰上冷却。

用下述引物用于Real-Time PCR检测miR169前体及其NFYA5基因的表达量。

引物miR169a F 5′-TGGGTATAGCTAGTGAAACGCG-3′

引物miR169a R 5′-CCTTAGCTTGAGTTCTTGCGA-3′

引物miR169b F 5′-CTCCACTCCCTAAACCATCACAA-3′

引物miR169b R 5′-CTCATACGGTCGATGTTAATCCGT-3′

引物miR169c F 5′-CTACATTCACAAACGAGAGAATT-3′

引物miR169c R 5′-GCTCTACTTTAGCATCTCAACCA-3′

引物miR169h F 5′-GTAGTCTTGTGGGATACTCATCA-3′

引物miR169h R 5′-ATCCCCAAATTTGGAGGCCAAACA-3′

引物miR169i F 5′-AAGGTGTCTCCTGGGTTGAAAAT-3′

引物miR169i R 5′-CCATGATCATTCATGTCGTGCCT-3′

引物miR169j F 5′-GAGAGCACATCCATGTGAGGAA-3′

引物miR169j R 5′-GTCAGGCAAGTCATCCTTGGCT-3′

引物miR169k F 5′-CTCTTTGGCTATCTTGACATGCT-3′

引物miR169k R 5′-CCAAGGAGACTGCCTGATGTCT-3′

引物miR169l F 5′-GAGAGCACATGAATGTAAGGCA-3′

引物miR169l R 5′-AATAATGTGTAGACTCAGCCACAT-3′

引物miR169l R 5′-CTTGCGGGTTAGGTTTCAGGCA-3′

引物miR169m R 5′-GCCTCGAAATCATGAACATTATC-3′

引物miR169n F 5′-AGAGAGCACATGCATGTATGGA-3′

引物miR169n R 5′-GAAAAGTAGGTATAACATGGATGG-3′

引物NFYA5F 5′-GAAGATTCATCTTGGGGAAACTC-3′

引物NFYA5R 5′-GAGCAGGAAACACAGAGTCTTGA-3′

引物Tub8 F 5′-ATAACCGTTTCAAATTCTCTCTCTC-3′

引物Tub8 R 5′-ATGCAAATCGTTCTCTCCTTG-3′

Real-time PCR检测基因丰度，试剂选用SYBR Premix ExTaqTM(perfect real time)kit(TaKaRa Biomedicals)，定量PCR仪器型号ABI7500，反转产物稀释3倍作为Real-time PCR模板

反应体系：

试剂用量

SYBR Mix 12.5μl

模板 3μl

上游引物(10μM)： 1μl

下游引物(10μM)： 1μl

无菌水 7.5μl

PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环(95℃15秒，58℃30秒，72℃1分钟)；融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；以Tub8为内参，采用相对定量算法计算miR169前体、NFYA5在不同处理中的相对表达量。

同时，以同样的体系，以引物Tub8F和引物Tub8R为引物扩增Tub8为内参对照。结果如图4所示，无论在拟南芥的根系(图2A)或者地上部(图2B)，显著诱导NFYA5的表达；而分析miR169前体对于缺氮处理反应发现：在地上部，miR169a/b/c/h/i/j/k/l/m/n的表达受到缺氮胁迫的抑制(图3A)，在根系，缺氮处理仅降低miR169a的表达，miR169b/c/h/i/j/k/l/m/n的表达在缺氮条件下反而升高(图3B)，表明在根系miR169表达的降低主要归于miR169a表达的减少，由于根系直接接触养分，对于植物适应养分胁迫起到主要作用，可以看出miR169a对于改变植物适应氮胁迫的能力起到至关重要的作用。

实施例4miR169a与NFYA5基因过量载体的构建

1、总RNA的提取与纯化

方法同实施例2

2、cDNA第一链的合成

方法同实施例3

3、miR169a、NFYA5的克隆

根据TAIR(www.arabidopsis.org)公布拟南芥野生型Col-0中miR169[at3g13405]、NFYA5基因[at1g54160]的序列设计合成PCR所需引物：

引物169a 1：5’-CACCTGGGTATAGCTAGTGAAACGCG-3’

引物169a2：5’-CCTTAGCTTGAGTTCTTGCGA-3’

引物NFYA51：5’-CACCATGCAAGTCTTTCAAAGGAAAG-3’

引物NFYA52：5’-TCAAGTCCCTGACATGAGAGCTGAGG-3’

上游引物5’端引入CACC交换为点(划线部分)，以拟南芥总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃，3min；(94，30s；55℃，40s；72℃，1min)×35个循环；72℃，10min。将PCR产物电泳检测。

4、miR169a、NFYA5表达载体的构建

电泳回收上述片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，通过CACC位点交换到pENTR^TM/D-TOPO载体(Invitrogen公司)。转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，提取质粒并测序，测序表明所扩增的片段确实为miR169a、NFYA5基因，且与所公布的序列一致。用Pvu I酶切pENTR-miR169a、pENTR-NFYA5a质粒，回收酶切产物，通过LR反应(Invitrogen公司)克隆到pMDC32载体，得到重组表达载体pMDC32-mir169a(图4)与pMDC32-NFYA5(图5)。载体可以使miR169a、NFYA5基因在35S启动子下组成型表达，并且携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。

实施例5培育对缺氮胁迫反应改变的植物

1、重组表达载体MDC32-mir169a或pMDC32-NFYA5转化农杆菌感受态细胞

分别取100μl农杆菌感受态GV3301，加入100ngpMDC32-mir169a或pMDC32-NFYA5，充分混匀后加入电转杯中，1800V电击转化，300μl LB培养液悬浮细胞；28℃，200rpm振摇复苏2h；涂布抗性于含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平、25mg/L庆大霉素的培养基，置于28℃培养箱培养48小时。

2、转化农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平、25mg/L庆大霉素的液体培养液中，28℃培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

3、拟南芥的转化

取已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和25mg/L庆大霉素的LB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600到0.5，4℃、4000rpm离心10分钟，除去上清液。用100ml的渗入缓冲液(1/2×MS，5％蔗糖)重悬菌体，加silwet L-77(GE公司，货号：S5505)至终浓度0.2‰。将抽苔后刚刚开花的拟南芥的花浸于重悬液中侵染，1分钟左右，取出。用保鲜膜包裹拟南芥植株，避光横置过夜，将保鲜膜揭开透气，置于正常条件下生长。

4、转基因阳性植株的筛选

由于转入pMDC32-mir169a或pMDC32-NFYA5载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入基因的野生型种子不能正常生长并死亡。转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。将收获的T0代转基因种子播种在含35μg/L潮霉素的MS培养基上，春化后于暗光下培养。生长一周后，可根据下胚轴长短区分转化植株与未转化植株。将阳性克隆植株转入土培，收获种子，经过重复筛选，可获得所有个体均能正常生长的35S::miR169a与35S::NFYA5纯合系。

5、转基因拟南芥的分子检测

提取35S::miR169a纯合植株的总RNA(方法同实施例2)，通过小RNA Northern检测miR169在南芥中的表达水平(方法同实施例2)。结果如图6A所示。

提取35S::NFYA5纯合植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以引物NFYA51，引物NFYA52为引物对进行定量PCR检测在转基因拟南芥中NFYA5基因的表达水平(方法同实施例3)。结果如图7A所示。

6、转基因植株耐受低氮胁迫能力的鉴定

为了鉴定转基因拟南芥耐受低氮胁迫能力的鉴定，采用1/10John’s配方(K₂SO₄2mmol·L^-1，Mg₂SO₄·7H₂O 1 mmol·L^-1，KH₂PO₄2mmol·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 2×10^-4mmol·L^-1，MnSO₄·7H₂O 2×10^-4mmol·L^-1，CuSO₄·5H₂O 5×10^-5mmol·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 5×10^-5mmol·L^-1，H₃BO₃1×10^-3mmol·L^-1，Fe-EDTA 0.1mmol·L^-1，CaCl₂1.5mmol·L^-1)、外加3mM、0.3mM、0.15mM N(KNO3，NH4NO3)固体培养基培养拟南芥，培养14天后，观察其绿叶率。

结果如图6B所示，在3mM外源N条件下，转基因植株与野生型相比生长并无明显差异，但在低氮条件下(0.15mM)，35S::miR169a对于氮胁迫表现出明显的敏感性，叶子发黄，生长受到抑制，绿叶率的结果进一步证实了此观点(图6C)。miRNA主要是通过抑制靶基因的表达实现其功能，因此我们过量表达miR169的其中一个靶基因----NFYA5以进一步验证miR169在植物适应氮胁迫中的作用，结果表明35S::NFYA5表现出更强的耐受低氮胁迫的能力(图7B)，其生物量在低氮条件下要显著高于野生型植株(图7C)。由于miRNA在进化上的保守性，这种调控机制可以借鉴到其它植物，譬如玉米、小麦、水稻等大田作物。

序列说明

SEQ ID NO1和2为分离mir169a全长的引物对；3和4为分离NFYA5全长的引物对；5和6、7和8、9和10、11和12、13和14、15和16、17和18、19和20、21和22、23和24、25和26、27和28分别为Real-Time PCR检测miR169a、miR169b，miR169c、miR169h、miR169i、miR169j、miR169k、miR169l、miR169m、miR169n、NFYA5和Tub8的引物对。

Claims

1.miR169a在改变植物耐受氮胁迫中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在植物中过表达或抑制表达miR169a改变植物对于氮素胁迫的耐受能力。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米、小麦或水稻。