CN101955970B - miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用 - Google Patents
miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101955970B CN101955970B CN 201010276128 CN201010276128A CN101955970B CN 101955970 B CN101955970 B CN 101955970B CN 201010276128 CN201010276128 CN 201010276128 CN 201010276128 A CN201010276128 A CN 201010276128A CN 101955970 B CN101955970 B CN 101955970B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nitrogen
- mir169
- nfya5
- plant
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 112
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 56
- 108091048615 miR169 stem-loop Proteins 0.000 title abstract description 36
- 101100079914 Arabidopsis thaliana NFYA5 gene Proteins 0.000 title abstract description 22
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 title abstract description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 108091030140 miR169a stem-loop Proteins 0.000 claims description 25
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract 2
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 abstract 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 101150063412 NFYA5 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 108091083845 miR169b stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 108091059268 miR169l stem-loop Proteins 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000618 nitrogen fertilizer Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 4
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 4
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 108091047192 miR169c stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091041872 miR169h stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091074061 miR169i stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091037879 miR169j stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091031815 miR169k stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091090356 miR169n stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- LMSDCGXQALIMLM-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;iron Chemical compound [Fe].OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O LMSDCGXQALIMLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N diazene Chemical compound N=N RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000071 diazene Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108091085989 miR169m stem-loop Proteins 0.000 description 2
- ADAMEOZKZQRNKP-UHFFFAOYSA-N n'-propylmethanediimine Chemical compound CCCN=C=N ADAMEOZKZQRNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylethylamine Chemical compound CCN(C)C DAZXVJBJRMWXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- MUKYLHIZBOASDM-UHFFFAOYSA-N 2-[carbamimidoyl(methyl)amino]acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoic acid Chemical compound NC(=N)N(C)CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O MUKYLHIZBOASDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036791 Adhesion G protein-coupled receptor L2 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 101100323274 Arabidopsis thaliana ANR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000928189 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor L2 Proteins 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219828 Medicago truncatula Species 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034408 Nuclear transcription factor Y subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710115878 Nuclear transcription factor Y subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101100010147 Oryza sativa subsp. japonica DOF1 gene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241001533104 Tribulus terrestris Species 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种与氮代谢相关的小RNA miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用。将miR169在拟南芥中过量表达，增加了拟南芥对于缺氮胁迫的敏感性，相应的过量表达miR169的靶基因NFYA5，降低了拟南芥对于缺氮胁迫的敏感性，增强了拟南芥耐低氮胁迫的能力。通过对这种复杂的调控网络的分析与深入了解，可进一步应用于氮高效农作物的培育。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及拟南芥miR169及其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用。
背景技术
作为植物需求量最大的元素——氮素，与植物的产量和品质关系密切。我国农业生产中每年要消耗掉2621万吨合成氮肥，但是我国目前的氮肥利用率仅有30％左右，远低于45％的世界平均水平，一方面增加了农业生产成本，另一方面极易造成地下水及其地表水的污染(Ju et al.，2009，Proc Natl Acad Sci USA 96：3041-3046)。为保证粮食安全，不可能简单的采用某些发达国家通过降低产量来减少氮肥使用量、进而提高肥料利用率的方法，因此我们必须在保证高产的前提下，充分挖掘作物本身吸收、利用氮素的生物学潜力，实现氮肥的高效利用。然而控制作物氮素养分高效性质的遗传基础非常复杂，科研工作者得到的关键氮高效基因和相应的调控元件还非常少。仅有的几个调控元件主要包括ANR1(Zhang and Forde，1998，Science 279：407-409)、GNC(Bi et al.，2005，Plant J 44：680-692)与DOF1(Yanagisawa et al.，2004，Proc Natl Acad Sci USA 101：7833-7838)。
21到24nt的小RNA的发现，使研究者意识到小RNA在转录后水平调控基因表达的重要作用(Carrington and Ambros，2003，Science 320：1185-1190)。这些小RNA基本上是由miRNA和siRNA组成。许多研究证实miRNA对于植物的正常生长发育起到重要的作用，包括开花，叶片和根发育，胚发育以及生长素信号(Carringtonand Ambros，2003，Science 320：1185-1190；Bartel，2004，Cell 116：281-297；Jones-Rhoades et al.，2006，Mol Cell 14：787-799)。
miR169是在植物中首批被发现的小RNA，在进化上具有高度的保守性，拟南芥中miR169为最大的miRNA家族，由14个成员组成，靶基因为核因子YA(nuclear factor YA)家族成员，人们对核因子Y家族成员的生物学功能了解的很少。Lee等发现AtNFYB9(LEC1)对于拟南芥胚的建成是必须的(Lee et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：2152-2156)；而将AtNFYB1在拟南芥和玉米中过量表达后可以显著增强其抗旱能力(Nelson et al.，2007，Proc NatlAcad Sci U S A.104：16450-16455)。
在拟南芥基因组中，由10条基因编码NF-YAs。靶基因功能的多样性加大了对于miR169生物学功能的研究难度，直到近几年才有关于miR169功能的报道。Combier等发现miR169参与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)根瘤的发育(Combier et al.，2006，Gene Dev20：3084-3088)；以前的研究结果显示AtNFYA5(miR169的一个靶基因)在拟南芥抗水分胁迫过程中起到重要作用，其表达受到转录和转录后水平的双重调控，转录后水平的调控主要是通过miR169来实现，进一步的研究结果表明尽管miR169是一个比较大的家族，但是仅有miR169a在其中起到重要的作用，过量表达miR169a后，突变株变得对干旱敏感(Li et al.，2008，Plant Cell 20：2238-2251)。到目前为止，还没有研究表明miR169及其靶基因与氮素胁迫相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物适应胁迫相关的miR169及其靶基因在改变植物耐受氮胁迫中的应用。
本发明首先通过改良的小RNA提取法提取小RNA，并通过小RNA Northern杂交证实miR169的表达受缺氮胁迫抑制，进一步的Q-PCR的结果表明miR169a对于miR169的表达降低起到决定性作用，其靶基因NFYA5在氮胁迫条件下表达量显著上升。这一结果表明，miR169及其靶基因NFYA5与植物适应氮胁迫相关。
其次，从拟南芥哥伦比亚生态型中分离出miR169的前体miR169a和其靶基因NFYA5，构建了上述两个基因的双元表达载体，通过农杆菌介导法转化拟南芥。在3mM外源N条件下，转基因植株与野生型相比生长并无明显差异，但在低氮条件下(0.15mM)，35S::miR169a对于氮胁迫表现出明显的敏感性，叶子发黄，生长受到抑制，绿叶率含量降低。而35S::NFYA5表现出更强的耐受低氮胁迫的能力，其生物量在低氮条件下要显著高于野生型植株。因此，可以通过调控miR169的表达量，就可以实现调控miR169靶基因的表达，或者单独调控miR169靶基因NFYA5的表达量来改变植物适应氮胁迫的能力。
所述调控miR169或其靶基因的表达量，可以是过量表达或者抑制表达。
由于miRNA在进化上的保守性，这种调控机制可以借鉴到其它植物，能应用于玉米、小麦、水稻等大田作物。
本发明首次鉴定了一个与植物适应低氮胁迫相关的小RNA——miR169，其在地上部与根系均有表达，其表达量受到氮的调控，其功能是通过对靶基因的调控实现的，将miR169a在植物中过量表达，增加了植物对于低氮胁迫的敏感性，相应地将其靶基因NFYA5在植物中表达，增强了植物耐受低氮胁迫的能力。
附图说明
图1小RNANorthern分析拟南芥根系(A)与地上部(B)miR169对于缺氮胁迫的反应。miR171与5S/tRNA作为表征上样量的正对照。图下方的数字表示相对表达量。
图2荧光实时定量PCR分析拟南芥根系(A)与地上部(B)中NFYA5基因在供氮和缺氮处理下的表达变化情况。
图3荧光实时定量PCR分析拟南芥根系(A)与地上部(B)中miR169前体在供氮和缺氮处理下的表达变化情况。
图4为miR169a多拷贝表达载体pMDC32-miR169a。
图5为NFYA5基因多拷贝表达载体PMDC32-NFYA5的质粒图谱。
图6转miR169a拟南芥改变植物对低氮耐受能力。A为转基因植株的小RNANorthem验证；B琼脂培养体系中的植物表型图；C是相应的绿叶率的统计结果。
图7转NFYA5拟南芥改变植物对低氮耐受能力。A为转基因植株的Q-PCR验证；B琼脂培养体系中的植物表型图；C是相应的生物量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1材料试剂的准备
1、菌株与工具质粒
本发明实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌DH10B、DB3.1和根癌农杆菌GV3101、pGEM T-Easy克隆载体购自Promega公司；pENTRTM/D-TOPO载体购自Invitrogen公司；植物表达载体pMDC32购自TAIR。
2、工具酶及生化试剂
普通Taq酶由本实验制备；高保真Taq酶、SYBR购自Takara公司；dNTPs混合物购自上海生工；Trizol、LR Clonase购自Invitrogen公司；T4DNA激酶购自New England Biolab公司；乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺购自Promega公司；氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、壮观霉素(Spe)、利福平(Rif)购自欣经科公司。
实施例2小RNA Northern分析miR169对氮胁迫的反应
1、总RNA提取
拟南芥采用水培，营养液成分如下：1mM NH4NO3，1mMNaH2PO4，1.5mM MgSO4，1.5mM CaCl2，100μM Fe-EDTA，50μMH3BO3，12μM MnCl2，2μM ZnSO4，1μM CuSO4，and 0.2μMNa2MoO4。每2天换一次营养液。萌发后28天，移入不含氮的营养液中进行缺氮0、1、2、3、4天处理，分别提取相应氮处理根系、地上部总RNA。
DEPC处理过的Eppendorf管中加入1ml Trizol；在液氮中将0.15g样品研成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末用小药勺转移到上述离心管中，颠倒混匀；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30秒；4℃、13000rpm离心5min；取上清，加入400μl异丙醇，-20℃放置1h；4℃、13000rpm离心15min；沉淀用1ml 70％酒精洗涤沉淀两次，4℃、7500rpm离心5min；放于超净工作台上吹干沉淀；沉淀用15μl DEPC水溶解，置于-75℃保存。
2、总RNA纯化
纯化体积为50μl体系，包括30μg总RNA、5μl 10×DNase IBuffer、10个单位DNase I、0.5μl RNA酶抑制剂，加DEPC水至50μl；37℃反应30min；加入50μlDEPC水；加入100μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀；4℃、13000rpm离心15min；取上清；加入100μl的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分混匀；4℃、13000rpm离心10min；取上清，加入10μl 3M NaAC(pH5.2)，250μl预冷的无水乙醇，-20℃放置1h；离心回收沉淀，用冷的70％乙醇清洗沉淀，真空干燥；用适量的DEPC水溶解后，进行琼脂糖电泳确认是否除去基因组DNA同时用分光光度计测定RNA浓度。
3、小RNA提取
总RNA溶于1ml无RNA酶的水中，加入等体积的20％PEG8000/1M NaCl，至于冰上1h；4℃、8000rpm离心15min；取上清，加入200μl 3M NaAC(pH5.2)，2ml异丙醇，-20℃放置过夜；离心回收沉淀，用冷的70％乙醇清洗沉淀，真空干燥；用适量的DEPC水溶解。
4、小RNA分离
制备聚丙烯酰胺变性胶：10*TBE 4ml，40％聚丙烯酰胺17ml，65℃加热溶解，冷却至室温，用无RNA酶水补齐至40ml，加入200μl10％APS、20μl TEMED，倒胶，凝固1h。180v预跑30min；30ug小RNA65℃变性10min，至于冰上冷却，180v跑胶6h。
5、转膜及其固定
利用湿法转膜：100v 1h，膜为Hybond N(Amersham)；将膜至于123mM乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(Sigma)、240mM碳化二亚胺(Sigma)pH8.0预先浸润的Watman滤纸上，RNA面朝上，60℃1.5h。
6、探针标记
10μM Oligo 2μl
10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液 5μl
T4多聚核苷酸激酶(NEB) 2μl
γ-32P-ATP 5μl
水 36μl
37℃孵育1h。
7、杂交
将膜移至杂交管，加5ml 1*perfect Hyb plus hybridization buffer(Sigma)，38℃预杂交1h；标记好的探针沸水浴中变性5min，迅速至于冰上冷却，加入杂交管，38℃杂交过夜，用2*SSC/0.1％SDS在38℃分两次洗膜，每次10min；压片。
结果如图1所示，无论是根系(图1A)还是地上部(图1B)，随着氮胁迫时间的延长，miR169的表达量显著降低。
实施例3Real-Time PCR分析miR169前体、NFYA5对于氮胁迫的反应
用实施例2提取的总RNA为模板，oligo(dT)为引物反转录获cDNA第一链，方法如下所述：
(1)将2μg总RNA，2μl Oligo(dT)18nt，1μl 10mmol L-1dNTPs加入一个PCR管中，混匀；
(2)65℃保温5min，冰上急冷；
(3)在冰上按顺序加入下列组分：
5×M-MLV缓冲液 4μl
0.1×DTT 2μl
RNA酶抑制剂(40U/μl) 1μl
M-MLV反转录酶 1μl
DEPC水 补足至20μl
(4)轻轻混匀，37℃保温50min；
(5)70℃保温15min以终止反应，冰上冷却。
用下述引物用于Real-Time PCR检测miR169前体及其NFYA5基因的表达量。
引物miR169a F 5′-TGGGTATAGCTAGTGAAACGCG-3′
引物miR169a R 5′-CCTTAGCTTGAGTTCTTGCGA-3′
引物miR169b F 5′-CTCCACTCCCTAAACCATCACAA-3′
引物miR169b R 5′-CTCATACGGTCGATGTTAATCCGT-3′
引物miR169c F 5′-CTACATTCACAAACGAGAGAATT-3′
引物miR169c R 5′-GCTCTACTTTAGCATCTCAACCA-3′
引物miR169h F 5′-GTAGTCTTGTGGGATACTCATCA-3′
引物miR169h R 5′-ATCCCCAAATTTGGAGGCCAAACA-3′
引物miR169i F 5′-AAGGTGTCTCCTGGGTTGAAAAT-3′
引物miR169i R 5′-CCATGATCATTCATGTCGTGCCT-3′
引物miR169j F 5′-GAGAGCACATCCATGTGAGGAA-3′
引物miR169j R 5′-GTCAGGCAAGTCATCCTTGGCT-3′
引物miR169k F 5′-CTCTTTGGCTATCTTGACATGCT-3′
引物miR169k R 5′-CCAAGGAGACTGCCTGATGTCT-3′
引物miR169l F 5′-GAGAGCACATGAATGTAAGGCA-3′
引物miR169l R 5′-AATAATGTGTAGACTCAGCCACAT-3′
引物miR169l R 5′-CTTGCGGGTTAGGTTTCAGGCA-3′
引物miR169m R 5′-GCCTCGAAATCATGAACATTATC-3′
引物miR169n F 5′-AGAGAGCACATGCATGTATGGA-3′
引物miR169n R 5′-GAAAAGTAGGTATAACATGGATGG-3′
引物NFYA5F 5′-GAAGATTCATCTTGGGGAAACTC-3′
引物NFYA5R 5′-GAGCAGGAAACACAGAGTCTTGA-3′
引物Tub8 F 5′-ATAACCGTTTCAAATTCTCTCTCTC-3′
引物Tub8 R 5′-ATGCAAATCGTTCTCTCCTTG-3′
Real-time PCR检测基因丰度，试剂选用SYBR Premix ExTaqTM(perfect real time)kit(TaKaRa Biomedicals)，定量PCR仪器型号ABI7500，反转产物稀释3倍作为Real-time PCR模板
反应体系：
试剂 用量
SYBR Mix 12.5μl
模板 3μl
上游引物(10μM)： 1μl
下游引物(10μM)： 1μl
无菌水 7.5μl
PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环(95℃15秒，58℃30秒，72℃1分钟)；融解曲线步骤：95℃15秒，以10秒钟一个循环，每个循环增加0.5℃的速度从60℃升温到95℃，进行70个循环；以Tub8为内参，采用相对定量算法计算miR169前体、NFYA5在不同处理中的相对表达量。
同时，以同样的体系，以引物Tub8F和引物Tub8R为引物扩增Tub8为内参对照。结果如图4所示，无论在拟南芥的根系(图2A)或者地上部(图2B)，显著诱导NFYA5的表达；而分析miR169前体对于缺氮处理反应发现：在地上部，miR169a/b/c/h/i/j/k/l/m/n的表达受到缺氮胁迫的抑制(图3A)，在根系，缺氮处理仅降低miR169a的表达，miR169b/c/h/i/j/k/l/m/n的表达在缺氮条件下反而升高(图3B)，表明在根系miR169表达的降低主要归于miR169a表达的减少，由于根系直接接触养分，对于植物适应养分胁迫起到主要作用，可以看出miR169a对于改变植物适应氮胁迫的能力起到至关重要的作用。
实施例4miR169a与NFYA5基因过量载体的构建
1、总RNA的提取与纯化
方法同实施例2
2、cDNA第一链的合成
方法同实施例3
3、miR169a、NFYA5的克隆
根据TAIR(www.arabidopsis.org)公布拟南芥野生型Col-0中miR169[at3g13405]、NFYA5基因[at1g54160]的序列设计合成PCR所需引物：
引物169a 1：5’-CACCTGGGTATAGCTAGTGAAACGCG-3’
引物169a2：5’-CCTTAGCTTGAGTTCTTGCGA-3’
引物NFYA51：5’-CACCATGCAAGTCTTTCAAAGGAAAG-3’
引物NFYA52：5’-TCAAGTCCCTGACATGAGAGCTGAGG-3’
上游引物5’端引入CACC交换为点(划线部分)，以拟南芥总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃，3min；(94，30s；55℃，40s；72℃，1min)×35个循环；72℃，10min。将PCR产物电泳检测。
4、miR169a、NFYA5表达载体的构建
电泳回收上述片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，通过CACC位点交换到pENTRTM/D-TOPO载体(Invitrogen公司)。转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，提取质粒并测序，测序表明所扩增的片段确实为miR169a、NFYA5基因，且与所公布的序列一致。用Pvu I酶切pENTR-miR169a、pENTR-NFYA5a质粒，回收酶切产物，通过LR反应(Invitrogen公司)克隆到pMDC32载体，得到重组表达载体pMDC32-mir169a(图4)与pMDC32-NFYA5(图5)。载体可以使miR169a、NFYA5基因在35S启动子下组成型表达，并且携带有潮霉素抗性的筛选标记基因。
实施例5培育对缺氮胁迫反应改变的植物
1、重组表达载体MDC32-mir169a或pMDC32-NFYA5转化农杆菌感受态细胞
分别取100μl农杆菌感受态GV3301，加入100ngpMDC32-mir169a或pMDC32-NFYA5，充分混匀后加入电转杯中，1800V电击转化，300μl LB培养液悬浮细胞；28℃，200rpm振摇复苏2h；涂布抗性于含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平、25mg/L庆大霉素的培养基，置于28℃培养箱培养48小时。
2、转化农杆菌阳性克隆的PCR鉴定
挑取平板上长出的单菌落，接种于50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平、25mg/L庆大霉素的液体培养液中，28℃培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。
3、拟南芥的转化
取已经鉴定为阳性的农杆菌菌液0.5ml接种于500ml含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和25mg/L庆大霉素的LB液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600到0.5，4℃、4000rpm离心10分钟，除去上清液。用100ml的渗入缓冲液(1/2×MS，5％蔗糖)重悬菌体，加silwet L-77(GE公司，货号：S5505)至终浓度0.2‰。将抽苔后刚刚开花的拟南芥的花浸于重悬液中侵染，1分钟左右，取出。用保鲜膜包裹拟南芥植株，避光横置过夜，将保鲜膜揭开透气，置于正常条件下生长。
4、转基因阳性植株的筛选
由于转入pMDC32-mir169a或pMDC32-NFYA5载体的拟南芥植株具有潮霉素抗性，所以在含有潮霉素的MS固体培养基上可以正常生长，而未转入基因的野生型种子不能正常生长并死亡。转化当代转基因植株为T0代，由该T0代植株自交产生的种子及由它所长成的植株为T1代。将收获的T0代转基因种子播种在含35μg/L潮霉素的MS培养基上，春化后于暗光下培养。生长一周后，可根据下胚轴长短区分转化植株与未转化植株。将阳性克隆植株转入土培，收获种子，经过重复筛选，可获得所有个体均能正常生长的35S::miR169a与35S::NFYA5纯合系。
5、转基因拟南芥的分子检测
提取35S::miR169a纯合植株的总RNA(方法同实施例2)，通过小RNA Northern检测miR169在南芥中的表达水平(方法同实施例2)。结果如图6A所示。
提取35S::NFYA5纯合植株的总RNA，在oligo(dT)引导下反转录成第一链cDNA，以引物NFYA51，引物NFYA52为引物对进行定量PCR检测在转基因拟南芥中NFYA5基因的表达水平(方法同实施例3)。结果如图7A所示。
6、转基因植株耐受低氮胁迫能力的鉴定
为了鉴定转基因拟南芥耐受低氮胁迫能力的鉴定，采用1/10John’s配方(K2SO42mmol·L-1，Mg2SO4·7H2O 1 mmol·L-1，KH2PO42mmol·L-1，ZnSO4·7H2O 2×10-4mmol·L-1，MnSO4·7H2O 2×10-4mmol·L-1，CuSO4·5H2O 5×10-5mmol·L-1，Na2MoO4·2H2O 5×10-5mmol·L-1，H3BO31×10-3mmol·L-1，Fe-EDTA 0.1mmol·L-1，CaCl21.5mmol·L-1)、外加3mM、0.3mM、0.15mM N(KNO3，NH4NO3)固体培养基培养拟南芥，培养14天后，观察其绿叶率。
结果如图6B所示，在3mM外源N条件下，转基因植株与野生型相比生长并无明显差异，但在低氮条件下(0.15mM)，35S::miR169a对于氮胁迫表现出明显的敏感性，叶子发黄，生长受到抑制，绿叶率的结果进一步证实了此观点(图6C)。miRNA主要是通过抑制靶基因的表达实现其功能，因此我们过量表达miR169的其中一个靶基因----NFYA5以进一步验证miR169在植物适应氮胁迫中的作用，结果表明35S::NFYA5表现出更强的耐受低氮胁迫的能力(图7B)，其生物量在低氮条件下要显著高于野生型植株(图7C)。由于miRNA在进化上的保守性，这种调控机制可以借鉴到其它植物，譬如玉米、小麦、水稻等大田作物。
序列说明
SEQ ID NO1和2为分离mir169a全长的引物对；3和4为分离NFYA5全长的引物对；5和6、7和8、9和10、11和12、13和14、15和16、17和18、19和20、21和22、23和24、25和26、27和28分别为Real-Time PCR检测miR169a、miR169b，miR169c、miR169h、miR169i、miR169j、miR169k、miR169l、miR169m、miR169n、NFYA5和Tub8的引物对。
Claims (3)
1.miR169a在改变植物耐受氮胁迫中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过在植物中过表达或抑制表达miR169a改变植物对于氮素胁迫的耐受能力。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米、小麦或水稻。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010276128 CN101955970B (zh) | 2010-09-07 | 2010-09-07 | miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010276128 CN101955970B (zh) | 2010-09-07 | 2010-09-07 | miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101955970A CN101955970A (zh) | 2011-01-26 |
| CN101955970B true CN101955970B (zh) | 2013-01-09 |
Family
ID=43483557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010276128 Expired - Fee Related CN101955970B (zh) | 2010-09-07 | 2010-09-07 | miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101955970B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102899352B (zh) * | 2011-07-26 | 2014-04-02 | 中山大学 | 一种利用反义寡核苷酸沉默拟南芥内源miRNA的方法 |
| CN104988158B (zh) * | 2015-07-15 | 2018-09-18 | 南京农业大学 | 甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA12及其应用 |
| CN105695482B (zh) * | 2016-04-15 | 2018-09-18 | 南京农业大学 | 甘蓝型油菜核转录因子NF-YA基因BnNF-YA3及其应用 |
| CN107418972B (zh) * | 2017-09-04 | 2020-07-24 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种获得生长特性改良水稻品种的方法 |
| CN110373413B (zh) * | 2019-06-24 | 2023-03-17 | 浙江农林大学 | 光皮桦miR169a的前体基因及其在降低植物低氮胁迫耐受性中的应用 |
| CN111593058B (zh) * | 2020-05-25 | 2022-01-25 | 扬州大学 | Bna-miR169n基因及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用 |
| CN111876430B (zh) * | 2020-06-16 | 2023-06-16 | 浙江农林大学 | 光皮桦nfya2基因及其在提高植物对氮素吸收中的应用 |
| CN114457074B (zh) * | 2021-09-27 | 2024-05-24 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种与木本植物铵态氮应答相关的miRNA及其应用 |
| CN118620895A (zh) * | 2024-07-02 | 2024-09-10 | 江西农业大学 | 一种蒺藜苜蓿中应答热激胁迫的miRNA及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102124110A (zh) * | 2008-04-30 | 2011-07-13 | 加利福尼亚大学董事会 | 抗旱的转录因子的转录调节和转录后调节 |
-
2010
- 2010-09-07 CN CN 201010276128 patent/CN101955970B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Bikram Datt Pant et al.Identification of Nutrient-Responsive Arabidopsis and Rapeseed MicroRNAs by Comprehensive Real-Time Polymerase Chain Reaction Profiling and Small RNA Sequencing.《Plant Physiology》.2009,第150卷1541－1555. * |
| HAN-HUA LIU et al.Microarray-based analysis of stress-regulated microRNAs in Arabidopsis thaliana.《RNA》.2008,第14卷836-843. * |
| Meng Zhao et al.Involvement of miR169 in the nitrogen-starvation responses in Arabidopsis.《New Phytologist》.2011,第190卷906－915. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101955970A (zh) | 2011-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101955970B (zh) | miR169或其靶基因NFYA5在植物适应氮胁迫中的应用 | |
| Han et al. | The suppression of WRKY44 by GIGANTEA-miR172 pathway is involved in drought response of Arabidopsis thaliana | |
| Yadav et al. | microRNA 166: An evolutionarily conserved stress biomarker in land plants targeting HD-ZIP family | |
| CN101955521B (zh) | 植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN101633934A (zh) | 表达生长素合成相关基因的植物表达载体及其在棉花纤维性状改良的应用 | |
| CN102766618B (zh) | 水稻OsICL蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN102002101B (zh) | 与植物根系发育相关的蛋白ZmNR1及其编码基因 | |
| CN104195150A (zh) | 拟南芥糖基转移酶基因ugt79b2在提高植物抗盐耐旱性中的应用 | |
| Sun et al. | Sensitivity of translation initiation factor eIF1 as a molecular target of salt toxicity to sodic-alkaline stress in the halophytic grass Leymus chinensis | |
| CN105504034A (zh) | Myb37蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| CN108795944A (zh) | 棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用 | |
| CN113621625B (zh) | 芝麻SiERF103基因在增强植物抗性中的应用 | |
| CN108103076B (zh) | 一种抑制叶片衰老的黑麦草转录因子基因LpNACL及其应用 | |
| CN104313026A (zh) | 香蕉水通道蛋白基因启动子及其应用 | |
| Okeyo-Ikawa et al. | In planta seed transformation of Kenyan cowpeas (Vigna unguiculata) with P5CS gene via Agrobacterium tumefaciens. | |
| CN101955948A (zh) | 拟南芥srpr1在植物逆境胁迫中的应用 | |
| CN103114098B (zh) | 控制白菜避荫性反应基因BrPHYB及其应用 | |
| CN103382475B (zh) | 植物耐旱耐碱相关的dna片段及其应用 | |
| CN105112395A (zh) | 猕猴桃AdPDC1基因与应用 | |
| CN105112380A (zh) | 猕猴桃AdADH2基因与应用 | |
| CN110272912B (zh) | 蛋白激酶atm基因序列、应用及调控植物叶片衰老进程的方法 | |
| CN101979408A (zh) | 棉花衰老相关转录因子及其编码基因与应用 | |
| CN118440957B (zh) | 薄荷中调控表皮毛与根毛发育和耐盐胁迫的转录因子McZFP4及其应用 | |
| CN105154419A (zh) | AtSRT2基因在提高植物耐盐性中的应用 | |
| CN105481959A (zh) | 一种通过下调PAB2和PAB4提高植物对NaCl耐受性的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130109 Termination date: 20150907 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |