CN107686514B - 一个新的编码芹菜dreb转录因子的基因克隆及功能鉴定 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及1个在植物逆境胁迫中发挥重要调控作用的基因AgDREB2，该基因含有681个核苷酸，编码226个氨基酸，属于AP2/ERF转录因子家族中的DREB‑A1亚家族成员。本发明公开了一种利用聚合酶扩增技术从芹菜中克隆出抗逆相关DREB转录因子的方法。

Description

一个新的编码芹菜DREB转录因子的基因克隆及功能鉴定
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及1个在植物逆境胁迫中发挥重要调控作用的基因AgDREB2。本发明公开了一种利用聚合酶扩增技术从芹菜品种‘津南实芹’中克隆出抗逆相关DREB转录因子的方法。
背景技术
芹菜(Apium graveolens L.)是伞形科(Apiaceae)一年或多年生草本植物，原产于地中海和中东地区，在我国栽培历史悠久，分布较广。芹菜含有丰富的营养成分和膳食纤维，除作为蔬菜外，还具有极好的药用功能。‘津南实芹’是天津津南区选育的优良地方品种，抗逆性强，生长速度快，我国南北四季均可栽培(李海燕，天津农林科技2004，4：21)。
农作物的生长、发育及产量受到许多生物和非生物胁迫的影响，如干旱、低温或高温等极端天气、土壤盐渍化等。在植物中，许多基因在胁迫下被诱导表达，这些基因不仅自身能产生有抵抗力的功能性蛋白，同时也作为信号传导因子参与胁迫应答(Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，Annu Rev Plant Biol 2006，57：781-803；Cao et al.，PlantSignal Behav 2008，3：761-763)。一些研究已经表明转录因子在基因表达调控中起重要作用，其中AP2/ERF家族转录因子是一类广泛参与各种生物过程的转录因子，如花和种子的发育(Chung et al.，Plant J 2010，64：936-947)，果实成熟、抵抗病原菌、参与胁迫应答等(Gutterson and Reuber，Curr Opin Plant Biol 2004，7：465-471；Chen et al.，PlantMol Biol Rep 2012，30：1415-1425)。AP2/ERF家族是植物中非常大的一类转录因子家族，该成员均含有一个60～70氨基酸组成的结构域。AP2/ERF家族成员又可分为5大类：AP2、RAV、DREB、ERF和一个单独类别。其中，DREB又可分为6个六个亚组(A1、A2、A3、A4、A5和A6)，ERF也分为6个六个亚组(B1、B2、B3、B4、B5和B6)。转录因子可以通过结合下游基因的启动子中的cis元件调节下游基因在不同时空、不同组织或不同条件的表达量(Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki，Curr Opin Plant Biol 2000，3：217-223；Schramm et al.，PlantJ 2008，53：264-274)。以往研究证明DREB类转录因子能够特异性地结合DRE(Dehyarationresponsive element)顺式元件，DRE元件也在许多非生物胁迫相关的基因的启动子中被发现(Stockinger et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1997，94：1035-1040；Maruyama etal.，Plant J 2004，38：982-993；Maruyama et al.，DNA Res 2012，19：37-49)。
发明内容
本发明提供了一种芹菜转录因子AgDREB2基因的制备方法和用途。本发明利用聚合酶扩增技术从芹菜‘津南实芹’中克隆的DREB转录因子，所获得的DREB转录因子能够增强植物对逆境的耐性。
附图说明
图1.芹菜AgDREB2蛋白序列与拟南芥AP2/ERF家族的进化树分析。
图2.芹菜AgDREB2基因在不同逆境胁迫下的表达分析。
图3.酵母单杂交验证AgDREB2蛋白结合DRE元件。
图4.β-半乳糖苷酶活性测定芹菜AgDREB2蛋白结合能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。具体实验步骤如下：
1.芹菜总RNA的提取及cDNA的合成
芹菜总RNA提取按照RNA试剂盒(RNAsimply total RNA Kit，北京天跟公司)说明书进行，用Prime Script RT reagent Kit(大连TaKaRa公司)将提取的总RNA反转录成cDNA。
2.芹菜转录因子AgDREB2基因的克隆
基于芹菜转录组测序信息，以拟南芥AP2/ERF转录因子家族为信息探针，进行检索分析，获得芹菜AgDREB2的基因序列。正向：5’-ATGGATCAGTTACTCACCAATC-3’，反向5’-TCAAAATGAAAAACTCCATAAAGAC-3’。以‘津南实芹’cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃60s，共30个循环；72℃10min。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收后，连接到pMD18-T载体上并转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经PCR鉴定后委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
3.序列分析
通过核苷酸序列测定，获得了芹菜转录因子AgDREB2基因的序列，对其编码的氨基酸序列进行分析。氨基酸组成与多序列比对采用Clustal X软件，进化树分析使用MEGA4.0软件。
4.实时定量PCR反应
对生长两个月‘津南实芹’幼苗分别进行4种逆境胁迫处理：4℃低温处理、干旱处理(200g·L-1的PEG6000)、盐胁迫处理(200mmol·L-1的NaCl)、ABA激素(0.1mmol·L-1)处理。分别于处理后0、1、3、6、12、24和48h取叶片样本并立即用液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中。根据‘津南实芹’中扩增的AgDREB2基因序列设计表达检测引物，正向为5’-CTCCCACCGAAACAACAAGCAAAG-3’，反向为5’-CGGAACAGGCAACCTCCATACG-3’。荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)是采用ABI 7300 Real-time PCR System和7300Systemsoftware。实时定量PCR使用宝生物工程(大连)有限公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒，按照操作说明进行。采用芹菜的TUB-B基因作为参考基因(Li et al.，Frontiers Plant Sci2016，7：313)，与目标基因一起扩增，引物序列为正向5’-TGGTGGCACTGGATCTGGTATGG-3’，反向为5’-ACTTTCGGAGGAGGGAAGACTGAA-3’，目的基因相对转录表达水平的计算公式为2-CtΔ，CtΔ＝Ct(目的基因)-Ct(actin)。
5.酵母单杂交体系和X-gal活性的测定
酵母菌株为EGY48，鱼饵质粒G222(G221质粒载体插入3拷贝的DRE顺式元件后构建成)载体由本实验室保存构建(Li et al.，Mol Genet Genomics 2015，290：2049-2061)。将扩增好的AgDREB2基因片段克隆在酵母系统pPC86载体(Li et al.，Mol Genet Genomics2015，290：2049-2061)的BamH I-Sac I位点上。同时将重组质粒转化菌株EGY48，均匀涂于SD/-Trp/-His双缺陷平板，30℃培养箱培养2～3d后，将转化子影印到无菌硝酸纤维素膜上，平铺于含有X-gal的SD培养基上，1d后观察是否显蓝色。并以ONPG(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(美国Sigma公司)为底物，进行β-半乳糖苷酶活性检测。
6试验结果：
1).从芹菜品种‘津南实芹’中克隆出的编码芹菜DREB转录因子基因AgDREB2。多序列比对和进化树分析显示该转录因子蛋白属于AP2/ERF类转录因子家族中的DREB-A1亚家族(图1)。
2).荧光定量表达分析结果显示芹菜AgDREB2基因对非生物胁迫有响应，证明该转录因子参与了芹菜植株对多种非生物胁迫调控(图2)。
3).酵母转录激活实验证明，芹菜AgDREB2基因可以与DRE顺式作用元件特异结合，并具有较高的转录激活活性，进一步证实芹菜AgDREB2基因对非生物逆境具有调控作用(图3和图4)。
Figure ISB0000191692760000011

Claims (3)

1.一种从芹菜中获得的DREB类转录因子基因AgDREB2，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.一种制备权利要求1所述的从芹菜中获得的DREB类转录因子基因AgDREB2的方法。
3.权利要求1所述的从芹菜中获得的DREB类转录因子基因AgDREB2的应用，所述AgDREB2基因与DRE顺式作用元件特异结合，并具有转录激活活性。
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