CN110129335B

CN110129335B - 葡萄果实成熟相关基因VvNAC及其应用

Info

Publication number: CN110129335B
Application number: CN201910446954.8A
Authority: CN
Inventors: 余义和; 郭大龙; 李红英; 孟祥轩; 杨英军; 张国海
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110129335A

Abstract

本发明涉及葡萄果实成熟相关基因VvNAC及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明中为解析葡萄果实成熟的分子机制并克隆果实成熟相关关键基因，对京秀葡萄不同发育阶段的果实进行转录组测序，在转色期发现一个基因表达量显著增加，该基因具有保守的NAC结构域，命名为VvNAC。本发明中采用农杆菌介导的子叶转化方法将VvNAC基因转化至草莓中，转基因植株果实成熟期提前6‑8 d。说明VvNAC基因及其重组表达载体对于促进果实成熟，调控果实上市时间具有重大的应用价值。

Description

葡萄果实成熟相关基因VvNAC及其应用

技术领域

本发明涉及葡萄果实成熟相关基因VvNAC及其应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

葡萄是一种多年生果树，在世界范围内被广泛栽培利用，主要用于鲜食、制汁、制干和酿酒等，可以创造巨大经济价值。葡萄除味道可口之外，还富含丰富的维生素、矿物质和类黄酮等有益物质而具有保健功能。葡萄中的白藜芦醇具有抗癌、抗氧化和抗炎等功能，对人的健康有益，并且白藜芦醇还是一种植保素，可以在环境胁迫和病原菌入侵过程中由植物自身合成。现在越来越多的人参与到葡萄的研究当中，已经证实葡萄中的白藜芦醇不仅能够提高葡萄对各种胁迫的抗性，而且对人体保健如降血压、抑制血小板聚集防心血管疾病，以及抗氧化、抗肿瘤具有特殊功效。这些研究极大的丰富了葡萄栽培及营养保健的研究内容，促进了葡萄产业的发展。

根据果实在成熟过程中是否有呼吸峰的出现，将果实分为呼吸跃变型和非呼吸跃变型2种类型。迄今，对于跃变型果实成熟的调节与信号转导途径方面的研究已经上取得很大进展，尤其是在番茄上，通过大量的成熟缺陷突变体的研究获得了大量信息。对这些成熟缺陷突变体的研究在基因水平上证明了乙烯是跃变型果实成熟的最基本的信号物质。与这类跃变型果实相比，对非跃变型果实成熟的分子调控机制更是缺乏了解。葡萄作为非跃变型果实，一般认为它的成熟是由ABA调控的，而乙烯只起很小的作用。到目前为止，葡萄果实成熟的分子机制还不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供葡萄果实成熟相关基因VvNAC，该基因在葡萄果实转色期表达量显著增加。

本发明还提供了葡萄果实成熟相关蛋白VvNAC，该蛋白能够促进植物果实成熟。

本发明还提供了包含葡萄果实成熟相关基因VvNAC的重组表达载体，该载体携带葡萄果实成熟相关基因VvNAC，因此能够超表达VvNAC基因，进而促进植物果实成熟。

本发明还提供了上述的包含葡萄果实成熟相关基因VvNAC的重组表达载体的制备方法，能够制得该载体。

本发明还提供了上述的葡萄果实成熟相关基因VvNAC和重组表达载体在植物品种育种中的应用，能够获得植物早熟品种。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

葡萄果实成熟相关基因VvNAC，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为解析葡萄果实成熟的分子机制并克隆果实成熟相关关键基因，对京秀葡萄不同发育阶段的果实进行转录组测序，在转色期发现一个基因表达量显著增加，该基因具有保守的NAC结构域，命名为VvNAC。

葡萄果实成熟相关基因VvNAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的核苷酸序列为葡萄中天然存在的序列，也可以根据该序列进行密码子优化，得到的优化序列也具有同样的效果。

葡萄果实成熟相关蛋白VvNAC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

葡萄果实成熟相关蛋白VvNAC是一个含333个氨基酸的蛋白，其蛋白序列中存在一个保守的基序，该蛋白能够促进植物果实成熟。

重组表达载体，所述重组表达载体包含葡萄果实成熟相关基因VvNAC，所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中的重组表达载体为植物过量表达载体，能够在植物中超表达目的基因。

重组表达载体的制备方法，包括：根据如SEQ ID NO.1所示的序列设计引物，克隆所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC，然后将所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC连接到pCAMBIA2300植物表达载体上，即得。

本发明中将VvNAC基因开放阅读框连接至植物过量表达载体pCAMBIA2300上，能够形成重组表达载体pCAMBIA2300-VvNAC。

上述的葡萄果实成熟相关基因VvNAC在植物品种育种中的应用；具体的，在植物早熟品种育种中的应用；更为具体的，在草莓早熟品种育种中的应用。上述的的重组表达载体在植物品种育种中的应用；具体的，在植物早熟品种育种中的应用；更为具体的，在草莓早熟品种育种中的应用。

本发明中利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将VvNAC基因的超量表达载体转入草莓中，从而获得转基因草莓植株。实验证明，转基因草莓果实相对于野生型果实成熟期提前了6-8d；说明VvNAC基因及其重组表达载体对于促进果实成熟，调控果实上市时间具有重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明中VvNAC基因的5'-RACE扩增结果图；

图2为本发明中VvNAC基因的3'-RACE扩增结果图；

图3为本发明中VvNAC基因的全长扩增结果图；

图4为本发明中构建的植物表达载体pCAMBIA2300-VvNAC结构示意图；

图5为本发明中获得抗性草莓植株的过程图；

图6为本发明中PCR检测转基因草莓植株结果图；

图7为本发明中野生型、转化空载体及转VvNAC基因的草莓果实成熟对比图；

图8为本发明中野生型、转化空载体及转VvNAC基因的草莓果实中成熟相关基因的表达检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

葡萄果实成熟相关基因VvNAC的实施例1

本实施例中葡萄果实成熟相关基因VvNAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本实施例中葡萄果实成熟相关基因VvNAC的克隆，包括如下步骤：

(1)5’RACE和3’RACE引物的设计：根据转录组测序获得的部分序列设计5’RACE引物VvNAC5’RACE-R和3’RACE引物VvNAC3’RACE-F，其中：

VvNAC5’RACE-R：5'-CCCAATCATCCAACTTGGAGCTTCC-3'(如SEQ ID NO.3所示)；

VvNAC3’RACE-F：5'-CTTCCCAGCAAAGCGCACAGCAAC-3'(如SEQ ID NO.4所示)。

(2)提取‘京秀’葡萄转色期果实的总RNA，按照TaKaRa公司

RACE Kit的说明书进行反转录。

(3)RACE技术克隆VvNAC基因全长：按照TaKaRa公司

RACE Kit的说明书进行PCR反应，其中5’RACE的正向引物为UPM，反向引物为VvNAC5’RACE-R，3’RACE的正向引物为VvNAC3’RACE-F，反向引物为UPM，反应体系和反应程序按照试剂盒说明书进行。其中，UPM的序列为：

5'-TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(如SEQ ID NO.5所示)。

(4)PCR产物进行回收、载体连接、转化、测序，得到VvNAC基因的开放阅读框(openreading frame,ORF)为1002bp，编码333个氨基酸。

更为具体的，葡萄果实成熟相关基因VvNAC的克隆过程如下所示：

1、葡萄幼果总RNA的提取与纯化

按照SDS/酚法进行RNA的提取及纯化。具体操作如下：

(1)取0.2g幼果置于研钵中，在液氮中充分研磨后，加入装有800μL提取缓冲液[140mM LiCl，10mM EDTA，10mM Tris，5％(w/v)SDS，2％(w/v)PVP]的2mL离心管中涡旋混匀；

(2)加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，涡旋混匀，4℃，12000rpm离心15min；

(3)转移上清至一新的2mL离心管中，加入1/3体积5M，pH4.8的KAc，涡旋混匀，4℃，12000rpm离心10min；

(4)转移上清至一新的2mL离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，涡旋混匀，4℃，12000rpm离心10min；

(5)转移上清至一新的2mL离心管中，加入1/3体积8M LiCl，-20℃放置1h以上，4℃，12000rpm离心15min；

(6)弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀两次；

(7)倾去75％乙醇，待乙醇挥发干净后，加入30μL DEPC-H₂O溶解RNA；

(8)按下述体系于1.5mL离心管中加入各组分：

表1

(9)37℃温育30min；

(10)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，涡旋混匀，4℃，12000rpm离心10min；

(11)转移上清至一新的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，4℃，12000rpm离心10min；

(12)转移上清至一新的1.5mL离心管中，加入1/10体积3M NaAC(pH5.2)，2.5倍体积无水乙醇，-80℃过夜；

(13)4℃，12000rpm离心15min后；弃上清，75％乙醇洗涤两次，室温干燥；

(14)沉淀溶于20μL DEPC-H₂O中，-80℃冻存。

2、葡萄果实成熟相关基因VvNAC的5'-RACE扩增

(1)First-Strand cDNA的合成

a)在一0.2mL PCR薄壁管中加入如下试剂：

表2

b)混匀并离心后，于70℃温育2min，然后于冰上冷却2min；

c)在上述反应体系中加入如下物质：

表3

d)混匀后在PCR仪上于42℃反应1.5h；

e)将反应产物用100μL TE[10mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0)]溶液稀释；

f)将稀释后的反应产物在70℃加热7min；

g)最终的反应产物于-20℃保存备用。

(2)反转录产物的PCR扩增

a)在一0.2mL PCR薄壁管中加入如下试剂：

表4

b)将上述试剂混匀离心后，加2滴矿物油于表面，置于PCR仪上反应，PCR程序为：5cycles：94℃30s，72℃3min→5cycles：94℃30s，70℃30s，72℃，3min→25cycles：94℃30s，68℃30s，72℃3min；

c)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中M为Maker，1号泳道为目的条带。将目的条带所在的胶块切下后，用凝胶回收试剂盒回收目的条带，然后将回收产物与pGEM-T easy载体连接并转入DH5α感受态细胞中进行克隆，通过蓝白斑筛选后选择阳性克隆进行测序。

3、葡萄果实成熟相关基因VvNAC的3'-RACE扩增

(1)First-Strand cDNA的合成

a)在一0.2mL PCR薄壁管中加入如下试剂：

表5

b)混匀并离心后，于70℃温育2min，然后于冰上冷却2min；

c)在上述反应体系中加入如下物质：

表6

d)混匀后在PCR仪上于42℃反应1.5h；

f)将稀释后的反应产物在70℃加热7min；

g)最终的反应产物于-20℃保存备用。

(2)反转录产物的PCR扩增

a)在一0.2mL PCR薄壁管中加入如下试剂：

表7

c)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，其中M为Maker，1号泳道为目的条带。将目的条带所在的胶块切下后，用凝胶回收试剂盒回收目的条带，然后将回收产物与pGEM-T easy载体连接并转入DH5α感受态细胞中进行克隆，通过蓝白斑筛选后选择阳性克隆进行测序。

4、葡萄果实成熟相关基因VvNAC的全长扩增

反转录按照TaKaRa PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。具体操作步骤如下：在PCR管中加入：Random 6mers(50μM)1μL，dNTP Mixture(10mM each)1μL，Total RNA 2μg，RNase free dH₂O补齐至10μL，充分混匀，瞬时离心使溶液至PCR管底部。在PCR仪上65℃反应5min，冰上急冷。在PCR管中加入：

Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，

RTase(200U/μL)1μL，RNase Free dH₂O补齐至20μL。在PCR仪上进行下述反应：30℃，10min；42℃，60min；95℃，5min；4℃，保存。

反转录产物的PCR扩增。cDNA模板1μL，全长正向引物2μL，全长反向引物2μL，PCRBuffer 5μL，dNTP Mix 2.5μL，DNA Polymerase 1.0μL，PCR-Grade Water补齐至50μL。PCR反应程序为：94℃30sec；94℃30sec，56℃30sec，72℃3min，30cycles；72℃10min；4℃Forever。

全长正向引物：5'-ACCTACCGCGGGCATCCGACCG-3'(如SEQ ID NO.6所示)；

全长反向引物：5'-GTGTCGGTCCGTAGGATCAACAC-3'(如SEQ ID NO.7所示)。

PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，其中M为Maker，1号泳道为目的条带。将目的条带所在的胶块切下后，用凝胶回收试剂盒回收目的条带，然后将回收产物与pGEM-T easy载体连接并倒入DH5α感受态细胞中进行克隆，通过蓝白斑筛选后选择阳性克隆进行测序，获得pGEM-T easy-VvNAC质粒。葡萄果实成熟相关基因VvNAC的全长序列如SEQID NO.8所示，全长为1534个核苷酸；通过分析发现该基因的编码区共1002bp，如SEQ IDNO.1所示，为ORF片段。

葡萄果实成熟相关蛋白VvNAC的实施例1

本实施例中葡萄果实成熟相关蛋白VvNAC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

重组表达载体的实施例1

本实施例中重组表达载体包含葡萄果实成熟相关基因VvNAC，所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

重组表达载体的制备方法的实施例1

葡萄果实成熟相关基因VvNAC过量表达载体的构建

为研究葡萄果实成熟相关基因VvNAC的功能，将包含有VvNAC基因编码区在内的共1002bp的ORF片段正确插入植物过量表达载体pCAMBIA2300上。

根据葡萄果实成熟相关基因VvNAC的实施例1中克隆到的VvNAC基因序列，设计可以扩增VvNAC基因ORF的上下游引物VvNAC-ORF-F和VvNAC-ORF-R：

VvNAC-ORF-F：5'-ATGGGTGTACCGGAGACTGAC-3'(如SEQ ID NO.9所示)；

VvNAC-ORF-R：5'-TTACTGCCTATATCCAAATCCAC-3'(如SEQ ID NO.10所示)。

根据pCAMBIA2300载体上的酶切位点，在引物VvNAC-ORF-F的5’端加上酶切位点XbaI，在引物VvNAC-ORF-R的5’端加上酶切位点KpnI，具体序列如下所示：

VvNAC-ORF-XbaI-F：5'-GGGGGTACCATGGGTGTACCGGAGACTGAC-3'(如SEQ ID NO.11所示)；

VvNAC-ORF-KpnI-R：5'-GGGCTCGAGTTACTGCCTATATCCAAATCCAC-3'(如SEQ IDNO.12所示)。

以pGEM-T easy-VvNAC质粒为模板，用VvNAC-ORF-XbaI-F与VvNAC-ORF-KpnI-R进行扩增，回收目的条带后连接到pMD19-T克隆载体，转化TOP10感受态细胞，在附加Amp的LB培养基上进行蓝白斑筛选，分别经过菌液PCR与质粒酶切检测，pMD19-T-VvNAC阳性克隆送公司测序。用KpnI、XhoI双酶切重组克隆载体pMD19-T-VvNAC与植物表达载体pCAMBIA2300，回收线性化载体与目标片段，连接并转化TOP10，经Kan抗生素筛选，挑取单克隆摇菌，菌液检测后提质粒酶切检测，形成植物表达载体pCAMBIA2300-VvNAC(其结构如图4所示)。

葡萄果实成熟相关基因VvNAC及重组表达载体的应用的实施例1

1、抗性草莓植株的获得

将植物表达载体pCAMBIA2300-VvNAC以及不含VvNAC基因的空载体转化入农杆菌中。将两组农杆菌菌液于超低温冰箱取出后，在冰上溶化，取200μL接种于液体LB培养基中(含60mg·L^-1Kan和60mg·L^-1Gent)，28℃180rpm培养20h后取30μL该菌液接种于20mL液体LB培养基中，相同条件下，进行二次活化，培养20h左右至菌液浑浊。将菌液转移到灭菌的50mL离心管中，6000rpm 8min，去上清，再用液体MS培养基(含200μMAS和3％的蔗糖)重悬菌液，28℃、180rpm培养3-4h，在紫外可见分光光度计上检测菌液浓度，可用重悬液稀释，使菌液浓度达到试验所确定的最佳浓度(OD₆₀₀＝0.1-0.2)，备用。

选取饱满的草莓种子，用70％的乙醇消毒10s，再用有效氯1％的次氯酸钠溶液消毒15min，用无菌水冲洗干净，置于MS培养基中，光照培养至种子萌发长出子叶至3-5叶一心。将无菌草莓叶片切去叶尖和基端，切成0.5cm²的小块，将切好的叶片转移至农杆菌侵染液中侵染10min，用无菌滤纸吸干表面菌液，接种于共培养培养基(MS+2.0mg L^-1 6BA+0.2mgL^-1IBA+AS 200μM)，黑暗培养48h。将叶片转移至新的共培养培养基上继续黑暗培养2-4d。推迟筛选后接种于含抗生素的分化培养基(MS+2.0mg L^-1 6BA+0.2mg L^-1IBA+10g L^-1Kan+Carb 400mg·L^-1)中，两周后转移至新的分化培养基(20g L^-1Kan)，每两周转移一次，至长出抗性芽，抗性芽接入生根培养基(MS+IAA 0.2mg·L^-1+Carb 200mg·L^-1)中，待发育成完整植株后移栽至温室中，获得转化空载体及转VvNAC基因的抗性草莓植株(如图5所示，A为愈伤组织再生抗性芽；B为抗性芽转移至生根培养基；C为转基因植株移栽至营养钵中)。

2、转基因草莓植株的检测

用无液氮DNA快速提取法提取抗性草莓植株叶片DNA，作为模板，设计特异引物两对。

其序列如下所示：

转基因检测-F：5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAAAG-3'(如SEQ ID NO.13所示)；

转基因检测-R：5'-GCCGGTGGTGCAGATGAAC-3'(如SEQ ID NO.14所示)。该引物为根据pCAMBIA2300载体上报告基因GFP和CaMV 35S启动子的序列来设计的，通过检测选载体和目的基因是否存在来说明转基因是否成功。

检测体系：模板：2μL；正向引物1μL；反向引物1μL；rTaq酶0.25μL；dNTP2μL；Buffer2.5μL；水16.25μL。PCR扩增程序：94℃，3min；94℃，30s；57℃，60s；72℃，2min，29个循环；72℃，5min；4℃保存。PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，以DNA Mark DL 2000为标样，检测PCR产物。分别以pCAMBIA2300-VvNAC质粒DNA和未转化的植株DNA PCR产物为阳性和阴性对照。检测结果如图6所示，其中M为Maker，N为未转化的植株DNA阴性对照，P为质粒DNA阳性对照，其中泳道4、6为空载体转入到草莓植株中，目的基因未转入草莓植株中，泳道2未检测到任何条带，泳道1、3、5三个株系包含了目的基因条带，为VvNAC转基因阳性植株，分别命名为OE1、OE3、OE5。

3、转VvNAC基因的草莓果实的表型变化

在实验中发现，在开花后28d，转基因植株草莓果实达到了成熟；然而转化空载体的植株以及野生型植株，在开花后28d，草莓果实还没有成熟。结果如图7所示，其中转入空载体的植株草莓果实未完全成熟，而转入VvNAC基因的转基因植株(OE1、OE3、OE5)草莓果实已经成熟。因此，VvNAC基因对于草莓果实成熟具有促进作用。

4、草莓果实中成熟相关基因的表达检测

在开花后28d，采集野生型、转化空载体及转VvNAC基因的草莓果实，采用SDS/酚法提取果实总RNA，按PrimeScript^TM RT-PCR Kit说明进行反转录。Real-time PCR按照TAKARA公司的SYBR Premix Ex TMTaq II试剂盒进行操作。反应体系为：模板1μL，SYBR Mix 12.5μL，正反向引物各1μL，灭菌蒸馏水补齐至25μL。反应程序为：95℃5min；95℃30S，58℃30S，72℃30S，30个循环；72℃5min；4℃10min。PCR反应在Bio-Rad公司的iCycler iQ5 Real-timePCR仪上进行。Thresh值按PCR仪默认为30，分别记录每个反应荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(threshold cycle,Ct)。

用2^-△△Ct法检测草莓果实中成熟相关基因的表达水平，分别为VvNAC基因、FaCHS基因、FaF3H基因、FaUFGT基因、FaDFR基因，检测时使用FaActin基因作为内参基因。所用引物如下所示：

Qt-VvNAC-F：5'-CGGACAGGGGTTTTCATTG-3'(如SEQ ID NO.15所示)；

Qt-VvNAC-R：5'-GTTTTGGTTCCTTTTGGAGCT-3'(如SEQ ID NO.16所示)；

Qt-FaCHS-F：5'-GCTGTCAAGGCCATTAAGGA-3'(如SEQ ID NO.17所示)；

Qt-FaCHS-R：5'-GAGCAAACAACGAGAACACG-3'(如SEQ ID NO.18所示)；

Qt-FaF3H-F：5'-TTTTCTGAGCAATGGGAGG-3'(如SEQ ID NO.19所示)；

Qt-FaF3H-R：5'-CTGGGTTCTGGAATGTCG-3'(如SEQ ID NO.20所示)；

Qt-FaUFGT-F：5'-GGTAAGCCACAGGAGGACA-3'(如SEQ ID NO.21所示)；

Qt-FaUFGT-R：5'-TATGAGCACCGAACCAAAA-3'(如SEQ ID NO.22所示)；

Qt-FaDFR-F：5'-ACGAAGTGATAAAGCCAACA-3'(如SEQ ID NO.23所示)；

Qt-FaDFR-R：5'-AAACACCAACCTCCGAAC-3'(如SEQ ID NO.24所示)；

Qt-FaActin-F：5'-TGGGTTTGCTGGAGATGAT-3'(如SEQ ID NO.25所示)；

Qt-FaActin-R：5'-CAGTTAGGAGAACTGGGTGC-3'(如SEQ ID NO.26所示)。

结果如图8所示，从图8中可以看出，与野生型和转空载体植株相比，转VvNAC基因的草莓果实(OE1、OE3、OE5)中VvNAC基因、FaCHS基因、FaF3H基因、FaUFGT基因，FaDFR基因的表达量明显升高。说明VvNAC基因对于FaCHS基因、FaF3H基因、FaUFGT基因，FaDFR基因的表达具有促进作用。

综上，本发明通过植物基因工程技术，从‘京秀’葡萄果实中分离克隆出与果实成熟相关基因VvNAC完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，发现超量表达之后转基因草莓果实成熟期提前6-8d。

<110> 河南科技大学

<120> 葡萄果实成熟相关基因VvNAC及其应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 1002

<212> DNA

<213> 葡萄

<221> VvNAC基因

<400> 1

atgggtgtac cggagactga cccgctttca cagcttagtt tgccgcctgg gttccgattt 60

tatcccaccg atgaggagct tctggtgcag tatctctgcc ggaaagtggc cggacagggg 120

ttttcattgg agataattgg cgaaatcgat ctgtacaagt ttgacccatg ggttcttccc 180

agtaaagcta tatttggaga gaaagagtgg tactttttca gtcccagaga tcggaagtac 240

ccaaatgggt ccagacccaa tagggttgct gggtctgggt attggaaggc caccggaact 300

gataaggtga ttaccaccga gggccggaaa gttggcatca agaaagctct ggtgttttac 360

gtcggcaaag ctccaaaagg aaccaaaact aattggatca tgcatgagta cagactccta 420

gaaaattcga ggaaaaatgg aagctccaag ttggatgatt gggttctgtg ccgaatttac 480

aagaagaatt ccaactcttc gaaacccata gcagctgtac ttcccagcaa agcgcacagc 540

aacggctcgt catcgtcatc gtcgtcccac ctcgacgacg tcctggagtc gctgccggag 600

atcgatgaca ggttcttttc tcctaatcgg atgaattctc tgagagtttc acagccggac 660

gagaaagtca acttccataa cctgggctcg ggcaacttcg actgggccac tctagcaggc 720

gtctcctcct tgcaggagtt ggtctccggc gtccaatccc acgcccagcc tcccgcagct 780

gtcaacaaca gcaacgaaat gtacgttccg tcactgccgc cgctaatcca agccgaagaa 840

gaagtccaga gcggactcag aacccagaga gtcgacccag taatgaacca agggttcttc 900

ccgcagaact cgaacgcgtt cagtcagagt ttctctaact cactcgaccc gttcgggttt 960

cggtacccga cccaacctag tggatttgga tataggcagt aa 1002

<211> 333

<212> PRT

<213> 葡萄

<221> VvNAC蛋白

<400> 2

MET Gly Val Pro Glu Thr Asp Pro Leu Ser Gln Leu Ser Leu Pro

1 5 10 15

Pro Gly Phe Arg Phe Tyr Pro Thr Asp Glu Glu Leu Leu Val Gln

20 25 30

Tyr Leu Cys Arg Lys Val Ala Gly Gln Gly Phe Ser Leu Glu Ile

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Val Leu Pro

50 55 60

Ser Lys Ala Ile Phe Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro

65 70 75

Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Val Ala

80 85 90

Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Val Ile Thr

95 100 105

Thr Glu Gly Arg Lys Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr

110 115 120

Val Gly Lys Ala Pro Lys Gly Thr Lys Thr Asn Trp Ile MET His

125 130 135

Glu Tyr Arg Leu Leu Glu Asn Ser Arg Lys Asn Gly Ser Ser Lys

140 145 150

Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Lys Lys Asn Ser Asn

155 160 165

Ser Ser Lys Pro Ile Ala Ala Val Leu Pro Ser Lys Ala His Ser

170 175 180

Asn Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Leu Asp Asp Val Leu

185 190 195

Glu Ser Leu Pro Glu Ile Asp Asp Arg Phe Phe Ser Pro Asn Arg

200 205 210

MET Asn Ser Leu Arg Val Ser Gln Pro Asp Glu Lys Val Asn Phe

215 220 225

His Asn Leu Gly Ser Gly Asn Phe Asp Trp Ala Thr Leu Ala Gly

230 235 240

Val Ser Ser Leu Gln Glu Leu Val Ser Gly Val Gln Ser His Ala

245 250 255

Gln Pro Pro Ala Ala Val Asn Asn Ser Asn Glu MET Tyr Val Pro

260 265 270

Ser Leu Pro Pro Leu Ile Gln Ala Glu Glu Glu Val Gln Ser Gly

275 280 285

Leu Arg Thr Gln Arg Val Asp Pro Val MET Asn Gln Gly Phe Phe

290 295 300

Pro Gln Asn Ser Asn Ala Phe Ser Gln Ser Phe Ser Asn Ser Leu

305 310 315

Asp Pro Phe Gly Phe Arg Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Gly Phe Gly

320 325 330

Tyr Arg Gln

333

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvNAC5’RACE-R

<400> 3

cccaatcatc caacttggag cttcc 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvNAC3’RACE-F

<400> 4

cttcccagca aagcgcacag caac 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> UPM

<400> 5

taatacgact cactataggg caagcagtgg tatcaacgca gagt 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 全长正向引物

<400> 6

acctaccgcg ggcatccgac cg 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 全长反向引物

<400> 7

gtgtcggtcc gtaggatcaa cac 23

<211> 1534

<212> DNA

<213> 葡萄

<221> VvNAC基因的全长序列

<400> 8

acctaccgcg ggcatccgac cgctcctccc ccattaacgt tcatttacca cccaagtgct 60

gcttcatggc cccaggccct acttattacg gttgcgcggt tatggcgccc aagagattaa 120

atcatacgag gtcatatagc aggacaaacc tcatgacgga acccctgatt gccgctcttg 180

tcgtaccgta atgcgttgcg aacactcacg ctttgagaca cttccaaacc ttatgcaaga 240

ggactaagtt gttcgggcat ctttttgtag tttcggttaa tcaagtacgc atgggtgtac 300

cggagactga cccgctttca cagcttagtt tgccgcctgg gttccgattt tatcccaccg 360

atgaggagct tctggtgcag tatctctgcc ggaaagtggc cggacagggg ttttcattgg 420

agataattgg cgaaatcgat ctgtacaagt ttgacccatg ggttcttccc agtaaagcta 480

tatttggaga gaaagagtgg tactttttca gtcccagaga tcggaagtac ccaaatgggt 540

ccagacccaa tagggttgct gggtctgggt attggaaggc caccggaact gataaggtga 600

ttaccaccga gggccggaaa gttggcatca agaaagctct ggtgttttac gtcggcaaag 660

ctccaaaagg aaccaaaact aattggatca tgcatgagta cagactccta gaaaattcga 720

ggaaaaatgg aagctccaag ttggatgatt gggttctgtg ccgaatttac aagaagaatt 780

ccaactcttc gaaacccata gcagctgtac ttcccagcaa agcgcacagc aacggctcgt 840

catcgtcatc gtcgtcccac ctcgacgacg tcctggagtc gctgccggag atcgatgaca 900

ggttcttttc tcctaatcgg atgaattctc tgagagtttc acagccggac gagaaagtca 960

acttccataa cctgggctcg ggcaacttcg actgggccac tctagcaggc gtctcctcct 1020

tgcaggagtt ggtctccggc gtccaatccc acgcccagcc tcccgcagct gtcaacaaca 1080

gcaacgaaat gtacgttccg tcactgccgc cgctaatcca agccgaagaa gaagtccaga 1140

gcggactcag aacccagaga gtcgacccag taatgaacca agggttcttc ccgcagaact 1200

cgaacgcgtt cagtcagagt ttctctaact cactcgaccc gttcgggttt cggtacccga 1260

cccaacctag tggatttgga tataggcagt aagcaactgc acttattgcc acgacgaaaa 1320

gtgaggtaaa atgagcgcag gcctataatt caggctgtgc agacttctat acgtgattca 1380

tcgaggacgc gacccggctt tcgcgtgaat ggggtacata cgtgacaacc gtccctttag 1440

acgctgtggg tcacgggtag gagcctaaat gcgccatctt gtcagtcggc cgagtgcgca 1500

caatcaccaa cgtgttgatc ctacggaccg acac 1534

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvNAC-ORF-F

<400> 9

atgggtgtac cggagactga c 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvNAC-ORF-R

<400> 10

ttactgccta tatccaaatc cac 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvNAC-ORF-XbaI-F

<400> 11

gggggtacca tgggtgtacc ggagactgac 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> VvNAC-ORF-KpnI-R

<400> 12

gggctcgagt tactgcctat atccaaatcc ac 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 转基因检测-F

<400> 13

cctaacagaa ctcgccgtaa ag 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 转基因检测-R

<400> 14

gccggtggtg cagatgaac 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-VvNAC-F

<400> 15

cggacagggg ttttcattg 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-VvNAC-R

<400> 16

gttttggttc cttttggagc t 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaCHS-F

<400> 17

gctgtcaagg ccattaagga 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaCHS-R

<400> 18

gagcaaacaa cgagaacacg 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaF3H-F

<400> 19

ttttctgagc aatgggagg 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaF3H-R

<400> 20

ctgggttctg gaatgtcg 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaUFGT-F

<400> 21

ggtaagccac aggaggaca 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaUFGT-R

<400> 22

tatgagcacc gaaccaaaa 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaDFR-F

<400> 23

acgaagtgat aaagccaaca 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaDFR-R

<400> 24

aaacaccaac ctccgaac 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaActin-F

<400> 25

tgggtttgct ggagatgat 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Qt-FaActin-R

<400> 26

cagttaggag aactgggtgc 20

Claims

1.葡萄果实成熟相关基因VvNAC在植物品种育种中的应用，其特征在于，所述应用为在草莓早熟品种育种中的应用，所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.重组表达载体在植物品种育种中的应用，其特征在于，所述应用为在草莓早熟品种育种中的应用，所述重组表达载体包含葡萄果实成熟相关基因VvNAC，所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的重组表达载体在植物品种育种中的应用，其特征在于：所述重组表达载体的制备方法，包括：根据如SEQ ID NO.1所示的序列设计引物，克隆所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC，然后将所述葡萄果实成熟相关基因VvNAC连接到pCAMBIA2300植物表达载体上，即得。