CN101230353A - 花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法 - Google Patents
花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了调控花生籽粒蛋白质/油脂含量比例的一个关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的核苷酸序列及所编码的蛋白质序列。本发明还提供了该花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法。本发明基因AhPEPC的mRNA表达分析表明该基因在脂肪含量不同的花生品种间表达差异明显。
Description
技术领域
本发明属于脂肪酸代谢工程领域，具体涉及一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法。
背景技术
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是高等植物、细菌、蓝细菌、绿藻中广泛存在的一种胞质酶(Chollet R，Vidal J，O’Leary MH.Phosphoenolpyruvate carboxylase：a ubiquitous，highly regulatedenzyme in plants[J].Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996)，它能催化CO2和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)形成草酰乙酸(OAA)，是C4植物光合固定CO2的关键酶。同时，PEPCase在柠檬酸循环、调控细胞内pH值及阳离子平衡等方面也具有重要作用(潘瑞炽，董愚得.植物生理学.第三版[M]北京：高等教育出版社，1995)。1999年，陈锦清等利用PCR技术克隆了油菜PEP基因片段，并构建了带PEP反义基因的双元载体，以利用反义RNA抑制油菜PEP基因表达量，从而使油菜油脂/蛋白质含量比率向高油脂变化。2005年，张银波等利用RT-PCR技术克隆到了油菜PEP基因片段，并构建了对应于PEPCase基因的RNAi载体，以利用RNAi技术抑制油菜PEPCase基因的表达，使代谢流偏向油脂合成，从而提高油菜籽粒中的油脂含量。
2006年，吴关庭等采用根癌农杆菌介导方法将反义磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPCase)基因导入粳稻品种秀水11，获得一批转基因植株，T2代测定结果显示，转基因水稻株系的稻米脂肪含量比对照高出0.37±0.12个百分点，其差异大部分达到极显著水平。在反义PEP基因表达技术提出之前，世界上基因工程提高植物种子含油量主要有两条技术途径，一是使外源乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase，ACCase)基因在籽粒中表达，从而正向提高脂肪酸生物合成限速酶ACCase活性，通过这一途径，曾将油菜种子含油量提高了5％(Roesler K，Shintani D，Savage L，Boddupalli S，Ohlrogge J.Targeting of the Arabidopsis homomericacetyl-coenzyme a carboxylasetoplastidsofrapeseeds.PlantPhysiol，1997)。二是导入酵母溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidic acidacyltransferase，LPAAT)基因，提高脂肪酸合成酯类的速度，减轻脂肪酸合成中的反馈抑制(Zou J，Katavic V，Giblin EM，et al.Modificationof seed oil content and acyl composition in the Brassicaceae byexpressionofayeastsn-2acyl-transferasegene.PlantCell，1997)。目前应用的反义PEP基因表达技术是在油脂生物合成的上游对该代谢途径进行调控，即通过反义抑制PEPCase活性，将更多的碳源用于脂肪酸合成，提高种子含油量。
花生籽仁含有50％左右的脂肪和24％～36％的蛋白质。研究表明，花生脂肪含量与蛋白质含量呈极显著负相关(廖小妹等.珍珠豆型花生脂肪蛋白质含量与农艺性状相关与通径分析.莱西：花生科技，1992)。80年代末，日本学者杉本博士发现籽粒蛋白质含量与丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性密切相关(陈锦清，黄锐之，郎春秀等.油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建.浙江大学学报，1999)。本发明首次从花生中分离克隆了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC)，并研究了不同脂肪含量的花生品种间该基因的表达差异，提出利用AhPEPC的基因工程来提高花生油份含量的方法。
发明内容
本发明的目的在于公开一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC)的核苷酸序列。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是调控花生籽粒蛋白质/油脂含量比例的关键酶，该酶活性的降低可使花生中脂肪含量增加。
本发明的第二个目的还提供一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码的蛋白质。
同时，本发明还要提供该磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法。
本发明所提供的花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，它来自花生(Arachis hypogaea)，命名为AhPEPC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因编码的蛋白质，它来自花生(Arachis hypogaea)，命名为AhPEPC蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
上述花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC)的克隆方法，包括如下步骤：
(1)选用E11花生种子置于研钵中，室温下加入0.5ml植物RNA提取试剂(可使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAplant试剂)，充分研磨后，转移至1.5ml EP管中，振荡至彻底混匀，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量；
(2)根据已经扩增的花生AhPEPC部分序列(1331bp)，设计引物：
GSP1：5-GGAGTTCATCAGCACGAACACGAGGC-3
GSP2：5-CAGAGGAGGGACTGTTGGAAGAGGAG-3
以获得的总RNA为模板，经反转录合成5’-RACE-Ready cDNA和3’-RACE-Ready cDNA，用高保真Taq酶进行PCR扩增。
5’-RACE的PCR程序如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃15min；
3’-RACE的PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸2min，27个循环后，72℃15min；
PCR产物回收后克隆至pMD18-T载体，委托上海英骏公司测序后获得AhPEPC的5’端序列和3’端序列。
(3)根据已经获得的AhPEPC基因的5’端序列和3’端序列，设计两端引物：
fPEPC5：5′-AGTTTTTTGTGAGGAAGGAC-3′
fPEPC3：5′-CAGCAGACATCATAGAATAG-3′
以步骤(2)获得的5’-RACE-Ready cDNA为模板，用高保真Taq酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4min，94℃变性45s，57℃复性50s，72℃延伸3min20s，30个循环后，72℃15min，最终将PCR产物进行克隆、测序获得了花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的全长cDNA序列，。
本发明公开了一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC)的核苷酸序列及其编码的蛋白质。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是调控花生籽粒蛋白质/油脂含量比例的关键酶，该酶活性的降低可能使花生中脂肪含量增加。花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC基因)，来自花生(Arachis hypogaea)，该基因沉默，可提高花生脂肪酸含量，以进行花生品质改良。本发明提供的AhPEPC基因来自花生，在不同脂肪含量的花生品种中，在转录水平上表达差异明显，具有适合于花生等双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物，如水稻、玉米、小麦等之外更加适合于大豆、棉花、烟草等双子叶植物。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1
花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因AhPEPC的分子克隆
选用花生品种E11的种子(不多于0.1克)于研钵中，室温下加入0.5ml植物RNA提取试剂(天根生化科技(北京)有限公司的RNAplant试剂)，充分研磨，转移至1.5mL EP管中，振荡至彻底混匀，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，经反转录合成5’-RACE-Ready cDNA和3’-RACE-Ready cDNA，利用RACE技术获得了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的5’端序列和3’端序列。根据磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的5’端序列和3’端序列设计两端引物：
fPEPC5：5′-AGTTTTTTGTGAGGAAGGAC-3′
fPEPC3：5′-CAGCAGACATCATAGAATAG-3′
采用RT-PCR方法进行cDNA克隆，PCR反应程序为：94℃预变性4分钟，94℃变性45s，57℃复性50s，72℃延伸3min20s，30个循环后，72℃15min，最终将PCR产物进行克隆、测序获得了花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的全长cDNA序列。
实施例2
AhPEPC的序列信息与特性分析
本发明的AhPEPC全长3151bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其第一个开放阅读框位于25-2931处。DNAssist软件分析表明AhPEPC共编码968个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。利用MOTIFSCAN软件分析，其氨基酸序列含有两个大的PEPC活性位点，分别位于171～182氨基酸位点和594～606氨基酸位点。
实施例3
AhPEPC的表达研究
利用花生AhPEPC基因部分序列设计引物，采用半定量RT-PCR技术，分析不同脂肪含量花生品种间的表达差异。以18SrRNA基因(A.S.Bhagwat，T.G.Krishna，N.Jawali，R.K.Mitra.Cloning andcharacterisation of a ribosomal RNA gene repeat unit fromgroundnut，2001)的表达作为内参，结果表明，AhPEPC基因在转录水平上在花生脂肪含量不同品种间表达差异明显，高油花生品种中该基因表达水平低。
上述实施例表明本发明中克隆的花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC)，是首次从双子叶植物花生(Arachis hypogaea)中分离获得。mRNA表达分析表明AhPEPC在检测的不同脂肪含量花生品种间表达差异明显，高油花生品种中该基因表达水平低，因此可利用基因工程进行花生品质改良。
本发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：3151bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：968 a.a
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
序列表
<110>山东省花生研究所
<120>花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法
<160>2
<210>1
<211>3151
<212>DNA
<213>花生
<400>1
agttttttgt gaggaaggac taagatggca gctactagta ggaacattga gaagatggct 60
tcaattgatg ctcagctgag gttgctggca ccaaggaagg tttctgatga tgacaagctt 120
gttgagtatg atgctttgtt gcttgatcga ttccttgaca ttcttcagga tttgcatggt 180
gaagatatca ggcaaacggt tcaagattgt tatgagcttt cagctgagta tgaagggaag 240
cataagactg agaagttgga ggaacttggg aatatgctaa ctggtcttga tgctggggat 300
tctattgtca ttgccaaatc attttcccac atgcttaatt tggctaactt ggcagaagaa 360
gtccaaattg cctaccgaag aaggattaaa ctattaaaga agggcgattt tgctgatgag 420
aaccctgcca tcactgaatc tgacattgaa gaaaccttca agaggcttgt gactgaactg 480
aagaagtccc cacaggaagt gtttgatgcc ttgaagaacc aaactgtaga tttggtccta 540
actgctcatc ccactcagtc cattcgtcga tctctgctgc aaaagcatgg aagggtaagg 600
aactgtctga cacagttgta tgcaaaagac ataacaccgg atgataagca ggaacttgat 660
gaggctctcc aaagagagat tcaagctgca tttcgcacag atgaaattcg aaggagtcct 720
ccgacaccac aagatgagat gagggcagga atgagctact ttcatgagac aatatggaaa 780
ggtgtaccaa agtttttgcg ccgtgttgac acagctctga agaacatcgg aataaatgag 840
cgtgtcccat acaatgcccc tcttattcaa ttctcttctt ggatgggagg agatcgtgat 900
ggtaacccta gggtaacccc tgaagttaca agggatgtgt gtttgctggc tagaatgatg 960
gctgctaatt tatacttctc tcagatagaa gatctcatgt ttgagctgtc tatgtggcgc 1020
tgcaatgatg agcttcgtgt tcgtgctgat gaactccatg tgtcctcaag gagagatgca 1080
aaacattaca ttgaattttg gaagcagatt cctccaaatg agccatatcg tgttattctt 1140
ggtgatgtga gggacaaact atacaataca cgcgaacgtg ctcgccagtt attagccaat 1200
ggaacctctg acatccccga agagacaacc ttcacaaatg ttgagcagtt cctggagccc 1260
ctcgaactct gctatagatc actctgcgca tgtggtgacc gaccaatagc agatggtagc 1320
cttcttgatt tcttgcggca agtttccaca tttggactct caatggtaag actcgacatt 1380
cgtcaagagt cagaccggca cactgatgtc atggatgcca ttaccaaaca cttggagatt 1440
ggatcatacc gagagtggtc tgaggaacgc aggcaggaat ggcttctgtc agagctcagt 1500
ggaaagcgcc ctctgttcgg ccctgatctt cccaaaacag aagagatcgc cgatgttctg 1560
gaaaccttcc atgtcattgc agaacttccc tcagacaact ttggtgccta cataatctca 1620
atggcaacag caccgtctga tgtgcttgct gttgagctct tacaacggga atgccatgtg 1680
aagcaaccgc taagggttgt gccattgttt gaaaagcttg ctgatcttga gtctgctcct 1740
gctgcagtgg cgcggctttt ctctattgat tggtacagaa accgaatcaa tgggaggcaa 1800
gaagttatga taggatactc agactcagga aaagatgccg gtcgtctttc tgcggcttgg 1860
gcgctgtaca aggctcaaga ggagctcata aaggttgcga aggatttcgg tgttaagctg 1920
acaatgttcc atggcagagg agggactgtt ggaagaggag gcggccccac tcaccttgct 1980
atattatctc agccaccaga aaccattcat ggctcacttc gggtgacagt tcaaggtgaa 2040
gttattgaac aatcctttgg agaggagcac ttgtgcttta gaactctcca gcgattcact 2100
gctgctacac ttgagcacgg aatgcaccct cccgtgtcac ccaaaccgga atggcgagtg 2160
ctgctagatg agatggctgt cattgcaacg aaggagtatc gctccattgt tttccaggaa 2220
ccccgttttg ttgaatactt ccgatgtgct acccctgagt tggagtatgg acgaatgaac 2280
attggaagtc gtccatcaaa gagaaagccg agtggaggaa tcgaatcact gcgtgctatt 2340
ccatggattt ttgcttggac acaaacaagg tttcatttgc cagtgtggct tggctttggt 2400
tctgcattta agcatgcaat tgagaaggat ccaaagaatc tcctaatgct tcaggatatg 2460
tacaaccagt ggcctttctt cagggtcacc ctggacttga tcgagatggt gttcgccaag 2520
ggagacccgg ggatcgcttc cctgtacgac aaactcctag tgtcagaaga gctgttgcca 2580
ttcggagagc gcttgaggac taaatatgaa gaaaccaaga gttttctcct taaggttgct 2640
gggcacaggg atcttcttga aggtgacccc tacttgaagc aaaggcttcg tctccgcgat 2700
tcatacatca caaccctgaa tgtgttacaa gcctacacgt tgaagagaat ccgcgacccc 2760
gactaccatg tcaagttgag gccacatttg tcaaaggaat tcatggaatc aaacaagcca 2820
gctgcagaac ttgttaaact caacccaaaa agtgagtatg ctcctggttt ggaggacaca 2880
cttatcttga caatgaaggg tattgctgct ggcatgcaaa acacaggtta agaagctgaa 2940
aaaaattggc attttttttt tggttatgtc agtggatatg taaacattgt ataacctatt 3000
ctatgatgtc tgctggatat ttagatcagc atcatatgac tgtgtcgcta atactattgt 3060
tatttatata ataagacttt gatcctttat gatggcatat ttggttaaaa aaaaaaaaaa 3120
aaaaaaaaaa aaaagtactc tgcgttgata c 3151
<210>2
<211>968
<212>PRT
<213>花生
<400>2
Met Ala Ala Thr Ser Arg Asn Ile Glu Lys Met Ala Ser Ile Asp Ala
1 5 10 15
Gln Leu Arg Leu Leu Ala Pro Arg Lys Val Ser Asp Asp Asp Lys Leu
20 25 30
Val Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Leu Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln
35 40 45
Asp Leu His Gly Glu Asp Ile Arg Gln Thr Val Gln Asp Cys Tyr Glu
50 55 60
Leu Ser Ala Glu Tyr Glu Gly Lys His Lys Thr Glu Lys Leu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Gly Asn Met Leu Thr Gly Leu Asp Ala Gly Asp Ser Ile Val Ile
85 90 95
Ala Lys Ser Phe Ser His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu
100 105 110
Val Gln Ile Ala Tyr Arg Arg Arg Ile Lys Leu Leu Lys Lys Gly Asp
115 120 125
Phe Ala Asp Glu Asn Pro Ala Ile Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr
130 135 140
Phe Lys Arg Leu Val Thr Glu Leu Lys Lys Ser Pro Gln Glu Val Phe
145 150 155 160
Asp Ala Leu Lys Asn Gln Thr Val Asp Leu Val Leu Thr Ala His Pro
165 170 175
Thr Gln Ser Ile Arg Arg Ser Leu Leu Gln Lys His Gly Arg Val Arg
180 185 190
Asn Cys Leu Thr Gln Leu Tyr Ala Lys Asp Ile Thr Pro Asp Asp Lys
195 200 205
Gln Glu Leu Asp Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg
210 215 220
Thr Asp Glu Ile Arg Arg Ser Pro Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg
225 230 235 240
Ala Gly Met Ser Tyr Phe His Glu Thr Ile Trp Lys Gly Val Pro Lys
245 250 255
Phe Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asn Glu
260 265 270
Arg Val Pro Tyr Asn Ala Pro Leu Ile Gln Phe Ser Ser Trp Met Gly
275 280 285
Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp
290 295 300
Val Cys Leu Leu Ala Arg Met Met Ala Ala Asn Leu Tyr Phe Ser Gln
305 310 315 320
Ile Glu Asp Leu Met Phe Glu Leu Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu
325 330 335
Leu Arg Val Arg Ala Asp Glu Leu His Val Ser Ser Arg Arg Asp Ala
340 345 350
Lys His Tyr Ile Glu Phe Trp Lys Gln Ile Pro Pro Asn Glu Pro Tyr
355 360 365
Arg Val Ile Leu Gly Asp Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu
370 375 380
Arg Ala Arg Gln Leu Leu Ala Asn Gly Thr Ser Asp Ile Pro Glu Glu
385 390 395 400
Thr Thr Phe Thr Asn Val Glu Gln Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys
405 410 415
Tyr Arg Ser Leu Cys Ala Cys Gly Asp Arg Pro Ile Ala Asp Gly Ser
420 425 430
Leu Leu Asp Phe Leu Arg Gln Val Ser Thr Phe Gly Leu Ser Met Val
435 440 445
Arg Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Asp Arg His Thr Asp Val Met Asp
450 455 460
Ala Ile Thr Lys His Leu Glu Ile Gly Ser Tyr Arg Glu Trp Ser Glu
465 470 475 480
Glu Arg Arg Gln Glu Trp Leu Leu Ser Glu Leu Ser Gly Lys Arg Pro
485 490 495
Leu Phe Gly Pro Asp Leu Pro Lys Thr Glu Glu Ile Ala Asp Val Leu
500 505 510
Glu Thr Phe His Val Ile Ala Glu Leu Pro Ser Asp Asn Phe Gly Ala
515 520 525
Tyr Ile Ile Ser Met Ala Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu
530 535 540
Leu Leu Gln Arg Glu Cys His Val Lys Gln Pro Leu Arg Val Val Pro
545 550 555 560
Leu Phe Glu Lys Leu Ala Asp Leu Glu Ser Ala Pro Ala Ala Val Ala
565 570 575
Arg Leu Phe Ser Ile Asp Trp Tyr Arg Asn Arg Ile Asn Gly Arg Gln
580 585 590
Glu Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu
595 600 605
Ser Ala Ala Trp Ala Leu Tyr Lys Ala Gln Glu Glu Leu Ile Lys Val
610 615 620
Ala Lys Asp Phe Gly Val Lys Leu Thr Met Phe His Gly Arg Gly Gly
625 630 635 640
Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln
645 650 655
Pro Pro Glu Thr Ile His Gly Ser Leu Arg Val Thr Val Gln Gly Glu
660 665 670
Val Ile Glu Gln Ser Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe Arg Thr Leu
675 680 685
Gln Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Val
690 695 700
Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Val Leu Leu Asp Glu Met Ala Val Ile
705 710 715 720
Ala Thr Lys Glu Tyr Arg Ser Ile Val Phe Gln Glu Pro Arg Phe Val
725 730 735
Glu Tyr Phe Arg Cys Ala Thr Pro Glu Leu Glu Tyr Gly Arg Met Asn
740 745 750
Ile Gly Ser Arg Pro Ser Lys Arg Lys Pro Ser Gly Gly Ile Glu Ser
755 760 765
Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala Trp Thr Gln Thr Arg Phe His
770 775 780
Leu Pro Val Trp Leu Gly Phe Gly Ser Ala Phe Lys His Ala Ile Glu
785 790 795 800
Lys Asp Pro Lys Asn Leu Leu Met Leu Gln Asp Met Tyr Asn Gln Trp
805 810 815
Pro Phe Phe Arg Val Thr Leu Asp Leu Ile Glu Met Val Phe Ala Lys
820 825 830
Gly Asp Pro Gly Ile Ala Ser Leu Tyr Asp Lys Leu Leu Val Ser Glu
835 840 845
Glu Leu Leu Pro Phe Gly Glu Arg Leu Arg Thr Lys Tyr Glu Glu Thr
850 855 860
Lys Ser Phe Leu Leu Lys Val Ala Gly His Arg Asp Leu Leu Glu Gly
865 870 875 880
Asp Pro Tyr Leu Lys Gln Arg Leu Arg Leu Arg Asp Ser Tyr Ile Thr
885 890 895
Thr Leu Asn Val Leu Gln Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro
900 905 910
Asp Tyr His Val Lys Leu Arg Pro His Leu Ser Lys Glu Phe Met Glu
915 920 925
Ser Asn Lys Pro Ala Ala Glu Leu Val Lys Leu Asn Pro Lys Ser Glu
930 935 940
Tyr Ala Pro Gly Leu Glu Asp Thr Leu Ile Leu Thr Met Lys Gly Ile
945 950 955 960
Ala Ala Gly Met Gln Asn Thr Gly
965
Claims (3)
1.一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法，包括如下步骤：
(1)选用E11花生种子置于研钵中，室温下加入0.5ml植物RNA提取试剂，充分研磨后，转移至1.5ml EP管中，振荡至彻底混匀，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量；
(2)根据已经扩增的花生AhPEPC部分序列，设计引物：
GSP1：5-GGAGTTCATCAGCACGAACACGAGGC-3
GSP2：5-CAGAGGAGGGACTGTTGGAAGAGGAG-3
以获得的总RNA为模板，经反转录合成5’-RACE-Ready cDNA和3’-RACE-Ready cDNA，用高保真Taq酶进行PCR扩增；
5’-RACE的PCR程序如下：94℃预变性4min，94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃ 15min；
3’-RACE的PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸2min，27个循环后，72℃ 15min；
PCR产物回收后克隆至pMD18-T载体，测序后获得AhPEPC的5’端序列和3’端序列；
(3)根据已经获得的AhPEPC基因的5’端序列和3’端序列，设计两端引物：
fPEPC5：5′-AGTTTTTTGTGAGGAAGGAC-3′
fPEPC3：5′-CAGCAGACATCATAGAATAG-3′
以步骤(2)获得的5’-RACE-Ready cDNA为模板，用高保真Taq酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性45s，57℃复性50s，72℃延伸3min20s，30个循环后，72℃ 15min，最终将PCR产物进行克隆、测序获得了花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的全长cDNA序列。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063046A (zh) * | 2015-08-04 | 2015-11-18 | 山西省农业科学院作物科学研究所 | 一种籽粒苋的绿色组织特异启动子及其应用 |
| CN108624578A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-10-09 | 中山大学 | 花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的应用 |
-
2008
- 2008-01-23 CN CNA2008100027954A patent/CN101230353A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063046A (zh) * | 2015-08-04 | 2015-11-18 | 山西省农业科学院作物科学研究所 | 一种籽粒苋的绿色组织特异启动子及其应用 |
| CN105063046B (zh) * | 2015-08-04 | 2017-11-28 | 山西省农业科学院作物科学研究所 | 一种籽粒苋的绿色组织特异启动子及其应用 |
| CN108624578A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-10-09 | 中山大学 | 花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的应用 |
| CN108624578B (zh) * | 2018-06-25 | 2021-09-28 | 中山大学 | 花生AhPEPC5基因片段在提高微生物对渗透胁迫与盐胁迫耐受能力中的应用 |
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