CN110846293B

CN110846293B - 一种溶血磷脂酸酰基转移酶

Info

Publication number: CN110846293B
Application number: CN201911211450.4A
Authority: CN
Inventors: 郭溆; 孙金月; 王新坤; 刘超; 王青
Original assignee: INSTITUTE OF AGRO-FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF AGRO-FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN110846293A

Abstract

本发明提供了一种溶血磷脂酸酰基转移酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核酸序列如SEQ ID NO:2所示。可将所述溶血磷脂酸酰基转移酶转入适当的载体并构建工程菌，并生产溶血磷脂酸酰基转移酶、生产sn‑2位不饱和甘油三酯，还能够提高植物种子中油脂含量。

Description

一种溶血磷脂酸酰基转移酶

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种溶血磷脂酸酰基转移酶及其基因。

背景技术

γ-亚麻酸在植物种子中主要以三酰甘油（triacylglycerol, TAG）的形式进行贮藏。TAG的生物合成发生在内质网膜上，通过Kennedy途径中的甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT）和二酰甘油酰基转移酶（DGAT）3种酰基转移酶调控，由游离脂肪酸和甘油组装而成。其中，溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT，EC2.3.1.51）是TAG组装过程中的第二个酰基转移酶，主要催化sn-2位点的酰基化反应，使溶血磷脂酸（LPA）酰基化形成磷脂酸（PA），PA可以继续进行脱磷酸反应进入TAG合成，也可以进入磷脂合成途径参与生物膜结构的形成。在植物中，TAG的不饱和脂肪酸通常位于sn-2位，这是因为LPAT具有底物选择特异性，可以在sn-2位上优先转移不饱和酰基链。LPAT活性的提高还可以减轻TAG合成过程中的反馈抑制作用，是TAG生物合成中的一个潜在限速步骤，过表达LPAT基因可以显著提高种子的含油量。因此，LPAT逐渐成为利用基因工程改良种子油脂组成、降低饱和脂肪酸比例和提高含油量等方面的研究热点。

琉璃苣（Borago officinalis L.）为紫草科（Boraginaceae）琉璃苣属（Borago）一年生草本植物，原产于地中海沿岸和小亚细亚，近年来引入我国，已取得一定的社会和经济效益。琉璃苣的幼嫩茎叶脆而多汁，有黄瓜香味，可用作蔬菜。花通常蓝色，有很高的观赏价值，并可制作糖果、蜜饯或加入色拉、果汁饮料中。种子油脂含量丰富，具有脂肪酸组成特殊、不饱和脂肪酸含量高、含有生物活性物质等特点，对人体的新陈代谢有较好的调节作用。其中γ-亚麻酸含量约为25%，是天然植物油中含量最高的，是常用γ-亚麻酸来源植物月见草油（Oenothera spp.）的2-2.5倍。作为一种人体无法合成的一种必需脂肪酸，γ-亚麻酸具有降血脂、杀菌、抗炎、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗糖尿病，治疗哮喘、溃疡、特应性皮炎，以及减肥、美容等一系列生物学功能，是医药、高级营养食品、化妆品等三大领域多系列产品的主要原料，备受国内外营养及临床学界的广泛关注，市场需求广阔。然而，目前琉璃苣中还没有LPAT基因克隆及功能研究的报导。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明克隆了琉璃苣中的LPAT基因，可用于提高琉璃苣种子中γ-亚麻酸的油脂含量，提高琉璃苣的抗逆性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT），其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

优选的，所述溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因，简称BoLPAT基因，如SEQ ID NO:2所示。

上述溶血磷脂酸酰基转移酶编码基因在生产溶血磷脂酸酰基转移酶的应用、在生产sn-2位不饱和甘油三酯中的应用或提高植物种子，尤其是琉璃苣种子中油脂含量中的应用。

上述溶血磷脂酸酰基转移酶在生产sn-2位不饱和甘油三酯中的应用。

所述溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因可以通过现有技术获得相应的载体转染到适当的原核或真核微生物中，如大肠杆菌、农杆菌或者酵母，获得能够表达该溶血磷脂酸酰基转移酶的工程菌，通过发酵获得该溶血磷脂酸酰基转移酶，该酶可以用于催化底物合成sn-2位不饱和甘油酯；或者通过在发酵过程中添加适当的底物使工程菌发酵获得sn-2位不饱和甘油酯。

所述溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因还可以用于提高植物种子中油脂含量，尤其是sn-2位不饱和甘油三酯含量。比如，通过适当的诱导条件，增加溶血磷脂酸酰基转移酶基因的表达量；再比如，通过基因工程的手段将植物中的溶血磷脂酸酰基转移酶基因加倍，获得溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达量高的转基因作物，从而提高植物种子中油脂含量，特别是sn-2位不饱和甘油三酯含量。优选的，所述诱导条件为水渍或缺氧胁迫、干旱胁迫、高盐胁迫或生长调节剂处理。所述生长调节剂选自生长素类、细胞分裂素类或脱落酸类中的至少一种。

一种包含如权利要求1所述的溶血磷脂酸酰基转移酶的转基因植物。所述植物可以是双子叶植物或单子叶植物。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种溶血磷脂酸酰基转移酶及其编码基因。该酶和基因能够用于提高植物种子中油脂含量。

附图说明

图1为BoLPAT基因克隆的凝胶电泳图，M-DL2000，S-BoLPAT；

图2为LPAT的聚类分析图；

图3为BoLPAT酵母表达载体构建示意图；

图4为BoLPAT基因在琉璃苣叶片中受H₂O（图4A）、NaCl（图4B）、6-BA（图4C）、ABA（图4D）和PEG4000（图4E）胁迫处理的不同时间表达变化分析与极差分析（图4F）。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 BoLPAT基因克隆

1. RNA的提取和cDNA的合成

取适量琉璃苣叶片组织材料在液氮中研磨，依据百泰克公司多糖多酚植物RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，利用NanoDrop2000进行含量测定和1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。利用无RNA酶的脱氧核糖核酸酶（DNase）对所提取的RNA进行消化，去除样品中的脱氧核糖核酸（DNA）。利用TaKaRa公司PrimeScript反转录酶将RNA反转录为第一链互补链DNA（cDNA）。反转录的反应条件及程序均按照Takara公司的PrimeScript反转录试剂盒说明书进行。将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用。

基因克隆

通过RT-PCR对BoLPAT进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为Pyrobest polymerase( TaKaRa )，反应体系如下：cDNA 4.0 μL，10×Pyrobest Buffer 5 μL，2 mmol·L⁻¹dNTP 2μL，Pyrobest 酶0.5 μL，10 μmol上下游引物各2.0 μL，终体积为50 μL。反应程序：94 ℃预变性7min，然后进行30个循环：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，循环结束后72 ℃ 10min延伸反应，4 ℃保温。扩增基因全长所用引物为：

BoLPAT-FP：5’-ATGTCGATTGCAGCAGC-3’（SEQ ID NO: 3）；

BoLPAT-RP：5’-CTACAGTTGTTTATCTTCCGAG-3’（SEQ ID NO: 4）。

以1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图1所示，其产物大小为1164 bp，对扩增所得目的片段进行切胶回收。将回收的PCR产物与测序载体pMD19-T (TaKaRa)连接后，转化DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上进行筛选，再经菌落PCR检测后选择阳性克隆进行测序，其核酸序列如SEQ ID NO: 2所示，可以编码如SEQ ID NO: 1所示的长度为387的氨基酸序列。将该基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与紫草科蓝蓟（Echium pitardii）的同源性为86.7%，将该基因命名为BoLPAT。

从NCBI的非冗余蛋白数据库（Nr）中选取与BoLPAT基因编码蛋白相似性较高的10条蛋白序列，分别来自蓝蓟Echium pitardii（AGO14580.1和AGO14579.1）、醉蝶花Tarenaya hassleriana（XP_010554846.1）、蓝果树Nyssa sinensis（KAA8518214.1）、克莱门柚Citrus clementina（XP_006421453.1）、荔枝Litchi chinensis （AXM43882.1）、角豆树Prosopis alba（XP_028808735.1）、温州蜜柑Citrus unshiu（GAY61112.1）、绿豆Vigna radiata var. Radiata（XP_014513776.1）、茶树Camellia sinensis（XP_028114840.1）。通过MEGA4.0软件构建NJ系统进化树，结果如图2所示。

实施例2 BoLPAT基因的表达与功能

1. YES2.0重组载体构建

以BoLPAT全长cDNA序列为模板设计引物，经酶切位点分析后，在其两端加上酶切位点和保护碱基，载体构建图谱如图3所示。引物序列为：

BoLPATy-FP（BamH I）：5’-CGCGGATCCATGTCGATTGCAGCAGC’（SEQ ID NO: 5）；

BoLPATy-RP（EcoR I）：5’-GGAATTCCAGTTGTTTATCTTCCGAG-3’（SEQ ID NO: 6）

分别对YES2.0载体质粒和BoLPAT基因的PCR扩增产物进行酶切，双酶切体系为（10μL）：10× K buffer 1μL，DNA 5μL，Sac I 0.2μL，EcoR I 0.2μL，ddH₂O 3.6μL，37℃反应过夜。

回收酶切产物，T4连接酶连接目标片段连及YES2.0载体大片段。连接体系为（10μL）：vector 1μL，insert DNA 3μL，10×buffer 1μL，T4 Ligease 0.5μL，ddH₂O 4.5μL，37℃反应过夜。将连接产物转入DH5α，检测后提取质粒，采用LiAc的方法转化酵母INVSC。

酵母转化及诱导表达

将阳性酵母菌株涂布于SD-Ura平板上，30℃倒置培养3天后，挑酵母单菌落，悬浮在无葡萄糖的D-半乳糖YPDA培养液中，30℃振荡培养48小时。

酵母脂肪酸组成检测

离心收集菌体并烘干至恒重，研磨破开细胞壁；精确称量50mg样品，装入有盖子的玻璃试管中，依次加入2mL 5% 硫酸/甲醇、25μL 0.2% BHT/甲醇、300μL甲苯溶液，轻轻振荡、混匀，将盖子拧紧后70℃水浴90min，冷却至室温。加入200μL十七烷酸甲酯（5mg/mL）作为内标，再加入2mL 0.9% NaCl、1mL正己烷，涡流振荡混匀后，3000rpm离心5min，取上清到自动进样瓶中，使用Agilent 7890A进行气相色谱分析。

色谱条件如下：

AT-FFA色谱柱（30m×0.25mm×0.25µm）；

进样口温度：260℃；分流比：30:1；

柱流速（N₂）：5mL/min，恒流模式；

FID温度：260℃；

H₂流速：25mL/min；

空气流速：300mL/min；

尾吹气（N₂）流速：20mL/min；

柱温程序：初始温度170℃，以20℃/min 速度升温至230℃，保持25 min。

结果分析

结果如表1所示：

表

转化BoLPAT融合表达载体和空载体YES2.0后酵母的脂肪酸组成

根据表1可知，转化BoLPAT菌株的脂肪酸含量显著高于对照菌株，提高了近50%；并且能够提高C16:1、C18:1的含量，不饱和脂肪酸的含量由60.93%提高到71.76%。

实施例3 通过诱导BoLPAT基因提高增加琉璃苣种子中油脂含量

1. 实验材料

将琉璃苣种于育苗盆中，待长出4-5片真叶时用于NaCl、PEG-4000、水渍、6-BA和ABA处理。分别提取处理后琉璃苣叶片RNA进行定量RT-PCR分析，各处理取样时间段分别为处理后0、3、6、12和24 h。水渍处理是将育苗钵浸泡至清水中，水面淹没油菜根部；干旱胁迫是用20% PEG-4000溶液喷洒油菜叶面浇灌根部；盐胁迫是以300 mmol·L^-1 NaCl溶液喷洒叶面和浇灌根部；植物生长调节剂处理是分别将浓度为0.1 mg·L^-1 6-BA和3 mg·L^-1 ABA溶液喷洒叶面和浇灌根部。叶面喷洒量为每株2 mL，根部浇灌量即将育苗钵中土壤浇透。所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。

表达分析

利用实时荧光定量PCR的方法检对BoLPAT基因进行表达分析，仪器采用美国ABI7500实时PCR检测系统。实时PCR检测的反应体系如下：2×SYBR^® PremixEx Taq^TM 10 μL；正反向引物浓度均为0.2 μmol·L⁻¹；cDNA模板1 μL；加水补足至25 μL，每个反应体系至少重复3次。实时PCR扩增程序如下：95 ℃ 30 s，以下反应40个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34s，循环结束。实时PCR反应均以18s为内参基因。

BoLPAT荧光定量验证用的引物序列为：

QBoLPAT-FP：5’-AGTTGGGCGAAGGATGAAAGC-3’（SEQ ID NO: 7）；

QBoLPAT-RP：5’-AACATTGTAGGTGGAGGCGAAG-3’（SEQ ID NO: 8）；

内参基因18s所用引物序列为：

Q18s-FP：5’-GAGAAACGGCTACCACATCCAA-3’（SEQ ID NO: 9）

Q18s-RP：5’-AGAAGAGACAAGACAATCGGTGC-3’（SEQ ID NO: 10）。

琉璃苣种子脂肪酸组成分析

取琉璃苣种子，冷冻干燥至恒重，并粉碎，精确称量50mg样品，装入有盖子的玻璃试管中，依次加入2mL 5% 硫酸/甲醇、25μL 0.2% BHT/甲醇、300μL甲苯溶液，轻轻振荡、混匀，将盖子拧紧后70℃水浴90min，冷却至室温。加入200μL十七烷酸甲酯（5mg/mL）作为内标，再加入2mL 0.9% NaCl、1mL正己烷，涡流振荡混匀后，3000rpm离心5min，取上清到自动进样瓶中，做色谱分析。

按照实施例2第3部分中的方法，以气相色谱检测上述不同条件获得的琉璃苣种子油脂中脂肪酸组成。

数据分析

通过极差比较NaCl、PEG-4000、水渍、6-BA和ABA对BoLPAT表达的影响，极差= (最大值表达值-最小值表达值)/初始表达值，进行极差分析前，将所有处理的初始表达值定义为“1”。

结果分析

（1）表达量

通过荧光定量PCR验证了BoLPAT在水渍、干旱、高盐和生长调节剂的胁迫下的表达模式，结果表明该基因在四种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高（图4）。从图4可以看出，BoLPAT在水渍、干旱、高盐和生长调节剂处理的叶片中表达量均有明显提高（图4A、B、C、D、E），极差比分表明该基因对高盐胁迫最敏感（图4F）。以上结果表明逆境胁迫会提高琉璃苣体内与脂肪酸合成相关的BoLPAT基因的表达量。

（2）脂肪酸组成

如表2所示，与未处理的琉璃苣种子相比较，经过逆境胁迫处理后种子不饱和脂肪的含量会有所提高。其中经NaCl处理后，种子中C18:1的含量提高了28.90%；经干旱处理后种子中C18:1的含量提高了21.30%；水渍处理后种子中C18:1的含量提高了14.55%；经6-BA处理后C18:3的含量提高了21.53%；经ABA处理后C18:1的含量提高了49.74%。可见，逆境处理能够提高琉璃苣种子相对短链不饱和脂肪酸的含量。

表2 琉璃苣种子脂肪酸组成

。

序列表

<110> 山东省农业科学院农产品研究所

<120> 一种溶血磷脂酸酰基转移酶

<130> 20191119

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1164

<212> DNA

<213> Borago officinalis

<400> 1

atgtcgattg cagcagctgc tgttgtagtt ccactgggag ttctcttctt tatttctggc 60

ttatgcgtta atctcattca ggcagtcttt tttatttgtg tacgcccagt gtcaaggaac 120

acttacagga agataaacag gtgggtggca gagctaatgt ggttggagct tgtttggatc 180

attgactggt gggctggtgt taggattcaa ttgttcactg atgcggaaac ctttcactta 240

atgggtgaag aacacgcttt gctcatatgt aatcacagga gtgatattga ctggctcgta 300

ggatgggttt tagcgcagag atccggatgc ctcggtagta ctttagctgt gatgaagaaa 360

tcatcaaaat tccttccagt aattggctgg tctatgtggt tttctgagta tctctttctt 420

gaaagaagtt gggcgaagga tgaaagcaca ttgaagcttg gtcttcaacg tcttaaggac 480

tttcctcaac ccttctggct tgctcttttt gttgagggaa cccgctttac acaggcaaag 540

cttaaatccg ctcaggaata tgcaacttcc acaggcttgc caattccaaa aaatgttttg 600

attcctcgta ctaagggttt tgttacagct gtgagtcaca tgcgctcgtt tgttccagct 660

atttatgata taacagtttc aattccaaaa acttcgcctc cacctacaat gttaagactc 720

tttaaagggc agtcttctgt ggtacatgtc caccttaaga ggcatctcat gaaaaatttg 780

ccagaagacg atgatgctgt tgctcagtgg tgtaaagata tttttgtggc caaggataag 840

ttgttggaca agcatataac agaggacaca ttcagtgacc aaccacaaca aaatattggc 900

cgtcctttga aatctcttgt ggtggttacc tgttggggat gcctgctaat tttagggacc 960

atcaagtttc tccaacggtc catgcttctg tcttcatgga aggggcgtgt gttttcaatg 1020

gttggggtcg gagcaattac gtttctcatg catttcttga ttcagttctc tcagtcggaa 1080

cgctcaactc cggctaaggt tgtccccagg aagccaaaga gtggaggcaa ttcttccaat 1140

tcctcggaag ataaacaact gtag 1164

<210> 2

<211> 387

<212> PRT

<213> Borago officinalis

<400> 2

Met Ser Ile Ala Ala Ala Ala Val Val Val Pro Leu Gly Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Ile Ser Gly Leu Cys Val Asn Leu Ile Gln Ala Val Phe Phe Ile

20 25 30

Cys Val Arg Pro Val Ser Arg Asn Thr Tyr Arg Lys Ile Asn Arg Trp

35 40 45

Val Ala Glu Leu Met Trp Leu Glu Leu Val Trp Ile Ile Asp Trp Trp

50 55 60

Ala Gly Val Arg Ile Gln Leu Phe Thr Asp Ala Glu Thr Phe His Leu

65 70 75 80

Met Gly Glu Glu His Ala Leu Leu Ile Cys Asn His Arg Ser Asp Ile

85 90 95

Asp Trp Leu Val Gly Trp Val Leu Ala Gln Arg Ser Gly Cys Leu Gly

100 105 110

Ser Thr Leu Ala Val Met Lys Lys Ser Ser Lys Phe Leu Pro Val Ile

115 120 125

Gly Trp Ser Met Trp Phe Ser Glu Tyr Leu Phe Leu Glu Arg Ser Trp

130 135 140

Ala Lys Asp Glu Ser Thr Leu Lys Leu Gly Leu Gln Arg Leu Lys Asp

145 150 155 160

Phe Pro Gln Pro Phe Trp Leu Ala Leu Phe Val Glu Gly Thr Arg Phe

165 170 175

Thr Gln Ala Lys Leu Lys Ser Ala Gln Glu Tyr Ala Thr Ser Thr Gly

180 185 190

Leu Pro Ile Pro Lys Asn Val Leu Ile Pro Arg Thr Lys Gly Phe Val

195 200 205

Thr Ala Val Ser His Met Arg Ser Phe Val Pro Ala Ile Tyr Asp Ile

210 215 220

Thr Val Ser Ile Pro Lys Thr Ser Pro Pro Pro Thr Met Leu Arg Leu

225 230 235 240

Phe Lys Gly Gln Ser Ser Val Val His Val His Leu Lys Arg His Leu

245 250 255

Met Lys Asn Leu Pro Glu Asp Asp Asp Ala Val Ala Gln Trp Cys Lys

260 265 270

Asp Ile Phe Val Ala Lys Asp Lys Leu Leu Asp Lys His Ile Thr Glu

275 280 285

Asp Thr Phe Ser Asp Gln Pro Gln Gln Asn Ile Gly Arg Pro Leu Lys

290 295 300

Ser Leu Val Val Val Thr Cys Trp Gly Cys Leu Leu Ile Leu Gly Thr

305 310 315 320

Ile Lys Phe Leu Gln Arg Ser Met Leu Leu Ser Ser Trp Lys Gly Arg

325 330 335

Val Phe Ser Met Val Gly Val Gly Ala Ile Thr Phe Leu Met His Phe

340 345 350

Leu Ile Gln Phe Ser Gln Ser Glu Arg Ser Thr Pro Ala Lys Val Val

355 360 365

Pro Arg Lys Pro Lys Ser Gly Gly Asn Ser Ser Asn Ser Ser Glu Asp

370 375 380

Lys Gln Leu

385

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BoLPAT-FP

<400> 3

atgtcgattg cagcagc 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BoLPAT-RP

<400> 4

ctacagttgt ttatcttccg ag 22

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BoLPATy-FP

<400> 5

cgcggatcca tgtcgattgc agcagc 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BoLPATy-RP

<400> 6

ggaattccag ttgtttatct tccgag 26

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> QBoLPAT-FP

<400> 7

agttgggcga aggatgaaag c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> QBoLPAT-RP

<400> 8

aacattgtag gtggaggcga ag 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q18s-FP

<400> 9

gagaaacggc taccacatcc aa 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q18s-RP

<400> 10

agaagagaca agacaatcgg tgc 23

Claims

1.一种溶血磷脂酸酰基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

2.一种如权利要求1所述的溶血磷脂酸酰基转移酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如SEQ ID NO: 1所示。

4.一种包含如权利要求2或3任一所述的溶血磷脂酸酰基转移酶编码基因的载体或工程菌。

5.一种如权利要求2或3任一所述的溶血磷脂酸酰基转移酶编码基因、如权利要求4所述的载体或工程菌在生产溶血磷脂酸酰基转移酶、生产sn-2位不饱和甘油三酯中的应用。

6.一种如权利要求1所述的溶血磷脂酸酰基转移酶在生产sn-2位不饱和甘油三酯中的应用。